JP2023549701A - 抗ｉｌ５ナノボディおよびその適用 - Google Patents

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Abstract

ＩＬ５ナノボディおよびその適用を提供する。具体的には、ＩＬ５ナノボディを提供し、上記ナノボディをコードするコード配列、対応する発現ベクターおよび当該ナノボディを発現できる宿主細胞、ならびにナノボディの製造方法をさらに提供する。当該ナノボディは、ヒトおよびカニクイザルのＩＬ５を特異的に識別できるが、マウスのＩＬ５は識別できず、良好な結合活性を有し、良好なＩＬ５／ＩＬ５Ｒ遮断活性を有し、遮断活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも大幅に優れており、ＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、その阻害活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも優れており、ピキアパストリスでの発現収量は、１３ｇ／Ｌに達することができ、目的タンパク質発現上清の純度が高い。【選択図】なし

Description

本発明は、生物医学または生物医薬品の技術分野に関し、より具体的には、抗ＩＬ５ナノボディおよびその適用に関する。
好酸球は、感染から体を守る上で重要な役割を果たす。しかし、いくつかの個体において、好酸球レベルの上昇が炎症の一因となり、特定の炎症性疾患の発症に関与している可能性がある。ＩＬ５は、既知のサイトカイン中で好酸球に対して最も選択的であり、好酸球の成長、分化、動員、活性化および生存を制御できる。その受容体ＩＬ５Ｒαは、好酸球上で高度に発現しており、好酸球による血液および組織中のアレルゲンの除去に重要な役割を果たす。ＩＬ５は、現在Ｔｈ２経路の主要な駆動因子の一つであると考えられており、ＩＬ５は、その受容体と結合した後、下流のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路をさらに活性化する。
近年、ＩＬ５は、免疫調節薬物の研究開発における重要なターゲットとして、免疫治療の分野で重要な役割を果たしており、ＩＬ５／ＩＬ５Ｒαを標的とする３種類のモノクローナル抗体薬物が世界中で販売承認されており、そのうちの二つは、ＩＬ５抗体（ＧＳＫ会社のメポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）およびＴｅｖａ会社のレスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ））であり、一つは、ＩＬ５Ｒα抗体（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ会社のベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ））であり、患者に新しい治療選択肢をもたらした。中国の地元製薬会社３Ｓ ＧｕｏｊｉａｎのＩＬ５ヒト化モノクローナル抗体注射液（６１０）、ＨＥＮＧＲＵＩのＩＬ５抗体（ＳＨＲ－１７０３）も国家薬品監督管理局によって臨床試験が承認されている。世界初の承認を受けたＩＬ５モノクローナル抗体薬物、即ちＧＳＫ会社のメポリズマブは、中等度の喘息、好酸球性肉芽腫性多発血管炎（ＥＧＰＡ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、重度好酸球性症候群、重度アトピー性皮膚炎、重度両側鼻ポリープ等の適応症を対象とした数多くの臨床研究で承認されている。
現在まで、ＩＬ５を標的とするナノボディ薬物はまだ市販されておらず、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、即ち重鎖ナノボディＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）-ラクダの体内では、天然に軽鎖を欠失する重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＣＡｂ）と、その可変領域をクローニングして得られた一つの重鎖可変領域のみからなるナノボディとは、現在入手可能な完全な機能と安定した結合可能な抗原を有する最小単位である。ナノボディは、高い安定性、良好な水溶性、簡単なヒト化、高い標的性、強力な浸透性等の特徴を有し、免疫実験、診断および治療において、想像を超える大きな役割を果たす。ナノボディは、新世代の抗体診断および治療において徐々に台頭しつつある。
従って、新しい抗ＩＬ５ナノボディを開発するのは、良好な臨床応用の見通しを有し、ＩＬ５ナノボディ薬物の市場の空白を埋めて、患者に利益をもたらすことが期待される。
本発明の目的は、抗ＩＬ５ナノボディおよびその適用を提供することである。
本発明の第１の態様は、抗ＩＬ５ナノボディを提供し、前記ナノボディは、ＩＬ５に特異的に結合でき、前記ナノボディにおけるＶＨＨ鎖の相補性決定領域ＣＤＲは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ３、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ３、ならびに
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３からなる群から選択される一つまたは複数である。
別の好ましい例において、上記アミノ酸配列中の任意の一つのアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つ（例えば、１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を受けて、ＩＬ５に結合する能力を保持する誘導体配列をさらに含む。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディのＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域ＦＲをさらに含み、前記フレームワーク領域ＦＲは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＦＲ４、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＦＲ４、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＦＲ４、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＦＲ４、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＦＲ４、ならびに
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＦＲ４からなる群から選択される一つまたは複数である。
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔離される。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディは、単量体、二価体（二価抗体）、四価体（四価抗体）、および／または多価体（多価抗体）を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含み、好ましくは、前記ＶＨＨ鎖間は、接続ペプチドによって接続される。
別の好ましい例において、前記接続ペプチドは、（ＧａＳｂ）ｘ-（ＧｍＳｎ）ｙの配列から選択され、ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０である（好ましくは、ａ＝４およびｂ＝１、ｍ＝３およびｎ＝１）。
別の好ましい例において、前記接続ペプチドの配列は、（Ｇ４Ｓ）４である。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディは、二つの異なるＩＬ５エピトープを識別することができる。
別の好ましい例において、前記ナノボディは、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体を含む。
本発明の第２の態様は、抗ＩＬ５抗体を提供し、それは、インターロイキン５（ＩＬ５）のエピトープに対する抗体であり、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディを有する。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５抗体は、単量体、二価体（二価抗体）、四価体（四価抗体）、および／または多価体（多価抗体）を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有する一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＩＬ５抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、Ｎ末端からＣ末端までの前記抗ＩＬ５抗体の構造は、式Ｉに示されたとおりであり、
Ａ１－Ａ２－Ｌ－Ｂ（Ｉ）、
ここで、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディのいずれか一つであり、
Ｂは、ＩｇＧのＦｃ断片であり、ならびに
Ｌは、なしまたは柔軟性リンカーである。
別の好ましい例において、前記Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖である。
別の好ましい例において、前記Ａ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるようなアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖であり、前記Ａ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖である。
別の好ましい例において、前記Ａ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖であり、前記Ａ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるようなアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖である。
別の好ましい例において、前記柔軟性リンカーは、接続ペプチドである。
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖間は、接続ペプチドによって接続される。
別の好ましい例において、前記接続ペプチドは、（ＧａＳｂ）ｘ-（ＧｍＳｎ）ｙの配列から選択され、ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０である（好ましくは、ａ＝４およびｂ＝１、ｍ＝３およびｎ＝１）。
別の好ましい例において、前記接続ペプチド的配列は、（Ｇ４Ｓ）４である。
別の好ましい例において、前記抗体的アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記抗体は、正確な空間構造を有するＩＬ５タンパク質に特異的に結合できる。
別の好ましい例において、前記抗体は、ＩＬ５とＩＬ５Ｒとの相互作用を効果的に遮断できる。
別の好ましい例において、前記抗体は、ヒト、カニクイザルのＩＬ５を識別できるが、マウスのＩＬ５を識別できない。
別の好ましい例において、ＩＬ５に対する前記抗体の親和性は、１ｎＭ未満である。
別の好ましい例において、前記抗体は、良好なＩＬ５／ＩＬ５Ｒ遮断活性を有し、遮断活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａの活性よりも大幅に優れる。ここで、対照抗体Ｎｕｃａｌａは、ＧＳＫ会社の市販薬のＭｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ、即ちメポリズマブである。
別の好ましい例において、前記抗体ＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、その阻害活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａの阻害活性よりも優れる。
別の好ましい例において、前記抗体は、ナノボディである。
本発明の第３の態様は、抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質を提供し、Ｎ末端からＣ末端までの前記融合タンパク質の構造は、式ＩａまたはＩｂに示されたとおりであり、
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉａ）、
Ｂ－Ｌ－Ａ（Ｉｂ）、
ここで、
「－」は、ペプチド結合であり、
Ａは、本発明の第１の態様に記載の一つまたは複数の抗ＩＬ５ナノボディであり、
Ｂは、ＩｇＧのＦｃ断片であり、ならびに
Ｌは、なしまたは柔軟性リンカーである。
別の好ましい例において、前記柔軟性リンカーは、接続ペプチドである。
別の好ましい例において、前記ＩｇＧのＦｃ断片は、ヒトＩｇＧのＦｃ断片を含む。
別の好ましい例において、前記ＩｇＧのＦｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ断片、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ＩｇＧのＦｃ断片は、ＩｇＧ４である。
別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、ＩＬ５エピトープに対するナノボディＦｃ融合タンパク質である。
本発明の第４の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチド配列は、組み合わせ形態であり、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２のうちの一つまたは複数を含む。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
本発明の第５の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入システム、またはその組み合わせからなる群から選択される。
好ましくは、前記発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはその組み合わせ等のウイルスベクターを含む。
本発明の第６の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第５の態様に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムには、本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、ファージ、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記原核細胞は、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、ストレプトミセス、プロテウスミラビリス、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記真核細胞は、ピキアパストリス、サッカロミセスセンビシェ、ミゾサッカロミセス、トリコデルマ、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、ピキアパストリスである。
本発明の第７の態様は、
（ａ）ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を生成するのに適した条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を含む培養物を取得する段階と、
（ｂ）前記培養物から前記抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を分離または回収する段階と、ならびに
（ｃ）任意選択で、精製および／または修飾して段階（ｂ）で得られた抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を得る段階とを含む、抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を生成する方法を提供する。
本発明の第８の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の態様に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質と、ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
別の好ましい例において、前記放射性核種は、
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはその組み合わせからなる群から選択される診断用同位体と、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはその組み合わせからなる群から選択される治療用同位体とを含む。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい例において、前記薬物は、細胞傷害性薬物である。
別の好ましい例において、前記細胞傷害性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗物、抗代謝薬物、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、特に有用な細胞傷害性薬物の例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞傷害性薬物は、例えば、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン／デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）もしくはベンゾジアゼピン含有薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリンベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記毒素は、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、メイタンセトール、リシン、リシンＡ－鎖、コンブレタスタチン、ドカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラキシンジケトン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、レンコン毒素Ａ鎖、α－サルシナ、ゲロニン、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロトニン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））または任意形態のナノ粒子からなる群から選択される。
本発明の第９の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと、ならびに
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲート的カップリング部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎、アレルギー性鼻炎および／または湿疹を治療するための他の薬物，例えば、コルチコステロイド（ＴＣＳ）、ネドクロシルナトリウム、クロモリンナトリウム、テオフィリン、ロイコトリエン受容体拮抗剤、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ＩＬ５／ＩＬ５Ｒシグナル伝達に関連する疾患または病症を予防および／または治療するための薬物の調製に使用される。
本発明の第１０の態様は、（ａ）ＩＬ５／ＩＬ５Ｒシグナル伝達に関連する疾患または病症を予防および／または治療するための薬物の調製に使用され、（ｂ）ＩＬ５を検出するための試薬、検出プレートまたはキットの調製に使用される、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記疾患または病症は、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎、アレルギー性鼻炎、湿疹、副鼻腔炎、鼻ポリープ、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性肉芽腫性多発血管炎、好酸球増加症候群、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
別の好ましい例において、前記ＩＬ５は、ヒトＩＬ５である。
別の好ましい例において、前記試薬は、診断試薬である。
別の好ましい例において、前記診断試薬は、造影剤である。
別の好ましい例において、前記試薬は、サンプル中のＩＬ５タンパク質またはその断片を検出するために使用される。
本発明の第１１の態様は、多重特異性抗体を提供し、前記多重特異性抗体は、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体を含む。
別の好ましい例において、多重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１１、ＩＬ－１１Ｒ、またはその組み合わせからなる群から選択されるターゲットを標的とする第２の抗原結合領域を含む。
別の好ましい例において、前記第２の抗原結合領域は、ナノボディである。
別の好ましい例において、前記多重特異性抗体は、一つまたは複数の第２の抗原結合領域を含む。
別の好ましい例において、前記多重特異性抗体は、抗体のＦｃセグメントをさらに含む。
本発明の第１２の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質と、ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を助けるための任意のタグ配列とを有する。
別の好ましい例において、前記タグ配列は、Ｆｃタグ、ＨＡタグおよび６Ｈｉｓタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、ＩＬ５タンパク質に特異的に結合する。
在本発明の第１３の態様は、サンプル中のＩＬ５タンパク質の検出、またはＩＬ５／ＩＬ５Ｒシグナル伝達に関連する疾患または病症の治療および／または予防に使用される、本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記疾患または病症は、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎、アレルギー性鼻炎、湿疹、副鼻腔炎、鼻ポリープ、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性肉芽腫性多発血管炎、好酸球増加症候群、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
別の好ましい例において、前記検出は、フローサイトメトリー検出、細胞免疫蛍光検出を含む。
別の好ましい例において、前記用途は、診断的および／または非診断的、および／または治療的および／または非治療的である。
本発明の第１４の態様は、サンプル中のＩＬ５タンパク質を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（１）サンプルを本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと接触される段階と、
（２）抗原－抗体複合体を形成するかどうかを検出し、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＩＬ５タンパク質が存在することを示す。
別の好ましい例において、前記方法は、非診断的かつ非治療的な方法である。
本発明の第１５の態様は、ＩＬ５タンパク質検出試薬を提供し、前記検出試薬は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または本発明の第２の発明に記載の抗ＩＬ５抗体、または本発明の第３の態様に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと、ならびに
（ｉｉ）検出学的に許容されるベクターとを含む。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用同位体である。
別の好ましい例において、前記検出学的に許容されるベクターは、非毒性で不活性な水性ベクター媒体である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フローサイトメトリー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される一つまたは複数の試薬である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、インビボ検出に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬の財形は、液体または粉末状態（例えば、水溶液、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、口腔内剤、エアロゾル剤）である。
本発明の第１６の態様は、ＩＬ５タンパク質を検出するためのキットを提供し、前記キットは、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートまたは本発明の第１５の態様に記載の検出試薬、および取扱説明書を含む。
別の好ましい例において、前記取扱説明書では、前記キットは、検出対象のＩＬ５発現を非侵襲的に検出するために使用される。
本発明の第１７の態様は、インビボでＩＬ５タンパク質を検出するための造影剤を調製するために使用される、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記検出は、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎、アレルギー性鼻炎、湿疹、副鼻腔炎、鼻ポリープ、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性肉芽腫性多発血管炎、好酸球増加症候群等の診断または予後に使用される。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
ＩＬ５ナノボディのスクリーニングおよび濃縮のプロセスを示す。５ラウンドのパニング語、二つのライブラリー内のＩＬ５特異的ナノボディファージには、それぞれ１２０倍および１４．６倍の濃縮が現される。 フローサイトメトリーによる、ＩＬ５とＩＬ５Ｒとの間の相互作用を遮断するナノボディを有する事前にスクリーニングの結果を示す。結果は、９６株のナノボディのうち１１株の抗体が遮断活性を有することを示す。 １１株の遮断型ＩＬ５ナノボディの異種間活性のＥＬＩＳＡ検出の結果を示す。結果は、１１株のナノボディがすべてヒトおよびカニクイザルのＩＬ５を識別できるが、マウスのＩＬ５を識別できないことを示す。 バイオレイヤー干渉を使用したナノボディの親和性のＦｏｒｔｅｂｉｏ検出の結果を示す。結果は、ＩＬ５に対する１１株のナノボディの親和性がすべて１ｎＭ未満であることを示す。 ナノボディの結合活性のＥＬＩＳＡ検出の結果を示す。結果は、４株のナノボディの結合活性がすべて対照抗体Ｎｕｃａｌａの結合活性よりも優れることを示す。 フローサイトメトリーによって同定された候補ＩＬ５ナノボディの遮断活性を示す。結果は、４株のナノボディがすべて良好なＩＬ５／ＩＬ５Ｒ遮断活性を有することを示し、ここで、Ｎｂ２１、Ｎｂ６６の遮断活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａの遮断活性よりも大幅に優れる。 遮断型ナノボディの抗原識別エピトープの一致性のＥＬＩＳＡ検出の結果を示す。結果は、Ｎｂ２１およびＮｂ６６が異なる抗原識別エピトープであることを示す。 フローサイトメトリーによって検出されたヒト化二価ナノボディの遮断活性を示す。結果は、ヒト化二価抗体の活性が一価抗体の活性よりも有意に上昇することを示し、ここで、ＨｕＮｂ２１－ＨｕＮｂ６６－ＦｃおよびＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１－Ｆｃ二価バイエピトープ抗体の遮断活性が最もよく、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも大幅に優れる。 Ｆｏｒｔｅｂｉｏによって検出されたバイエピトープ二価ＩＬ５ナノボディピキアパストリスの発酵上清液中の含有量結果を示す。結果は、当該発酵条件下で、二価バイエピトープ抗体の発現量が培養時間の延長とともに連続的に増加し、２０２時間の発酵培養での抗体収量が１３ｇ／Ｌに達することができることを示す。 バイエピトープ二価ＩＬ５ナノボディピキアパストリス発酵上清液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果を示す。結果は、バイエピトープＩＬ５ナノボディＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１ピキアパストリスでの発現収量は、１３ｇ／Ｌに達することができ、目的タンパク質発現上清の純度が高いことを示す。 二価バイエピトープＩＬ５ナノボディの遮断活性のフローサイトメトリー検出の結果を示す。結果は、酵母によって発現された二価バイエピトープ抗体ＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１の遮断活性（ＩＣ５０＝０．８４１μｇ／ｍＬ）が対照抗体Ｎｕｃａｌａ（ＩＣ５０＝２．０３５μｇ／ｍＬ）の遮断活性よりも優れることを示す。 ＴＦ１細胞の増殖に対する二価バイエピトープＩＬ５ナノボディの阻害効果の検出結果を示す。結果は、酵母によって発現された二価バイエピトープ抗体がＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、ＴＦ－１細胞の増殖に対するその阻害活性（ＩＣ５０ ＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１＝０．０５１２ｎＭ）が対照抗体の阻害効果（ＩＣ５０ Ｎｕｃａｌａ＝０．１７８２ｎＭ）よりも優れることを示す。
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究、および多くのスクリーニングの後、ＩＬ５ナノボディのクラスを予想外に初めて発見し、実験結果に示されるように、本発明のナノボディは、ヒトおよびカニクイザルのＩＬ５を特異的に識別できるが、マウスのＩＬ５を識別できず、良好な特異性および結合活性を有し、本発明のナノボディは、良好なＩＬ５／ＩＬ５Ｒ遮断活性を有し、遮断活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも大幅に優れており、本発明のナノボディＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、その阻害活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも優れており、本発明のナノボディピキアパストリスでの発現収量は、１３ｇ／Ｌに達することができ、目的タンパク質発現上清の純度が高い。
用語
本明細書で使用されるように、「本発明のナノボディ」、「本発明のナノボディ」、「本発明の抗ＩＬ５ナノボディ」、「本発明のＩＬ５ナノボディ」、「抗ＩＬ５ナノボディ」、「ＩＬ５ナノボディ」という用語は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、すべてＩＬ５（ヒトＩＬ５を含む）を特異的に識別および結合するナノボディを指す。
本明細書で使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域間で界面を形成する。
本明細書で使用されるように、「単一ドメイン」、「ＶＨＨ」、「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「重鎖抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ、またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ））という用語は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築することを指し、それは、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、天然に軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を欠失する抗体を取得した後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分散されていない。これは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与するが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、様々なエフェクター機能を示す。
当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素ならびに他の診断用分子または治療用分子を本発明の抗体またはその断片に結合して形成されるコンジュゲートを含む。本発明は、前記抗ＩＬ５抗体またはその断片に結合する細胞表面マーカーまたは抗原をさらに含む。
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域」および「ＶＨ」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、三つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は、交換可能に使用され、すべて、ＩＬ５タンパク質に特異的に結合するポリペプチド、例えば、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。それらは、出発メチオニンを含んでも含まなくてもよい。
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現生成物をさらに提供する。具体的には、本発明は、当該可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同じまたは少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性である限り、可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物）を含む。
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、重鎖可変領域に位置する三つの特定の領域によって説明でき、当該セクションは、四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分けられ、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的保存され、結合反応には直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβフォールディングは、空間構造に互いに近接しており、重鎖上のＣＤＲと対応する軽鎖上のＣＤＲとは、抗体の抗原結合部位を構成する。どのアミノ酸がＦＲ領域またはＣＤＲ領域を構成するかは、同じ種類の抗体のアミノ酸配列を比較することによって決定されることができる。
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、それらの少なくとも一部が抗原の結合に関与しているため、特に興味深い。従って、本発明は、ＣＤＲが本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性がある限り、そのＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体および他の配列によって形成された融合タンパク質も含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体をさらに含む。
本明細書に使用されるように、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、（ｉ）一つのまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示に従って、これらの断片、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。
本発明の抗体とは、ＩＬ５結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態をさらに含む。これらの変異形態は、一つまたは複数（通常は、１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、およびＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内である）のアミノ酸の追加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、類似または近似の性能を有するアミノ酸によって置換される場合、通常、タンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数のアミノ酸の追加も、通常、タンパク質の機能を変化させない。当該用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに含む。
当該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本発明は、ナノボディまたはその断片を含む融合タンパク質等の他のポリペプチドをさらに提供する。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のナノボディの断片をさらに含む。通常、当該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続アミノ酸を有する。
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が同様または類似の性質を有するアミノ酸の置換によって形成されたポリペプチドを指す。これらの保存性変異体ポリペプチドは、表Ａに従って、アミノ酸置換を行うことにより生成されるのが最もよい。
Figure 2023549701000001
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列を含む。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０oＣ等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２oＣ等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。
関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
現在、完全に化学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、または例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、または例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。
得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。
前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピューター断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体と結合またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒性、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））等を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体に結合またはカップリング可能な治療剤は、１．放射性核種；２．生物毒；３．サイトカイン、例えば、ＩＬ－２等；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス粒子；６．リポソーム；７．ナノ磁性粒子；８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））等を含むが、これらに限定されない。
インターロイキン－５（ＩＬ５）
インターロイキン－５（ＩＬ５）は、既知のサイトカイン中で好酸球に対して最も選択的であり、好酸球の成長、活性化、生存および移動を調節することができる。インターロイキン－５は、インターロイキン－５特異的αおよび一般的β－サブユニットを含む受容体を介して、その増殖および分化の効果を発揮する。ＩＬ５は、好酸球が骨髄から背部および他の器官へ移動する場合に重要な役割を果たす。ＩＬ５シグナルは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＢｔｋおよびＲａｓ／Ｒａｆ－ＥＲＫシグナル伝達を通じて、Ｂ細胞および好酸球の生存および機能を維持する。インビボでのＩＬ５の過剰発現は、好酸球およびＢ細胞の数を有意に増加させるが、ＩＬ５またはＩＬ５受容体の機能遺伝子を欠失するマウスは、Ｂ細胞および好酸球系に多数の発生および機能損傷を示す。ヒトでは、ＩＬ５の生物学的効果は、好酸球の最も好ましい特徴である。ＩＬ５は、現在Ｔｈ２経路の主要な駆動因子の一つであると考えられる。
インターロイキン－５受容体α（ＩＬ５Ｒα）
ＩＬ５の受容体であるＩＬ５Ｒαは、好酸球で高度に発現されており、好酸球が血液および組織内のアレルゲンを除去する際に重要な役割を果たすＩＬ５受容体は、α鎖およびβｃ鎖で構成され、αサブユニットは、ＩＬ５分子に特異的であるが、βｃサブユニットは、インターロイキン３（ＩＬ３）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によっても識別される。活性化Ｂ細胞におけるＩＬ５Ｒαの発現は、Ｅ１２、Ｅ４７、Ｓｐ１、ｃ／ＥＢＰβおよびＯｃｔ２を含む、様々な転写因子によって調節される。
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）。
本発明の医薬組成物は、ＩＬ５タンパク質分子の結合に直接使用されることができ、したがって、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎、アレルギー性鼻炎、湿疹等の治療に使用されることができる。さらに、他の治療剤を併用することもできる。
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の前記ナノ抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有効量であり、例えば、毎日の約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤とともに使用することもできる。
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
抗ＩＬ５ナノボディ
本発明において、前記抗ＩＬ５ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の一つまたは複数から選択される。
本発明の好ましい例において、前記抗ＩＬ５ナノボディは、単量体、二価体（二価抗体）、四価体（四価抗体）、および／または多価体（多価抗体）を含む。
典型的には、前記抗ＩＬ５ナノボディは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖間は、接続ペプチドによって接続される。
別の好ましい例において、前記接続ペプチドは、（ＧａＳｂ）ｘ-（ＧｍＳｎ）ｙの配列から選択され、ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０（好ましくは、ａ＝４およびｂ＝１、ｍ＝３およびｎ＝１）。
別の好ましい例において、前記接続ペプチド的配列は、（Ｇ４Ｓ）４である。
標識されたナノボディ
本発明の好ましい例において、前記ナノボディは、検出可能なマーカーを有する。より好ましくは、前記マーカーは、同位体、金コロイドマーカー、着色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選択される。
金コロイド標識は、当業者に知られている方法によって行われることができる。本発明の好ましい実施形態において、ＩＬ５ナノボディは、金コロイドで標識されて、金コロイド標識ナノボディを得る。
検出方法
本発明は、ＩＬ５タンパク質を検出する方法にも関する。当該方法の段階は、大まかに次のとおりである。細胞および／または組織サンプルを取得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解したサンプル中のＩＬ５タンパク質のレベルを検出する。
本発明の検出方法において、使用されたサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルである。
キット
本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、ＩＬ５レベルを検出するための検出キットをさらに提供し、当該キットは、ＩＬ５タンパク質を識別する抗体、サンプルを溶解するための溶解媒体、例えば様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の検出に必要な一般的に試薬および緩衝液を含む。当該検出キットは、対外診断装置であってもよい。
適用
上記のように、本発明のナノボディは、生物学的および臨床上の幅広い適用価値を有し、その適用は、ＩＬ５に関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の複数の領域に関する。好ましい適用は、ＩＬ５に対する臨床診断および標的療法である。
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（ａ）本発明のナノボディは、ＩＬ５とＩＬ５Ｒとの相互作用を効果的に遮断できる。
（ｂ）本発明のナノボディは、ヒト、カニクイザルのＩＬ５を識別できるが、マウスのＩＬ５を識別できない。
（ｃ）本発明のナノボディは、対照抗体Ｎｕｃａｌａと比較して、より強い結合活性および遮断活性を有する。
（ｄ）本発明のナノボディは、ピキアパストリスで発現されることができ、発現収量は、１３ｇ／Ｌに達することができ、目的タンパク質発現上清の純度が高い。
（ｅ）本発明のナノボディＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、阻害効果は、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも優れる。
以下の具体的な実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。
実施例１：ファージディスプレイ技術によるＩＬ５特異的ナノボディのスクリーニング
初期段階で高純度のヒトＩＬ５タンパク質と免疫アジュバントとを混合し、２頭の新疆フタコブラクダに免疫し、７回免疫後に末梢血を採取し、その後そこからリンパ球を抽出してＲＮＡを分離する。ＲＮＡの逆転写後、ネステッドＰＣＲ増幅によってＶＨＨ遺伝子を分離し、ＶＨＨ断片をｐＭＥＣＳベクターにクローニングし、ＴＧ１コンピテント細胞に電気形質転換して、抗ＩＬ５ナノボディのファージディスプレイライブラリーを確立する。測定によると、二つのライブラリーの記憶容量は、それぞれ６．４×１０８ＣＦＵおよび１．３×１０８ＣＦＵであり、ライブラリーの目的断片ＶＨＨの挿入率は、それぞれ９１．７％および１００％に達する。その後ファージディスプレイ技術を利用してＩＬ５特異的ナノボディをスクリーニングし、具体的なスクリーニング方法は、特許ＣＮ１１０１４４０１１Ｂの実施例３のスキームを参照する。５ラウンドの「結合－洗浄－溶出」の濃縮プロセスの後、最終的にそれぞれ１２０倍および１４．６倍の特異的ファージ濃縮を得る（図１）。ＰＥ－ＥＬＩＳＡ同定およびシーケンシング分析の後、異なる配列を有する９６株のＩＬ５特異的にナノボディを最終的に取得する。
実施例２：遮断型ＩＬ５ナノボディのスクリーニング
適切な濃度のアンピシリンを含む１ｍＬのＴＢ培地に異なる配列のＩＬ５ナノボディクローン株を接種し、３７℃の恒温シェーカーで対数成長期まで培養する際にＩＰＴＧ誘導剤を加え、２８℃で１６時間誘導し、１６時間後に浸透圧ショック法を用いて菌体を破壊して、ナノボディ粗抽出液を取得し、各サンプルについて、１Ｅ６個のＨＥＫ２９３Ｆ／ＩＬ５Ｒａ細胞を採取して、０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、それぞれ２００μＬの上記ＩＬ５ナノボディ粗抽出液を加え、同時に陰性対照（溶解液）を設定し、すべてのサンプルに適切な濃度のＩＬ５－ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を加え、４℃で２０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＳＡ－ＰＥを加え、４℃の暗所で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後にフローサイトメーター（ＢＤ Ｃａｌｉｂｅｒ）で検出し、結果は、図２に示されるように、良好な遮断効果を有する１１株のＩＬ５ナノボディを事前にスクリーニングし、ここで、陽性細胞のパーセンテージの数値が低いほど、抗体の遮断効果が優れていることを示し、ここで、１１株のナノボディの番号は、それぞれＮｂ６、Ｎｂ１３、Ｎｂ２０、Ｎｂ２１、Ｎｂ２５、Ｎｂ２６、Ｎｂ５０、Ｎｂ６６、Ｎｂ７１、Ｎｂ８５、Ｎｂ９２である。配列分析によると、１１株の遮断型ＩＬ５ナノボディ配列は、四つのファミリーに分けられることができ、後続の主要な研究対象は、表１に示されたとおりである。
Figure 2023549701000002
実施例３：ＩＬ５ナノボディの種特異的検出
ＥＬＩＳＡを使用して実施例２で取得した１１株のナノボディが他の種ＩＬ５と交差反応できるかどうかを検出する。１μｇ／ｍＬのヒトＩＬ５、マウスＩＬ５、カニクイザルＩＬ５およびＩｇＧ１タンパク質をそれぞれマイクロタイタープレートに加えて、４℃、１００ｕＬ／ウェルで一晩コーティングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した後、各ウェルに３００ｕＬの１％ＢＳＡを加えて室温下で２時間密封し、ＰＢＳＴで５回洗浄した後、それぞれ１００ｕＬの２μｇ／ｍＬ原核発現ナノボディ（Ｎｂ６、Ｎｂ１３、Ｎｂ２０、Ｎｂ２１、Ｎｂ２５、Ｎｂ２６、Ｎｂ５０、Ｎｂ６６、Ｎｂ７１、Ｎｂ８５、Ｎｂ９２）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、１００ｕＬの希釈マウス抗ＨＡ抗体（１：２０００希釈）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、１００ｕＬの希釈塩基性ホスファターゼ修飾抗マウス抗体（１：２０００希釈）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、発色液を加え、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍ波長での吸収値を測定する。結果は、図３に示されたとおりであり、１１株のナノボディは、すべてヒトおよびカニクイザルＩＬ５を識別できるが、マウスＩＬ５を識別できない。
実施例４：ＩＬ５ナノボディの親和性測定
実施例２で取得した１１株のナノボディのヒトＩＬ５に対する結合動態を、バイオレイヤー干渉（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ＢＬＩ）を通じて、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｒｅｄ９６装置を使用して測定する。動態測定の場合、ＩＬ５抗原タンパク質をＰＢＳＴ緩衝液で１．５μｇ／ｍＬに希釈し、１１株のＩＬ５ナノボディをＰＢＳＴ緩衝液で六つの濃度勾配で２倍に段階希釈し（３０ｎＭ、１５ｎＭ、７．５ｎＭ、３．７５ｎＭ、１．８８ｎＭ、０．９４ｎＭ）、装置の動作条件を温度３０℃、振とう速度（Ｓｈａｋｅ ｓｐｅｅｄ）１０００ｒｐｍのように設定する。プロテインＡをコーティングしたプローブを使用して抗体を捕捉し、捕捉時間は、１８０秒であり、段階希釈した抗原に結合し、結合時間は、３００秒であり、解離時間は、３６０秒であり、１０ｍＭグリシン（ＰＨ１．７）は、毎回５秒で３回再生する。ＦｏｒｔｅｂｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ９．０バージョンを使用して分析し、１：１結合モデルＧｌｏｂａｌモードでフィッティングし、結合速度（Ｋｏｎ）、解離速度（Ｋｄｉｓ）および解離定数ＫＤを計算する。結果は、図４に示されたとおりであり、ＩＬ５に対する１１株のナノボディの親和性は、すべて１ｎＭ未満である。
実施例５：ＥＬＩＳＡによるＩＬ５ナノボディの結合活性の検出
ＥＬＩＳＡ法によって、異なる配列の四つのナノボディ（Ｎｂ２１、Ｎｂ２５、Ｎｂ６６およびＮｂ９２）のＩＬ５に対する結合活性を検出および比較する。すべてのＩＬ５ナノボディを１μｇ／ｍＬに希釈し、１００ｕＬ／ウェルを採取してコーティングし、４℃で一晩放置する。ＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで各ウェルに３００ｕＬの１％ＢＳＡを加えて、３７℃で２時間静置して密封する。ＰＢＳＴで５回洗浄し、１００ｕＬの段階希釈したＩＬ５－ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を加え、濃度勾配を２μｇ／ｍＬから開始し、１２ポイントの２倍段階希釈で開始し、サンプルを加えて３７℃下で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで５回洗浄し、１００ｕＬのＳＡ－ＨＲＰ（ＰＢＳで１：５０００に希釈する）を加え、３７℃下で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで５回洗浄し、各ウェルに１００ｕＬのＴＭＢ発色液を加え、室温の暗所で５分間反応させ、５０ｕＬの２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定する。結果は、図５に示されたとおりであり、４株のナノボディの結合活性は、すべて対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも優れる。
実施例６：フローサイトメトリーによるＩＬ５抗体の遮断活性の検出
ＩＬ５Ｒを高度に発現するＨＥＫ２９３Ｆを安定にトランスフェクトした細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。５ｍＬのＰＢＳで細胞を１回洗浄した後に２ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、計数した後にウェルあたり３×１０５個の細胞で細胞を９６ウェルプレートに分注する。それぞれ４株のナノボディ（Ｎｂ２１、Ｎｂ２５、Ｎｂ６６およびＮｂ９２）ならびに対照抗体Ｎｕｃａｌａを２倍段階希釈し（２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ）、希釈した抗体をそれぞれ等量の２．５μｇ／ｍＬのＩＬ５－ビオチンと混合した後に９６ウェルプレートに細胞を再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートし、３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した後に２００ｕＬのＰＢＳ／ウェルを添加し、再懸濁した後に３０００ｒｐｍで、４℃下で４分間遠心分離し、希釈したＳＡ－ＰＥ抗体（０．３：１００に希釈する）を加え、４℃下で２０分間インキュベートし、３０００ｒｐｍ下で、４℃で４分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００ｕＬのＰＢＳ／ウェルを加えて細胞を洗浄し、２回洗浄し、２００ｕＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローチューブに移し、フローサイトメーターで各サンプルのＰＥシグナルを検出する。結果は、図６に示されたとおりであり、４株のナノボディは、すべてが良好なＩＬ５／ＩＬ５Ｒの遮断活性を有し、ここで、Ｎｂ２１、Ｎｂ６６の遮断活性は、対照抗体Ｎｕｃａｌａの遮断活性よりも大幅に優れる。
実施例７：ＩＬ５ナノボディの抗原識別エピトープ分析
ＥＬＩＳＡ法を使用して、実施例６においてより良好な遮断活性を有する二つの好ましいナノボディ（Ｎｂ２１およびＮｂ６６）が異なるＩＬ５抗原エピトープを検出することができる。具体的には、４℃で１μｇ／ｍＬのＩＬ５抗原タンパク質を一晩コーティングし、ＰＢＳＴで酵素プレートを５回洗浄した後に１％ＢＳＡを加えて室温下で２時間密封し、ＰＢＳＴで酵素プレートを５回洗浄し、１００ｕＬの希釈した抗体混合液を加え、３７℃下で１時間インキュベートし（ナノボディの作業濃度は、２０μｇ／ｍＬであり、ビオチン化ナノボディの作業濃度は、３μｇ／ｍＬであり、三つのグループのサンプルは、それぞれ３μｇ／ｍＬのＮｂ２１－ビオチン、２０μｇ／ｍＬのＮｂ２１＋３μｇ／ｍＬのＮｂ２１－ビオチン、２０μｇ／ｍＬのＮｂ６６＋３μｇ／ｍＬのＮｂ２１－ビオチンである）、ＰＢＳＴで酵素プレートを５回洗浄し、１００ｕＬのＳＡ－ＨＲＰ（１：５０００に希釈する）を加え、３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、各ウェルに１００ｕＬのＴＭＢ発色液を加え、室温の暗所で５分間反応させ、５０ｕＬの２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定する。結果は、図７に示されたとおりであり、Ｎｂ２１およびＮｂ６６は、異なる抗原識別エピトープを有する。
実施例８：二価ヒト化ナノボディの構築および発現
上記実施例６において良好な遮断活性を有する２株のナノボディＮｂ２１、Ｎｂ６６をそれぞれフレームワーク領域でヒト化修正し、修正スキームについては、特許ＣＮ１１０１４４０１０Ｂの実施例３を参照する。ヒト化後の抗体配列は、表２に示されたとおりである。
Figure 2023549701000003
ヒト化後の抗体をそれぞれペアで組み合わせ、Ｆｃと融合して発現させ、ｐＣＤＮＡ３．１＋ベクターに構築する。融合後の配列は、表３に示されたとおりである。
Figure 2023549701000004
構築したプラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入し、発現方法については、特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６の実施例３を参照する。
実施例９：フローサイトメトリーによる二価ヒト化ＩＬ５ナノボディの遮断活性の検出
実施例８で取得した精製ヒト化二価抗体を、細胞レベルでの遮断活性について、一価ナノボディおよび陽性対照Ｎｕｃａｌａと比較する。具体的には、ＩＬ５Ｒを高度に発現するＨＥＫ２９３Ｆを安定にトランスフェクトした細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。５ｍＬのＰＢＳで細胞を１回洗浄した後に２ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、計数した後に細胞をウェルあたり３×１０５細胞で９６ウェルプレート分注する。それぞれ試験する抗体を２倍段階希釈し（８０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ）、希釈した抗体をそれぞれＩＬ５－ビオチンと混合した後に９６ウェルプレートに再懸濁および分注した細胞を、４℃で２０分間インキュベートし、３０００ｒｐｍで４℃下で遠心分離した後に２００ｕＬのＰＢＳ／ウェルを加え、再懸濁した後に３０００ｒｐｍで、４℃下で４分間遠心分離し、希釈したＳＡ－ＰＥ抗体を加え（０．３：１００に希釈する）、４℃で２０分間インキュベートし、３０００ｒｐｍで、４℃下で４分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００ｕＬのＰＢＳ／ウェルを加えて細胞を洗浄し、２回洗浄し、２００ｕＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローチューブに移し、フローサイトメーターによって各サンプルのＰＥシグナルを検出する。
結果は、図８に示されたとおりであり、ヒト化二価抗体は、一価抗体と比較して活性が有意に上昇し、ここで、ＨｕＮｂ２１－ＨｕＮｂ６６－ＦｃおよびＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１－Ｆｃヘテロ二価抗体の遮断活性は、より良好であり、対照抗体Ｎｕｃａｌａよりも大幅に優れる。
実施例１０：ピキアパストリスにおける二価バイエピトープＩＬ５ナノボディの発現
好ましくは、上記ヒト化Ｎｂ６６およびＮｂ２１を組み合わせて二価バイエピトープナノボディを形成し、抗体アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されたとおりであり、当該配列をピキアパストリスコドン最適化後の塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されたとおりであり、ｐＰＩＣＺａＡベクターにクローニングし、その後ピキアパストリスで発現させる。簡単に言うと、発現方法は、次のとおりである。Ｓａｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼでｐＰＩＣＺａＡ－ＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１を線形化した後にＸ－３３コンピテント細胞に電気形質転換し、電気形質転換したサンプルを、それぞれ異なる濃度のブレオマイシン耐性を含むＹＰＤプレート培地にコーティングし、３０℃のインキュベーターで３～４日間培養し、具体的な実施形態については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社によって提供されたｐＰＩＣＺａＡベクターの取扱説明書を参照することができ、プレート培地上でモノクローンが増殖した後、プレート上の異なる濃度のモノクローンを採取してＢＭＧＹ培地に置き、ＢＭＧＹ培養液のＯＤ値が約２０に達する場合、菌体を収集した後にＢＭＭＹ培地に交換し、２８℃下で２５０ｒｐｍで培養し、その後２４時間ごとにサンプルを採取し、最終体積が１％であるメタノールを加えてサンプルを採取し、サンプルを１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取し、－２０℃で保存し、５日間誘導を継続し、培養を終了し、上清液を採取してその目的タンパク質の含有量を測定する。その後高収量クローンを選択して、７Ｌ発酵槽で培養し、発酵条件は、２４℃の誘導培養、ｐＨ６．５、８．５ｍＬ／Ｌ／ｈのメタノール供給速度である。発酵プロセスの様々な時点で上清を採取して、目的タンパク質の含有量を検出し、結果は、図９に示されたとおりであり、ピキアパストリスにおけるバイエピトープＩＬ５ナノボディＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１の発現収量は、約１３ｇ／Ｌに達することができる。採取したサンプルを１３倍に希釈して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、結果は、図１０に示されたとおりであり、目的タンパク質は、透明であり、発現上清の純度は、高い。
実施例１１：二価バイエピトープＩＬ５ナノボディの遮断活性の検出
酵母が発現させた上記二価バイエピトープ抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、比較的高純度の抗体を取得した後に遮断活性を検出し、検出方法は、実施例９と同じである。結果は、図１１に示されたとおりであり、酵母が発現させた二価バイエピトープ抗体ＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１の遮断活性（ＩＣ５０＝０．８４１μｇ／ｍＬ）は、対照抗体Ｎｕｃａｌａ（ＩＣ５０＝２．０３５μｇ／ｍＬ）よりも大幅に優れる。
実施例１２：ＴＦ１細胞の増殖に対する二価バイエピトープＩＬ５ナノボディの阻害効果
回復および培養したＴＦ－１細胞（ＩＬ５誘導処理）を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、５ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２０ｍＬの１６４０培地で細胞を再懸濁して計数し、細胞溶液濃度を６×１０５／ｍＬに希釈し、６０ｕＬ／ウェルを９６ウェルプレートに分注し、それぞれ５０ｕＬの段階希釈したＩＬ５抗体を５０ｕＬの２５ｎｇ／ｍＬＩＬ５タンパク質と混合した後、４０ｕＬ混合液を取り、細胞溶液に加え、同時に、細胞ウェルの溶液が蒸発するのを防ぐために、すべての細胞の周囲のウェルに２００ｕＬのＰＢＳを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いて７２時間培養し、細胞培養プレートを取り出し、１０ｕＬ／ウェルのＣＣＫ８溶液を加え，３７℃に置き、４時間発色させ、発色終了後、マイクロプレートリーダーで各ウェルのＯＤ４５０値を読み取る。
結果は、図１２に示されたとおりであり、酵母が発現させた二価バイエピトープ抗体は、ＩＬ５によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を効果的に阻害でき、ＴＦ－１細胞の増殖に対するその阻害活性（ＩＣ５０ ＨｕＮｂ６６－ＨｕＮｂ２１＝０．０５１２ｎＭ）は、対照抗体阻害効果（ＩＣ５０ Ｎｕｃａｌａ＝０．１７８２ｎＭ）よりも優れる。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (15)

  1. 抗ＩＬ５ナノボディであって、
    前記ナノボディは、ＩＬ５に特異的に結合でき、前記ナノボディにおけるＶＨＨ鎖の相補性決定領域ＣＤＲは、
    （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ３、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３、
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ３、ならびに
    （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３からなる群から選択される一つまたは複数であることを特徴とする、抗ＩＬ５ナノボディ。
  2. 前記抗ＩＬ５ナノボディのＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域ＦＲをさらに含み、前記フレームワーク領域ＦＲは、
    （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＦＲ４、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＦＲ４、
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＦＲ４、
    （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＦＲ４、
    （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＦＲ４、ならびに
    （６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＦＲ３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＦＲ４からなる群から選択される一つまたは複数であることを特徴とする
    請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ。
  3. 前記抗ＩＬ５ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５またはその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ。
  4. 抗ＩＬ５抗体であって、
    前記抗体は、請求項１に記載の一つまたは複数の抗ＩＬ５ナノボディを含むことを特徴とする、抗ＩＬ５抗体。
  5. 前記抗体は、単量体、二価抗体および／または多価抗体を含むことを特徴とする
    請求項４に記載の抗体。
  6. 前記抗ＩＬ５抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるようなアミノ酸配列を有する一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含むことを特徴とする
    請求項４に記載の抗体。
  7. 抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質であって、
    Ｎ末端からＣ末端までの前記融合タンパク質の構造は、式ＩａまたはＩｂに示されたとおりであり、
    Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉａ）、
    Ｂ－Ｌ－Ａ（Ｉｂ）、
    ここで、
    Ａは、請求項１に記載の一つまたは複数の抗ＩＬ５ナノボディであり、
    Ｂは、ＩｇＧのＦｃ断片であり、
    Ｌは、なしまたは柔軟性リンカーであることを特徴とする、融合タンパク質。
  8. 前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されたとおりであることを特徴とする
    請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. ポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、請求項４に記載の抗ＩＬ５抗体、または請求項７に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
  10. 発現ベクターであって、
    前記発現ベクターは、請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現ベクター。
  11. 宿主細胞であって、
    前記宿主細胞は、請求項１０に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムには請求項７に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、宿主細胞。
  12. 抗ＩＬ５ナノボディ、抗ＩＬ５抗体またはそのＦｃ融合タンパク質を生成する方法であって、
    （ａ）ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を生成するのに適した条件下で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を含む培養物を取得する段階と、
    （ｂ）前記培養物から前記抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を分離または回収する段階と、ならびに
    （ｃ）任意選択で、精製および／または修飾して段階（ｂ）で得られた抗ＩＬ５ナノボディまたはそのＦｃ融合タンパク質を得る段階とを含むことを特徴とする、抗ＩＬ５ナノボディ、抗ＩＬ５抗体またはそのＦｃ融合タンパク質を生成する方法。
  13. 免疫コンジュゲートであって、
    前記免疫コンジュゲートは、
    （ａ）請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または請求項４に記載の抗ＩＬ５抗体、または請求項７に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質と、ならびに
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
  14. 医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    （ｉ）請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、または請求項４に記載の抗ＩＬ５抗体、または請求項７に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または請求項１３に記載の免疫コンジュゲートと、ならびに
    （ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
  15. 請求項１に記載の抗ＩＬ５ナノボディ、請求項４に記載の抗ＩＬ５抗体、請求項７に記載の抗ＩＬ５ナノボディＦｃ融合タンパク質、または請求項１３に記載の免疫コンジュゲートの用途であって、
    （ａ）ＩＬ５／ＩＬ５Ｒシグナル伝達に関連する疾患または病症を予防および／または治療するための薬物の調製に使用され、（ｂ）ＩＬ５を検出するための試薬、検出プレートまたはキットの調製に使用されることを特徴とする、用途。
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