CN110551222A - 一种新型双功能抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体包括：第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成。VH为重链可变区，VL为轻链可变区。本发明提供的双功能抗体，半衰期大大提高；且同源二聚体极少，即使出现聚集体，仅一次纯化就可鉴别和去除。

Description

一种新型双功能抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种双功能抗体，具体涉及新型双功能抗体。
背景技术
双特异性抗体(BsAb)又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc片段的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。
双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的2个双特异性抗体产品都属于这个类别，Trion Pharma公司开发的catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。但是blinatumomab抗体，已被证明只有几个小时很短的血液半衰期。
但是目前已有的多种双功能抗体形式普遍面临易聚集、纯化产量低、稳定性差或血液半衰期短等问题。CN104829726A提供了一种双特异性CD19XCD3抗体，但是该抗体易于形成同源二聚体，难以鉴别、去除，极大增加了纯化和鉴定难度，使其工业化应用收到限制。
肝细胞肝癌占原发性肝癌的70-90％，许多病人被确诊时已是晚期不能进行外科手术切除或射频消融等方法。目前临床被批准用于晚期HCC治疗的药物只有Sorafenib、Regorafenib和Lenvatinib多靶点激酶抑制剂，但仍对一些患者治疗有限，迫切需要新的治疗方式联合治疗。重新定向T细胞杀伤癌细胞的策略已被证明能够有效的治疗或辅助治疗癌症，如已经被FDA批准上市的CD3/CD19的双功能抗体Blinatumomab，用于治疗复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病等。目前已有数十个靶向T细胞表面CD3分子来富集T细胞杀伤肿瘤细胞(实体瘤、血液瘤)的双功能抗体正在将进行临床实验。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白类聚糖，通过细胞顶膜上的糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)锚定连接于细胞表面。GPC3是近年发现的HCC细胞表面特异性膜蛋白，是良好的免疫治疗靶点，目前已有几个抗GPC3单克隆抗体，如hGC33(中外制药株式会社，专利号CN101186650A)和YP7(美国国立卫生研究院国家癌症研究所，专利号CN104520331)，被报道能诱发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)抑制肝癌裸鼠移植的生长。
将靶向GPC3的单克隆抗体与靶向T细胞表面CD3构建双功能抗体是治疗GPC3阳性肿瘤的重要方向。目前已有多种双功能抗体形式，但普遍面临易聚集、纯化产量低、稳定性差或血液半衰期短等问题。比如CN107556387A提供了一种链式抗-GPC3/CD3双特异性抗体，虽然能特异地识别并结合GPC3抗原和GPC3过表达的肿瘤细胞，介导T细胞发挥杀伤作用，但是该结构同blinatumomab抗体BITE结构类似，已被证明只有几个小时很短的血液半衰期。
发明内容
本发明解决了现有技术的上述技术问题。本发明提供了一种既能够保持双功能抗体功效，又易于鉴定、纯化和生产的双功能抗体。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体：包括第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成。VH为重链可变区，VL为轻链可变区。
为了进一步降低工业化生产的难度，如纯化、检测等，上述抗体还包括第三功能域，所述第三功能域包括第一Fc结构域和第二Fc结构域，第一Fc结构域与第一VL结构域相连，第二Fc结构域与第二VH结构域相连。
上述抗体，第一功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别CD3抗原的抗体结合位点；第二功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别GPC3抗原的抗体结合位点。
优选的，上述第一功能域包括CD3单克隆抗体的VH-VL功能域(ScFv)，通过铰链与第一人IgG1 Fc功能域相连；上述第二功能域包括抗GPC3单克隆抗体的VH功能域，通过铰链与第二人IgG1 Fc功能域相连。该结构结合GPC3抗原的抗体片段仅为ScFv的VH域，结合CD3抗原的抗体片段为ScFv域。
上述第一功能域与第二功能域通过铰链区二硫键相连。
优选的，对Fc片段改造进行了P329G/L234A/L235A定点突变，减弱Fc介导的ADCC作用和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。两个Fc片段还引入了knob-into-hole技术的点突变以进一步促进两个不对称异源二聚体的形成。氨基酸使用Eu编号。
GPC3/CD3双功能抗体构型见图1。
上述抗GPC3 VH-Fc链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述抗CD3 VH-Fc链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种核苷酸分子，包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示片段。分别可以用于编码GPC3 VH-Fc链和CD3 VH-Fc链。
有益效果
1.CN104829726B提供的双特异性CD19XCD3抗体，不好纯化与鉴定。即使Fc经过改造,利用了静电吸附等多种方式促使其异源二聚化，但仍易形成非目的二聚体，尤其是各自形成同源二聚体后难以鉴别与去除(图9)，使其工业化应用受到限制。而本发明提供的双功能抗体，经实验验证其同源二聚体极少，即使出现聚集体，仅一次纯化经过SDS-PAGE和SCEC_HPLC这些常规方法就可以鉴别是否发生聚集，并且能够有效的纯化、去除杂质。而且，本发明可以表达和生产更多的抗体量。
2.本发明所述双功能抗体的半衰期大大提高，从常规的几个小时提高到十天左右。
3.本发明经纯化的GPC3/CD3双功能抗体为单体，积分后纯度>99.9％，几乎无聚集体。阳性细胞株HepG2、Huh-7及人PBMCs与该双功能抗体具有较强的结合，但与GPC3阴性细胞株SK-Hep-1无结合。此种构型的双功能抗体仍保留与靶细胞较强的亲合力。
4.本发明研究了新型结构的双功能抗体的生物物理特性及体内外生物活性。本发明所述双功能抗体，具有良好的热稳定。
5.本发明所述双功能抗体，呈浓度依赖性的杀伤GPC3阳性细胞，在高E:T比例情况下对GPC3阴性细胞SK-Hep-1无杀伤作用。对HepG2具有较强的杀伤作用，此作用是通过激活初始T细胞分化为CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T亚群。
6.本发明所述双功能抗体在0.4mg/kg就能明显抑制小鼠肝癌移植瘤的生长，证明该抗体能够在体内有效发挥生物功能。
附图说明
图1GPC3/CD3双功能抗体构型简图；
图2GPC3/CD3双功能抗体的纯化检测图；
图3GPC3/CD3双功能抗体的纯度鉴定
图4GPC3/CD3双功能抗体与不同细胞结合力检测
图5GPC3/CD3双功能抗体的热稳定性鉴定
图6GPC3/CD3双功能抗体体外毒性实验
图7GPC3/CD3双功能抗体体外激活人T细胞检测
图8GPC3/CD3双功能抗体体内抑制肝癌异种抑制瘤的生长检测
图9CN104829726B图2所述结构的GPC3/CD3双功能抗体的WB鉴定图
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例
1.GPC3/CD3双功能抗体的构建
将抗CD3单克隆抗体的VH-VL功能域(ScFv)通过铰链连接于人IgG1 Fc功能域，抗CD3单克隆抗体的VH功能域通过铰链连接于人IgG1 Fc功能域，序列进行从头合成并连接在pCDNA3.4瞬时表达载体上(金唯智生物科技公司)。其中，两个Fc片段都进行了P329G/L234A/L235A定点突变(专利号WO20121380831A1)，减弱Fc介导的ADCC作用和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，并且还引入了knob-into-hole技术的点突变(knob：T366W，hole：T366S/L368A/Y407V)以促进两个不对称异源二聚体的形成。氨基酸使用Eu编号。GPC3/CD3双功能抗体构型简图见图1。
2.GPC3/CD3双功能抗体的表达
HEK-293F悬浮细胞、转染试剂及补料均购自北京诺进生物。准备两个EP管各加入500uL基础培养基，分别加入50ug质粒DNA和150uL转染试剂，混匀室温孵育5分钟。将转染试剂稀释液快速加入质粒稀释液中，轻轻混匀，室温孵育15-20分钟。将混合液快速加入50mLHEK-293F细胞悬液中；将293F悬浮细胞放入摇床中培养(37度，140rpm/min)；分别在转染48小时，96小时和144小时后加入293F补料培养基2.5mL(初始体积的5％)；每天检测细胞活率；待细胞活率降至60％左右时，离心收取细胞上清，备用或纯化；第4天收取小量上清进行Western Blot检测。
3.GPC3/CD3双功能抗体的Western Blot鉴定
贴壁或悬浮细胞表达上清离心留上清，分装两管，加入适量非还原SDS上样buffer，其中一管还原剂(DTT或β－巯基乙醇)，煮沸5-10min；上样20ul，NuPAGETM10％Bis-Tris Protein Gels(Invitrogen)120V，2h；转PVDF膜；30V，1h；室温封闭1h：5％脱脂奶粉室温封闭1h；孵育一抗：Mouse anti-His antibody(Santa Cruz)或Mouse anti-human IgG1antibody(Life technology)，4℃过夜；孵育荧光二抗：anti-Mouse IgG(H+L)Alexa FluorPlus 488(Life technology)；显影并分析结果。
图2左图Western blot结果显示GPC3/CD3双功能抗体在非还原条件下分子量约为110kDa，在还原条件下，抗GPC3单链为46kDa左右，均接近理论分子量大小，说明该双功能抗体成功表达。
4.GPC3/CD3双功能抗体的纯化
收集悬浮细胞表达上清，用0.22um滤网过滤后，用protein A亲和柱((CaptoTMSImpAct,GE Healthcare)纯化。用20mM磷酸盐+150mM氯化钠缓冲液平衡柱子(5CV)，3ml/min；上样1ml/min；再用20mM磷酸盐+150mM氯化钠缓冲液平衡柱子(5CV)，3ml/min；用100mM甘氨酸-HCl(pH＝3.0)洗脱液洗脱，3ml/min。将洗脱下的抗体立即用pH9.0的Tris-HCl中和后，用SDS-PAGE初步检测纯度。
图2右图SDS-PAGE结果表明纯化的GPC3/CD3双功能抗体单体的纯度>95％，且在还原条件下存在两条分子量与理论值接近的条带。
图9为采用CN104829727B图2所述结构的GPC3/CD3双功能抗体进行Westblot实验所得到的WB鉴定图。
5.GPC3/CD3双功能抗体的纯度鉴定
仪器：Agilent 1260Infinity II液相色谱仪。用超纯水冲洗柱子(TSKgelSuperSW3000)1h，0.2ml/min；用pH 6.7的100mM硫酸钠+100mM磷酸钠盐流动相A等度洗脱至平衡，0.3ml/min；进样纯化的抗体30ug(浓度0.5mg/ml)，采集25min，分析结果。图3结果证明纯化的GPC3/CD3双功能抗体为单体，积分后纯度>99.9％，几乎无聚集体。
6.GPC3/CD3双功能抗体与细胞结合能力的鉴定
根据GE Ficoll-Paque PLUS试剂盒(GE Healthcare)操作说明分离健康成年捐献者的外周血淋巴细胞(PBMCs)。准备对数生长的靶细胞(Huh-7、HepG2、SK-hep-1(购自中国国家实验细胞资源共享平台)，新鲜分离的人PBMCs)，1×106个细胞/管；加入梯度稀释的GPC3/CD3双功能抗体，4℃孵育1h；用2％FBS-PBS溶液洗涤两遍，加入Mouse anti-HumanIgG Alexa633荧光二抗(Life technology)，4℃孵育30min；用2％FBS-PBS溶液洗涤两遍，上流式细胞仪机器(BD Bioscience)检测并分析结果。
图4.A为GPC3/CD3双功能抗体与不同肝癌细胞及人PBMCs的结合，结果表明HepG2、Huh-7及人PBMCs与双功能抗体具有较强的结合，但与GPC3阴性细胞株SK-Hep-1无结合。图4.B为浓度梯度的双功能抗体与HepG2和人PBMCs结合，计算其半数有效浓度分别为4.8nM和5.5nM，证明此种构型的双功能抗体仍保留与靶细胞较强的亲合力。
7.GPC3/CD3双功能抗体的热稳定性鉴定
热稳定性分析通过MicrolCalTM VP-DSC系统(GE Healthcare)进行测定。用样品缓冲液分别将双功能抗体稀释至0.5mg/ml；将背景缓冲液用真空脱气机脱气5min；将缓冲液分别用注射器加至参比池与样品池中，反复吹打排出气泡，并吸去多余液体；将样品及缓冲液经真空泵脱气5min后进行测定，测定条件为：升温速率60℃/h(1℃/min)，温度范围25-95℃。数据通过系统自带的MicrolCal Origin 7.0(Origin-Lab Corp.，MA)软件进行处理。
图5为DSC数据拟合结果，Tm,onset为蛋白开始展开温度，约54℃；图中左右两个峰分别为Fc的CH2和CH3结构域，经改造与大多数IgG构型双功能抗体热稳定的相似，略低于野生型人IgG1蛋白。
8.GPC3/CD3双功能抗体体外毒性实验
将人PBMCs用RosetteSepTMHuman T Cell Enrichment Cocktail(Stemcell)分离出人T细胞作为效应细胞(E)；准备对数生长期的癌细胞HepG2、Huh-7及SK-Hep-1作为靶细胞(T)；以不同E:T(10:1/5:1/2:1/1:1)比接种于96细胞板，加入梯度稀释的GPC3/CD3双功能抗体37℃孵育48h,随后根据Cell Counting Kit-8试剂盒(博士德生物)操作说明计算抗体对靶细胞的毒性。
图6为GPC3/CD3双功能抗体对GPC3阳性和阴性细胞的毒性作用，结果表明该抗体呈浓度依赖性的杀伤GPC3阳性细胞，在高E:T比例情况下对GPC3阴性细胞SK-Hep-1仍无杀伤作用。已有研究证明Huh-7的GPC3蛋白表达水平低于HepG2，故在E:T比例情况下，不同双功能抗体对HepG2杀伤作用强于Huh-7的结果可能与其GPC3蛋白表达水平有关。
2.8GPC3/CD3双功能抗体体外激活人T细胞
将分离的新鲜人T细胞与对数生长期的癌细胞HepG2以E:T＝5:1的比例接种于96细胞板，加入梯度稀释的GPC3/CD3双功能抗体37℃孵育24h、48h、72h后，取出T细胞并4℃孵育荧光抗体：APC-anti-humanCD3抗体、APC-Cy7anti-Human-CD4抗体、FITC-anti-humanCD8抗体、PE-anti-humanCD69抗体、PE-anti-humanCD25抗体(BD Bioscience)，30min后用2％FBS-PBS溶液洗涤两遍，上流式细胞仪检测并分析结果。
GPC3/CD3双功能抗体已证明对HepG2具有较强的杀伤作用，此作用是通过激活初始T细胞分化为CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T亚群，结果见图7。CD69和CD25为T细胞激活maker，A图表明CD8+及CD4+T细胞在24h时已被激活，B图证实CFSE染料标记的PBMCs在96h后已明显增殖。
2.9GPC3/CD3双功能抗体体内抑制肝癌异种抑制瘤的生长
准备对数生长期的Huh-7细胞，与Matrigel matrix(Corning)1:1混合后皮下注射，NOD/SCID雌鼠(北京维通利华)，每只小鼠细胞接种量为5×106个。每周用卡尺测量肿瘤体积大小(肿瘤体积＝1/2[长×宽2])，待体积长至180-200mm3左右时,进行分组(n＝5)，当天腹腔注射人PBMCs或vehicle，第二天尾静脉给药0.4mg/kg或2mg/kg，每五天测一次肿瘤体积。
图8结果表明相比只注射抗体或人PBMCs的条件下，GPC3/CD3双功能抗体在0.4mg/kg能明显抑制小鼠肝癌移植瘤的生长(P<0.01)，证明该抗体能够在体内有效发挥生物功能。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市畜牧科学院、重庆金迈博生物科技有限公司
<120>一种新型双功能抗体及其用途
<160>
<210> 1
<211> 355
<212> 抗GPC3 VH-Fc 链氨基酸序列
<213> Artificial
<400> 1
QVQLVQSGGG LVQPGGSLRL SCAASYFDFD SYEMSWVRQA PGKGLEWIGS IYHSGSTYYN 60
PSLKSRVTIS RDNSKNTLYL QMNTLRAEDT ATYYCARVNM DRFDYWGQGT LVTVSSSEPK 120
SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY 180
VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL GAPIEKTISK 240
AKGQPREPQV YTLPPCRDEL TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 300
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGKH HHHHH 355
<210> 2 <211> 1065 <212> 抗GPC3 VH-Fc 链碱基序列 <213> Artificial(人工序列)
<400> 2
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tcctgtgcag cctcttattt cgatttcgat tcttatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120
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<210> 3 <211> 471 <212> 抗CD3 VH-Fc 链氨基酸序列 <213> Artificial
<400> 3
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSRGYTNY 60
NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSSG 120
GGGSGGGGSG GGGSQIVLTQ SPAIMSASPG EKVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKSGTSPKRW 180
IYDTSKLASG VPAHFRGSGS GTSYSLTISG MEAEDAATYY CQQWSSNPFT FGSGTKLEIE 240
PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN 300
WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTI 360
SKAKGQPREP QVCTLPPSRD ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 420
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 471
<210> 4 <211> 1413
<212>抗CD3 VH-Fc 链碱基序列 <213> Artificial
<400> 4
CAGGTCCAGC TGCAGCAGTC CGGAGCTGAG CTGGCACGAC CAGGAGCAAG TGTGAAAATG 60
TCCTGTAAGG CCAGCGGCTA CACCTTCACA CGGTATACCA TGCATTGGGT GAAACAGAGA 120
CCCGGGCAGG GACTGGAATG GATCGGGTAC ATTAATCCTA GCCGAGGATA CACAAACTAC 180
AACCAGAAGT TTAAAGACAA GGCTACTCTG ACCACAGATA AGAGCTCCTC TACCGCATAT 240
ATGCAGCTGA GTTCACTGAC ATCTGAGGAC AGTGCCGTGT ACTATTGCGC TAGGTACTAT 300
GACGATCACT ACTGTCTGGA TTATTGGGGC CAGGGGACTA CCCTGACCGT GAGCTCCGGC 360
GGAGGAGGCT CCGGAGGAGG AGGGTCTGGA GGAGGAGGAA GTCAGATCGT CCTGACACAG 420
AGCCCAGCAA TCATGTCAGC CAGCCCCGGC GAGAAAGTCA CAATGACTTG CTCAGCAAGC 480
TCCTCTGTGA GCTACATGAA CTGGTATCAG CAGAAAAGCG GAACCTCCCC CAAGAGATGG 540
ATCTACGACA CATCCAAGCT GGCTTCTGGA GTGCCTGCAC ACTTCAGGGG CAGCGGCTCT 600
GGGACCAGTT ATTCACTGAC AATTTCCGGC ATGGAGGCTG AAGATGCCGC TACCTACTAT 660
TGCCAGCAGT GGAGTTCAAA CCCATTCACT TTTGGATCTG GCACCAAGCT GGAAATTGAG 720
CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA AGCCGCTGGG 780
GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC 840
CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC 900
TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 960
AACAGCACGT ACCGGGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC 1020
AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCGGGG CCCCCATCGA GAAAACCATC 1080
TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTGCA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT 1140
GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGAGC TGCGCCGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 1200
ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 1260
GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC GTGAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG 1320
TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC 1380
ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA 1413

Claims (8)

1.一种抗体，包含了蛋白二聚体，所述蛋白二聚体包括：第一功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点；第二功能域，它包含免疫球蛋白链或特异性识别特定抗原的抗体结合位点，其特征在于：所述第一功能域由第一VH结构域和第一VL结构域组成，第二功能域由第二VH结构域组成；VH为重链可变区，VL为轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗体，还包括第三功能域，所述第三功能域包括第一Fc结构域和第二Fc结构域，第一Fc结构域与第一VL结构域相连，第二Fc结构域与第二VH结构域相连。
3.如权利要求1或2所述抗体，第一功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别CD3抗原的抗体结合位点；第二功能域包含免疫球蛋白链或特异性识别GPC3抗原的抗体结合位点。
4. 如权利要求3所述抗体，所述第一功能域包括CD3单克隆抗体的VH-VL功能域（ScFv），通过铰链与第一人IgG1 Fc功能域相连；所述第二功能域包括抗GPC3单克隆抗体的VH功能域，通过铰链与第二人IgG1 Fc功能域相连。
5.如权利要求1或2所述抗体，所述第一功能域与第二功能域通过铰链区二硫键相连。
6. 如权利要求1所述抗体，所述抗GPC3 VH-Fc 链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7. 如权利要求1或6所述抗体，抗CD3 VH-Fc 链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8. 一种核苷酸分子，包含SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4所示片段。
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