CN105073977A - 重组酵母转化体和用其制备免疫球蛋白Fc片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在毕赤酵母属酵母中导入包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体而制备的转化体;生产免疫球蛋白Fc片段的方法,包括培养转化体,和从培养物回收免疫球蛋白Fc片段;和通过上述方法制备、用作药物载体的免疫球蛋白Fc片段。提出该转化体是大肠杆菌或动物细胞作为生产可用作药物载体的免疫球蛋白Fc片段的宿主的应用的相关问题的解决方案,因此其可在药物的高效和经济生产中得到多种应用。
Description
技术领域
本发明涉及重组酵母转化体、和用其制备免疫球蛋白Fc片段的方法。更具体地,本发明涉及通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属(Pichiasp.)酵母制备的转化体;生产免疫球蛋白Fc片段的方法,包括培养转化体和从培养物回收免疫球蛋白Fc片段;和通过上述方法制备的免疫球蛋白Fc片段,用作药物载体。
背景技术
随着生物工程和生物技术的进步,已研发出许多生物活性多肽(蛋白质)和肽药物作为多种疾病的治疗选择。然而,由于其低稳定性,这种多肽或肽药物容易变性,因此非常容易被肾或肝清除。因此,包括多肽作为医学活性成分的蛋白质药物具有必须频繁给予患者以维持其适当血清水平和效价的缺点。因此研发能够在不频繁给予的情况下在体内维持适当水平的蛋白质药物至关重要。
为解决这些问题,很多尝试致力于提高蛋白质药物的血清稳定性和长时间维持血液高药物浓度水平以最大化药物的药效,因此已尝试与其它蛋白质或结合聚合物融合,提高蛋白质配制的变化。近年来最好的方法其中之一致力于免疫球蛋白与蛋白质的融合。
已做出很多尝试来通过利用免疫球蛋白和其片段增加蛋白质药物的稳定性,如美国专利号5,045,312所述,其中人生长激素通过交联剂缀合至牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白。缀合物与无修饰的生长激素相比具有增强的活性。还制备了其它多种在使免疫球蛋白的Fc片段连接至干扰素(韩国专利公开号10-2003-0009464)、白介素-4受体、白介素-7受体或促红细胞生成素(韩国专利号10-249572)后在哺乳动物体内表达的融合蛋白。PCT专利公开号WO01/03737公开了一种融合蛋白,其中细胞因子或生长因子通过寡肽连接物连接至免疫球蛋白的Fc片段。而且,美国专利号5,116,964描述了利用基因重组技术融合至免疫球蛋白Fc片段的氨基或羧基端的蛋白质。美国专利号5,349,053公开了其中IL-2通过肽连接物连接至免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。
很多其它利用基因重组技术构建的Fc融合蛋白已被公开,其实例包括免疫球蛋白Fc片段与干扰素-β或其衍生物的融合蛋白(PCT专利公开号WO00/23472)、和免疫球蛋白Fc片段与IL-5受体的融合蛋白(美国专利号5,712,121)。进一步,免疫球蛋白Fc片段已被用作载体,而非融合配体,如美国专利号7,736,653公开。
免疫球蛋白或免疫球蛋白Fc片段的生产主要在大肠杆菌(E.coli)中进行。美国公司AmgenInc.在美国专利号6,660,843和美国专利公开号2004-0044188和2004-0053845中描述了一种人IgG1Fc衍生物,其铰链区前五个氨基酸残基的氨基酸被删除,其融合至治疗蛋白或肽模拟治疗蛋白的氨基或羧基末端;和其利用大肠杆菌宿主的生产。然而,这种不具有信号序列的融合蛋白作为包含体表达,因此一定会经历额外的重折叠过程。这种蛋白质重折叠过程降低产率,特别在作为同质二聚体或异质二聚体存在的蛋白质中,明显减少二聚体产量。而且,当不具有信号序列的蛋白质在大肠杆菌中表达时,基于大肠杆菌蛋白质表达系统的特点,甲硫氨酸残基添加至表达产物的N端。上述AmgenInc.的表达产物具有N端甲硫氨酸残基,其在反复或过度给予身体时可引起免疫应答。而且,由于通过将编码治疗蛋白的基因连接至Fc基因来在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达这些融合分子,其难以在大肠杆菌中表达,并且治疗蛋白难以在大肠杆菌中生成——如果其以融合形式在大肠杆菌中表达导致活性显著减少或丧失。进一步,由于两种分子的融合在两种蛋白质之间的连接区产生非天然存在的异常氨基酸序列,该融合蛋白可能被免疫系统认作外源物质,因此引起免疫应答。
如上所述,使用大肠杆菌的优势之处在于治疗有效的蛋白质可以基于大肠杆菌的快生长速率以及发酵和生物工程的积累技术以非糖基化形式以高产率表达,但劣势之处在于重组蛋白与天然蛋白相比具有甲硫氨酸作为第一个氨基端残基,并且考虑到大肠杆菌衍生的热原(内毒素)的去除和蛋白质重折叠,需要复杂的纯化过程。
另一方面,使用动物细胞有利的是生产的融合蛋白是与天然免疫球蛋白形式同类的糖基化蛋白质,但不利的是具有高生产成本,并且非常容易被动物衍生的病毒或蛋白质污染。因此,对上述问题解决方案的需求正在增加。推荐利用同时具有大肠杆菌和动物细胞作为宿主细胞的优势的酵母的策略。
酵母中用于蛋白质生产的代表是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。除对人体安全外,真核生物酿酒酵母还容易遗传操纵和大规模培养。而且,真核生物的多种表达系统已被建立。在利用重组方法生产高级细胞衍生的蛋白质如人蛋白质时,这种微生物另外提供给蛋白质在细胞外分泌和翻译后修饰(如通过糖基化)的能力。另外,酵母的重组蛋白在分泌信号驱动的胞外分泌期间进行折叠、和二硫键形成、糖基化,因此演变成完全生物活性形式。酵母还在经济上有利,因为其不需要低效率细胞溶解和蛋白质重折叠。然而,酿酒酵母的蛋白质分泌系统已显示的问题是,根据人蛋白质种类,分泌速率有很大差异。通常,作为高价值人用药物使用的蛋白质难以在酿酒酵母中表达和分泌(韩国专利号10-0798894)。
发明的公开内容
技术问题
关于本发明,发明人进行的关于酵母在生产蛋白质用于人用药物中的应用的大量且全面的研究导致如下发现:毕赤酵母属酵母,一种甲醇营养型酵母物种,可用于在无额外重折叠过程也无用额外氨基酸进行N端修饰的情况下以高表达水平生产可用作药物载体的分泌型免疫球蛋白Fc片段,并且分泌型免疫球蛋白Fc片段可用简单方法纯化,具有最低负载(load)的内毒素或动物衍生型外源病原。
问题的解决方案
本发明的一个目的是提供转化体,其通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属酵母来制备。
本发明的另一目的是提供生产免疫球蛋白Fc片段的方法,包括培养转化体,和从培养物回收免疫球蛋白Fc片段。
本发明的进一步目的是提供通过该方法生产的免疫球蛋白Fc片段,用作药物载体。
发明的有益效果
本发明的重组转化体可克服与大肠杆菌或动物细胞在生产免疫球蛋白Fc片段时用作宿主细胞相关的问题,可用作药物载体,并且可在药物的高效和经济生产中得到应用。
附图简述
图1是示例重组表达载体pPIC9K-IgG4Fc的构建方法的示意图。
图2是示例重组表达载体pPIC9K-mPSCFc的构建方法的示意图。
图3是显示目标基因通过3mg/ml和4mg/ml遗传霉素(Geneticin)整合入选定的多拷贝克隆基因组DNA的PCR图。
实施发明的最佳方式
在这方面的一个实施方式中,本发明涉及通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属酵母而修饰的转化体。
如本文所用,术语“免疫球蛋白”,也被称为“抗体”,指代由免疫系统响应抗原刺激生成并且在警戒(vigilance)期间通过血液和淋巴特异性地结合至具体抗原以发生抗原抗体反应的蛋白质。免疫球蛋白基本上由两条相同的全长轻链和两条相同的全长重链组成,重链之间以及重链和轻链之间通过二硫键连接。重链基于其恒定区氨基酸序列的差异具有五种不同类型:gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε),并且重链包括下列子类:gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)和alpha2(α2)。根据重链恒定区的特征,免疫球蛋白分成五种同种型:IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。代表性同种型IgG进一步分成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4子类。基于本发明的目的,术语“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白分子的功能片段以及完整的免疫球蛋白分子。该功能片段意为保留抗原结合功能的片段,并且包括Fab、F(ab')、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、和Fc。
在免疫球蛋白片段中,Fab包含轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1),并且具有单个抗原结合位点。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的C端具有包含一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)2片段通过Fab′片段铰链区的半胱氨酸残基之间形成的二硫键以一对Fab′片段生成。Fv是最小的抗体片段,其仅包含重链可变区和轻链可变区。scFv(单链Fv)片段包括通过肽连接物彼此连接的重链可变区和轻链可变区,因此以单个多肽链形式存在。而且,Fd片段仅包括重链的可变区和CH1结构域。免疫球蛋白分子的这些功能片段可利用蛋白水解酶(例如,全抗体通过木瓜蛋白酶消化被消化成Fab,通过胃蛋白酶消化被消化成F(ab’)2)或通过基因重组技术获得。
如本文所用,术语“免疫球蛋白Fc片段”指代由贡献两个恒定结构域(CH2和CH3)的两个重链——无轻链和重链可变结构域、恒定重链结构域1(CH1)和轻链恒定结构域(CL1)组成的免疫球蛋白片段。任选地,免疫球蛋白Fc片段可进一步包括铰链区,该铰链区附接至重链的恒定结构域。由于其是可在体内代谢的可生物降解的多肽,免疫球蛋白Fc片段是安全用作药物载体的。另外,免疫球蛋白Fc片段由于其分子量较低而在制备、纯化和缀合物生成方面优于完整免疫球蛋白分子。无Fab片段(Fab片段是异源的,因为抗体与抗体之间其氨基酸序列不同)的免疫球蛋白Fc片段预期大幅增加缀合物的同源性,同时减少引起缀合物的血液抗原性的可能性。
本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是扩展的Fc片段——包括部分或全部重链恒定结构域1(CH1)和/或轻链恒定结构域1(CL1),无重链和轻链可变区——只要其显示基本上相同于或优于传统Fc片段的效果。进一步,本发明的免疫球蛋白Fc片段可由缺失显著部分氨基酸序列的CH2和/或CH3组成。因此,本发明的免疫球蛋白Fc片段可由下列组成:1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域;2)CH1结构域和CH2结构域;3)CH1结构域和CH3结构域;4)CH2结构域和CH3结构域;5)一个或多个恒定结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合;或6)重链各恒定结构域和轻链恒定结构域的二聚体。
另外,本发明的免疫球蛋白Fc片段意图不仅涵盖天然氨基酸序列,而且涵盖其突变体。氨基酸序列突变体意为与天然序列相差一个或多个氨基酸残基的删除、插入、非组成型或组成型取代或其组合的氨基酸序列。例如,IgGFc第214至238、297至299、318至322、或327至331位的氨基酸残基——已知在抗体结合中具有重要作用——可被修饰,从而用作适当的结合位点。另外,多种突变体,例如缺少形成二硫键或天然Fc的若干N端氨基酸的残基或在天然Fc的N端具有额外的甲硫氨酸残基的突变体,是可能的。进一步,可通过去除补体结合基序(例如,C1q结合基序)或ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)基序来消除效应功能。可参考PCT公开号97/34631和96/32478,其关于制备免疫球蛋白Fc片段的氨基酸序列突变体。Fc片段可以是从人和其它动物(包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)分离的天然形式,或可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其衍生物。在前者情况下,将完整免疫球蛋白从人或动物分离,然后酶处理。在用木瓜蛋白酶处理时,完整免疫球蛋白被分成Fab和Fc。胃蛋白酶将完整免疫球蛋白切割成pF’c和F(ab)。利用尺寸排阻色谱可从这些片段分离出Fc或pF’c。优选的是在微生物中衍生自人Fc结构域的重组免疫球蛋白Fc结构域。
基于本发明的目的,免疫球蛋白Fc片段可以是衍生自IgG的Fc片段,如IgG1Fc片段、IgG2Fc片段、IgG3Fc片段、IgG4Fc片段和类似物,优选IgG2Fc片段或IgG4Fc片段,更优选IgG4Fc片段,最优选由表示SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核苷酸序列编码的IgG4Fc片段、或包括由SEQIDNO:10或SEQIDNO:11表示的氨基酸序列的IgG4Fc片段。
免疫球蛋白Fc片段可进行不改变天然蛋白质或肽整体的活性的氨基酸取代。大多数的一般取代发生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly之间。如需,氨基酸可通过例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等被修饰。这些修饰方法在本领域已知(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork,1979)。
如本文所用,术语“转化”或“修饰”指代利用遗传操纵技术通过导入外源遗传物质(无论是否由质粒携载)造成的宿主细胞(包括原核生物、真核生物、动物细胞和植物细胞)的遗传改变。术语“转化体”意为即使细胞分裂多次也稳定保留和表达从外部导入的外源遗传物质(无论是否由质粒携载)的细胞。任何可将核酸物质导入生物体、细胞、组织、器官、或核酸物质的方法可在本发明中被用于实施转化。优选地,可根据宿主细胞选择本领域已知的标准方法。转化酵母宿主一般可利用VanSolingen(J.Bact.,1977,130:946)和Hsiao等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1979,76:3829)描述的方法进行。转化酵母的方法包括但不限于,利用电装置进行的电穿孔,和利用无细胞壁的球形进行的体球形体化。基于本发明的目的,转化体可以是通过将免疫球蛋白GFc基因整合入酵母宿主基因组产生的多拷贝克隆形式。基于本发明的目的,对转化体不赋予任何具体限制,只要其具有包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体。作为实例,可使用巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC041(登录号KCCM11348P),其具有包括免疫球蛋白Fc片段编码多核苷酸的表达载体pPIC9K-IgG4Fc;或巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC042(登录号KCCM11350P),其具有包括免疫球蛋白Fc片段编码多核苷酸的表达载体pPIC9K-mPSCFc。
如本文所用,术语“宿主细胞”意为导入外源遗传物质的靶细胞。可用于本发明的宿主细胞的实例包括但不限于,酵母(例如,巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母、裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)))。优选地,酵母用作宿主细胞,因为其可在无利用额外氨基酸进行N端修饰也无需重折叠过程的情况下表达结构上类似于天然形式的重组免疫球蛋白,并且安全,无动物来源物的污染。更优选的是毕赤酵母属酵母,最优选巴斯德毕赤酵母。
描述能够在适当的宿主细胞中表达目标蛋白的载体的术语“表达载体”,如本文所用,指代这样的基因构建物:包括必要的调控元件,基因插入物可操作地连接于该调控元件,从而在宿主细胞中表达。对表达载体不赋予任何具体限制,只要其携载编码本发明的免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸。基于本发明的目的,表达载体被配置以在转化到毕赤酵母属酵母中后表达免疫球蛋白Fc片段。例如,其可以是由图1的切割图表示的pPIC9K-IgG4Fc、或由图2的切割图表示的pPIC9K-mPSCFc。
术语“可操作地连接”,如本文所用,指代核酸表达调控序列和编码目标蛋白的核酸序列之间功能性连接,从而实现整体功能。与重组载体的可操作的连接可利用本领域公知的基因重组技术来完成,并且位点特异性DNA切割和连接可利用本领域公知的酶来实施。
根据本发明的一个实施方式,构建表达载体pPIC9K-IgG4Fc和pPIC9K-mPSCFc,其分别包括免疫球蛋白Fc片段编码多核苷酸。表达载体pPIC9K-IgG4Fc和pPIC9K-mPSCFc被转化到巴斯德毕赤酵母中,以制备转化体,该转化体被命名为“巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC041”和“巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC042”,并且分别以登录号KCCM11348P和KCCM11350P分别于2013年1月7日和2013年1月10日保藏于韩国微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)(地址是361-221,Hongje-1dong,Seodaemungu,Seoul)。
术语“多拷贝克隆”,如本文所用,指代这样的转化体:其中外源基因的多个拷贝通过在交叉外源基因与特定基因组基因时重组或重排而随机整合入宿主细胞基因组,或在外源基因通过遗传操纵导入宿主细胞后随机整合入宿主细胞位点。总体上,多拷贝克隆可以是如下转化体:其中可通过遗传霉素标记物选择的基因的一个或多个拷贝插入宿主细胞基因组,优选其中可通过3mg/ml或更高的遗传霉素标记物选择的基因的五个或更多个拷贝插入基因组。
根据其另一方面,本发明涉及制备免疫球蛋白Fc片段的方法,包括培养转化体;和从培养物回收免疫球蛋白Fc片段。并且该方法的特征可在于:无需额外的蛋白质重折叠过程。
重组巴斯德毕赤酵母酵母可在本领域已知的适当条件下在适当的介质中培养。本领域技术人员可容易根据所用菌种调整培养方法。
从培养物回收的免疫球蛋白Fc片段可不经进一步纯化而使用,或利用透析、盐析和层析纯化。其中,层析最为广泛使用。不存在可不考虑所用的柱的种类和顺序而普遍适用的规则。根据抗体靶蛋白的特征和培养方法,可在离子交换层析、尺寸排阻层析、亲和层析、疏水层析、和蛋白-A亲和柱中做出选择。
根据其进一步方面,本发明涉及通过该方法制备的免疫球蛋白Fc片段,用作药物载体。作为载体,免疫球蛋白Fc片段与药物一起形成缀合物,并且可增加药物的生物利用度。
如本文所用,术语“药物”表示在被给予人或动物时对其发挥治疗作用的物质。作为非限制性实例,肽、多肽、化合物、提取物和核酸落入药物的范围,其中优选肽或多肽。
如本文所用,术语“载体(carrier)”指代连接至药物、旨在最小化药物的生理活性减少和增加药物体内稳定性的物质。即,本发明提供多种可能的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4Fc片段,用于增加药物的体内持续性和最小化药物的体内活性减少。优选地,提供IgG2Fc和IgG4Fc片段。更优选地,本发明提供IgG4Fc片段。然而,只要其具有体内持续性所需的FcRn受体结合位点,任何Fc片段可落入本发明的范围。
利用本发明的方法制备的免疫球蛋白Fc片段具有下列优点:不需要额外的重折叠过程并且N端不具有额外的氨基酸残基。而且,其可以增加的水平表达,具有最低负载的内毒素或动物来源的病原,并且利用简单方法纯化。由于其是可在体内代谢的可生物降解的多肽,具有这种优点的免疫球蛋白Fc片段可用作药物载体。另外,免疫球蛋白Fc片段由于其分子量较低而在制备、纯化和缀合物生成方面优于完整免疫球蛋白分子。不具有Fab片段(其具有异源性,因为在抗体与抗体之间其氨基酸序列不同)的免疫球蛋白Fc片段预期大幅增加缀合物的同源性,同时减少引起缀合物血液抗原性的可能性。
在IgG的子类中,IgG4最不容易结合至补体(C1q)。在对补体亲和力较低的情况下,Fc片段较不易于介导效应功能如ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)和CDC(补体-依赖性细胞毒性),因此较不易于引起体内不必要的免疫应答。IgG2和IgG4Fc片段的C1q亲和力低于IgG1Fc片段,并且IgG4Fc片段的C1q亲和力最低。关于作为药物载体的应用,缀合至药物的Fc片段优选必须呈现低效应功能,如ADCC和CDC。因此基于本发明的目的,IgG2Fc和IgG4Fc片段是可用的,更优选IgG4Fc片段。即,根据本发明可用作药物载体的免疫球蛋白Fc片段可以是衍生自缺少部分铰链的人IgG4Fc片段或其衍生物的Fc片段,该人IgG4Fc片段或其衍生物由SEQIDNO:10或SEQIDNO:11表示,其可与通过韩国专利号10-824505公开的大肠杆菌转化体HM11201(KCCM-10660P)生成的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
发明的方式
通过下列实施例可获得对本发明的最充分理解,该实施例被提供用于示例,而非解释为限制本发明。
实施例1:巴斯德毕赤酵母中用于生产免疫球蛋白Fc片段的表达载体的构建
如下构建在巴斯德毕赤酵母中表达人免疫球蛋白Fc片段的重组表达载体,以锚定编码人免疫球蛋白Fc片段的核苷酸序列(SEQIDNO:1),该人免疫球蛋白Fc片段由IgG4铰链区和IgG4恒定结构域CH2和CH3组成。
利用韩国专利号10-0725314公开的质粒pBG4CH1-3作为模板,通过PCR获得人免疫球蛋白Fc片段的DNA。首先,正向引物(SEQIDNO:3)被设计以包含SnaBI限制性位点,用于融合至α因子分泌信号序列,同时反向引物(SEQIDNO:4)被配置以具有EcoRI限制性位点。利用这些引物通过PCR扩增编码免疫球蛋白G4Fc片段的DNA。PCR进行30次下列循环:在95℃下变性40sec,在60℃下退火30sec,和在68℃下延伸50sec。
5'-GCTTACGTAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCC-3'(SEQIDNO:3)
5'-CCGGAATTCTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG-3'(SEQIDNO:4)
将由此获得的免疫球蛋白G4Fc片段DNA(ca.700bp)克隆到pPIC9K载体(Invitrogen)中。为与α因子分泌信号序列同在框架内,将免疫球蛋白G4Fc片段的PCR产物用限制性酶SnalBI和EcoRI消化,然后在T4连接酶存在的情况下连接至之前用相同限制性酶处理过的pPIC9K载体。所得重组表达载体包含紧邻α因子分泌信号序列下游的免疫球蛋白G4Fc基因,但通过正向引物表示的SnBI识别位点也留在了载体上,使得免疫球蛋白G4Fc片段,若由该载体表达,在N端会具有两个不期望的氨基酸残基。为删除插入α因子分泌信号序列和免疫球蛋白G4Fc基因之间的接合处的SnaBI识别位点,利用由SEQIDNOS:6和7表示的引物对进行定点突变,所得表达载体被命名为pPIC9K-IgG4Fc(图1)。
5'-GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCA-3'(SEQIDNO:6)
5'-TGGGGGACCATATTTGGACTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTC-3'(SEQIDNO:7)
图1是示例构建重组表达载体pPIC9K-IgG4Fc的方法的示意图。如图1可见,pPIC9K-IgG4Fc表达载体包含在5’醇氧化酶1(AOX1)基因启动子的控制下的SEQIDNO:1的DNA,并且可通过位于免疫球蛋白G4Fc基因下游的3’醇氧化酶1(AOX1)基因整合到宿主细胞的基因组DNA。
实施例2:巴斯德毕赤酵母中用于生产免疫球蛋白Fc片段缺少部分铰链的表达
载体的构建
根据与实施例1所述相同的策略,构建在巴斯德毕赤酵母中用于表达缺少部分铰链区的免疫球蛋白Fc片段的表达载体,以锚定人免疫球蛋白Fc片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2),该人免疫球蛋白Fc片段由IgG4的部分铰链、和IgG4的恒定结构域CH2和CH3组成。
利用韩国专利号10-0725314描述的质粒pBG4CH1-3作为模板,通过PCR获得编码缺少部分铰链区的人免疫球蛋白Fc片段的DNA。
首先,正向引物(SEQIDNO:5)被设计以包含SnaBI限制性位点,用于融合至α因子分泌信号序列,同时反向引物(SEQIDNO:4)被配置以具有EcoRI限制性位点。利用这些引物通过PCR扩增编码免疫球蛋白G4Fc片段的DNA。PCR进行30次下列循环:在95℃下变性40sec,在60℃下退火30sec,和在68℃下延伸50sec。
5'-GCTTACGTACCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCC-3'(SEQIDNO:5)
将由此获得的免疫球蛋白G4Fc片段DNA(ca.680bp)克隆到pPIC9K载体(Invitrogen)中。为与α因子分泌信号序列同在框架内,将免疫球蛋白G4Fc片段的PCR产物用限制性酶SnalBI和EcoRI消化,然后在T4连接酶存在的情况下连接至之前用相同限制性酶处理过的pPIC9K载体。所得重组表达载体包含紧邻α因子分泌信号序列下游的免疫球蛋白G4Fc基因,但通过正向引物表示的SnBI识别位点也留在了载体上,使得免疫球蛋白G4Fc片段,若由该载体表达,在N端会具有不期望的两个氨基酸残基。为删除插入α因子分泌信号序列和免疫球蛋白G4Fc基因之间的接合处的SnaBI识别位点,利用由SEQIDNOS:8和9表示的引物对进行定点突变,所得表达载体被命名为pPIC9K-mPSCFc(图2)。
5'-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTG-3'(SEQIDNO:8)
5'-CAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGA-3'(SEQIDNO:9)
图2是示例构建重组表达载体pPIC9K-mPSCFc的方法的示意图。如图2可见,pPIC9K-mPSCFc表达载体包含在5’醇氧化酶1(AOX1)基因启动子的控制下的SEQIDNO:2的DNA,并且可通过位于免疫球蛋白G4Fc基因下游的3’醇氧化酶1(AOX1)基因整合到宿主细胞的基因组DNA。用该表达载体转化的宿主细胞可通过α因子分泌信号序列驱动,将缺少部分铰链区的免疫球蛋白Fc片段分泌至培养基。
实施例3:转化巴斯德毕赤酵母和选择多拷贝克隆
为用于稳定转化和基因组DNA整合,通过用限制性酶SalI消化,使分别在实施例1和2中获得的重组载体pPIC9K-IgG4Fc和pPIC9K-mPSCFc线性化。线性化的重组IgGFc片段表达载体被设计以通过与宿主的醇氧化酶基因位点重组而整合到宿主的基因组DNA中。巴斯德毕赤酵母KM71和GS115用作所要用实施例1和2获得的重组表达载体转化的宿主。转化通过电穿孔实施,电穿孔已知最普遍和最有效用于酵母。为用于转化,根据InvitrogenUSA提供的方案制备巴斯德毕赤酵母KM71和GS115的球形体。
将10ug各线性化的重组载体与80ul的KM71或GS115球形体充分混合,然后将混合物在冰上的0.2cm-缺口-电击杯中培育5min。然后,在GenePulser电穿孔装置(BIO-Rad)中向电击杯施加2000V,200Ω,25uF的电击,以引起转化。反应混合物中加入1ml的1M冷山梨醇,并散布在MD(最小葡萄糖)琼指平板上,然后将该平板在28℃下培育3天,选择His+阳性转化体。为辨识多拷贝克隆,将MD琼指平板上形成的每种His+阳性转化体均匀地悬浮于1ml无菌蒸馏水中,并将相当于105细胞的量的悬浮液散布在包含不同遗传霉素浓度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/ml)的YPD琼指平板上,然后在28℃下培育5天。将由此选择的抗遗传霉素的多拷贝克隆——包含3.0mg/ml和4.0mg/ml的YPD琼指平板上形成的菌落——进行菌落PCR,以检测免疫球蛋白片段基因是否整合到了基因组DNA。简而言之,PCR利用SEQIDNOS:3和4的引物对来检测免疫球蛋白Fc片段基因的整合,和SEQIDNOS:5和4的引物对来检测编码缺少部分铰链区的免疫球蛋白Fc片段的基因的整合。PCR进行30次下列循环:在95℃下变性40sec,在60℃下退火30sec,和在68℃下延伸50sec(图3)。图3是显示目标基因在通过3mg/ml和4mg/ml遗传霉素选择的多拷贝克隆的基因组DNA中的整合的PCR图。如图3可见,PCR证实免疫球蛋白Fc片段基因整合到宿主细胞的基因组。
通过用携带各自的免疫球蛋白Fc片段基因的表达载体pPIC9K-IgG4Fc和pPIC9K-mPSCFc转化巴斯德毕赤酵母菌株而制备的转化体被命名为“巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC041”和“巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC042”,并且分别于2013年1月7日和2013年1月10日分别以登录号KCCM11348P和KCCM11350P保藏于韩国微生物保藏中心(地址在361-221,Hongje-1dong,Seodaemungu,Seoul)。
虽然以示例为目的公开本发明的优选实施方式,但本领域技术人员会理解各种没有脱离如所附权利要求公开的本发明的范围和精神的改进、增加和取代都是可以的。
Claims (12)
1.转化体,其通过将表达载体导入毕赤酵母属(Pichiasp.)酵母中而修饰,所述表达载体包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸。
2.权利要求1所述的转化体,其中所述毕赤酵母属酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
3.权利要求1所述的转化体,其中所述免疫球蛋白是IgG。
4.权利要求3所述的转化体,其中所述IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.权利要求1所述的转化体,其中所述免疫球蛋白Fc片段包括由SEQIDNO:10或SEQIDNO:11表示的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的转化体,其中所述多核苷酸包括由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表示的核苷酸序列。
7.权利要求1所述的转化体,其中所述表达载体是由图1的切割图表示的pPIC9K-IgG4Fc、或由图2的切割图表示的pPIC9K-mPSCFc。
8.权利要求1所述的转化体,其是巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC041(登录号KCCM11348P)或巴斯德毕赤酵母(Komagataella)HMC042(登录号KCCM11350P)。
9.生产免疫球蛋白Fc片段的方法,包括:
(a)培养权利要求1至8中任一项所述的转化体;和
(b)从培养物回收所述免疫球蛋白Fc片段。
10.由权利要求9所述的方法制备的免疫球蛋白Fc片段,其用作药物载体。
11.权利要求10所述的免疫球蛋白Fc片段,其包括由SEQIDNO:10或SEQIDNO:11表示的氨基酸序列。
12.权利要求9所述的方法,其中所述方法的特征在于不需要额外的蛋白质重折叠过程。
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