KR20140015997A

KR20140015997A - Ｓｕｍｏ 단백질과 ｓｉｍ의 결합을 이용한 신규한 이중특이성 결합 복합체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140015997A
Application number: KR1020120082805A
Authority: KR
Inventors: 김은아; 이양순; 이동헌; 김수광; 문경덕; 박상경
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-07

Abstract

본 발명은 이중특이성 결합 복합체에 관한 것으로서, 구체적으로 a) SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인; 및 b) SIM과 연결된 제2 도메인을 포함하는, 이중특이성 결합 복합체로서, 상기 제1 도메인은 제1 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 제2 도메인은 제2 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인인, 이중특이성 결합 복합체 및 상기 이중특이성 결합 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 이중특이성 결합 복합체의 제조방법, 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

ＳＵＭＯ 단백질과 ＳＩＭ의 결합을 이용한 신규한 이중특이성 결합 복합체 및 그의 용도{Novel bispecific binding complex using the interaction between SUMO protein and SIM and use thereof}

이중특이성 결합 복합체는 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있는 복합체로서, 가장 대표적인 형태로는 이중특이성 항체일 수 있다.

이중특이성 항체는 두 가지의 항원에 동시에 결합할 수 있는 항체로서, 첫 번째 특이성은 제1 항원에 결합하는 작용이고, 두 번째 특이성은 제2 항원에 결합하는 작용이다. 이중특이성 항체는 단일클론 항체에 비하여 다양한 항원결합기능을 가져 단일클론항체에 비하여 향상된 결합 특이성 및 효율적인 표적인지가 가능한바, 치료효과를 증대할 수 있는 장점이 있다. 또한, 치료 효과를 증진시킬 수 있는 최적의 활성 분자를 선택할 수 있는 장점도 있다. 그러나, 이중특이성 항체를 이용한 항암제의 개발은 20년 이상 연구가 진행되어오고 있지만, 초기에는 하이브리도마 융합기술이나 화학적 교차결합 방법을 이용하여 제작하였기 때문에 순수한 동질의 이중특이성 항체를 대량생산 하는데 많은 어려움이 있었고, 또한 임상에서 부작용 및 저조한 효과 등의 문제들이 관찰되어 오랜 시간 동안 실용화되지 못하였다. 그러나 유전공학을 이용한 항체공학 기술의 발전으로 인해 최근에는 다양한 형태의 이중특이성 항체가 개발되고 있다(Van Spriel et al ., Immunol . 21:391,2000; Kufer et al ., Trend in Biotechnol .,22:238,2004; Marvinand Zhu, Curr . Opin . Drug Discovery Dev .,9:184,2006). 이러한 이중특이성 항체들은, scFv(single chain variable fragment) 형태를 기반으로 하는 tandem scFv, diabodies 등과 Fab의 형태를 기반으로 하는 항체, 그리고 IgG 기반 항체로 구분될 수 있다.

IgG 형태를 지닌 초기의 이중특이성 항체는 두 개의 각기 다른 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 체세포 융합하는 기술로 제조되었는데, 이 경우 각기 다른 두 개의 면역글로불린(Immunoglubulin, Ig) 중쇄와 각기 다른 두 개의 면역글로불린 경쇄가 무작위적으로 쌍을 이루었기 때문에, 원하는 단 한가지의 이중특이성 항체를 분리 정제하는 것이 매우 어려웠다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 유전자 조작을 통해 각기 다른 두 개의 면역글로불린(Ig) 중쇄의 CH3 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 하나의 Ig 중쇄의 CH3 도메인에는 hole 구조를, 또 다른 Ig 중쇄의 CH3 도메인에는 knob 구조를 만들어 두 개의 Ig 중쇄가 이형이합체(heterodimer)를 형성하도록 하여 이중특이성 항체를 제작하는 Knob & hole 기술이 개발되었다. 다만, 이 기술은 세포 내에서 각기 다른 두 개의 경쇄가 생성되므로 원하지 않는 VL/VH 쌍이 형성된다는 단점이 있다. 또 다른 형태의 IgG 기반의 이중특이성 항체로는 각각 다른 2 종의 항원에 결합이 가능한 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 보존부위(constant region)에 각각 융합 발현시킨 동형이합체(homodimer) 형태의 (scFv)₄-IgG 항체가 있다(Lu et al ., J. Biol . Chem ., 279:2856, 2004; Lu etal ., J. Biol . Chem ., 280:19665, 2005). 최근에는 세포에서 생산되는 모든 IgG가 이중특이성을 지니도록 하기 위하여 DVD-Ig(dual variable domain immunoglobulin) 기술이 개발되었다. DVD-Ig 기술은 경쇄의 경우 두 개의 VL 도메인을 VL1-VL2-CL 구조, 중쇄의 경우 역시 두 개의 VH 도메인을 VH1-VH2-CH1-CH2-CH3의 구조로 연결하는 기술이다. 다만, 이 기술은 두 개의 항원 결합 부위가 서로 가깝게 위치하고 있기 때문에, 세포막에 존재하는 막 단백질을 표적으로 하기보다는 주로 성장인자와 같은 수용성 인자를 표적으로 하는 것에 적합하다. IgG를 기반으로 하는 이중특이성 항체 중 Trion Pharma 사의 Catumaxomab는 EpCAM 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체로서, 악성 복수(malignant ascites)의 하이브리드 단일클론 항체로서 시장에 진출하였다.

scFv, Fab와 같은 항체 단편은 전체 IgG(whole IgG)에 비하여 크기가 작기 때문에, 조직이나 종양으로의 침투율이 좋으며, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있다. 이러한 점에서 기존 IgG 형태를 이용한 이중특이성 항체보다 좀 더 간단하며 작은 구조를 지닌 항체 단편을 이용하여 이중특이성 항체를 개발하기 위한 노력들이 진행되어 왔다.

scFv를 기반으로 하는 이중특이성 항체는 다양한 형태가 개발되어 왔다. 각기 다른 두 가지 항체의 VH와 VL 도메인을 3 내지 12 개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드 연결자를 이용하여 VH1-linker-VL2, VH2-linker-VL1 형태로 제작하고, 이를 대장균에서 동시에 발현되도록 하여 제작한, "디아바디(diabody)"라 불리는 이중특이성 항체가 있다. 이는 크기가 작고 박테리아에서 생산할 수 있으나, 짧은 연결자로 인하여 양 단말의 항원결합부위에 공간적 장애가 발생하는 문제점이 있다. 그 외에도 상이한 scFv를 서로 연결한 탠덤 scFv(tandem scFv)가 있다. 두 개의 scFv를 유연성 있는 펩타이드 연결자로 융합시켜 제작하는 Tandem di-scFv 이중특이성 항체의 경우, 이는 디아바디와는 달리 항원결합부위가 어느 정도 자유롭게 회전가능하여 무난하게 두 종류의 세포 표면에 존재하는 표적 항원과 동시에 결합할 수 있는 장점이 있으나, di-scFv는 대장균 숙주 세포 내에서 발현하는 경우 봉입체(inclusion body)를 형성하는 문제가 있어, 이의 생산을 위해서는 포유류 기원의 숙주세포를 사용해야한다는 단점이 있다. 또한, scFv의 중쇄 C-말단 부위에 이량체 도메인(dimerization domain)을 형성하는 부위를 융합함으로써 제작된 미니항체(miniantibody), 그리고 Fc의 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 하나의 CH3 도메인에는 hole 구조를, 또 다른 CH3 도메인에는 knob 구조를 만들어 이형이합체 구조를 형성하도록 변경시켜, 이러한 CH3 도메인을 각각의 scFv 말단에 발현시킨 미니바디(minibody) 등이 있다.

Fab을 기반으로 하는 이중특이성 항체의 경우, 특정 항원에 대한 각각의 Fab을 서로 조합한 이형이량체 Fab(heterodimeric Fab)의 형태가 보편적이다. 그리고 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 다른 항원에 대한 결합력이 있는 scFv를 발현시켜 다중표적이 가능하도록 개발한 항체들도 보고된바 있다.

이 밖에도 상호결합하는 도메인 또는 단백질을 이용하여 제작된 이중특이적 항체에 대해서도 보고된 바 있다. 예를 들어, 단백질 키나아제 A(protein kinase A, PKA)의 RDDD 도메인과 PKA의 정착 도메인(anchoring domain)을 이용하여 항체를 결합시키는 DNL(dock and lock)방법이 개발되어 이러한 방법을 통하여 제작한 이중특이성 항체가 보고되었다. 또한, 각각의 다른 scFv 말단에 상호 결합이 가능한 단백질인 Jun과 Fos를 각각 발현시켜서 결합시킨 이형이량체 scFv(heterodimeric scFv)에 대해서 보고된바 있다.

이와 같이, 지금까지 다양한 형태의 이중특이성 항체들이 발표되었으며, 이중특이성 항체에 대하여 끊임없는 연구가 진행되고 있다. 각각의 이중특이성 항체는 저마다의 기능상의 장점 및 단점을 보여왔다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 생산성 및 물성이 좋으면서도, 다양한 항원과 같은 표적 분자에 대한 결합이 우수한 이중특이성 결합 복합체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, SUMO 단백질과 SIM의 상호작용을 이용한, 이중특이성 결합 복합체의 일종인 이중특이성 항체를 개발하였다. 본 발명의 이중특이성 항체는 SUMO 단백질과 SIM 간의 결합이 우수하여 항체 생산성이 좋으며, 원하는 형태의 이중특이성 항체를 얻을 수 있다는 장점이 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 a) SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인; 및 b) SIM과 연결된 제2 도메인을 포함하는, 이중특이성 결합 복합체로서, 상기 제1 도메인은 제1 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 제2 도메인은 제2 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인인, 이중특이성 결합 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 조성물을 자가면역질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인; 및 b) SIM과 연결된 제2 도메인을 포함하는, 이중특이성 결합 복합체로서, 상기 제1 도메인은 제1 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 제2 도메인은 제2 표적 분자에 특이적으로 결합하는 도메인인, 이중특이성 결합 복합체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "이중특이성 결합 복합체"란 제1 표적분자 및 제2 표적분자인 두 개의 표적 분자에 동시에 결합할 수 있는 복합체를 의미하며, 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태를 의미할 수 있다. 상기 이중특이성 결합 복합체의 제1 표적분자 및 제2 표적분자는 서로 다른 두 종류의 표적 분자 또는 동일한 종류의 표적 분자일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 이중특이성 결합 복합체는 바람직하게는 이중특이성 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 이중특이성 결합 복합체는 바람직하게는 SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 항체; 및 SIM과 연결된 제2 항체를 포함하는 이중특이성 항체로서, 상기 SUMO의 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 SIM이 서로 결합하여 제1 항체 및 제2 항체가 연결된 것인 이중특이성 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "이중특이성 항체"는 두 가지 항원에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 의미하며, 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학에 의해 생산된 형태를 의미한다. 상기 이중특이성 항체는 서로 같은 종류 또는 서로 다른 종류의 항원에 결합할 수 있으며, 그 예로 VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 DLL4(delta-like ligand 4) 모두에 결합할 수 있는 이중특이성 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 제1 항체로 DLL4에 결합하는 항체; 제2 항체로 VEGF에 결합하는 항체가 서로 연결된 이중특이성 항체를 제조하였다(실시예 1).

본 발명의 이중특이성 항체에서 각각의 항체와 리간드는 각각의 특이적 결합을 유지하며, 특히 두 개의 항원을 동시에 억제시킬 수 있기 때문에, 하나의 결합과 결합하여 억제하는 것보다 더욱 효과적일 수 있고 또한, 동시에 두 개의 신호를 억제시킬 수 있다. 따라서 상기 VEGF 및 DLL4 모두에 결합하는 이중특이성 항체는 VEGF 및 DLL4 중 하나의 항원에 결합하는 항체에 비하여 더욱 효과적일 수 있다. 상기 VEGF 및 DLL4에 결합할 수 있는 이중특이성 항체는 암 또는 자가면역질환에서 과발현되는 VEGF 및 DLL4에 특이적으로 결합하므로, 본 발명의 VEGF 및 DLL4 모두에 결합하는 이중특이성 항체는 암 또는 자가면역질환의 치료에 이용될 수 있다. 상기 VEGF는 암세포에 과발현되어 있으며, 혈관내피세포의 성장에 관여하는 인자로서 혈관생성(angiogenesis)을 촉진시키므로, 암 또는 류마티스 관절염과 같은 질환에 있어서 신생혈관의 생성을 가져온다. 또한, DLL4는 노치(Notch) 신호전달에 관여하는 인자로서, 맥관 특이적인 노치 리간드(vascular-specific Notch ligand)를 지칭할 수 있으며, DLL4에 의해 매개되는 노치 신호전달은 혈관 내피세포의 증식 및 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 여러 종양 모델에서 DLL4를 블로킹(blocking)시킨 경우, 종양의 성장이 억제되는 것이 알려진 바 있다. 또한, 항-VEGF 저항 종양 모델을 포함한 다양한 종양 모델에서 VEGF와 DLL4를 동시에 억제하는 경우, VEGF를 단독으로 블로킹한 경우에 비해 훨씬 더 높은 항암 활성을 가짐이 보고된바 있다. 따라서 본 발명의 이중특이성 항체가 VEGF 또는/및 DLL4를 표적 분자로 삼는 경우, 혈관 생성을 억제시킬 수 있으며, 나아가 암 또는 류마티스성 관절염과 같은 자가면역질환의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 이중특이성 항체는 SUMO 단백질과 SIM의 결합으로 형성된 이중특이성 항체일 수 있다. 상기 SUMO 단백질과 SIM이 서로 결합하여, 제1 항체와 제2 항체를 연결해주는 링커로서 작용할 수 있다. 본 발명의 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 SUMO 단백질의 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합 부위와 SIM의 결합으로 형성된 이중특이성 항체일 수 있고, 그 예로 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 SUMO 단백질의 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합 부위와 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 SIM의 결합으로 형성된 이중특이성 항체일 수 있으나. 이에 제한되지 않는다. 상기 이중특이성 항체의 구조의 예를 도 1에 간략히 모식도로 나타내었다.

이와 같은 서로 다른 단백질 간의 상호작용에 의해 제1 항체와 제2 항체를 연결시키기 위한 연결 단백질의 선정은 결합된 항체 각각의 기능에 영향이 없으면서, 생체 내에서 손쉽게 분리가 되지 않는 단백질을 이용해야 하는 등 연결 단백질의 선정에 어려움이 있다. 이와 같은 SUMO 단백질과 SIM을 연결 단백질로서 사용하는 것은 본 발명자들이 최초로 규명한 것이다.

본 발명에서 용어, "SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인"은 SIM과 결합하는 SUMO 단백질의 전체 또는 일부분에 연결된 제1 도메인을 의미하며, 바람직하게는 SIM과 결합하는 SUMO 단백질의 전체 또는 일부분에 링커(linker)를 통해 연결한 제1 도메인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 이중특이성 결합 복합체가 이중특이성 항체의 형태인 경우, SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 부위는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위 즉, SUMO 단백질의 전체 또는 일부분의 N 말단 또는 C 말단에 어떠한 단백질(항체, 펩타이드 등)도 결합이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위를 항체의 C-말단에 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 3) 링커를 이용하여 연결하였다(실시예 1).

본 발명에서 용어, "SIM(SUMO interacting motif)에 연결된 제2 도메인"은 SUMO 단백질과 결합할 수 있는 SIM에 링커를 통하여 연결된 도메인을 의미하며, 바람직하게는 SUMO 단백질과 결합할 수 있는 SIM에 링커를 통하여 연결한 제2 도메인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 이중특이성 결합 복합체가 이중특이성 항체의 형태인 경우, 상기 SIM은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 연결된 형태를 포함한다. 또한, SIM의 N 말단 또는 C 말단에 어떠한 단백질(항체, 펩타이드 등)도 결합이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 SIM에 항-VEGF 항체를 서열번호 3으로 표시되는 링커를 이용하여 연결하였다(실시예 1).

본 발명에서 용어, "도메인"이란 표적 분자에 특이적으로 결합하는, SUMO 단백질의 전체 또는 일부, 또는 SIM과 연결될 수 있는 펩티드, 단백질 또는 핵산을 의미한다. 본 발명의 도메인은 바람직하게는 항체, 효소, 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 헤모글로빈 또는 압타머이며, 더욱 바람직하게는 항체이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 도메인이 항체인 경우에는, 두 도메인, 즉 두 항체가 같은 항원에 결합하는 경우 항원과의 결합이 보다 효율적으로 이루어질 수 있으며, 다른 항원에 결합하는 경우에는 두 항원에 결합하는 항체로서 이용될 수 있다. 상기 도메인이 사이토카인인 경우, 이에 제한되지는 않으나, 사이토카인이 도메인인 이중특이성 결합 복합체는 항원 보조제(adjuvant)로서 이용될 수 있으며, 상기 복합체를 이용하여 면역 반응을 보다 효율적으로 유도시킬 수 있다. 상기 케모카인은 세포에서 분비되는 단백질 또는 작은 사이토카인의 패밀리를 의미할 수 있으며, 본 발명의 케모카인은 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성장인자는 각종 세포분열이나 생장 및 분화를 촉진할 수 있는 폴리펩타이드를 의미할 수 있으며, 그 예로 유사인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈유래 성장 인자(bone-derived growth factor, BDF), 콜로니 자극 인자(colony stimulation factor, CSF) 등이 있다. 상기 압타머(aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산을 의미한다. 상기 압타머를 도메인으로 이용하는 경우, 질환에 관계된 분자에 특이적으로 결합시킴으로써 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 전체 항체의 일부분을 의미하며, 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 포함한다. 그 예로 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv, disulfide-stabilized variable frament)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv, single chain variable frament)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역(VH)과 경쇄의 가변 영역(VL)이 공유 결합으로 연결되어 있다. 본 발명에서 상기 scFv는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리페타이드쇄에 존재한다. 상기와 같은 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 상기 제1 항체 및 제2 항체는 전체 항체 또는 항체 단편의 형태일 수 있으며, 그 예로 scFv 형태의 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 VEGF 또는 DLL4를 항원으로 하는 scFv 형태의 항체를 이용하였다(실시예 1).

본 발명에서 용어, "SUMO (small ubiquitin-like modifier) 단백질"은 약 100개의 아미노산으로 구성된 약 11kDa 가량의 조절 인자를 의미한다. 본 발명의 SUMO 단백질은 제2 도메인에 연결된 SIM과 결합할 수 있는 모티프를 포함하는 결합부위를 갖는 단백질이라면 제한없이 포함하며, 그 예로 효모 유래의 SMT3, 포유동물 유래의 SUMO1, SUMO2 또는 SUMO3일 수 있다. 가장 바람직하게는 SUMO1 또는 SUMO3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 인간 SUMO3 단백질을 이용하여 SIM과 결합할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 SUMO 단백질은 효모 유래의 SMT3, 포유동물 유래의 SUMO1, SUMO2 또는 SUMO3의 아미노산 서열과 동일하지 않은 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 비제한적으로 내부 또는 말단이 첨가, 결실 또는 치환되었거나, 또는 반복서열의 순서가 재배열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 SUMO 단백질의 서열정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 AAC50996인 SUMO1 단백질 또는 P55854인 SUMO3 단백질일 수 있다.

본 발명에서 용어, "SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위"는 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 단백질이라면 제한없이 포함한다. 상기 SUMO 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위는 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 SIM과 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 SIM과 결합할 수 있는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하며, 그 예로 비제한적으로 내부 또는 말단 첨가, 결실 또는 치환되었거나, 또는 반복서열의 순서가 재배열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "SIM(SUMO interacting motif)"은 SUMO 단백질과 결합할 수 있는 단백질이 가지는 모티프로, 발린(Valine, V), 이소류신(Isoleucine, I), 글루탐산(Glutamic acid, E) 및 아스파르트산(Aspartic acid, D)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 구성된 모티프로서, 별도의 효소의 활성작용 없이 SUMO 단백질과 결합하는 부위를 의미한다. 상기 SIM의 예로, E3 리가아제(ligase)에 존재하는 SIM은 SUMO 파라로그 특이적 수식(SUMO paralogue-specific modification)을 조절하며, 기질의 SIM은 SUMO 수식을 촉진하는 역할을 하며, 수용체 단백질의 SIM은 SUMO화(SUMOylation)된 기질을 인지하는 역할을 한다. 본 발명의 SIM은 상기 SUMO 단백질 내의 SIM과 결합할 수 있는 모티프에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가진다면 제한없이 포함하며, 그 예로 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의된 SIM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SIM은 서열번호 2의 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 SUMO 단백질과 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 SUMO 단백질과 결합할 수 있는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하며, 그 예로 비제한적으로 내부 또는 말단 첨가, 결실 또는 치환되었거나, 또는 반복서열의 순서가 재배열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질은 SUMO 경로(SUMO pathway)에 관여하는 효소들에 의하여 활성화되어 목적 단백질에 부착될 수 있으며, 이를 수모화(sumoylation)이라고 한다. 수모화(sumoylation)되는 단백질의 수모 결합 부위는 ΨKEX(Ψ는 소수성 아미노산)로서, 상기 결합부위의 라이신(lysine, K) 잔기에 SUMO 단백질이 공유 결합적으로 수식되어 세포 내 위치, 단백질의 안정성, 및 다른 단백질 및 핵산과의 상호작용 능력을 변화시킬 수 있다. SIM(SUMO interacting motif)은 SUMO와 결합할 수 있는 모티프를 의미하며, SUMO에 의존적인 조절(SUMO-dependent regulation)을 매개하는 것으로 알려져 있다. SIM은 10개 이내의 아미노산으로 구성되어 있으며, 대부분 소수성 잔기로 구성되어 있다. 일반적으로 SUMO 단백질은 목적 단백질에 효소에 의해서 부착되며, 이러한 SUMO화된 단백질은 SIM을 포함하고 있는 다른 단백질과 결합한 형태를 형성할 수 있다. 다만, SUMO 단백질 자체에 인위적으로 다른 분자를 결합시켜, SIM과의 결합을 이용하여 복합체 형태, 예컨대 이중특이성 항체와 같은 형태를 만드는 것에 대해서는 알려진 바 없다. 상기와 같은 결합 형태는 본 발명자들에 의하여 최초로 개발되었다. 특히, SUMO와 SIM의 결합을 이용 할 경우 기존의 다른 도메인 서열을 이용하는 방법에 비하여 이형이합체(heterodimer)의 비율이 높아 이중특이성 항체의 생성율이 높으며, SUMO와 SIM의 N 말단과 C 말단에 어떠한 단백질(항체, 펩타이드 등)도 결합이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 이중특이성 결합 복합체는 생체 내에 존재하는 단백질을 이용하므로 생체 내 분해가 자연적으로 일어나는 이점을 지닌다.

본 발명에서 용어, "표적 분자"란 제1 또는 제2 도메인과 특이적으로 결합할 수 있는 분자로서, 바람직하게는 목적하는 질환에 관여하는 분자이면 제한 없이 포함되며, 그 예로 VEGF(vascular endothelial factor) 또는 DLL4(delta like ligand 4)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 VEGF 및 DLL4에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 상기 이중특이성 결합 복합체는 각 도메인이 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위 또는 SIM에 링커(linker)로 연결된 형태일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 링커로 연결된 형태일 수 있다.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너 (예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소결합, 정전기적 상호작용, 반데르발스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지(hinge)의 역할을 수행할 수도 있다. 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커일 수 있으며, 펩티드 결합, 이황화 결합 등에 의해서 직접 연결되는 것도 포함된다. 본 발명에서 상기 링커는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합 부위 또는 SIM과 도메인을 연결할 수 있는 것이면 모두 포함하나, 바람직하게는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합 부위 또는 SIM과 도메인을 연결하는 펩타이드 링커일 수 있고, 그 예로 GGGGS 모티프가 3번 반복된 형태의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다. 상기 GGGGS 모티프는 1 내지 10번 반복될 수 있으며, GGGGS가 3번 반복된 하기와 같은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성됨이 바람직하다.

펩타이드 링커: GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 3)

본 발명에서 용어, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.

본 발명에 사용가능한 비펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 더욱 바람직하게는 분자량 1 내지 5 kDa의 분자량인 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체이며, 가장 바람직하게는 3.4 kDa 정도이며, 양 말단에 양기능성 알데히드 (bifunctional aldehyde) 형태로 폴리펩타이드 아미노 말단의 아민그룹과 결합하여, SUMO 또는 SIM과 도메인을 연결시킬 수 있다. 특히, 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하는 데 효과적이다.

본 발명의 일 실시예에서는 DLL4를 인지하는 scFv의 C-말단에 SUMO 단백질을 서열번호 3으로 표시되는 링커를 통하여 연결한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하고, VEGF를 인지하는 scFv의 C-말단에 SIM을 서열번호 3으로 표시되는 링커를 통해 연결한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입한 다음, 이를 동물세포에 도입하여 발현시켰다 (실시예 1). 그 다음, SUMO 단백질과 SIM의 결합으로 형성된 이중특이성 항체를 분리하여 발현 및 결합능을 확인하였다 (실시예 2 내지 4).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중특이성 결합 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 상기 이중특이성 결합 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 이중특이성 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 이중특이성 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 CHO-S 세포를 숙주세포로 이용하였다(실시예 1).

본 발명에서 용어, "도입"은 이중특이성 결합 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이중특이성 결합 복합체의 제조 방법을 제공한다.

바람직하게는 a) SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인을 수득하는 단계; 및 b) SIM에 연결된 제2 도메인을 수득하는 단계; 및 c) 상기 제1 도메인과 제2 도메인을 연결시켜 이중특이성 결합 복합체를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 연결은 제1 도메인에 연결된 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 제2 도메인에 연결된 SIM 간의 상호작용(interaction)에 의하여 연결될 수 있다. 상기 a) 및 b) 단계는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 도메인을 코딩하는 유전자를 발현벡터에서 증폭하는 단계 및 SIM에 연결된 제2 도메인을 코딩하는 유전자를 발현벡터에서 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 이중특이성 결합 복합체의 제조 방법은 바람직하게는 이중특이성 항체의 제조 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 이중특이성 항체의 제조 방법의 예로, a) SUMO 단백질 및 SIM을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 수득하는 단계; b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 항체를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 각각 연결하고 말단에 히스티딘(histidine) 또는 HA 태그를 연결하여, 이중특이성 항체의 유전자를 수득하는 단계; c) 상기 수득한 이중특이성 항체의 유전자를 클로닝하고 단백질을 발현하는 벡터를 수득하는 단계; d) 상기 수득한 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및 e) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 이중특이성 항체를 회수하는 단계를 포함하는 이중특이성 항체의 제조 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 이중특이성 항체의 제조 방법은 상기 SUMO 단백질과 SIM 간의 특이적 결합을 이용하므로, 원하지 않는 형태의 항체의 생성을 현저히 감소시켜 원하는 형태의 이중특이성 항체를 높은 비율로 생산할 수 있는 이점이 있다(예를 들어, A항체-SUMO와 B항체-SIM을 반응시키는 경우, A항체-SUMO X B항체-SIM이 특이적으로 생성된다).

본 발명의 이중특이성 결합 복합체는 공지의 재조합 수단에 의해 제조될 수 있으며, 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드는 적절한 숙주세포에 도입되고, 형질전환체의 배양액으로부터 회수할 수 있다.

상기 이중특이성 결합 복합체는 공지의 정제방법에 의해 정제할 수 있으며, 그 예로 단백질 A 친화성 컬럼, 히스티딘 친화성 컬럼 또는 크기배제 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 이중특이성 결합 복합체의 제조 방법은 바람직하게는 단백질 A 친화성 컬럼, 히스티딘 친화성 컬럼 및 크기배제 크로마토그래피로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 이용하여 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 SUMO 단백질, SIM, 도메인 및 이중특이성 결합 복합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 일 실시예에서는 인간 SUMO3 단백질로부터 유래한 펩타이드를 scFv의 중쇄 C-말단 부위에 서열번호 3으로 표시되는 링커를 통해 연결한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및; SIM을 scFv의 중쇄 C-말단 부위에 서열번호 3으로 표시되는 링커를 통해 연결한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제작한 후, 이를 CHO-S 세포에 도입하여 이중특이성 항체를 발현시킨 다음, 히스티딘 친화성 컬럼 및 크기배제 크로마토그래피을 이용하여 배양액으로부터 정제하였다(실시예 1).

또 하나의 양태로서, 상기 이중특이성 결합 복합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 이중특이성 결합 복합체는 암의 발생 또는 진행에 관련되는 인자들에게 결합할 수 있는 복합체를 포함하며, 그 예로 VEGF 또는/및 DLL4에 결합하는 복합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 이중특이성 결합 복합체는 바람직하게는 이중특이성 항체의 형태이다. 상기 VEGF와 DLL4에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체인 경우, VEGF와 DLL4를 블로킹(blocking)시킴으로써, 암의 성장을 억제시킬 수 있으며, VEGF와 DLL4에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "암"은 암의 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발명을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 상기 이중특이성 결합 복합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적으로 허용가능한 담체, 예방 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 이중특이성 결합 복합체는 자가면역질환의 발생 또는 진행에 관여하는 인자들에 결합할 수 있는 형태일 수 있으며, 바람직하게는 VEGF 또는/및 DLL4에 결합하는 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 이중특이성 결합 복합체는 바람직하게는 이중특이성 항체의 형태일 수 있다. 상기 이중특이성 항체는 VEGF 또는/및 DLL4에 결합함으로써 자가면역질환의 발생 또는 진행을 억제할 수 있다.

본 발명에서 용어, "자가면역질환"은 그 종류에 관계없이 포함되나, 그 예로 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 또는 결절성 다발성 동맥염일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.

상기 이중특이성 결합 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 암과 사용될 수 있는 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암의 치료 방법은 바람직하게는 이중특이성 항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법일 수 있다.

상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.

이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암에 관여하는 인자들에게 결합하는 이중특이성 결합 항체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 VEGF 또는/및 DLL4에 결합하는 이중특이성 결합 항체를 포함할 수 있다. 상기 이중특이성 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하여, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 이중특이성 결합 복합체를 포함하는 조성물을 자가면역질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 이중특이성 결합 복합체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 자가면역질환이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 자가면역질환, 개체 및 사용될 수 있는 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 자가면역질환의 치료 방법은 바람직하게는 이중특이성 항체를 포함하는 조성물을 자가면역질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 치료 방법일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 자가면역질환에 관여하는 인자들에게 결합하는 이중특이성 항체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 VEGF 또는/및 DLL4에 결합하는 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하여, 자가면역질환의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 자가면역질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 이중특이성 결합 복합체는 서로 다른 두 가지 표적 분자에 대하여 결합할 수 있는 복합체로서, SUMO 단백질과 SIM의 강한 결합에 의하여 안정된 형태의 이중특이성 결합 복합체를 수득할 수 있고, 원하는 형태의 이중특이성 결합 복합체만을 얻을 수 있으므로, 이를 이중특이성 결합 복합체의 생산과 암 및 자가 면역 질환의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 것이다. 특히 SUMO 단백질과 SIM의 상호작용을 이용하여 형성된 본 발명의 이중특이성 항체는 암 또는 자가면역질환과 같은 질환 등에 있어 치료용 항체로서 이용될 수 있다.

도 1은, SUMO 단백질과 SIM 도메인 간의 결합을 통하여 형성된 이중특이성 항체의 구조의 예를 보여주는 모식도이다. 도 1에서 SUMO는 SUMO 단백질의 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위를 나타내는 것이다.
도 2는, SUMO3 단백질과 SIM 도메인 간의 결합으로 생성된 이중특이성 단백질의 발현 여부 및 크기를 나타내는 SDS-PAGE 실험 결과를 나타내는 도이다.
도 3은, SUMO3 단백질과 SIM 도메인 간의 결합을 통한 이중특이성 항체의 생성 여부를 나타낸 웨스턴 블로팅 실험 결과를 나타내는 도이다.
도 4는, SUMO 단백질과 SIM의 결합으로 형성된 본 발명의 이중특이성 항체의 VEGF와 DLL4에 대한 결합능 어세이를 ELISA를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 이중특이성 항체 발현 벡터의 제조 및 이중특이성 항체의 생산

CHO-S 포유동물 세포주에서 SUMO3 단백질과 SIM 도메인이 결합된 형태의 이중특이성 항체를 생산하기 위하여 인간 SUMO3 단백질과 SIM의 유전자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 공개된 유전자 서열을 사용하여 디자인하였다.

SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 HA 단백질을 코딩하는 유전자를, SIM 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 8개의 히스티딘(histidine)을 코딩하는 유전자를 디자인하여 합성하였다.

이중특이성 항체를 암호화하는 핵산의 발현은 원핵세포 또는 진핵세포에서 통상의 방법으로 수행할 수 있는데 진핵세포 숙주-벡터 시스템은 많은 상이한 종에 대한 광범위한 벡터를 포함한다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pcDNA3.1 벡터이고, 이를 사용하여 유전자 재조합을 통해 CHO-S 포유동물세포주에서 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터를 확보하였다. 이중특이성 항체를 발현할 수 있는 유전자를 디자인하기 위하여, 항체는 scFv 타입으로 설정하였고, 항체의 중쇄 영역 C-말단과 SUMO3 단백질 또는 SIM을 연결해주는 링커(linker) 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 3) 링커를 사용하여 연결하였다.

이중특이성 항체의 생성여부 및 기능을 확인하기 위하여, 항체는 항-VEGF 항체와 항-DLL4 항체의 유전자를 이용하여 발현 벡터에 클로닝 한 후 합성한 SUMO3 단백질과 SIM 도메인을 각각의 항체의 C-말단에 연결되도록 클로닝하여, 항-DLL4항체와 SUMO3 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위를 링커로 연결한 형태의 항-DLL4-SUMO3 단백질과 항-VEGF 항체와 SIM을 링커로 연결한 형태의 항-VEGF-SIM 단백질 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 재조합 발현벡터를 제작하였다.

항체 생산을 위해서, 세포 내 유전자 전달 효율을 높이는 폴리머를 이용하여 해당 유전자를 CHO-S 세포에 형질 주입한 다음 상기 부유 세포를 500mL 배양용 삼각 플라스크(코닝 코스타)에서 병 1개당 250㎖씩 4개의 병으로 총 1ℓ배양하였다. IgG 함량이 매우 낮은(ultra low IgG) 소 태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 RPMI 배지(Invitrogen)와 CHO 세포 전용 배지의 혼합액 1ℓ를 4일간 세포배양기(산요)에서 배양하여 재조합 단백질을 생산하였다. 세포 배양액을 수득하여 원심분리를 수행한 다음, 부유 세포와 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 분리하였다. 이를 0.22㎛ 진공 필터 장치(Millipore, 미국 메릴랜드주)를 이용하여 1회 여과하였다.

항체 정제를 위해서 히스티딘(histidine) 친화성 컬럼(His-Trap, 5 mL, GE healthcare)을 사용하여 이중특이성 항체를 배양액으로부터 정제하였다. 상기 여과된 배양 배지를 히스티딘 친화성 컬럼에 로딩하였다. 상기 컬럼에 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate), 0.5M NaCl, 5mM 이미다졸(imidazole) 및 pH 7.4인 결합 완충액(binding buffer)을 흘려주고 안정화시켰다. 그 다음, 배지를 넣은 후, 20mM 인산나트륨(sodium phosphate), 0.5M NaCl, 0.5M 이미다졸(imidazole), pH 7.4인 용출 완충액(elution buffer)으로 항체를 용출시켰다. 용출된 분획물을 SDS-PAGE로 분석하고, 양성 분획물을 모아서 원심분리형 농축기(아미콘 울트라(Amicon Ultra), 30,000 MWCO, 미국 메릴랜드주 베드포드 소재 밀리포어(Millipore))로 농축시켰다. 동일 원심분리형 농축기를 사용하여 PBS로 완충제 교환 및 농축을 실시하였다. 마지막으로, 항체를 0.22㎛ 공극 직경의 시린지 필터로 멸균 여과하고, 흡광도(A280㎚)를 측정하여 항체 농도를 측정하였다. 마지막으로 다량체 항체를 제거하기 위하여, 시료를 PBS로 안정화시킨 Superdex 200(16 mm x 60 cm, GE healthcare) 컬럼에 넣은 후, 크기배제 크로마토그래피를 수행하였다. 위 정제 과정을 모두 마친 항체를 이용하여 이중특이성 항체의 특성을 분석하였다.

실시예 2: SUMO / SIM 이중특이성 항체의 동정

SUMO3 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 SIM 간의 결합으로 생성된 이중특이성 항체 생산물의 발현 여부 및 크기를 SDS-PAGE 통해서 확인하였다. SDS-PAGE는 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 준용하였으며, 사용된 시료는 다음과 같다: 4-10% NuPAGE 겔(Invitrogen, 미국), 20X MOPS 완충액(Biorad, 미국), 염색을 통하여 항체의 크기를 확인하기 위한 코마시 블루 염색 완충액(comassie blue staining buffer, Biorad, 미국).

이중특이성 항체의 발현 여부 및 크기를 확인한 SDS-PAGE 결과를 도 2에 나타내었다.

SDS-PAGE 결과에서 레인 1 내지 4는 비환원(Non-reducing) 시료로서, 레인 1은 His-Trap 정제 시료 농축 전, 레인 2는 His-Trap 정제 시료 농축 후, 레인 3은 His-Trap 정제 시 분획(fraction) 1, 레인 4는 His-Trap 정제시 분획 2를 나타내며, 5 내지 8 레인은 레인 1 내지 4 시료를 환원(reducing)한 시료이다. 상기 결과에서 SUMO/SIM 이중특이성 항체의 발현 및 크기를 확인할 수 있다.

실시예 3: 웨스턴 블로팅을 이용한 이중특이성 항체의 생성여부 확인

웨스턴 블로팅법을 통한 분석을 위해서 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 분리한 항체를 SDS 샘플 완충액(SDS sample buffer)과 섞은 다음, 이를 끓이지 않은 시료와 10분간 끓인 시료를 각각 준비하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 준용하였으며, 사용된 시료는 다음과 같다:

4-10% NuPAGE 겔(Invitrogen, 미국), 20X MOPS 완충액(Biorad, 미국), PVDF 멤브레인(Millipore #IPVH00010, 미국), SUMO3 단백질의 HA를 확인하기 위한 항-HA-HRP 항체(Abcam, 영국) 및 SIM 도메인의 히스티딘을 확인하기 위한 항-His-HRP 항체(SIGMA, 미국)

상기 조건으로 수행한 웨스턴 블로팅의 결과를 도 3에 나타내었다. 항-HA-HRP 항체를 통하여 HA가 부착된 항-DLL4-SUMO 단백질을 검출하였으며, 항-His-HRP 항체를 통하여 His가 부착된 항-VEGF-SIM 단백질을 검출하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 항-DLL4-SUMO 단백질과 항-VEGF-SIM 단백질이 웨스턴 블로팅 결과상의 같은 위치에 존재하는 것을 보여주므로, SUMO3 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 SIM의 결합을 통하여 이중특이성 항체가 생성되었음을 확인하였다.

이러한 결과는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합 부위와 SIM이 서로 결합하여 이중특이성 항체와 같은 이중특이성 결합 복합체를 효율적으로 생산할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 4: 이중특이성 항체의 VEGF 와 DLL4 에 대한 결합능 어세이

상기 실시예 1에서 제작한 이중특이성 항체의 VEGF와 DLL4에 대한 결합능을 확인하기 위하여, 결합능 어세이를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 실시하였다. 이를 위하여 96-웰 플레이트에 VEGF와 DLL4를 각각 100ng씩 웰에 분주하여 실온에서 하루 동안 코팅한 후, 1% BSA/PBS를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트를 PBS로 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 미리 반응시킨 이중특이성 항체 혼합액을 다양한 농도(0nM 내지 10nM)로 상기 코팅된 웰에 넣고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 반응이 끝난 후, PBS-T를 이용하여 세척하였다. 이후, 상기 항체에 대한 2차 항체로써 HRP-conjugated goat anti-Kappa light chain 항체를 1:10,000의 비율로 희석해서 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, TMB substrate reagent(BD Biosciences #555214, 미국)를 이용해 발색반응을 유도하였으며, 2N 황산(H₂SO₄) 용액을 50㎕씩 첨가하여 발색반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 리더(Tecan, 스위스)를 이용해서 흡광도 450nm와 650nm에서 발색을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 항-VEGF-SIM 항체 및 항-DLL4-SUMO 항체는 각각 VEGF 및 DLL4에 결합하는 반면, SUMO 단백질과 SIM의 결합으로 형성된 본 발명의 이중특이성 항체(항-DLL4-SUMO X 항-VEGF-SIM 항체)는 DLL4와 VEGF 모두에 농도의존적으로 결합하는 것을 나타내어, 본 발명의 이중특이성 항체가 VEGF 및 DLL4 모두에 결합능을 가져 이중특이성 항체로서 기능하는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Novel bispecific binding complex using the interaction between SUMO protein and SIM and use thereof <130> PA120196KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a SIM binding region of SUMO protein <400> 1 Ser Glu Glu Lys Pro Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His Ile 1 5 10 15 Asn Leu Lys Val Ala Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys Ile 20 25 30 Lys Arg His Thr Pro Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Cys Glu Arg 35 40 45 Gln Gly Leu Ser Met Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln Pro 50 55 60 Ile Asn Glu Thr Asp Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu Asp 65 70 75 80 Thr Ile Asp Val Phe Gln Gln Gln Thr Gly Gly Val Pro Glu Ser Ser 85 90 95 Leu Ala Gly His Ser Phe 100 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM(SUMO interacting motif) <400> 2 Lys Thr Ile Asp Ala Ser Val Ser Lys Lys Ala Ala Asp Ser Thr Ser 1 5 10 15 Gln Cys Gly Lys Ala Thr Gly Ser Asp Ser Ser Gly Val Ile Asp Leu 20 25 30 Thr Met Asp Asp Glu Glu Ser Gly Ala Ser Gln Asp 35 40 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims

SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 항체; 및 SIM과 연결된 제2 항체를 포함하는 이중특이성 항체로서, 상기 SUMO의 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 SIM이 서로 결합하여 제1 항체 및 제2 항체가 연결된 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 제2 항체는 IgG, scFv(single chain variable fragment), dsFv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군에서 선택되는 형태인 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 SUMO 단백질은 효모 유래의 SMT3, 포유동물 유래의 SUMO1, SUMO2 및 SUMO3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위는 서열번호 1의 아미노산 서열로 정의되는 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 SIM은 서열번호 2의 아미노산 서열로 정의되는 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 제1 항체는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위와 링커(linker)로 연결된 것이고, 제2 항체는 SIM과 링커로 연결된 것인 이중특이성 항체.
제6항에 있어서, 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커인 것인 이중특이성 항체.
제7항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열로 정의되는 것인 이중특이성 항체
제7항에 있어서, 상기 비펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 제1 항체 및 제2 항체는 VEGF(vascular endothelial growth factor) 또는 DLL4(delta-like ligand 4)를 항원으로 하는 것인 이중특이성 항체.
제1항에 있어서, 상기 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위 및 SIM이 각각 제1 항체 및 제2 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 연결되어 있는 것인, 이중특이성 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제13항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
a) SUMO(small ubiquitin-like modifier) 단백질 중 SIM(SUMO interacting motif)과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 항체를 수득하는 단계;
b) SIM(SUMO interacting motif)에 연결된 제2 항체를 수득하는 단계; 및
c) 상기 제1 항체 및 제2 항체를 연결시켜 이중특이성 항체를 형성시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 a) 및 b) 단계는 SUMO 단백질 중 SIM과 결합하는 모티프를 포함하는 결합부위에 연결된 제1 항체를 코딩하는 유전자를 발현벡터에서 증폭하는 단계 및 SIM에 연결된 제2 항체를 코딩하는 유전자를 발현벡터에서 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 제조 방법은 단백질 A 친화성 컬럼, 히스티딘 친화성 컬럼 및 크기배제 크로마토그래피로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 이용하여 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 이중특이성 항체의 제조방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제18항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제20항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.