JP6636066B2

JP6636066B2 - ヒトｐ１８５及び血管内皮増殖因子の両方を標的とする抗体及びその適用

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Publication number: JP6636066B2
Application number: JP2018016826A
Authority: JP
Inventors: 洋楊; 偉尹
Original assignee: Ｓｕｎ−ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌＤｅｖｉｃｅ株式会社
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2020-01-29
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Description

本発明は、バイオ医薬品の分野に関するものであり、より具体的には、ヒトp185及び血管内皮増殖因子を同時に標的とする抗体及びその適用に関するものである。

悪性腫瘍は種々の腫瘍原性因子により誘導される新生物であり、局所的な組織細胞の増殖により特徴づけられる。2015年に中国で新たに発症した癌の症例数は4,292,000例であり、ヒトの健康に深刻な影響を及ぼしている。

腫瘍の分子生物学的研究により、ヒト上皮増殖因子受容体（HER2）遺伝子であるMyc遺伝子及び細胞シグナル伝達経路の障害を誘発するその他の発癌遺伝子の異常な活性化が確認されており、それによる細胞増殖の誘導が腫瘍発生の分子的メカニズムである。HER2は上皮増殖因子受容体（EGFR）ファミリーのメンバーであり、ヒト染色体17q21上に位置する。HER2は、1255個のアミノ酸で構成されチロシンプロテインキナーゼ活性を有する膜貫通蛋白質のp185をコードする。p185は、細胞外リガンド結合ドメイン、一本鎖膜貫通領域及び細胞内プロテインチロシンキナーゼ領域（アミノ酸720〜987位）で構成される。過剰活性化されたp185蛋白質は、膜受容体チロシンプロテインキナーゼシグナル伝達経路（Ras / Raf / MAPK）、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K / AKT）シグナル伝達経路及び転写活性化（STAT）シグナル伝達経路の活性化を介した細胞増殖の促進において重要な役割を果たす。

腫瘍細胞の無限増殖においては、大量の栄養が消費される。腫瘍増殖の初期段階においては、周囲組織の浸潤が、その増殖を維持する栄養の提供に関与する。腫瘍が2.0 mm³の大きさに成長すると、新たな血管が中に成長するか、又は栄養補給の欠如により中心部分が壊死する。この状況下では腫瘍組織が増殖を維持することは困難である。腫瘍細胞により分泌される血管内皮増殖因子（VEGF）は重要な血管新生因子であり、腫瘍血管新生において最も強力かつ最も特異的な増殖因子である。VEGF遺伝子は染色体6p21.3に位置し、8個のエクソン及び7個のイントロンからなる。この遺伝子は二量体の糖蛋白質をコードする。VEGFは内皮細胞内の細胞内Ca²⁺濃度を増加させるだけでなく、微小血管の巨大分子透過性も増加させる。

腫瘍分子生物学的研究の進歩により、抗がん剤の研究・開発コンセプトの刷新についての確固たる科学的根拠がもたらされている。現在、抗腫瘍薬研究・開発の焦点は、従来の細胞傷害性薬剤の研究・開発から、機能障害をきたした細胞シグナル伝達経路の重要な要素を標的とする新世代の抗腫瘍薬の開発に移行している。標的特異的抗腫瘍薬、特に正常細胞と腫瘍細胞の間の遺伝子発現の違いに基づく抗体薬は、治療効果の特異性が高く毒性が低い。例えば、HER2を標的とする抗体薬（トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）；例えば、特許文献１及び２参照）、VEGFを標的とする抗体薬（ベバシズマブ（商品名：アバスチン）；例えば、特許文献３参照）が既に上市されている。

特許第３０４０１２１号公報特許第４１２４４８０号公報特許第３３９８３８２号公報

本発明により解決されるべき技術的問題は、p185及びVEGFの両方に対して生物学的特異性を示す抗体の提供、並びに臨床での抗腫瘍薬の欠如に対するその利用である。

本発明者らは、分子生物学的技術により、それぞれヒトp185及びヒトVEGFを標的とする異なった抗体配列を合成した。抗体親和性及び阻害効率をin vitroで確認した後、DNA組換え技術により組換えDNAを調製し、哺乳類細胞に遺伝子導入して二重特異性抗体を発現させた。精製、同定及びスクリーニング後に、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする抗体が得られた。この抗体は、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする生物学的作用を有していた。即ち、本二重特異性抗体は、ヒトp185及びヒトVEGFに同時に結合し、腫瘍細胞増殖を抑制する作用があることを確認して、本発明を完成するに至った。

本発明は、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体を提供する。この抗体は、以下の4つのペプチド鎖で構成される。
（1）2本の同一の抗体軽鎖
（2）2本の同一の抗体重鎖
ここで、抗体軽鎖は、
（1-1）ヒトp185を抗原として認識する軽鎖可変領域、及び
（1-2）軽鎖定常領域
を含む。
一方、抗体重鎖は、
（2-1）ヒトp185を抗原として認識する重鎖可変領域、
（2-2）重鎖定常領域、
（2-3）可動性ペプチド、及び
（2-4）以下のいずれかのヒトVEGF結合ドメイン：
（a）ヒトVEGFを抗原として認識する抗体の一本鎖可変領域断片（scFv）、又は
（b）ヒトVEGFに結合する受容体の抗原結合ドメイン
を含む。

本発明において、抗体軽鎖は、ヒトp185を抗原として認識できる抗体の軽鎖であれば特に限定されず、p185タンパク質の任意の領域（N末端からC末端まで）を抗原決定基（エピトープ）として認識してもよい。好ましくは、本発明の抗体軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の1-107位の配列を可変領域として含むものである。該抗体軽鎖は任意の適切な定常領域を含むことができ、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の108-214位の配列を挙げることができる。より好ましくは、本発明の抗体軽鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである。

本発明において、抗体重鎖の上記（2-1）及び（2-2）の領域は、ヒトp185を抗原として認識できる抗体の重鎖であれば特に限定されず、上記抗体軽鎖と同一のエピトープを認識する限り、p185タンパク質の任意の領域（N末端からC末端まで）をエピトープとして認識してよい。好ましくは、本発明の抗体重鎖の上記（2-1）及び（2-2）の領域は、配列表の配列番号２〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列の1-449位の配列を有するものである。

本発明において、抗体重鎖の上記（2-3）の可動性ペプチドは、上記（2-4）のヒトVEGF結合ドメインを、その機能（ヒトVEGFに結合し、そのシグナル伝達を阻害する機能）を保持した状態で、上記（2-2）の重鎖定常領域と連結させ得るリンカーペプチドとして機能する限り、任意のアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。好ましくは、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６）のアミノ酸配列を有するものである。

本発明において、抗体重鎖の上記（2-4）（a）の一本鎖可変領域断片（scFv）は、ヒトVEGFを抗原として認識できる任意の抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを適当なリンカーを介して連結したものであれば特に限定されず、ヒトVEGFタンパク質の任意の領域（N末端からC末端まで）をエピトープとして認識する抗体由来のものであってよい。軽鎖可変領域と重鎖可変領域の配置は特に限定されず、どちらがN末端側（可動性ペプチドと連結する側）でもC末端側でもよい。好ましくは、軽鎖可変領域として、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の465-587位（配列番号３に示されるアミノ酸配列の588-710位）の配列、重鎖可変領域として、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の604-710位（配列番号３に示されるアミノ酸配列の465-571位）の配列を有するものである。また、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを繋ぐリンカーペプチドは、両可変領域がヒトVEGFに結合し、そのシグナル伝達を阻害する機能を保持した立体構造をとり得る限り、任意のアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。好ましくは、GGGSGGGSGGGSGGGS（配列番号７）のアミノ酸配列を有するものである。より好ましくは、本発明の抗体重鎖のscFv領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の465-710位、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の465-710位の配列を有するものである。

本発明において、抗体重鎖の上記（2-4）（b）のヒトVEGFに結合する受容体の抗原結合ドメインとしては、ヒトVEGFに対して結合能を有する限りいかなる受容体由来であってもよいが、好ましくはVEGFR1又はVEGFR2のVEGF認識領域である。好ましくは、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の465-653位の配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の465-676位の配列を有するものである。

より好ましくは、本発明の抗体重鎖は、配列表の配列番号２〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するものである。

本発明は、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とし、p185及びVEGFを特異的に認識する生物学的機能を有する二重特異性抗体を提供するものである。配列の融合は蛋白質の分泌に影響を及ぼすものではなく、空間的構造及び機能の観点でVEGF及びp185を特異的に認識する能力は維持される。

本発明はまた、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を標的とする上記の二重特異性抗体をコードする核酸を提供する。該核酸は、抗体軽鎖をコードする核酸と抗体重鎖をコードする核酸の組み合わせからなる。これらの核酸は、本発明の二重特異性抗体の組換え製造のため、宿主細胞内で機能的なプロモーターを含むベクター中に挿入され得る。従って、本発明はまた、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。該発現ベクター中で、上記の核酸は、プロモーターに機能的に連結している。軽鎖のコードする核酸と重鎖をコードする核酸とは、別々のベクター中に挿入されてもよいし、同一ベクター中に挿入されてもよい。同一ベクター中に挿入される場合、両核酸は、モノシストロニックに発現する形態でベクターに挿入されてもよいし、ジシストロニックに発現する形態で挿入されてもよい。該発現ベクターとして、宿主細胞で機能的なプロモーターに加えて、発現した抗体軽鎖及び重鎖が宿主細胞から培養液中に分泌されるように、分泌リーダー配列をさらにコードする分泌発現ベクターを用いることもできる。

本発明はまた、上記の発現ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を提供する。該発現ベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞の種類に応じて、自体公知の方法を適宜選択して実施することができる。得られた形質転換体を、宿主細胞の培養に適した公知の培地を用いて、公知の培養条件にて培養し、得られた培養物から二重特異性抗体を採取することにより、該抗体を製造することができる。

本発明の二重特異性抗体は、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を標的とし、それらが関与するシグナル伝達経路を阻害することができるので、該シグナル伝達経路の異常亢進を伴う疾患、好ましくは各種の癌、より好ましくは肺癌、乳癌及び胃癌の治療又は予防のための医薬として使用することができる。該抗体は、抗体医薬の製造において、通常用いられる医薬上許容される担体とともに製剤化することができる。このようにして得られた本発明の二重特異性抗体を含有する医薬は、一般的な用量及び投与経路でヒトに投与することができる。

本発明によれば、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的として結合し、親和性が高く、蛋白質レベルでp185及びVEGF蛋白質を効果的に阻害する作用を有する二重特異性抗体が提供される。この抗体はp185及びVEGF蛋白質の両方に結合するか、又は他方の蛋白質の結合に影響を及ぼすことなく一方の蛋白質に結合する。すなわち、p185及びVEGFへの同時結合能を有する。この抗体は、p185及びVEGFを同時に標的とする抗体がないというギャップを埋めるものである。この二重特異性抗体は、血管内皮細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト乳癌細胞及びヒト胃癌細胞の増殖を抑制する。T細胞刺激アッセイにより、本二重特異性抗体は、Tリンパ球によるIFN-γ発現を促進することが示された。

図1は、ヒトP185及びヒトVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体の構造模式図である。図2は、ヒトp185及びヒトVEGFを標的とする二重特異性抗体（軽鎖配列は配列番号１、重鎖配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる）が、ヒトp185及びヒトVEGF蛋白質に対して高い親和性を有することを示す。図3は、ヒトp185及びヒトVEGFを標的とする二重特異性抗体（軽鎖配列は配列番号１、重鎖配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる）が、ヒトp185及びヒトVEGFを効果的に認識する作用を有することを示す。図4は、ヒトp185及びヒトVEGFを標的とする二重特異性抗体（軽鎖配列は配列番号１、重鎖配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる）が、血管内皮細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト乳癌細胞及びヒト胃癌細胞の増殖を抑制したことを示す（検出時間：投与後96時間）。図5は、ヒトp185及びヒトVEGFを標的とする二重特異性抗体（軽鎖配列は配列番号１、重鎖配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる）が、ヒトTリンパ球によるIFN-γ分泌を促進することを示す。

本発明は、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体を提供するものである。この二重特異性抗体は、2本の同一の軽鎖及び2本の同一の重鎖で構成される。軽鎖及び遺伝子組換え重鎖の構造において、軽鎖はヒトp185を抗原として認識する抗体に一般的な軽鎖である。一方、遺伝子組換え重鎖配列において、N末端はヒトp185を抗原として認識する重鎖可変領域配列（該重鎖可変領域が認識するp185のエピトープは、上記軽鎖が認識するエピトープと同一である）であり、重鎖定常領域がそれに続き、C末端はヒトVEGFを抗原として認識する抗体の一本鎖可変領域断片（ScFv）又はヒトVEGFに結合する受容体の抗原結合ドメインである。遺伝子組換え重鎖のN末端及びC末端は、可動性ペプチドにより連結されている（図1）。

好ましい実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する遺伝子組換え重鎖とからなる。これらの軽鎖及び遺伝子組換え重鎖のアミノ酸配列を表１に示す。

本発明においては、抗p185抗体、抗VEGF抗体又はVEGFに結合するドメイン配列をコードするDNAフラグメントが、それぞれ最初に合成される。その後、抗体軽鎖配列及び遺伝子組換え重鎖配列が、遺伝子組換えDNAを介して、それぞれ真核性発現ベクターpcDNA内にクローン化される（重複PCR技術）。293F細胞又はCHO細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の5〜7日後に上清を採取した後、親和性クロマトグラフィーゲルカラムにより精製し、二重特異性抗体を採取した。

以下の実施例において、発明の制限を意図しない発明の更なる詳細を記述した。

（例１）二重特異性抗体の製造
抗ヒトp185抗体、抗ヒトVEGF抗体及びVEGF結合ドメインをコードするDNAフラグメントを合成した。その後、軽鎖配列（配列番号１）及び遺伝子組換え重鎖配列（配列番号２、３、４又は５）を、それぞれ真核性発現ベクターpcDNA内にクローン化した。軽鎖及び重鎖DNAを2：1の質量比で混合した。DNA混合物（4〜10 μg）及び40 μLの2M CaCl₂を、総容量250 μLのddH₂Oに添加した。混合物全体を250 μLの2 × HBS（NaCl 16.3 g、KCl 0.74 g、Na₂HPO₄ 0.214g、グルコース2.4 g及びHEPES 10 g、pH=7.05）に添加してカルシウムリン酸DNA懸濁液を調製し、それを293F細胞又はCHO細胞に添加した（対数増殖相）。遺伝子導入の5〜7日後に上清を採取した。0.45 μmフィルターでの濾過後に、上清を、結合緩衝液（ddH₂Oに溶解させた12.15 g Tris、pH=7.5、8.78 g NaClを添加）で洗浄した親和性クロマトグラフィーゲルカラム（蛋白質A）に添加した。その後、溶出剤（ddH₂Oに溶解させた7.5 gグリシン、pH=3.5、8.78 g NaClを添加）により溶出した。溶出画分が二重特異性抗体であり（図1）、これを1 M Tris-HCl（pH 9.0）で中和した。

（例２）酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
ヒトp185又はヒトVEGF蛋白質を96ウェルプレート内に16時間コーティングし、1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するPBS緩衝液とともに37°Cで2時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、市販の抗ヒトp185抗体もしくは抗ヒトVEGF抗体、又は実施例１で作製した二重特異性抗体とともに、37°Cで2時間インキュベートした。その後PBSTで洗浄し、抗ヒトIgG Fab抗体を添加して1時間おいた。PBSTで洗浄した後、テトラメチルベンジジンを添加して5分間おき、反応を終了させた。450 nmでの吸収により親和性を測定した。
ELISAの結果を図2に示す。その結果によると、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を標的とする二重特異性抗体は、ヒトp185（図2A）、VEGF（図2B）、p185-VEGF（図2C）及びVEGF-p185（図2D）に対して高い親和性を示した。

（例３）ウェスタンブロッティングアッセイ
(1) 二重特異性抗体によるVEGFの認識
形態学的に健康で融合率が80%のHUVEC細胞を採取した。遠心分離後に細胞溶解物を添加した。細胞溶解物を95℃で10分間インキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。蛋白質をニトロセルロース膜（NC膜）内に移し、5%ミルクを用いて室温で1時間ブロッキングした。二重特異性抗体、市販のVEGF又はβアクチンを添加し、室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、化学蛍光試薬を用いて暗室で発光させた。

(2) 二重特異性抗体によるp185の認識
形態学的に健康で融合率が80%のMDA-MB-453細胞を採取した。遠心分離後に細胞溶解物を添加した。細胞溶解物を95℃で10分間インキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。蛋白質をニトロセルロース膜（NC膜）内に移し、5%ミルクを用いて室温で1時間ブロッキングした。二重特異性抗体、市販のp185又はβアクチン抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、化学蛍光試薬を用いて暗室で発光させた。
ウェスタンブロッティングアッセイの結果を図3に示す。その結果、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を標的とする二重特異性抗体は、p185（図3A）及びVEGF（図3B）を効率的に認識すると考えられた。

（例４）細胞増殖アッセイ
細胞（HUVEC細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト乳癌細胞及びヒト胃癌細胞）を96ウェルプレート内に播種し、0.5%ウシ胎児血清を含有する培地を用いて一晩培養した。各細胞株について5つの群（対照群、市販p185抗体群、市販VEGF抗体群、市販p185及びVEGF抗体群並びに二重特異性抗体群）をおいた。細胞を72時間培養した。市販の細胞増殖アッセイキット（CCK8キット）を用いて細胞の増殖を検出した。
細胞増殖検査の結果を図4に示す。その結果、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を標的とする二重特異性抗体は、HUVEC細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト乳癌細胞及びヒト胃癌細胞の増殖を効果的に抑制すると考えられた。

(例５)T細胞刺激試験
Tリンパ球懸濁液を96ウェルプレート内に添加した。本試験には培地及び二重特異性抗体を添加する2つの群をおいた。細胞を72時間培養した。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キットを用いて、IFN-γの濃度を測定した。
T細胞刺激試験の結果を図5に示す。その結果、ヒトp185及びVEGFの両方を標的とする二重特異性抗体は、Tリンパ球のIFN-γ発現を促進すると考えられた。

（比較例1）
一般的なp185抗体と一般的なVEGF抗体を、例２と同じ手順で結合させても、p185及びVEGFの両方を同時に標的とすることはできなかった。一部の結合は発現が低度であったのに対し、別の結合は空間的構造により発現させることができなかった。発現が可能であった一部の結合では、p185及び／又はVEGFとの結合能が低下していた（図2）。

本発明の二重特異性抗体は、ヒトp185及びヒトVEGFの両方を同時に標的化し、両蛋白質の関与するシグナル伝達経路を特異的に阻害し得るので、該シグナル伝達経路が異常亢進した種々のがんの治療又は予防薬として、極めて有用である。

本発明は、２０１７年９月２２日出願の中国特許出願第２０１７１０８６７２６５．５号を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体であって、以下の4本のペプチド鎖：
（1）2本の同一の抗体軽鎖、及び
（2）2本の同一の抗体重鎖
で構成され、
該抗体軽鎖は、
（1-1）ヒトp185を抗原として認識する軽鎖可変領域、及び
（1-2）軽鎖定常領域
を含み、該抗体重鎖は、
（2-1）ヒトp185を抗原として認識する重鎖可変領域、
（2-2）重鎖定常領域、
（2-3）可動性ペプチド、及び
（2-4）以下のいずれかのヒトVEGF結合ドメイン：
（a）ヒトVEGFを抗原として認識する抗体の一本鎖可変領域断片（scFv）、又は
（b）ヒトVEGFに結合する受容体の抗原結合ドメイン
を含む、抗体であり、ここで、該抗体軽鎖が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり；該抗体重鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、抗体。
請求項１に記載の抗体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸。
請求項２記載の核酸を含有する発現ベクター。
請求項３記載の発現ベクターで形質転換した形質転換体。
請求項４記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から二重特異性抗体を採取することを含む、ヒトp185及びヒトVEGFを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法。
請求項１に記載の抗体を含有してなる医薬。
癌の治療又は予防剤である、請求項６記載の医薬。
癌が、肺癌、乳癌又は胃癌である、請求項７記載の医薬。