BR112020011295A2

BR112020011295A2 - anticorpo biespecífico anti-pd-l1/anti-cd47 com estrutura semelhante ao anticorpo natural e em forma de heterodímero e preparação do mesmo

Info

Publication number: BR112020011295A2
Application number: BR112020011295-0A
Authority: BR
Inventors: Jiawang Liu; Yaping Yang; Nanmeng Song; Maengsup Kim
Original assignee: Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2018-12-01
Publication date: 2020-11-24
Also published as: SG11202005216XA; US20210230277A1; EP3722322A4; CN111615521A; JP7231641B2; MX2020005792A; CA3084626A1; JP2021505195A; EA202091364A1; US11739151B2; EP3722322A1; KR20200093639A; IL275135A; ZA202003382B; AU2018378529A1; WO2019109876A1

Abstract

É fornecido um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-CD47 que possui características de IgG natural e está em uma forma de heterodímero altamente estável sem despareamento da cadeia pesada e cadeia leve, e um método de preparação do mesmo. A primeira cadeia Fc ou a segunda cadeia Fc do anticorpo biespecífico compreende substituições de aminoácidos nas posições 366 e 399, e a outra compreende substituições de aminoácidos nas posições 351, 407 e 409.

Description

“ANTICORPO BIESPECÍFICO ANTI-PD-L1/ANTI-CD47 COM ESTRUTURA

SEMELHANTE AO ANTICORPO NATURAL E EM FORMA DE HETERODÍMERO E PREPARAÇÃO DO MESMO” CAMPO TÉCNICO

[001] A invenção refere-se a um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-CD47 com uma estrutura semelhante ao anticorpo natural e na forma de um heterodímero, e preparação do mesmo. Especificamente, a presente invenção proporciona um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-CD47 que tem características de IgG natural e está na forma de um heterodímero altamente estável sem despareamento da cadeia leve e cadeia pesada, e um método para preparação do mesmo.

FUNDAMENTOS

[002] O ligante de morte celular programada 1 (PD-L1) é um ligante do receptor de checkpoint imunológico — morte celular programada-1 (PD-1) — e pertence à família B7, e sua expressão é induzida nas superfícies de várias células imunes, incluindo células T, células B, monócitos, macrófagos, células DC e células endoteliais, células epidérmicas, etc. Depois que o PD-L1 se liga ao PD-1, ele está principalmente envolvido na regulação negativa da ativação das células T, que pode ajustar a força e a duração da resposta imunológica. Além de ser um ligante de PD-1, o PD-L1 também pode servir como ligante para CD80, transmitir sinais regulatórios negativos para células T e induzir a tolerância imunológica das células T (Autoimmun Rev, 2013, 12 (11): 1091-1100 Front Immunol, 2013, 4: 481. Nat Rev Cancer, 2012, 12 (4): 252-264. Trends Mol Med. 2015 Jan; 21 (1): 24-33. Clin Cancer Res. 2012 Dec 15; 18 (24): 6580-7). Em circunstâncias normais, PD-L1 e PD-1 podem mediar e manter a tolerância autoimune dos tecidos do corpo, impedir que o sistema imunológico seja excessivamente ativado levando à danificação dos próprios tecidos do corpo durante a reação inflamatória e apresentar efeitos positivos ao evitar a ocorrência de doenças autoimunes. Sob condições patológicas, está envolvido na ocorrência e desenvolvimento da imunidade tumoral e várias doenças autoimunes. Vários estudos relataram que PD-L1 é altamente expresso em vários tecidos tumorais, e PD-1 é altamente expresso em linfócitos infiltrantes de tumor, e a superexpressão de PD-L1 e PD-1 está intimamente relacionada ao mau prognóstico clínico de tumores (Anticancer Agents Med Chem. 2015; 15 (3): 307-13. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2014 Mar; 7 (1): 1-17. Trends Mol Med. 2015 Jan; 21 (1): 24 -33. Imunity. 2013 jul 25; 39 (1): 61-73. J Clin Oncol. 2015 jun 10; 33 (17): 1974-82.). O uso de anticorpos monoclonais PD-L1 para bloquear a interação de PD-L1/PD-1 e CD80/PD-L1 mostrou bons efeitos antitumorais em estudos experimentais pré-clínicos e ensaios clínicos. Atualmente, os anticorpos monoclonais PD-L1 foram aprovados para o tratamento de vários tumores, como câncer de pulmão de células não pequenas e câncer urotelial. No entanto, apenas uma pequena porcentagem de pacientes com tumor pode se beneficiar desse tipo de terapia com anticorpos monocilonais, e a maioria dos pacientes não responde a esse tipo de anticorpos monoclonais (Expert Opin Ther Targets. 2014 Dec; 18 (12): 1407-20. Oncology (Williston Park). Nov 2014; 28 Suppl 3: 15-28).

[003] O CD47, também chamado de proteína relacionada à integrina, é uma proteína transmembranar de 50 kD e pertence à família das imunoglobulinas. É amplamente expresso em uma variedade de células, mas sua expressão é significativamente aumentada em uma variedade de células tumorais (Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109 (17): 6662-6667). O ligante do CD47 é a proteína regulatória de sinal a (SIRPa), que é principalmente expressa em macrófagos. Após a ligação ao CD47, ele transmite o sinal de "não me coma" e inibe a fagocitose pelos macrófagos (Curr Opin Immunol, 2009, 21 (1): 47-52). A utilização de anticorpos anti-CD47 pode bloquear a via de sinalização CD47-SIRPa e, assim, exercem um efeito antitumoral. Atualmente, uma variedade de anticorpos monoclonais anti-CD47 foi inserida na etapa de pesquisa clínica para o tratamento de vários tumores hematológicos e sólidos. No entanto, como o CD47 também é expresso na superfície dos eritrócitos, esses tratamentos anti-CD47 podem levar a reações adversas graves, como anemia e trombocitopenia, e baixa biodisponibilidade.

[004] Ainda é necessário estudar um novo medicamento terapêutico que bloqueie as vias de sinalização PD-L1 e CD47 nesse campo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção proporciona um novo anticorpo bifuncional que pode bloquear o PD-L1 e CD47 ao mesmo tempo e apresentar uma forma de heterodímero altamente estável com características estruturais de IgG natural e sem despareamento da cadeia pesada e cadeia leve, e um método para preparação do mesmo. O anticorpo bifuncional tende a se ligar seletivamente a células tumorais que expressam, simultaneamente, PD-L1 e CD47, e, deste modo, exerce efeitos mortais eficientes e específicos, ao mesmo tempo que apresenta poucos efeitos tóxicos e colaterais.

[006] O primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, que compreende uma primeira cadeia Fc e uma segunda cadeia Fc, e uma primeira região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a PD-L1 e uma segunda região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a CD47; em que cada primeira cadeia Fc e segunda cadeia Fc é um fragmento Fc de imunoglobulina G compreendendo uma substituição de aminoácidos, e a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc juntas constituem um heterodímero que pode se ligar a um receptor Fc; em que a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas à primeira região funcional de ligação ao antígeno e à segunda região funcional de ligação ao antígeno através de uma ligação covalente ou um agente de ligação, respectivamente; e em que qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições 366 e 399, e a outra compreende substituições de aminoácidos nas posições 351, 407 e 409, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração Índice EU de Kabat.

[007] A primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc deste documento são definidas apenas com o objetivo de distinguir as duas cadeias Fc existentes, e isso não significa que a importância ou ordem das mesmas seja diferente. Ao mesmo tempo, a ligação da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc à primeira região funcional de ligação ao antígeno e à segunda região funcional de ligação ao antígeno também é arbitrária. Ou seja, a primeira cadeia Fc pode estar ligada à primeira região funcional de ligação do antígeno ou ao segundo domínio de ligação ao antígeno, assim como a segunda cadeia Fc.

[008] Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácidos da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc são as seguintes: a) L351G, L351Y, L351V, L351P, L351D, L351E, L351K ou L351W; b) T366L, T366P, T366W ou T366V; c) D399C, D399N, D399I, D399G, D399R, D399T ou D399A; d) Y407L, Y407A, Y407P, Y407F, Y407T ou Y407H; e e) K409C, K409P, K409S, K409F, K409V, K409Q ou K409R.

[009] Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácidos compreendem as: a) substituições T366L e D399R em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351E, Y407L e K409V na outra; b) substituições T366L e D399C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351G, Y407L e K409C na outra; c) substituições T366L e D399C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351Y, Y407A e K409P na outra; d) substituições T366P e D399N em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351 V, Y407P e K4098 na outra; e) substituições T366W e D399G em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351D, Y407P e K409S na outra; f) substituições de T366P e D399| em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351P, Y407F e K409F na outra; g) substituições de T366V e D399T em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351K, Y407T e K409Q na outra; h) substituições T366L e D399A em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351W, Y407H e K409R na outra.

[010] Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácidos compreendem as: a) substituições T366L e K409V em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351E, Y407L e D399R na outra; b) substituições T366L e K409C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351G, Y407L e D399C na outra; c) substituições T366L e K409P em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351Y, Y407A e D399C na outra; d) substituições T366P e K409S em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351V, Y407P e D399N na outra; e) substituições T366W e K409S em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351D, Y407P e D399G na outra; f) substituições T366P e K409F em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351P, Y407F e D399| na outra; g) substituições T366V e K409Q em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351K, Y407T e D399T na outra;

h) substituições T366L e K409R em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351W, Y407H e D399A na outra.

[011] Em algumas formas de realização, os aminoácidos em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc são substituídos por T366L e D399R, e os aminoácidos da outra são substituídos por L351E, Y407L e K409V.

[012] Em algumas formas de realização, a primeira região funcional de ligação ao antígeno e a segunda região funcional de ligação ao antígeno são selecionadas a partir de um fragmento Fab, um fragmento scFv, um fragmento de domínio variável Fv e um fragmento da região variável da cadeia pesada VHH de uma cadeia pesada de anticorpo.

[013] Em algumas formas de realização, a primeira região funcional de ligação ao antígeno e a segunda região funcional de ligação ao antígeno são ambas fragmentos Fab.

[014] Em algumas formas de realização, uma da primeira região funcional de ligação ao antígeno e da segunda região funcional de ligação ao antígeno é um fragmento Fab e a outra é um scFv.

[015] Em algumas formas de realização, o fragmento Fab compreende primeira região variável da cadeia pesada e segunda região variável da cadeia pesada diferentes e primeira região variável da cadeia leve e segunda região variável da cadeia leve diferentes.

[016] Em algumas formas de realização, a primeira cadeia Fc e a primeira região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, e a segunda cadeia Fc e a segunda região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, quando em uma solução na qual um agente redutor está presente e que compreende nenhum outro polipeptídeo além da primeira cadeia Fc e a primeira região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, e a segunda cadeia Fc e a segunda região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, forma menos do que 50% dos homodímeros com base no peso de todas as cadeias polipeptídicas.

[017] Em algumas formas de realização, a primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 6.

[018] Em algumas formas de realização, a segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 e 12.

[019] Em algumas formas de realização, a primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 e

8.

[020] Em algumas formas de realização, a segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 e 14.

[021] Em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos do anticorpo biespecífico é a combinação correspondente das SEQ ID NOs: 2,4,6,8, 10, 12 e 14. Por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 4, 6 e 8 são combinadas entre si, e SEQ ID NOs: 10, 4, 12 e 14 são combinadas entre si e, em seguida, as duas combinadas são combinadas posteriormente para formar o anticorpo biespecífico da presente invenção.

[022] O segundo aspecto da presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto.

[023] Em algumas formas de realização, a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da primeira região funcional de ligação ao antígeno é selecionada dentre as SEQ ID NOs: 1 e 5.

[024] Em algumas formas de realização, a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da segunda região funcional de ligação ao antígeno é selecionada dentre as SEQ ID NOs: 9 e 11.

[025] Em algumas formas de realização, a sequência nucleotídica que codifica o aminoácido da primeira região funcional de ligação ao antígeno é selecionada ainda dentre as SEQ ID NOs: 3 e 7.

[026] Em algumas formas de realização, a sequência nucleotídica que codifica o aminoácido da segunda região funcional de ligação ao antígeno é selecionada ainda dentre as SEQ ID NOs: 3 e 13.

[027] Em algumas formas de realização, a sequência do polinucleotídeo é a combinação correspondente das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13. Por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 são combinadas entre si e SEQ ID NOs: 9, 3, 11 e 13 são combinadas entre si.

[028] O terceiro aspecto da presente invenção refere-se a um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto.

[029] Em algumas formas de realização, o vetor de expressão é um vetor plasmidial XOGC modificado a partir de pPCDNA.

[030] O quarto aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto, ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto.

[031] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir da célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli, uma levedura ou Píichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto;

uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

[032] O quinto aspecto da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto, ou o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto, ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto, ou a célula hospedeira de acordo com o quarto aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[033] O sexto aspecto da presente invenção refere-se a um método para produção de um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto, que compreende as etapas de: 1) expressar o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto em uma célula hospedeira, respectivamente; 2) reduzir as proteínas expressas respectivamente na célula hospedeira; e 3) misturar as proteínas reduzidas e oxidar a mistura.

[034] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é selecionada a partir da célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli, uma levedura ou Píichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto; uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

[035] Em algumas formas de realização, a etapa de redução compreende 1) realizar uma reação de redução na presença de um agente redutor selecionado do grupo que consiste em 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol, tris(2-carboxietil)fosfina ou outros derivados químicos; 2) remover o agente redutor, por exemplo, realizando a reação de redução na presença de ditiotreitol a uma concentração de 0,1 mM ou maior a 4ºC por pelo menos 3 horas. A limitação do agente redutor e as condições da reação de redução, também se aplicam a outras situações que envolvam a utilização do agente redutor e a uma reação de redução aqui.

[036] Em algumas formas de realização, a etapa de oxidação é a oxidação no o ar, e também compreende realizar uma reação de oxidação na presença de um agente oxidante selecionado do grupo que consiste em ácido L-desidroascórbico ou os derivados químicos dos mesmos. Por exemplo, a reação de oxidação é realizada na presença de ácido L-desidroascórbico, a uma concentração de 0,5 mM ou maior a 4ºC por pelo menos 5 horas.

[037] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda a etapa de separação e purificação.

[038] O sétimo aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto e/ou a célula hospedeira do quarto aspecto e/ou a composição do quinto aspecto, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

[039] O oitavo aspecto da presente invenção refere-se ao anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto e/ou a célula hospedeira do quarto aspecto e/ou a composição do quinto aspecto, para uso como um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

[040] O nono aspecto da presente invenção refere-se a um método para prevenção e/ou tratamento de uma doença, compreendendo administrar o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com o primeiro aspecto e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com o segundo aspecto e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com o terceiro aspecto e/ou a célula hospedeira do quarto aspecto e/ou a composição do quinto aspecto a um indivíduo que precise do mesmo.

[041] Em algumas formas de realização, indivíduo é um mamífero, preferencialmente, um indivíduo humano.

[042] Em algumas formas de realização, a doença é selecionada dentre os seguintes tumores: leucemia, linfoma, mieloma, tumor cerebral, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer endometrial, sarcoma uterino, câncer de próstata, câncer de bexiga, carcinoma de células renais, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de osso.

[043] A invenção delineia um novo anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- CD47 na forma de um heterodímero com estrutura semelhante à do anticorpo natural. Possui características de IgG natural e não apresenta despareamento entre cadeia pesada e cadeia leve e é um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-CD47 altamente estável na forma de um heterodímero. O anticorpo biespecífico preparado pela invenção pode se ligar simultaneamente a duas moléculas alvo, PD-L1 e CD47, e, quando aplicado ao tratamento de doenças complexas, pode exercer melhores efeitos que um único agente terapêutico. Ao mesmo tempo, em relação à terapia combinada com vários medicamentos, o anticorpo biespecífico como uma molécula terapêutica única não apenas facilita o uso por pacientes e profissionais da área médica, como também simplifica o complexo processo de desenvolvimento de novos medicamentos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[044] Figura 1 ilustra o cromatograma do pico de eluição de um anti-PD-L1-

Fc1.

[045] Figura 2 ilustra o cromatograma do pico de eluição de um anti-CD47- Fc2.

[046] Figura 3 ilustra a estrutura da uma molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

[047] Figura 4 ilustra a estrutura de uma molécula de meio-anticorpo de uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[048] Figura 5 ilustra os resultados da análise por SEC-HPLC de uma molécula de meio-anticorpo de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. O painel A e painel B ilustram os resultados de uma molécula de meio-anticorpo anti-PD-L1 e uma molécula de meio-anticorpo anti-CD47, respectivamente.

[049] Figura 6 ilustra os resultados da análise por SEC-HPLC de uma molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

[050] Figura 7 ilustra os resultados da análise por RPC de uma molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

[051] Figura 8 ilustra os resultados da análise por CE de uma molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

[052] Figura 9 - Painel A ilustra a afinidade de um anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-cCD47 a PD-L1. Painel B ilustra a afinidade de um anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 a CDA47.

[053] Figura 10 ilustra que a combinação de um anticorpo monoclional para PD-L1 e CD47 não podem se ligar simultaneamente a PD-L1 e CD47, e apenas um anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 possui a atividade de se ligar aos dois antígenos simultaneamente.

[054] Figura 11 - Painéis A e B ilustram a atividade de ligação de um anticorpo monoclonal para CD47 e de um heterodímero anti-PD-L1/anti-CD47 a HCC827 e RBC, respectivamente.

[055] Figura 12 ilustra a atividade regulatória de células T de um anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

[056] Figura 13 ilustra a atividade fagocítica dos macrófagos sobre as células tumorais mediada por um anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definição:

[057] Ligação covalente significa que, em um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, as duas cadeias Fc, e qualquer cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno, são ligadas de modo a ser uma molécula por uma ligação covalente, em que a cadeia Fc compreende uma primeira região funcional de ligação ao antígeno e uma segunda região funcional de ligação ao antígeno ligadas através de uma ou mais ligações covalentes (tal como uma cadeia de ligação dissulfeto); a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão respectivamente ligadas a uma região funcional de ligação ao antígeno por meio de uma ligação covalente (como uma ligação imina ou uma ligação amida).

[058] A região funcional de ligação ao antígeno refere-se a uma região que pode interagir especificamente com uma molécula alvo, como um antígeno, e sua ação é altamente seletiva. A sequência que reconhece uma molécula-alvo geralmente não pode reconhecer as sequências de outras moléculas. As regiões funcionais de ligação ao antígeno representativas compreendem regiões variáveis do anticorpo, variantes estruturais de regiões variáveis do anticorpo, domínios de ligação ao receptor, domínios de ligação ao ligante ou domínios de ligação à enzima.

[059] A ligação entre uma ou mais cadeias de ligação dissulfeto significa que a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas através de uma ou mais cadeias de ligação dissulfeto para formar um fragmento heterodimérico. Na presente invenção, as uma ou mais ligações dissulfeto podem ser formadas quando a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas são sintetizadas na mesma célula, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas são sintetizadas separadamente em diferentes células e, então, formadas por um método de redução e oxidação in vitro.

[060] A primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc referem-se a um fragmento ligado formado por uma ligação covalente. A ligação covalente compreende uma ligação dissulfeto, e cada cadeia compreende pelo menos uma parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina; e a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc são diferentes quanto às sequências de aminoácidos, incluindo pelo menos um aminoácido diferente. Na primeira cadeia Fc e na segunda cadeia Fc na presente invenção, há uma forte repulsão mútua entre cadeias iguais, e há uma atração entre cadeias diferentes. Portanto, quando coexpressas na célula, a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas, tendem a formar um heterodímero. Quando a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas são expressas em duas células hospedeiras, respectivamente, as primeiras cadeias Fc ou a primeira cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno ligada à mesma, tendem a não formar um homodímero, e as segundas cadeias Fc ou a segunda cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno ligada à mesma, tendem a não formar um homodímero. Na presente invenção, quando a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas são expressas em duas células hospedeiras, respectivamente, e na presença de um agente redutor, a proporção de homodímeros é inferior a 50%, isto é, a proporção de monômeros (uma cadeia Fc ou uma cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno ligada à mesma) é superior a 50%.

[061] A imunoglobulina é uma estrutura simétrica com quatro cadeias polipeptídicas, duas das quais são cadeias pesadas iguais, que são relativamente longas e possuem um grande peso molecular relativo, e contêm 450-550 resíduos de aminoácidos, e têm uma massa molecular relativa dentre 55.000 e 70.000 Da; duas das quais são cadeias leves iguais (cadeias L), que são relativamente curtas e possuem um pequeno peso molecular relativo, e contêm cerca de 210 resíduos de aminoácidos e possuem uma massa molecular relativa de cerca de 24.000 Da. Uma sequência de cerca de 110 aminoácidos próxima à extremidade N terminal varia muito entre diferentes cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, e é denominada de região variável (região V), enquanto as demais sequências de aminoácidos próximas à extremidade C terminal são relativamente estáveis e são denominadas de região constante (região C). Na cadeia pesada, a região variável constitui cerca de 1/4 do comprimento da cadeia pesada e a região constante constitui cerca de 3/4 do comprimento da cadeia pesada. Para as cinco lgs conhecidas, 19G (y), IgA (a), IgD (5), I9M (u) e IgE (e), as três primeiras classes de Ig possuem três regiões constantes na cadeia H, ou seja, CH1, CH2 e CH3. A cadeia H das duas últimas classes (IM e IgE) possui uma região VH e quatro regiões constantes, a saber CH1 a CH4. A região constante não é apenas o arcabouço da molécula de imunoglobulina, mas também um dos sítios que ativam a resposta imune. Embora os exemplos da presente invenção se refiram à IgG, os técnicos no assunto sabem que, se desejado, as classes de anticorpos da presente invenção podem ser alteradas por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da invenção, originalmente IgM, pode ter sua classe trocada para um anticorpo IgG da invenção. Além disso, técnicas de troca de classe podem ser usadas para converter uma subclasse de IgG em outra, por exemplo, de I9G1 a IgG2. Portanto, a função efetora do anticorpo da presente invenção pode ser alterada para, por exemplo, anticorpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM por troca de isotipo para vários usos terapêuticos. Em um exemplo, o anticorpo da invenção é um anticorpo I9gG1, como I9G1,K.

[062] Uma parte da região constante na presente invenção compreende pelo menos a região onde a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc interagem. Para IgG, essa região faz parte dos aminoácidos localizados na região CH3, incluindo pelo menos GLN347, TYR349, THR350, LEU3S51, SER354, ARG355, ASP356, GLU357, LYS360, SER364, THR366, LEUS68, LYS370, ASN390, LYS392, THR394, PRO395, VAL397, ASP399, SER400, PHE405, TYR407, LYS409, LYS439.

[063] A primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc ligadas a uma região funcional de ligação ao antígeno por meio de uma ligação covalente ou um agente de ligação, respectivamente, significa que a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas a um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo ou a um anticorpo de cadeia única capaz de reconhecer um antígeno, ou outra variante de fragmento de anticorpo capaz de reconhecer um antígeno, ou um receptor capaz de reconhecer um ligante, ou um ligante capaz de reconhecer um receptor através de uma ligação covalente ou um agente de ligação, respectivamente. A ligação covalente é um tipo de ligação química, na qual dois ou mais átomos juntos usam seus elétrons externos, e sob situações ideais, o status de saturação eletrônica é alcançado, formando assim uma estrutura química relativamente estável chamada de ligação química, ou a ligação covalente é a interação entre átomos formados por pares de elétrons compartilhados. Átomos do mesmo elemento ou átomos de diferentes elementos podem estar todos ligados através da ligação covalente. A ligação covalente entre a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc da presente invenção inclui uma ligação amida formada por desidratação entre um grupo amino de um aminoácido de uma molécula e um grupo carboxila de um aminoácido de outra molécula ou uma ligação amida ou uma ligação imida formada entre um grupo aldeído de etilenoglicol ou polietilenoglicol ou outro composto ou um polímero do mesmo e um grupo amino de um aminoácido de uma molécula, mas não está limitado a isso. O agente de ligação é uma sequência de aminoácidos ou um composto ou um multímero de um composto capaz de ligar duas cadeias polipeptídicas por meio de uma ligação covalente, em que a sequência de aminoácidos inclui, mas não está limitado a, um peptídeo pequeno, como GGGGSGGGGSGGGGS, e a sequência de aminoácidos liga a primeira cadeia Fc ou a segunda cadeia Fc e um anticorpo da cadeia única capaz de reconhecer um antígeno, ou outra variante estrutural do fragmento de anticorpo capaz de reconhecer um antígeno através de uma ligação amida.

[064] A primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc têm uma tendência a sofrer formação heterodimérica e nenhuma tendência a sofrer formação homodimérica, o que significa que na primeira cadeia Fc e na segunda cadeia Fc, existe uma força repulsiva forte entre as mesmas cadeias polipeptídicas e um existe força atrativa entre as diferentes cadeias polipeptídicas, e, portanto, a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas têm uma tendência a sofrer formação heterodimérica, quando coexpressas em uma célula. Quando a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc e as regiões funcionais de ligação ao antígeno ligadas às mesmas são expressas em duas células hospedeiras, respectivamente, as primeiras cadeias Fc, ou a primeira cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno ligada à mesma não tem tendência a sofrer formação homodimérica, e as segundas cadeias Fc, ou a segunda cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno ligada à mesma também não têm tendência a sofrer formação homodimérica.

[065] O sistema de numeração EU de Kabat significa que Kabat atribui um número a cada aminoácido em uma sequência de anticorpos, e esse método de atribuição do número de cada resíduo tornou-se padrão no campo. O método de Kabat é extensível a outros anticorpos não incluídos em seu alcance, alinhando um anticorpo alvo com uma das sequências consenso identificadas por Kabat com base em aminoácidos conservados.

[066] Um domínio Fc refere-se a um fragmento cristalizável (Fc) e corresponde aos domínios estruturais CH2 e CH3 de lg e é um sítio onde ocorre uma interação entre lg e uma molécula efetora ou uma célula.

[067] IG é uma abreviação de imunoglobulina G (IgG) e é o principal componente do anticorpo no soro. A IgG humana possui quatro subclasses — I9G1, I9G2, I9gG3 e IgG4, com base nas diferenças antigênicas nas cadeias r na molécula de IgG.

[068] Uma molécula de meio-anticorpo refere-se a uma estrutura formada por uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo, em que a cadeia pesada e a cadeia leve podem estar ligadas por meio de uma ligação covalente ou tem uma estrutura de anticorpo monovalente que reconhece um antígeno, que pode ser formada sem uma ligação covalente.

[069] O fragmento Fab é uma sequência de reconhecimento de molécula e um fragmento de ligação ao antígeno (Fab) e corresponde a dois braços de uma molécula de anticorpo, cada um constituído por uma cadeia leve completa e domínios estruturais VH e CH1 de uma cadeia pesada. scFfy é uma sequência de reconhecimento de molécula e é um isômero estrutural de um fragmento de anticorpo obtido por engenharia genética de uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo. Um domínio extracelular de um receptor de membrana é uma sequência de reconhecimento de molécula, e o receptor de membrana geralmente inclui uma região extracelular que está localizada fora da célula e que reconhece e se liga ao antígeno ou ligante correspondente, uma região transmembrana que ancora o receptor na superfície celular, e uma região intracelular que possui atividade de quinase intracelular ou uma via de sinalização. O ligante do receptor de membrana celular refere-se a uma proteína, um peptídeo pequeno ou um composto que pode ser reconhecido e ligado pela região extracelular do receptor de membrana. As citocinas são proteínas solúveis de baixo peso molecular que são produzidas por diversos tipos de células induzidas por imunógenos, mitógenos ou outros estimulantes, e possuem várias funções, tais como a regulação da imunidade inata e imunidade adaptativa, hematopoese, crescimento celular, células multipotentes APSC e reparo de dano tecidual, etc. As citocinas podem ser classificadas em interleucinas, interferons, superfamílias do fator de necrose tumoral, fatores estimuladores de colônias, fatores quimiotáticos, fatores de crescimento, etc. Um marcador ou tag de expressão de proteína significa uma sequência de aminoácidos adicionada à extremidade N-terminal ou à C-terminal de uma proteína alvo e podem ser pequenos peptídeos ou aminoácidos longos. A adição do tag pode ser vantajosa para dobrar corretamente as proteínas, isolar e purificar as proteínas e degradar a proteína intracelular. As tags usadas com frequência podem incluir HA, SUMO, His, GST, GFP e Flag, mas não se limitam às mesmas.

[070] Não há limitação para os anticorpos aplicáveis ao anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero da presente invenção. De preferência, os anticorpos já utilizados na arte para o tratamento e/ou prevenção de doenças podem ser aplicados à presente invenção.

[071] O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero da presente invenção pode ter uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Por exemplo, alguns aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos na estrutura da proteína sem perda significativa da capacidade de se ligar a outros polipeptídeos (por exemplo, antígenos) ou células. Uma vez que a capacidade de ligação e as propriedades da proteína determinam a atividade biológica funcional da proteína, a substituição de alguns aminoácidos na sequência da proteína pode não causar perda significativa de sua utilidade ou atividade biológica.

[072] Em muitos casos, as variantes polipeptídicas incluem uma ou mais substituições —conservativas. A "substituição conservativa" significa que os aminoácidos no polipeptídeo são substituídos por outros aminoácidos com propriedades semelhantes, de modo que os técnicos no assunto da química de peptídeos esperariam uma estrutura secundária e natureza hidrofílica do polipeptídeo substancialmente inalteradas.

[073] As substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na similaridade relativa dos substituintes da cadeia lateral dos aminoácidos, como a hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, etc. Exemplos de substituições que levam em consideração várias características descritas acima são bem conhecidas pelos técnicos no assunto e incluem arginina e lisina; ácido glutâmico e ácido aspártico; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

[074] Conforme utilizado neste documento, o termo "identidade" tem o significado comumente conhecido na arte, e os técnicos no assunto também estão familiarizados com as regras e critérios para determinar a identidade entre diferentes sequências, e a identidade refere-se à porcentagem de homologia entre resíduos de uma variante da sequência polinucleotídica ou polipeptídica e resíduos de uma sequência não variante após o alinhamento das sequências e a introdução de espaços ou gaps (se necessário, para atingir a % de homologia máxima). Na presente invenção, quando a definição de identidade é atendida, faz-se necessário também que a sequência variante obtida tenha as atividades biológicas apresentadas pela sequência parental. Os métodos e meios para rastrear sequências variantes utilizando as atividades acima são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Tais sequências variantes podem ser facilmente obtidas pelos técnicos no assunto a partir dos ensinamentos aqui apresentados. Em uma forma de realização específica, as variantes polinucleotídicas e polipeptídicas têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% de identidade polinucleotídica ou de polipeptídica com o polinucleotídeo ou polipeptídeo aqui descrito. Devido à redundância dos códigos genéticos, existirão variantes dessas sequências que codificam a mesma sequência de aminoácidos.

[075] Outra forma de realização da presente invenção fornece uma composição polinucleotídica capaz de hibridizar com a sequência polinucleotídica fornecida pela presente invenção ou um fragmento da mesma ou uma sequência complementar da mesma em condições moderadas a altamente estringentes. As técnicas de hibridização são bem conhecidas na arte da biologia molecular. Para fins explicativos, condições moderadamente estringentes adequadas para testar a hibridização do polinucleotídeo da presente invenção com outro polinucleotídeo podem incluir a pré-lavagem com uma solução de SSC 5X, SDS a 0,5%, SDS a 0,5%, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); realizar hibridização em SSC 5X de 50ºC a 60ºC durante a noite; e lavagem duas vezes com SSC 2X, 0,5X e 0,2X contendo SDS a 0,1% durante 20 minutos a 65ºC, respectivamente. Os técnicos no assunto entendem que a estringência da hibridização pode ser facilmente manipulada, por exemplo, variando o teor de sal da solução de hibridização e/ou a temperatura da hibridização. Por exemplo, em outra forma de realização, condições de hibridização altamente estringentes adequadas incluem as condições descritas acima, exceto pelo aumento da temperatura de hibridização, por exemplo, para 60ºC a 65ºC ou 65ºC a 70ºC.

[076] A célula hospedeira da presente invenção pode ser qualquer célula que possa ser usada na expressão de genes estranhos e inclui E.coli, células de levedura, células de insetos, células vegetais e células de mamíferos, mas não se limita às mesmas.

[077] O vetor da presente invenção inclui um vetor que pode se replicar em qualquer tipo de células ou organismos, e incluem, por exemplo, plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e minicromossomos. Em algumas formas de realização, o vetor incluindo o polinucleotídeo da presente invenção é um vetor adequado para propagação ou replicação de um polinucleotídeo ou um vetor adequado para a expressão do polipeptídeo da presente invenção. Tais vetores são conhecidos na arte e encontram-se disponíveis comercialmente.

[078] O "vetor" pode incluir um vetor shuttle e um vetor de expressão. Geralmente, uma construção plasmidial pode incluir também uma origem de replicação (por exemplo, origem de replicação ColE1) e um marcador selecionável (por exemplo, resistência à ampicilina ou tetraciclina) que servem para replicação e seleção de plasmídeos em bactérias, respectivamente. O "vetor de expressão" refere- se a um vetor incluindo uma sequência controle ou um elemento regulador que é necessário para a expressão do anticorpo da presente invenção, incluindo fragmentos de anticorpo, em células bacterianas ou eucarióticas.

[079] O vetor da presente invenção pode ser qualquer vetor usado para expressão de genes estranhos e pode incluir, mas não está limitado a, um vetor plasmidial, em que o vetor plasmidial inclui pelo menos uma origem de replicação, um promotor, um gene de interesse, um sítio de clonagem múltipla, um gene marcador de seleção. De preferência, o vetor da presente invenção inclui, mas não está limitado a um vetor plasmidial obtido pela modificação de pc/DNA, como o vetor XOGC.

[080] O objeto da presente invenção pode incluir aves, répteis, mamíferos, etc. Dentre os mamíferos incluem-se um roedor, um primata. Preferencialmente, o primata inclui um humano.

[081] O escopo das doenças compreendidas na presente invenção inclui, mas não está limitado a tumores. De preferência, os tumores podem incluir leucemia, linfoma, mieloma, tumor cerebral, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer endometrial, sarcoma uterino, câncer de próstata, câncer de bexiga, carcinoma de células renais, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de osso.

[082] UM veículo farmaceuticamente aceitável significa um veículo farmacêutico que é comumente usado na técnica farmacêutica, por exemplo, diluentes, excipientes, água, etc., agentes de enchimento, como amido, sacarose, lactose, celulose microcristalina, etc.; aglutinantes, tais como derivados de celulose, alginatos, gelatina e polivinilpirrolidona; agentes molhantes, tais como glicerina; agentes desintegrantes, tais como carboximetilamido sódico, hidroxipropilcelulose, croscarmelose, ágar, carbonato de cálcio, hidrogenocarbonato de sódio, etc.; intensificadores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; tensoativos, tais como cetanol, lauril sulfato de sódio, etc.; veículos de adsorção, como caulinita, bentonita, etc.; lubrificantes, como talco, estearato de cálcio e magnésio, gel de sílica micronizada, polietilenoglicol|, etc. Além disso, outros aditivos, como agentes aromatizantes, adoçantes, etc., podem ser adicionados à composição.

[083] Em algumas formas de realização, a presente invenção refere-se às seguintes soluções técnicas.

[084] Solução técnica 1. Um anticorpo biespecífico, na forma de um heterodímero, que compreende uma primeira região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a PD-L1 e uma segunda região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a CD47, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia Fc e uma segunda cadeia Fc ligadas através de uma ou mais cadeias de ligação dissulfeto, e a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas a uma região funcional de ligação ao antígeno PD- L1 e uma região funcional de ligação ao antígeno CD47, respectivamente, através de uma ligação covalente ou um agente de ligação, ou a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas a uma região funcional de ligação ao antígeno CD47 e a uma região funcional de ligação ao antígeno PD-L1, respectivamente, através de uma ligação covalente ou um agente de ligação; e a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc compreendem 5 substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 1) substituições de aminoácido nas posições 366 e 399 na primeira cadeia Fc e substituições de aminoácidos nas posições 351, 407 e 409 na segunda cadeia Fc; ou 2) substituições de aminoácido nas posições 366 e 409 na primeira cadeia Fc, e substituições de aminoácidos nas posições 351, 399, e 407 na segunda cadeia Fc; a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc compreendendo as substituições de aminoácidos mencionadas acima tendem a formar um heterodímero entre si, em vez de cada um formar um homodímero, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração índice EU de Kabat.

[085] Solução técnica 2. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com a solução técnica 1, em que as substituições de aminoácidos da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc são as seguintes: a) substituição por glicina, tirosina, valina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina ou triptofano na posição 351; b) substituição por leucina, prolina, triptofano ou valina na posição 366; c) substituição por cisteína, asparagina, isoleucina, glicina, arginina, treonina ou alanina na posição 399; d) substituição por leucina, alanina, prolina, fenilalanina, treonina ou histidina na posição 407; e e) substituição por cisteína, prolina, serina, fenilalanina, valina, glutamina ou arginina na posição 409.

[086] Solução técnica 3. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com a solução técnica 1 ou 2, em que as substituições de aminoácidos compreendem as:

a) substituições T366L e D399R na primeira cadeia Fc e substituições L351E, Y407L e K409V na segunda cadeia Fc; b) substituições T366L e D399C na primeira cadeia Fc e substituições L351G, Y407L e K409C na segunda cadeia Fc; c) substituições T366L e D399C na primeira cadeia Fc e substituições L351Y, Y407A e K409P na segunda cadeia Fc; d) substituições de T366P e D399N na primeira cadeia Fc e substituições de L351V, Y407P e K4098S na segunda cadeia Fc; e) substituições T366W e D399G na primeira cadeia Fc e substituições L351D, Y407P e K409S na segunda cadeia Fc; f) substituições T366P e D399I na primeira cadeia Fc e substituições L351P, Y407F e K409F na segunda cadeia Fc; g) substituições T366V e D399T na primeira cadeia Fc e substituições L351K, Y407T e K409Q na segunda cadeia Fc; h) substituições T366L e D399A na primeira cadeia Fc e substituições L351W, Y407H e K409R na segunda cadeia Fc.

[087] Solução técnica 4. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-3, em que as substituições de aminoácidos compreendem as: a) substituições T366L e K409V na primeira cadeia Fc, e substituições L351E, Y407L e D399R na segunda cadeia Fc; b) substituições T366L e K409C na primeira cadeia Fc, e substituições L351G, Y407L e D399C na segunda cadeia Fc; c) substituições T366L e K409P na primeira cadeia Fc, e substituições L351Y, Y407A e D399C na segunda cadeia Fc; d) substituições T366P e K409S na primeira cadeia Fc, e substituições L351V, Y407P e D399N na segunda cadeia Fc;

e) substituições T366W e K409S na primeira cadeia Fc, e substituições L351D, Y407P e D399G na segunda cadeia Fc; f) substituições T366P e K409F na primeira cadeia Fc, e substituições L351P, Y407F e D399| na segunda cadeia Fc; g) substituições T366V e K409Q na primeira cadeia Fc, e substituições L351K, Y407T e D399T na segunda cadeia Fc; h) substituições T366L e K409R na primeira cadeia Fc, e substituições L351W, Y407H e D399A na segunda cadeia Fc.

[088] Solução técnica 5. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com a solução técnica 1, em que os aminoácidos da primeira cadeia Fc são substituídos por T366L e D399R, e os aminoácidos da segunda cadeia Fc são substituídos por L351E, Y407L e K409V.

[089] Solução técnica 6. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-5, em que a cadeia Fc é derivada de IgG.

[090] Solução técnica 7. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-6, em que as regiões funcionais de ligação ao antígeno PD-L1 e CD47 são fragmentos Fab ou fragmentos scFv.

[091] Solução técnica 8. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-7, em que ambas as regiões funcionais de ligação ao antígeno PD-L1 e CD47 são fragmentos Fab.

[092] Solução técnica 9. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com as soluções técnicas 1-7, em que uma das regiões funcionais de ligação ao antígeno PD-L1 e CD47 é um fragmento Fab, e a outra é um scFv.

[093] Solução técnica 10. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 7-9, em que o fragmento Fab compreende primeira região variável da cadeia pesada e segunda região variável da cadeia pesada diferentes, e primeira região variável da cadeia leve e segunda região variável da cadeia leve diferentes.

[094] Solução técnica 11. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-10, em que quando a primeira cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno PD-L1 ligada à mesma, e a segunda cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno CD47 ligada à mesma, ou a primeira cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno CD47 ligada à mesma, e a segunda cadeia Fc e a região funcional de ligação ao antígeno PD-L1 ligada à mesma, estão presentes isoladamente ou em conjunto com um agente redutor, formam menos que 50% de homodímeros por peso.

[095] Solução técnica 12. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-11, em que a sequência de aminoácidos do anticorpo biespecífico é selecionada dentre as SEQ ID NOs: 2,4,6,8,10,12e 14.

[096] Solução técnica 13. Um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12.

[097] Solução técnica 14. O polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13, que apresenta a sequência selecionada dentre: SEQ ID NOs: 1,3,5,7,9, 11e13.

[098] Solução técnica 15. Um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14.

[099] Solução técnica 16. O vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15, em que o vetor de expressão é um vetor plasmidial XOGC modificado a partir de pPCDNA.

[0100] Solução técnica 17. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14, ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16.

[0101] Solução técnica 18. A célula hospedeira de acordo com a solução técnica 17, que é selecionada a partir de célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli uma levedura ou Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto; uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

[0102] Solução técnica 19. Uma composição compreendendo o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12 ou o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14 ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16 ou a célula hospedeira de acordo com a solução técnica 17 ou 18, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0103] Solução técnica 20. Um método para produção de um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12, que compreende as etapas de: 1) expressar o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14 ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16 em uma célula hospedeira, respectivamente; 2) reduzir as proteínas expressas respectivamente na célula hospedeira; e 3) misturar as proteínas reduzidas e oxidar a mistura.

[0104] Solução técnica 21. O método de acordo com a solução técnica de 20, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli; uma levedura ou Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto; uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

[0105] Solução técnica 22. O método de acordo com a solução técnica 20 ou 21, em que a etapa de redução compreende 1) adicionar um agente redutor selecionado dentre o grupo que consiste em 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol, tris(2- carboxietil)fosfina ou outros derivados químicos; 2) realizar uma reação de redução na presença de ditiotreitol a uma concentração de 0,1 mM ou superior a 4ºC por pelo menos 3 horas; 3) remover o agente redutor, como pela dessalinização.

[0106] Solução técnica 23. O método de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 20-22, em que a etapa de oxidação compreende 1) oxidar no ar, e também compreende adicionar um agente oxidante selecionado do grupo que consiste em ácido L-desidroascórbico ou outro produto químico 2) realizar a reação de oxidação na presença de ácido L-desidroascórbico a uma concentração de 0,5 mM ou superior a 4ºC por pelo menos 5 horas.

[0107] Solução técnica 24. O método, de acordo com qualquer uma das soluções técnicas de 20-23, compreende ainda uma etapa de separação e purificação.

[0108] Solução técnica 25. Uso do anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12 e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14 e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16 e/ou a célula hospedeira de acordo com a solução técnica 17 ou 18 e/ou a composição de acordo com a solução técnica 19 na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

[0109] Solução técnica 26. O anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12 e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14 e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16 e/ou a célula hospedeira de acordo com a solução técnica 17 ou 18 e/ou a composição de acordo com a solução técnica 19, para uso como um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

[0110] Solução técnica 27. Um método para prevenção e/ou tratamento de uma doença que compreende administrar o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das soluções técnicas 1-12 e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com a solução técnica 13 ou 14 e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a solução técnica 15 ou 16 e/ou a célula hospedeira de acordo com a solução técnica 17 ou 18 e/ou a composição de acordo com a solução técnica 19, a um indivíduo que precise do mesmo.

[0111] Solução técnica 28. O uso de acordo com a solução técnica 25, o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, o polinucleotídeo isolado, o vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira ou a composição de acordo com a solução técnica 26, ou o método de acordo com a solução técnica a 27, em que o indivíduo é um mamífero, preferencialmente, um indivíduo humano.

[0112] Solução técnica 29. O uso de acordo com a solução técnica 25, o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, o polinucleotídeo isolado, o vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira ou a composição de acordo com a solução técnica 26, ou o método de acordo com a solução técnica 27, em que a doença é selecionada a partir dos seguintes tumores: leucemia, linfoma, mieloma, tumor cerebral, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer endometrial, sarcoma uterino, câncer de próstata, câncer de bexiga, carcinoma de células renais, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de osso.

[0113] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos não limitativos. Os técnicos no assunto compreenderão que várias modificações podem ser realizadas na mesma sem se afastar do espírito da presente invenção, e as modificações também estão incluídas no escopo da presente invenção.

[0114] Os métodos experimentais a seguir são todos métodos comuns, salvo especificação em contrário, e os materiais experimentais utilizados também podem ser facilmente obtidos de empresas comerciais, salvo especificação em contrário. Os vários anticorpos utilizados nos seguintes Exemplos da presente invenção são todos anticorpos padrão obtidos por via comercial.

Exemplo 1: Construção do vetor da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47

[0115] Vetores de expressão XOGC compreendendo a cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 humano foram construídos, respectivamente, em que a sequência da região variável do anticorpo foi derivada de http://imgt.org/mAb- DB/mAbcard?Abld=526, e a região constante da cadeia pesada foi I9G1 humana (Fc1, no qual a mutação N297A foi introduzida para eliminar o efeito de ADCC/CDC). À sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO. 1 e sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 2; a sequência nucleotídica da região constante da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO. 3 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 4; a sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO. 5 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 6; a sequência nucleotídica da região constante da cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO. 7 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 8. A região variável da cadeia leve e a região constante da cadeia leve, e a região variável da cadeia pesada e a região constante da cadeia pesada foram amplificadas por PCR, respectivamente.

Em todas as reações de PCR do presente pedido, foi utilizada a DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (F-530L) da NEB, Inc.

Os iniciadores de PCR foram desenhados, em geral, de acordo com o princípio da complementariedade de bases e a necessidade de sítios de digestão enzimática.

Cada sistema reacional consistia em 8,9 ul de H2O, 4 ul de tampão de DNA polimerase Phusion de alta fidelidade 5X, 4 uL de dNTPs a 1 mM, 1 uL de iniciador direto, 1 ul de iniciador reverso, 0,1 ul de DNA polimerase Phusion de alta fidelidade e 1 ul do molde.

Os produtos de PCR da região variável e da região constante foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% e os fragmentos correspondentes foram recuperados utilizando-se um kit de recuperação de DNA (Promega, A9282, o mesmo abaixo). O fragmento da região variável e o fragmento da região constante recuperados foram utilizados como moldes e um iniciador direto da região variável e um iniciador reverso da região constante foram utilizados para realizar outro ciclo de PCR.

Os fragmentos correspondentes foram recuperados novamente para se obter fragmentos completos da cadeia leve ou da cadeia pesada.

O vetor XOGC e os fragmentos completos foram digeridos enzimaticamente com EcoR! (NEB, Cat.

No.

R3101L) e Hindlll (NEB, Cat.

No.

R3104L). O sistema de digestão enzimática consistiu em 2 ul de tampão 3 10X, 0,5 uL de EcoRI e Hindlll, cada, 3 ul dos fragmentos completos recuperados do gel, e 14,5 ul de H2O.

O sistema de digestão enzimática foi deixado em reação a 37ºC por três horas.

Os produtos digeridos enzimaticamente foram ligados utilizando ligase T4DNA (NEB, Cat.

No. M0202V) (o mesmo a seguir), e o sistema de reação consistiu em 2 uL de tampão ligase 10X, 0,5 uL de ligase, 3 uL dos fragmentos completos recuperados do gel, 3 uL do vetor XOGC recuperado do gel, e 11,5 ul de H2O. A ligação foi realizada à temperatura ambiente por 12 horas. O produto de ligação foi transformado em célula E. coli competente DH5a (Tiangen, CB104, o mesmo abaixo). Os vetores de expressão XOGC da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo foram obtidos para expressar a cadeia pesada do anticorpo (Fc1) e a cadeia leve em células eucarióticas, respectivamente.

[0116] Na presente invenção, os vetores de expressão XOGC compreendendo a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo anti-CD47 humano foram construídos, respectivamente, onde a sequência da região variável do anticorpo foi derivada do documento WOZ2016109415A1. A sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO. 9 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 10; a sequência nucleotídica da região constante da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO. 3 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 4; a sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO. 11 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 12; a sequência nucleotídica da região constante da cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO. 13 e a sua sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO. 14. Os vetores de expressão XOGC da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo foram obtidos para expressar a cadeia pesada do anticorpo (Fc2) e a cadeia leve em células eucarióticas, respectivamente.

Exemplo 2: Expressão da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD- L1/anti-CD47

[0117] Os vetores de expressão compreendendo a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 humano foram transfectados em células 293F (Células 293-F FreeStyle'Y, Cat. No. R79007, Invitrogen), respectivamente, e os vetores de expressão compreendendo a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo anti-CD47 humano também foram transfectados nas células 293F, respectivamente. Um dia antes da transfecção, as células foram plaqueadas. No dia da transfecção, as células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em meio de expressão 293-F FreeStyle'Y (Cat. No. 12338001, Gibco) a uma densidade celular de 200 x 105 células/mL. Os plasmídeos foram adicionados de acordo com o volume de transfecção à concentração final de 36,67 pg/mL, e o meio foi misturado suavemente até a homogeneidade. Em seguida, PEI linear (polietilenoimina linear, PM 25000, Cat. No. 43896, Alfa Aesar) foi adicionada à concentração final de 55 ug/mL, e o meio foi suavemente misturado até a homogeneidade. Em seguida, a mistura foi colocada em uma incubadora e incubada em um agitador de 120 rpm a 37ºC por 1 hora. Em seguida, adicionou-se 19 vezes o volume de transfecção do meio fresco à mesma. À incubação foi realizada continuamente em um agitador de 120 rpm a 3/7ºC. O sobrenadante de cultura das células transfectadas por 5 a 6 dias foi coletado por centrifugação.

[0118] O nível de expressão foi determinado por ELISA. Antes da purificação por coluna de cromatografia, o precipitado foi removido por filtração através de um filtro de 0,2 um. Esta etapa foi realizada a 4ºC.

Exemplo 3. Purificação do produto de expressão da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47

[0119] A purificação foi realizada a 4ºC pelo uso do sistema de purificação de proteínas AKTA explorer tipo 100 (GE Healthcare) e da coluna de cromatografia por afinidade rProtein A Sepharose Fast Flow (16 mm ID, 22 mL, GE Healthcare). Primeiramente, uma fase móvel A (tampão fosfato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,4) foi usada para equilibrar a coluna de cromatografia. Depois de estabilizada uma linha de base, o sobrenadante das células tratadas acima foi carregado a uma taxa de fluxo de 5 mL/min. Depois de carregada a amostra, o equilíbrio foi efetuado utilizando-se a fase móvel A. As amostras foram o produto de expressão anti-PD-L1 e o produto de expressão anti-CD47, respectivamente. Depois disso, uma fase móvel B1 (fase móvel A contendo arginina a 0,5 M) foi usada para eluir 5 volumes da coluna. Em seguida, uma fase móvel B2 (ácido cítrico a 100 mM, pH 3,0) foi usada para eluir 5 volumes da coluna de modo a coletar um pico de eluição, isto é, um pico da proteína de interesse. A taxa de fluxo durante as etapas de lavagem acima foi de 5 mL/min. O cromatograma do pico de eluição de anti-PD-L1-Fc1 é mostrado na FIG. 1, e o pico de eluição de anticorpos anti-CD47-Fc2 é mostrado na FIG.2. O pico de eluição indicado (área cinza mostrada na figura) foi coletado e o pH foi ajustado para 5,0 pela adição, por gotejamento, da solução de acetato de sódio a 1M.

Exemplo 4. Preparação e purificação da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47

[0120] A estrutura da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti- CD47 é tal como ilustrada na FIG. 3.

[0121] O produto obtido pelo método rProtein A Sepharose Fast Flow acima descrito (16 mm ID, 22 mL, GE Healthcare) foi submetido a recombinação in vitro para se obter um heterodímero. Primeiramente, a solução de proteína purificada e coletada acima foi concentrada por ultrafitração através de um tubo de ultrafiltração concentrando (cut-off de peso molecular nominal de 10 kDa), e a solução foi substituída pelo tampão fosfato salino (PBS) (pH = 7,4). As soluções dos produtos de purificação anti-PD-L1 e anti-CD47 obtidos foram respectivamente ajustadas para 1 mg/mL por adição de PBS, e 1/200 vezes do volume final de DTT a 1 M foi adicionado (as concentração finais de DTT foram 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, mM, respectivamente). As ligações dissulfeto nas regiões de dobradiça das moléculas homodiméricas de anticorpos contidas nos produtos anti-PD-L1 e anti- CD47 também foram abertas, formando assim uma molécula de meio-anticorpo contendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cuja estrutura é tal como ilustrado em FIG. 4. A amostra reduzida foi analisada por SEC-HPLC (TOSOH, TSKgel superSW3000) compreendendo agente redutor DTT a 1 mM no tampão de fase móvel. Os resultados são mostrados na FIG. 5. A proporção de homodímeros anti-PD-L1 e anti-CD47 foi inferior a 10%, enquanto a proporção das moléculas de meio-anticorpo foi superior a 90%.

[0122] Posteriormente, as moléculas de meio-anticorpo anti-PD-L1 e anti- CD47 reduzidas foram misturadas em proporção molar igual e a reação de recombinação foi realizada a 4ºC por 0,5-24 horas. Durante a recombinação, um anticorpo biespecífico heterodimérico compreendendo as moléculas de meio- anticorpo anti-PD-L1 e anti-CD47 foi formado por meio da interação não covalente entre CH2 e CH3 das moléculas de meio-anticorpo anti-PD-L1 e anti-CD47. Em seguida, a solução proteica foi concentrada por ultrafiltração através de um tubo de concentração por ultrafiltração (cut-off de peso molecular nominal de 10 kKDa)e a solução foi substituída por solução fosfato (PBS, pH = 7,4) para interromper a redução. A solução foi submetida à oxidação no ar ou com um agente oxidante para permitir a formação de ligações dissulfeto do anticorpo biespecífico heterodimérico. As condições de oxidação incluíram: A amostra foi colocada no ar por 1 dia, 3 dias, 4 dias. Foi adicionado ácido L-desidroascórbico a 100 mM como agente oxidante (a concentração final da proteína foi de 1 mg/mL e as concentrações finais do agente oxidante foram de 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM) e a oxidação foi realizada a 4ºC por 24 horas.

[0123] A molécula heterodímérica anti-PD-L1/anti-CD47, obtida pela redução/oxidação dos produtos de expressão anti-PD-L1 e anti-CD47 descritos acima, foi concentrada por ultrafiltração através de um tubo de concentração por ultrafiltração (cut-off de peso molecular nominal de 10 kDa) e a solução foi substituída por uma solução tampão fosfato de sódio, pH 5,8. A purificação foi realizada a 4ºC pelo uso do sistema de purificação de proteínas AKTA explorer tipo 100 (GE Healthcare) e da coluna de cromatografia iônica Source 158 (ID 16 mm, 17mL, GE Healthcare). Primeiramente, uma fase móvel A (fosfato de sódio a 10 mM, pH 7,0) foi usada para equilibrar a coluna de cromatografia. Depois de estabilizada uma linha de base, a solução de proteína tratada acima foi carregada a uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Após o carregamento da amostra, o equilíbrio foi realizado usando a fase móvel A. Em seguida, 20 volumes da coluna (0% B-100% B, 170 min, taxa de fluxo 2 mL/min) foram lavados com um gradiente de A (fosfato de sódio a 10 mM, pH 5,8) a B (fosfato de sódio a 10 mM, pH 5,8). O pico principal da eluição foi coletado e a solução proteica coletada foi concentrada por ultrafiltração através de um tubo de concentração por ultrafiltração (cut-off de peso molecular nominal de 10 kDa). A solução foi substituída por uma solução fosfato (PBS, pH = 7,4) e filtrada e esterilizada e, em seguida, armazenada a 4ºC. A pureza do produto purificado foi analisada pelo método SEC- HPLC, e os resultados são mostrados na FIG. 6. A pureza foi de 99,3%. Como resultado da análise de RPC-HPLC (Thermo Fisher, MAbPac RP), a pureza foi de 100%, tal como mostrado na FIG. 7. Como resultado da análise de CE, a pureza foi de 97,1%, tal como mostrado na FIG. 8.

Exemplo 5. Atividade de ligação ao alvo da molécula de anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47

[0124] A capacidade de ligação do anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti- CD47 a um único antígeno foi determinada por ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA).

[0125] O procedimento detalhado do ELISA foi o seguinte: PD-L1 humano recombinante (Sino Biological Inc., Cat. No. 10377-H08H) ou CD47 humano (Beijing ACROBIiosystems, Cat. CD7-H5227) foi revestido em uma placa de ELISA de alta adsorção de 96 poços (Costar, Cat. No. 42592) utilizando-se uma solução tampão de carbonato (0,05M) de pH 9,6 a uma concentração de revestimento de 1 ug/mL e uma quantidade de revestimento de 100 ul por poço. O revestimento foi realizado a 4ºC durante a noite. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. A placa foi bloqueada com 300 ul/poço de PBST contendo 1% de BSA e incubada por 1 hora a 25ºC, e lavada cinco vezes com PBST. Uma amostra de anticorpo heterodimérico e um controle, cada um diluído em série com PBST contendo 1% de BSA, foram adicionados em uma quantidade de 100 ul por poço e incubados a 25ºC por 1 hora. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. Em seguida, um anticorpo IgG anti-humano marcado com peroxidase de rábano (Chemicon, Cat. No. AP309P) diluído 1:10.000 com PBST contendo 1% de BSA foi adicionado em uma quantidade de 100 ul por poço e incubado a 25ºC por 1 hora. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. Um substrato colorimétrico TMB foi adicionado em uma quantidade de 100 ulL/poço e desenvolvido por 10 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de 100 ul/poço de H2SO4 a 1 M. A absorbância a 450 nm foi lida em um leitor de microplacas.

[0126] Como resultado, tal como mostrado na FIG. 9, Painel A, o anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 possui alta afinidade a PD-L1, que é comparável à atividade de ligação ao antígeno do anticorpo monoclonal bivalente PD-L1; tal como mostrado na FIG.9, Painel B, o anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 possui alta afinidade a CD47, que é comparável à atividade de ligação ao antígeno do anticorpo monoclonal bivalente CD47.

Exemplo 6. Atividade de ligação simultânea do anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 a dois alvos

[0127] A capacidade de ligação simultânea do anticorpo heterodimérico anti- PD-L1/anti-CD47 a dois antígenos diferentes foi determinada pelo ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA).

[0128] O procedimento detalhado do ELISA foi o seguinte: CD47 humano recombinante (Beijing ACROBiosystems, Cat. No. CD7-H5227) foi revestido em uma placa de ELISA de alta adsorção de 96 poços utilizando-se uma solução tampão de carbonato de pH 9,6 a uma concentração de revestimento de 1 pg/ml e uma quantidade de revestimento de 100 ul por poço. O revestimento foi realizado a 4ºC durante a noite. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. A placa foi bloqueada com 300 ulL/poço de PBST contendo 1% de BSA e incubada por 1 hora a 25ºC, e lavada cinco vezes com PBST. Uma amostra de anticorpo heterodimérico e um controle, cada um diluído em série com PBST contendo 1% de BSA, foram adicionados em uma quantidade de 100 ul por poço e incubados a 25ºC por 1 hora. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. Um PD-L1-Fc ligado à biotina (Beijing Hanmi pharmaceutical) a 0,5 ug/mL, diluído com PBST contendo 1% de BSA foi adicionado em uma quantidade de 100 uL por poço e incubado a 25ºC por 1 hora. Um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano (BD Pharmingen, Cat. No. 554066) diluído 1:1000 com PBST contendo 1% de BSA foi adicionado em uma quantidade de 100 ul por poço e incubado a 25ºC por 1 hora. A placa foi lavada cinco vezes com PBST. Um substrato colorimétrico TMB foi adicionado em uma quantidade de 100 ul/poço e desenvolvido por 10 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de 100 uL/poço de H2SOa a 1 M. A absorbância a 450 nm foi lida em um leitor de microplacas.

[0129] Como resultado, tal como mostrado em FIG. 10, a combinação do anticorpo monoclonal para PD-L1 e CD47 não pode se ligar simultaneamente a PD- L1 e CD47, e apenas o anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 tem a atividade de se ligar simultaneamente aos dois antígenos.

Exemplo 7. Ligação do anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 a células tumorais/glóbulos vermelhos

[0130] As células tumorais HCC827 expressam PD-L1 e CDA47, e os glóbulos vermelhos (RBCs) expressam apenas CD47. HCC827s e RBCs foram misturados, e a citometria de fluxo (FCM) foi usada para detectar se o heterodímero era seletivo para a ligação das duas células nas células mistas.

[0131] O procedimento específico deste método foi o seguinte: células HCC827 (adquirido da ATCC) e glóbulos vermelhos (coletados de pessoas saudáveis) foram coletados, e lavados uma vez com DPBS frio (GIBCO, Cat. No. 14190-235) contendo 2% de SFB (Hyclone, Cat. No. SH30084.03). HCC827s foram misturadas a 1 x 1086 células/tubo, e os RBCs foram misturados a 10 x 10º células/tubo e ressuspensos em 200 ul de DPBS frio contendo 2% de SFB. Uma amostra de anticorpo heterodimérico e um controle, cada um diluído em série, foram adicionados. O tubo de citometria de fluxo foi incubado em gelo por 30 minutos e foi lavado duas vezes com DPBS contendo 2% de SFB. As células foram ressuspensas novamente em 200 uL de DPBS frio contendo SFB a 2% e o anticorpo IgG anti-humano marcado com FITC diluído a 1:1000 (Beijing Zhongshan Goldenbridge, Cat. No. ZFO0306) e foram incubadas em gelo por 30 minutos no escuro. As células foram lavadas com DPBS contendo 2% de SFB e depois ressuspensas em 500 ul de DPBS frio. À suspensão de células foi analisada em um citômetro de fluxo (BD, FACS, Calibur) e a intensidade de fluorescência de cada uma das duas células nas células misturadas foi lida.

[0132] Como resultado, tal como mostrado na FIG. 11, a ligação do anticorpo monoclonal para CD47 a HCC827s e RBCs misturados é basicamente a mesma (Painel A); enquanto o heterodímero anti-PD-L1/anti-CD47 tem a tendência de se ligar às células HCC827 que expressam PD-L1 e CD47, enquanto se liga ao RBC que expressa apenas CD47 fracamente, mostrando a seletividade de ligação (Painel B).

Exemplo 8. Atividade regulatória de células T do anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47

[0133] Uma reação linfocítica mista (MLR) foi utilizada para determinar a atividade de regulação do anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 na resposta imune das células T.

[0134] Aquisição de células dendríticas humanas (DC): PBMCs humanas (Lonza, Cat No. CC-2702) foram obtidas por descongelamento. As PBMC humanas foram ressuspensas em meio RPM! 1640 sem soro (GIBCO, Cat. No. 22400-089) a uma densidade celular de 5 x 10%/mL e foram semeadas em um frasco de cultura de células e foram incubadas em uma incubadora de CO>2 a 37ºC por 90 minutos. O sobrenadante da cultura e as células suspensas foram descartadas. As células aderentes foram cultivadas em um meio completo (RPMI 1640 com 10% de SFB), e 100 ng/ml de GM-CSF (Sino Biological Inc., Cat. No. 10015-HNAH) e 100 ng/mL de I1L-4 (Sino Biological Inc., Cat. No. 11846-HNAE) foram adicionados. As células foram incubadas por 3 dias. Depois que o meio foi mudado para um fresco, as células foram incubadas por mais 3 dias. Em seguida, o meio foi alterado para um meio completo (RPMI 1640 com 10% de SFB) contendo 100 ng/ml de GM-CSF, 100 ng/mL de IL-4 e 20 ng/mL de TNF-a, e as células foram incubadas por 1 dia para se obter as células DC.

[0135] Aquisição de células T humanas: PBMCs humanas foram obtidas por descongelamento. Tais PBMCs e as PBMCs para induzir células DC eram provenientes de indivíduos diferentes. As células T foram isoladas de acordo com o manual de instruções do kit de isolamento Pan T Cell (Miltenyi Biotech, Cat. No. 5150414820). Resumidamente, as PBMCs foram lavadas uma vez com DPBS, em seguida ressuspensas a 107 células com 40 ul de tampão de separação (DPBS contendo EDTA a 2 mM, 0,5% de BSA, pH = 7,2) (as quantidades seguintes são todas baseadas em 107 células), adicionadas com 10 ul de Pan T cell Biotin Antibody Cocktail e incubadas a 4ºC por 5 minutos. Após a adição de 30 ul de tampão de separação e 20 ul de Pan Cell MicroBead Cocktail, as células foram incubadas a 4ºC durante 10 minutos. Após a passagem por uma coluna de separação MACS, as células T foram obtidas.

[0136] As células DC humanas coletadas e as células T humanas foram ressuspensas em um meio completo (RPMI 1640 com 10% de SFB) e plaqueadas em uma placa de 96 poços. As células DC e células T foram plaqueadas a 1 x 10*/poço e 1 x 105/poço, respectivamente, e foram cultivadas em mistura. Uma amostra de anticorpo heterodimérico e um controle, cada um diluído em série com o meio completo, foram adicionados. A placa foi incubada em uma incubadora de CO? a 37ºC por 5 dias. Após a incubação, o sobrenadante do poço foi removido e a citocina IFN- y foi detectada de acordo com o manual de instruções do kit (RayBiotech, Cat. No. ELH-IFNg).

[0137] Como mostrado na Fig. 12, as células T humanas são ativadas para secretar IFN-y serem após estimuladas por células DC alogênicas. A adição do anticorpo PD-L1 aumentará a ativação das células T e promoverá a secreção de citocinas. O anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 também mostra forte atividade regulatória pelas células T, promovendo significativamente a secreção da citocina IFN-y.

Exemplo 9. Atividade fagocítica mediada pelo anticorpo heterodimérico anti-PD-L1/anti-CD47 por macrófagos contra células tumorais

[0138] Preparação de macrófagos humanos maduros: PBMCs humanas (Lonza, Cat No. CC-2702) foram obtidas por descongelamento. PBMCs humanas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 sem soro a uma densidade celular de 5 x 106/mL e foram semeadas em um frasco de cultura de células, e foram incubadas em uma incubadora de CO? a 37ºC durante 90 minutos. O sobrenadante da cultura e as células suspensas foram descartadas. As células aderentes foram cultivadas em um meio completo (RPM! 1640 com 10% de SFB), e 25 ng/mL de M-CSF (Sino Biological Inc., Cat. No. 10015-HNAH) foram adicionados. As células foram incubadas por 7 dias. Em seguida, os macrófagos foram coletados e ressuspensos em um meio completo (RPMI 1640 com 10% de SFB) contendo 25ng/ml. de M-CSF e 50ng/mL de IFN-y (Sino Biological Inc., Cat. No. 11725-HNAS). A suspensão celular foi plaqueada em uma placa de cultura de células de 48 poços a 50.000 células por poço, e incubada durante 1 dia para tornar os macrófagos maduros e prontos para uso.

[0139] As células tumorais Raji foram coradas de acordo com o manual de instruções do kit CFSE (Life Technology, Cat. No. C34554). Resumidamente, CFSE foi diluído com DPBS a uma concentração de trabalho de 5 uM. Depois de pré- aquecidas a 37ºC, as células Raji foram coletadas por centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos. Após ressuspensas com a solução de trabalho CFSE pré- aquecida, as células Raji foram incubadas a 37ºC durante 15 minutos. As células foram lavadas uma vez com o meio completo, ressuspensas no meio completo, incubadas por 30 minutos, lavadas duas vezes com o meio completo, e em seguida ressuspensas no meio completo para uso.

[0140] A placa de 48 poços foi lavada 3 vezes com o meio completo. As células Raji coradas com CFSE foram pré-incubadas com a amostra de heterodímero a ser testada e o controle por 15 minutos, depois adicionadas a uma placa de cultura de 48 poços e incubadas em uma incubadora de CO? a 37ºC por 2 horas. Após a incubação, a placa de 48 poços foi lavada três vezes com o meio completo, adicionou- se 10 ug/mL de aglutinina de gérmen de trigo, Alexa fluor 555 (Life Technologies, No. W32464) diluído no meio completo, e incubadas durante 15 minutos no escuro. À placa de 48 poços foi lavada mais três vezes com o meio completo e fixada com paraformaldeído a 4% por 15 minutos. A placa de 48 poços foi lavada mais três vezes com o meio completo e meio completo foi adicionado à mesma. As células foram contadas por fotografia com um microscópio de fluorescência. O método de cálculo do índice fagocítico (%) foi: o número de células Raji marcadas em verde fagocitadas/o número de macrófagos marcados em vermelho existentes x 100.

[0141] Como mostrado na FIG. 13, o anticorpo heterodimérico anti-PD- L1/anti-CD47 pode mediar os macrófagos a fagocitar as células tumorais Raji, que é comparável com a atividade do anticorpo monoclonal para CD47..

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero CARACTERIZADO por compreender uma primeira cadeia Fc e uma segunda cadeia Fc, e uma primeira região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a PD-L1 e uma segunda região funcional de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a CD47; em que cada primeira cadeia Fc e segunda cadeia Fc é um fragmento Fc de imunoglobulina G compreendendo uma substituição de aminoácidos, e a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc juntas constituem um heterodímero que pode se ligar a um receptor Fc; em que a primeira cadeia Fc e a segunda cadeia Fc estão ligadas à primeira região funcional de ligação ao antígeno e à segunda região funcional de ligação ao antígeno através de uma ligação covalente ou um agente de ligação, respectivamente; e em que qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições 366 e 399, e a outra compreende substituições de aminoácidos nas posições 351, 407 e 409, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração Índice EU de Kabat.

2. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as substituições de aminoácidos da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc são as seguintes: a) L351G, L351Y, L351V, L351P, L351D, L351E, L351K ou L351W; b) T366L, T366P, T366W ou T366V; c) D399C, D399N, D399|, D399G, D399R, D399T ou D399A; d) Y407L, Y407A, Y407P, Y407F, Y407T ou Y407H; e e) K409C, K409P, K409S, K409F, K409V, K409Q ou K409R.

3. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as substituições de aminoácidos compreendem as: a) substituições T366L e D399R em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351E, Y407L e K409V na outra; b) substituições T366L e D399C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351G, Y407L e K409C na outra; c) substituições T366L e D399C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351Y, Y407A e K409P na outra; d) substituições T366P e D399N em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351V, Y407P e K4098S na outra; e) substituições T366W e D399G em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351D, Y407P e K409S na outra; f) substituições de T366P e D399!| em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351P, Y407F e K409F na outra; g) substituições de T366V e D399T em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351K, Y407T e K409Q na outra; h) substituições T366L e D399A em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351W, Y407H e K409R na outra.

4. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as substituições de aminoácidos compreendem as: a) substituições T366L e K409V em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351E, Y407L e D399R na outra; b) substituições T366L e K409C em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351G, Y407L e D399C na outra; c) substituições T366L e K409P em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351Y, Y407A e D399C na outra;

d) substituições T366P e K409S em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351V, Y407P e D399N na outra; e) substituições T366W e K409S em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351D, Y407P e D399G na outra; f) substituições T366P e K409F em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351P, Y407F e D399| na outra; g) substituições T366V e K409Q em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351K, Y407T e D399T na outra; h) substituições T366L e K409R em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc, e substituições L351W, Y407H e D399A na outra.

5. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que os aminoácidos em qualquer uma da primeira cadeia Fc e da segunda cadeia Fc são substituídos por T366L e D399R, e os aminoácidos da outra são substituídos por L351E, Y407L e K409V.

6. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira região funcional de ligação ao antígeno e a segunda região funcional de ligação ao antígeno são selecionadas a partir de um fragmento Fab, um fragmento scFv, um fragmento de domínio variável Fv e um fragmento da região variável da cadeia pesada VHH de uma cadeia pesada de anticorpo.

7. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira região funcional de ligação ao antígeno e a segunda região funcional de ligação ao antígeno são ambas fragmentos Fab.

8. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que uma da primeira região funcional de ligação ao antígeno e da segunda região funcional de ligação ao antígeno é um fragmento Fab e a outra é um scFv.

9. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento Fab compreende primeira região variável da cadeia pesada e segunda região variável da cadeia pesada diferentes e primeira região variável da cadeia leve e segunda região variável da cadeia leve diferentes.

10. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira cadeia Fc e a primeira região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, e a segunda cadeia Fc e a segunda região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, quando em uma solução na qual um agente redutor está presente e que compreende nenhum outro polipeptídeo além da primeira cadeia Fc e a primeira região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, e a segunda cadeia Fc e a segunda região funcional de ligação ao antígeno ligada covalentemente à mesma, forma menos do que 50% dos homodímeros com base no peso de todas as cadeias polipeptídicas.

11. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 e 6.

12. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 e 12.

13. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4e 8.

14. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 e 14.

15. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO por codificar o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOs: 1 e5.

17. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOs: 9 e 11.

18. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da primeira região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda SEQ ID NOs: 3 e 7.

19. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos da segunda região funcional de ligação ao antígeno compreende ainda SEQ ID NOs: 3 e 13.

20. Vetor de expressão recombinante CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19.

21. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor plasmidial XOGC modificado a partir de pPCDNA.

22. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, ou o vetor de expressão recombinante definido na reivindicação 20 ou 21.

23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que é selecionada a partir da célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCcHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli uma levedura ou Piíchia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto; uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

24. Composição CARACTERIZADA por compreender o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, ou o vetor de expressão recombinante definido na reivindicação 20 ou 21, ou a célula hospedeira definida na reivindicação 22 ou 23, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

25. Método para produção de um anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: 1) expressar o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19 ou o vetor de expressão recombinante definido na reivindicação ou 21, em uma célula hospedeira, respectivamente; 2) reduzir as proteínas expressas respectivamente na célula hospedeira; e 3) misturar as proteínas reduzidas e oxidar a mistura.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir da célula embrionária de rim humano HEK293 ou HEK293T, HEK293E, HEK293F modificada a partir da célula HEK293; células de ovário de hamster CHO ou CHO-S, CHO-dhfr, CHO/DG44, ExpiCcHO modificada a partir de células CHO; Escherichia coli ou Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), Rosetta, Origami modificado a partir de Escherichia coli, uma levedura ou Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha modificada a partir de uma levedura; uma célula de inseto ou High5, célula SF9 modificada a partir de uma célula de inseto; uma célula vegetal; uma célula mamária de mamífero, célula somática.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de redução compreende 1) realizar uma reação de redução na presença de um agente redutor selecionado do grupo que consiste em 2- mercaptoetilamina, ditiotreitol, tris(2-carboxietil)fosfina ou outros derivados químicos; 2) remover o agente redutor.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de oxidação é a oxidação no ar, e também compreende realizar uma reação de oxidação na presença de um agente oxidante selecionado do grupo que consiste em ácido L-desidroascórbico ou os derivados químicos do mesmo.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, CARACTERIZADO por compreender ainda a etapa de separação e purificação.

30. Uso do anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 20 ou 21, e/ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22 ou 23, e/ou a composição de acordo com a reivindicação 24 CARACTERIZADO por ser para fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

31. Anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e/ou o polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, e/ou o vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 20 ou 21, e/ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22 ou 23, e/ou a composição de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO por ser para uso como um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo.

32. Método para prevenção e/ou tratamento de uma doença, CARACTERIZADO por compreender administrar o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero definido em com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e/ou o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, e/ou o vetor de expressão recombinante definido na reivindicação 20 ou 21, e/ou a célula hospedeira definida na reivindicação 22 ou 23, e/ou a composição definida na reivindicação 24, a um indivíduo que precise do mesmo.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 30, o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, o polinucleotídeo isolado, o vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira ou a composição de acordo com a reivindicação 31, ou o método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que indivíduo é um mamífero, preferencialmente, um indivíduo humano.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 30, o anticorpo biespecífico na forma de um heterodímero, o polinucleotídeo isolado, o vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira ou a composição de acordo com a reivindicação 31, ou o método de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é selecionada dentre os seguintes tumores: leucemia, linfoma, mieloma, tumor cerebral, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer endometrial, sarcoma uterino, câncer de próstata, câncer de bexiga, carcinoma de células renais, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de osso.