CN109963876B - 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 - Google Patents
抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109963876B CN109963876B CN201780071590.9A CN201780071590A CN109963876B CN 109963876 B CN109963876 B CN 109963876B CN 201780071590 A CN201780071590 A CN 201780071590A CN 109963876 B CN109963876 B CN 109963876B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chain
- substitutions
- seq
- amino acid
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 72
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 69
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 56
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 56
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 56
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 43
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N Dehydro-L-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(=O)C1=O SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 11
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 7
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 7
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- RUXQWZJWMCHCHH-IZZDOVSWSA-N [(e)-1-pyridin-2-ylethylideneamino]urea Chemical compound NC(=O)N\N=C(/C)C1=CC=CC=N1 RUXQWZJWMCHCHH-IZZDOVSWSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 229940124532 absorption promoter Drugs 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013632 covalent dimer Substances 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012362 drug development process Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950008579 ertumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical group 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
提供一种具有天然IgG特点的异源二聚体形式的抗PD‑1/抗HER2双特异性抗体及其制备方法，所述抗体同时结合两种靶分子，可治疗复杂疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月18日提交的中国专利申请号201611016435.0的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及抗PD-1/抗HER2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备。具体而言，本发明提供了一种具有天然IgG特点、并且没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式的抗PD-1/抗HER2双特异抗体及其制备方法。
背景技术
单克隆抗体是只作用于单一抗原表位的高度特异性抗体，已被广泛用于许多疾病的治疗，例如，癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病。但是，此类治疗分子如果单独使用，没有一种能够显示出足够的药效，这是由于疾病的复杂性，如癌症或炎症性疾病通常涉及多种疾病介导的分子通路以及信号通路之间的相叉作用。在这些情况下，靶向单一的分子不能提供最佳的治疗效果，而同时阻断多个靶点或者同一靶点的多个位点的分子能够改善治疗效果。同时，使用多特异性如双特异性分子的双靶向治疗可以简化新药开发过程，因为它是单一分子。和使用多个单特异分子的联合用药相比，对于患者和医疗工作者都是更方便的。
许多不同形式的双特异抗体或双功能分子在该领域已被报道。最初的双特异抗体是应用化学方法使用双功能偶联试剂将两个现有的IgG分子、Fab’或(Fab’)2片段连接起来。但是，这种化学偶联的双特异抗体存在很多的局限性，例如生产的工作强度，纯化异源偶联物、去除同源偶联物及原单特异抗体或片段的复杂性和低收率。
用于产生双特异性抗体的另一种方法是使用杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤)技术，其是通过体细胞融合两种分泌不同抗体的杂交瘤细胞系而生产的。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机配对，仅有抗体混合物的1/10是所需要的功能性双特异性抗体，这使纯化过程复杂并使生产收率减少。
WO2013060867描述了一种大规模生产异二聚体双特异抗体的方法，该方法先还原两种混合的同源二聚体形式抗体，然后通过在这两种同源二聚体抗体的CH3区引入不对称氨基酸突变从而促使不同抗体的Fab臂发生交换，最后通过氧化铰链区的链间二硫键形成稳定的双特异抗体。
WO2009089004描述了一种制备异源二聚体蛋白的方法，该方法通过突变CH3-CH3界面处的氨基酸为带电荷氨基酸，从而通过静电作用力促进异源二聚体形成，而不利于同源二聚体形成。
US5731168描述了一种利用“杵-臼”策略来制备异源二聚体IgG的方法。该方法将第一条链CH3区界面处的小氨基酸替换成大氨基酸，从而形成“杵”；同时将第二条链上CH3界面处相应的大氨基酸突变成小氨基酸，从而形成“臼”。杵和臼的相互作用有利于异源二聚体IgG的形成，而不利于同源二聚体的形成。
WO2012058768描述了一种稳定的和高特异的异源二聚体IgG制备方法。该方法组合采用阴性和阳性设计以及结构和计算机模型指导的蛋白工程技术来突变IgG1CH3结构域的多个氨基酸，从而形成稳定的并且同源二聚体杂质含量低的异源二聚体IgG。
程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是近期炙手可热的免疫检查点(immune checkpoint)，主要参与T细胞的活化调控，可以调节免疫应答的强弱程度和持续时间。在正常情况下，PD-1可以介导和维持机体组织的自身免疫耐受，防止在炎症反应过程中免疫系统过度活化伤害自身组织，对避免自身免疫性疾病的发生具有积极作用；在病理情况下，其参与肿瘤免疫以及多种自身免疫病的发生发展过程(Anticancer Agents MedChem.2015；15(3)：307-13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014 Mar；7(1)：1-17.TrendsMol Med.2015Jan；21(1)：24-33.Immunity.2013 Jul 25；39(1)：61-73.J ClinOncol.2015 Jun 10；33(17)：1974-82.)。
PD-1属于CD28家族成员，但不同于CD28家族其它成员如CTLA4能以二硫键形成共价二聚体，PD-1以单体形式存在。PD-1的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区样结构域、疏水的跨膜区和胞内区，其胞内区含有两个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转移基序(ITSM)。PD-1主要诱导性表达于活化的T细胞表面，也表达于B细胞、NK细胞、单核细胞、DC细胞。PD-1的配体包括PD-L1(programmeddeath ligand 1)、PD-L2(programmed death ligand 2)，其配体属于B7家族，其中PD-L1诱导性表达于多种免疫细胞表面包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、以及内皮细胞、表皮细胞等，而PD-L2仅诱导性表达于一些免疫细胞，包括巨噬细胞、DC细胞、B细胞(Autoimmun Rev，2013，12(11)：1091-1100.Front Immunol，2013，4：481.Nat Rev Cancer，2012，12(4)：252-264.Trends Mol Med.2015 Jan；21(1)：24-33.)。
在二十世纪80年代，Denis Slamon首次在189个原发性乳腺癌病例中发现HER2(人表皮生长因子受体2)基因在30％的病例中都过度扩增，并表明HER2与总存活率及复发时间密切相关(Salman DJ，等人，Science，235：177-182，1985)。目前的研究表明，大约25～30％的乳腺癌病人中的HER2都是过表达的(Revillion F，等人，Eur J Cancer，34：791-808，1998)，并且其与肿瘤的恶性生长程度相关(Wright C，等人，Cancer Res，49：2087-2090，1989)。
曲妥珠单抗(Trastuzumab)是一个抗HER2胞外区的人源化单克隆抗体(Carter P，等人，PNAS，89(10)：4285-4289，1992)。然而其在临床应用中的抗肿瘤效果往往没有临床前实验那么好，所以通常需要与化疗药等联合用药(Slamon DJ，等人，N Engl J Med，344：783-792，2001)。
设计一种可以募集效应细胞的双功能抗体是提高抗体效能的有效手段。目前为止，研究最多的是利用CD3分子的功能。通过CD3分子将杀伤性T细胞激活，可以有效地清除目的肿瘤(Haas C，等人，Immunobiology，214：441-453，2009)。其中Micormet公司开发的一种重组双功能T细胞激动抗体为BiTE，具有很好的前景，但是其最大的问题在于血浆半衰期非常短，人体半衰期仅为1小时(Loffler A，等人，Blood，95：2098-2103)。这是由BiTE本身的结构所导致的，其由两个单链抗体片段组成，分子量仅60kDa，并且缺失了抗体分子中对延长半衰期有重要作用的Fc片段。
卡妥索单抗(Catumaxomab)是另一种具有前景的多功能抗体，是一种靶向CD3及EpCAM的杂合Ig分子，目前该产品已经被批准用于腹水癌的治疗(Jager M，等人，CancerRes，72：24-32，2012)。另一种处于临床二期的多功能抗体为厄妥索单抗(Ertumaxomab)，其靶向CD3及HER2。这种杂合抗体的一条重链及轻链来源于大鼠的IgG，靶向CD3；另一条重链及轻链来源于小鼠的IgG，靶向HER2。由此而带来的问题就是这种产品的生产非常困难，因为，为了获得表达双功能厄妥索抗体的细胞系，首先要获得一株表达CD3抗体的二倍体杂交瘤，以及一株表达HER2抗体的二倍体杂交瘤，然后将两株杂交瘤再次杂交，获得四倍体杂交瘤，其可以表达抗CD3以及HER2的双功能抗体。而生产普通的单个靶点的抗体，只需要获得一株二倍体杂交瘤，与此相比较，双功能抗体的生产过程更复杂，而且四倍体杂交瘤的获得更加困难，并且由于其鼠源的来源，导致其免疫原性很高。
另外，由于抗CD3的抗体最明显的副反应是导致体内的细胞因子在短时间内增高，也称为细胞因子风暴。因此需要开发一种新的同时将免疫细胞招募至肿瘤细胞表面的双功能抗体。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种异源二聚体形式的双特异抗体，其包含能与PD-1特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与HER2特异性结合的第二个抗原结合功能区，其中所述双特异抗体包含通过一个或多个二硫键链间连接的第一Fc链及第二Fc链，该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到PD-1抗原结合功能区和HER2抗原结合功能区上；并且第一Fc链和第二Fc链在如下位置包含5个氨基酸的替换，
1)第一Fc链上366位及399位氨基酸替换，第二Fc链上351位、407位及409位氨基酸的替换；或者
2)第一Fc链上366位及409位氨基酸替换，第二Fc链上351位、399位及407位氨基酸替换；
包含上述氨基酸替换的第一Fc链与第二Fc链更倾向于互相形成异源二聚体而不倾向于各自形成同源二聚体，
其中氨基酸位置根据KabatEU指数编号系统编号。
在一些实施方案中，第一Fc链及第二Fc链氨基酸替换如下，
a)351位上替换为甘氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸，赖氨酸或色氨酸；
b)366位上替换为亮氨酸、脯氨酸、色氨酸或缬氨酸；
c)399位上替换为半胱氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸或丙氨酸；
d)407位上替换为亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，苏氨酸或组氨酸；和
e)409位上替换为半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸替换包括：
a)第一Fc链T366L及D399R替换，第二Fc链L351E、Y407L及K409V替换；
b)第一Fc链T366L及D399C替换，第二Fc链L351G、Y407L及K409C替换；
c)第一Fc链T366L及D399C替换，第二Fc链L351Y、Y407A及K409P替换；
d)第一Fc链T366P及D399N替换，第二Fc链L351V、Y407P及K409S替换；
e)第一Fc链T366W及D399G替换，第二Fc链L351D、Y407P及K409S替换；
f)第一Fc链T366P及D399I替换，第二Fc链L351P、Y407F及K409F替换；
g)第一Fc链T366V及D399T替换，第二Fc链L351K、Y407T及K409Q替换；
h)第一Fc链T366L及D399A替换，第二Fc链L351W、Y407H及K409R替换。
在一些实施方案中，氨基酸替换包括：
a)第一Fc链T366L及K409V替换，第二Fc链L351E、Y407L及D399R替换；
b)第一Fc链T366L及K409C替换，第二Fc链L351G、Y407L及D399C替换；
c)第一Fc链T366L及K409P替换，第二Fc链L351Y、Y407A及D399C替换；
d)第一Fc链T366P及K409S替换，第二Fc链L351V、Y407P及D399N替换；
e)第一Fc链T366W及K409S替换，第二Fc链L351D、Y407P及D399G替换；
f)第一Fc链T366P及K409F替换，第二Fc链L351P、Y407F及D399I替换；
g)第一Fc链T366V及K409Q替换，第二Fc链L351K、Y407T及D399T替换；
h)第一Fc链T366L及K409R替换，第二Fc链L351W、Y407H及D399A替换。
在一些实施方案中，第一Fc链的氨基酸替换为T366L和D399R，第二Fc链的氨基酸替换为L351E、Y407L和K409V。
在一些实施方案中，Fc链来源于IgG。
在一些实施方案中，PD-1和HER2抗原结合功能区是Fab片段或scFv片段。
在一些实施方案中，PD-1和HER2抗原结合功能区都是Fab片段。
在一些实施方案中，PD-1和HER2抗原结合功能区一个是Fab片段，另一个是scFv。
在一些实施方案中，Fab片段包含不同的第一重链可变区及第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区及第二轻链可变区。
在一些实施方案中，双特异抗体的氨基酸序列选自：SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16和18。
本发明的第二方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码如第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体。
在一些实施方案中，多核苷酸的序列选自：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15和17。
本发明的第三方面涉及一种重组表达载体，其包含第二方面所述的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达载体为基于pCDNA改造得到的质粒载体X0GC。
本发明的第四方面涉及一种宿主细胞，其包含第二方面所述的分离的多核苷酸，或第三方面所述的重组表达载体。
在一些实施方案中，宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E、仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO。
本发明的第五方面涉及一种组合物，其包含第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体或第二方面所述的分离的多核苷酸或第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。
本发明的第六方面涉及一种生产如第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体的方法，其包括步骤：
1)将第二方面所述的分离的多核苷酸或第三方面所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；
2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白进行还原；以及
3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。
在一些实施方案中，宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293F、仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO。
在一些实施方案中，还原步骤包括1)加入还原剂，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其他化学衍生物，2)在0.1mM或更高浓度二硫苏糖醇存在下在4℃条件下进行还原反应最少3小时，3)去除还原剂，如通过脱盐进行。
在一些实施方案中，氧化步骤包括1)在空气中氧化，也包括加入氧化剂，所述氧化剂选自：L-脱氢抗坏血酸或其他化学衍生物，2)在0.5mM或更高浓度L-脱氢抗坏血酸存在下在4℃条件下进行氧化反应最少5小时。
在一些实施方案中，所述的方法还包括分离纯化的步骤。
本发明的第七方面涉及第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途。
本发明的第八方面涉及第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物，其用做用于预防和/或治疗受试者疾病的药物。
本发明的第九方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，包括将第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物施予有需求的受试者。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地，人类受试者。
在一些实施方案中，所述疾病选自如下肿瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。
本发明将PD-1作为免疫细胞招募的分子，HER2作为肿瘤细胞的靶向分子，设计了一种全新的抗PD-1/抗HER2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体，其具有天然IgG特点，并且没有重轻链错配，是高度稳定的异源二聚体形式的抗PD-1/抗HER2双特异抗体。该双特异抗体能同时结合两种靶分子PD-1和HER2并且在治疗复杂疾病方面会更有效。
附图说明
图1：示出了异源二聚体抗体分子的单体的洗脱峰。
图2：示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的结构。
图3.示出了一条重链和一条轻链的半抗体分子结构图。
图4.示出了一条重链和一条轻链的半抗体分子的SEC分析结果。其中A图和B图分别表示抗HER2半抗体分子和抗PD-1半抗体分子的结果。
图5.示出了抗PD-1，抗HER2抗体半抗体分子氧化产物的SDS-PAGE分析结果。
图6.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的洗脱峰。
图7.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的SDS-PAGE分析结果。
图8.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的SEC分析结果。
图9.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的稳定性实验。
图10.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的稳定性实验。
图11.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的Her2结合活性，PD-1结合活性。其中A图和B图分别表示HER2结合活性和PD-1结合活性。
图12.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子与高表达PD-1的CHO/PD-1细胞和高表达HER2的SK-BR-3细胞的同时结合。其中A图到D图分别表示HER2单抗、PD-1单抗、HER2单抗+PD-1单抗和抗PD-1BJHM/抗HER2的同时结合。
图13.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子封闭PD-1/PD-L1结合，PD-1/PD-L2结合的活性。其中A图和B图分别表示PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2的结合封闭活性。
图14.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子促进细胞因子IL-2的分泌。
图15.示出了抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的药时曲线。
具体实施方式
定义：
共价连接是指异源二聚体形式的双特异抗体中，两个Fc链之间，任一个Fc链及与其相连接的抗原结合功能区之间，是通过共价键而连接成为一个分子。其中Fc链包含通过一个或多个通过共价连接(如二硫键链)而连接的第一抗原结合功能区及第二抗原结合功能区；该第一Fc链及第二Fc链分别通过共价连接(如亚胺键或酰胺键)而连接到一个抗原结合功能区上；
抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。
一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。
第一Fc链及第二Fc链是指通过共价连接而组成结合片段，共价连接包括二硫键，每条链至少包含免疫球蛋白重链恒定区的一部分；并且该第一Fc链及第二Fc链在氨基酸序列上是不同的，至少包括了一位氨基酸的不同。在此发明中的第一Fc链及第二Fc链，相同链之间存在强烈的相互排斥作用，而不同链之间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。在本发明中，当第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，并且在存在还原剂时，同源二聚体的比例低于50％，即单体(一条Fc链或者一条Fc链及其相连接的抗原结合功能区)比例大于50％。
免疫球蛋白是具有四条多肽链的对称结构，其中两条较长、相对分子量较大的相同的重链，含450～550个氨基酸残基，相对分子质量在55000～70000Da之间；两条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)，含约210个氨基酸残基，相对分子质量约24000Da。不同的免疫球蛋白重链和轻链在靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区(variable region，V区)，而靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constantregion，C区)。重链中可变区约占重链长度的1/4，恒定区约占重链长度的3/4。对于已知五种Ig来说，IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)和IgE(ε)，其中前三类Ig的H链内有三个恒定区，即CH1、CH2和CH3组成。后两类(IgM和IgE)的H链中有一个VH区和四个恒定区，即CH1至CH4。恒定区既是免疫球蛋白分子的骨架，又是激活免疫反应的部位之一。
本发明中的恒定区一部分至少包括了第一Fc链和第二Fc链相互作用的区域，该区域对于IgG来说，是位于CH3区域的一部分氨基酸，至少包括GLN347、TYR349、THR 350、LEU351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439。
第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗原结合功能区上是指第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗体的抗原结合片段，或可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段变构体，或可以识别配体的受体，或可以识别受体的配体，其中所述共价键是指是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构叫做共价键，或者说共价键是原子间通过共用电子对所形成的相互作用。同一种的元素的原子或不同元素的都可以通过共价键结合，对于本发明的第一Fc链及第二Fc链间的共价键，包括但不限于一分子氨基酸的氨基与另一分子氨基酸的羧基脱水反应形成的酰胺键，或者乙二醇或聚乙二醇或其他化合物或其多聚物的醛基与一分子氨基酸的氨基形成酰胺键或亚胺键，其中连接体是可以将两条多肽链通过共价键连接起来的一段氨基酸序列或者一种化合物或者一种化合物的多聚体，其中一段氨基酸序列包括但不限于一段小肽，如GGGGSGGGGSGGGGS，通过酰胺键将第一Fc链或第二Fc链，以及可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段结构变构体连接起来
第一Fc链与第二Fc链更倾向于形成异源二聚体而不倾向于各自形成同源二聚体是指，由于在第一Fc链与第二Fc链中，相同的多肽链间存在互相排斥的作用，而不同的多肽链间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。
Kabat EU指数编号系统是指，Kabat利用一种方法将一个编号指定给抗体序列的每个氨基酸并且这种指定每个残基的编号的方法已经成为本领域的标准方法。Kabat方案可以延伸到不存在于他的研究中的其它抗体，基于保守的氨基酸，将目标抗体与Kabat鉴定的共有序列之一进行比对。
Fc结构域是指可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。
IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
半抗体分子是指抗体的一条重链与一条轻链形成的结构，其中重链与轻链间可以通过共价键连接，也可以不通过共价键连接，是一种识别抗原的单价抗体结构。
Fab片段是一种分子识别序列，是抗原结合片段(fragment of antigen binding，Fab)，相当于抗体分子的两个臂，由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。scFv是一种分子识别序列，是一种由抗体的轻链可变区与重链可变区通过基因工程改造而得到的抗体片段的结构异构体。膜受体的细胞外区是一种分子识别序列，膜受体通常包括位于细胞外部的可以识别并结合相应抗原或者配体的细胞外区域，将受体锚定在细胞表面的跨膜区，以及在胞内的具有激酶活性或者可以传递信号通路的胞内区。细胞膜受体的配体是指能被膜受体胞外区识别并结合的蛋白质，小肽或化合物。细胞因子包是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。蛋白表达标签指在目标蛋白的N端或C端加入的一段氨基酸序列，可以是小肽也可以是长的氨基酸，标签的加入可以有利于蛋白质的正确折叠，可以有利于蛋白质的分离纯化，可以有利于降低蛋白质在胞内的降解，常用的标签包括但不限于HA，SUMO，His，GST，GFP，Flag。
可应用于本发明的异源二聚体形式的双特性抗体中的抗体并无任何限制。优选地，现有技术中已知可以用于治疗和/或预防疾病的抗体均可以用于本发明。
本发明的异源二聚体形式的双特性抗体可具有一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。例如，某些氨基酸可以替换在蛋白质结构中的其它氨基酸而没有明显损失与其它多肽(如抗原)或细胞结合的能力。由于结合能力和蛋白性质决定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上进行某些氨基酸序列的替换而不会明显损失它们的生物效用或活性。
在许多情况中，多肽变体含有一个或多个保守替换。“保守替换”是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生变化。
氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准，是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。。在本发明中，在满足同一性限定的情况下，还需要所获得的变体序列具有母体序列所具有的生物活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％，或至少约99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的多核苷酸或多肽同一性。由于遗传密码的冗余性，将存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。
本发明的另一个实施方式中，提供了能够在中度至高度严格条件下与本发明提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列相杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次。本领域技术人员理解，可容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方式中，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
本发明的宿主细胞可以是用于外源基因表达的所有细胞，包括但不限于大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞。
本发明的载体包括可以在任何类型的细胞或生物体中进行复制的载体，包括如质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体。在一些实施方式中，包括本发明多核苷酸的载体是适合于多核苷酸繁殖或复制的载体，或者是适合于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知并可以购买的。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒复制和选择的复制起点(如复制的ColE1起点)和选择标记(如氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指包含用于在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体包括抗体片段所需要的控制序列或调控元件的载体。
本发明的载体可以是用于外源基因表达的所有载体，包括但不限于质粒载体，其中质粒载体至少包含复制起始位点、启动子、目的基因、多克隆位点、筛选标记基因，优选地，本发明所述载体包括但不限于基于pCDNA改造得到的质粒载体，比如X0GC载体。
本发明的受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。
本发明所涉及的疾病的范围包括但不限于肿瘤，优选的，所述肿瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。
药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例1 抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的载体构建
构建分别含抗人PD-1(Pem)的抗体重链和轻链的X0GC表达载体，其中抗体可变区序列来源于http：//www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi？pdbcode＝9798。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。通过PCR的方法分别扩增轻链可变区以及轻链恒定区，重链可变区以及重链恒定区。本申请中所有PCR反应均使用NEB公司的Phusion超保真DNA聚合酶(F-530L)。PCR引物根据碱基互补原则以及酶切位点的需要进行常规设计。反应体系均为：H2O 8.9μl，5×Phusion超保真DNA聚合酶缓冲液4μl，1mM dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.1μl，模板1μl。将可变区及恒定区PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳后用DNA回收试剂盒(Promega，A9282，下同)回收相应片段。以回收的可变区片段与恒定区片段作为模板，使用可变区上游引物及恒定区下游引物，再进行一轮PCR反应，然后再回收相应片段，得到重链和轻链的全长片段。将X0GC载体及全长片段，用EcoRI(NEB，货号R3101L)及HindIII(NEB，货号R3104L)酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液3 2μl，EcoRI及HindIII各0.5μl，胶回收获得的全长片段3μl，H2O 14.5μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物用T4DNA连接酶(NEB，货号M0202V)连接(下同)，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，胶回收获得的全长片段3μl，胶回收获得的X0GC载体3μl，H2O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根，CB104，下同)。获得抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。
本发明同时分别构建了另一种抗人PD-1(BJHM)的抗体重链和轻链的X0GC表达载体。其中轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。获得抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。
分别构建抗人HER2的抗体重链和轻链的X0GC表达载体，其中抗体可变区序列来源于http：//www.drugbank.ca/drugs/DB00072，重链恒定区为人IgG1(Fc2)。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。获得抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。
实施例2 抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的表达
分别将含抗人PD-1抗体的重链和轻链的表达载体转染293F细胞(FreeStyleTM293-F Cells，货号R79007，invitrogen)，另外分别将含抗人HER2抗体的重链和轻链的表达载体也转染293F细胞。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的FreeStyleTM293表达培养基(FreeStyleTM293 Expression Medium，货号12338001，Gibco)中，细胞密度为200*105细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为36.67ug/mL，轻轻混匀；然后加入线性PEI(聚乙烯亚胺，线形，M.W.25000，货号43896，Alfa Aesar)，终浓度为55ug/mL，轻轻混匀。之后放入细胞培养箱，120rpm摇床37℃培养1小时。之后加入19倍转染体积的新鲜培养基。继续120rpm摇床37℃培养。离心收集转染5～6天的细胞培养上清。
通过ELISA的方法测定表达量。在应用层析柱纯化之前，以0.2μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤在4℃下进行。
实施例3.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子表达产物的纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.，22ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A(20mM磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.4)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的细胞上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡。样品分别为抗PD-1表达产物和抗Her2表达产物。之后，首先以流动相B1(含有0.5M精氨酸的流动相A)冲洗5个柱体积；然后以流动相B2(100mM柠檬酸，pH 3.0)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；以上洗脱步骤流速都为5ml/min。抗PD-1-Fc1的洗脱峰色谱图如图1所示，抗HER2-Fc2的洗脱峰与之类似(结果未包括)。收集标示的洗脱峰(图示灰色区域)，并通过滴加1M醋酸钠溶液将pH调至5.0。
实施例4.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的纯化
抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的结构如图2所示。
将上述rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.，22ml，GE Healthcare)方法获得的抗PD-1和抗Her2表达产物，进行体外重组以获得异源二聚体。首先将上述纯化收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)PBS(pH＝7.4)。将获得的抗PD-1和抗HER2表达产物分别加所述PBS调整到1mg/ml，加入1/200倍终体积的1M DTT，DTT终浓度分别为5mM，在4℃条件下进行还原(3-8小时)，通过还原的过程，二硫键被打开，抗PD-1和抗HER2表达产物中含有的少量的抗体同源二聚体分子的铰链区二硫键也打开，形成了含有一条重链和一条轻链的半抗体分子，结构如图3所示。还原的样品经流动相缓冲液中包含1mM DTT还原剂的SEC-HPLC分析，结果如图4所示，抗PD-1和抗HER2同源二聚体分子重量比例均小于10％，相应地半抗体分子重量比例均大于90％。
然后将还原的抗PD-1和抗HER2半抗体分子等摩尔比例混合，在4℃条件下进行重组反应24小时，在重组的过程中，抗PD-1和抗HER2半抗体分子分子通过CH2/CH3的非共价作用力形成了同时含有抗PD-1以及抗HER2半抗体分子的异源二聚体形式的双特异抗体，之后将蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)终止还原，通过空气或者氧化剂进行氧化反应，使异源二聚体的双特异抗体的二硫键重新形成。氧化反应的条件为加入氧化剂100mM L-脱氢抗坏血酸，蛋白终浓度1mg/ml，氧化剂终浓度1mM，在4℃条件下进行氧化，反应进行24小时。将上述氧化反应获得的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示。
上述抗PD-1和抗HER2半抗体分子经还原氧化得到的异源二聚体分子通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为10mM磷酸钠缓冲液，pH 5.8。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及离子色谱柱Source 15S(16mmI.D.，17ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A(10mM磷酸钠，pH 7.0)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的蛋白溶液进行上样，流速为3ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡，之后以A(10mM磷酸钠，pH 5.8)到B(10mM磷酸钠，pH 5.8)梯度冲洗20个柱体积(0％B-100％B，170min，流速2ml/min)，收集标示的洗脱主峰(如图6所示)，收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)，过滤除菌4℃保存。将纯化产物通过SDS-PAGE方法分析，结果如图7所示。经SEC-HPLC纯度分析，结果如图8所示，纯度为97.3％。
实施例5.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的稳定性
分别将充分密封的10mg/mL和1mg/mL的PD-1/HER2异源二聚体样品放置于40℃恒温箱(BINDER KBF240)，在相应时间点(基线(第0天)、第1天、第3天、第5天、第7天，第14天)取20μg样品进行高效排阻液相色谱(SEC-HPLC)分离。上述SEC-HPLC条件如下：(1)排阻色谱柱：TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience)，5μm，7.8mm×30cm；(2)流动相：5mM PBS，150mMNaCl，pH 6.7；(3)流速：0.6mL/min；(4)紫外检测波长：280nm；(5)采集时间：30min。所用仪器是Agilent 1200 Infinity色谱仪，利用Agilent ChemStation记录图谱并计算剩余单体的比例。如图9(10mg/mL)和图10(1mg/mL)所示，在40℃实验条件下，所述二聚体不会发生明显的聚集；故认为所述PD-1/HER2异源二聚体具备较好的热稳定性。
实施例6.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的体外结合活性
用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定PD-1/HER2异源二聚体抗体与单个抗原的结合能力。
该方法具体实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1(北京义翘神州，货号10377-H08H)或者人HER2(北京义翘神州，货号10004-H08H)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的异源二聚体抗体样品以及对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶2000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图11所示，抗PD-1pem/抗HER2和抗PD-1BJHM/抗HER2均具有对PD-1和HER2的高亲和力，较好的保持了双价单抗的抗原亲和活性。其中抗PD-1BJHM/抗HER2比PD-1pem/抗HER2具有更强的PD-1亲和力。
实施例7.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的双靶点抗原同时结合活性
用流式细胞术(FACS)在高表达PD-1的CHO/PD-1(GenScript，货号M00529)细胞和高表达HER2的SK-BR-3细胞上测定PD-1/HER2异源二聚体抗体与双靶点抗原的同时结合能力。
参照PKH26试剂盒(Sigma，货号SLBH4568V)使用说明书染色CHO/PD-1细胞。简要的说，收集CHO/PD-1细胞，无血清培养基洗涤一次后，用PKH26试剂盒里的Diluent C分别将CHO/PD-1制备成2×107/mL细胞悬液，将PKH26染料稀释到4μM，然后1∶1混合在一起，此混合悬液的细胞密度为1×107/mL，PKH26的浓度为2μM，室温孵育1分钟，再用同等体积的FBS孵育1分钟终止染色。400g离心10分钟，用完全培养基洗涤两次，再重悬于完全培养基备用。参照CFSE试剂盒(Life technology，货号C34554)使用说明书染色SK-BR-3细胞。简要的说，用PBS稀释CFSE到工作浓度0.5μM并在37℃预热，1000rpm离心5分钟收集SK-BR-3细胞，用预热的CFSE工作溶液重悬SK-BR-3，在37℃孵育15分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，再重悬于完全培养基中，孵育30分钟，用完全培养基洗涤一次，再重悬于完全培养基备用。
离心收集以上已经染色的细胞，并用含2％FBS的冷PBS洗涤一次。将细胞重悬于含2％FBS的冷PBS中，细胞密度为5×106/mL。将SK-BR-3和CHO/PD-1按1∶1混合，然后每个流式管取100μL(即2.5×105SK-BR-3和2.5×105CHO/PD-1)，再加入100μL稀释于含2％FBS的冷PBS中的异源二聚体抗体样品，对照以及同型对照(人免疫球蛋白，江西博雅生物制药股份有限公司，国药准字S19993012)，终浓度为5nM。流式管于冰上孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次。再重悬于500μL冷PBS中，该细胞悬液于流式细胞仪上进行检测分析。
结果如表1和图12所示，通过异源二聚体抗体同时结合高表达PD-1的CHO/PD-1细胞和高表达HER2的SK-BR-3细胞，PD-1/HER2异源二聚体抗体能够引发SK-BR-3和CHO/PD-1细胞的靠近关联，这是介导T细胞杀伤肿瘤细胞的基础。
表1诱导靠近关联的细胞比例
实施例8.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子对PD-1与配体PD-L1，PD-L2结合的阻断活性
用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1-Fc，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的异源二聚体抗体样品以及对照，并同时加入终浓度为1μg/mL的生物素标记的PD-L1-Fc或者终浓度为4μg/mL的生物素标记的PD-L2，100μL/孔，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶1000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(BD，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图13所示，抗PD-1pem/抗HER2和抗PD-1BJHM/抗HER2均能够阻断PD-1/PD-L1结合、PD-1/PD-L2结合，较好的保持了双价单抗的阻断活性。其中抗PD-1BJHM/抗HER2比PD-1pem/抗HER2具有更强的PD-1阻断活性。
实施例9.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子的T细胞细胞因子分泌增强活性
收集人PBMC细胞(Lonza，货号CC-2702)。将人PBMC细胞按细胞密度为2×106/mL，重悬于完全培养基(RPMI 1640含10％FBS)中，接种于96孔板，每孔100μL(2×105细胞每孔)，再加入用完全培养基序列稀释的PD-1/HER2异源二聚体抗体样品以及对照，50μL每孔。加入稀释在完全培养基中的终浓度为1μg/mL的PHA(Sigma，货号L-2769)，50μL每孔。将培养板置于37℃二氧化碳培养箱中孵育。孵育3天之后，取出50μL孔内上清，用于检测细胞因子IL-2(RayBiotech，货号ELH-IL2)。
如图14所示，人T细胞在PHA的刺激下，会活化分泌IL-2。加入PD-1抗体会增强T细胞的活化，促进细胞因子的分泌，而PD-1/HER2异源二聚体抗体有与PD-1单克隆抗体相似的效应，浓度依赖性地促进细胞因子IL-2的分泌。
实施例10.抗PD-1/抗HER2异源二聚体抗体分子在大鼠体内的药代动力学研究
实验材料选用雌性SD大鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。大鼠适应环境一周后，随机分组，每组3只。各组分别给予PD-1单抗、HER2单抗、PD-1/HER2异源二聚体抗体，剂量均为20nmol/kg，静脉注射，单次给药。在0点，给药后5分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时、312小时、360小时、408小时、480小时眼眶采血0.2mL-0.3mL，不予抗凝，室温放置血样30分钟至1个小时，待凝血后，3000rpm离心10分钟，得到的血清样品冷冻于-80℃保存，待测。
ELISA测定血清中PD-1单抗、HER2单抗、PD-1/HER2异源二聚体抗体的浓度。简要的说，用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液4℃过夜包被人重组HER2蛋白(北京义翘神州，货号10004-H08H)，或者重组PD-1蛋白(北京义翘神州，货号10377-H08H)于高吸附酶标板上。PBST洗涤。为了防止非特异性结合，用含5％脱脂奶粉的PBST封闭该板，PBST洗涤。然后加入用含10％混合大鼠血清、1％BSA的PBST稀释的待测血清样品孵育，25℃，1小时，PBST洗涤该板。加入稀释于含5％脱脂奶粉的PBST中的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，25℃，1小时，PBST洗涤该板。最后使用比色底物TMB进行显色，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图15所示，单次静脉注射的剂量为20nmol/kg的PD-1/HER2异源二聚体抗，在大鼠体内显示出了良好的药代动力学特征。抗PD-1BJHM/抗HER2异源二聚体抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为207小时；药时曲线下面积AUClast为33448nM.hr；C0为534nM；表观分布容积Vd为148mL/Kg；清除率CL为0.50mL/hr/kg；平均驻留时间MRTlast为159小时。
Claims (26)
1.一种异源二聚体形式的双特异抗体，其包含能与PD-1特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与HER2特异性结合的第二个抗原结合功能区，其中所述双特异抗体包含通过一个或多个二硫键链间连接的第一Fc链及第二Fc链，该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到PD-1抗原结合功能区和HER2抗原结合功能区上，或者该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到HER2抗原结合功能区和PD-1抗原结合功能区上；并且第一Fc链和第二Fc链在如下位置包含5个氨基酸的替换，
第一Fc链上T366位及D399位氨基酸替换，第二Fc链上L351位、Y407位及K409位氨基酸的替换；
其中所述5个氨基酸替换包括：
a)第一Fc链T366L及D399R替换，第二Fc链L351E、Y407L及K409V替换；
b)第一Fc链T366L及D399C替换，第二Fc链L351G、Y407L及K409C替换；
c)第一Fc链T366L及D399C替换，第二Fc链L351Y、Y407A及K409P替换；
d)第一Fc链T366P及D399N替换，第二Fc链L351V、Y407P及K409S替换；
e)第一Fc链T366W及D399G替换，第二Fc链L351D、Y407P及K409S替换；
f)第一Fc链T366P及D399I替换，第二Fc链L351P、Y407F及K409F替换；
g)第一Fc链T366V及D399T替换，第二Fc链L351K、Y407T及K409Q替换；
h)第一Fc链T366L及D399A替换，第二Fc链L351W、Y407H及K409R替换；
其中所述PD-1抗原结合功能区包含：
(i)如SEQ ID NO：12的氨基酸序列所示的重链可变区和如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示的轻链可变区，或
(ii)如SEQ ID NO：18的氨基酸序列所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16的氨基酸序列所示的轻链可变区；并且
其中所述HER2抗原结合功能区包含：
(i)如SEQ ID NO：6的氨基酸序列所示的重链可变区，以及
(ii)如SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的轻链可变区，
其中氨基酸位置根据Kabat EU指数编号系统编号。
2.如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中第一Fc链的氨基酸替换为T366L和D399R，第二Fc链的氨基酸替换为L351E、Y407L和K409V。
3.如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中Fc链来源于IgG。
4.如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中PD-1和HER2抗原结合功能区是Fab片段或scFv片段。
5.如权利要求4所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中PD-1和HER2抗原结合功能区都是Fab片段。
6.如权利要求4所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中PD-1和HER2抗原结合功能区一个是Fab片段，另一个是scFv。
7.如权利要求4-6中任一项所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中Fab片段包含不同的第一重链可变区及第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区及第二轻链可变区。
8.如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中第一Fc链及其相连接的PD-1抗原结合功能区和第二Fc链及其相连接的HER2抗原结合功能区,或者第一Fc链及其相连接的HER2抗原结合功能区和第二Fc链及其相连接的PD-1抗原结合功能区，在单独存在并且同时存在还原剂时其形成同源二聚体的重量比例均低于50％。
9.如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体，其中双特异抗体的氨基酸序列进一步包含：SEQ ID NO：4、8和14。
10.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-9中任一项所述的异源二聚体形式的双特异抗体。
11.如权利要求10所述的分离的多核苷酸，其序列包含：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和13。
12.如权利要求10所述的分离的多核苷酸，其序列包含：SEQ ID NO：1、3、5、7、13、15和17。
13.一种重组表达载体，其包含如权利要求10所述的分离的多核苷酸。
14.如权利要求13所述的重组表达载体，其中表达载体为基于pCDNA改造得到的质粒载体X0GC。
15.一种宿主细胞，其包含如权利要求11或12所述的分离的多核苷酸，或者如权利要求12或13所述的重组表达载体。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293E、HEK293F、仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO。
17.一种组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所述的异源二聚体形式的双特异抗体、如权利要求10-12中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求13或14所述的重组表达载体、或者如权利要求15或16所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。
18.一种生产如权利要求1-9中任一项所述的异源二聚体形式的双特异抗体的方法，其包括步骤：
1)将如权利要求10-12中任一项所述的分离的多核苷酸、或者如权利要求13或14所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；
2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白分别进行纯化及还原；以及
3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。
19.如权利要求18所述的方法，其中宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO。
20.如权利要求18所述的方法，其中还原步骤包括1)加入还原剂，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其他化学衍生物，2)在0.1mM或更高浓度二硫苏糖醇存在下在4℃条件下进行还原反应最少3小时，3)去除还原剂，如通过脱盐进行。
21.如权利要求18所述的方法，其中氧化步骤包括1)在空气中氧化，也包括加入氧化剂，所述氧化剂选自：L-脱氢抗坏血酸或其他化学衍生物，2)在0.5mM或更高浓度L-脱氢抗坏血酸存在下在4℃条件下进行氧化反应最少5小时。
22.如权利要求18所述的方法，其还包括分离纯化的步骤。
23.如权利要求1-9中任一项所述的异源二聚体形式的双特异抗体、如权利要求10-12中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求13或14所述的重组表达载体、如权利要求15或16所述的宿主细胞、和/或如权利要求17所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中受试者是哺乳动物。
25.如权利要求24所述的用途，其中受试者是人类受试者。
26.如权利要求23所述的用途，其中所述疾病选自如下肿瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611016435 | 2016-11-18 | ||
| CN2016110164350 | 2016-11-18 | ||
| PCT/CN2017/111310 WO2018090950A1 (zh) | 2016-11-18 | 2017-11-16 | 抗pd‐1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109963876A CN109963876A (zh) | 2019-07-02 |
| CN109963876B true CN109963876B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=62146170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780071590.9A Active CN109963876B (zh) | 2016-11-18 | 2017-11-16 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11319378B2 (zh) |
| EP (1) | EP3533804A4 (zh) |
| JP (1) | JP7031810B2 (zh) |
| KR (1) | KR102247704B1 (zh) |
| CN (1) | CN109963876B (zh) |
| AU (1) | AU2017359813A1 (zh) |
| BR (1) | BR112019010051A2 (zh) |
| CA (1) | CA3043652A1 (zh) |
| CL (1) | CL2019001352A1 (zh) |
| CO (1) | CO2019005101A2 (zh) |
| DO (1) | DOP2019000124A (zh) |
| EA (1) | EA201990894A9 (zh) |
| EC (1) | ECSP19035482A (zh) |
| MX (1) | MX2019005858A (zh) |
| PE (1) | PE20191080A1 (zh) |
| PH (1) | PH12019501089A1 (zh) |
| SG (1) | SG10201913260VA (zh) |
| TN (1) | TN2019000161A1 (zh) |
| WO (1) | WO2018090950A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2017336867B2 (en) * | 2016-09-29 | 2024-03-14 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof |
| EP3533804A4 (en) | 2016-11-18 | 2020-06-17 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | BISPECIFIC ANTIBODY TYPE ANTI-PD -1 / ANTI-HER2 NATURAL ANTIBODY HETERODIMERIC FORM AND PREPARATION THEREOF |
| KR20200093639A (ko) * | 2017-12-04 | 2020-08-05 | 북경한미약품 유한공사 | 천연 항체 구조-유사 헤테로다이머 형태의 항 pd-l1/항 cd47 이중특이성 항체 및 이의 제조 |
| WO2019153200A1 (zh) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
| TWI825214B (zh) * | 2018-11-05 | 2023-12-11 | 中國大陸商北京韓美藥品有限公司 | 抗TNFα/抗IL-17A天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備 |
| CN111196856A (zh) * | 2018-11-19 | 2020-05-26 | 三生国健药业（上海）股份有限公司 | 抗her2/pd1双特异性抗体 |
| CN111378045B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-08-02 | 长春金赛药业有限责任公司 | 二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物 |
| EP4011390A4 (en) * | 2019-08-07 | 2023-09-13 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. | PREPARATION WITH ANTI-PD-1/HER2 BISPECIFIC ANTIBODY AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF |
| CN111995685B (zh) * | 2020-04-30 | 2022-03-08 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种靶向her2和pd-1的双特异性抗体及其应用 |
| WO2024061223A1 (zh) * | 2022-09-20 | 2024-03-28 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 抗体及其在抗肿瘤中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1176659A (zh) * | 1995-03-01 | 1998-03-18 | 基因技术股份有限公司 | 制备异多聚体多肽的方法 |
| CN1299370A (zh) * | 1998-05-06 | 2001-06-13 | 基因技术股份有限公司 | 用离子交换层析纯化蛋白质 |
| CN103429620A (zh) * | 2010-11-05 | 2013-12-04 | 酵活有限公司 | 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 |
| CN104114579A (zh) * | 2011-10-27 | 2014-10-22 | 根马布股份公司 | 异二聚体蛋白的生成 |
| WO2016115274A1 (en) * | 2015-01-14 | 2016-07-21 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs |
Family Cites Families (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9100352A (nl) | 1991-02-27 | 1992-09-16 | Hoogovens Groep Bv | Werkwijze voor het vervaardigen van ijzerfolie door elektrodepositie. |
| US5869046A (en) * | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| US20050106667A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
| US20060074225A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-04-06 | Xencor, Inc. | Monomeric immunoglobulin Fc domains |
| DK2170959T3 (da) | 2007-06-18 | 2014-01-13 | Merck Sharp & Dohme | Antistoffer mod human programmeret dødsreceptor pd-1 |
| PT2235064E (pt) | 2008-01-07 | 2016-03-01 | Amgen Inc | Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática |
| CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
| JP2013511281A (ja) | 2009-11-23 | 2013-04-04 | アムジェン インコーポレイテッド | 単量体抗体Ｆｃ |
| EA028804B1 (ru) | 2011-03-25 | 2018-01-31 | Гленмарк Фармасьютикалс С.А. | Гетеродимерные иммуноглобулины |
| LT2699264T (lt) | 2011-04-20 | 2018-07-10 | Medimmune, Llc | Antikūnai ir kitos molekulės, kurios jungiasi prie b7-h1 ir pd-1 |
| WO2013063702A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Zymeworks Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain |
| MX360109B (es) | 2012-04-20 | 2018-10-23 | Merus Nv | Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig. |
| AU2013322710A1 (en) | 2012-09-25 | 2015-04-16 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Purification of hetero-dimeric immunoglobulins |
| CA2889951C (en) | 2012-11-02 | 2023-04-18 | Zymeworks Inc. | Crystal structures of heterodimeric fc domains |
| US9914785B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-03-13 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
| WO2014082179A1 (en) | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
| JP6392770B2 (ja) | 2012-12-03 | 2018-09-19 | ノビミューン エスアー | 抗ｃｄ４７抗体およびその使用方法 |
| JP6586087B2 (ja) * | 2013-08-20 | 2019-10-02 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． | Ｐｄ−１アンタゴニストとジナシクリブとの組合せでの癌治療 |
| EP3083692B1 (en) | 2013-12-17 | 2020-02-19 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating her2-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-her2 antibodies |
| WO2015095412A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Zhong Wang | Bispecific antibody with two single-domain antigen-binding fragments |
| TWI681969B (zh) | 2014-01-23 | 2020-01-11 | 美商再生元醫藥公司 | 針對ｐｄ-１的人類抗體 |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| WO2016024021A1 (en) | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Merck Patent Gmbh | Sirp-alpha immunoglobulin fusion proteins |
| CN107428825A (zh) | 2014-10-10 | 2017-12-01 | 创祐生技股份有限公司 | 治疗及/或预防肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法 |
| WO2016109415A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | Celgene Corporation | Anti-cd47 antibodies and uses thereof |
| WO2016170039A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of antibody binding to angiopoietin 2 with antibody binding to programmed death 1 polypeptide |
| TW201709929A (zh) * | 2015-06-12 | 2017-03-16 | 宏觀基因股份有限公司 | 治療癌症的聯合療法 |
| CN105111314B (zh) | 2015-08-13 | 2019-01-08 | 成都百世博生物技术有限公司 | 一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途 |
| CN105175545B (zh) | 2015-10-20 | 2019-01-25 | 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 | 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用 |
| CN106883297B (zh) | 2015-12-16 | 2019-12-13 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途 |
| WO2017117179A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor |
| WO2017167350A1 (en) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | Horst Lindhofer | Multispecific antibodies for use in the treatment of a neoplasm of the urinary tract |
| GB201611530D0 (en) | 2016-07-01 | 2016-08-17 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides |
| AU2017336867B2 (en) | 2016-09-29 | 2024-03-14 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof |
| KR20190065183A (ko) | 2016-10-15 | 2019-06-11 | 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 | Pd-1 항체 |
| EP3533804A4 (en) | 2016-11-18 | 2020-06-17 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | BISPECIFIC ANTIBODY TYPE ANTI-PD -1 / ANTI-HER2 NATURAL ANTIBODY HETERODIMERIC FORM AND PREPARATION THEREOF |
| AU2018243104A1 (en) | 2017-04-01 | 2019-10-17 | Beijing Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof |
| AR112603A1 (es) | 2017-07-10 | 2019-11-20 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control |
| CN107325184A (zh) | 2017-08-08 | 2017-11-07 | 安徽大学 | 一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其应用 |
| EA039662B1 (ru) | 2017-10-03 | 2022-02-24 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1 |
| KR20200093639A (ko) | 2017-12-04 | 2020-08-05 | 북경한미약품 유한공사 | 천연 항체 구조-유사 헤테로다이머 형태의 항 pd-l1/항 cd47 이중특이성 항체 및 이의 제조 |
| WO2019153200A1 (zh) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
| CA3090878A1 (en) | 2018-02-11 | 2019-08-15 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-pd-1/anti-vegf natural antibody structure-like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof |
-
2017
- 2017-11-16 EP EP17871719.5A patent/EP3533804A4/en active Pending
- 2017-11-16 US US16/461,646 patent/US11319378B2/en active Active
- 2017-11-16 JP JP2019527168A patent/JP7031810B2/ja active Active
- 2017-11-16 CN CN201780071590.9A patent/CN109963876B/zh active Active
- 2017-11-16 TN TNP/2019/000161A patent/TN2019000161A1/en unknown
- 2017-11-16 KR KR1020197013134A patent/KR102247704B1/ko active IP Right Grant
- 2017-11-16 WO PCT/CN2017/111310 patent/WO2018090950A1/zh unknown
- 2017-11-16 CA CA3043652A patent/CA3043652A1/en active Pending
- 2017-11-16 SG SG10201913260VA patent/SG10201913260VA/en unknown
- 2017-11-16 MX MX2019005858A patent/MX2019005858A/es unknown
- 2017-11-16 PE PE2019001036A patent/PE20191080A1/es unknown
- 2017-11-16 EA EA201990894A patent/EA201990894A9/ru unknown
- 2017-11-16 AU AU2017359813A patent/AU2017359813A1/en active Pending
- 2017-11-16 BR BR112019010051A patent/BR112019010051A2/pt active Search and Examination
-
2019
- 2019-05-16 PH PH12019501089A patent/PH12019501089A1/en unknown
- 2019-05-17 DO DO2019000124A patent/DOP2019000124A/es unknown
- 2019-05-17 CO CONC2019/0005101A patent/CO2019005101A2/es unknown
- 2019-05-17 CL CL2019001352A patent/CL2019001352A1/es unknown
- 2019-05-17 EC ECSENADI201935482A patent/ECSP19035482A/es unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1176659A (zh) * | 1995-03-01 | 1998-03-18 | 基因技术股份有限公司 | 制备异多聚体多肽的方法 |
| CN1299370A (zh) * | 1998-05-06 | 2001-06-13 | 基因技术股份有限公司 | 用离子交换层析纯化蛋白质 |
| CN103429620A (zh) * | 2010-11-05 | 2013-12-04 | 酵活有限公司 | 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 |
| CN104114579A (zh) * | 2011-10-27 | 2014-10-22 | 根马布股份公司 | 异二聚体蛋白的生成 |
| WO2016115274A1 (en) * | 2015-01-14 | 2016-07-21 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018090950A1 (zh) | 2018-05-24 |
| EA201990894A1 (ru) | 2019-09-30 |
| US11319378B2 (en) | 2022-05-03 |
| KR102247704B1 (ko) | 2021-05-03 |
| US20190367633A1 (en) | 2019-12-05 |
| EP3533804A1 (en) | 2019-09-04 |
| SG10201913260VA (en) | 2020-03-30 |
| EA201990894A9 (ru) | 2019-11-27 |
| ECSP19035482A (es) | 2019-05-31 |
| CO2019005101A2 (es) | 2019-05-31 |
| PE20191080A1 (es) | 2019-08-20 |
| DOP2019000124A (es) | 2019-11-15 |
| TN2019000161A1 (en) | 2020-10-05 |
| BR112019010051A2 (pt) | 2019-09-03 |
| EP3533804A4 (en) | 2020-06-17 |
| JP7031810B2 (ja) | 2022-03-08 |
| CL2019001352A1 (es) | 2019-08-02 |
| PH12019501089A1 (en) | 2020-03-02 |
| AU2017359813A1 (en) | 2019-05-30 |
| JP2020510407A (ja) | 2020-04-09 |
| KR20190065375A (ko) | 2019-06-11 |
| MX2019005858A (es) | 2019-08-12 |
| CA3043652A1 (en) | 2018-05-24 |
| CN109963876A (zh) | 2019-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109963876B (zh) | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| CN110520445B (zh) | 抗pd-l1/抗pd-1天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| WO2019109876A1 (zh) | 抗pd‐l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| US11827697B2 (en) | Anti-PD-1/anti-VEGF natural antibody structure like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof | |
| TWI806961B (zh) | 抗pd-1/抗her2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備 | |
| WO2022148411A1 (zh) | 抗pd-l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| EA043006B1 (ru) | Анти-pd-1/анти-her2 гетеродимерное биспецифическое антитело со структурой природного антитела и способ его получения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40004713 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |