CN113698498B - 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113698498B
CN113698498B CN202111021192.0A CN202111021192A CN113698498B CN 113698498 B CN113698498 B CN 113698498B CN 202111021192 A CN202111021192 A CN 202111021192A CN 113698498 B CN113698498 B CN 113698498B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
fusion protein
cells
seq
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111021192.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113698498A (zh
Inventor
朱毅敏
高凡
李霖
刘翠娟
秦迎州
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Original Assignee
Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS filed Critical Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority to CN202111021192.0A priority Critical patent/CN113698498B/zh
Publication of CN113698498A publication Critical patent/CN113698498A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113698498B publication Critical patent/CN113698498B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种多肽‑Fc融合蛋白及其制备方法和应用。所述多肽‑Fc融合蛋白包括：多肽和Fc片段，所述多肽为特异性靶向肿瘤细胞的多肽，且所述多肽含有5‑30个氨基酸，所述多肽与Fc片段通过柔性肽段连接。所述多肽‑Fc融合蛋白的制备方法包括：融合蛋白的表达载体构建、融合蛋白的表达和纯化。所述多肽‑Fc融合蛋白介导细胞毒性作用对肿瘤细胞进行杀伤，既保留了融合蛋白的生物学活性，又发挥了Fc段与Fc受体结合的生物学活性。本发明构建的多肽‑Fc融合蛋白分子量小，具有更好的组织穿透性，更易到达肿瘤微环境发挥作用。所述多肽易于筛选，还可以使用多个多肽进行融合构建，提高融合蛋白对肿瘤细胞的特异性和靶向性。

Description

一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
传统的癌症治疗方法包括手术治疗、化学治疗、放射治疗。随着不断地探索，免疫治疗作为一种创新的治疗方法已成为肿瘤治疗研究领域的一大热点。单克隆抗体由于其副作用小、效果好和靶向性强在肿瘤免疫治疗中占据十分重要的地位。
治疗性单克隆抗体通过多种机制发挥抗肿瘤作用，一些体内体外研究表明，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)是多种单克隆抗体发挥抗肿瘤作用的主要机制。研究发现抗PD-L1抗体阿维单抗具有通过ADCC裂解肿瘤细胞的能力，利妥昔单抗在体外通过ADCC介导淋巴瘤细胞的杀伤。
ADCC包括三个组分：表达抗原的靶细胞、表达Fc受体的效应细胞(NK细胞)以及特异性识别抗原的抗体。ADCC的发生依赖于抗体的双功能结构，其Fab段特异性识别和结合靶细胞上的抗原，使ADCC具有特异性，其Fc段与效应细胞上的Fc受体结合，并进一步激活效应细胞。活化的效应细胞释放一些毒性因子对肿瘤细胞进行杀伤，如释放穿孔素来裂解细胞、释放IFN-γ、颗粒酶促进细胞凋亡。
CN109824780A公开了一种用于研发药物的双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白自N端至C端依次包括第一受体片段、IgG1Fc片段和第二受体片段，是一种二聚体结构，所述二聚体通过所述IgG1Fc片段间的二硫键结合，从而可以形成Fc片段，并可以进一步在Fc片段的N端形成两分子的第一受体片段、IgG1Fc片段，在Fc片段的C端形成两分子的第二受体片段。所述双功能融合蛋白能够有效结合第一受体和第二受体，发挥相应的作用，具有良好的生物活性、特异性和稳定性。但是所述双功能融合蛋白的分子量较大，组织穿透力有限。
CN105111315B公开了一种MIP3α-Fc融合蛋白，所述MIP3α-Fc融合蛋白为巨噬细胞炎性蛋白MIP3α和Fc的二聚体融合蛋白，MIP3α与Fc之间通过免疫球蛋白的铰链区或柔性肽段连接。MIP-3α是目前最强的趋化树突状细胞的趋化因子，其特异性受体CCR6高表达于未成熟的树突状细胞，所述MIP3α-Fc融合蛋白通过诱导针对肿瘤细胞的特异性免疫应答发挥抗肿瘤作用。所述MIP3α-Fc融合蛋白在体内外都体现出良好的生物活性和稳定性，有效抑制肿瘤的生长，同时具有长效血浆半衰期。但是所述MIP3α-Fc融合蛋白不具备靶向性。
近年来ADCC也逐渐成为研究热点，通过各种策略来增强ADCC效应，如对抗体Fc段进行点突变或改变糖基化的模式来增强抗体与Fc受体的亲和力。目前单克隆抗体药物已经在多种恶性肿瘤中使用，但依旧存在一些问题，如单克隆抗体的分子量较大，不易穿过肿瘤组织等。
传统的ADCC作用要求靶向分子针对某一特定靶点产生作用，需具有较高的特异性和亲和力；单克隆抗体的靶点不易筛选，在作用于肿瘤细胞时易发生靶标下调的现象，产生免疫逃逸，且单克隆抗体针对的可能是肿瘤相关抗原而非肿瘤特异性抗原，从而对表达靶标的正常细胞产生毒性。
因此，利用特异性靶向肿瘤细胞的多肽，开发蛋白分子量较小，具有更好的组织穿透性，更易到达肿瘤微环境发挥作用的药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用。本发明构建的多肽-Fc融合蛋白介导细胞毒性作用来对肿瘤细胞进行杀伤，既保留了融合蛋白的生物学活性，又发挥了Fc段与Fc受体结合的生物学活性。本发明构建的多肽-Fc融合蛋白分子量小，具有更好的组织穿透性，更易到达肿瘤微环境发挥作用。本发明还提供了一种多肽-Fc融合蛋白依赖的NK细胞介导的细胞毒性作用(Peptide-Fcfusion protein-Dependent Cellular Cytotoxicity，PDCC)在肿瘤治疗中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多肽-Fc融合蛋白，所述多肽-Fc融合蛋白包括：多肽和Fc片段。
其中，所述多肽为特异性靶向肿瘤细胞的多肽，且所述多肽含有5-30个氨基酸。
所述多肽与Fc片段通过柔性肽段连接。
本发明中，所述多肽可特异性靶向肿瘤细胞，保证融合蛋白能够有效地结合肿瘤细胞，所述IgG1的Fc段可以与NK细胞上的活化受体结合，进一步激活NK细胞，释放细胞因子、穿孔素等来杀伤肿瘤细胞。
本发明中所述多肽仅包含5-30个氨基酸，例如可以是5个、10个、12个14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个或30个中任意一种，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。所述多肽分子量较小，相对与大分子量的蛋白而言，小分子多肽更容易穿透组织，更易到达肿瘤微环境发挥作用。从不同患病个体的组织细胞筛选出的相应特异性多肽，通过细菌随机多肽库体外展示方法和流式细胞分选，该筛选方法较为简单，不用知悉具体靶点，可以通过本发明提供的PDCC的平台去进行个性化治疗。
利用本发明提供的PDCC的平台可以在众多类型的肿瘤细胞表面筛选多肽，所述肿瘤细胞包括直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞或膀胱癌细胞中任一项，所述筛选得到的多肽与本发明中的Fc片段通过柔性肽段连接，得到的多肽-Fc融合蛋白能够靶向相对应的肿瘤细胞发挥疾病的治疗作用。
作为本发明的优选技术方案，所述Fc片段包括IgG1的Fc段。
优选地，所述Fc片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明中所述Fc片段的核苷酸序列包括SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。
优选地，所述柔性肽段包括GGSSGGS或(GGGGS)n，其中n为1-3的整数，例如1、2或3中任一项，所述柔性肽段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO.8为GGSSGGS。
SEQ ID NO.9为GGGGSGGGGS。
SEQ ID NO.10为GGGGSGGGGSGGGGS。
柔性肽段有利于融合蛋白形成正确的空间结构，更好地发挥生物学活性。
优选地，所述Fc片段的C端连接His标签。
优选地，所述多肽的N端连接信号肽。
优选地，所述信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2为MEFGLSWVFLVAIIKGVQC。
本发明中所述信号肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
本发明中信号肽的核苷酸序的5’端ATGG与kozak序列的ATGG共用。
优选地，所述信号肽的N端连接Kozak序列。
优选地，所述Kozak序列的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.3为GCCACCATGG。
优选地，所述多肽-Fc融合蛋白包括依次连接的Kozak序列、信号肽、多肽、柔性肽段、Fc片段和His标签。
作为本发明的优选技术方案，所述多肽为5-20个氨基酸的特异性靶向肿瘤细胞的多肽。
优选地，所述多肽包括A1多肽，所述A1多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4为WFCSWYGGDTCVQ。
本发明中所述A1多肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供了一种核酸片段，所述核酸片段包含编码如第一方面所述的多肽-Fc融合蛋白的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核酸片段。
第四方面，本发明提供了一种重组的宿主细胞，所述重组的宿主细胞含有如第二方面所述的核酸片段或如第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述多肽-Fc融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括：
构建表达所述多肽-Fc融合蛋白的表达载体，而后，表达并纯化得到所述多肽-Fc融合蛋白。
作为本发明的优选技术方案，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以重叠延伸PCR的方法构建表达如第一方面所述的多肽-Fc融合蛋白的表达载体。
(2)将所述表达载体转化到用于克隆的宿主细胞中，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌。
(3)从所述阳性转化菌中提取所述表达载体，并转化到用于表达的宿主细胞中，对所述用于表达的宿主细胞扩大培养，诱导表达所述多肽-Fc融合蛋白，而后进行纯化，得到所述多肽-Fc融合蛋白。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)所述表达载体在包括质粒pcDNA3.4或pcDNA3.1。
优选地，步骤(2)所述用于克隆的宿主细胞包括大肠杆菌DH5α、TOP10或Stbl3中的任意一种。
优选地，步骤(3)所述用于表达的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
优选地，所述真核细胞包括Expi-CHO细胞或293T细胞。
优选地，步骤(3)所述纯化的方法包括利用Protein A磁珠纯化或亲和凝胶层析中的任意一种。
优选地，步骤(1)中所述重叠延伸PCR的引物包括正向引物1、正向引物2和反向引物。
优选地，所述正向引物1包括SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
优选地，所述正向引物2包括SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
优选地，所述反向引物包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
第五面，本发明提供了一种如第一方面所述的多肽-Fc融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为激活NK细胞、诱导NK细胞发挥细胞毒性作用的药物。
类似于抗体介导细胞依赖的细胞毒性作用，本发明所构建的多肽-Fc融合蛋白也可以介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中构建一个多肽-Fc融合蛋白介导细胞毒性作用来对肿瘤细胞进行杀伤，既保留了融合蛋白的生物学活性，又发挥了Fc段与Fc受体结合所产生的生物学活性。所述多肽可特异性靶向肿瘤细胞，保证融合蛋白能够有效地结合肿瘤细胞，所述IgG1的Fc段可以与NK细胞上的活化受体结合，进一步激活NK细胞，释放细胞因子、穿孔素等来杀伤肿瘤细胞；柔性肽段有利于融合蛋白的两种成分形成正确的空间结构，更好地发挥生物学活性；利用本发明提供的PDCC的平台可以在众多类型的肿瘤细胞表面筛选多肽，所述肿瘤细胞包括直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞或膀胱癌细胞中任一项，所述筛选得到的多肽与本发明中的Fc片段通过柔性肽段连接，得到的多肽-Fc融合蛋白能够靶向相对应的肿瘤细胞发挥疾病的治疗作用。
(2)本发明提供了一种多肽-Fc融合蛋白依赖的NK细胞介导的细胞毒性作用在肿瘤治疗中的应用。本发明所构建的多肽-Fc融合蛋白也可以介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，而相比于抗体(即抗体介导细胞依赖的细胞毒性作用)，本发明构建的多肽-Fc融合蛋白分子量小，具有更好的组织穿透性，更易到达肿瘤微环境发挥作用；并且，所述多肽-Fc融合蛋白中的多肽易于筛选，可以使用多个多肽进行融合构建，提高融合蛋白对肿瘤细胞的特异性和靶向性，应用针对细胞和/或蛋白质分子的多肽构建PDCC发挥疾病的治疗作用，拓展了PDCC的应用范围。
附图说明
图1为实施例1中制备得到的融合质粒的结构图。
图2为本发明中提供的A1多肽-Fc融合蛋白的结构示意图。
图3为本发明中提供的A1多肽-Fc融合蛋白的作用机制示意图。
图4为实施例2中SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中泳道M：Marker，泳道1：培养基上清，泳道2：结合流穿，泳道3：洗涤流穿，泳道4：磁珠，泳道5：目的蛋白。
图5为实施例2中蛋白免疫印迹(Western Blot)验证目的蛋白图；其中泳道1：细胞裂解液，泳道2：目的蛋白(细胞)，泳道3：培养基上清，泳道4：目的蛋白(上清)。
图6为实施例3中不同浓度的A1多肽-Fc融合蛋白对A549细胞和NK细胞的靶向结合能力统计图。
图7为实施例4中A1多肽-Fc融合蛋白介导的细胞杀伤活性检测图。
图8为实施例4中A1多肽-Fc融合蛋白介导的NK细胞活化检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，所用实验试剂和耗材均可购自本领域常规生产厂商；所用实验方法，若无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的实验方法。
实施例1
本实施例的目的在于提供一种编码A1多肽-Fc融合蛋白表达载体的构建方法。
(1)PCR扩增目的基因
以重叠延伸PCR的方法构建表达所述A1多肽-Fc融合蛋白的表达载体，第一次PCR反应的模板是pcDNA3.4-IgG1质粒，pcDNA3.4-IgG1质粒的骨架为pcDNA3.4质粒，该质粒包含完整的IgG1序列，不包含多肽序列。
第一次扩增的正向引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，该引物包括A1多肽、GGS柔性接头序列及一部分模板序列，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，反向引物包含一部分模板互补序列、His标签、BamHI酶切位点及酶切保护碱基，PCR反应体系如表1所示，经过如表2所示的PCR循环条件反应后，得到PCR产物1。
表1
试剂 使用量
5×Q5缓冲液 10μL
PCR正向引物1 2μL
PCR反向引物 2μL
dNTP 1μL
DNA聚合酶 0.5μL
PcDNA3.4-IgG1模板 1μL
双蒸水 33.5μL
表2
第二次PCR反应的模板是PCR产物1，正向引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，正向引物2包括HindIII酶切位点及酶切保护碱基、Kozak序列、信号肽及一部分与正向引物1重叠序列，第二次PCR的反向引物与第一次的反向引物相同，PCR反应体系如表3所示，经过如表2所示的PCR循环条件反应后，得到PCR产物2。PCR产物2包含Kozak序列、信号肽、A1多肽、IgG1 Fc段和His标签。
表3
试剂 使用量
5×Q5缓冲液 10μL
PCR正向引物2 2μL
PCR反向引物 2μL
dNTP 1μL
DNA聚合酶 0.5μL
PCR产物1模板 1μL
双蒸水 33.5μL
(2)酶切连接目的基因与载体
PCR产物2用PCR纯化试剂盒回收并测定浓度，双酶切PCR产物2与pcDNA3.4载体，将酶切后的目的基因插入pcDNA3.4载体中，酶切体系如表4所示，连接体系如表5所示。酶切条件为37℃，20min。连接反应条件为16℃，16h；65℃，10min，4℃保存。经过上述酶切连接目的基因与载体后得到连接产物。
表4
试剂 使用量
10×Cutsmart buffer 5μL
PCR产物/pcDNA3.4载体 1μg
HindIII酶 1μL
BamHI酶 1μL
双蒸水 加至50μL
表5
试剂 使用量
5×T4 ligation buffer 4μL
Vector DNA 20ng
Insert DNA 9ng
T4 DNA ligase 1μL
双蒸水 加至20μL
(3)连接产物的热激转化及验证
将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出，迅速插入冰上，5min后待菌块融化，加入连接产物并用手拨打离心管底轻轻混匀，冰中静置25min。42℃水浴热激45s，迅速放回冰中并静置2min。向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5000rpm离心1min后收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含氨苄的LB固体培养基上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
次日，挑单克隆摇菌进行测序验证，所述质粒的图谱如图1所述，序列验证正确说明本实施例中成功构建了融合质粒A1-Fc pcDNA3.4。
实施例2
本实施例的目的在于提供一种A1多肽-Fc融合蛋白的表达及纯化及验证方法。
(1)融合蛋白的表达
为保证融合蛋白的正确加工及包装，保证融合蛋白的生物活性，采用Expi-CHO细胞表达系统做真核表达。如图2所示，在A1多肽-Fc融合蛋白的示意图中，A1多肽与Fc片段通过柔性肽段形成正确的空间结构，更好地发挥生物学活性。如图3所示，A1多肽-Fc融合蛋白与NK细胞和肿瘤细胞相结合，通过激活NK细胞、诱导NK细胞发挥细胞毒性作用。
转染Expi-CHO细胞：
将前一天培养的Expi-CHO细胞用37℃预热的新鲜Expi-CHO表达培养基重新稀释至6×106个/mL，25mL放于培养箱中备用。
配制DNA稀释液：将20μg DNA置于离心管中，加入1mL OptiPRO培养基，翻转数次混匀，放置待用。迅速配制转染试剂稀释液：加入80μL ExpiFectamineTMCHO Reagent(转染试剂)于离心管中，加入920μL OptiPRO培养基，翻转数次混匀，将转染试剂稀释液加入质粒A1-Fc pcDNA3.4稀释液中，翻转离心管数次混匀，放置5min，待用。
取出提前准备好的细胞，将质粒A1-Fc pcDNA3.4/转染试剂混合液缓慢滴加进细胞中，在此过程中，不断摇晃细胞培养瓶混匀。将细胞放置于37℃，8％CO2培养箱中，125rpm振荡培养。
转染22h后加入150μL ExpiFectamineTMCHO Enhancer(转染增强试剂)和6mLExpiCHOTMFeed(补料)，继续放置于37℃，8％CO2培养箱中，125rpm振荡培养7d，收集培养基，5000rpm离心20min去除细胞沉淀，收上清备用。
(2)融合蛋白的纯化
融合蛋白通过BEAVER Protein A磁珠纯化：将Protein A纯化磁珠漩涡振荡30s，使磁珠充分重悬；取500μL 10％(v/v)磁珠悬液置于另一新的15mL离心管中。对磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液，用5mL Binding buffer(PBST(pH 7.2)：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2.0mM KH2PO4，质量分数0.1％Tween-20)洗涤2次，磁性分离，管中磁珠可直接用于抗体分离。
在预处理的磁珠管中加入10mL收集的上清液，漩涡振荡均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和磁珠充分接触并吸附，翻转约15min后进行磁性分离，收集上清液。
向离心管中加入1mL Washing buffer(PBST(pH7.2):137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2.0mM KH2PO4，质量分数0.1％Tween-20)，振荡重悬磁珠后进行磁性分离，收集上清液；该操作重复3次。
在上述完成磁珠洗涤的离心管中加入1.0mL Elution buffer(100mM Gly，质量分数0.1％Tween-20，pH2.5)，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，翻转10min后进行磁性分离，收集上清液至新的离心管。在蛋白洗脱液中加入一定量的Neutrilization buffer(1.0M Tris-HCl，pH9.0)，一般为蛋白洗脱体积的1/10，最终使洗脱的A1多肽-Fc融合蛋白的pH值保持中性环境，以利于维持蛋白的生物活性，避免蛋白失活。
(3)SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白
制备A1多肽-Fc融合蛋白样品：吸取30μL A1多肽-Fc融合蛋白样品于离心管中，加入10μL上样缓冲液(4倍稀释)。混匀后，100℃水浴加热10min，使蛋白变性。冷却至室温后，10000rpm离心5min，取上清直接上样电泳，左侧加入8μL蛋白marker来比对大小。
电泳：同时电泳两块凝胶，加样完毕后，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在80V，大约20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到120V，电泳过程保持电压稳定。
电泳结束后，关掉电源，进行染色、脱色。如图4所示，目的蛋白条带约为35KD，可以看到与目的蛋白条带大小相对应的较为清晰的条带，可以初步证明，A1多肽-Fc融合蛋白表达纯化成功，为了进一步验证条带的正确性，进行蛋白免疫印迹(Western Blot)，将凝胶和膜按顺序装于电转仪中，接通电源，100V恒压70min。
转膜完成后，将膜放入含有质量分数为5％脱脂奶粉的TBST室温封闭2h。
孵育一抗：将膜用TBST洗3次，每次5min，把抗His标签的小鼠单抗用TBST按1/1000稀释后与膜置于杂交带中，4℃过夜旋转孵育。
孵育二抗：用TBST重复洗膜3次，每次5min，将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗用TBST按1/8000稀释，与膜置于杂交带中，室温孵育1h。
显色：膜用TBST洗3次，每次5min，将WB显色液A、B按1:1的比例混合好后均匀的滴加在膜上，压平后成像，
如图5所示，条带与抗体产生了特异性结合，进一步说明该条带确实是目的蛋白条带，A1多肽-Fc融合蛋白表达纯化成功。
用BCA法对检测纯化后的蛋白测定浓度，分装至合适用量，冻干保存，备用。
实施例3
本实施例用于A1多肽-Fc融合蛋白的靶向结合能力检测的实验方法及实验结果分析。
将A549细胞和H460细胞培养于含质量分数的10％胎牛血清和质量分数的1％双抗(青霉素与链霉素)RPMI-1640完全培养基，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度达到80％-90％。
用PBS清洗两遍，用胰蛋白酶消化，300g离心，用PBS清洗两遍，并用PBS调整细胞密度为2×105/mL，取100μL细胞，加入96孔板过夜培养，每孔铺板2万个细胞；
取20万个从志愿者血液中分离、诱导、扩增的NK细胞，300g离心，用PBS清洗两遍，并用PBS调整细胞密度为2×105/mL，取100μL细胞，加入96孔板过夜培养，每孔铺板2万个细胞。
将之前准备好的冻干A1多肽-Fc融合蛋白用PBS复溶成不同浓度，0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。离心去除前一天96孔板中NK细胞、H460细胞、A549细胞的培养基上清，加入不同浓度的A1多肽-Fc融合蛋白溶液，室温孵育1h。
检测抗体用的是PE标记的羊抗人Fc抗体，加入PE标记的羊抗人Fc抗体，室温孵育30min，离心去除上清，PBS清洗两次，加入100μL PBS，用酶标仪检测各孔荧光强度。
如图6所示，A1多肽-Fc融合蛋白对A549细胞和NK细胞的特异性随蛋白浓度的增加逐渐增强，而对照细胞H460没有明显变化，说明构建的A1多肽-Fc融合蛋白可以特异性结合A549细胞和NK细胞。
实施例4
本实施例用于A1多肽-Fc融合蛋白的肿瘤杀伤能力检测的实验方法及实验结果分析。
靶细胞使用的是可以稳定表达荧光素酶(luc)的A549细胞。
将A549-luc细胞培养于含质量分数的10％胎牛血清和质量分数的1％双抗(青霉素与链霉素)RPMI-1640完全培养基，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度达到80％-90％。用PBS清洗两遍，用胰蛋白酶消化，300g离心，用PBS清洗两遍，并用PBS调整细胞密度为2×105/mL，取100μL细胞，加入96孔板过夜培养，每孔铺板2万个细胞；
将之前准备好的冻干A1多肽-Fc融合蛋白用RPMI-1640完全培养基复溶成0μg/mL、50μg/mL，去除前一天96孔板中的培养基上清，一组加入50μg/mL复溶的蛋白溶液(A549+蛋白)，一组加入0μg/mL复溶的蛋白溶液(A549)，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养1h。
效应细胞选用分离培养的NK细胞，按效靶比为20：1进行孵育，孵育24h后。取出上清用于检测IFN-γ，每孔剩余活细胞用于检测A1多肽-Fc融合蛋白的肿瘤杀伤能力。
(1)A1多肽-Fc融合蛋白的肿瘤杀伤能力检测
向96孔板中加入D荧光素钾，37℃孵育5min，酶标仪检测每孔剩余活细胞的生物发光强度。
可以看到如图7所示，未加入A1多肽-Fc融合蛋白的条件下，NK细胞对肿瘤细胞的裂解率为40.45％，加入A1多肽-Fc融合蛋白的条件下，NK细胞对肿瘤细胞的裂解率为74.74％，在A1多肽-Fc融合蛋白存在的情况下，NK细胞对A549细胞的杀伤能力明显增强，说明A1多肽-Fc融合蛋白可以特异性介导NK细胞对A549产生PDCC作用。
(2)细胞培养上清中IFN-γ的测定
IFN-γ的检测可以通过ELISA的方法进行，ELISA测试方法采用如下步骤进行。
在预包被IFN-γ捕获抗体的96孔板上加入300μL洗脱缓冲液，浸泡30s后倒去缓冲液，并在无纺布上面拍去残留液体。每孔依次加入50μL实验缓冲液，50μL样本上清以及实验缓冲液稀释的IFN-γ检测抗体50μL，150rpm振荡，室温孵育120min。弃掉液体，每孔加入200μL洗液洗板，洗涤4次，每次1min，在无纺布上拍干。
实验缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的链亲和素，每孔加入100μL，150rpm振荡，室温孵育45min，弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次，每次1min，在无纺布上拍干。每孔加入100μL显色底物TMB，室温避光孵育约45min，每孔按次序加入100μL终止液，在30min之内用酶标仪测定450nm波长处的光吸收，并以测定570nm处的光吸收作为对照。光吸收值与IFN-γ标准曲线对比即可得出细胞培养上清中的IFN-γ的含量。
标准曲线的绘制采用IFN-γ标准样品进行。取500pg/mL IFN-γ储存液，采用梯度稀释的方法稀释样本，设置因子梯度为：1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.63pg/mL。
如图8所示，在A1多肽-Fc融合蛋白存在的情况下，NK细胞被激活并产生IFN-γ，其样本中IFN-γ的含量达到367.64±28.87pg/mL，而没有加入A1多肽-Fc融合蛋白的样本中，IFN-γ的含量为123.71±11.62pg/mL，表明A1多肽-Fc融合蛋白可以激活NK细胞产生IFN-γ，能够特异性介导NK细胞对A549的裂解。
此外，本发明中以A1多肽为例阐述了所述多肽-Fc融合蛋白在肿瘤治疗中的作用，其他通过细菌随机多肽库体外展示方法分选得到的5-30个氨基酸的特异性靶向肿瘤细胞的多肽，也可以通过本发明提供的PDCC的平台去对相应的肿瘤细胞发挥治疗作用。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
gccaccatgg 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 4
Trp Phe Cys Ser Trp Tyr Gly Gly Asp Thr Cys Val Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
gcagtggttc tgcagctggt acggcggcga cacctgcgtg cagggcggaa gtaagggcgg 60
cagttctggc gggtctaggg agcctaag 88
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
caccaagctt gccaccatgg agttcgggct gagctgggtg tttctggtgg ccatcatcaa 60
gggcgtgcag tgcagcgggc agtggttctg 90
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
cggtggatcc tcagtgatgg tggtggtggt ggatgtcgct gccgccgtcg atcttcccgg 60
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 8
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
agggagccta agtcttgcga caaaacacat acctgtccac cctgccccgc tcccgaactg 60
ctgggaggac cctcagtgtt cctgtttccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc 120
agaacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaaa 180
tttaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaaacc cagagaggaa 240
cagtataaca gtacatacag agtggtgagc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 300
aacggcaagg agtacaaatg caaggtgagc aacaaggccc tgccagcccc cattgagaaa 360
accatcagca aagccaaggg ccagcccagg gaaccacagg tgtacaccct gccccccagc 420
agagaagaaa tgaccaagaa ccaggtgagc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 480
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg aaaacaacta caaaaccacc 540
ccccccgtgc tggacagcga cggatctttt tttctgtact ccaagctgac cgtggacaag 600
agccgctggc agcagggaaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 660
cactataccc agaagtcact gtccctgagc cccgggaaga 700
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 12
atggagttcg ggctgagctg ggtgtttctg gtggccatca tcaagggcgt gcagtgc 57
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 13
agcgggcagt ggttctgcag ctggtacggc ggcgacacct gcgtgcaggg cggaagtaag 60

Claims (13)

1.一种多肽-Fc融合蛋白，其特征在于，所述多肽-Fc融合蛋白包括依次连接的Kozak序列、信号肽、多肽、柔性肽段、Fc片段和His标签；
所述Kozak序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述多肽为特异性靶向肿瘤细胞的多肽，所述多肽为A1多肽，所述A1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述Fc片段为IgG1的Fc段，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述柔性肽段为GGSSGGS或(GGGGS)n，其中n为1-3的整数。
2.一种编码如权利要求1所述的多肽-Fc融合蛋白的核酸。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞含有如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的表达载体。
5.一种如权利要求1所述的多肽-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
构建表达所述多肽-Fc融合蛋白的表达载体，而后，表达并纯化得到所述多肽-Fc融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以重叠延伸PCR的方法构建表达如权利要求1所述的多肽-Fc融合蛋白的表达载体；
(2)将所述表达载体转化到用于克隆的宿主细胞中，筛选阳性转化菌；
(3)从所述阳性转化菌中提取所述表达载体，并转化到用于表达的宿主细胞中，对所述用于表达的宿主细胞扩大培养，诱导表达所述多肽-Fc融合蛋白，而后进行纯化，得到所述多肽-Fc融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体包括质粒pcDNA3.4或pcDNA3.1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述用于克隆的宿主细胞包括大肠杆菌DH5α、TOP10或Stbl3中的任意一种。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述用于表达的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述真核细胞包括Expi-CHO细胞或293T细胞。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化的方法包括Protein A磁珠纯化或亲和凝胶层析。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述重叠延伸PCR的引物包括正向引物1、正向引物2和反向引物；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
13.一种如权利要求1所述的多肽-Fc融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为激活NK细胞、诱导NK细胞发挥细胞毒性作用的药物。
CN202111021192.0A 2021-09-01 2021-09-01 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用 Active CN113698498B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111021192.0A CN113698498B (zh) 2021-09-01 2021-09-01 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111021192.0A CN113698498B (zh) 2021-09-01 2021-09-01 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113698498A CN113698498A (zh) 2021-11-26
CN113698498B true CN113698498B (zh) 2023-10-03

Family

ID=78658804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111021192.0A Active CN113698498B (zh) 2021-09-01 2021-09-01 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113698498B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382175A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用
CN103864924A (zh) * 2014-02-14 2014-06-18 中国科学院微生物研究所 一种中东呼吸综合征冠状病毒抗体及其制备方法
CN113214394A (zh) * 2020-10-30 2021-08-06 上海洛启生物医药技术有限公司 抗il5纳米抗体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382175A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用
CN103864924A (zh) * 2014-02-14 2014-06-18 中国科学院微生物研究所 一种中东呼吸综合征冠状病毒抗体及其制备方法
CN113214394A (zh) * 2020-10-30 2021-08-06 上海洛启生物医药技术有限公司 抗il5纳米抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Targeting lymphoma with precision using semisynthetic anti-idiotype peptibodies;James Torchia等;《PNAS》;20160510;第113卷(第19期);第5376-5381页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113698498A (zh) 2021-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6636066B2 (ja) ヒトｐ１８５及び血管内皮増殖因子の両方を標的とする抗体及びその適用
CN107903324B (zh) 一种结合人cd19和cd3的双特异性抗体
KR100981356B1 (ko) 신호서열 및 변이된 신호서열로 디자인된 분비증강자에의한 원래 형태의 수용성 재조합 단백질 생산 방법
TW201831516A (zh) 抗gpc3抗體
CN106892980B (zh) 抗vegfr2单克隆抗体及其应用
CN106589129A (zh) 一种结合cd19、cd3和cd28的三功能分子及其应用
CN109336980B (zh) 一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
Piatesi et al. Directed evolution for improved secretion of cancer–testis antigen NY-ESO-1 from yeast
CN114516921A (zh) 基于单链抗体片段的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用
CN108264560B (zh) 一种结合cd3和cd28的双功能分子及其应用
WO2019109954A1 (zh) PD-1-Fc融合蛋白及其制备方法和用途
CN113698498B (zh) 一种多肽-Fc融合蛋白及其制备方法和应用
CN113292652A (zh) 具有增强的adcc效应的抗cd70抗体及其应用
KR102100813B1 (ko) C형 간염바이러스 유래 융합 단백질 및 이를 포함하는 진단키트
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN110903402A (zh) 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
CN110615847A (zh) TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用
CN111763255B (zh) 一种经基因修饰的vegfa蛋白及其单克隆抗体与应用
CN109053875A (zh) 突变型igf-1、重组质粒、重组蛋白及应用
CN113999306B (zh) 一种获得识别空间构象表位抗体的方法
Bilbao et al. Genetically engineered intracellular single-chain antibodies in gene therapy
US20240190934A1 (en) Engineered interleukin-10 and fusion proteins thereof
CN111116733B (zh) 一种靶向程序性死亡受体1和pd-1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体
CN111705065B (zh) 一种抗kras突变体单克隆抗体及其用途
US20240218030A1 (en) Mutated ferritin protein

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant