CN111116733B - 一种靶向程序性死亡受体1和pd-1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向程序性死亡受体1和PD‑1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体，所示抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所示纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明构建了一种以PD‑1/PD‑L1相互作用界面的β环序列PD‑1125‑136为抗原肽序列筛选的靶向PD‑1/PD‑L1的相互作用界面的纳米抗体。此纳米抗体可显著抑制PD‑1与靶细胞表面的结合，在研发靶向PD‑1/PD‑L1治疗性纳米抗体方面具有重要应用价值。因此，此抗原肽和纳米抗体有很好的研究和应用推广价值。

Description

一种靶向程序性死亡受体1和PD-1配体1相互作用界面的抗原 肽和纳米抗体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种靶向程序性死亡受体1和PD-1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体。
背景技术
PD-1/PD-L1免疫疗法，是目前除了常见的治疗手段如手术、放化疗和靶向药治疗等之外的最新的治疗方法。PD-1全称是程序性死亡受体1，英文名字为prog rammed death1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-L1全称是程序性死亡受体-配体1，英文名字programmed cell death-Ligand 1，是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。
T细胞有“人体卫士”之称，可以识别人体的肿瘤细胞并进行杀伤攻击。但是肿瘤细胞是比较狡猾的，它看到T细胞上有个蛋白叫做PD-1，然后肿瘤细胞便伸出一个PD-L1蛋白(是PD-1的配体)，当两个小手(PD-1与PD-L1)结合后，便提供了抑制性信号，诱导了T细胞凋亡、抑制T细胞的活化和增殖。
PD-L1蛋白是PD-1的配体，与免疫系统的抑制有关，可以传导抑制性的信号。PD-1和PD-L1一旦结合便会向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，让其无法识别癌细胞，并且使T细胞自身增殖减少或凋亡，有效解除机体的免疫反应，因此癌细胞可以肆无忌惮地生长了。PD-1/PD-L1免疫治疗法通过把其中一个通路的限制，使得PD-1与PD-L1不能结合，免疫系统恢复正常工作，从而能够攻击肿瘤细胞，控制肿瘤。
靶向PD-1/PD-L1通路的免疫疗法是一种较广谱的抗肿瘤方法，已被用于多种类型的肿瘤疾病的治疗，可有效改善患者的总生存期。但已有的临床使用数据显示，PD-1/PD-L1疗法的个体差异很大，部分患者有显著的效果，部分患者却无效。如黑色素瘤的有效率可达40-50％，膀胱癌可达50％，肺癌有效率可达30％，胃癌、食管癌和肝癌的有效率约在30％。研究结果表明，PD-1/PD-L1免疫治疗的高反应性跟CD8+T细胞效应基因的表达、肿瘤突变负荷、高新抗原负荷相关；低反应性与PD-1/PD-L1信号通路的抑制效率有关，PD-1/PD-L1信号通路活性的抑制率越低，肿瘤病人的反应性就越低。PD-1/PD-L1信号通路活性的抑制率与所用抑制剂(主要是抗体)的靶向部位密切相关，目前已有抗体的靶向部位均不在PD-1和PD-L1相互作用的界面区。而靶向PD-1和PD-L1相互作用的界面区的抗体将显著提高对该信号通路活性的抑制率。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种靶向程序性死亡受体1和PD-1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体。
本发明的第一个目的是提供一种PD-1与PD-L1相互作用界面的抗原肽。
本发明的第二个目的是提供所述的抗原肽在筛选靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的抗体中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体。
本发明的第四个目的是提供一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体的编码基因。
本发明的第五个目的是提供一种重组载体。
本发明的第六个目的是提供一种工程菌。
本发明的第七个目的是提供所述的纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、或所述的工程菌任一在制备PD-1与PD-L1相互作用的抑制剂，和/或制备PD-1/PD-L1免疫治疗法药物中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种PD-1/PD-L1免疫治疗法治疗药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明首先要求保护一种PD-1与PD-L1相互作用界面的抗原肽，所示抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(SEQ ID NO:1：AISLAPKAQIKE)。
进一步要求保护所述的抗原肽在筛选靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的抗体中的应用。
优选地，所述抗体为纳米抗体。
本发明同时还要求保护以下内容：
一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体，所示纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2：
KREAEAAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDKVNNQNMGWVRQAPGKGLEWVSAIAVRNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATARHRLPVKHSAHQLKSWGQGTLVTVSSHHHHHH
一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体的编码基因，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3：
AAGAGAGAGGCTGAAGCTGCTCAAGTTCAATTGGTTGAGTCTGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTGACAAGGTTAACAACCAAAACATGGGTTGGGTTAGACAAGCTCCAGGTAAGGGTTTGGAGTGGGTTTCTGCTATCGCTGTTAGAAACGGTTCTACTTACTACGCTGACTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATCTCTCGTGACAACTCTAAGAACACTTTGTACTTGCAAATGAACTCTTTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTTTACTACTGTGCTACTGCTAGACACAGATTGCCAGTTAAGCACTCTGCTCACCAATTGAAGTCTTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCTCACCACCACCACCACCAC
一种重组载体，连接有所述的编码基因。
一种工程菌，携带有所述的重组载体。
本发明还要保护所述的纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、或所述的工程菌任一在制备PD-1与PD-L1相互作用的抑制剂，和/或制备PD-1/PD-L1免疫治疗法药物中的应用。
所述PD-1/PD-L1免疫治疗法药物是基于抑制PD-1与PD-L1相互作用的。
本发明还要保护一种PD-1/PD-L1免疫治疗法治疗药物，含有所述的纳米抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明构建了一种以PD-1/PD-L1相互作用界面的β环序列PD-1125-136(AISLAPKAQIKE)为抗原肽序列筛选的靶向PD-1/PD-L1的相互作用界面的纳米抗体。此纳米抗体可显著抑制PD-1与靶细胞表面的结合，在研发靶向PD-1/PD-L1治疗性纳米抗体方面具有重要应用价值。因此，此抗原肽和纳米抗体有很好的研究和应用推广价值。
附图说明
图1为PD-1的β环和抗原肽PD-1 125-136的位置；使用Cn3D 4.1对PD-1和PD-L1的胞外域(ECD)进行3D建模：紫色部分是PD-L1的ECD；蓝色和黄色部分是PD-1的ECD；PD-1ECD的β环(黄色)与与PD-L1的结合。
图2为PD-1-Nb-B20基因序列。
图3为纳米抗体表达和纯化的SDS-PAGE分析；(A)表达分析：泳道1，未诱导的重组细胞，泳道2：用IPTG诱导的细胞10小时，泳道3和4：超声细胞的沉淀和上清液，M：分子大小标记，箭头指示的条带是纳米抗体表达产物；(B)纯化分析：泳道1和2：分别是超声处理细胞的上清液和稀释的色谱样品，CM-Sepharose阴离子交换色谱的3-6道洗脱样品，第3和5道：分别用420mmol/L和1000mmol/L NaCl洗脱的峰样品，第4和6道：分别用420mmol/L和1000mmol/L NaCl洗脱的总样品，泳道7：来自Ni-NTA色谱的洗脱样品。
图4为D-L1表达的蛋白质印迹分析；通过SDS-PAGE电泳分离总蛋白并转移至PVDF膜。使用了总蛋白(～20μg)，将膜暴露于X射线胶片30秒，探测β-肌动蛋白作为对照。
图5为PD-L1表达的流式细胞仪；约1×106个细胞用小鼠抗人PD-L1单克隆抗体(抗PD-L1)和FITC标记的山羊抗小鼠单克隆二抗标记。
图6为BxPC-3细胞中的竞争结合测定；(A)：空白细胞与PBS在4℃孵育2小时；(B)：阴性对照细胞与BSA和重组人PD-1在4℃孵育2小时；(C-E)：纳米抗体治疗组，其中细胞分别与人重组PD-1和1μg/mL，10μg/mL和100μg/mL纳米抗体一起孵育。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
材料和试剂
人源结构域抗体文库(Source BioScience，英国)用于噬菌体筛选。
大肠杆菌DH5α(默克，德国)用于分子克隆，大肠杆菌BL21(DE3)(默克)用作人类纳米抗体表达的宿主。
pET-21b载体(Merck)用于克隆人类纳米抗体基因。
Ni-NTA，CM-Sepharose，Sephadex-G25和Sephadex 75色谱柱用于纯化纳米抗体(GE Healthcare，英国)。
人宫颈癌HeLa细胞和人肺癌A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏中心；人胰腺腺癌BxPC-3细胞和人肺癌NCI-H292细胞购自中国Jennio Biotech。
DMEM，RPMI-1640，胎牛血清(FBS)和补充剂购自USA HyClone；MPBS缓冲液是补充有5％脱脂奶粉(w/v)的PBS缓冲液；PBST在PBS缓冲液中含有0.1％Tween-20。
将16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g NaCl溶解在1L去离子水中，制成2×YT培养基。
将细菌胰蛋白胨10g，酵母提取物5g和NaCl 8g溶解在800mL去离子水中，并与200ml 20％葡萄糖溶液(w/v)混合，然后加入氨苄青霉素溶液1ml以制备TYE氨苄青霉素葡萄糖琼脂平板；其中，青霉素溶液为：将氨苄西林钠盐溶解在去离子水中至100mg/mL的浓度，并在-20℃下保存。
实施例1抗原肽设计
一、实验方法
从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人PD-1/PD-L1的序列和3D结构。
为了鉴定靶向PD-1/PD-L1相互作用界面的抗原肽，CN3D 4.1对人PD-1/PD-L1复合物的3D结构(NCBI PDB ID：4ZQK)进行了分析。
二、实验结果
识别出PD-1上的两个β环，它们形成了一个直接接触PD-L1的“V形角”(图1A)。β环之一PD-1125-136(AISLAPKAQIKE)被选择并合成为抗原肽(图1B)。
选择这12个氨基酸(序列如SEQ ID NO:1所示)序列作为抗原肽，并由上海初泰生物技术公司(中国)合成。肽制品的纯度≥95％。
实施例2纳米抗体的筛选和表征
一、实验方法
根据制造商的说明书，使用PD-1125-136(序列如SEQ ID NO:1所示)对人类域抗体库进行了三轮生物淘选。
将96孔板(Corning，USA)用PBS中的PD-1125-136包被。将板分别以100μg/mL，50μg/mL，5μg/mL抗原浓度筛选三轮，在PBS中洗涤，并在4℃的MPBS缓冲液中孵育过夜。然后将孔在37℃的孔中用MPBS中展示的PBS噬菌体洗涤3次，持续2小时。洗涤后，加入胰蛋白酶1小时，吸取洗脱的展示噬菌体，用于在30ml 2×YT培养基中感染大肠杆菌TG1。培养板直到光密度(OD)达到0.5。
将孔在PBS中洗涤3次，并将5×1012噬菌体稀释至10ml，其中以100μl/孔将MPBS添加至微量滴定板的孔中。将孔在室温下摇动1小时，并用PBST洗涤10次并用PBS洗涤两次。将Typsin(100μl)添加到每个孔中，并将混合物缓慢振摇1h，然后转移到10ml EP管中。然后将溶液添加到30ml TG1肉汤中，在37℃下孵育1h，并在3200g下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1ml 2×YT中，并在37℃下过夜接种于TYE氨苄青霉素葡萄糖琼脂平板上。第二天，用5ml 2×YT培养基洗涤菌落，并混合细菌溶液。将悬浮液用500ml 2×YT培养基稀释500倍，其中含有100μg/ml AMP和4％葡萄糖至OD600＝0.1。重复的噬菌体抗体文库扩增步骤从新一轮噬菌体筛选开始。
第三轮筛选涉及将单克隆菌株划线到TYE氨苄青霉素葡萄糖琼脂平板上，并将其添加到含有100μg/mL AMP和4％葡萄糖2×YT培养基的96孔板中。转移每种单克隆菌株。细菌在37℃，180rpm下孵育过夜。将细菌溶液(2μl)移入装有200μl2×YT培养基(含100μg/mLAMP和4％葡萄糖)的96孔板的孔中，在37℃下以180rpm的速度移3h。接着，在37℃下加入50μl 4×108KM13辅助噬菌体1小时，并离心10分钟以弃去液体。将细胞沉淀重悬于200μl/孔的2×YT培养基中，该培养基包含100μg/mL AMP，50μg/mL KAN和0.1％葡萄糖，并在25℃，180rpm下培养18h。在3200g离心10分钟后，将上清液转移到96孔板中，然后将25μl上清液与75μlMPBS混合。然后将溶液添加到用靶蛋白包被的孔中。加入PBS作为阴性对照。将板在室温下摇动1h，并用PBST缓冲液洗涤5次后，用MPBS(每孔100μl)稀释1：5000HRP-/Anti M13单克隆结合物。将板在室温下摇动1小时，用PBST洗涤3次并用PBS洗涤一次。将TMB溶液(100μL)在室温下添加到每个孔中30分钟。通过向每个孔中添加50μl1 M H2SO4终止反应。选择阳性菌株进行进一步分析。
对噬菌体纳米抗体的DNA进行测序，并使用VBASE2(http://www.vbase2.org/)进行分析。
二、实验结果
使用商业化的人源化纳米抗体噬菌体展示文库。经过三轮生物淘选后，获得了六个阳性噬菌体克隆。噬菌体抗体的氨基酸序列通过VBASE2(http://www.vbase2.org/)在线分析。纳米抗体具有与人源化VHH抗体V3-23/DP47相同的FR，它们的CDR3在碱性氨基酸组成和序列长度上表现出很大差异(如表1所示)。使用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线分析了纳米抗体的理化特性。除了一个样品外，其他所有样品中的纳米抗体都由～120个氨基酸组成，分子量为12～13kDa，具有基本等电点(表2)。选择具有最长CDR3区域的纳米抗体，称为PD-1-Nb-B20(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，以进行进一步分析。
表1纳米抗体的氨基酸序列：
Figure BDA0002294181510000071
表2纳米抗体的理化性质：
Figure BDA0002294181510000072
实施例3PD-1-Nb-B20的表达和纯化
一、实验方法
(1)PD-1-Nb-B20的表达
用JCat密码子适应工具(http://www.jcat.de/)，根据大肠杆菌偏好密码子优化所选纳米抗体的编码序列。将his6标签添加到下游，并根据常规方法将其克隆到pET21b的Nde I和Hind III位点之间。用于克隆的PCR引物对为：5'GACACTCGAGAAGAGAGAGAGGCTGAAGC3'(正向)和5'ACTCAAGCTTTTAGTAGTGGTGGTGGT 3'(反向)。
将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃，170rpm/min的条件下培养14h，然后转移到含100％g/mL AMP的LB培养基(接种量为1％)中。在37℃，170rpm/min的条件下孵育2.5小时后，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)以诱导目标蛋白的表达。将样品在25℃下孵育10小时，培养10小时，然后以8000rpm离心10分钟。将培养物重悬于1mmol/L EDTA，20mmol/L PB，pH 7.0中。重悬后，将PMSF加入至终浓度为0.1mmol/L，在4℃超声处理30分钟，以8,000rpm离心15分钟，收集沉淀物和上清液用于SDS-PAGE。
(2)PD-1-Nb-B20的纯化
如上所述培养2L重组大肠杆菌BL21(DE3)。将上清液加到用含200mmol/LNaCl和1mmol/L EDTA的20mmol/L PB(pH 7.0)平衡的CM-Sepharose阴离子交换色谱柱上(10mm×150mm)。用含有420mmol/L NaCl的20mmol/L PB(pH7.0)洗脱目标蛋白。将洗脱的样品上样到用20mmol/L PB(pH 7.0)含420mmol/LNaCl平衡的Ni-NTA色谱柱(10mm×150mm)上，用20mmol/L PB(pH 7.0)洗脱目标蛋白)含有420mmol/L NaCl和100mmol/L咪唑。用SephadexG25柱(16mm×400mm)将目标蛋白交换成10mmol PBS。
将氨化酶平板用1.25μg/mL，2.5μg/mL和5.0μg/mL的抗原肽包被。制备梯度稀释的纯化产物，并将纯化产物用作一抗。抗His抗体被用作与TMB偶联以显色的二级抗体。通过ElISA检测抗受体亲和力常数Kaff。
二、实验结果
为了制备纳米抗体，对得到PD-1-Nb-B20的编码基因根据大肠杆菌密码子优化进行优化(如图2)，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。之后，用His6标记的C末端的编码序列，并将其克隆到pET21b中以在T7启动子的控制下进行过表达。在25℃下于1mmol IPTG中诱导重组大肠杆菌DE3(BL21)细胞。纳米抗体的表达产物存在于超声处理的上清液中，表明它们是可溶性蛋白(图3A)。纳米抗体通过CM-Sepharose阴离子交换色谱法部分纯化，并使用Ni-NTA亲和色谱法纯化，纯度超过95％(如图3B所示)。通过ELISA测定，纯化产物的亲和常数Kaff为1.0×105L/mol。
实施例4PD-1-Nb-B20抑制PD-1与细胞表面PD-L1结合
为了选择过表达PD-L1的肿瘤细胞作为纳米抗体竞争抑制试验的靶标，人类肺癌细胞A549，人类粘液表皮样肺癌细胞系NCI-H292，人类胰腺腺癌细胞BxPC-3和人类宫颈癌细胞HeLa通过蛋白质印迹和流式细胞术分析PD-L1表达。
一、实验方法
(1)PD-L1表达的蛋白质印迹分析
A549，BxPC-3，NCI-H292和Hela细胞在37℃，5％CO2下培养。细胞裂解后测量蛋白质含量，并通过SDS-PAGE电泳分离50ng蛋白质。将蛋白质转移到PVDF膜上，将其封闭并用小鼠抗人PD-L1单克隆抗体(1：5000)(ProteintechGroup，芝加哥，伊利诺伊州，美国)在4℃过夜标记。然后洗涤膜，并用缀合有HRP的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1：2000)(BeyotimeBiotechnology，上海，中国)标记1h。ECL用于可视化蛋白质条带。用X射线胶片将膜曝光30秒钟，显影5分钟，固定5分钟，然后在Tanon-1220凝胶成像系统(Tanon，中国)上成像。
(2)测定PD-L1表达的流式细胞术分析
将A549，NCI-H292，BxPC-3，NCI-H292和Hela细胞在37℃，5％CO2中培养，在1.5mlEP管中收集大约1×10 6个细胞，并在PBS缓冲液中于2％BSA封闭。4℃1小时。将细胞以1000rpm沉淀5分钟，用PBS洗涤3次，并弃去上清液。将小鼠抗人PD-L1单克隆抗体(Proteintech Group，芝加哥，伊利诺伊州，美国)在含有2％BSA的PBS中稀释至0.2μg/100μl，并添加到细胞中(每个EP管100μl)。阴性对照不含PD-L1抗体。细胞在4℃下孵育2小时，洗涤3次，弃去上清液。向细胞中添加100μlFITC标记的山羊抗小鼠二抗(ProteintechGroup，芝加哥，伊利诺伊州，美国)，稀释500倍，并在黑暗中孵育30分钟。用PBS洗涤3次后，弃去上清液，将沉淀重悬于300μl的4℃预冷的PBS中，将其转移至流管中并通过流式细胞术进行分析。
二、实验结果
Western印迹分析显示A549细胞和BxPC-3细胞的PD-L表达水平高于其他两个细胞系(图4)，而流式细胞仪分析显示BxPC-3细胞的PD-L表达水平最高(图5)。因此，选择BxPC-3细胞作为靶细胞进行后续实验。
实施例5竞争性抑制PD-1与细胞表面的PD-L1结合
一、实验方法
在含有10％(v/v)FBS的1640中培养BxPC-3细胞，在1.5ml EP管中收集1×106个细胞，并在4℃用PBS缓冲液中的2％BSA封闭1h。将细胞以1000rpm沉淀5分钟，然后在PBS中洗涤3次。弃去上清液，将纳米抗体与带有His6标签的PD-1细胞外域蛋白(Sino Biological，中国)在10mmol/L PBS中于37℃孵育2小时。将它们添加到上述细胞中并在4℃下孵育2小时。阴性对照组缺乏抗体和“抗体药物溶剂”作为对照。用PBS洗涤3次后，在4℃下用2％BSA的PBS中FITC偶联的小鼠抗His抗体标记细胞30分钟。用PBS洗涤3次后，弃去上清液，将沉淀重悬于300μl4℃的预冷PBS中，转移至流式管中，并使用Coulter ELITE流式细胞仪(Beckman，美国)进行分析。
二、实验结果
重组His6标签的PD-1细胞外域蛋白被用于纳米抗体竞争抑制测定中，并通过FITC标记的抗His6标签抗体和流式细胞仪检测结合到BxPC-3细胞表面的PD-1蛋白(图6)。阴性对照组中缺乏纳米抗体的BxPC-3细胞表面结合的PD-1的荧光强度，分别以1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml的纳米抗体处理组分别为13.9％，2.11％，分别为0.91％和0.85。三种浓度的纳米抗体的抑制率分别为84.8％，93.5％和93.9％。这些结果表明，纳米抗体PD-1-Nb-B20可以有效抑制PDx与BxPC-3细胞上PD-L1的结合。靶向相互作用界面的纳米抗体可有效阻断PD-1/PD-L1在细胞表面的结合。
序列表
<110> 广东药科大学
<120> 一种靶向程序性死亡受体1和PD-1配体1相互作用界面的抗原肽和纳米抗体
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25 30
Gly Asp Lys Val Asn Asn Gln Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ala Val Arg Asn Gly Ser
50 55 60
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Arg His Arg Leu Pro Val
100 105 110
Lys His Ser Ala His Gln Leu Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser His His His His His His
130 135
<210> 3
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagagagagg ctgaagctgc tcaagttcaa ttggttgagt ctggtggtgg tttggttcaa 60
ccaggtggtt ctttgagatt gtcttgtgct gcttctggtg acaaggttaa caaccaaaac 120
atgggttggg ttagacaagc tccaggtaag ggtttggagt gggtttctgc tatcgctgtt 180
agaaacggtt ctacttacta cgctgactct gttaagggta gattcactat ctctcgtgac 240
aactctaaga acactttgta cttgcaaatg aactctttga gagctgagga cactgctgtt 300
tactactgtg ctactgctag acacagattg ccagttaagc actctgctca ccaattgaag 360
tcttggggtc aaggtacttt ggttactgtt tcttctcacc accaccacca ccac 414

Claims (6)

1.一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体，其特征在于，所示纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种靶向PD-1与PD-L1的相互作用界面的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，连接有权利要求2所述的编码基因。
4.一种工程菌，其特征在于，携带有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、或权利要求4所述的工程菌任一在制备PD-1与PD-L1相互作用的抑制剂，和/或制备PD-1/PD-L1免疫治疗法药物中的应用。
6.一种PD-1/PD-L1免疫治疗法治疗药物，其特征在于，含有权利要求1所述的纳米抗体。
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