KR100981356B1

KR100981356B1 - 신호서열 및 변이된 신호서열로 디자인된 분비증강자에의한 원래 형태의 수용성 재조합 단백질 생산 방법

Info

Publication number: KR100981356B1
Application number: KR1020070009453A
Authority: KR
Inventors: 이상준; 김영옥; 남보혜
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2010-09-14
Also published as: EP1981979A4; EP1981979A1; US20090011995A1; AU2007210396A1; KR20070079025A; WO2007089093A8; CA2637881A1; WO2007089093A1; JP2009525042A; AU2007210396B2

Abstract

본 발명은 신호서열(directional signal)의 N-영역 및/또는 N-영역을 포함하는 신호 서열의 소수성 단편을 포함하는 변이된 신호 서열 및/또는 친수성 폴리펩티드로 구성된 분비증강자를 이용한 분비효율 향상방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 단백질의 불용성 침전을 방지하고, 세포질 밖 또는 페리플라즘으로의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 외래단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 강력한 분비증강자를 이용하여 막 침투성을 향상시켜, 유용 치료용 단백질의 이동(transduction)에 이용될 수 있다.

신호서열, 짧은 신호서열, 변이된 신호서열 영역, 소수성 평균값, 소수성 프로파일, 분비증강자, 수용성 단백질, 원래 형태의 재조합 단백질

Description

신호서열 및 변이된 신호서열로 디자인된 분비증강자에 의한 원래 형태의 수용성 재조합 단백질 생산 방법{Production of soluble native form of recombinant protein by signal sequence and secretional enhancer}

도 1은 본 발명의 발현벡터에 다양한 실시태양을 나타내는 개요도이다.

도 2는 클로닝된 mefp1 클론, pBluescriptIISK(+)-La-7×mefp1-Ra의 염기서열을 나타낸 도면이다:

La (left-adaptor) : 밑줄 친 BamHI/EcoRI/SmaI region;

Linker : linker DNA(TACAAA);

AlaLysProSerTyrProProThrTyrLys : a basic unit of Mefp1; 및

Ra (right adaptor) : 밑줄 친 Arg/HindIII/SalI/XhoI region.

도 3은 pET-22b(+)[ompASP_{( )}-7×mefp1*] (* : Ra-6×His) 클론의 유도체로부터 얻어진 재조합 Mefp1 융합단백질의 수용성 상층액 발현 결과를 나타낸 도면으로, 항-His tag 항혈청(antiserum)은 3' 말단에 His tag가 포함된 pET-22b(+)에 의해 생산되는 재조합 Mefp1을 검출하기 위해 사용되었다;

(A) SDS-PAGE;

(B) 웨스턴 블롯;

우측 상단 화살표 : 재조합 Mefp1;

우측 하단 화살표 : OmpA 신호서열(OmpASP)이 절단된 Mefp1(OmpA 신호 펩티다제에 의해 OmpASP₁ _-21이 잘려나간 matured form);

라인 1 : OmpASP₁ _-3-7×Mefp1*;

라인 2 : OmpASP₁ _-5-7×Mefp1*;

라인 3 : OmpASP₁ _-7-7×Mefp1*;

라인 4 : OmpASP₁ _-9-7×Mefp1*;

라인 5 : OmpASP₁ _-11-7×Mefp1*;

라인 6 : OmpASP₁ _-13-7×Mefp1*;

라인 7 : OmpASP₁ _-15-7×Mefp1*;

라인 8 : OmpASP₁ _-21-7×Mefp1*(OmpA 신호서열 일부가 부족한 상태에서 Mefp1 서열이 연결되어 OmpA 신호 펩티다제에 의해 OmpASP₁ _-21가 반은 절단되고 반은 절단되지 않은 것); 및

라인 9 : OmpASP_1-23-7×Mefp1* 이고, (OmpA 신호서열을 완전히 가지고 있어 OmpA 신호 펩티다제에 의해 OmpASP_1-21이 잘려나간 것).

도 4는 클론 pET-22b(+) (ompASP_8-Xa-7×mefp1*) (* : Ra-6×His) 으로부터 얻어진 수용성 재조합 Mefp1 단백질 및 원래 형태의 아미노 말단을 가진 7×Mefp1*의 발현 결과를 나타낸 도면이다:

(A) SDS-PAGE;

(B) 웨스턴 블롯;

우측 상단 화살표 : 재조합 Mefp1 (OmpASP_1-8-Xa-7×Mefp1*);

우측 하단 화살표 : 원래 형태의 Mefp1 (7×Mefp1*);

라인 1 : 3시간 발현유도하지 않은 전체 세포(whole cell) 시료;

라인 2 : 3시간 발현 유도된 전체 세포(whole cell) 시료;

라인 3 : 3시간 발현 유도된 수용성 상층액(soluble supernatant fraction) 시료; 및

라인 4 : 3시간 발현 유도된 수용성 상층액 시료를 factor Xa 절단효소로 처리하여 얻어진 원래 형태의 N-말단을 가진 Mefp1 시료.

도 5는 재조합 단백질 Mefp1에 대한 유리판 코팅을 나타낸 도면이다:

+ : tyrosinase 처리한 시료; 및

- : tyrosinase 처리하지 않은 시료.

도 6은 pET22b(+)[ompASP_1-10-( )-Xa-ofhepcidinI**] (** : Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ-6×His) 클론으로부터 재조합 넙치(olive flounder, 학명: Paralichthys olivaceus) HepcidinⅠ(ofHepcidinI) 발현을 위한 OmpASP-( )-Xa의 분비증강자 결과이다. pI 및 소수성 상수값은 표 4에서 알 수 있듯이 OmpASP₁ _-10-( )-Xa의 괄호 안에 삽입하는 아미노산과 연관되어 있다:

(A) SDS-PAGE;

(B) 웨스턴 블롯;

화살표 : 재조합 ofHepcidinⅠ;

M : 마커;

라인 1 : 대조구;

라인 2 : 6×Arg;

라인 3 : 6×Lys;

라인 4 : 6×Glu;

라인 5 : 6×Asp;

라인 6 : 6×Try; 및

라인 7 : 6×Trp.

도 7은 직접신호로서 OmpASP 단편의 길이가 ofHepcidinⅠ수용성 발현에 미치는 효과를 나타낸 도면이다. 수용성 상층 분획은 IPTG에서 3시간 동안 유도되었다. 웨스턴 블롯은 도 3과 같은 방법으로 수행하였다:

(A) SDS-PAGE;

(B) 웨스턴 블롯;

화살표 : 재조합 ofHepcidinⅠ;

M : 마커;

라인 1: pET22b(+)[ompASP_(1-6)-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**];

라인 2 : pET22b(+)[ompASP_(1-8)-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**];

라인 3 : pET22b(+)[ompASP_(1-10)-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**];

라인 4 : pET22b(+)[ompASP_(1-12)-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**]; 및

라인 5 : pET22b(+)[ompASP_(1-14)-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**].

도 8은 신호서열 영역의 높은 pI 및 친수성 아미노산이 ofHepcidinⅠ 발현에 미치는 효과를 나타낸 도면이다. 수용성 상층 분획은 IPTG에서 3시간 동안 유도되었다. 웨스턴 블롯은 도 3과 같은 방법으로 수행하였다:

(A) SDS-PAGE;

(B) 웨스턴 블롯;

화살표 : 재조합 ofHepcidinⅠ;

M : 마커;

라인 1 : 대조군; pET22b(+)[ompASP_1-10-Xa-ofhepcidinI**];

라인 2 : pET22b(+)[ompASP_1-10-(LysArg)-Xa-ofhepcidinI**];

라인 3 : pET22b(+)[ompASP_1-10-(4×Arg)-Xa-ofhepcidinI**];

라인 4 : pET22b(+)[ompASP_1-10-(6×Arg)-Xa-ofhepcidinI**];

라인 5 : pET22b(+)[ompASP_1-10-(8×Arg)-Xa-ofhepcidinI**]; 및

라인 6 : pET22b(+)[ompASP_1-10-(10×Arg)-Xa-ofhepcidinI**].

도 9는 컴퓨터 프로그램으로 ofHepcidinⅠ 및 이의 변이체에서 신호서열 영역의 C-말단의 친수성 아미노산을 삽입한 후 소수성 프로파일을 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale)값으로 분석한 결과이다:

(A) ofHepcidinⅠ(26 aa, Av -0.21);

(B) OmpASP_1-10-Xa-ofHepcidinI(40 aa, Av -0.19);

(C) OmpASP_1-10-LysArg-Xa-ofHepcidinI(42 aa, Av -0.04);

(D) OmpASP_1-10-6×Arg-Xa-ofHepcidinI(46 aa, Av 0.22);

aa : 아미노산 수; 및

Av : 소수성 평균값.

본 발명은 신호서열(directional signal), 분비증강자(secretional enhancer) 및 절단효소 인식부위에 의한 원래 형태의 수용성 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것이다.

현대의 생명공학에 있어서 핵심은 재조합 단백질 생산이며 그중에서도 중요 한 것은 수용성인 원래 형태의 단백질을 손쉽게 생산하는 것이다. 수용성 단백질은 활성 단백질의 생산 및 회수, 기능 연구를 위한 결정화, 산업화 등에 매우 중요하다. 현재까지 많은 재조합 단백질 생산 연구가 대장균을 이용해서 많이 진행되어 왔는데, 대장균은 조작이 쉽고, 짧은 성장시간, 안전한 발현, 저비용과 규모를 쉽게 바꿀 수 있는 장점이 있기 때문이다.

그러나 대장균(E. coli)에서 생산된 외래 기원의 재조합 단백질은 적절한 전사 후 샤페론(post-translational chaperons)이나 전사 후 과정(post- translational processing)이 없기 때문에 생산된 재조합 단백질의 적절한 접힘(fold)이 일어나지 않거나 또는 불가용성 단백질 응집체(inclusion body)가 형성된다(Baneyx, Curr. Opin Biotechnol. 10:411-421, 1999).

이러한 문제를 해결하기 위해, 신호 서열(signal sequence)이 단백질을 페리플라즘(periplasm) 밖으로 분비하도록 한다(Inouye and Halegoua, CRC Crit. Rev. Biochem. 7:339-371, 1980)는 것이 알려졌기 때문에, 신호 서열(signal sequence)의 구조 및 기능에 대한 연구가 아미노 말단 염기성 지역(amino terminal basic region)(Lehnhardt et al., J. Biol. Chem. 263:10300-10303, 1988), 소수성 지역(hydrophobic region)(Goldstein et al., J. Bacteriol. 172:1225-1231, 1990), 절단 지역(cleavage region)(Duffaud and Inouye, J. Biol. Chem. 263:10224-10228, 1988)을 대상으로 하여 진행되었다. 동시에 수용성 단백질을 생산하기 위 해 여러 가지 신호 서열(signal sequence)을 이용한 벡터들이 개발되었다(ompA: Ghrayeb et al., EMBO J. 3:2437-2442, 1984; Duffaud et al., Methods Enzymol. 153: 492-507, 1987; Delrue et al., Nucleic Acids Res. 16:8726, 1988; phoA : Dodt et al., FEBS Lett. 202:373-377, 1986; Kohl et al., Nucleic Acids Res. 18:1069, 1990; eltA : Morika-Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 266:1728-1732, 1991; bla : Oka et al., Agric Biol. Chem. 51:1099-1104, 1987; eltIIb-B : Jobling et al., Plasmid 38:158-173, 1997).

그러나 지금까지 신호 서열(signal sequence)을 이용한 벡터들은 수용성 단백질을 발현시키는데 한계가 있고, 또한 발현된 단백질조차도 재조합 융합(fusion) 단백질로 생산되기 때문에 단백질 절단효소의 절단부위를 가져 원래 형태의 아미노 말단을 가진 재조합 단백질을 얻기는 매우 어려운 실정이다.

신호 서열(signal sequence)을 이용한 재조합 단백질 생산이 어려운 원인으로는 1) 수용성 단백질의 생산에 대한 예측이 불가능하여 많은 연구자들이 재조합 단백질의 수용성은 전체 단백질의 아미노산 서열의 특성에 달렸다고 추측하고 있으며; 2) 신호 서열(signal sequence)로 작용하는 다른 서열(sequence)이 너무 많고, 신호 서열(signal peptides)의 상호작용을 직접적으로 조사할 수 있는 분석방법이 개발되지 못하였기 때문이다(Triplett et al., J. Biol. Chem. 276:19648-19655, 2001).

이에, 본 발명자들은 단백질의 분비효율을 향상시킬 수 있는 분비증강자가 어떤 요소인지 확인하기 위하여 예의 노력한 결과, 단백질의 신호서열의 염기성 N- 영역 자체로 또는 염기성 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 영역을 포함하는 신호서열에 연결되는 친수성 아미노산으로 구성된 펩티드가 분비증강자가 될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 외래 기원의 유전자로부터 효과적으로 수용성 재조합 융합 단백질을 생산하고 원래 형태의 아미노 말단을 가진 단백질로 회수하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신호 서열(signal sequence)의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 신호서열의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 영역을 포함하는 신호서열의 소수성 단편 및 상기 신호서열의 N-영역의 단편 및 신호 서열의 소수성 단편에 연결된 친수성 증가서열로 구성된 분비증강자를 포함하는 변이된 신호서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 상기 발현벡터에 외래 유전자가 삽입되어 상기 변이된 신호서열 및 외래 유전자의 융합단백질의 생산을 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 발명은 상기 발현 벡터 또는 재조합 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 재조합 단백질의 분비 효율 향상 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생산 방법에 의하여 생산된 재조합 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래 단백질 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 단백질의 약학적 용도를 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

"외래 단백질(heterologous protein) 또는 목적 외래단백질(target heterologous protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

"융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 외래단백질의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

"신호 서열(signal sequence)"은 외래 단백질이 바이러스, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포에서 발현되는 외래 단백질을 페리플라즘 또는 세포외부로 분비하기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 효율적인 서열을 의미한다. 신호 서열은 N-말단에 양전하가 충전된 N-영역(positively charged N-region), 중앙의 특이적인 소수성 영역(central characteristic hydrophobic region) 및 C-말단 절단 영역(C-region with a cleavage site)으로 구성되어 있다. 본 발명에서 사용한 신호 서열 단편은 N-말단에 양전하가 충전된 영역(positively charged region)과 중앙의 특이적인 소수성 영역(central characteristic hydrophobic region) 및 C-말단 절단 영역의 전체 또는 일부를 의미한다.

"폴리펩티드(polypeptide)"는 두 개 이상의 아미노산이 펩티드 결합으로 열결된 중합체 분자를 의미하며, 단백질(protein)도 폴리펩티드의 일종이다.

"폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)"은 특정 폴리펩티드의 기능을 유지하면서 최소 길이 또는 그 이상의 크기를 갖는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 본 문서에서 특별히 언급하지 않는 한, 전체 길이의 폴리펩티드는 이에 포함되지 않는다. 예를 들어, 본 문서에서 언급하고 있는 '신호 서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편'은 신호 서열 중 신호서열로 기능하는 단축된 신호 서열을 의미하며, 전체 신호서열은 이에 포함되지 않는다.

"폴리뉴클레오티드"는 두 개 이상의 핵산분자가 이인산에스테르 결합으로 연결된 중합체 분자를 의미하며, DNA 및 RNA가 이에 포함된다.

"분비증강자(secretional enhancer)"는 신호 서열(signal sequence)의 친수성을 증가시키는 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드를 의미한다.

"N-영역(N-region)"은 통상의 신호서열에서 보존적으로 발견되는 부분으로서, N-말단에 위치한 염기성이 강한 서열을 의미하며 신호서열에 따라, 3 내지 10 개의 아미노산을 구성된다.

"중앙 특이적 소수성 영역(central specific hydrophobic region)"은 통상적인 신호서열의 구조 중 N-영역에 바로 뒤따르는 지역으로서 다수의 소수성 아미노산에 의하여 소수성을 강하게 띄는 부분을 의미한다.

"변이된 신호 서열(changed signal sequence)"은 신호 서열의 전체가 아닌, 상기 신호 서열의 N-영역 자체를 의미하거나 또는 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 영역으로 구성된 신호서열의 소수성 단편(truncated signal peptide)에 상기 분비증강자가 연결된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드에 단백질 절단효소 인식 부위가 부가적으로 연결된 폴리펩티드를 의미한다.

"신호서열 단편 또는 신호서열 파편(signal sequence fragment) 또는 절단된 신호 서열(truncated signal sequence)"은 모두 신호서열의 일부를 의미하며, 본 문서에서 특별히 언급하지 않는 한, 신호서열의 C-말단 부위가 절단되어 제거된 단편을 의미한다.

"제한효소 부위"는 특별한 언급이 없는 한, DNA 제한효소가 특정자리를 인식하여 절단하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질 절단효소 인식 부위"는 단백질 절단효소가 특정 자리를 인식하여 절단하는 아미노산 서열을 의미한다.

"양친매성 도메인(amphipathic domain)"은 친수성 및 소수성 지역이 혼재하고 있는 도메인으로서, 막전위 도메인과 유사한 구조를 갖는 단백질 내부의 영역을 의미한다. 따라서, 본 문서에서는 "막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)"과 동일한 의미로 사용된다.

"막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석시, 막단백질의 막전위 도메인과 유사한 구조를 가질 것으로 예측되는 부위를 의미한다(Brasseur et al., Biochim. Biophys. Acta 1029(2): 267-273, 1990). 통상적으로 상기 막전위-유사 도메인은 막전위 도메인을 예측하는 다양한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 용이하게 예측이 가능하다. 상기 컴퓨터 소프트웨어의 예로는 TMpred(//), HMMTOP(//), TBBpred(//), DAS-TMfilter(://www.enzim.hu/DAS/DAS.html) 등이 존재한다. 상기 "막전위-유사 도메인"은 실제 막전위 특성을 가진 것으로 규명된 "막전위 도메인(transmembrane domain)"도 포함한다.

"발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나이상의 복제개시점, 하나이상의 선택마커, 증폭제(enhancer), 폴리아데닐화 신호, 기타 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

"작동 가능하게 연결된"은 단편은 배열되어서 그들은 일제히 그들의 의도한 목적, 예를 들면, 전사는 프로모터에서 개시하고 암호화 단편을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하는 것을 나타낸다.

"프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하고 mRNA 합성이 개시되는 유전자의 부 분이다.

"숙주세포(host cell)"는 재조합 유전자의 재생산 또는 외래단백질의 생산이 가능하도록 바이러스 또는 플라스미드 벡터와 같은 다른 유전자 운반체에 의하여 감염이 될 수 있는 세포를 의미한다.

"뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier)" 특정한 물질들이 혈관으로부터 들어가는 것을 막는 기능적인 장벽을 의미한다. 뇌혈관장벽을 이루는 주된 구조는 모세혈관 내피세포(capillary endothelial cell)에 있는 폐쇄연접(tight junction, 폐쇄띠, zonula occludens)으로 추측된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 반복된 접착성 단백질, Mefp1(Waite et al., Biochemistry 24:5010-5014, 1985)을 발현하는 과정에서, His 태그(tag)를 가진 pET 벡터를 기본으로 1) 신호서열을 이용한 수용성 외래 단백질(heterologous protein)을 생산하기 위해, OmpASP의 전체 및 일부 신호 코딩 서열(signal sequence)과 외래 유전자(heterologous gene)를 PCR 반응으로 연결하여 벡터를 구성한 다음, fusion 단백질을 수용성으로 발현시켰고, 또한 절단된 OmpASP(truncated OmpASP or OmpASP_tr)와 절단효소 factor Xa 인식부위를 연결한 OmpASP_tr-factor Xa cleavage site 변이된 신호서열 영역에 외래 유전자(heterologous gene)를 PCR 반응으로 연결하여 벡터를 구성한 다음, 융합 단백질을 수용성으로 발현시킨 후, 절단효소를 처리하여 원래 형태의 아미노말단을 가진 단백질을 생산하였다. 이를 통해 신호서열의 전체 및 일부는 일정한 pI 값을 갖고, 이 pI 값이 수용성 단백질 발현에 중요함을 확인하였다.

동시에 수행한 발현 실험에서 넙치 헵시딘 I은 짧은 신호서열의 OmpASP로 수용성의 fusion 단백질로 발현되지 않았다. 2) 따라서 신호서열 만으로 외래 단백질(heterologous protein)이 수용성으로 생산되지 않는 경우에는, 분비증강자(secretional enhancer)인 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys의 코딩 서열을 신호서열 영역의 C-말단에 삽입하여 절단효소 인식부위와 외래 유전자(heterologous gene)를 PCR 반응으로 연결하여 벡터를 구성한 다음, 수용성 단백질을 생산하였다. 이 때 외래유전자 앞부분 전체를 변이된 신호서열 영역이라 칭하였다.

상기 변이된 신호서열 영역을 OmpASP-SmaI-Xa(접착성 단백질의 경우) 또는 OmpASP-( )-Xa(넙치 헵시딘 I의 경우)의 형태로 디자인하고 SmaI 또는 ( ) 부분에 pI 및 소수성/친수성에 관련되는 아미노산을 여섯 개 선택하여 같은 아미노산을 여섯 개씩 삽입하여 클론을 만들고 발현을 조사한 결과 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys에 해당하는 염기서열이 삽입된 클론에서 수용성 발현의 증가현상이 관찰되었는데, 수용성 접착성 단백질의 경우에는 수용성 발현이 약간 증가한 반면 수용성 넙치 헵시딘 I 재조합 단백질의 경우에는 수용성 발현이 매우 증가하여, 분비증강자로서의 기능을 하였다. 이는 결국 염기성 아미노산인 Arg 및 Lys이 C-말단에 삽입되어 신호서열 영역의 친수성 값과 pI 값을 높임으로써 단백질 의 수용성 발현이 증가됨을 의미한다.

실제로, 신호서열 영역에서 N-말단의 신호서열 길이를 축소하고, C-말단에 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys 서열을 추가할수록 친수성 값이 높아지고, 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 변이된 신호서열 영역의 높은 pI 값과 친수성 값이 수용성 발현의 열쇠(key)가 될 수 있고, 또한 소수성 프로파일도 보조열쇠(secondary key)가 될 수 있다. 즉, 신호서열의 길이를 일정 크기 이상 사용하여 신호서열 영역을 디자인하면 신호서열 부분이 통상의 막전위 도메인 또는 막전위-유사 도메인 보다 친수성 값이 큰 막전위-유사 도메인의 구조를 갖게 되는데 이런 구조를 갖는 단백질의 수용성 발현이 가능할 것으로 판단하였다.

위의 결과를 토대로 수용성 발현을 이룬 클론들의 신호서열 영역의 소수성 프로파일을 조사한 결과, 수용성 발현을 이룬 클론들의 신호서열 영역에는 넙치 헵시딘 I이 분자 내에 가지고 있는 양친매성 도메인(amphipathic domain) 또는 막전위-유사 도메인보다, 크기가 유사하거나 또는 더 큰 친수성 프로파일의 막전위-유사 도메인을 가지고 있음이 판명되었다. 따라서 이 결과에서 넙치 헵시딘 I과 같이 분자 내에 양친매성 도메인을 가지고 있는 외래 단백질을 수용성으로 발현시키기 위해서는 신호서열 영역 내에 더 큰 친수성의 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)이 필요하다는 것을 알 수 있다.

이를 통해 변이된 신호서열 영역의 소수성 평균값(hydrophobicity average value)이 수용성 단백질 발현에 중요함을 확인하였다. 또한, 컴퓨터 프로그램 DNASIS^TM(Hitachi, Japan, 1997)을 통하여 변이된 신호서열의 소수성 평균값(Hopp & Woods scale)을 미리 계산하고 소수성 프로파일을 최적화할 수 있음으로 신호 서열 영역에 목적 외래 단백질(target heterologous protein)이 가지고 있는 막전위-유사 도메인보다 큰 친수성을 갖는 막전위-유사 도메인을 갖게 디자인함으로서 수용성 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 목적이 되는 외래단백질의 내부에 막전위-유사

본 발명을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 외래 단백질을 코딩하는 염기서열 7×mefp1의 5' 말단에 대장균에서 분비를 유도하는 신호 서열(signal sequence) OmpA의 일부인 OmpASP_1-3에서 전부인 OmpASP_1-23의 코딩 서열을 융합하여, 도 2의 주형을 이용하여 PCR 방법으로 pET-22b(+)[ompASP_{( )}-7×mefp1*] 클론을 제작하였다(표 1). 제작된 클론 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였고 IPTG로 단백질 발현을 3시간 동안 유도하였다. 그 결과, 상기 제작된 클론들은 대장균 내에서 모두 수용성 Mefp1 재조합 단백질을 발현하였다(표 1 및 도 3 참조).

신호 서열(signal sequence)은 Met으로 시작하여 양전하 N-구역(positively charged N-region), 중앙 특이 소수성 구역(central characteristic hydrophobic region), 절단 자리를 가진 C-말단 구역(C-region ending with cleavage site)을 가지고 있다. 신호 서열(signal sequence)은 전구 단백질의 접힘(folding)을 조절하고, 단백질의 분비에 있어서 필수적인 역할을 한다(Izard et al., Biochemistry 34:9904-9912, 1995; Wickner et al., Annu. Rev. Biochem. 60:101-124, 1991).

지금까지는 재조합 융합 단백질의 발현이 수용성 단백질로 발현되는데 영향을 미치는 요인이 전체 단백질의 pI값, 소수성, 분자량 및 안전성 등으로 알려져 있었다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 변이 신호 서열로서 신호 서열(signal sequence) OmpASP의 일부인 OmpASP_1-3에서 전부인 OmpASP_1-23의 pI 값을 조사한 결과 모두 길이에 관계없이 균일한 10.55를 가졌음을 확인하였다(표 2). 모든 클론들은 신호서열의 길이에 상관없이 IPTG로 유도하여 3시간 이후 전체 및 수용성의 Mefp1 단백질을 생산하였다(도 3 참조). 따라서 상기 결과로부터 수용성 Mefp1의 발현은 신호서열 OmpASP의 일부 및 전체에서 소수성 값이 아니라 높은 pI 값이 직접신호(directional signal)로 작용하였음을 알 수 있었다. 이는 전체 신호서열 중 양전하를 띄는 N-영역만으로도 미완성 폴리펩티드 사슬(nascent polypeptide chains)을 수용성 형태로 분비시킬 수 있다는 것을 의미하며, 이는 본 발명자가 최초로 규명한 것으로서 매우 놀라운 발견이다. 한편, 신호 서열 중 N-영역에 양전하를 띄는 염기성 아미노산이 아닌 글루탐산 또는 아스파르트산이 위치하는 경우도 있기 때문에, pI 값이 4 이하인 경우에도 본 발명의 N-영역을 포함하는 신호 서열의 폴리펩티드 단편으로 사용이 가능하다. 이 때, 변이된 신호서열의 pI 값은 8 이상인 것이 바람직하고, 9 이상인 것이 더욱 바람직하며, 10 이상인 것이 가장 바람직하 다.

본 발명에서는 대장균 기원의 OmpA 신호 서열(signal sequence)을 사용하였으나, 상기 신호 서열(signal sequence)과 유사한 구조를 가지는 CT-B(cholera toxin subunit B) 신호 서열, LTⅡb-B(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit) 신호 서열, BAP(bacterial alkaline phosphatase) 신호 서열(Izard and Kendall, Mol. Microbiol. 13:765-773, 1994), Yeast carboxypeptidase Y 신호 서열(Blachly-Dyson and Stevens, J. Cell. Biol. 104:1183-1191, 1987), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 치사독소 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호 서열(Stark et al., EMBO J. 5(8): 1995-2002, 1986), bovine growth hormone의 신호 서열(Lewin, B. (Ed), GENES V, p290. Oxford University Press, 1994), influenza neuraminidase의 신호-앵커(signal-anchor)(Lewin, B. (Ed), GENES V, p297. Oxford University Press, 1994), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α, Prehn et al., Eur. J. Biochem. 188(2): 439-445, 1990)의 신호 서열, Twin-arginine translocation(Tat) 신호 서열(Robisnon, Biol. Chem. 381(2): 89-93, 2000) 등을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호 서열(signal sequence)과 유사한 구조를 가지는 그 외의 어떠한 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호 서열(signal sequence)과 선도 서열(leader sequence)도 사용이 가능하다. 상기 서열들은 모두 높은 소수성 값을 가지고 있는 경우이다.

재조합 융합 단백질을 생산할 때, 신호서열의 C-말단에 단백질 절단효소 인 식부위를 가진 변이된 신호 서열 영역(changed signal sequence region)과 외래 단백질 사이를 연결하고, 재조합 단백질을 발현하여 절단효소 처리를 하면 원래 형태(native form)의 아미노 말단을 가진 외래 단백질을 회수하기에 용이하다. 본 발명자들은 위의 실험 결과를 토대로 OmpASP_1-8에 C-말단을 절단 할 수 있는 factor Xa 절단효소 인식부위를 붙여 mefp1을 주형 (도 2)으로 PCR 방법으로 pET-22b(+)(ompASP_1-8-Xa-7×mefp1*) 클론을 제작하여 대장균에서 발현을 조사하였다(표 1). 그 결과 상기 클론은 수용성 단백질을 생산하였고, 절단효소 factor Xa로 처리하여 직접 신호(directional signal)로 사용한 변이된 신호 서열 영역을 제거하고 원래 형태(native form)의 아미노 말단을 가지는 Mefp1 단백질을 생산할 수 있음을 성공적으로 확인하였다(도 4 참조).

본 발명의 재조합 단백질에서 사용하는 factor Xa는 서열(Ile-Glu-Gly-Arg)을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 절단효소는 factor Xa, 엔테로키나제(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), Genenase Ⅰ(His-Tyr), Furin(Arg-X-X-Arg)로 이루어진 군에서 선택된 절단효소를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 재조합 단백질을 발현하여 단백질을 수거하여 단백질 기능에 이상이 없는지 확인하였다. 재조합으로 생성된 Mefp1의 접착성을 조사한 결과, 대조구로 사용한 BSA에 비해 현저한 접착성을 갖고 있었다(도 5 참조). 이를 통해 본 발명의 재조합 단백질 생산 방법은 외래 단백질의 기능에 영향을 주지 않고 외래 단백질을 효과적으로 수용성 단백질로 생산할 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명자들은 신호서열 OmpASP의 단편(파편) 이외의 영역에서 접착성 단백질의 수용성 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, 평활말단(blunt end)을 편리하게 클로닝 할 수 있는 SmaI 부위를 선택하여 OmpASP_1-8-SmaI-Xa로 형태의 신호서열 영역을 디자인하여 위와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 pET-22b(+)(ompASP_1-8-SmaI-Xa-7×mefp1*) 클론을 제작하였다(표 1 참조). 또한 SmaⅠ 자리에 높은 pI 값과 친수성 아미노산인 아르지닌(Arg) 또는 리신(Lys)을 대체하는 클론을 제작하였다. SmaⅠ 자리에 높은 pI 값과 친수성인 아미노산을 처리한 클론 역시 재조합 외래 단백질을 생산하였으며 분비가 일부 증강됨을 확인하였다.

동시에 수행한 발현 실험에서 넙치 헵시딘 I은 짧은 신호서열의 OmpASP로 수용성의 fusion 단백질로 발현되지 않았다(표 3 참조).

따라서 본 연구자들은 분비증강자를 스크린하기 위해 신호서열 영역을 OmpASP_1-10-( )-Xa로 디자인하여, pI 및 소수성/친수성에 영향을 주는 아미노산을 여섯 개씩 6×Arg, 6×Lys, 6×Glu, 6×Asp, 6×Tyr, 6×Phe, 6×Trp을 ( )안에 삽입하여(표 4 참조), 넙치 헵시딘 I 유전자(Kim et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:1411-1414, 2005)를 주형으로 PCR 방법으로 pET-22b(+)[ompASP_1-10-( )-Xa-ofhepcidinI**]의 일반적인 클론을 구성하였다(표 3 참조). 상기 클론들에 대해서 대장균에서 발현시킨 결과, 높은 pI 값과 친수성 아미노산인 6×Arg 및 6×Lys의 서열을 삽입시킨 클론들은 수용성 넙치 헵시딘 I을 강하게 발현시켰으나, 다른 아미노산을 삽입시킨 클론들은 수용성 넙치 헵시딘 I을 매우 약하게 발현시켰 다(도 6 참조). 따라서 수용성 넙치 헵시딘 I의 발현은 높은 pI 값과 친수성 아미노산인 Arg 및 Lys에 의한 친수성 값의 증가와 관련이 있어, 신호서열 영역의 C-말단에 삽입된 아미노산 Arg 및 Lys이 분비증강자임이 완전히 밝혀졌다(표 4 참조).

위의 실험 결과를 토대로, 본 발명자들은 신호서열 영역에서 N-말단의 신호서열 OmpASP의 단편(파편)과 C-말단 -( )-Xa 부분의 변이가 신호서열 영역 내에서 친수성 에 어떤 영향을 미치는 가를 조사하였다. 먼저 N-말단 부분의 신호서열 OmpASP의 여러 길이를 일정한 C-말단 -6×Arg-Xa에 연결하여 PCR 방법으로 pET-22b(+)[ompASP_{( )}-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**]의 일반적인 클론을 구성하였다(표 3 참조). 상기 클론들에 대해서 대장균에서 발현시킨 결과 신호서열 OmpASP 길이가 짧을수록 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale) 값에 의한 친수성이 증가되고(실시예 6), 발현이 증가되었다(도 7 참조). 그러나 호프 앤 우드 스케일에 의한 프로파일은 조사한 신호서열 OmpASP의 길이가 가장 짧은, OmpASP_1-6로 구성된 OmpASP_1-6-6×Arg-Xa은 N-말단에 소수성 곡선이 보이지 않고 친수성 곡선만을 나타내었다. 그 밖의 경우 신호서열 크기가 OmpASP_1-8이상은 -6×Arg-Xa에 연결되어 N-말단에 소수성 곡선을, C-말단에는 친수성 곡선을 보여 일반적인 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)의 형태를 보였다. 상기 결과들을 종합할 때 신호서열의 염기성 N-영역 및 중앙 특이 소수성 지역으로 구성된 상기 신호서열의 염기성 단편 및 소수성 단편의 C-말단에 친수성이 강한 아미노산으로 구성된 펩티드를 부가할 경우, 단백질 내 존재하는 막전위 도메인과 유사한 구조를 갖게 되며, 그 러한 변이된 신호서열의 C-말단에 증가된 친수성이 미완성 폴리펩티드 사슬(nascent polypeptide chains)의 내부에 존재하는 막전위 도메인 또는 막전위-유사 도메인의 친수성 부위보다 높을 경우, 상기 미완성 폴리펩티드 사슬이 수용성 형태로 분비가 된다는 점이다. 이와 같은 사실은 본 발명자에 의하여 최초로 규명된 것으로서, 매우 놀라운 것이다. 이런 특징을 이용할 경우, 막 단백질과 같이 통상적으로는 분비가 불가능한 단백질을 수용성 형태로 생산하는 것이 가능해지며, 생물학적 제제로 사용되는 각종 단백질의 막투과성을 향상시킴으로써, 의약전달(drug delivery)에 효과적으로 사용할 수 있다. 특히, 의약 물질 전달과 관련하여, 종래의 단백질 제제들이 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier)을 통과하지 못한다는 단점을 해소하여, 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있는데 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법을 통해 각종 뇌질환에 적용할 수 있는 치료용도의 단백질(예를 들어 항-베타-아밀로이드 항체)을 뇌실에 직접 주입할 필요 없이, 혈관주사를 통해 투여하는 것이 가능해지는 것이다.

이후 본 발명자들은 신호서열의 N-말단은 OmpASP_1-10으로 일정하게 하고, C-말단 부분 -( )-Xa에 친수성 아미노산을 2개에서 10개까지 추가하여 PCR 방법으로 pET-22b(+)[ompASP_1-10-( )-Xa-ofhepcidinI**]의 일반적인 클론 클론을 구성하였다(표 3 참조). 상기 클론들에 대해서 대장균에서 발현시킨 결과 신호서열 영역(변이된 신호서열)에 친수성 아미노산이 추가될수록 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale) 값에 의한 친수성이 커지고(실시예 6), 발현이 증가되었다(도 8 참 조). 이 경우, 호프 앤 우드 스케일에 의한 프로파일은 수용성 단백질을 발현시킨 모든 신호서열 영역의 소수성 프로파일은 N-말단에 소수성 곡선을, C-말단에는 친수성 곡선을 보여 일반적인 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)의 형태를 보였다

상기 두 경우 모두, 신호서열 영역을 변이시켜 친수성 값을 높여 수용성 발현이 이루어져 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale) 값이 index로 될 수 있다고 생각된다. 따라서 신호서열 영역에서 N-말단에 위치한 신호서열 OmpASP 단편(파편)은 pI 값이 직접 신호(directional signal)에 중요하게 작용하고, C-말단에 위치한 -( )-Xa에서 친수성 값은 분비증강자로서의 역할과 상관관계가 높았다. N-말단을 OmpASP_1-10으로 일정하게 하고, C-말단 부분을 변조시킨 경우, 수용성 발현이 이루어진 모든 신호서열 영역은 N-말단에 소수성 곡선을, C-말단에는 친수성 곡선을 보여 막전위 도메인(transmembrane domain)과 유사한 형태의 쌍곡선(hyperbolic curve)을 가지고 있어, 호프 앤 우드 스케일 값에 따른 소수성 프로파일은 보조 인덱스(index)로서 활용이 편리하다.

이후 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램으로 넙치 헵시딘 I 및 신호서열 영역과 넙치 헵시딘 I 부분(** 부분은 제외)의 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale)에 의한 소수성 프로파일을 조사하였다(도 9 참조). 이 때 대조구인 넙치 헵시딘 I은 분자 내에 하나의 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있었고(도 9의 A), 가상적인 신호서열 영역-넙치 헵시딘 I 융합단백질은 두 개의 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)을 가진 것으로 나타났는데, 하나는 신호 서열 영역에 다른 하나는 넙치 헵시딘 I 부분에 가지고 있었다(도 9의 B, C, D). 이때 수용성으로 강하게 발현된 재조합 넙치 헵시딘 I은 신호서열 영역에 헵시딘 I이 가지고 있는 양친매성 도메인보다 친수성 정도가 큰 막전위-유사 도메인을 가지고 있었다(도 9의 D). 한 가지 예로 도 9의 D의 융합단백질에 해당하는 클론 pET-22b(+)[ompASP_1-10-6×Arg-Xa-ofhepcidinI**]은 수용성으로 발현되었다(도 8의 lane 4 참조). 이 결과로부터 분자 내에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가지는 분자들의 수용성 발현에는 당해 막전위-유사 도메인이 발현에 장애가 됨으로 상기 막전위-유사 도메인보다 친수성이 큰 막전위성-유사 도메인을 가진 신호 서열 영역이 필요함을 알 수 있다. 따라서 목적 단백질의 수용성 발현을 위해서는 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값뿐만 아니라 소수성 프로파일도 수용성 발현을 예측할 수 있는 기준이 될 수 있음을 입증하였다.

상기 결과로 미루어보아 본 발명은 원래 형태의 N-말단을 가진 수용성 외래 단백질 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시태양을 상세히 설명한다.

본 발명은 (ⅰ) 프로모터 및 (ⅱ) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호 서열(signal sequence)의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다(도 1 (a) 참조).

이때, 상기 프로모터는 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 바이러스 기원의 프로모터는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 효모 기원의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라 제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 디히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동물 세포 기원의 프로모터는 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 프로모터로는 본 발명의 외래유전자를 숙주세포에서 정상적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 모두 사용가능하다.

상기 신호 서열(signal sequence)은 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호 서열(signal sequence) 및 선도 서열(leader sequence)인 것이 바람직하며, OmpA 신호 서열, CT-B(cholera toxin subunit B) 신호 서열, LTⅡb-B(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit) 신호 서열, BAP(bacterial alkaline phosphatase) 신호 서열(Izard and Kendall, Mol. Microbiol. 13:765-773, 1994), 효모 카복시펩티다제(Yeast carboxypeptidase) Y 신호 서열(Blachly-Dyson and Stevens, J. Cell. Biol. 104:1183-1191, 1987), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 치사독소 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호 서열(Stark et al., EMBO J. 5(8): 1995-2002, 1986), 소 성장호르몬(bovine growth hormone)의 신호 서열(Lewin, B. (Ed), GENES V, p290. Oxford University Press, 1994), 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase)의 신호-앵 커(signal-anchor)(Lewin, B. (Ed), GENES V, p297. Oxford University Press, 1994), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α, Prehn et al., Eur. J. Biochem. 188(2): 439-445, 1990)의 신호 서열, Twin-arginine translocation(Tat) 신호 서열(Robisnon, Biol. Chem. 381(2): 89-93. 2000) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 염기성이 높은 N-영역을 갖는 신호서열이라면 모두 사용될 수 있다.

상기 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편은 신호 서열의 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개의 아미노산 길이로 구성되는 펩티드인 것이 바람직하며, 당해 신호 서열의 N-영역의 소수성 프로파일 및 pI 값 등을 고려하여, 적절한 길이로 조절할 수 있다. 더욱 바람직한 양태에서, 상기 신호 서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편의 pI 값은 8 이상인 것인 것이 바람직하며, 더욱 바라직하게는 9 이상이며, 가장 바람직하게는 10 이상이다. N-영역은 염기성 아미노산, 예를 들어 리신, 아르기닌과 같은 양전하를 띄는 아미노산 또는 아스파르트산, 글루탐산과 같은 음전하를 띄는 아미노산이 적어도 두 개 이상 존재하며, 이들의 pI 값은 양전하를 띄는 아미노산이 위치할 경우에는 8 이상이, 음전하를 띄는 아미노산이 위치할 경우 4 이하의 값을 갖게 된다. 따라서 공지의 신호서열 중 N-영역의 pI 값이 8 이상인 신호서열 모두를 본 발명의 발현벡터에 사용되는 신호 서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편으로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 신호서열들에 있어서 N-영역의 하나 이상의 아미노산을 다른 염기성 아 미노산, 즉, 아르지닌, 리신 같은 아미노산으로 치환하는 것이 가능하다. 상기와 같이 아르지닌, 리신 등 pI 값이 높은 아미노산이 N-영역에 하나 또는 두 개 이상 존재할 경우, 분비효율의 증가가 예상된다. 상기와 같은 아미노산의 치환방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

더 나아가, 본 발명의 벡터의 상기 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 분비증강자(secretional enhancer)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다(도 1 (c) 참조). 분비증강자(secretional enhancer)는 높은 pI 값과 친수성 아미노산으로 구성되어 있으며, 이를 통해 신호 서열(signal sequence)의 친수성을 증가시켜 외래 단백질의 페리플라즘(periplasm) 밖으로의 이동을 촉진해 줄 수 있다. 상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드이며, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 더 더욱 바람직하게는 6 내지 15개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩티드로 구성된다. 상기 분비증강자의 pI 값은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 10 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터의 상기 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결된다(도 1 (d) 참조). 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 한편, 상기 단백질 절단효소 인식 부위는 인자 Xa의 경우, Ile-Glu-Gly-Arg인 것이 바람직하다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 발현 벡터에서 상기 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입되는데(도 1 (e) 참조), 이러한 삽입의 경우 상기 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입된 제한효소 부위, 특히 SmaI과 같은 평활말단을 생성하는 제한효소에 의해 절단되는 제한효소 부위를 통해 이뤄지는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 및 퓨린(Furin) 인식부위로 이루어진 군으로부터 단독 또는 융합의 형태로 사용된다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터는 추가적으로 외래단백질을 코딩하는 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위가 포함된다(도 1 (b) 및 (f) 참조). 상 기 제한효소 부위는 상기 신호 서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뒤에 연결되고(도 1 (b)), 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터의 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드 뒤에 연결될 수 있다(도 1(f)). 만일, 벡터 내에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 존재할 경우에는 제한효소 부위는 부가되거나 부가되지 않을 수 있는데, 원래 형태의 단백질을 생산한다는 관점에서는 제한효소 부위를 통한 외래단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝은 바람직하지 않을 수 있다.

한편, 상술한 벡터 중 어느 하나 이상에, 외래단백질을 코딩하는 유전자가 추가적으로 삽입될 수 있다. 이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 재조합 융합 단백질로 발현할 수 있다. 또는, 상기 외래단백질은 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것이 바람직하며, 상기 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 없는 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Mefp1 중합체인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, (ⅰ) 프로모터, 및 (ⅱ) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호 서열(signal sequence)의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 영역으로 구성된 신호 서열의 소수성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (ⅲ) 상기 폴리뉴 클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다(도 1 (g) 참조).

상기 발현 벡터에 있어서, 상기 프로모터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 바이러스 기원의 프로모터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것이 바람직하며, 이때, 상기 효모 기원의 프로모터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타 제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 데히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것이 바람직하고, 상기 동물 세포 기원의 프로모터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것이 바람직하다.

상기 발현벡터에 있어서, 신호 서열(signal sequence)은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호 서열(signal sequence) 및 선도 서열(leader sequence)인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 OmpA 신호 서열, CT-B(cholera toxin subunit B) 신호 서열, LTⅡb-B(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit) 신호 서열, BAP(bacterial alkaline phosphatase) 신호 서열(Izard and Kendall, Mol. Microbiol. 13:765-773, 1994), 효모 카보시펩티다제(Yeast carboxypeptidase) Y 신호 서열(Blachly-Dyson and Stevens, J. Cell. Biol. 104:1183-1191, 1987), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 치사독소 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호 서열(Stark et al., EMBO J. 5(8): 1995-2002, 1986), 소 성장호르몬(bovine growth hormone)의 신호 서열(Lewin, B. (Ed), GENES V, p290. Oxford University Press, 1994), 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase)의 신호-앵 커(signal-anchor)(Lewin, B. (Ed), GENES V, p297. Oxford University Press, 1994), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α, Prehn et al., Eur. J. Biochem. 188(2): 439-445, 1990)의 신호 서열, Twin-arginine translocation(Tat) 신호 서열(Robisnon, Biol. Chem. 381(2): 89-93. 2000) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 염기성이 높은 N-영역을 갖는 신호서열이라면 모두 사용될 수 있다.

상기 신호 서열의 소수성 단편은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 신호서열의 1번째 내지 6번째 아미노산을 포함하는 6 내지 21개의 아미노산으로 구성되는 펩티드인 것이 바람직하다.

상기와 같이 아르지닌, 리신 등 pI 값이 높은 아미노산이 N-영역에 하나 또는 두 개 이상 존재할 경우, 분비효율의 증가가 예상된다. 상기와 같은 아미노산의 치환방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). 또한, 상기 N-영역에 대한 돌연변이화(mutagenesis)를 수반하거나 수반하지 않은 채, 상기 중앙 특이적 소수성 영역에 대한 돌연변이화를 유발할 수 있다. 즉, 중앙 특이적 소수성 영역의 하나 이상의 아미노산을 공지의 방법을 이용하여 다른 소수성 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌, 타이로산, 트립토판, 류신, 발린, 이소류신, 트레오닌 및 알라닌)으로 치환하는 것은 당업자의 능력의 범위 내에 있으며, 당업자가 본 발명의 내용을 이해한다면, 그러한 변이에 의해서도 당해 전체 변이된 신호서열의 소수성 프로파일이 본 발명의 신호 서열과 유사할 경우, 본 발명의 신호서열과 동등한 효과를 나타낼 것이라고 인정할 것이다.

상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되며, 더 더욱 바람직하게는 6 내지 15개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 이때, 상기 친수성 아미노산은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 리신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산인 것이 바람직하며, 리신 또는 아르기닌인 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 리신 또는 아르기닌과 같은 친수성이 강한 아미노산이 6개 반복된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 분비증강자에 의하여 코드되는 폴리펩티드의 pI 값은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 8 이상인 것이 바람직하고, 9 이상인 것이 더욱 바람직하며, 10 이상인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 발현 벡터는 상기 분비증강자를 코 딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함한다(도 1 (i) 참조). 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 한편, 상기 단백질 절단효소 인식 부위는 인자 Xa의 경우, Ile-Glu-Gly-Arg인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 신호서열의 소수성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뒤에 작동 가능하도록 연결된 SmaⅠ 인식부위(OmpASP 단편-SmaI-Xa)를 통해 삽입가능하며, 전체 분비증강자까지 포함하는 변이된 신호서열에 대응되는 폴리뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 삽입될 수 있다. 상기 SmaI 인식부위로 인하여 분비증강자로 당업자가 원하는 아미노산서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 자유자재로 삽입할 수 있게 된다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 발현벡터는 상기 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 제한효소 부위를 추가적으로 포함할 수 있는데, 상기 제한효소 부위를 통해 외래단백질을 코딩하는 유전자를 용이하게 클로닝할 수 있다(도 1 (h) 참조).

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터는, 상기 유전자 컨스트럭트에 작동 가능하도록 연결된 외래단백질을 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함한다. 상기 외래 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절 단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 외래단백질 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 외래단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다.

이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 내부에 막전위 도메인(transmembrane domain), 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain) 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있는 단백질인 것이 바람직하다. 상기 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 외래단백질은 + 하전을 가지고 있는 부분이 막의 지질이중층(lipid bilayer)에 부착되어 이러한 막전위-유사 구조가 일종의 앵커 역할을 수행하여, 세포 외부로 분비가 잘 안되는 것으로 추정된다. 이런 분비 곤란한 단백질을 세포외로 분비시키는데 본 발명의 상기 발현벡터는 매우 효율적이다. 그러나, 비록 본 발명의 상기 분비증강자를 이용한 발현벡터가 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 단백질의 생산에 보다 효과적이기는 하지만, 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가지고 있지 않은 단백질의 경우에도 분비효율이 증가되므로, 어떠한 종류의 단백질이라도 상기 분비증강자를 이용한 본 발명의 발현벡터를 이용하여 수용성으로 생산 가능하다. 본 발명의 벡터가 상기와 같이 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 단백질의 수용성 생산에 적합한데, 이는 본 발명의 변이된 신호서열이 가지고 있는 유도 신호(directional signal)와 높은 친수도가 외래 목적 단백질이 내부에 가지고 있는 막전위 도메인이 가지고 있는 친수도 보다 클 경우, 미완성 단백질(nascent polypeptide)을 페리플라즘 밖으로 이동을 가능하기 때인 것으로 사료된다. 그 원리는 상기 도메인들이 지질 이중층(lipid bilayer)에 붙는 힘보다 변이된 신호서열이 가지는 방향성과 높은 친수도가 더 커서 분비가 촉진되기 때문인 것으로 추측된다.

상기 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 넙치 헵시딘 I인 것이 바람직하다. 다른 단백질의 경우에도, 소수성 프로파일을 분석할 때, N-말단 또는 C-말단이 아닌 단백질의 내부에, 막전위-유사 도메인으로 판정되는 부분이 나타나거나, 연속적인 다수의 소수성 아미노산으로 구성된 서열 뒤에 연속적인 다수의 친수성 아미노산으로 구성된 서열이 나타날 경우, 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 단백질로 판정하여 본 발명의 발현시스템에 적용시킬 수 있다. 그러한 판정을 위해서, 컴퓨터 소프트웨어를 이용할 수 있는데, 대표적인 것은 DNASIS^TM, DOMpro(Cheng et al., Knowledge Discovery and Data Mining, 13(1): 1-20, 2006, //www.ics.uci.edu/~baldig/dompro.html), TMpred (//www.ch.embnet.org /software/TMPRED_form.html), HMMTOP (//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html), TBBpred(//www.imtech.res.in/raghava/tbbpred/), DAS-TMfilter(://www.enzim.hu/ DAS/DAS.html) 등이 존재한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터 중 어느 하나로 숙주세포를 형질전환하여 제조한 비인간 형질전환체를 제공한다.

이때, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군로부터 선택된 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은,

1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인, 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질 또는 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편 및 절단효소 인식부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

(b) 단계 2에서 상기 외래단백질의 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer), 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단 백질 또는 신호서열의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer), 단백질 절단효소 인식 부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;

4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.

이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 외래 단백질은 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것이 바람직하고, 불용성으로 발현되는 단백질인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 외래 단백질로 Mefp1 다중체 및 넙치 헵시딘 Ⅰ을 대상으로 수행하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 소수성 프로파일은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 소수성 프로파일 분석용 컴퓨터 소프트웨어 또는 웹기반의 어플리케이션으로 분석되는 것이 바람직하며, 상기 컴퓨터 소프트웨어로는 컴퓨터 프로그램은 DNASIS^TM(Hitachi, Japan), Visual OMP(DNA software, USA), Lasergene(DNASTAR, USA), pDRAW32(USA) 및 NetSupport DNA(NetSupport Inc. USA)로 이루어진 군으로부터 선택되어진 프로그램을 사용하는 것이 바람직하며, DNASIS^TM(Hitachi, Japan)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 분비증강자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 60% 이상의, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산 길이인 것이 바람직하고, 4 내지 25개의 아미노산 크기인 것이 더욱 바람직하며, 6 내지 15개의 아미노산 길이인 것이 더 더욱 바람직하며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 것이다. 또한, 상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드이며, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드로서, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 가장 바람직하게는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩티드이다. 한편, 상기 분비증강자는 pI 값이 8 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, pI 값이 9 이상인 것이 더욱 바람직하 고, 10 이상인 것이 가장 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 친수성 아미노산은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 리신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 리신 또는 아르기닌이다.

본 발명의 방법의 다른 실시태양에서, 상기 분비증강자 및 외래단백질 사이에 단백질 절단효소 인식 부위가 추가적으로 삽입되어 있는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군로부터 선택된 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.

더 나아가, 본 발명은

1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편 및 단백질 절단효소 인식 부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

(b) 단계 2에서 상기 외래단백질의 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer), 단백질 절단효소 인식 부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;

5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및

7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 분비증강자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 60% 이상의, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산 길이인 것이 바람직하고, 4 내지 25개의 아미노산 크기인 것이 더욱 바람직하며, 6 내지 15개의 아미노산 길이인 것이 더 더욱 바람직하며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 것이다. 또한, 상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드이며, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드로서, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 가장 바람직하게는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩티드이 다. 한편, 상기 분비증강자는 pI 값이 8 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 바람직하고, pI 값이 9 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 더욱 바람직하며, pI 값이 10 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 가장 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 융합 외래단백질은 상술한 발현벡터가 형질전환된 형질전환체에서 발현하여 단백질을 회수함으로서 생산할 수 있다. 회수 방법은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있다.

상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것이 바람직하고, 불용성 단백질인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 외래 단백질로 Mefp1 다중체 및 넙치 헵시딘 Ⅰ을 대상으로 수행하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

더 나아가, 상기 외래단백질로 뇌를 표적으로 하는 치료용 단백질, 예를 들어 베타-아밀로이드에 특이적인 scFv(single-chain variable fragment) 사용할 경우, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 변이된 신호서열과 외래단백질간의 융합단백질은 종래에 단백질이 통과할 수 없었던, 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 뇌에 직접 작용할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 약물전달체계(drug delivery system), 특히, 뇌질환 치료를 위한 약물전달체계의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다. 상기 뇌혈관 장벽의 통과 문제뿐만 아니라, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 융합 외래단백질은 경구투여시, 위내에서 분해되기 전에, 위벽을 통과하거나, 경피에 도포 또는 패치함으로써 피부를 통과하여 체내에 온전하게 전달될 수 있다. 그럼으로써, 종래의 단백질 제제의 가장 큰 문제점인 투여 방법의 제한(정맥주사, 근육주사, 피하주사 또는 비강투여)을 해소하고, 보다 간편한 투여방법인 경구투여, 경피투여를 가능하게 할 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 융합 외래단백질을 제공한다.

이때, 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌를 표적으로 하는 치료용 단백질인 것이 바람직하다. 또한, 상기 방법에 의하여 제조되는 융합 외래단백질은 본 발명의 변이된 신호서열로 말미암아 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있는 막투과 부위를 갖게 된다.

더 나아가, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 변이된 신호서열과 외래단백질의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되는 것은 아 니나, 뇌질환 치료에 사용되는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은

1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편 및 단백질 절단효소 인식 부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;

7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및

8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 외래 단백질은 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것이 바람직하고, 불용성 단백질인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 외래 단백질로 Mefp1 다중체 및 넙치 헵시딘 Ⅰ을 대상으로 수행하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 소수성 프로파일의 분석은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 소수성 프로파일 분석용 컴퓨터 소프트웨어 또는 웹기반의 어플리케이션으로 분석되는 것이 바람직하며, 상기 컴퓨터 소프트웨어로는 컴퓨터 프로그램은 DNASIS^TM(Hitachi, Japan), Visual OMP(DNA software, USA), Lasergene(DNASTAR, USA), pDRAW32(USA) 및 NetSupport DNA(NetSupport Inc. USA)로 이루어진 군으로부터 선택되어진 프로그램을 사용하는 것이 바람직하며, DNASIS^TM(Hitachi, Japan)을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 웹 기반의 어플리케이션으로는 이노바젠사(Innovagen, Inc., Sweden)의 홈페이지를 통해 제공되는 어플리케이션을 이용할 수 있다(//www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-property-calculator /peptide-property-calculator.asp).

상기 방법에 있어서, 상기 분비증강자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 60% 이상의, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산 길이인 것이 바람직하고, 4 내지 25개의 아미노산 크기인 것이 더욱 바람직하며, 6 내지 15개의 아미노산 길이인 것이 더 더욱 바람직하며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 것이다. 또한, 상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드이며, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩티드로서, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 가장 바람직하게는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩티드이다. 한편, 상기 분비증강자는 pI 값이 8 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 바람직하고, pI 값이 9 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 더욱 바람직하며, pI 값이 10 이상인 친수성 폴리펩티드인 것이 가장 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군로부터 선택된 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.

상기 융합 외래단백질은 상술한 발현벡터가 형질전환된 형질전환체에서 발현하여 단백질을 회수함으로서 생산할 수 있다. 회수 방법은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있다. 또한 상기 회수 전/후의 융합 외래단백질을 당해 융합 외래단백질에 삽입된 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 처리하여 원래 형태의 외래단백질만을 순수 분리할 수 있으며, 상기 단백질 절단효소로는 인자 Xa, 엔테로키나제, 게네나제(Genenase) Ⅰ, 퓨린(Furin)이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 단백질 절단효소 인식 부위는 인자 Xa의 경우, Ile-Glu-Gly-Arg인 것이 바람직하다.

일실시태양으로서, 본 발명은 1) 본 발명의 발현벡터의 제한효소 부위에 외래단백질을 코딩하는 유전자를 작동 가능하도록 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1의 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.

이때, 상기 숙주세포는 특별히 제한되는 것은 아니나, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균 또는 바실러스(Bacillus)속 미생물인 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모, 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

더 나아가, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 외래단백질의 분비향상을 유도하는 분비증강자의 스크리닝방법을 제공한다:

1) 프로모터, 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 신호서열의 N-영영 및 중앙 특이적 소수성 지역을 포함하는 소수성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 분비증강자 후보 서열의 삽입을 위한 제한효소부위 및 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서로 작동 가능하도록 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현벡터의 제한효소부위에 친수성 아미노산을 포함하는 분비증강자 후보서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 틀에 맞게 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

3) 단계 2의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

4) 상기 단계 3의 형질전환체를 배양하는 단계;

5) 단계 1의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(대조군)와 단계 4의 형질전환체의 배양액에서 상기 외래단백질의 발현정도를 측정하는 단계; 및

6) 대조군과 비교하여 유의하게 상기 외래단백질의 발현 수준을 증가시킨 분비증강자를 선별하는 단계.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 접착성 단백질 유전자 DNA 다중체 카세트의 클로닝

본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 기본 단위 Mefp1(Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys)을 근거로 하여, 서열번호 2로 기재되는 정방향 프라이머(5'-TAC AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC-3')와 서열번호 3으로 기재되는 역방향 프라이머(5'-TTT GTA GGT TGG CGG ATA AGA CGG CTT AGC-3')를 이용하여 합성 mefp1 DNA를 제작하였다. 왼쪽 어댑터(Left adapter: 이하 “La”라 칭함) 합성 DNA는 BamHI/EcoRI/SmaI를 가지는 서열번호 4로 기재되는 정방향 프라 이머(5'-GAT CCG AAT TCC CCG GG-3')와 서열 번호 5로 기재되는 역방향 프라이머(5'-TTT GTA CCC GGG GAA TTC G-3')로 제작하였고, 오른쪽 어댑터(Right adapter: 이하 “Ra”라 칭함) 합성 DNA는 Arg/HindIII/SalI/XhoI를 가지는 서열번호 6으로 기재되는 정방향 프라이머(5'-TAC AAA CGT AAG CTT GTC GAC C-3')와 서열 번호 7로 기재되는 역방향 프라이머(5'-TCG AGG TCG ACA AGC TTA CG-3')로 제작하여, 대한민국 등록특허 제 379,025호에 공시된 방법으로 mefp1 DNA 다중체(multimer)를 제작하여 pBluescriptⅡSK(+) 벡터(Stratagene, USA)에 클로닝하였고, 7번 반복된 mefp1 DNA 다중체를 탐색하여 pBluescriptⅡSK(+)La-7×mefp1-Ra이라 명명하였다(도 2).

CAT는 NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.

이탤릭 굵은 문자: OmpASP 및 OmpASP 파편의 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드를 적절하게 나타낸다.

굵은 문자: SmaI 자리의 올리고뉴클레오티드.

밑줄 친 굵은 문자: factor Xa 절단 자리의 올리고뉴클레오티드.

일반 문자: 도 2에서 나타나는 Mefp1 부분의 올리고뉴클레오티드.

역방향 프라이머: 도 2에서 나타나는 Ra(오른쪽 어댑터; Arg/HindⅢ/SalI/XhoI)에 상보적인 올리오뉴클레오티드 서열.

OmpA 신호 펩티드(OmpASP)는 23개의 아미노산 잔기(MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAP: 서열번호 46)로 구성되어 있다(Movva et al., J. Biol. Chem. 255, 27-29, 1980).

mefp1: Mefp1의 유전자

*: Ra 및 His 태그(6×His)의 잉여 서열.

약자: T-전체 단백질; S-수용성 단백질; 및 P-페리플라즘 분획.

재조합 Mefp1 단백질의 발현 결과는 무발현시 "-"로, 발현시 "+"로 표시하였다.

다양한 길이의 OmpASP에 대한 pI 및 소수성 평균값과 수용성 재조합 Mefp1 단백질 발현 결과

OmpASP의 다양한 길이	pI	호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값	표 1에서 나타난 수용성 재조합 Mefp1 단백질 발현 결과
OmpASP₁	5.70	-	NT
OmpASP_1-2	9.90	-	NT
OmpASP₁ _-3	10.55	-	+
OmpASP_1-4	10.55	-	+
OmpASP_1-5	10.55	-	+
OmpASP_1-6	10.55	-0.03	+
OmpASP_1-7	10.55	-0.09	+
OmpASP_1-8	10.55	-0.31	+
OmpASP_1-9	10.55	-0.33	+
OmpASP_1-10	10.55	-0.44	+
OmpASP_1-11	10.55	-0.45	+
OmpASP_1-12	10.55	-0.56	NT
OmpASP_1-12	10.55	-0.56	+
OmpASP_1-14	10.55	-0.52	NT
OmpASP_1-15	10.55	-0.65	+
OmpASP_1-21	10.55	-0.61	+
OmpASP_1-23	10.55	-0.58	+

OmpASP의 다양한 길이에 대한 pI 및 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale with window size : 6 and threshold line : 0.00)에 의한 소수성 값은 DNASIS^TM으로 계산되었다. 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값이 +가 나올 경우 당해 펩티드는 친수성을 띄며, -가 나올 경우 소수성을 띈다. 절대 값이 클수록 친수성 또는 소수성은 정도가 높음을 의미한다.

<실시예 2> 접착성 단백질 발현 조사

앞선 연구에서 Mefp1은 Met-Mefp1을 선도 서열(leader sequence)로 사용할 때는 불가용성 단백질 응집체를 형성하였다(Kitamura et al., J Polym. Sci. Ser. A 37:729-736, 1999). 이에 본 발명자들은 수용성 발현을 위해 신호서열 OmpASP(OmpA signal peptide)를 도입하여 도 2의 mefp1 염기서열을 주형으로 PCR를 수행하여 여러 크기의 신호서열 OmpASP과 상기 제작한 mefp1 카세트(cassette)가 연결된 클론을 제작하였다(표 1).

상기 표 1과 같이 제작한 신호 서열을 가진 발현벡터를 E.coli BL21(DE3)에 통상의 방법으로 형질전환하여 LB 배지[트립톤(tryptone) 20 g, 효모 추출물(yeast extract) 5.0 g, NaCl 0.5 g, KCl 1.86 mg/ℓ]에 50 ㎍／㎖ 암피실린(ampicillin)과 함께 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 LB 배지를 사용하여 200배 희석하였다. 희석된 배양액에 1 mM IPTG를 첨가하여 OD₆₀₀값이 0.3이 되도록 배양하였다. 발현을 위해 3시간 동안 배양하였다. 배양액 1 ㎖을 4,000×g, 4℃에서 30분간 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 100 내지 200 ㎕ 시료 버퍼(sample buffer: 0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 1% glycerol, 0.1% bromphenol blue)로 현탁하였다. 현탁액은 단백질을 분리하기 위하여 소니케이터(sonicator)를 사용하여 100 3-s pulse로 분쇄하였고, 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하기 위하여 16,000 rpm, 30분, 4℃에서 원심분리를 수행하여 비수용성 부분(insoluble fraction)을 분리하였다. 페리플라즘 분획은 급격한 삼투압 변화(osmotic shock)에 의한 삼투압 충격법(Nossal and Heppel, J. Biol. Chem. 241:3055-3062, 1966)을 사용하여 분리하였다. 전체 단백질, 수용성 분획(soluble fraction) 및 페리플라즘 분획(periplasmic fraction)의 단백질을 16% SDS-PAGE 젤을 사용하여 Laemmli 등의 방법(Laemmli, Nature 227:680-685, 1970)으로 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 블루 염색법(Coomassie Brilliant Blue stain; Sigma, USA)으로 염색하였다. 상기 SDS-PAGE를 수행한 젤을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; Roche, USA)에 이동시켰다. 이후 5% 스킴 밀크(skimmed milk; Difco, USA)에 담근 후, 막을 0.4 ㎍／㎖ 항-His6 모노클로날 항체(monoclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology, USA)가 포함된 용액에 37℃, 2시간 동안 담갔다. 이후 HRP-결합 토끼 항-마우스 IgG(horseradish peroxidase conjugated rabbit anti-mouse IgG; Santa Cruz Biotechnology, USA)를 2차 항체로 사용하여 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)를 염색액으로 사용하여 염색하였다.

본 실험 결과, 선도 서열(leader sequence)인 OmpASP_1-3이상 OmpASP_1-23까지의 크기를 가지는 모든 벡터 클론은 전체 단백질(total protein), 수용성 분획(soluble fraction) 및 페리플라즘 분획(periplasmic fraction)에서 Mefp1 단백질을 발현시켰다(표1 및 도 3). 그러므로 Mefp1의 수용성 발현을 위해서는 OmpASP_1-23의 전체 길이가 필요한 것이 아니고 OmpASP_1-3만으로도 Mefp1 단백질 전구체를 페리플라즘으로 전이시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 발현 양은 선도 서열의 길이와 무관하여 신호서열 내의 소수성 구역(central characteristic hydrophobic region: OmpASP_7-14) 및 절단 자리를 가진 C-말단 구역(C-region ending with cleavage site: OmpASP_15-23)에는 분비증강자가 없다고 판단하였다. 신호서열 OmpA의 여러 길이에 대한 pI 값과 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale)에 의한 소수성 값을 분석한 결과, OmpASP_1-3에서 OmpASP_1-23까지의 모든 서열은 동일한 pI 값 10.55를 가졌고, 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값은 변이가 많았다(표 2). 따라서 상기 일정한 pI 값은 신호서열이 수용성 발현을 위해 직접 신호(directional signal)로서 작용하는데 가장 중요하다고 사료된다.

<실시예 3> 원래 형태(native form)의 접착성 단백질 생산

원래 형태의 N-말단 접착성 단백질을 생산하기 위해, 짧은 OmpASP 신호서열의 수용성 발현 결과를 토대로, 본 발명자들은 C-말단이 절단되는 factor Xa 절단 부위(cleavage site)를 도입하여 OmpASP_1-8-Xa-Mefp1의 올리고뉴클리오타이드를 전방향 프라이머로 합성하여 pBluescriptIISK(+)-La-7×mefp1-Ra(도 2)를 주형으로 PCR를 수행하여 pET-22b(+)(ompASP_1-8-Xa-7×mefp1*)(* : Ra-6×His, Ra derived from the right adaptor; 6×His derived from His tag) 클론을 제작하였다(표 1). 상기 벡터를 실시예 2의 형질전환 방법과 웨스턴 블롯 방법을 수행하여 발현을 확인하였다.

그 결과, 이 클론은 수용성 단백질 OmpASP₁ _-8-Xa-7×Mefp1*를 생산하였다. 이렇게 생산된 재조합 융합 단백질을 절단효소 factor Xa로 처리하여 수용성 발현을 유도한 OmpASP₁ _-8-Xa 서열이 제거된, 원래 형태의 아미노 말단을 가진 7×Mefp1* 단백질을 얻을 수 있었다(도 4).

또한, 우리는 위의 pET-22b(+)(ompASP₁ _-8-Xa-7×mefp1*) 클론이 원래 형태의 아미노 말단을 가진 접착성 단백질을 생산할 수 있음으로 접착성 단백질의 유전자가 짧기 때문에 여러 카피를 클로닝하는 과정에서 PCR를 통해 항상 같은 수의 접착성 단백질의 유전자를 클로닝한 후 신호서열을 변조시키기 위해서는 SmaI 부위를 신호서열 영역에 도입하는 것이 편리하다고 판단되어 pET-22b(+) (ompASP_1-8-SmaI-Xa-7×mefp1*) 클론(표 1)을 제작하였고, 발현된 단백질은 절단효소 factor Xa로 OmpASP_1-8-SmaⅠ-Xa를 절단하여 원래 형태의 아미노 말단을 가진 7×Mefp1* 단백질을 수득되었다. 또한 pET-22b(+)(ompASP₁ _-8-SmaⅠ-Xa-7×mefp1*) 클론 중 SmaⅠ 자리에 6개의 아르지닌(Arg) 또는 6개의 리신(Lys)에 해당하는 뉴클리오타이드를 대치한 결과 단백질 분비가 약간 증가됨을 확인하였다.

<실시예 4> 접착성 단백질 기능 조사

pET-22b(+) (ompASP_1-8-Xa-7×mefp1*) 클론으로부터 Mefp1을 아래와 같이 분리하였다. 발현이 유도된 세포를 4,000 ×g, 4℃, 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액은 버리고 세포 펠렛(pellet)을 세척하고 -70℃에 냉동하거나 바로 PBS(pH 8.0)으로 현탁하였고, 소니케이터로 분쇄하였다. 분쇄한 세포는 12,000 ×g, 4℃, 30분간 원심분리를 수행하였다. 상층액에 절단효소 factor Xa(New England Biolabs, USA)를 처리하여 신호서열 OmpASP₁ _-8-Xa 부분을 절단한 후, 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 사용하여 여과하였고, 원래 형태의 Mefp1 단백질(7×Mefp1*)을 가진 상층액을 His tag purification kit(Qiagen, USA)를 사용하여 제작사의 방법으로 다음과 같이 정제하였다. Ni²⁺ 킬레이팅 레진(chelating resion) 1 ㎖를 5 ㎖ 증류수, 3 ㎖ 50 mM NiSO₄, 5 ㎖ 1×결합 버퍼(binding buffer; 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazole, pH7.9)로 평형화(equilibration)시켰다. 상층액을 컬럼에 통과시키고, 10 ㎖의 1×결합 버퍼와 6 ㎖ 세척 버퍼(washing buffer; 60 mM imidazole in PBS)로 세척하였다. 단백질은 6 ㎖ 용출 버퍼(elution buffer; 1,000 mM imidazole in PBS)를 사용하여 용출하였고, 용출된 분획(fraction)은 12% SDS-PAGE 젤을 사용하여 분석하였다.

상기와 같이 얻어진 원래 형태의 아미노말단을 가진 재조합 Mefp1 단백질이 고유의 기능을 할 수 있는지 조사하였다. 이후 5% 아세트산(acetic acid)으로 투석(Hwang et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:3352-3359, 2004)시킨 후, 타이로시네이즈(tyrosinase; Sigma, USA)를 사용하여 Mefp1 단백질의 타이로신(tyrosine)을 DOPA로 변환하였다. 접착 어세이(adhesion assay)를 수행하기 위하여 1 ㎎／㎖ 단백질에 타이로시네이즈(tyrosinase) 10 unit를 가하여 실온에서 교반하면서 6시간 처리하였다. 대조군으로는 5% 아세트산(acetic acid) 버퍼에 용해된 BSA를 사용하였다.

그 결과, 대조군으로 사용된 BSA에 비하여 원래 형태의 아미노말단을 가진 재조합 Mefp1 단백질(7×Mefp1*)은 현저한 접착성을 보여 주었다(도 5). 이를 통해 본 발명의 방법으로 생산된 수용성 재조합 Mefp1 단백질은 적당한 구조로 생산되었으며, 원래 단백질의 기능을 가지고 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 넙치 헵시딘 I의 수용성 단백질 발현을 위한 분비증강자의 스크린

실시예 2의 방법을 이용한 발현실험을 통해 넙치 헵시딘 I(Kim et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1411-1414, 2005)을 접착성 단백질과 같은 방법으로 OmpA 신호서열(OmpASP)의 여러 길이로 융합단백질을 발현시켰으나, 수용성으로 발현되지 않았다(표 3). 넙치 헵시딘 I의 서열은 하기와 같다(서열번호 47):

His Ile Ser His Ile Ser Met Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys Lys Ala Lys Gly Cys Gly Pro Cys Cys Lys Phe.

본 발명자들은 넙치 헵시딘 I과 OmpASP의 단편과의 융합단백질이 수용성으로 발현되지 않는 이유가 접착성 단백질은 평이한 구조(pI: 10.03 ; 소수성: -0.05)로 되어있으나, 넙치 헵시딘 I은 4개의 이황 결합(disulfide bonds)과 하나의 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지기 때문이라 추측하였다.

따라서 수용성 단백질 발현을 위한 분비증강자를 스크린하기 위해, 우리는 넙치 헵시딘 I에 대해서 신호서열 부분을 OmpASP_1-10-( )-Xa로 디자인하여 pET-22b(+)[ompASP_1-10-( )-Xa-ofhepcidinI**]을 제작하여, N-말단에 위치한 신호서열 부분 OmpASP_1-10을 고정시키고 C-말단에 위치한 ( )-Xa 부분을 변조시키기 위해 ( )안에 pI와 소수성/친수성 값에 많은 변화를 주는 아미노산인 아르지닌(Arginine), 리신(Lysine), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파르트산(Aspartic acid), 타이로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan)을 여섯 개씩 추가하여(표 4) 클론을 제작하였고(표 3) 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현을 조사하였다. 그 결과 친수성 아미노산인 아르지닌(Arginine) 및 리신(Lysine)이 삽입된 클론에서 수용성 헵시딘 I이 강하게 발현되었고, 다른 아미노산이 삽입된 클론에서는 발현이 약하게 일어났다(도 6). 이를 통해, 넙치 헵시딘 I에서는 디자인한 신호서열의 C-말단에 추가한 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 아르지닌(Arginine) 및 리신(Lysine)이 강한 분비증강자로서 역할을 하였고, 다른 아미노산들은 비교적 약한 분비증강자로서 작용하였음을 알 수 있었다(도 6 및 표 4). 따라서 상기 결과로부터 변이된 신호서열 영역 C-말단에 추가한 아미노산은 높은 pI 값과 친수성이 분비증강에 큰 영향을 미치는 것을 증명하였다.

CAT는 NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.

이탤릭 문자: OmpASP 파편의 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드를 적절하게 나타낸다.

이탤릭 굵은 문자: pI 및 소수성 평균값과 연관된 아미노산의 올리고뉴클레오티드.

굵은 문자: 헵시딘 Ⅰ 부분의 올리고뉴클레오티드.

ofhepⅠ: ofHepcidinⅠ의 유전자.

역방향 프라이머: ofHepcidienⅠ의 C-말단 및 Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ 부분이 포함된 상보 서열의 올리고뉴클레오티드 서열.

밑줄 친 굵은 문자: factor Xa의 인식 서열.

** : Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ-6×His(Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ은 역방향 프라이머 디자인에서 유래되었다; 6×His는 His 태그에서 유래되었다.)

재조합 ofHepⅠ** 발현 결과는 무발현시 "-"로, 약하게 발현시 "+/-"로,발현시 "+"로 표시하였다.

다양한 pI 및 소수성 값을 가진 아미노산이 OmpASP_1-10-( )-Xa에 삽입된 신호서열 영역의 소수성 값 및 도 6 및 표 3의 pET22b(+)ompASP_1-10-( )-Xa-ofHepI** 클론에서 수용성 넙치 헵시딘 I의 발현 결과

	삽입된 아미노산	삽입된 pI값	삽입된 아미노산의 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값	신호 펩티드 형태	신호 펩티드 결과물의 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값	도 6 및 표 3의 클론의 ofHepcidinⅠ의 발현
대조군	-	-	-	OmpASP_1-10-( )-Xa	-0.02	+/-
1	6×Arg	13.20	1.75	OmpASP_1-10-(6×Arg)-Xa	0.88	+
2	6×Lys	11.20	1.75	OmpASP_1-10-(6×Lys)-Xa	0.88	+
3	6×Glu	2.82	1.75	OmpASP_1-10-(6×Glu)-Xa	0.88	+/-
4	6×Asp	2.56	1.75	OmpASP_1-10-(6×Asp)-Xa	0.88	+/-
5	6×Tyr	5.55	-1.33	OmpASP_1-10-(6×Tyr)-Xa	-0.70	+/-
6	6×Phe	5.70	-1.45	OmpASP_1-10-(6×Phe)-Xa	-0.76	+/-
7	6×Trp	5.90	-1.98	OmpASP_1-10-(6×Trp)-Xa	-1.03	+/-

재조합 ofHepⅠ** 발현 결과는 약하게 발현시 "+/-"로, 양호한 발현시 "+"로 표시하였다.

<실시예 6> 신호서열의 소수성 변화에 의한 넙치 헵시딘 I의 발현 조사

소수성 변화에 의한 넙치 헵시딘 I 단백질의 발현을 조사하기 위해, 우리는 신호서열의 N-말단 부분인 직접 신호(directional signal)로 사용된 OmpASP 단편(파편)의 영향을 조사하기 위해, 여러 길이에 해당하는 신호서열 OmpASP₍ ₎-6×Arg-Xa을 디자인하고 그에 해당하는 클론을 만들어 발현을 조사하였다(표 3 및 도 7). 디자인된 신호서열 영역 OmpASP_1-6-6×Arg-Xa, OmpASP_1-8-6×Arg-Xa, OmpASP_1-10-6×Arg-Xa, OmpASP_1-12-6×Arg-Xa, OmpASP_1-14-6×Arg-Xa의 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값은 각각 1.37, 1.09, 0.88, 0.69 및 0.62였다. 그 결과 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값 0.62 이상에서 모두 수용성으로 발현되었고, 신호서열이 짧을수록 친수성이 커지고 수용성 발현이 증가되었다. 또한 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale)을 조사한 결과 인위적으로 디자인하여 너무 짧은 신호서열 OmpASP_1-6(소수성 값 -0.03)은 6×Arg-Xa(친수성 값 1.47)의 융합에 의해 친수성 곡선만을 나타내었고, 조금 긴 신호서열들(OmpASP_1-8, OmpASP_1-10, OmpASP_1-12, OmpASP_1-14)(소수성 값, 표 2 참조)은 6×Arg-Xa의 융합에 의해 N-말단에 소수성 곡선, C-말단에 친수성곡선을 보였다. 따라서 신호서열의 호프 앤 우드 스케일을 자연스러운 형태의 소수성 및 친수성 곡선을 갖는 막전위-유사 친수도(transmembrane-like hydropathy)를 갖게 하기 위해서는 OmpASP_1-8 이상의 크기가 적당함을 알 수 있었다.

또한 신호서열 C-말단의 분비증강자의 기능을 조사하기 위해, 신호서열 OmpASP_1-10을 직접 신호(directional signal)로 선택하여 N-말단으로 사용하고, OmpASP_1-10-( )-Xa를 디자인하고 ( ) 안에 여러 길이의 친수성 아미노산을 삽입하여 클론을 만들고, 발현을 조사하였다(표 3 및 도 8). 디자인된 신호서열 영역 OmpASP_1-10-Xa, OmpASP_1-10-LysArg-Xa, OmpASP_1-10-4×Arg-Xa, OmpASP_1-10-6×Arg-Xa, OmpASP_1-10-8×Arg-Xa, OmpASP_1-10-10×Arg-Xa의 호프 앤 우드 스케일 값은 각각 -0.02, 0.35, 0.64, 0.88, 1.07 및 1.23 였다. 그 결과, 호프 앤 우드 스케일 값 0.35 이하에서는 매우 약하게 수용성으로 발현되었고, 호프 앤 우드 스케일 값 0.64 이상에서 모두 양호하게 수용성으로 발현되었으며(도 8), 친수성 아미노산의 길이가 길수록 규칙적으로 친수성이 증가되고 수용성 발현이 증가되었다. 수용성 발현을 유도한 모든 신호서열들의 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale)을 조사한 결과, 모든 신호서열들은 막전위-유사 친수도(transmembrane-like hydropathy)와 유사하게 N-말단에 소수성 곡선과 C-말단에 친수성 곡선을 가지고 있었다.

따라서 위의 결과로부터 신호서열 영역의 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값은 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현을 위한 분비증강자의 기준이 될 수 있다고 생각되고, 그에 따른 호프 앤 우드 스케일에 따른 소수성 프로파일도 위의 결과를 토대로 디자인할 경우 분비증강자로서 판단할 수 있는 보조 기준이 될 수 있다고 생각된다.

<실시예 7> 신호서열의 호프 앤 우드 스케일에 따른 소수성 프로파일과 넙치 헵시딘 I의 발현과의 상관성 조사

실시예 6의 경우 호프 앤 우드 스케일 값은 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현에 대한 좋은 기준이 되었다. 그러므로 호프 앤 우드 스케일에 따른 소수성 프로파일을 분석하여 분비증강자의 기준으로서의 활용 가능성을 조사하였다. 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 가상적으로 넙치 헵시딘 Ⅰ(ofHepcidinI)을 대조구로 사용하여, 신호서열과 넙치 헵시딘 I의 융합단백질인 OmpASP_1-10-Xa-ofHepcidinI, OmpASP_1-10-LysArg-Xa-ofHepcidinI, 및 OmpASP_1-10-6×Arg-Xa-ofHepcidinI을 호프 앤 우드 스케일에 따른 소수성 프로파일을 분석하였다(도 9). 그 결과, 넙치 헵시딘 I은 분자 내에 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있었고, OmpASP_1-10-Xa-ofHepcidinI 및 OmpASP_1-10-LysArg-ofHepcidinI은 두 개의 유사한 크기의 막전위-유사(transmembrane-like) 도메인을 가졌고, 하나는 신호서열에서 다른 하나는 넙치 헵시딘 I의 양친매성 도메인에서 유래한 것이다. 그러나 이 가상적인 OmpASP_1-10-Xa-ofHepcidinI 및 OmpASP_1-10-LysArg-ofHepcidinI 융합단백질에 해당하는 재조합 단백질 OmpASP_1-10-Xa-ofHepcidinI** 및 OmpASP_1-10-LysArg-ofHepcidinI**은 수용성으로 약하게 발현되었다(표 3 및 도 8). 그러나 가상적인 융합단백질 OmpASP_1-10-6×Arg-Xa-ofHepcidinI의 호프 앤 우드 스케일의 프로파일은 두 개의 막전위-유사(transmembrane-like) 도메인을 신호서열과 넙치 헵시딘 I 분자 내에 각각 하나씩 가졌고, 신호서열의 막전위-유사(transmembrane-like) 도메인은 넙치 헵시딘 I 분자 내에 있는 양친매성 도메인보다 크기가 컸으며, 그에 일치하는 클론으로부터 수용성의 재조합 단백질 OmpASP_1-10-6×Arg-Xa-ofHepcidinI**이 강하게 발현되었고, 그 발현 양은 신호서열의 막전위-유사 친수도(transmembrane-like hydropathy)의 크기와 잘 일치하였다(도 8).

따라서 이 결과에서 넙치 헵시딘 I과 같이 분자 내에 양친매성 도메인을 가지고 있는 외래단백질을 수용성으로 발현시키기 위해서는 신호서열 영역 내에 더 큰 막전위-유사(transmembrane-like) 도메인의 친수도가 필요하다는 것을 알 수 있다.

처음 본 발명자들은 넙치 헵시딘 I이 OmpASP의 단편(파편)과 융합단백질의 수용성으로 발현되지 않는 이유를 4개의 이황 결합(disulfide bonds)과 하나의 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지기 때문이라 가정하였으나, 위의 실험을 통해 막전위-유사(transmembrane-like) 도메인이 가장 중요한 장애라고 생각된다. 그 밖의 4개의 이황 결합(disulfide bonds)에 대해서는 페리플라즘으로 배출된 미완성 폴리펩티드 사슬(nascent polypeptide chains)이 페리플라즘의 산화적 환경에서 이황 아이소머레이즈(disulfide isomerases)와 같은 DsbA에 의해서 이황 결합(disulfide bonds)을 형성하고(Bardwell et al., Cell 67, 581-589, 1991; Kamitani et al., EMBO J. 11, 57-62, 1992), 또한 잠재 접힘 조력자(potential folding aid)인 DsbA와 같이 발현시켜도 목적 단백질의 발현에 영향을 주지 않는다(Beck and Burtscher, Protein Expression and Purification 5, 192-197, 1994)는 보고가 있음으로 이황 결합(disulfide bonds)이 수용성 발현에 장애가 되지 않으리라고 판단된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 재조합 단백질의 불용성 침전을 방지하고, 세포질 밖 또는 페리플라즘으로의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 외래단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 강력한 분비증강자를 이용하여 막 침투성을 향상시켜, 유용 치료용 단백질의 이동(transduction)에 이용될 수 있다.

<110> National Fisheries Research and Development Institute <120> Production of soluble native form of recombinant protein by directional signal and secretional enhancer <130> 6p-12-36 <150> KR2006-9418 <151> 2006-01-31 <150> KR2006-22389 <151> 2006-03-09 <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mefp1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 2 tacaaagcta agccgtctta tccgccaacc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 3 tttgtaggtt ggcggataag acggcttagc 30 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 4 gatccgaatt ccccggg 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 5 tttgtacccg gggaattcg 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 6 tacaaacgta agcttgtcga cc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 7 tcgaggtcga caagcttacg 20 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-22b(+)OmpASP1-3-7XMefp1* sense primer <400> 8 catatgaaaa aggctaagcc gtcttatccg ccaacc 36 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-4-7XMefp1* sense primer <400> 9 catatgaaaa agacagctaa gccgtcttat ccgccaacc 39 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-5-7XMefp1* sense primer <400> 10 catatgaaaa agacagctgc taagccgtct tatccgccaa cc 41 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-6-7XMefp1* sense primer <400> 11 catatgaaaa agacagctat cgctaagccg tcttatccgc caacc 45 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-7-7XMefp1* sense primer <400> 12 catatgaaaa agacagctat cgcggctaag ccgtcttatc cgccaacc 48 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)-OmpASP1-8-7XMefp1* sense primer <400> 13 catatgaaaa agacagctat cgcgattgct aagccgtctt atccgccaac c 51 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-9-7XMefp1* sense primer <400> 14 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gctaagccgt cttatccgcc aacc 54 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-7XMefp1* sense primer <400> 15 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggctaagc cgtcttatcc gccaacc 57 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-11-7XMefp1* sense primer <400> 16 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcagcta agccgtctta tccgccaacc 60 60 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-13-7XMefp1* sense primer <400> 17 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcactgg ctgctaagcc gtcttatccg 60 ccaacc 66 <210> 18 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-15-7XMefp1* sense primer <400> 18 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcactgg ctggtttcgc taagccgtct 60 tatccgccaa cc 72 <210> 19 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-21-7XMefp1* sense primer <400> 19 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcactgg ctggtttcgc taccgtagcg 60 caggccgcta agccgtctta tccgccaacc 90 <210> 20 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-23-7XMefp1* sense primer <400> 20 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcactgg ctggtttcgc taccgtagcg 60 caggccgctc cggctaagcc gtcttatccg ccaacc 96 <210> 21 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-8-Xa-7XMefp1* sense primer <400> 21 catatgaaaa agacagctat cgcgattatc gaaggtcgtg ctaagccgtc ttatccgcca 60 acc 63 <210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-8-SmaI-Xa-7XMefp1* sense primer <400> 22 catatgaaaa agacagctat cgcgattccc gggatcgaag gtcgtgctaa gccgtcttat 60 ccgccaacc 69 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 23 ctcgaggtcg acaagcttac g 21 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-4 ofHepI** sense primer <400> 24 catatgaaaa agacacacat cagccacatc tccatgtgc 39 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-6 ofHepI** sense primer <400> 25 catatgaaaa agacagctat ccacatcagc cacatctcca tgtgc 45 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-8 ofHepI** snse primer <400> 26 catatgaaaa agacagctat cgcgattcac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 27 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10 ofHepI** primer <400> 27 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgcacatca gccacatctc catgtgc 57 <210> 28 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-12 ofHepI** sense primer <400> 28 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcactgc acatcagcca catctccatg 60 tgc 63 <210> 29 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-6XTrp-Xa-ofHepI** sense primer <400> 29 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgtggtggt ggtggtggtg gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 30 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-6XArg-Xa-ofHepI** sense primer <400> 30 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 31 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-6XLys-Xa-ofHepI** sense primer <400> 31 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgaaaaaga aaaagaaaaa gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 32 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-6XGlu-Xa-ofHepI** sense primer <400> 32 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggaagagg aagaggaaga gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 33 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-6XAsp-Xa-ofHepI** sense primer <400> 33 catatgaaaa agacagctat 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catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtatcga aggtcgtcac 60 atcagccaca tctccatgtg c 81 <210> 43 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-8XArg-Xa-ofHepI** sense primer <400> 43 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tcgccgtatc 60 gaaggtcgtc acatcagcca catctccatg tgc 93 <210> 44 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET22b(+)OmpASP1-10-10XArg-Xa-ofHepI** sense primer <400> 44 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tcgccgtcgc 60 cgtatcgaag gtcgtcacat cagccacatc tccatgtgc 99 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 45 ctcgaggtcg acaagctttt cgaacttgca gcaggggcca cagcc 45 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpA signal peptide <400> 46 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro 20 <210> 47 <211> 26 <212> PRT <213> Paralichthys olivaceus <400> 47 His Ile Ser His Ile Ser Met Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys Lys 1 5 10 15 Ala Lys Gly Cys Gly Pro Cys Cys Lys Phe 20 25

Claims

(ⅰ) 프로모터, 및

(ⅱ) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호 서열(signal sequence)로서, 10 이상의 pI를 갖는 신호 서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21 개 아미노산 길이의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 및 양친매성 도메인이 없는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 바이러스 기원의 프로모터는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 2항에 있어서, 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 5항에 있어서, 효모 기원의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 데히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 5항에 있어서, 동물 세포 기원의 프로모터는 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 신호 서열(signal sequence)은 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호 서열(signal sequence) 및 선도 서열(leader sequence)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 신호 서열(signal sequence)은 OmpA, 콜레라톡신 B(cholera toxin B, CT-B) 신호 서열, 대장균 이열성 엔테로톡신 B 서브유닛(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTⅡb-B) 신호서열, BAP(bacterial alkaline phosphatase) 신호 서열, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 킬러 톡신 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호 서열, 효모 카복시펩티다제(Yeast carboxypeptidase) Y 신호 서열, 소 성장호르몬(bovine growth hormone)의 신호 서열, 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase) 의 신호-앵커(signal-anchor), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α)의 신호 서열 및 트윈-아르기닌 전위(Twin-arginine translocation, Tat) 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
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제 1항에 있어서, N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 분비증강자로 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50 개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 12항에 있어서, 분비증강자는 6개의 아르기닌 또는 6개의 리신으로 구성된 친수성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, N-영역으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 14항에 있어서, 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 및 퓨린(Furin) 인식부위로 이루어진 군으로부터 단독 또는 융합의 형태로 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 12항에 있어서, 분비증강자를 코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 16항에 있어서, 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 및 퓨린(Furin) 인식부위로 이루어진 군으로부터 단독 또는 융합의 형태로 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항 또는 제 12항에 있어서, 외래단백질을 코딩하는 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
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제 1항에 있어서, 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 및 양친매성 도메인이 없는 외래단백질은 Mefp1인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 유전자 컨스트럭트에 작동가능하도록 연결된 외래 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
(ⅰ) 프로모터,

(ⅱ) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호 서열(signal sequence)로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번재 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 영역으로 구성된 신호 서열의 소수성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및

(ⅲ) 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 분비증강자로 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50 개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 갖는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 상기 프로모터는 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 23항에 있어서, 상기 바이러스 기원의 프로모터는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 23항에 있어서, 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터
제 23항에 있어서, 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 효모 기원의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 데히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 26항에 있어서, 동물 세포 기원의 프로모터는 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 신호 서열(signal sequence)은 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호 서열(signal sequence) 및 선도 서열(leader sequence)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 신호 서열(signal sequence)은 OmpA 신호 서열, 콜레라톡신 B(cholera toxin B, CT-B) 신호 서열, 대장균 이열성 엔테로톡신 B 서브유닛(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTⅡb-B), BAP 신호 서열, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 킬러 톡신 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호 서열, 효모 카복시펩티다제(Yeast carboxypeptidase Y) 신호 서열, 소 성장호르몬(bovine growth hormone)의 신호 서열, 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase)의 신호-앵커(signal-anchor), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α)의 신호 서열 및 트윈-아르기닌 전위(Twin-arginine translocation, Tat) 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 신호 서열의 소수성 단편은 신호서열의 1번째 내지 6번째 아미노산을 포함하는 6 내지 21개의 아미노산으로 구성되는 펩티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 분비증강자는 6개의 아르기닌 또는 6개의 리신으로 구성된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 분비증강자는 pI 값이 10 이상인 친수성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
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제 22항에 있어서, 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴크레오티드에 연결된, 외래 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
제 22항에 있어서, 유전자 컨스트럭트에 작동 가능하도록 연결된 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 발현 벡터.
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제 22항에 있어서, 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 갖는 외래단백질은 넙치 헵시딘 I인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항 또는 제 22항의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조한 비인간 형질전환체.
1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 및 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호 서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하며, 3 내지 21 개 아미노산 길이의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질 또는 상기 신호서열의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편 및 절단효소 인식부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

(b) 단계 2에서 상기 외래단백질의 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호 서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer)로서 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드, 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질, 또는 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호 서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer)로서 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드, 단백질 절단효소 인식 부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;

4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 외래단백질은 불용성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 소수성 프로파일은 소수성 프로파일 분석용 컴퓨터 소프트웨어 또는 웹기반의 어플리케이션으로 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서, 컴퓨터 소프트웨어는 DNASIS^TM, Visual OMP, Lasergene, pDRAW32 및 NetSupport로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 분비증강자는 6개의 아르기닌 또는 6개의 리신으로 구성된 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 분비증강자는 pI 값이 10 이상인 친수성 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
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1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 및 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편 및 단백질 절단효소 인식 부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

(b) 단계 2에서 상기 외래단백질의 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21 개 아미노산 길이의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer)로서 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50 개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드, 단백질 절단효소 인식 부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;

4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및

7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 융합 외래단백질의 제조방법.
1) 외래단백질의 소수성 프로파일을 분석하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분석결과 외래단백질 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는지 여부를 판정하는 단계;

3) (a) 단계 2에서 상기 외래단백질 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 및 양친매성 도메인이 존재하지 않는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편 및 단백질 절단효소 인식 부위에 상기 외래단백질이 연결된 융합 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하고,

(b) 단계 2에서 상기 외래단백질의 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 존재하는 것으로 판정될 경우에는, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21개 아미노산 길이의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 서열로 구성된 신호 서열의 소수성 단편, 분비증강자(secretional enhancer)로서 아르기닌 또는 리신이 포함된 2 내지 50 개의 아미노산으로 구성된 친수성 펩티드, 단백질 절단효소 인식 부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;

4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;

7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및

8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법.
1) 제 18항의 발현 벡터의 제한효소 부위에 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작동 가능하도록 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1의 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
1) 제 37항의 발현 벡터의 제한효소 부위에 외래단백질을 코딩하는 유전자를 작동 가능하도록 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1의 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
1) 제 38항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 단계 2의 형질전환체를 배양하는 단계;

3) 배양액으로부터 상기 외래단백질을 분리하는 단계; 및

4) 상기 분리된 외래단백질에 단백질 절단효소를 처리한 뒤, 원래 형태의 외래 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법.
제 52항에 있어서, 외래단백질은 뇌를 표적으로 하는 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 41항에 있어서, 숙주세포는 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 58항에 있어서, 원핵생물세포는 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 58항에 있어서, 진핵생물세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모, 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
1) 프로모터, 신호서열로서 10 이상의 pI를 갖는 신호서열의 N-말단에 위치한 1번째 내지 3번째 아미노산을 포함하는 3 내지 21 개의 아미노산 길이의 N-영역으로 구성된 폴리펩티드 단편 또는 상기 신호서열의 N-영역 및 중앙 특이적 소수성 지역을 포함하는 소수성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 분비증강자 후보 서열의 삽입을 위한 제한효소부위 및 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서로 작동 가능하도록 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현벡터의 제한효소부위에 친수성 아미노산을 포함하는 분비증강자 후보서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 틀에 맞게 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

3) 단계 2의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

4) 상기 단계 3의 형질전환체를 배양하는 단계;

5) 단계 1의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(대조군)와 단계 4의 형질전환체의 배양액에서 상기 외래단백질의 발현정도를 측정하는 단계; 및

6) 대조군과 비교하여 유의하게 상기 외래단백질의 발현 수준을 증가시킨 분비증강자를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비향상을 유도하는 분비증강자의 스크리닝방법.