KR20230079458A - Pd-1 효능제 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-인간 PD-1 효능제 항체, 및 류마티스 관절염과 같은 자가면역 장애를 치료하기 위한 또는 이식된 세포 및/또는 조직의 거부를 감소시키기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

PD-1 효능제 항체 및 그의 용도{PD-1 AGONIST ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 의약 분야의 것이다. 보다 특히, 본 발명은 인간 프로그램화된 사멸 1 (PD-1; 또한 CD279로 공지됨)에 대해 지시된 효능작용 항체, 이러한 항-인간 PD-1 효능작용 항체를 포함하는 조성물, 및 자가면역 장애 또는 이식 거부의 치료를 위해 이러한 항-인간 PD-1 효능작용 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역 체크포인트 경로는 자가면역 반응 및 항암 면역 반응 둘 다를 조정한다 (Isakov, N., J. Autoimmune Disorders 2016; 2(2):17). 자가면역 질환 요법에서, 면역 반응이 억제되도록 면역-억제 경로의 효과를 촉진시키는 것, 즉 효능작용하는 것이 바람직하다. 반대로, 암 요법에서는, 면역 반응이 탈억제되거나 자극되도록 면역-억제 경로의 효과를 억제하는 것, 즉 길항작용하는 것이 바람직하다.
PD-1은 유형 I 세포 막 단백질이다. PD-1은 세포외 IgV 도메인에 이어서 막횡단 및 세포내 도메인을 함유하는 연장된 CD28/CTLA-4 패밀리에 속한다. PD-1 경로의 활성화는 면역 세포 활성화의 억제, 예컨대 감소된 세포 증식, 감소된 세포 생존, 및 염증성 시토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα 및 IL-2)의 억제로 이어진다. PD-1은 최근 활성화된 면역 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, NKT 세포, 단핵구, 및 수지상 세포 상에서 발현되고; 그의 발현은 철저히 조절된다. 인간 면역 반응을 조정하는데 있어서 PD-1 매개 신호전달의 중요성은 길항제 PD-1 항체를 사용한 종양학 환자의 치료 성공에 의해 입증되었다. PD-1 길항제 항체로 치료된 암 환자는 치료의 부작용으로서 상이한 자가면역 징후를 갖는 경향이 있다 (Cappelli, L.C., et al., 2017; Hoffman, L., et al., 2016). 또한, 자가면역 질환 활성과 PD-1 경로 사이에 다른 공지된 상관관계가 존재한다. 예를 들어, 급성악화 상태의 SLE 환자는 낮은 PD-L1 발현 (Mozaffarian, N., et al., 2008) 및 PD-1에 대한 자가항체 (Shi, H., et al., 2017)를 갖는 경향이 있다.
따라서, PD-1 매개 신호전달을 증가시키는 것은 자가면역 장애를 관리하기 위한 잠재적인 접근법을 구성하며, 이는 현행 면역조정 요법에 비해 주요 안전성 이익과 함께 현저한 질환 조절 및 반응의 지속성으로 이어질 수 있다. 일반적으로 말하면, 이들 현행 요법은 신체의 면역계 (예를 들어, 코르티코스테로이드 및 시클로포스파미드)를 광범위하게 하향-조절한다. 그러나, PD-1은 대부분 활성화된 면역 세포 상에서 발현된다. 따라서, 항-PD-1 항체는 치료 시간 동안 활성화된 세포를 선택적으로 표적화하고 나머지 면역 세포 레퍼토리는 무손상으로 남기는 잠재력을 갖는다.
본 기술분야는 PD-1 효능작용 항체를 전달하기 위해 노력하고 있다 (Sharpe, A. and Pauken, E., Nature Reviews Immunology (2017)). 어려움은, 적어도 부분적으로, 시험관내 또는 생체내 생리학적 환경에서 PD-1 효능작용을 달성하는데 필요한 복잡한 세포 상호작용의 결과인 것으로 생각된다. 따라서, 치료 항체를 확인하는데 사용되는 검정 또는 모델의 맥락은 PD-1 효능제 항체 활성을 평가할 때 명백하게 중요하다.
미국 특허 출원 공개 US20170088618은, 일부 실시양태에서 및 특정 시험관내 검정에서, PD-1 세포외 도메인과 관련하여 19-22 nM 사이의 KD 값 (비아코어(BIAcore)® T200을 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정된 바와 같음)을 발생시키는 회합 및 해리율을 갖는 효능제로서 거동하는 항-인간 PD-1 항체를 개시한다.
따라서, 1) 최적의 효능제 활성을 위한 바람직한 회합 및 해리율로 인간 PD-1에 결합하고/거나, 2) 생체내 효능을 달성하기 위한 면역학적으로 관련된 맥락으로 인간 PD-1에 대해 효능작용하고/거나, 3) 자가면역 장애의 치료 및/또는 예방, 또는 이식 거부의 예방을 위해 단독요법으로서 충분한 효력을 나타내고/거나, 4) 자가면역 장애의 치료 및/또는 예방, 또는 이식 거부의 예방을 위해 다른 치료제와의 조합 요법의 일부로서 목적하는 활성을 나타내고/거나, 5) 또 다른 항-인간 PD-1 효능제 항체에 의한 자가면역 장애의 치료 동안, 요법이 적어도 1종의 유해 사건 및/또는 비효능 (특히, 효능의 항-약물 항체 (ADA) 매개 감소)으로 인해 중지되는 경우에, 약물 전환을 위한 효과적인 대안을 제공하는 대안적 항-인간 PD-1 항체에 대한 필요가 존재한다.
따라서, 본 발명은 신규 인간화 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 이유로 선행 기술 항-PD-1 항체에 비해 특히 유리하다: 1) 이들은 인간 PD-1 (뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이 PD-1)에 바람직한 회합 및 해리율로 결합함, 2) 이들은 보다 낮은 용량 또는 덜 빈번한 투약으로 치료상 유효할 수 있음, 3) 이들은 시험관내 1차 인간 T 세포 증식을 억제함, 4) 이들은 인간 PD-1 세포 표면 발현을 조절함, 5) 이들은 시험관내 NFAT 리포터 세포 검정에서 T 세포 수용체 신호전달 활성을 억제함, 6) 이들은 낮은 치료 단백질 면역원성 (즉, 항-약물 항체 (ADA)) 잠재력을 가짐, 7) 이들은 인간화 GvHD 모델에서 질환 활성을 감소시킴, 및/또는 8) 루푸스 신염 생체내 모델에서, 이들은:
a) 유의한 및/또는 검출가능한 보체-의존성 세포독성 없이,
b) 인간 PD-1에의 결합에 대해 인간 PD-L1/2와 경쟁하지 않고,
c) 시험관내 검정에서 유의한 및/또는 검출가능한 시토카인 방출을 유도하지 않으면서
면역 세포 활성화를 억제함.
추가로, 본 발명의 예시적인 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체는 또한, 자가면역 장애 및/또는 이식 거부 (즉, 이식편-대-숙주 질환)의 치료를 위한 개발 및/또는 사용에 허용되는, 열적 안정성, 용해도, 낮은 자기-회합, 및 약동학적 특징을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체내 안정성, 물리적 및 화학적 안정성을 나타낸다. 추가적으로, 본 발명의 예시적인 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체를 코딩하는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직한 포유동물 세포주 발현 시스템, 예컨대 CHO에서 항체의 발현을 유의하게 개선시키기 위해 바람직한 코돈을 사용하도록 조작되었다.
본 발명은 유의하게 조작된 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체를 사용하여 면역 체크포인트 자극을 통해 자가면역 및/또는 면역 관용 관련 장애를 예방, 하향조절 또는 호전시키는데 유용한 조성물 및 방법을 제공함으로써, 선행 기술에 비해 진보를 제공한다. 본 발명의 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체는 바람직하게는 면역 반응의 적응 부문의 억제를 통해, 항원 특이적 면역 과정의 폐지를 통해, 및 그에 의해 기저 질환 병리상태를 직접 다루는 것을 통해, 면역 병리상태를 개선시키거나 회복시킬 수 있다. 이러한 항체의 임상적 사용은 장기 지속성 또는 치료될 질환(들)의 완화를 발생시키는 것으로 입증될 수 있다.
본 개시내용은 1) 서열식별번호(SEQ ID NO): 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR); 및 2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는, IgG 이소형 하위부류 1 (IgG1)인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
본 개시내용은 또한 1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
본 개시내용은 또한 a) 1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 효능제 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 효능제 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 상기 언급된 방법에 의해 생산된 항-인간 PD-1 항체를 제공한다.
본 개시내용은 또한 상기 언급된 방법에 의해 생산된 항-인간 PD-1 항체 및 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 또는 서열식별번호: 11 및 12의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 또는 서열식별번호: 11 및 12의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공한다.
본 개시내용은 1) a) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 b) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체; 및 2) 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) a) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 b) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체; 및 2) 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 1) a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체; 및 2) 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 제약 조성물의 항-인간 PD-1 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진다.
본원에 사용된 "PD-1"은 세포외 IgV 도메인에 이어서 막횡단 및 세포내 도메인을 함유하는 연장된 CD28/CTLA-4 패밀리에 속하는 유형 I 세포 막 단백질인, 프로그램화된 사멸 1 (PD-1; CD279)로도 공지되어 있는, 프로그램화된 세포 사멸 1을 지칭한다.
본원에 사용된 "hPD-1" 또는 "인간 PD-1"은 야생형 인간 PD-1, 바람직하게는 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열 (즉, NCBI 참조 서열 NP_005009.2)을 갖는 야생형 인간 PD-1을 지칭한다.
용어 "시노", "시노몰구스" 또는 "시노몰구스 원숭이"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. PD-1 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 상기 용어는 야생형 시노몰구스 원숭이 PD-1, 및 바람직하게는, 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 야생형 시노몰구스 원숭이 PD-1을 지칭하는 것으로 의도된다.
PD-1 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 PD-1 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, PD-1 ECD는 1% 미만의 막횡단 및 세포질 도메인을 갖고, 보다 바람직하게는 PD-1 ECD는 0.5% 미만의 이러한 도메인을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 인간 PD-1 ECD 폴리펩티드는 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같고, 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD 폴리펩티드는 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같다. PD-1 폴리펩티드 ECD는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 인간 PD-1 폴리펩티드 ECD는 다양한 판매업체, 예컨대 시노 바이올로지칼(Sino Biological) (중국 베이징; 참조 #10377-H08) 및 알앤디 시스템즈(R&D Systems) (미국 미네소타주 미네아폴리스; cat. #8986-PD)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 시노몰구스 PD-1 폴리펩티드 ECD는 알앤디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스; cat. #8509-PD)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
본원에 사용된 "항-인간 PD-1 효능제 항체"는 인간 PD-1에 결합하고, 생체내 투여된 경우에, 적어도 1종의 유의하게 경감된 자가면역 활성, 예컨대 항-이중 가닥 DNA (ds-DNA) 역가의 감소, 질환 스코어의 감소 또는 염증성 시토카인의 감소를 발생시키는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "항체 1"은 1) 서열식별번호: 5의 HCDR1 아미노산 서열, 서열식별번호: 6의 HCDR2 아미노산 서열, 서열식별번호: 7의 HCDR3 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 8의 LCDR1 아미노산 서열, 서열식별번호: 9의 LCDR2 아미노산 서열, 서열식별번호: 10의 LCDR3 아미노산 서열을 갖는 LCVR, 서열식별번호: 3의 HCVR 아미노산 서열, 서열식별번호: 4의 LCVR 아미노산 서열, 서열식별번호: 1의 HC 아미노산 서열, 및 서열식별번호: 2의 LC 아미노산 서열을 포함하는 인간 PD-1 결합 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)를 갖고, 중쇄 및 경쇄가 디술피드 결합에 의해 상호연결되고, IgG 이소형 항체인, 조작된 비-자연 발생 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 본 발명의 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "항체"는 IgG 이소형 하위부류 1 (즉, IgG1)인 항체를 지칭하고, 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교결합된 "중쇄" 및 "경쇄"를 갖는다. 경쇄는 각각 중쇄와 디술피드 결합을 형성하고, 2개의 중쇄는 서로의 사이에 2개의 디술피드 결합을 형성한다. 각각의 중쇄는 N-말단 HCVR 및 중쇄 불변 영역 ("HCCR")으로 구성된다. 각각의 경쇄는 N-말단 LCVR 및 경쇄 불변 영역 ("LCCR")으로 구성된다. 특정 생물학적 시스템에서 발현되는 경우, 천연 인간 Fc 서열을 갖는 항체는 Fc 영역에서 글리코실화된다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역 내의 고도로 보존된 N-글리코실화 부위에서 발생한다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다. 항체는 또한 다른 위치에서도 글리코실화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 IgG1 하위유형인 Fc 부분을 함유한다. 인간 IgG1은 Fc-감마 수용체 패밀리 (FcγR) 뿐만 아니라 C1q에 결합하는 것으로 널리 공지되어 있다. 이들 수용체와의 상호작용은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유도할 수 있다.
중쇄의 불변 영역은 CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 함유한다. CH1은 HCVR 다음에 위치하고; CH1 및 HCVR은 Fab의 중쇄 부분을 형성한다. CH2는 힌지 영역 다음 및 CH3 앞에 위치한다. CH3은 CH2 다음에 위치하고, 중쇄의 카르복시-말단 단부에 존재한다. 경쇄의 불변 영역은 1개의 도메인, CL을 함유한다. CL은 LCVR 다음에 위치하고; CL 및 LCVR은 Fab의 경쇄 부분을 형성한다. 바람직하게는, 본 발명의 항-인간 PD-1 효능제 항체의 CL 영역은 인간 카파 하위유형의 것이다 (예를 들어, 서열식별번호: 18).
본 발명의 DNA 분자는 본 발명의 항체의 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄, 경쇄, 가변 중쇄, 및 가변 경쇄) 중 적어도 1개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자이다.
본 발명의 항체의 HCVR 및 LCVR 영역은 프레임워크 영역 ("FR")으로 불리는 보다 보존된 영역이 사이에 배치되어 있는, 상보성 결정 영역 ("CDR")으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에서, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3"으로 지칭되고, 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하는 잔기의 대부분을 함유한다. 카바트 CDR 정의 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))는 항체 서열 가변성을 기초로 한다. 코티아(Chothia) CDR 정의 (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))는 항체의 3차원 구조 및 CDR 루프의 위상을 기초로 한다. 코티아 CDR 정의는, HCDR1 및 HCDR2를 제외하고, 카바트 CDR 정의와 동일하다. 노스(North) CDR 정의 (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))는 다수의 결정 구조를 갖는 친화도 전파 클러스터링을 기초로 한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 항체의 LCVR 및 HCVR 영역 내의 CDR 도메인에 대한 아미노산의 배정은 널리 공지된 카바트 넘버링 규정 (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), 및 노스 넘버링 규정 (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))에 기초한다. 본 발명의 항체의 경쇄 CDR의 경우에, 노스 CDR 정의가 사용된다. 중쇄에서, HCDR1 및 HCDR3 둘 다도 또한 노스 정의를 사용한다. HCDR2는 노스 및 카바트 정의의 하이브리드를 사용한다. 노스 정의는 출발 N-말단 부위를 확인하는데 사용되는 한편, 카바트는 마지막 위치를 정의하는데 사용된다.
HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시키는 것에 의해 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간, 뿐만 아니라 다른 포유동물의 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은, 예를 들어, 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시키는 것에 의해 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간, 뿐만 아니라 다른 포유동물의 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 경우에, 경쇄 불변 영역은 카파 불변 영역이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후에 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 그러한 세포의 검출을 가능하게 하기 위해 선택 마커, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.
본 발명의 항체는 포유동물 세포에서 용이하게 생산될 수 있고, 그의 비제한적 예는 CHO, NS0, HEK293 또는 COS 세포를 포함한다. 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 배양된다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
다양한 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질을 정제할 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 항체 또는 그를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 제공된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 세포 환경에서 발견되는 임의의 다른 거대분자 종이 없거나 실질적으로 없는 단백질, 펩티드, 또는 핵산을 지칭한다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은 관심 단백질, 펩티드, 또는 핵산이 존재하는 거대분자 종의 80% 초과 (몰 기준), 바람직하게는 90% 초과, 및 보다 바람직하게는 95% 초과를 차지한다는 것을 의미한다.
본 발명의 항체, 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 비경구 경로에 의해 투여될 수 있고, 그의 비제한적 예는 피하 투여 및 정맥내 투여이다. 본 발명의 항체는 단일 또는 다중 용량으로 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 환자에게 단독으로 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2012), A. Loyd et al., Pharmaceutical Press])에 의해 제조될 수 있고, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "자가면역 질환" 또는 "자가면역 장애"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 자기-세포 및/또는 조직 또는 이식된 세포 및/또는 조직에 대한 부적절하거나 원치 않는 면역 반응으로부터 발생하는 바람직하지 않은 상태를 지칭한다. 용어 "자가면역 질환" 또는 "자가면역 장애"는 이들이 체액성 또는 세포성 면역 반응에 의해 매개되는지와 상관없이 이러한 상태를 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 자가면역 질환 또는 장애는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD), 실질 기관 이식 거부, 혈관염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 제1형 당뇨병 (T1DM), 다발성 경화증 (MS), 거대 세포 동맥염 (GCA), 건선 (PsO), 건선성 관절염 (PsA), 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 (IBD), 궤양성 결장염 (UC), 강직성 척추염 (AS), 쇼그렌 증후군 (SjS), 자가면역 간염, 경피증, 복강 질환, 애디슨병, 하시모토병, 그레이브스병, 위축성 위염/악성 빈혈, 후천성 생식선기능저하증/불임, 부갑상선기능저하증, 쿰스 양성-용혈성 빈혈, 만성 알레르기성 질환 (예컨대 천식, 고초열, 또는 알레르기성 비염), 크론병, 남성 또는 여성 불임, 베체트병, 베게너 육아종증, 심근염, 근염, 다발근육통 류마티스성 (PMR), 자연 유산, 백반증, 아테롬성동맥경화증, 자가면역 췌장염, 수포성 유천포창, 만성 바이러스 감염 및 중증 근무력증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 목적상, 바람직한 자가면역 질환은 이식편-대-숙주 질환 (GVHD), 실질 기관 이식 거부, 혈관염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 제1형 당뇨병 (T1DM), 다발성 경화증 (MS), 거대 세포 동맥염 (GCA), 건선 (PsO), 건선성 관절염 (PsA), 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 (IBD), 궤양성 결장염 (UC), 강직성 척추염 (AS), 쇼그렌 증후군 (SjS), 자가면역 간염, 및 경피증이다.
본원에 사용된 용어 "약'은 언급된 값 또는 값의 범위의 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트를 의미한다. 예를 들어: "약" 12는 10.8 (포함) 내지 13.2 (포함) 범위의 값을 포함하고; 약 10 중량 퍼센트는 9 (포함) 내지 11 (포함) 중량 퍼센트를 포함하는 구성을 포괄하는 등이다.
인간 PD-1 (서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD, 바람직하게는, 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 인간 PD-1 ECD에 대한 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체의 친화도와 관련하여 본원에 사용된 "결합한다"는, 달리 나타내지 않는 한, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같은, 약 1 x10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 5 x 10-9 M, 약 1 x 10-10 M의 KD를 의미하는 것으로 의도된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 SPR 바이오센서를 사용하는 것을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에 대해, 25℃ 또는 37℃에서 SPR 바이오센서를 사용하는 것을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 5 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 친화도를 가질 것이다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에 대해 각각 약 1.0 x 10-4 내지 약 1.0 x 10-3 및 약 1.3 x 105 내지 약 2.0 x 105의 Kon 및 Koff 값을 가질 것이다 (본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 비아코어®8K 상에서 사용한 SPR에 의해 결정된 바와 같음).
모노클로날 항체와 관련하여, 용어 "인간", "인간화" 및 "완전 인간"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (Weiner LJ, J. Immunother. 2006; 29: 1-9; Mallbris L, et al., J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016; 9: 13-15).
본원에 사용된 용어 "적응 면역"은, 면역 반응의 선천성 부문과 대조적으로, 항원 특이적이고 동일한 항원으로의 재자극 시에 증진된 2차 항원-특이적 면역 반응을 나타내는 면역 반응의 부문을 포함한다.
용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 장애, 상태, 또는 질환의 진행 또는 중증도를 둔화, 차단, 저지, 완화, 정지, 감소 또는 역전시키는 것을 지칭한다.
"유효량"은 연구원, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응 또는 그에 대한 목적하는 치료 효과를 도출할, 본 발명의 항-인간 PD-1 효능제 IgG1 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물의 양을 의미한다. 항체의 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출할 수 있는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 것이다. 이러한 이익은 이식된 기관의 증가된 면역 관용; 안정화된 자가면역 질환 또는 장애; 또는 자가면역 장애의 징후 또는 증상의 개선 등 중의 어느 하나 이상을 포함한다. 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 공지된 기술을 사용하는 것에 의해, 및 유사한 상황 하에서 수득된 결과를 관찰하는 것에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정하는데 있어서, 환자의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 정도, 또는 침범정도, 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택된 투여 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.
본원에 사용된 용어, 치료에 대한 환자의 "유효 반응" 또는 환자의 "반응성"은 본 개시내용의 항체의 투여 시에 환자에게 부여되는 임상 이익 또는 치료 이익을 지칭한다. 이러한 이익은 하기 중 어느 하나 이상을 포함한다: 이식된 기관의 증가된 면역 관용; 안정화된 자가면역 질환 또는 장애; 또는 자가면역 장애의 징후 또는 증상의 개선 등.
본원에 개시된 방법의 잠재적 이점은 허용되는 내약성, 독성 및/또는 유해 사건을 포함한 허용되는 안전성 프로파일로 자가면역 장애를 앓고 있는 환자에서 현저하고/거나 지속적인 완화를 발생시켜, 환자가 치료 방법으로부터 전체적으로 이익을 얻게 할 가능성이다. 본 개시내용의 치료 효능은 미국 류마티스 학회 (ACR) 20, ACR50, ACR70, 건선 면적 및 중증도 지수 (PASI) 50, PASI75, PASI90, PASI100, 전신 홍반성 루푸스 질환 활성 지수 (SLEDAI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 자가면역 장애에 대한 치료를 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 종점에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 면역 세포 활성화 마커, 염증의 측정, 세포-주기 의존성 바이오마커 측정 시각화, 및/또는 통증 평가를 통한 반응의 측정을 포함한, 본 발명의 임의의 특정한 요법의 효능을 결정하기 위한 다양한 다른 접근법이 임의로 사용될 수 있다.
생물제제에 대한 항-약물 항체 형성은 중화 항체의 형성 또는 보다 신속한 약동학으로 인해 치료의 유효성을 감소시킬 수 있다. 일부 드문 예에서, ADA는 또한 안전성 이슈와 연관될 수 있다. 자가면역 질환은 장기 치료를 필요로 하는 만성 질환이다. 따라서, 치료 생물학적 약물 (예를 들어, 치료 항체)이 작용을 멈춘 경우 대안적 치료가 종종 필요하다. 시간 경과에 따른 면역원성으로 인한 도전과제를 극복하기 위해, 심지어 동일한 표적을 표적화하는 것들인 생물제제들, 예를 들어 TNF 억제제들의 순차적 사용이 널리 허용되고, 자가면역 분야의 치료 실무에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Lloyd, S., et al., (2010) The effectiveness of anti-TNFα therapies when used sequentially in rheumatoid arthritis patients: a systematic review and meta-analysis. Rheumatology, 49:2313-21] 참조).
본 개시내용은
1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및
2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x 10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 5 x 10-9 M, 또는 약 1 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 5 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은
1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및
2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 5 x 10-9 M, 약 1 x 10-10 M의 KD로 결합한다.
보다 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 5 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은
1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 5 x 10-9 M, 약 1 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 1 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 PD-1 (즉, 서열식별번호: 13) 또는 인간 PD-1 ECD (예를 들어, 서열식별번호: 14)에, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서를 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 방법 및/또는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 5 x 10-8 M 내지 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다.
본 개시내용은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 항체를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다.
본 개시내용은 1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 2) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 2) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 2) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 항-인간 PD-1 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 2) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-인간 PD-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 방법에 의해 생산된 항-인간 PD-1 항체 및 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 제공한다.
본 개시내용은 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 또는 서열식별번호: 11 및 12의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 또는 서열식별번호: 11 및 12의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유동물 세포를 제공한다.
본 개시내용은 1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체, 및 2) 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하고, 여기서 항체는 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-인간 PD-1 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진다.
면역에 대한 체크포인트로서의 PD-1 경로의 역할이 광범위하게 연구되었다. PD-1 경로가 자극되는 경우, 면역계 활성이 일반적으로 감소하고, 이는 자가면역 장애의 치료, 면역 관용의 유도, 및/또는 이식편 대 숙주 질환의 감소를 위해 사용될 수 있다는 것이 공지되어 있다.
본 개시내용은 자가면역 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 1) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 항체가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 것을 제공한다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용 또한 자가면역 장애가 GVHD, 실질 기관 이식 거부, 혈관염, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, 자가면역 간염, 경피증, 복강 질환, 애디슨병, 하시모토병, 그레이브스병, 위축성 위염/악성 빈혈, 후천성 생식선기능저하증/불임, 부갑상선기능저하증, 쿰스 양성-용혈성 빈혈, 만성 알레르기성 질환 (예컨대 천식, 고초열 또는 알레르기성 비염), 크론병, 남성 또는 여성 불임, 베체트병, 베게너 육아종증, 심근염, 근염, PMR, 자연 유산, 백반증, 아테롬성동맥경화증, 자가면역 췌장염, 수포성 유천포창, 만성 바이러스 감염, 또는 중증 근무력증인 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 항체가 자가면역 장애의 치료에 사용되는 다른 치료제와 조합되어 투여되는 것을 제공한다.
본 개시내용은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 항체가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 요법이 자가면역 장애의 치료를 위한 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애가 GVHD, 실질 기관 이식 거부, 혈관염, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, 자가면역 간염, 경피증, 복강 질환, 애디슨병, 하시모토병, 그레이브스병, 위축성 위염/악성 빈혈, 후천성 생식선기능저하증/불임, 부갑상선기능저하증, 쿰스 양성-용혈성 빈혈, 만성 알레르기성 질환 (예컨대 천식, 고초열, 또는 알레르기성 비염), 크론병, 남성 또는 여성 불임, 베체트병, 베게너 육아종증, 심근염, 근염, PMR, 자연 유산, 백반증, 아테롬성동맥경화증, 자가면역 췌장염, 수포성 유천포창, 만성 바이러스 감염, 또는 중증 근무력증인 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체가 자가면역 장애를 치료하기 위한 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 항체가 자가면역 장애를 치료하기 위한 또 다른 치료제와 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 투여되는 (또는 투여되어야 한다는) 것을 제공한다.
본 개시내용은 자가면역 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 1) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 2) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, IgG1인 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 1) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 2) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 항체가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄로 이루어진 것을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 의약이 자가면역 장애의 치료를 위한 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의약이 GVHD, 실질 기관 이식 거부, 혈관염, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, 자가면역 간염, 경피증, 복강 질환, 애디슨병, 하시모토병, 그레이브스병, 위축성 위염/악성 빈혈, 후천성 생식선기능저하증/불임, 부갑상선기능저하증, 쿰스 양성-용혈성 빈혈, 만성 알레르기성 질환 (예컨대 천식, 고초열, 또는 알레르기성 비염), 크론병, 남성 또는 여성 불임, 베체트병, 베게너 육아종증, 심근염, 근염, PMR, 자연 유산, 백반증, 아테롬성동맥경화증, 자가면역 췌장염, 수포성 유천포창, 만성 바이러스 감염, 또는 중증 근무력증의 치료를 위한 것을 제공한다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 효과)을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다. 정맥내 (i.v.) 또는 비-정맥내 투여, 피하 (s.c.) 국부 또는 전신, 또는 그의 조합을 위한 투여 스케쥴은 전형적으로 단일 볼루스 투여량 또는 연속 주입으로부터 1개월에 다수회 피하 투여, 바람직하게는 1일에 1회 이하, 보다 바람직하게는 1주에 1회 이하, 보다 더 바람직하게는 2주마다 1회 이하, 보다 더 바람직하게는 1개월에 1회 이하, 또는 치료 의사 및 환자의 상태에 의해 지시되는 바와 같은 범위일 것이다. 투여량 및 빈도는 환자를 치료하는 의사(들)에 의해 결정될 수 있다.
실시예 1: 항체 발현 및 정제
항체 1의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열, 완전 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기에 표제 "아미노산 및 뉴클레오티드 서열"의 섹션에 열거되어 있다. 또한, 항체 1의 경쇄, 중쇄, LCVR, 및 HCVR의 아미노산 서열의 서열식별번호는 하기 표 1(a)에 제시된다. 또한, 항체 1의 HC 가변 영역 및 LC 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열에 대한 서열식별번호가 표 1(a)에 제시된다.
항체 1을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 발명의 항체는 본질적으로 하기와 같이 제조 및 정제될 수 있다. 적절한 숙주 세포, 예컨대 비제한적으로 HEK 293 또는 CHO는, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 발현을 코딩하는 단일 벡터, 또는 하나는 중쇄를 코딩하고 하나는 경쇄를 코딩하는 2개의 벡터 (최적의 미리 결정된 HC:LC 벡터 비 (예컨대 1:3 또는 1:2)를 사용함)를 사용하는 항체를 분비하기 위한 발현 시스템으로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다.
포유동물 세포에서의 치료 항체의 효율적인 발현은 종종 치료 항체의 상업적 성공을 위한 중요한 인자이기 때문에, 신호 서열 및 가변 영역에 대한 상업적으로 입수가능한 코돈 최적화 서비스로부터 수득한 일부를 포함하여 다중 코돈 변이체를 시험함으로써 항체 1을 코딩하는 cDNA를 최적화하였다. 각각 항체 1의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 11 및 12에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 안정한 CHO 세포주에서의 코돈 용법과 관련하여 최적화되지 않은 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 항체 1의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유사한 CHO 세포주와 비교하여 증가된 역가 (예를 들어, 바람직하게는, 최대 약 6-배, 보다 바람직하게는, 최대 약 7-배, 보다 더 바람직하게는, 최대 약 8-배, 보다 더 바람직하게는, 최대 약 9-배, 보다 더 바람직하게는, 최대 10-배, 보다 더 바람직하게는 최대 11-배 초과)를 효율적으로 생산하는 세포주를 생성하였다.
항체 1이 분비된 배지는 많은 통상적으로 사용되는 기술 중 임의의 것을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 배지를 Fab 단편을 위해 상용 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 맙셀렉트(MabSelect) 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 또는 카파셀렉트(KappaSelect) 칼럼 (지이 헬스케어)에 적용할 수 있다. 칼럼을 세척하여 비특이 결합 성분을 제거할 수 있다. 결합된 항체를, 예를 들어, pH 구배 (예컨대, 20 mM 트리스 완충제 pH 7에서 10 mM 시트르산 나트륨 완충제, pH 3.0, 또는 포스페이트 완충 염수 pH 7.4에서 100 mM 글리신 완충제, pH 3.0)에 의해 용리시킬 수 있다. 항체 분획을 예컨대 UV 흡수 또는 SDS-PAGE에 의해 검출할 수 있고, 이어서 풀링할 수 있다. 가용성 응집체 및 다량체를 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 다중모드, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 비롯한 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 통상적인 기술을 사용하여 항체를 농축, 완충제 교환, 및/또는 멸균 여과할 수 있다. 생성물을 4-5℃에서 저장하거나, 또는 -80℃에서 즉시 동결시키거나, 또는 동결건조시킬 수 있다.
표 1(a): 항-인간 PD-1 효능제 항체에 대한 서열식별번호
Figure pat00001
표 1(b): PD-1 서열에 대한 서열식별번호
Figure pat00002
실시예 2: 항체 1은 세포 표면 상의 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합한다
본원에 개시된 항-인간 PD-1 효능제 항체가 세포 표면 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하는 능력은 유동 세포측정 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 플라스미드 DNA를 확립된 프로토콜에 따라 전기천공 시스템 (진 펄서 엑스셀(Gene Pulser Xcell); 바이오라드(BioRad))을 사용하여 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-k1; 론자(Lonza)) 내로 형질감염시킴으로써, 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 (즉, 각각 서열식별번호: 13 및 15에 제시된 바와 같음) 발현 안정한 세포를 생성한다. 배양 배지에서 500 μg/mL G418 (써모 사이언티픽)을 사용하여 단일 단리된 세포로부터 안정한 세포를 선택한다. 유동 세포측정법을 위해, 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 1 x 105개 세포/웰의 밀도로 옮긴다. 세포를 1x FACS 완충제 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) #554656)로 세척한다. 항체 1, 또는 대조군 인간 IgG1 (100 마이크로그램/mL에서 시작하여 항체의 3-배 12-포인트 적정으로 FACS 완충제 중에 희석함)을 첨가하고 (100 마이크로리터), 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후, FITC 접합된 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 109-096-170)를 1:200 희석으로 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 시톡스블루(SytoxBlue) (인비트로젠(Invitrogen), # S34857)를 사용하여 살아있는/사멸 세포 염색을 수행한다. 세포를 포르테사(Fortessa), 포르테사 Fx 또는 LSRII 유동 세포측정 기기 상에서 처리한다. 유동 세포측정법 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 기하 평균 형광 강도 (GMFI) 값을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 회귀에 기초하여 상대 EC50을 계산한다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 1은 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1이 발현된 세포 막에 각각 1.30 +/- 0.16 μg/mL 및 1.09 +/- 0.30 μg/mL의 평균 EC50으로 결합할 수 있었다. 이러한 데이터는 항체 1이 인간 및 시노몰구스 원숭이 막 결합된 PD-1 둘 다에 유사한 친화도로 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD에 대한 항체 1 결합 동역학/친화도
인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD에 대한 본 발명의 항-인간 PD-1 효능제 항체의 결합 동역학은 표면 플라즈몬 공명 바이오센서, 예컨대 비아코어®2000, 비아코어®3000, 비아코어® 8K, 또는 비아코어® T100 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 결정할 수 있다. 간략하게 기재하자면, 비아코어® 8K 기기를 사용하여 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 통해 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1-세포외 도메인 (ECD)-His에 대한 항체 1의 결합 동역학을 측정한다. 샘플을 1X HBS-EP+ 구동 완충제 (테크노바(Teknova) cat. # H8022) 중에 용해시키고, 단백질 A 커플링된 CM5 시리즈 S 센서 칩 (지이 헬스케어 Cat #29139131-AA)을 이용하여 mAb를 포획한다. C-말단 8x 히스티딘 태그를 함유하는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1-ECD 단백질이 CHO 세포에서 발현되고, 니켈 하전된 IMAC에 의해 정제한 후 크기 배제에 의해 정제한다.
다중 분석 사이클을 사용하여 결합을 평가한다. 각각의 사이클은 25℃에서 mAb 포획의 경우 10 μl/분의 유량으로, 리간드 회합 및 해리의 경우 30 μl/분의 유량으로 수행한다. 각각의 사이클은 하기 단계로 이루어진다: 유동 셀 2 상에서의 대략 220RU의 포획 수준을 목표로 60s 접촉 시간 동안 2 μg/ml로의 mAb의 주입, 인간 또는 시노몰구스 PD1-ECD-his (4배 연속 희석에 의한 400 nM에서 1.6 nM의 농도 범위)의 150초 주입에 이어 600초 해리기, 및 30초의 접촉 시간에 걸쳐 10 mM 글리신 히드로클로라이드, pH 1.5를 사용한 재생. 각각의 사이클에 대한 회합률 (즉, Kon) 및 해리율 (즉, Koff)을 표준 이중 참조를 이용하여 평가하고, 비아코어 8K 평가의 "1:1 (랭뮤어) 결합" 모델에 병렬 동역학 배치 모드로 피팅한다. 결합 동역학으로부터 관계 KD = Koff/ Kon에 따라 친화도 (KD)를 계산한다.
후속 실험에서, 비아코어를 사용하여, 비아코어® T200에 의해 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 통해 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1-세포외 도메인 (ECD)-His에 대한 항체 1의 결합 동역학을 측정하였다. 37℃에서의 분석을 위해, 결합은 다중 분석 사이클을 사용하여 평가한다. 각각의 사이클은 37℃에서 mAb 포획의 경우 10 μl/분의 유량으로, 리간드 회합 및 해리의 경우 100 μl/분의 유량으로 수행한다. 각각의 사이클은 하기 단계로 이루어진다: 유동 셀 2 상에서의 대략 220RU의 포획 수준을 목표로 2.5 μg/ml로의 mAb의 주입, 인간 또는 시노몰구스 PD1-ECD-his (2-배 연속 희석에 의한 1000 nM에서 1.6 nM의 농도 범위)의 180초 주입에 이어 600초 해리기, 및 30초의 접촉 시간에 걸쳐 10 mM 글리신 히드로클로라이드, pH 1.5를 사용한 재생. Kon, Koff, 및 KD는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 계산된다. 친화도 데이터는 3회의 독립적 실험에서 삼중 측정으로부터 결정된 평균 및 표준 편차로서 보고된다 (평균 ± SD, n = 9).
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 1은 25℃ (n=1) 및 37℃ (n=9)에서 비아코어에 의해 결정된 바와 같이, 표 2에 예시된 바와 같이, 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD1-ECD-his에 결합한다.
표 2. PD-1 ECD에 대한 항체 1 결합의 동역학 및 친화도
Figure pat00003
표 2에 제시된 바와 같이, 항체 1은 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD 둘 다에 나노몰 친화도로 결합하고, 이는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD 둘 다에 대한 유사한 결합 동역학을 입증한다.
실시예 4: 항체 1은 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 차단하지 않는다
PD-L1 및 PD-L2에 대한 PD-1 결합을 차단하는 본 발명의 항체의 능력은 하기와 같이 결정될 수 있다. 간략하게 기재하자면, 인간 PD-1 플라스미드 DNA를 확립된 프로토콜에 따라 전기천공 시스템 (진 펄서 엑스셀; 바이오라드)을 사용하여 CHO-k1 세포 (론자) 내로 형질감염시킴으로써, 인간 PD-1 발현 안정한 세포를 생성한다. 배양 배지에서 500 μg/mL G418 (써모 사이언티픽)을 사용하여 단일 단리된 세포로부터 안정한 세포를 선택한다. 200 μg/mL의, 또는 100 μg/mL에서 시작하여 FACS 완충제 중 12-배 7 포인트 항체 적정의 시험 PD-1 항체를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 FACS 완충제로 2회 세척한다. 세포를 20 μg/mL 비오티닐화된 인간 PD-L1 (아크로스(Acros), #PD-1-H82F3) 또는 PD-L2 (압캠(Abcam), ab198764)를 함유하는 FACS 완충제 50 μl 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, FACS 완충제 중에 1:200 희석된 스트렙타비딘-APC (비디 바이오사이언시스(BD Bioscienses), #554067)를 함유하는 FACS 완충제 100 마이크로리터 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 시톡스블루 (인비트로젠, # S34857)를 사용하여 살아있는/사멸 세포 염색을 수행한다. 세포를 포르테사, 포르테사 Fx 또는 LSRII 유동 세포측정 기기 상에서 처리한다. 유동 세포측정법 데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 평균 형광 강도 (MFI) 값을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 회귀에 기초하여 상대 IC50을 계산한다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 1 및 이소형 대조군 항체는 PD-L1 또는 PD-L2 결합을 차단하지 않았고, PD-1 특이적 길항제 항체 (니볼루맙에 대한 상동체)인 양성 대조군 항체의 IC50은 PD-L1에 대해 0.22 +/- 0.02 μg/mL였고, PD-L2에 대해 0.42 +/- 0.12 μg/mL였다. 이들 데이터는 항체 1이 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 PD-1 결합을 차단하지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 5: 항체 1은 T 세포 수용체 활성화 유도된 NFAT 신호전달을 억제한다
NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자)는 염증성 시토카인, 예를 들어 TNF, IL-2 뿐만 아니라 여러 세포 표면 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 조정함으로써 면역 반응에 대해 T 세포 수용체 활성화를 매개하는데 중요한 역할을 하는 전사 인자이다. 본원에 개시된 항체가 T 세포 수용체 활성화 유도된 NFAT 신호전달을 억제하는 능력은 다음과 같이 측정할 수 있다.
간략하게 기재하자면, NFAT 루시페라제 리포터 및 인간 PD-1 (프로메가(Promega)) 둘 다로 형질감염된 Jurkat T 세포를 인간 CD3 항체 및 THP-1 세포 (ATCC®)로 활성화한다. THP-1 세포 (40,000개 세포/웰)를 100 μl로 백색 96-웰 플레이트 (코닝(Corning), #3917)에 플레이팅한다. 2 μg/mL의 항-인간 CD3 항체 (OKT3) (이바이오사이언스(eBioscience), #16-0037), 및 20 μg/mL의 최종 농도의, 또는 10 μg/mL에서 시작하여 5-배 7-포인트 항체 적정의 치료 항체 (항체 1 또는 이소형 대조군 항체)를 THP-1 세포에 첨가한다. 세포 및 항체 혼합물을 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션한다. PD-1을 발현하는 NFAT-루시페라제 Jurkat 리포터 세포 (50,000개 세포/웰)를 96-웰 플레이트의 THP-1 세포, CD3 항체 및 치료 항체 혼합물에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 종료시, 플레이트를 10분 동안 실온이 되게 한다. 바이오글로(BioGlo) 시약 (프로메가, #G7940) 80 마이크로리터를 웰에 첨가하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 발광은 LMaxII384 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 또는 엔비전 2105 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 의해 준비한다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 1 및 이소형 대조군 항체는 인간 PD-1 NFAT-루시페라제 리포터 세포 활성을 4회의 독립적인 실험으로부터의 평균 IC50 75.2 +/- 37.6 ng/mL로 억제한 반면에, 이소형 대조군 항체는 NFAT 신호전달을 유의하게 억제하지 않았다. 이들 데이터는 항체 1이 T 세포 수용체 활성화 유도된 NFAT 신호전달을 억제할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 항체 1은 인간 1차 T 세포 증식을 억제한다
본원에 개시된 항체가 T 세포 수용체 활성화에 의해 유도된 T 세포 증식을 억제하는 능력은 다음과 같이 측정할 수 있다. 간략하게 기재하자면, 건강한 인간 트리마 LRS (샌디에고 혈액 은행; 캘리포니아주 샌디에고)로부터 피콜 밀도 구배 원심분리 방법을 사용하여 50 mL 원추형 튜브에서 35 mL 희석 혈액 (칼슘 또는 마그네슘 부재 하의 PBS 중에 10배 희석)을 15 mL 37℃ 피콜 (피콜-파크 플러스, 지이 헬스케어; #17144002) 상에 오버레이함으로써 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리한다. 튜브를 실온에서 30분 동안 900xG로 원심분리한다. 세포 계면을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 옮긴다. 최종 부피를 실온에서 PBS (칼슘 또는 마그네슘 부재)로 50 mL로 조정한다. PBS 중에서 2회 세척한 후, 세포를 완전 CTS 배지 (깁코, #A1048501; #A10484-02) 중에 재현탁시킨다.
단리된 인간 PBMC를 CFSE (바이오레전드(Biolegend), cat. #79898)로 표지한다. PBMC를 무혈청 RPMI 중에서 3회 세척한다. 1 μM CFSE의 존재 하의 무혈청 배지에서 5% CO2 하에 37℃에서 20분 동안 CFSE 표지화를 수행한다. CFSE를 완전 CTS 배지로 켄칭하고, 세척 단계가 이어진다.
CFSE 표지된 PBMC (150,000개 세포/웰)를 항체 1 또는 이소형 대조군 항체를 함유하는 각각의 96-웰 둥근 바닥 웰에 첨가한다. 세포를 4 ng/mL 초항원 (스타필로코쿠스 엔테로톡신(Staphylococcal Enterotoxin), SEB) (톡신 테크놀로지스(Toxin Technologies) BT2021MG)으로 5% CO2 하에 37℃에서 72시간 동안 자극한다.
인큐베이션 후 플레이트를 FACS 완충제 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec); #130-091-221)로 세척하고, 인간 Fc 차단 시약 (밀테니 바이오텍, #130-059-901)과 함께 10분 동안 인큐베이션한 후, CD4에 대해 표지된 항체 (바이오레전드, #317426) 및 PD-1 (이바이오사이언스, #17-2799-42)로 30분 동안 얼음 상에서 염색한다. FACS 완충제 중에서 세척한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 시톡스블루 (인비트로젠, # S34857)를 사용하여 살아있는/사멸 세포 염색을 수행한다. 세포를 포르테사 X20 유동 세포측정 기기 상에서 카운트브라이트 비즈 (인비트로젠, #C36950)의 존재 하에 처리하여 세포 수를 정량화한다. 유동 세포측정법 데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 절대 분할 CD4 양성 세포 계수를 CFSE 염색 및 카운트브라이트 비즈를 사용하여 계산한다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 1은 8명의 상이한 공여자에 대해 175 +/- 128 ng/mL의 평균 IC50으로 인간 1차 T 세포 증식을 억제할 수 있는 반면에, 이소형 대조군 항체는 1차 T 세포 증식을 억제하지 않았다. 이들 데이터는 항체 1이 시험관내에서 T 세포 증식을 억제할 수 있음을 입증한다.
실시예 7: 시험관내 시토카인 방출 연구
본 연구의 목적은 항체 1이 비자극 인간 PBMC로부터 시토카인 방출을 유도하는지 여부를 시험하기 위한 것이다.
간략하게 기재하자면, 건강한 대상체로부터 새로이 단리한 PBMC를 플레이트 결합된 항체 1, 또는 대조군 항체와 함께 24시간 동안 0.5 μg 내지 1.5 μg의 적정 범위에 걸쳐 인큐베이션한다. 양성 대조군은 상업적으로 입수가능한 항-인간 CD3ε 항체, OKT3, 및 CD28-특이적 초효능제 치료 항체의 상동체, TGN1412이다. 둘 다의 항체는 생명을 위협할 수 있는 전신 염증 반응 증후군의 한 형태인 시토카인 방출 증후군을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 음성 대조군은 인간 IgG1 야생형 (WT) 이소형 대조군 항체이다. 메소스케일 플랫폼에 기초한 상업적으로 입수가능한 멀티플렉스 검정을 이용하여, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10, 및 TNF-α를 비롯한 5종의 시토카인을 세포 배양 상청액에서 측정한다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 인간 PBMC와 항체 1의 인큐베이션은 0.5, 1, 또는 1.5 μg/웰의 농도에서 IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10, 및 TNF-α에 대해 유의한 수준의 시토카인 방출을 발생시키지 않았다. 대조적으로, PBMC와 항-CD3ε 및 TGN1412 양성 대조군 항체의 인큐베이션은 웰당 1 μg에서, 대부분의 공여자에서 IL-2, IFN-γ, IL-10 및 TNF-α의 강건한 생산을 발생시켰다.
실시예 8: 마우스 이식편-대-숙주 질환 (GVHD) 생체내 모델
인간 PBMC를 주사한 면역결핍 계통에 기초한 이종-GvHD의 인간화 마우스 모델 ("Hu-PBMC 마우스")은 인간 면역 기능을 생체내 연구하기 위한 중요한 도구이다. 본원에 개시된 항체가 마우스를 GvHD로부터 보호하는 능력을 Hu-PBMC 마우스 모델에서 평가한다.
간략하게 기재하자면, 암컷 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, JAX 랩스(JAX Labs), 스톡 #05557)를 케이지당 3마리씩 72℃에서 12시간 명:암주기 하에 수용하고, 사료 및 물은 자유롭게 허용한다 (n=78). 인간 PBMC를 제조업체의 지침 (스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies), 브리티시컬럼비아주 밴쿠버)에 따라 셉메이트 50 피콜 제조 튜브를 사용하여 2명의 공여자 (샌디에고 혈액 은행)로부터 수득한 LRS 튜브에서 단리한다. 새로이 단리한 PBMC를 PBS 중에 1.2 x 108개 세포/mL로 현탁시키고, 100 μL PBMC 현탁액을 사용하여 제0일에 정맥내로 마우스에 생착시키고 (1.2 x 107개/마우스); 36마리의 마우스에게는 공여자 1로부터의 PBMC를 제공하고, 36마리의 마우스에게는 공여자 2로부터의 PBMC를 제공하고, 6마리의 마우스는 비-생착 대조군으로 남겼다. 후속해서 각각의 공여자는 동일한 프로토콜을 따른다. 제1일에, 마우스를 4개의 체중 매칭 군/공여자로 나누고, 이소형 대조군 또는 항체 1을 0.1, 1.0 또는 10.0 mg/kg으로 피하로 투여한다 (200 μL/마우스). 나머지 실험 동안 투여를 매주 2회 계속한다. 건강 점검 및 체중 측정은 상용적으로 수행된다. 출발 체중의 20%가 줄었거나 명백한 곤란 상태에 있는 마우스는 안락사시킨다. 대부분의 이소형 대조군 마우스가 질환의 진행으로 인해 안락사를 필요로 하면, 모든 마우스를 희생시킨다. 모든 안락사된 마우스에 대해, 이소플루란 마취 하에 심장 천자에 의해 FACS 분석을 위한 EDTA 튜브 내로 혈액을 수집하고, 혈장 분석을 위해 원심분리에 의해 정화한다. 체중 및 임상 관찰: 마우스를 BSL2 후드에서 칭량하고, 곤란상태의 임상 징후에 대해 2-3회/주로 평가한다. 이러한 모델에 공통적인 임상 징후는 지저분한 털, 구부러진 몸, 약화, 및 노력성 호흡 또는 움직임이다. 체중 변화는 그의 기준선 체중의 백분율로서 계산된다: (제(x)일 체중/제0일 체중)*100.
혈장 분석: 심장 천자로부터의 혈액을 EDTA 코팅된 튜브 내로 수집하고, 원심분리에 의해 정화하고, 생성된 혈장을 추후 처리를 위해 -80℃에서 저장한다. 혈장 시토카인을 제조업체의 지침에 따라 메소스케일 디스커버리 인간 Th1/Th2 10-V플렉스 (메릴랜드주 록빌)를 사용하여 측정한다.
통계: 데이터를 그래프화하고, 프리즘 소프트웨어 (그래프패드, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 통계를 계산한다. 군 사이의 체중 차이는 터키 사후 검정과 함께 2-원 RM-ANOVA에 의해 결정한다. 말단 혈장 시토카인 수준의 차이는 터키 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA에 의해 결정한다. 시험 군 사이의 차이는 p < 0.05인 경우에 유의한 것으로 간주된다.
본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 공여자 1 또는 공여자 2로부터의 인간 PBMC의 생착은 NSG 마우스에서 현저한 약화에 의해 입증된 바와 같이 GvHD를 도출하였다. 질환 진행은 공여자 1과 비교하여 공여자 2 PBMC가 생착된 마우스에서 보다 신속하였고, 연구는 각각 제26일 및 제40일에 유의한 체중 감소로 인해 종결되었다. 항체 1에 의한 처리는, 어느 하나의 공여자가 생착된 마우스에서의 체중 감소의 감소에 의해 측정된 바와 같이, 질환 진행을 유의하게 약화시켰다. 추가적으로, 항체 1은 질환 진행과 연관된 혈장 인간 Th1 (IFN-γ) 및 Th2 (IL-13) 시토카인의 현저한 증가를 억제하였다. 따라서, 항체 1은 인간화 GvHD 모델에서 질환 진행을 유의하게 감소시킨다.
실시예 9: 루푸스 신염의 Bm12 만성 GvHD 마우스 모델에 대한 hPD-1 KI
인간 루푸스 신염과 유사한 자가-항체 및 병리상태의 발생을 특징으로 하는 만성 GvHD (cGvHD)는 Bm12 마우스에서 C57BL/6 배경에 인간 PD-1을 발현하는 공여자 마우스로부터의 비장세포를 주사하는 것에 의해 유도할 수 있다. 본 실시예 9에 기재된 연구에서, hPD-1 KI 마우스 (C57BL/6-Pdcd1<tm1606.1)로부터의 비장세포를 B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ (Bm12) 마우스 내로 주사한다. 후속적으로, 숙주 마우스에서 dsDNA에 대한 자가항체의 발생 및 신장에서의 면역-복합체 침착을 특징으로 하는, 서서히 진행되는 SLE-유사 질환이 발생한다. 따라서, PD-1 효능제 항체의 활성은 이러한 루푸스 신염 모델에서 하기와 같이 평가될 수 있다.
간략하게 기재하자면, 수컷 인간 PD-1 녹-인 마우스 (타코닉 래보러토리즈(Taconic Laboratories))는 도착 시 9주령이고, 수컷 Bm12 마우스 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories))는 도착 시 11주령이다. 모든 마우스를 케이지당 4마리씩 수용하고, 연구 시작 전 1주 동안 순응하게 한다. 마우스에게 테클라드 글로벌 설치류 식이 2014(Teklad Global Rodent Diet 2014) (하를란) 및 물을 자유롭게 공급한다. 마우스를 68-79℉로 설정된 주위 온도 하에 12-시간 명/암주기로 수용한다. 연구 시작 4일 전에, 마우스를 체중에 기초하여 무작위로 분류하고, 꼬리 닉을 통해 75 μl의 전혈을 수집한다. 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 전혈로부터 혈청을 분리하고, 이를 사용하여 항-dsDNA 역가를 정량화한다. 이어서, 마우스를 하기 처리군으로 분배한다: (1) 10.0 mg/kg hIgG1 이소형 대조군, (2) 1.0 mg/kg 항체 1, (3) 10.0 mg/kg 항체 1. 마우스에게 인간 IgG1 이소형 대조군 또는 항체 1을 제0일에 시작하여 1주에 2회 피하로 투여한다. 처리 개시 후 연구 종료 42일까지 2주마다 마우스로부터의 꼬리 닉을 통해 혈청 샘플을 수집한다.
혈청 항-dsDNA 수준을 맞춤형 ELISA에 의해 측정한다. 플레이트 (96 웰)를 10 μg/ml 송아지 흉선 DNA (알앤디 시스템즈)로 4℃에서 밤새 코팅한다. PBS-트윈 (0.05%)으로 세척한 후, 샘플 2 μl를 첨가하고 (1:100 희석), 1:3으로 연속 희석한다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치)를 1:2000 희석으로 90분 동안 첨가한다. 플레이트를 세척하고, 울트라-TMB (써모사이 피어스(ThermoSci Pierce))를 15분 동안 첨가하고, 1N H2S04로 반응을 정지시킨다. 450 nm 파장에서 OD를 판독하고, EC50 값을 계산한다.
본질적으로 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행된 실험에서, 이중 가닥 DNA에 대한 자가항체 (항-dsDNA) 역가는 항체 1 처리에 의해 연구 과정 동안 용량-의존성 방식으로 감소된다. 1 mg/kg 및 10 mg/kg의 항체 1의 용량에서, 항-dsDNA 수준의 감소는 제28일 및 제42일에 인간 IgG1 이소형 대조군과 통계적으로 유의하였다. 항-dsDNA AUC가 또한 항체 1에 의해 용량-의존적으로 감소되었다. 항체 1은 10 mg/kg에서 항-dsDNA AUC를 인간 IgG1 이소형 대조군보다 유의하게 감소시킬 수 있었다. 따라서, 항체 1은 cGvHD 루푸스 모델에서 질환 진행을 유의하게 감소시킬 수 있다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> PD-1 AGONIST ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> X21715 <150> 62/637,643 <151> 2018-03-02 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Lys Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Thr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 50 55 60 Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Asn Gly Phe Asn Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 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Claims (1)

  1. 인간 PD-1에 결합하는 항체의 용도.
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