CN114437218A - 靶向cd276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向CD276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞。还公开了编码核酸,重组表达载体,宿主细胞,细胞群体,药物组合物以及缀合物。还公开了包含靶向CD276的嵌合抗原受体的免疫细胞在抗癌症治疗中的应用。

Description

靶向CD276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞
技术领域
本发明涉及医药生物领域,涉及靶向CD276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)是一种人工合成的结构。利用转基因技术,将CAR序列转导入T细胞中,能够产生识别特异靶点、杀伤肿瘤细胞的CAR-T细胞,CAR-T细胞展示出良好的抗肿瘤活性。
CAR主要由3部分构成:胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中,胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性,往往由scFv序列构成,scFv序列的特异性和亲和性决定了CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。选择亲和力较强的特异scFv有助于提高CAR-T细胞治疗效果。胞内共刺激信号分子(CD28和/或41BB)对维持CAR-T细胞杀伤活性至关重要。
CD276是在肿瘤中广泛表达的膜抗原,是较好的CAR-T细胞治疗靶点。但是,目前针对该靶点的治疗研究较少,特别是不清楚采取何种scFv能够取得最佳治疗效果。
发明内容
本发明提供了特异性结合CD276的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下氨基酸序列的重链可变区:
1)SEQ ID NO.1所示的序列;
2)与SEQ ID NO.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或
选自以下氨基酸序列的轻链可变区:
4)SEQ ID NO.2所示的序列;
5)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
6)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
进一步,所述抗体或其抗原结合片段包括scFv、di-scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、(Fab’)2、(Fab’)3、Fv片段、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白、单结构域抗体。
在本发明的一个具体实施方案中,所述抗体的抗原结合片段是scFv,所述scFv还包括连接重链可变区和轻链可变区的linker。
优选地,所述linker序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明提供了特异性结合CD276的嵌合抗原受体,其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域,所述胞外抗原结合结构域为特异性结合CD276的scFv,所述scFv限定如前面所述。所述scFv的序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步,所述跨膜结构域包含选自下列蛋白的跨膜区:T细胞受体的α、β或δ链、CD3ε、CD3δ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154、PD1;优选地,所述跨膜结构域包含CD8α的跨膜区;更优选地,所述CD8α的跨膜区序列包括以下任一项所述的序列:
1)SEQ ID NO.4所示的序列;
2)与SEQ ID NO.4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
进一步,所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间,所述间隔结构域包含选自铰链结构域和/或免疫球蛋白的CH2和CH3区;优选地,所述铰链结构域包含CD8α、PD1、CD152或CD154的铰链区;优选地,所述铰链结构域包含CD8α的铰链区;更优选地,所述CD8α的铰链区序列包括以下任一项所述的序列:
1)SEQ ID NO.5所示的序列;
2)与SEQ ID NO.5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.5所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
进一步,所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
优选地,所述胞内信号传导结构域从N端到C端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。
优选地,所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。
优选地,所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序。
优选地,所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域:CD3δ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d;更优选地,所述初级信号传导结构域包含CD3δ的胞内信号传导结构域;更优选地,所述CD3δ的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列:
1)SEQ ID NO.6所示的序列;
2)与SEQ ID NO.6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.6所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
优选地,所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域:CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134、4-1BB、CD150、CD270、CD278或DAP10;更优选地,所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB的胞内信号传导结构域;更优选地,所述4-1BB的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列:
2)SEQ ID NO.7所示的序列;
2)与SEQ ID NO.7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.7所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
进一步,所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽;优选地,所述信号肽包含重链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽,或CD8α信号肽;更优选地,所述信号肽是CD8α信号肽。CD8α信号肽包括以下任一项所述的序列:
1)SEQ ID NO.8所示的序列;
2)与SEQ ID NO.8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.8所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
本发明的所述嵌合抗原受体包含以下任一项所述的氨基酸序列:
1)SEQ ID NO.9所示的序列;
2)与SEQ ID NO.9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.9所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
本发明提供了分离的核酸分子,其包含编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列,或者编码前面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
进一步,所述核酸分子进一步包含编码自杀开关多肽和/或自裂解肽的核苷酸序列。
进一步,所述自裂解肽包括P2A,E2A,F2A或T2A;优选地,所述自裂解肽是T2A,优选地,T2A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
进一步,所述自杀开关多肽包括Caspase-9、EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段或RQR8,优选地,EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。
本发明提供了载体,其包含前面所述的核酸分子。
进一步,所述载体包括DNA载体,RNA载体,质粒,转座子载体,CRISPR/Cas9载体,或病毒载体;优选地,所述病毒载体包含慢病毒载体,腺病毒载体或逆转录病毒载体。
本发明提供了宿主细胞,其包含前面所述的核酸分子,或前面所述的载体。
进一步,所述宿主细胞包括大肠杆菌,酵母,昆虫细胞,或哺乳动物细胞。
进一步,所述宿主细胞包括包含免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞,单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养前面所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了制备表达前面所述的嵌合抗原受体的细胞的方法,其包括:(1)提供宿主细胞;(2)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞;其中步骤(2)包括将前面所述的核酸分子或前面所述的载体引入步骤(1)所述的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞包括免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了宿主细胞群体,其包含前面所述的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞群体进一步包含不包含前面所述的核酸分子,或前面所述的载体的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞包括包含免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞,单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了试剂盒,其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子,前面所述的载体,前面所述的宿主细胞,或前面所述的宿主细胞群体。
本发明提供了缀合物,其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段,以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分;优选地,所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂;优选地,可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素;优选地,所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
本发明提供了药物组合物,其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子,前面所述的载体,前面所述的宿主细胞,前面所述的宿主细胞群体,或前面所述的缀合物,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步,本发明的药物组合物还包括另外的药学活性剂;优选地,所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物(如抗癌症药物,如用于放疗的药物或化疗药物)。
本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗癌症的方法,所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前面所述的宿主细胞、前面所述的宿主细胞群体,或前面所述的药物组合物。
本发明提供了用于诊断受试者是否患有表达CD276的癌症的方法,其包括使用前面所述的抗体或其抗原结合片段检测CD276在来自所述受试者的样品中的量;
优选地,所述方法还包括:将所述CD276在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较,并确定来自所述受试者的样品的CD276水平是否落入与癌症相关的CD276水平内;
优选地,所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物。
本发明提供了应用,其包含以下任一项所述的应用:
1)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备特异性结合CD276的嵌合抗原受体中的应用;优选地,所述嵌合抗原受体包括前面所述的嵌合抗原受体。
1)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是前面所述的药物组合物;
2)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备诊断受试者是否患有表达CD276的癌症的试剂盒中的应用;
3)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备前面所述的缀合物中的应用;
4)前面所述的核酸分子,前面所述的载体在制备表达嵌合抗原受体的宿主细胞中的应用;优选地,所述宿主细胞是前面所述的宿主细胞;
5)前面所述的核酸分子,前面所述的载体在制备前面所述的试剂盒中的应用;
6)前面所述的核酸分子,前面所述的载体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是前面所述的药物组合物;
7)前面所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是前面所述的药物组合物;
8)前面述的宿主细胞群体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是前面所述的药物组合物。
本发明的癌症的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症(参见,例如Rosenberg(1996)《医学年鉴》47:481-491,其全部内容通过引用并入本文)。
如本文中所使用的,术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用,该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体,而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(例如scFv,di-scFv,(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体包括任何类型的抗体,例如IgG、IgA或IgM(或其亚类),并且抗体不需要属于任何特定的类型。取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分配到不同的类型。有五种主要类型的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中几种可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。重链恒定区由4个结构域(CH1、hinge region、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽,例如全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb,纳米抗体)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“骆驼Ig”或“骆驼VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人,FASEB J.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼抗体”是指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann L.等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)231:25-38(1999);WO94/04678;WO94/25591;美国专利第6,005,079号)。
如本文中所使用的,术语“IgNAR”或“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫组库的由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成的一类抗体。
本发明的优点和有益效果
本发明以癌症广泛高表达的CD276为靶点进行CAR-T细胞治疗,结果显示该抗原是较好的癌症治疗靶点。同时,本发明采用了亲和力强的抗CD276 scFv作为CAR-T细胞识别区,可以更加有效地捕获相应抗原阳性癌细胞,有助于免疫细胞治疗效果改善。
附图说明
图1显示利用流式细胞仪检测T细胞表面CAR的表达情况的结果图;
图2显示利用流式细胞仪检测CAR-T细胞对A375细胞杀伤效果的结果图;
图3显示利用流式细胞仪检测CAR-T细胞对A549细胞杀伤效果的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
实施例
1、T细胞纯化
人外周血经密度梯度离心后,分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞,再按照2个细胞加入1个磁珠的比例,加入适量的CD3/CD28磁珠活化2天,之后加入病毒上清与polybrene(8μg/mL)孵育。10小时后,离心清洗T细胞1次后,加入含10ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15的
Figure BDA0003467566480000101
CTSTM OpTmizer TM T细胞扩增无血清培养基扩增T细胞。
2、CAR表达载体构建
构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中嵌合抗原受体各个元件的组合顺序(从N端到C端)如下:
scFv-人CD8a分子柔性片段-人CD8分子跨膜区-4-1BB胞内段-CD3δ。
另外,载体中还插入编码T2A的核苷酸序列和编码EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的核苷酸序列。
3、慢病毒包装
4、慢病毒转导
5、CAR-T细胞扩增
6、T细胞CAR表达效率检测
T细胞感染3天后,利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。结果显示CAR表达阳性率达到~58%(如图1所示)。
7、CAR-T细胞杀伤效果评价
T细胞感染3天后,计数T细胞与表达GFP的A375和A549靶细胞,然后按照效靶比(效应细胞:靶细胞,E:T)2:1,4:1和8:1的比例,将T细胞(效应细胞)与CD276高表达靶细胞(A375和A549)分别共孵育24小时、48小时和72小时。共孵育结束后,收集悬浮细胞,同时胰酶消化收集贴壁细胞,离心后细胞重悬,然后流式细胞术分析靶细胞占比(如图2和图3,表1和表2)。结果显示,当CAR-T细胞和A375细胞按不同效靶比(2:1,4:1和8:1)孵育时,CAR-T细胞对A375均有杀伤,效靶比为4:1时,CAR-T细胞对A375的杀伤更显著,效靶比为8:1时,CAR-T细胞将A375细胞完全清除。当CAR-T细胞和A549细胞按不同效靶比(2:1,4:1和8:1)孵育时,CAR-T细胞对A549均有杀伤,随着效靶比增加,CAR-T细胞对A549的杀伤更显著,效靶比为8:1时,CAR-T细胞几乎完全清除A549细胞。这些结果表明,靶向CD276的CAR-T细胞对表达CD276的人恶性黑色素瘤细胞和人非小细胞肺癌细胞均有很强的杀伤能力。
表1 A375细胞杀伤结果
A375细胞占比 0h 24h 48h 72h
2:1 26.6% 6.6% 6.7% 15.3%
4:1 15.2% 0.8% 0.4% 0.7%
8:1 9.2% 0.3% 0% 0%
表2 A549细胞杀伤结果
A549细胞占比 0h 24h 48h 72h
2:1 24% 14.3% 15.4% 7.8%
4:1 13% 5.4% 4.3% 1.3%
8:1 7.5% 1.5% 1% 0.3%
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 北京门罗生物科技有限公司
<120> 靶向CD276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞
<141> 2022-01-12
<150> PCT/CN2021/071249
<151> 2021-01-12
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 9
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
165 170 175
Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
195 200 205
Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
305 310 315 320
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
325 330 335
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
340 345 350
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
355 360 365
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
370 375 380
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
385 390 395 400
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
405 410 415
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
420 425 430
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
435 440 445
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
450 455 460
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
485 490 495
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
500 505 510
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
515 520 525
Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ala Ala
530 535
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 11
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
50 55 60
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
85 90 95
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
115 120 125
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
130 135 140
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
145 150 155 160
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
180 185 190
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
195 200 205
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
210 215 220
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
225 230 235 240
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
260 265 270
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
275 280 285
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
290 295 300
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
340 345 350
<210> 12
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys

Claims (10)

1.特异性结合CD276的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下氨基酸序列的重链可变区:
1)SEQ ID NO.1所示的序列;
2)与SEQ ID NO.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或选自以下氨基酸序列的轻链可变区:
4)SEQ ID NO.2所示的序列;
5)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
6)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包括scFv、di-scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、(Fab’)2、(Fab’)3、Fv片段、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白、单结构域抗体;
优选地,所述抗体的抗原结合片段是scFv,所述scFv还包括连接重链可变区和轻链可变区的linker;
优选地,所述linker序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
2.特异性结合CD276的嵌合抗原受体,其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域,所述胞外抗原结合结构域为特异性结合CD276的scFv,所述scFv如权利要求1中所述;优选地,所述scFv序列包括SEQ ID NO.12所示的序列;
优选地,所述跨膜结构域包含选自下列蛋白的跨膜区:T细胞受体的α、β或δ链、CD3ε、CD3δ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154、PD1;优选地,所述跨膜结构域包含CD8α的跨膜区;更优选地,所述CD8α的跨膜区序列包括SEQ ID NO.4所示的序列;
优选地,所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间,所述间隔结构域包含选自铰链结构域和/或免疫球蛋白的CH2和CH3区;优选地,所述铰链结构域包含CD8α、PD1、CD152或CD154的铰链区;优选地,所述铰链结构域包含CD8α的铰链区;更优选地,所述CD8α的铰链区序列包括SEQ ID NO.5所示的序列;
优选地,所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域;
优选地,所述胞内信号传导结构域从N端到C端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域;
优选地,所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域;
优选地,所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序;
优选地,所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域:CD3δ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d;更优选地,所述初级信号传导结构域包含CD3δ的胞内信号传导结构域;更优选地,所述CD3δ的胞内信号传导结构域序列包括SEQ ID NO.6所示的序列;
优选地,所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域:CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134、4-1BB、CD150、CD270、CD278或DAP10;更优选地,所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB的胞内信号传导结构域;更优选地,所述4-1BB的胞内信号传导结构域序列包括SEQ ID NO.7所示的序列;
优选地,所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽;优选地,所述信号肽包含重链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽,或CD8α信号肽;更优选地,所述信号肽是CD8α信号肽,更优选地,所述CD8α信号肽包括SEQ ID NO.8所示的序列;
优选地,所述嵌合抗原受体包含以下任一项所述的氨基酸序列:
1)SEQ ID NO.9所示的序列;
2)与SEQ ID NO.9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列;
3)与SEQ ID NO.9所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
3.分离的核酸分子,其包含编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列,或者编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的核酸序列;
优选地,所述核酸分子进一步包含编码自杀开关多肽和/或自裂解肽的核苷酸序列;
优选地,所述自裂解肽包括P2A,E2A,F2A或T2A,优选地,所述自裂解肽是T2A,优选地,T2A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列;
优选地,所述自杀开关多肽包括Caspase-9、EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段或RQR8;优选地,所述自杀开关多肽是EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段,优选地,EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的氨基酸序列包括SEQID NO.11所示的序列。
4.载体,其包含权利要求3所述的核酸分子;
优选地,所述载体选自DNA载体,RNA载体,质粒,转座子载体,CRISPR/Cas9载体,或病毒载体;优选地,所述病毒载体包含慢病毒载体,腺病毒载体或逆转录病毒载体。
5.宿主细胞,其包含权利要求3所述的核酸分子,或权利要求4所述的载体。
优选地,所述宿主细胞包括大肠杆菌,酵母,昆虫细胞,或哺乳动物细胞;
优选地,所述宿主细胞包括包含免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞,单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
6.一种方法,所述方法包括以下任一项所述的方法:
1)制备权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求5所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段;
2)制备表达权利要求2所述的嵌合抗原受体的细胞的方法,其包括:(a)提供宿主细胞;(b)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞;其中步骤(b)包括将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体引入步骤(a)所述的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞包括免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
7.宿主细胞群体,其包含权利要求5所述的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞群体进一步包含不包含权利要求3所述的核酸分子,或权利要求4所述的载体的宿主细胞;优选地,所述宿主细胞包括包含免疫细胞;优选地,所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞,单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
8.一种产品,所述产品包括以下任一项:
1)缀合物,其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分;优选地,所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂;优选地,可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素;优选地,所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂;
2)药物组合物,其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子,权利要求4所述的载体,权利要求5所述的宿主细胞,权利要求7所述的宿主细胞群体,或所述缀合物,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;优选地,所述药物组合物还包括另外的药学活性剂;优选地,所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物。
9.一种试剂盒,其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子,权利要求4所述的载体,权利要求5所述的宿主细胞,或权利要求7所述的宿主细胞群体、权利要求8所述的产品。
10.应用,其包含以下任一项所述的应用:
1)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备特异性结合CD276的嵌合抗原受体中的应用;优选地,所述嵌合抗原受体包括权利要求2所述的嵌合抗原受体;
2)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是权利要求8中所述的药物组合物;
3)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求8中所述的缀合物在制备诊断受试者是否患有表达CD276的癌症的试剂盒中的应用;
4)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备权利要求8中所述的缀合物中的应用;
5)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子,权利要求4所述的载体在制备表达嵌合抗原受体的宿主细胞中的应用;优选地,所述宿主细胞是权利要求5所述的宿主细胞;
6)权利要求3所述的核酸分子,权利要求4所述的载体在制备权利要求9所述的试剂盒中的应用;
7)权利要求3所述的核酸分子,权利要求4所述的载体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是权利要求8中所述的药物组合物;
8)权利要求5所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是权利要求8中所述的药物组合物;
9)权利要求7所述的宿主细胞群体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用;优选地,所述药物是权利要求8中所述的药物组合物;
优选地,所述癌症包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症。
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