KR20140098607A - 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 피키아 속(pichia sp .) 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 상기 배양물로부터 면역글로불린 Fc 단편을 회수하는 단계를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 생산하는 방법 및 상기 방법으로 생산되어 약물의 캐리어로서 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체를 이용하면, 약물의 캐리어로서 사용되는 면역글로불린 Fc 단편을 생산함에 있어 대장균이나 동물 세포등을 숙주로 사용시에 유발되는 문제를 해결할 수 있으므로, 약물의 보다 효과적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 피키아 속(pichia sp .) 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 상기 배양물로부터 면역글로불린 Fc 단편을 회수하는 단계를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 생산하는 방법 및 상기 방법으로 생산되어 약물의 캐리어로서 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편에 관한 것이다.
생명공학 기술의 발전과 함께 현재까지 다양한 질병에 대한 많은 생리활성 폴리펩타이드(단백질) 및 펩타이드 의약품이 개발되어 치료 옵션으로 유용하게 이용되고 있으나, 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 의약품을 환자에게 자주 투여해야 하는 단점이 있다. 따라서 단백질의 안정성을 증가시켜, 단백질 의약품의 생체 내의 농도를 적정 수준으로 유지시키는 것이 단백질 의약품 개발에 있어서 핵심적인 사안이다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 단백질 약물의 생체내 안정성 및 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어, 단백질 제형 변화, 다른 단백질과의 융합, 혹은 단백질 표면에 고분자 물질을 화학적 또는 생물학적 방법으로 부착시키는 등의 다양한 방법들이 시도되고 있으며, 단백질의 안정성을 증가시키기 위한 시도 중 최근 가장 각광을 받고 있는 방법 중 하나가 면역 글로불린과 단백질과의 융합이다.
면역글로불린 및 이의 단편을 이용하여 단백질 약물의 안정성을 높이 고자 하는 시도도 많이 이루어졌는 바, 미국특허 제5045,312호에서는 교차결합체를 이용하여 인간 성장호르몬에 혈청알부민 또는 쥐의 면역글로불린을 결합시킴으로써 변형되지 않은 성장호르몬에 비해 성장호르몬의 활성을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 단백질 약물과 면역글로불린 Fc를 융합시켜 보고자 하는 시도도 이루어졌는데, 인터페론(대한민국 특허공개 제2003-9464호) 및 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-7 수용체 또는 적혈구 생성인자 수용체(대한민국 특허등록 제249572호)를 면역글로불린의 Fc 단편과 융합된 형태로 포유동물에서 발현시키기도 하고, 국제특허공개 제WO 01/03737호에는 사이토카인 또는 성장인자를 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린의 Fc 단편에 결합시킨 융합단백질을 제조하기도 하였다. 또한, 미국특허 제5116964호에서는 면역글로불린 Fc 단편의 아미노 말단 또는 카르복시말단에 유전자 재조합 방법에 의해 융합시킨 단백질을 개시하고 있고, 미국특허 제5349053호에서는 IL-2를 면역그로불린 Fc 단편에 펩타이드 결합을 통해 융합시킨 융합단백질을 개시하고 있다.
그 외에도, 유전자 재조합에 의해 제조된 Fc 융합 단백질의 예로서 인터페론-베타 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 단편의 융합단백질(국제특허공개 제WO 0/23472호), IL-5 수용체와 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질(미국특허 제5712121호)이 개시되어 있다. 또한 미국특허 제 7736653호에서는 면역글로불린 Fc단편을 융합파트너가 아닌 캐리어로 사용하는 기술을 개시하고 있다.
기존의 면역글로불린 또는 면역글로불린 Fc 단편의 생산은 주로 대장균을 이용하였다. 미국의 암젠사는 미국특허 제6,660,843호, 미국특허 공개번호 제20040044188호 및 제20040053845호에서 치료용 단백질 혹은 치료용 단백질 펩타이드 미믹을 제조하고, 그의 아미노 말단 혹은 카르복실 말단에 인간 IgG1 Fc 힌지의 처음 5개 아미노산이 결실된 유도체를 융합시킨 후 대장균 숙주를 사용하여 생산하는 방법을 기술하였다. 그러나 신호시그널 없이 발현되는 융합 단백질은 발현되어 세포질 내에 응집체(inclusion body) 형태로 존재하기 때문에 분리 후 별도의 리폴딩 과정을 거쳐야 한다는 단점을 가진다. 리폴딩 과정을 거치면 단백질의 생산 수율은 저하되고, 상동 또는 이형의 이합체로 존재하는 단백질의 경우에는 이합체로 생성되는 수율이 현저하게 감소되는 문제점이 있다. 또한, 신호 시그널 없이 대장균에서 발현되는 단백질은 대장균의 단백질 발현 체계의 특성상 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 언급한 암젠사의 발현 산물은 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되어 있으며, 이러한 메티오닌 잔기는 인체에 반복 혹은 과량 투여시 면역반응을 유발할수 있다. 또한, 이들은 치료용 단백질을 코딩하는 유전자와 Fc를 코딩하는 유전자를 연결시켜 대장균에서 융합 단백질 형태로 발현시키기 때문에, 대장균에서 발현되기 어렵거나, 대장균에서 발현시 활성에 문제가 있는 치료용 단백질과의 융합체는 생산하기 힘들다는 단점이 있다. 또한, 두 개 단백질의 융합부위는 생체내에는 존재하지 않는 비정상적인 서열이기 때문에 면역계에서 외부물질로 인식되어 면역반응을 일으킬 수도 있다.
상기 기술한 바와 같이, 대장균의 이용은 빠른 성장 속도와 축적된 발효 및 유전 공학 기술로 인하여 치료적으로 유용한 단백질의 생산에 있어서, 비당화 단백질 형태로 높은 발현량을 확보할 수 있다는 장점이 있으나, 첫 번째 아미노 말단에 천연형 단백질에는 없는 메티오닌(methionine)이 첨가된다는 점과 대장균 유래의 발열(endotoxin)물질 제거와 단백질 재구성(refolding)에 따른 정제공정이 복잡하다는 단점이 있다.
또한, 동물세포를 이용할 경우에는 천연형 면역글로불린에 가까운 형태의 당화 단백질로 생산할 수 있다는 장점이 있으나, 생산비용이 매우 높고, 동물 유래 바이러스 또는 단백질의 유입 위험을 감수해야 한다는 단점이 있다. 따라서, 상술한 바와 같은 제한을 해결하고자 하는 요구가 증대되고 있으며, 이를 해결하기 위한 방법으로 대장균과 동물세포의 장점을 모두 지닌 효모를 숙주로 사용하는 방법이 추천되고 있다.
단백질 생산에 주로 이용되는 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속이 대표적이다. 진핵 미생물인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 인체에 대해 안전성이 입증된 미생물로서 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고, 대량배양이 용이하다. 뿐만 아니라 인체단백질과 같은 고등세포 유래의 단백질을 재조합 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능과 당쇄 부가 등과 같은 단백질의 해독 후 수식 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 또한 단백질의 분비시그날에 의한 단백질의 세포외 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행되며 따라서 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합단백질을 생산할 수 있고, 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재 접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다. 그러나, 사카로마이세스 세레비지애를 이용한 단백질 분비시스템의 문제점으로 지적되고 있는 것이 인체단백질의 종류에 따라서 분비율이 현격한 차이를 보여, 고부가가치의 인체의약용 단백질을 생산하고자 할 때 발현 및 분비가 힘든 문제가 자주 발생한다는 것이다(등록특허 10-0798894).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래의 효모를 이용하여 인체의약용 단백질을 생산하는 방법을 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 메탄올 자화 효모의 일종인 피키아 속 효모를 이용하여, 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편을 생산할 경우, 별도의 재접힘(refolding) 과정이 필요치 않고, N-말단에 부가적인 아미노산이 첨가되지 않으며, 분비 발현양이 증가되며, 내독소(endotoxin) 또는 동물 유래의 외래 병원체의 오염 부담을 최소화하고, 정제공정이 단순한 분비성 면역글로불린 Fc 단편을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 피키아 속(pichia sp .) 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고, 상기 배양물로부터 면역글로불린 Fc 단편을 회수하는 단계를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산되어 약물의 캐리어로서 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 피키아 속(pichia sp .) 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 용어 "면역글로불린"이란, "항체(antibody)"라고도 하고, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 생성되며, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미하는데, 기본적으로 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결된 형태로 구성되고, 상기 중쇄의 불변영역 유형(감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 등)과 이의 서브클래스(감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1), 알파2(α2) 등)에 의해 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 등의 다양한 아형(isotype)으로 분류되는데, 대표적인 아형인 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등으로 분류될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역글로불린은 전체(whole) 형태 뿐만 아니라 면역글로불린 분자의 기능적인 단편을 총칭한다. 상기 면역글로불린 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv, Fd, Fc 등을 포함한다. 상기 단편 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)과 1개의 항원 결합 부위를 포함하도록 구성되고, 상기 단편 F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 포함하도록 구성되며, 상기 단편 F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하도록 구성되고, 상기 단편 Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 구성되며, 상기 단편 scFv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만이 펩타이드 링커로 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄의 형태로 구성되고, 상기 단편 Fd는 중쇄 가변영역 및 CH1 도메인으로만 구성된다. 이러한 면역글로불린 분자의 기능적인 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 생산할 수 있다.
본 발명의 용어 "면역글로불린 Fc 단편"이란, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 경우에 따라서는 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 상기 면역글로불린 Fc 단편은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩티드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 면역글로불린 Fc 단편은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 ① CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; ② CH1 도메인 및 CH2 도메인; ③ CH1 도메인 및 CH3 도메인; ④ CH2 도메인 및 CH3 도메인; ⑤ 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합; ⑥ 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체 등이 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호등에 개시되어 있다. 또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusionchromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 단편이다.
본 발명의 목적상 상기 면역글로불린 Fc 단편은, IgG1 Fc 단편, IgG2 Fc 단편, IgG3 Fc 단편, IgG4 Fc 단편 등과 같은 IgG 유래의 Fc 단편이 될 수 있고, 바람직하게는 IgG2 Fc 단편 또는 IgG4 Fc 단편이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 IgG4 Fc 단편이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 IgG4 Fc 단편 또는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc 단편이 될 수 있다.
한편, 상기 면역글로불린 Fc 단편을 구성하는 아미노산은 면역글로불린 Fc 단편의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 수준에서 교환될 수 있다. 상기 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이 될 수 있고, 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있는데, 이들을 유도하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979).
본 발명의 용어 "형질전환"이란, 유전자조작 기법을 사용하여 외부로부터 도입된 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 유전체에 의해 숙주세포(원핵 및 진핵생물, 동물세포 및 식물세포)의 유전형질이 변화되는 현상을 의미하며, 용어 "형질전환체"란 외부로부터 도입 된 플라스미드 유전자 또는 유전체 DNA가 세포분열을 반복 하더라도 안정적으로 유전자를 보유하며, 안정적으로 유전자의 발현을 유지하는 세포를 의미한다. 상기 형질전환을 수행하기 위하여는, 핵산을 유기체, 세포, 조직, 기관 또는 핵산내로 도입하는 어떤 방법도 사용될 수 있고, 바람직하게는 당해 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 반 솔링겐(Van Solingen) 등의 문헌(J. Bact. ,1977, 130:946) 및 히시아오(Hsiao) 등의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 1979, 76:3829)의 방법에 따라 수행된다. 효모의 형질전환 방법에는 전기장치를 이용하는 전기충격유전자전달법(electroporation)과 세포벽의 일부를 제거하여 형질전환하는 스페로플라스팅법(spheroplasting) 방법이 널리 사용되나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상 상기 형질전환체는 형질전환에 의하여 면역글로불린 G Fc 유전자가 숙주인 효모의 유전체(genome)에 삽입되어 다중복제(multi-copy) 클론으로 존재하는 형질전환체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "숙주세포"란, 외부 핵산의 도입 대상이 되는 세포를 의미하며, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp .)과 같은 원핵생물; 진균(예를 들어, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp .)), 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 속(Schizosaccharomyces sp .), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵생물; 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는, 상기 면역글로불린 Fc 단편을 생산하기 위한 본 발명의 목적상, 천연형 면역글로불린과 구조적으로 유사하고, 부가적인 아미노산 첨가 및 재접힘 공정을 요하지 않으며, 또한 동물유래의 오염물질을 최소화 할수 있는 효모를 숙주로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 피키아 속(pichia sp .) 효모를 숙주로 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스 균주를 숙주로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 pPIC9K-IgG4Fc 발현벡터를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작한 형질전환체를 "Pichia(Komagataella) pastoris HMC041"라 명명하고, 2013년 1월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11348P호로 기탁하였고, 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 pPIC9K-mPSCFc 발현벡터를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작한 형질전환체를 "Pichia(Komagataella) pastoris HMC042"라 명명하고, 2013년 1월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11350P호로 기탁하였다.
본 발명의 용어 "다중복제(multi-copy) 클론"이란, 유전자 조작을 통하여 외부로부터 도입 된 유전자가 숙주세포 유전체(genome)의 특정 유전자 또는 특정 부위와의 교차로 인하여 재조합(recombination) 또는 재배열(rearrangement)이 일어나, 여러 개의 외부 유전자가 숙주세포 유전체내로 무작위적으로 삽입되어 있는 형태의 형질전환체를 의미한다. 대체로, 제네티신(Geneticin) 마커에 의해 선별되는 1개 이상의 유전자가 숙주세포 유전체내에 삽입되어 있는 형질전환체가 될 수 있고, 바람직하게는 3mg/ml 이상의 제네티신 마커에서 선별되는 5개 이상의 유전자가 삽입된 형질전환체가 될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고, 상기 배양물로부터 면역글로불린 Fc 단편을 회수하는 단계를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 재조합 피키아 파스토리스 효모를 배양하는 방법은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양물로부터 회수된 면역글로불린 Fc 단편은 정제하지 않은 상태로 사용되거나 또는 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 칼럼의 종류와 순서의 선택에는 어느 경우에나 적용될 수 있는 법칙은 없고 항체의 목적 단백질의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질-A 친화 칼럼 등에서 선택할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산되어 약물의 캐리어로서 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편을 제공한다. 상기 면역글로불린 Fc 단편은 약물의 캐리어로 작용하여 약물과 결합체를 형성하여, 약물의 생체내 이용률을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "약물"이란, 인간이나 동물에게 투여될 경우 치료적 효과를 나타내는 물질을 의미하며, 펩타이드, 폴리펩타이드, 화합물, 추출물, 핵산 등을 포함하고, 바람직하게는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "캐리어"란, 약물과 함께 결합되는 물질을 의미하며, 결합되는 약물의 생리활성의 감소를 최소화하면서 동시에 약물의 생체내 안정성을 증가시키기 위한 용도로 사용된다. 즉, 본 발명은 결합되는 약물의 생체내 지속성 증진과 생체내 활성 감소의 최소화를 위한 캐리어로 여러 가능한 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 단편을 제공함을 특징으로 한다. 바람직하게는 IgG2 Fc 및 IgG4 Fc 단편을 제공함을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 IgG4 Fc 단편을 제공함을 특징으로 하나 면역글로불린의 생체내 지속성에 필요한 FcRn 수용체에 결합하는 부위를 갖고 있는 Fc 단편이면 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 방법으로 제조된 면역글로불린 Fc 단편은 별도의 재접힘(refolding) 과정이 필요치 않고, N-말단에 부가적인 아미노산이 첨가되지 않으며, 분비 발현양이 증가되며, 내독소(endotoxin) 또는 동물 유래의 외래 병원체의 오염 부담을 최소화하고, 정제공정이 단순하다는 장점을 갖는다. 이러한 장점을 갖는 면역글로불린 Fc 단편은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로서 사용될 수 있다. 아울러, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
특히, IgG의 여러 서브클래스 중 특히 IgG4가 보체(C1q)에 대한 결합력이 가장 낮다. 이렇게 보체에 대한 결합력이 저하되면 항체-의존성 세포독성(ADCC, Antibody-dependent cell cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(CDC, Complement-dependet cytotoxicity)이 감소 또는 제거되므로 생체내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않게 된다. 이러한 C1q 결합력은 IgG2 및 IgG4 Fc 단편이 IgG1 보다 낮고, 이 중 IgG4 Fc 단편이 가장 낮다고 알려져 있다. 그러므로, 약물의 캐리어로 사용하기 위해서는 결합되는 Fc 단편의 항체-의존성 세포독성 및 보체-의존성 세포독성과 같은 이펙터(effector) 기능이 보다 낮은 것을 사용하는 것이 바람직하므로, 본 발명의 목적상 IgG2 Fc 및 IgG4 Fc 단편이 바람직하고, 보다 바람직하게는 IgG4 Fc 단편이다. 즉, 본 발명의 약물의 캐리어로서 사용되는 면역글로불린 Fc 단편은 서열번호 10 및 11로 기재되는 인간 IgG4 유래의 Fc 단편 및 힌지 영역 일부가 결실된 Fc 단편이며, 이는 대한민국 등록특허 제10-824505호 에 기재되어 있는 대장균 형질전환체 HM11201(KCCM-10660P)로부터 생산된 단백질과 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 형질전환체를 이용하면, 약물의 캐리어로서 사용되는 면역글로불린 Fc 단편을 생산함에 있어 대장균이나 동물 세포등을 숙주로 사용시에 유발되는 문제를 해결할 수 있으므로, 약물의 보다 효과적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 재조합 pPIC9K-IgG4Fc 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 재조합 pPIC9K-mPSCFc 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 Geneticin 3mg/ml과 4mg/ml에서 선별 된 다중복제클론 형질전환체에서 유전자의 삽입을 확인한 PCR 사진이다.
도 2는 재조합 pPIC9K-mPSCFc 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 Geneticin 3mg/ml과 4mg/ml에서 선별 된 다중복제클론 형질전환체에서 유전자의 삽입을 확인한 PCR 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 면역글로불린
Fc
단편을 생산하기 위한
피키아
파스토리스(
Pichia
pastoris) 발현 벡터의 제작
재조합 효모 피키아 파스토리스에서 인간 면역글로불린 Fc 단편을 발현 할수 있는 발현 벡터를 제작하였다. 상기 발현 벡터는 IgG4 힌지 영역과 IgG4 불변영역의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 염기 서열(서열번호 1)을 포함하며, 다음과 같이 제조하였다.
인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편 DNA는 대한민국 등록특허 제 0725314호에 개시 된 플라스미드 pBG4CH1-3을 주형으로 하여 PCR 방법을 사용하여 합성하였다. 먼저, 순방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 3)는 알파 factor 분비 서열과의 융합을 위하여 SnaB I 제한 효소 부위를 포함하도록 합성하고, 역방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 4)는 EcoR I 제한 효소 부위를 삽입하여 합성하였다. 이를 이용하여 면역글로불린 G4 Fc 단편을 암호화하는 DNA를 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 조건은 어닐링 온도 60℃에서 30초로 하였으며, 연장은 68℃에서 50초로 30 싸이클 수행하였다.
5'-GCTTACGTAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCC-3'(서열번호 3)
5'-CCGGAATTCTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG-3'(서열번호 4)
상기에서 얻어진 면역글로불린 G4 Fc 단편 DNA(약700 bp)를 pPIC9K 벡터(입수처:Invitrogen)에 클로닝하였다. 알파 factor 분비 서열과의 프레임(frame) 을 맞추기 위하여, pPIC9K 벡터를 제한 효소 SnalB I 및 EcoR I으로 처리하고, 상기에서 제조된 면역글로불린 G4 Fc 단편 PCR 산물을 동일한 제한효소로 처리하여 순수 분리한 뒤, T4 DNA 리가제(ligase)로 서로 접합하였다. 상기 결과로 얻어진 발현 벡터는 알파 factor 분비서열 바로 아래 위치에 면역글로불린 G4 Fc 유전자를 포함하나, 클로닝을 용이하게 하기 위하여 순방향 올리고 뉴클레오타이드에 첨가하였던 SnaB I 제한효소 인식 부위 또한 남게 되어, 상기 벡터로부터 발현 된 면역글로불린 G4 Fc 단편의 N 말단에는 원하지 않는 2개의 아미노산이 부가되게 된다. 따라서 알파 factor 분비서열과 면역글로불린 G4 Fc 유전자의 인접 부위에 삽입 된 SnaB I 제한효소 인식부위를 결실하기 위하여, 서열번호 6과 서열번호 7로 기재되는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 특정 부위 치환 돌연변이법을 수행하고, 상기 결과로 얻어진 발현벡터를 pPIC9K-IgG4Fc로 명명하였다(도 1).
5'-GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCA-3'(서열번호 6)
5'-TGGGGGACCATATTTGGACTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTC-3'(서열번호 7)
도 1은 재조합 pPIC9K-IgG4Fc 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다. 상기 도 1에서 보듯이, 상기 pPIC9K-IgG4Fc 발현 벡터는 5' 알코올 옥시다제 1(AOX1) 유전자 프로모터의 조절 하에 서열번호: 1의 DNA 서열을 포함하며, 면역글로불린 G4 Fc유전자의 아래 부위에 위치한 3' 알코올 옥시다제 1(AOX1) 유전자를 통하여 숙주 세포내의 지노믹(Genomic) DNA내로 통합(integration)이 가능하다.
실시예
2: 면역글로불린
힌지
일부 서열이 결실된
Fc
단편을 생산하기 위한 피키아
파스토리스
(
Pichia
pastoris
) 발현 벡터의 제작
힌지 일부 서열이 결실 된 면역글로불린 Fc 단편 발현 벡터는 IgG4 힌지 일부 영역과 IgG4 불변영역의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 염기 서열(서열번호 2)을 포함하며, 실시예 1에 기술한 방법과 동일한 전략으로 제작하였다.
힌지 영역 일부가 결실 된 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편 DNA는 대한민국 등록특허 제 0725314호에 개시 된 플라스미드 pBG4CH1-3을 주형으로 하여 PCR 증폭으로 수득하였다.
먼저, 순방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 5)는 알파 factor 분비 서열과의 융합을 위하여 SnaB I 제한 효소 부위를 포함하도록 합성하고, 역방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 4)는 EcoR I 제한 효소 부위를 삽입하여 합성하였다. 이를 이용하여 면역글로불린 G4 Fc 단편을 암호화하는 DNA를 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 조건은 어닐링 온도 60℃에서 30초로 하였으며, 연장은 68℃에서 50초로 30 싸이클 수행하였다.
5'-GCTTACGTACCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCC-3'(서열번호 5)
상기에서 얻어진 면역글로불린 G4 Fc 단편 DNA(약 680bp)를 pPIC9K 벡터(입수처:Invitrogen)에 클로닝하였다. 알파 factor 분비 서열과의 프레임(frame) 을 맞추기 위하여, pPIC9K 벡터를 제한 효소 SnalB I 및 EcoR I으로 처리하고, 상기에서 제조된 면역글로불린 G4 Fc 단편 PCR 산물을 동일한 제한효소로 처리하여 순수 분리한 뒤, T4 DNA 리가제(ligase)로 서로 접합하였다. 상기 결과로 얻어진 발현 벡터는 알파 factor 분비서열 바로 아래 위치에 면역글로불린 G4 Fc 유전자를 포함하나, 클로닝을 용이하게 하기 위하여 순방향 올리고 뉴클레오타이드에 첨가하였던 SnaB I 제한효소 인식 부위 또한 남게 되어, 상기 벡터로부터 발현 된 면역글로불린 G4 Fc 단편의 N 말단에는 원하지 않는 2개의 아미노산이 부가되게 된다. 따라서 알파 factor 분비서열과 면역글로불린 G4 Fc 유전자의 인접 부위에 삽입 된 SnaB I 제한효소 인식부위를 결실하기 위하여, 서열번호 8과 서열번호 9로 기재되는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 특정 부위 치환 돌연변이법을 수행하였고, 상기 결과로 얻어진 발현벡터를 pPIC9K-mPSCFc로 명명하였다(도 2).
5'-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTG-3'(서열번호 8)
5'-CAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGA-3'(서열번호 9)
도 2는 재조합 pPIC9K-mPSCFc 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다. 도 2에서 보듯이, 상기 pPIC9K-mPSCFc 발현 벡터는 5' 알코올 옥시다제 1(AOX1) 유전자 프로모터의 조절 하에 서열번호: 2의 DNA 서열을 포함하며, 면역글로불린 G4 Fc유전자의 아래 부위에 위치한 3' 알코올 옥시다제 1(AOX1) 유전자를 통하여 숙주 세포내의 지노믹(Genomic) DNA내로 통합(integration)이 가능하며, 알파 factor 분비서열에 의한 힌지 영역 일부가 결실 된 면역글로불린 Fc 단편 단백질을 배양 배지내로 분비할 수 있다.
실시예
3: 효모
피키아
파스토리스
숙주내로의
형질전환 및 다중복제클론의 선별
상기 실시예 1과 2에서 수득 된 재조합 발현 벡터 pPIC9K-IgG4Fc와 pPIC9K-mPSCFc는 안정적인 형질전환 및 지노믹 DNA내로의 삽입을 위하여 제한효소 Sal I으로 처리하여 선형화(linearized) 하였다. 선형화 된 재조합 면역글로불린 Fc 단편 발현 벡터는 숙주의 알코올 옥시다아제 유전자 부위를 통하여 재결합(recombination)의 방법으로 숙주의 지노믹 유전자내로 통합(integration)된다. 상기 실시예 1과 2에서 수득 된 재조합 발현 벡터들의 형질전환을 위한 숙주로 효모 피키아 파스토리스 KM71 및 GS115 균주를 사용하였으며, 형질전환은 여러가지 방법 중 가장 일반화되고 효율이 좋은 전기충격유전자전달법(electroporation) 으로 진행하였다. 형질전환을 위한 피키아 파스토리스 KM71 및 GS115의 스페로플라스트(spheroplast)는 인비트로젠사(Invitrogen, USA)에서 공급하는 매뉴얼에 따라서 준비하였다.
각각 10ug의 선형화 된 재조합 벡터는 80ul의 KM 71과 GS115 스페로플라스트(spheroplast)와 잘 섞은 후, 0.2cm 큐벳에 얼음 안에서 5분간 반응하였다. 반응 후, 큐벳(cuvette)을 바이오 라드사의(BIO-rad) 전기충격유전자 전달장치(electroporation device, gene pulser)에 넣고, 2000V, 200Ω, 25uF의 전기적 충격(pulse)을 가하여 형질전환을 유도하였다. 전기 충격 후, 1ml의 차가운 1M sorbitol을 형질전환 반응물에 첨가하고 MD(minimal dextrose) 한천 배지에 도포하여 28℃에서 3일간 배양하여 His+ 양성 형질전환체를 선별하였다. 다중복제 클론의 선별을 위하여, MD 한천배지에 형성된 His+ 양성 형질전환체들을 1ml의 멸균 증류수를 첨가하여 균등하게 녹이고 다양한 농도(0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/ml)의 제네티신(Geneticin)을 포함하고 있는 YPD 한천 배지에 105 개의 세포에 해당하는 형질전환체 반응물을 도포하고 28℃에서 5일간 배양하여 제네티신(Geneticine)에 내성을 가지는 다중복제 클론을 선별하였다. 이 중에서, 3.0 mg/ml과 4.0 mg/ml의 제네티신(Geneticin)을 포함하고 있는 YPD 한천 배지에서 선별 된 다중복제 클론들의 지노믹 유전자에 면역글로불린 단편 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여, 한천배지에 형성 된 콜로니들을 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 면역글로불린 Fc 단편 유전자의 삽입을 확인하기 위해서 서열번호 3과 4의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였고, 힌지 일부가 결실 된 면역글로불린 Fc 단편의 확인을 위해서 서열번호 5와 4의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 어닐링 온도 60℃에서 30초로 하였으며, 연장은 68℃에서 50초로 30 싸이클 수행하였다(도 3). 도 3은 Geneticin 3mg/ml과 4mg/ml에서 선별 된 다중복제클론 형질전환체에서 유전자의 삽입을 확인한 PCR 사진이다. 상기 도 3에서 보듯이, 상기 PCR로 면역글로불린 Fc 단편 유전자가 숙주세포 지노믹 유전자로 삽입되었음을 확인하였다.
이에, 상기 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 pPIC9K-IgG4Fc 발현벡터를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작한 형질전환체를 "Pichia ( Komagataella ) pastoris HMC041"라 명명하고, 2013년 1월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11348P호로 기탁하였고, 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 pPIC9K-mPSCFc 발현벡터를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작한 형질전환체를 "Pichia(Komagataella) pastoris HMC042"라 명명하고, 2013년 1월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11350P호로 기탁하였다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.
<120> Recombinant yeast transformant and process for preparing
immunoglobulin Fc fragment employing the same
<130> PA130034/KR
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> IgG Fc fragment
<400> 1
gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 120
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccctg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 300
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccatcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600
gaggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 660
aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690
<210> 2
<211> 666
<212> DNA
<213> IgG Fc fragment
<400> 2
ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120
agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180
gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300
ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360
caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540
tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctctgggt 660
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<212> PRT
<213> IgG Fc fragment
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
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<211> 221
<212> PRT
<213> IgG Fc fragment
<400> 11
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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115 120 125
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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Claims (11)
- 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 피키아 속(pichia sp .) 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 피키아 속 효모는 피키아 파스토리스(pichia pastoris)인 것인 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린은 IgG인 것인 형질전환체.
- 제2항에 있어서,
상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 것인 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 서열번호 10 또는 11의 아미노산서열을 포함하는 것인 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 것인 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 발현벡터는 도 1의 개열지도로 표시되는 pPIC9K-IgG4Fc 또는 도 2의 개열지도로 표시되는 pPIC9K-mPSCFc인 것인 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 형질전환체는 Pichia ( Komagataella ) pastoris HMC041(기탁번호 KCCM11348P) 또는 Pichia ( Komagataella ) pastoris HMC042(기탁번호 KCCM11350P)인 것인 형질전환체.
- (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
(b) 상기 배양물로부터 면역글로불린 Fc 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 면역글로불린 Fc 단편의 생산방법.
- 제9항의 방법으로 생산되어, 약물의 캐리어로서 사용될 수 있는 면역글로불린 Fc 단편.
- 제10항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 서열번호 10 또는 11의 아미노산서열을 포함하는 것인 면역글로불린 Fc 단편.
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