CN111448323A - 精确制导的多功能治疗抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型多特异性抗体，其包含亲和力精确微调后的低亲和力单结合域蛋白片段的协同组合来选择性靶向含双靶标的肿瘤细胞及其在治疗中的用途，例如在肿瘤精准免疫治疗中的用途。

Description

精确制导的多功能治疗抗体
技术领域
本发明涉及包含亲和力精确微调的低亲和力单结合结构域片段组合协同作用的新型双特异性和多特异性抗体及其在治疗中的用途，例如在精准免疫治疗中的用途。
背景技术
单克隆抗体(mAb)在针对癌症和其他疾病的临床实践中具有广泛的诊断和治疗潜力。单克隆抗体以裸露形式或连接细胞毒剂(如放射性同位素、药物、毒素或药物前体转化酶)的形式在癌症免疫治疗中发挥重要作用。这些方法获得积极应用，已在不同水平的开发和临床上获得成功。裸露的mAb可能通过与癌细胞上过表达的细胞表面蛋白结合诱导细胞毒性作用，从而达到临床治疗效果。研究表明，这些治疗作用是通过中和毒素或病原体、控制程序性细胞死亡(细胞凋亡)或诱导抗靶标先天性和主动性免疫反应来控制疾病而实现的。
自1975年Cesar Milstein和Georges J.F.Kohler发明单克隆抗体技术以来，由于其特异性靶向和介导免疫效应功能的独特特性，抗体被开发为靶向抗疾病免疫疗法的药物。目前，有60多种已获批准的基于抗体的生物药物，全球年销售额超过5000亿美元。当前第一代抗体药物的成功应用已经促进了制药业的发展，并极大地改善了公众健康。除了针对新型靶标的抗体药物的开发之外，改进组合疗法和创新性双特异性抗体的开发也是未来抗体药物的发展方向。
治疗性抗体已在临床应用中使用了二十多年。当前，临床上有许多抗肿瘤抗体药物，包括Rituxan(1997)、Herceptin(1998)、Mylotarg(2000)、Campath(2001)、Zevalin(2002)、Bexxer(2003)、Avastin(2004)、Erbitux(2004)、Vectibix(2006)、Arzerra(2009)，Benlysta(2011)，Yervoy(2011)、Adcetris(2011)、Perjeta(2012)、Kadcyla(2013)、Opdivo(2014)、Keytruda(2014)、Tecentriq(2016)。这些抗体主要靶向EGFR、Her2、CD20或VEGF，近来靶向CTLA，PD1或PD-L1等。
双特异性抗体是具有双重表位结合特异性的抗体，其中一个特异性是结合第一个表位或靶标的能力，而第二特异性是结合第二个表位或靶标的能力。
在一些实施例中，此类双特异性抗体是用于免疫治疗的潜在有价值的分子。例如，双特异性抗体可以使细胞毒性效应T细胞与靶细胞交联，从而杀死靶细胞。尽管许多双特异性抗体已经显示出体外有效性，但是在临床上被批准用作治疗剂的很少。一种双特异性抗体Catumaxomab(商品名Removab)于2009年在欧洲获得批准。双特异性抗体作为治疗剂缓慢发展的原因之一是难以以足够的纯度和数量来生产它们。
通过化学交联、杂交杂交瘤或转染瘤，或通过在两个不同Fab'的铰链处进行二硫键交换，可以生产双特异性抗体。第一种方法获得的产品不均一和不确定。第二种方法需要从许多杂交抗体副产物中纯化双特异性抗体，这可能会干扰细胞的交联活性。二硫键交换方法基本上仅适用于F(ab')2，因此受到单克隆抗体通过酶消化裂解的敏感性的限制。此外，由于Fab'彼此之间的亲和力很小，因此形成Fab'之间的二硫键需要非常高的蛋白质浓度。通过使用Ellman试剂在氧化一个Fab'之前修饰另一个Fab'，已经改进了二硫键交换方法，从而降低了同二聚化的发生率。但是，即使进行了这种改进，也很难以高于50％的产率来生产异二聚化F(ab')2。
然而，安全问题、低反应率和成效有限是当前抗体药物的普遍现实问题。这些缺点源自对正常组织/细胞的脱靶效应，因为抗体的表位或靶标通常来自自身抗原、免疫效应细胞的抑制性微环境和非预期的Fc介导的效应子功能等。因此，迫切需要用于以高纯度和更安全的设计有效生产双特异性抗体和其他类似化合物的改进方法。
发明内容
一方面，本发明提供了工程化的双特异性抗体，包括：(1)包含第一抗原结合结构域的第一链，该第一抗原结合结构域结合第一靶标，并且具有约10-5～10-8M的亲和力；(2)包含第二抗原结合结构域的第二链，该第二抗原结合结构域结合第二靶标，并且具有约10-5～10-8M的亲和力；其中所述第一抗原结合结构域连接至所述双特异性抗体的重链第一恒定区的N末端，其中所述第二抗原结合结构域连接至所述双特异性抗体的轻链的N末端，其中所述第一靶标和第二靶标均共定位在靶细胞上；并且其中所述双特异性抗体能达到约10-9～10-12M的协同亲和力来选择性结合含所述双靶标的靶细胞，而不是仅表达所述第一靶标或所述第二靶标的单靶细胞。
在某些方面，第一靶标和第二靶标选自肿瘤靶标、疾病特异性受体和免疫调节功能靶标。
在某些方面，肿瘤靶标选自Her2，CEA，ROR2，TROP2，mGluR1和EGFR等。
在某些方面，检查点受体选自PD-L1，CD47，LAG3，CD59和Tim 3等。
在某些方面，轻链包含以下序列中的任何一个：Seq ID No.1,Seq ID No.2,SeqID No.3,Seq ID No.4,Seq ID No.5,Seq ID No.6,Seq ID No.7,Seq ID No.8,Seq IDNo.9,Seq ID No.10,Seq ID No.11,Seq ID No.12,Seq ID No.30,Seq ID No.31,Seq IDNo.34,Seq ID No.35,Seq ID No.38,Seq ID No.39,Seq ID No.42和Seq ID No.43.。
在某些方面，上述抗体的重链包含以下序列中的任何一个：SEQ ID No.1，No.2，No.3，No.4，No.36，No.37，No.40，No.41；上述抗体的轻链包含以下序列中的任何一个：SEQID No.5，No.6，No.7，No.8，No.38，No.39，No.42，No.43，其中所述抗体结合Her2和CD47双阳性靶细胞。
在一些方面，上述抗体的重链包含SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.28，No.29，No.32，No.33序列中的任何一个。上述抗体的轻链包含SEQ ID No.9，No.10，No.11，No.12，No.30，No.31，No.34，No.35序列中的任何一个。其中所述抗体结合PD-L1和CD47双阳性靶细胞。
在另一方面，本发明提供了工程化的三特异性抗体，其包括：(1)包含第一抗原结合结构域的第一链，该第一抗原结合结构域结合第一靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力；(2)包含第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的第二链，该第二抗原结合结构域结合第二靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力，该第三抗原结合结构域结合第三靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力；其中所述第一抗原结合结构域连接至所述三特异性抗体的重链第一恒定区的N末端，其中所述第二抗原结合结构域连接至所述三特异性抗体的轻链的N末端，其中所述第一靶标和第二靶标均共定位在相同的靶细胞上；并且其中所述三特异性抗体能达到约10-9～10-12M的协同亲和力来选择性结合含所述双靶标的靶细胞，而不是仅表达所述第一靶标或所述第二靶标的单靶细胞。其中所述第三抗原结合结构域位于所述三特异性抗体的轻链的C末端连接；并且其中所述第三靶标是效应子功能靶标或调节因子靶标；并且其中所述第三抗原结合结构域能有效介导对靶细胞的效应细胞功能或调节因子功能。
在某些方面，第一靶标和第二靶标选自肿瘤靶标、疾病特异性受体和免疫调节功能靶标。
在某些方面，肿瘤靶标选自Her2，CEA，ROR2，TROP2，mGluR1和EGFR。
在某些方面，检查点受体选自PD-L1，CD47，LAG3，CD59和Tim 3。
在某些方面，第三靶标选自CD3，CD16a和CD59。
在某些方面，重链包含以下序列中的任何一个：Seq ID No.1,Seq ID No.2,SeqID No.3,Seq ID No.4,Seq ID No.5,Seq ID No.6,Seq ID No.7,Seq ID No.8,Seq IDNo.9,Seq ID No.10,Seq ID No.11,Seq ID No.2,Seq ID No.28,Seq ID No.29,Seq IDNo.32,Seq ID No.33,Seq ID No.36,Seq ID No.37,Seq ID No.40,Seq ID No.41,Seq IDNo.60,Seq ID No.61,Seq ID No.66,Seq ID No.67,Seq ID No.68,和Seq ID No.69。
在一些方面，轻链包含以下序列中的任何一个：Seq ID No.44,Seq ID No.45,SeqID No.46,Seq ID No.47,Seq ID No.48,Seq ID No.49,Seq ID No.50,Seq ID No.51,SeqID No.52,Seq ID No.53,Seq ID No.54,Seq ID No.55,Seq ID No.56,Seq ID No.57,SeqID No.58,Seq ID No.59,Seq ID No.62,Seq ID No.63,Seq ID No.64和Seq ID No.65。
在某些方面，上述抗体的重链包含以下序列中的任何一个：SEQ ID No.1，No.2，No.3，No.4，No.36，No.37，No.40，No.41。上述抗体的轻链包含以下序列中的任何一个：SEQID No.5，No.6，No.7，No.8，No.52，No.53，No.54，No.55，No.56，No.57，No.58，No.59。其中所述抗体结合Her2和CD47双阳性靶细胞。
在某些方面，上述抗体的重链包含以下序列中的任何一个：SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.28，No.29，No.32，No.33；上述抗体的轻链包含以下序列中的任何一个：SEQID No.9，No.10，No.11，No.12，No.44，No.45，No.46，No.47，No.48,No.49,No.50,No.51，其中所述抗体结合PD-L1和CD47双阳性靶细胞。
在另一方面，本发明提供了如上所述的抗体，其用于制备用于治疗癌症或与之相关的病症的药物。
在另一方面，本发明提供了一种治疗癌症或与之相关的病症的方法，其包括向人施用在治疗上有效剂量的上述抗体。
在另一方面，本发明提供了使用本发明提供的抗体治疗需要治疗的受试者的方法。
在一些实施例中，停止治疗后个体可以产生持续应答。
在一些实施例中，免疫治疗被连续不断的间歇性的进行。
在一些实施例中，个体患有结肠直肠癌，黑色素瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，血液系统恶性肿瘤或肾细胞癌。
在一些实施例中，其中抗体是静脉注射,肌肉注射，皮下，局部，口服，经皮，腹膜内，眶内，通过植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内给药。
在一些实施例中，本发明的治疗组合或药物组合物还包含有效剂量的另外的治疗剂，例如抗癌剂。
在一些实施例中，该抗癌剂是抗代谢物，拓扑异构酶I和II的抑制剂，烷化剂，微管抑制剂，抗雄激素剂，GNRh调节剂或其混合物。
在一些实施例中，另外的治疗剂是化学治疗剂，选自它莫西芬，雷洛昔芬，阿那曲唑，依西美坦，来曲唑，依马他尼，紫杉醇，环磷酰胺，洛伐他汀，米诺斯，吉西他滨，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，多西他赛，戈舍瑞林，长春新碱，长春花碱，诺考达唑，替尼泊苷，依托泊苷，吉西他滨，埃博霉素，长春瑞滨，喜树碱，柔红霉素，放线菌素D，米托蒽醌，吖啶，阿霉素，表柔比星或伊达比星。
在另一方面，本发明提供了用于在需要这种治疗的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用本发明提供的治疗性组合物或药物组合物。
在一些实施例中，疾病状况是肿瘤。
在一些实施例中，疾病状况包括异常的细胞增殖。
在一些实施例中，异常细胞增殖包括癌前病变。在一些实施例中，异常增殖是癌细胞的。
在一些实施例中，所述癌症选自：乳腺癌，结肠直肠癌，弥散性大B细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，滤泡性淋巴瘤，胃癌，胶质母细胞瘤，头颈癌，肝细胞癌，肺癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和肾细胞癌。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明提供的治疗性组合物，还包含说明书。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考下面的详细说明，可以更好地理解本发明的特征和优点，以下详细说明阐述了说明性实施例，在这些说明性实施例中包含了本发明的原理及其附图：
图1描绘了精确制导的多功能治疗抗体(GCT Ab)。它具有以下特征：(1)对双靶点结合域的亲和力精确微调的安全性配对结合；(2)具有协同靶点和效应子功能的双特异性和三特异性抗体设计；(3)多功能抗体中每个靶向结合域的二价性质；(4)具有持久的PK和标准生产的IgG抗体形式，且没有意想不到的有害效应子功能的Fc区。这些特征组合决定了GCT Ab为高效的抗体药物。
图2A-F描绘了基于单结合域的Fab和IgG抗体形式。A：单价双特异性抗体片段。B：双二价双特异性抗体(DBB Ab)。C：单价三特异性抗体片段。D：单价四特异性抗体片段。E：单价三特异性抗体-白蛋白药物。F：精确制导的多功能治疗抗体(GCT Ab)。
图3A和3B描绘了针对更安全的特异性靶向的亲和力精确微调。3A：TCR和CD4/CD8共受体与MHC肽的协同结合。3B：GCT中一对结合域的精细关联，可安全介导杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞。
图4描绘了双特异性GCT抗体ABP366和ABP336。左图描绘了GCT抗体ABP366，其包含针对HER2的工程化单结构域抗体，其通过连接子与CH1的N末端连接；和针对CD47的工程化SIRPa单结合域，其通过连接子与CK的N末端连接。IgG1的Fc保持为野生型。右图描绘了GCT抗体ABP336，它包含针对CD47的工程化SIRPa单个结合域，其通过接头与CH1的N端相连；和针对PD-L1的工程化PD-1单结合域，其通过接头与CK的N末端相连。IgG1的P329G-LALA突变体Fc用于保留长PK，同时消除Fc效应子功能的潜在有害作用。
图5A-5D显示了双特异性GCT抗体针对HER2和CD47的ELISA结合结果。5A显示针对HER2的亲本个体结合域抗体，而5B显示针对CD47的亲本个体结合域抗体。
5C和5D分别显示了与HER2和CD47结合的GCT抗体AbD066和AbD068-1。
图6A和6B显示了通过流式细胞术检测到的双特异性GCT抗体AbD066和AbD068-1分别针对HER2和CD47的的细胞表面染色结果。6A和6B的左上图显示阳性细胞的百分比，而6A和6B的右上图显示染色的细胞群体的荧光强度中值(MFI)。图6A和6B的下图显示了一组4个细胞群体的重叠直方图染色结果(黑色填充：对照细胞；空虚线：HER2+单阳性细胞；空实线：CD47+单阳性细胞；淡色虚线：CD47+HER2+双阳性细胞)。
图7显示了双特异性GCT抗体针对PD-L1和CD47的ELISA结合结果。上图显示了针对PD-L1的亲本个体结合域抗体，中图和下图分别显示了与PD-L1和CD47结合的GCT抗体AbD036和AbD037。HAC针对PD-L1的高亲和力抗体和CV 1针对CD47的高亲和力抗体用作阳性对照。
图8A和8B显示了通过流式细胞术检测到的AbD036和AbD037的双特异性GCT抗体分别针对PD-L1和CD47的细胞表面染色结果。8A和8B的左上图显示阳性细胞的百分比，而8A和8B的右上图显示染色的细胞群体的荧光强度中值(MFI)。8A和8B的下图显示了一组4个细胞群体的重叠直方图染色结果(黑色填充：对照细胞；空虚线：PD-L1单阳性细胞；空实线：CD47单阳性细胞；淡色虚线：CD47和PD-L1双阳性细胞)。
具体实施方式
以下对本发明的一些方面进行了描述，并以实施例进行了说明。应当理解，以下阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。本领域的普通技术人员可以在没有一个或更多的特定细节或其他方法的情况下实施本发明。本发明不受图示的动作或事件的顺序的限制，因为某些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时发生。
此外，并非所有示出的动作或事件都是实施本发明的方法所必需的。
本发明所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明。如本发明所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，在说明书和/或权利要求中使用“包括”、“具有”、“和”或其变体，这些术语旨在于以类似于术语“包含”的方式包括在内。
“约”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的那样，这将部分取决于如何测量或确定该值，比如测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差之内。替代地，“约”可以意指给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且还更优选地至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指数值的一个数量级内，优选地在值的5倍之内，更优选地在值的2倍之内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设“约”表示该特定值在可接受的误差范围内。
1.定义和缩写
除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。通常，本发明使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域众所公知的和常用的。核酸和肽的合成使用标准技术。该技术和过程通常根据本领域中的常规方法以及在本发明档全文中提供的各种一般参考来执行。本发明所用的命名法和分析化学中的实验室程序以及下文所述的有机合成物是本领域众所周知的和常用的。化学合成和化学分析使用标准技术或其修改方法。
尽管可以在单个实施例的上下文中描述本发明的各种特征，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合来提供。相反，尽管为了清楚起见在本发明中可以在单独的实施例的上下文中描述本发明，但是本发明也可以在单个实施例中实现。
说明书中对“一些实施例”、“一个实施例”或“其他实施例”的引用意味着结合这些实施例描述的特定特征，结构或特性包括在至少一些实施例中，但不包括必然是本公开的所有实施例。
如本发明所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。“约”还包括精确量，因此“约5μL”是指“约5μL”，也可以表示就是“5μL”。通常，“约”包括预期在实验误差内的量。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，以表示通过肽键彼此连接的线性氨基酸残基，包括蛋白质、多肽、寡肽、肽及其片段。该蛋白质可以由天然存在的氨基酸和/或合成的(例如修饰的或非天然存在的)氨基酸组成。因此，本发明所用的“氨基酸”或“肽残基”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸。“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白、具有或不具有N端甲硫氨酸残基和免疫标记蛋白具有可检测的融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白，β-半乳糖苷酶，荧光素酶等作为融合伴侣的融合蛋白等等。此外，应注意，在氨基酸残基序列的开始或末端的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键或与羧基或羟基的共价键。然而，没有破折号不代表不存在这样的与羧基或羟基的肽键或共价键，因为在氨基酸序列中通常省略了这种肽键或共价键。
本发明中的“核酸”是指DNA或RNA，或含有脱氧和/或核糖核苷酸的分子。核酸可以是天然存在的，也可以是人工合成的，并且包括天然存在的多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸被修饰成天然存在的核苷酸。
“缀合”和“连接”通常是指使一个分子与第二分子近端缔合的化学键，可以是共价或非共价。
“分离的”旨在表示化合物从自然界中与之伴随的所有或一些组分中分离出来。“分离的”也指化合物在制造过程中从其伴随的所有或一些组分中分离出来的状态(例如化学合成，重组表达，培养基等)。
“纯化的”旨在表示目的化合物已经从自然界或在制造过程中与之伴随的组分中分离出来并以富集形式提供。
在本发明的化合物的上下文中使用的“效力”是指化合物表现出所需活性的能力。
在一些分子例如肽片段中使用的“浓度”是指给定体积存在的分子量。在一些实施例中，以摩尔浓度给出的分子浓度，指的是存在于给定体积的溶液中的分子的摩尔数。
“抗原”和“表位”是指分子(例如多肽)被免疫系统的组分例如抗体特异性识别的部分。如本发明所用，“抗原”涵盖抗原表位，例如作为抗原表位的抗原片段。
“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，抗体可以是任何感兴趣的类别(例如，IgG，IgM及其亚类)，以及杂交抗体，修饰的抗体，F(ab')2片段，F(ab)分子，Fv片段，在噬菌体上展示的单链片段(scFv)，单链抗体，单域抗体，双抗体，嵌合抗体，人源化抗体及其片段。在一些实施例中，抗体的片段可以是表现出亲本抗体分子的免疫结合特性的功能片段。本发明所述的抗体可以用例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测地标记。在活体成像中使用的可检测标签是有意义的。抗体可以进一步缀合至其他部分，例如细胞毒性分子或其他分子，特异性结合对的成员等。
已知典型的抗体结构单元，特别是全长的抗体结构单元，包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N端具有约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链的可变区。
“抗原结合位点”或“结合结构域”是指抗体分子或其片段结构域中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由N端可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸残基形成。重链和轻链可变区内的三个高度发散的延伸是插在更保守的侧翼延伸片段之间的“高变区”，称为“框架区”或“FR”。因此，“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置，以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。重链和轻链各自的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责与抗原表位的结合。“结合结构域”由蛋白质的片段结构域组成，该蛋白质的片段结构域介导抗原结合或受体/配体相互作用。
本发明的抗体及其片段包括双特异性抗体及其片段。双特异性抗体类似于单个抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点或结构域。双特异性抗体对至少两个不同的表位具有结合特异性。双特异性抗体和片段也可以是异种抗体的形式。异种抗体是两个或多个抗体或连接在一起的抗体结合片段(例如Fab)，每种抗体或片段具有不同的特异性。
本发明还提供了抗体偶联物。偶联物包括本发明的任何抗体和试剂。该试剂可以选自治疗剂、显像剂、标记剂或可用于治疗和/或标记目的的试剂。
抗体(或其片段)与特定抗原(或表位)之间的免疫结合相互作用的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小的Kd代表较大的亲和力。可以使用本领域众所周知的方法对选定多肽的免疫结合特性进行定量，这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物的形成和解离的速率，这个速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上均会影响速率的几何参数。因此“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)都可以通过计算浓度以及结合和解离的实际速率来确定。Koff/Kon的比率可以去除所有与亲和力无关的参数，因此等于平衡解离常数Kd(参见Davies等人，Ann.Rev.Biochem.1990,59:439-15 473)。
在描述抗体特征时，“抗体的特异性结合”或“抗原特异性抗体”是指抗体优先结合存在于不同抗原的混合物中的特定抗原的能力。在一些实施例中，与样品中的合适和不合适的抗原之间的特异性结合(或“靶标”和“非靶标”抗原)有所区别，在一些实施例中，与靶标抗原的结合比非靶标抗原的结合多于约10倍至100倍甚至更多(例如多于1000倍或10,000倍)。在一些实施例中，当抗体和抗原特异性结合在抗体抗原复合物中时，抗原和抗体之间的亲和力的特征用KD(解离常数)表示，KD小于10-6M，小于10-7M，小于10-8M，小于10-9M，小于10-9M，小于10-11M，或小于约10-12M。
“单克隆抗体”是指具有同质抗体群体的抗体组合物。单克隆抗体包括完整的抗体分子，以及Fab分子、F(ab')2片段、Fv片段、在噬菌体(scFv)上展示的单链片段、由抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白组成的融合蛋白和其他具有亲本单克隆抗体分子免疫结合特性的分子。制备和筛选多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域已知的。
“衍生物”和“变体”是指但不限于具有衍生自本发明的化合物和抗体的结构或序列并且其结构/序列与本发明公开的那些足够相似并且基于该相似性的任何化合物或抗体。本领域技术人员可以预期，“衍生物”和“变体”具有与所要求保护的和/或所引用的化合物或抗体相同或相似的活性和效用，从而也可称为“功能等同物”。获得“衍生物”或“变体”的修饰包括，例如通过添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。功能等同物或功能等同物的片段可具有一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指氨基酸被另一种具有与原始氨基酸相似的性质的氨基酸取代。保守氨基酸基团是本领域已知的。
可以在优选的预选肽或其片段的任何位置引入保守取代。也可以在任何一个或多个位置引入非保守取代，特别但不限于非保守取代。非保守取代形成的功能等同肽的片段在极性、电荷和/或空间体积上基本上不同，同时保持衍生物或变体片段的功能。
通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定“序列相似性的百分比”，与参考序列(没有增加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸或多肽序列的一部分可能具有添加或缺失(如缺口)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，来计算百分比并将结果乘以100可得出序列相似性的百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列中“相同”或“相似性”百分数是指两个或更多个相同或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸的相同序列或子序列(例如在整个多肽序列或单个多肽的特定区域上，具有60％的相似性，可选地有65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的相似性)，当在比较窗口或使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和视觉检查所检测的指定区域进行比较和比对时，获得最大的对应性。这些序列被称为“基本上相同”。这个定义也指检测序列的补充。任选地，相似性存在于长度至少约5个至50个核苷酸或多肽序列的区域上，或更优选地存在于长度为100个至500个或1000个以上核苷酸或多肽序列的区域上。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与检测序列进行比较。使用序列比较算法时，将检测序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定其他参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算检测序列相对于参考序列的序列相似性百分比。
如本发明所述，“比较窗口”对选自全长序列或20至600、约50至约200、或约100至约150个氨基酸或核苷酸的序列，与参考序列进行最佳比对后，可将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域是众所周知的，例如，可以通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法来进行用于比较的序列的最佳比对，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(1970)J Mol.Biol.48:443，通过寻找Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877的相似方法，通过这些算法的计算机化实现(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过手动比对和视觉检查(参见，例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法分别在Altschul等人1977年Nuc.Acids Res.25:3389-3402和1990年JMol.Biol.215:403-410的文章中进行了描述。进行BLAST分析的软件可通过NationalCenter for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站获得。
本发明所述的“目的细胞”或“靶细胞”可互换地指一种或多种旨在调节一个或多个信号传导途径的细胞。在一些实施例中，靶细胞包括但不限于癌细胞。在某些其他实施例中，靶细胞包括免疫效应细胞，例如天然杀伤细胞、T细胞、树突细胞和巨噬细胞。
如本发明所述，“癌细胞”是指表现出赘生性细胞表型的细胞，其特征可以在于以下一种或多种：异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、锚定非依赖性生长的潜能、在免疫受损的非人类动物模型中具有促进肿瘤生长和/或发育的能力，和/或任何细胞转化的适当迹象。“癌细胞”在本发明中可以与“肿瘤细胞”互换使用，并且包括实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等。
在疾病或状况的描述中，“治疗”是指改善困扰个体的状况有关的症状，其中广义上的改善至少是指减小参数，例如与所治疗的疾病(例如癌症)相关的症状。治疗还包括完全抑制(例如防止)发生或停止(例如终止)病理状况或与其相关的症状的情况、终止以使宿主不再患有该病症或者至少不再表征该病症的症状。因此，治疗包括：(1)预防，即降低临床症状发展的风险，包括使临床症状不发展，例如防止疾病发展为有害状态；(2)抑制，即阻止临床症状的发展或进一步发展，例如减轻或完全抑制活动性疾病，例如减少肿瘤负荷，这种减少可以包括消除可检测的癌细胞，或保护免受细菌感染引起的疾病，其中包括消除和/或(3)缓解可检测的细菌、细胞，即导致临床症状消退。
本发明的组合物的“有效量”表示提供组合物所需的效用非致命但足够的量。例如，为了在目的细胞(靶细胞)中引发有利的应答，例如调节信号传导途径，(有活性的、有效的或有功能的)抗体的有效量会导致信号通路活性水平发生显著且实质性的变化，包括与不使用抗体或对照(无效或无功能)的抗体相比，信号通路的下调和上调。可以通过本领域已知的多种方法来测量信号传导途径的活性水平的变化。在另一个实例中，为了在受试者中引起治疗疾病(例如癌症)的有利反应，有效量是减少、消除或减轻与该疾病有关的症状的量，以便提供对疾病的控制，例如癌症转移和消除癌细胞等。如本领域普通技术人员所理解的，由于物种和年龄、所治疗的状况或疾病的严重性、用的特定组合物、给药方式等不同，所需的确切量将因个体而异。因此，不可能指定确切的“有效量”，但是本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的有效量。
如本发明所述，“药学上可接受的赋形剂”是指提供用于向受试者施用目的化合物的药学上可接受的化合物的任何合适的物质。“药学上可接受的赋形剂”可以包括被称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体。
“个体”或“受试者”涵盖人类、哺乳动物和其他动物。“个体”或“受试者”在本发明可互换使用，是指使用本发明中抗体或其片段的任何哺乳动物受试者。
某些实施例的特征是双特异性抗体、抗原结合片段或其重组蛋白，其能够调节目的细胞中一个或多个信号传导途径的活性。一种或多种信号传导途径的调节可导致某些靶细胞行为的变化，例如刺激或减少细胞增殖、细胞生长、细胞分化、细胞存活、细胞分泌、粘附调节和/或细胞运动。
如本发明所述，“药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物学有效性和性质并且在生物学上或其他方面不是所不希望的盐。在某些情况下，由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团(例如苯酚或羟酰胺酸)，本发明化合物能够形成酸和/或碱式盐。药学上可接受的酸衍生盐可以与无机酸和有机酸形成。可以衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。可以衍生盐的有机酸包括，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸等。药学上可接受的碱衍生盐可以与无机碱和有机碱形成。可以衍生盐的无机碱包括，例如、钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝等；特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生盐的有机碱包括例如伯、仲和叔胺、取代胺、包括天然存在的取代胺、环胺、碱性离子交换树脂等，特别是异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由母体化合物，碱性或酸性部分合成。通常可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当的碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等)反应，或通过使游离碱反应来制备此类盐。这些化合物具有化学计量的适当酸形式。这样的反应通常在水或有机溶剂或两者的混合物中进行。通常在可行的情况下，优选非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。可以在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)中找到其他合适的盐的列表，其通过引用并入本发明。
如本发明所述，“药学上可接受的载体/赋形剂”包括本领域普通技术人员已知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂和抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等材料及其组合(例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEd.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)，通过引用并入本发明。目前除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗或药物组合物中。
如本发明所用，“治疗组合”或“组合”是指一种或多种活性药物物质的组合，即具有治疗效用的化合物。通常本发明的治疗组合中的每种此类化合物将存在于包含该化合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。作为方案的一部分，本发明的治疗组合中的化合物可以同时或分开给药。
2.药物组合物
本发明提供工程化的双特异性抗体、三特异性抗体和四联体特异性抗体和组合物，能够识别两种、三种或四种不同细胞表面抗原的工程化抗体以及生产这种抗体的设计方法。本发明的工程化抗体包含两条单链片段，例如一条轻链(结构域1和CL)和一条重链(结构域2和CH1)，它们各自以相对较低的亲和力识别不同的抗原，例如低于10-8M，优选为10-5M至10-7M。两条链通过每条链的恒定区连接，例如CL和CH1的连接。
尽管每条单链的亲和力低，例如10-5M至10-8M，但是两条单链片段协同结合的亲和力高得多，例如10-9M至10-12M。
一方面，本发明提供了精确制导的多功能治疗抗体(GCT Ab)的创新性多特异性抗体药物平台，其目的是大大提高抗体免疫疗法的安全性、效力和有效性。如图1所示，本发明包括以下特征：(1)双特异性抗体的最小化脱靶效应，并选择结合片段对每个靶标的微调结合亲和力。(2)通过针对疾病特异性靶标、免疫调节功能靶标和确定的效应子功能靶标的抗体结合片段的新型三特异性抗体显著提高了效力；(3)通过创新设计具有多个单结构域结合片段和每个结合域的二价性质以及持久的PK和标准抗体生产特性的IgG形式来提高效力。
选择一对抗体结合片段针对每个靶标的安全性微调结合亲和力的设计模仿自人类自然免疫控制机制理论中的TCR复合物与MHC复合物之间相互作用(Alberti,S.A highaffinity T cell receptor？Immunology and cell biology 74,292-297(1996))。TCR对MHC肽的亲和力在T细胞发育和成熟过程中微调到一个安全范围，不会与没有外源肽的正常MHC发生不利相互作用，并且可以通过CD4/CD8到MHC的协同结合作用有效识别特异性MHC肽复合物。尽管CD4/CD8与MHC的亲和力在104～106M-1(Davies,D.R.,Padlan,E.A.&Sheriff,S.Antibody-antigen complexes.Annual review of biochemistry 59,439-473(1990))，并且TCR对MHC肽的亲和力在105～106M-1(Matsui,K.,et al.Low affinity interactionof peptide-MHC complexes with T cell receptors.Science 254,1788-1791(1991))。T细胞可以通过协同结合安全有效地识别靶细胞上的特定MHC肽复合物(Alberti,S.A highaffinity T cell receptor？Immunology and cell biology 74,292-297(1996))。疾病特异性靶标通常是表达上调的自身蛋白，它们也可能以较低水平单独存在于正常细胞上。高亲和力抗体可能介导脱靶到正常细胞并引起不良反应。为了采用天然的TCR/MHC安全控制机制(图2A)，我们的发明选择了一对疾病特异性靶标和一对与个体亲和力较低的靶标的结合域，因此它们只会松散地结合正常组织细胞上的靶标和可以通过双特异性结合的形式通过叠加和/或协同作用来有效地选择性结合双靶标疾病细胞，如图2B所示。
在另一方面，本发明提供了包含受控的Fc功能设计(例如不含所有Fc介导的效应子功能的P329GLALA-Fc(WO2012130831 A1))，以避免潜在的不受控制/意外的不良效应子功能的影响，同时保留具有长的半衰期的FcRn的亲和力(PK)和蛋白质A结合用于标准化生产。
在另一方面，本发明提供了针对疾病特异性靶标、免疫调节功能靶标和确定的效应子功能靶标的的新型三特异性多功能抗体，以实质上改善药物的效力。
在另一方面，本发明提供了一种抗体形式的新设计，该抗体形式具有多个单结构域结合片段和每个结合域的二价性质以及持久的PK和标准抗体生产特性(图1和3F)。一对疾病特异性结合结构域分别与CH1和CL连接，每个结合结构域均具有完整功能。这种基于单结合域的双特异性抗体设计可单独用作单价双特异性抗体片段的Fab形式或双双价双特异性抗体(DBBAb)的完整IgG抗体形式(图3A和3B)。此外，用于效应子功能靶向的第三结合结构域在CL的C末端连接以将效应子细胞引导至疾病部位。这种三特异性抗体设计的创新Fab样形式可以单独用作BiTE抗体的改进版本，与检查点抑制剂(专利US9315567 B2和WO2015095418 A1)结合使用(图3C)，并且可以与白蛋白结合的结构域，或在CH1的C端与白蛋白直接连接(专利WOI992001476A1和WO2010056550 A1)，作为一种持久的高效的抗体药物(图3D和3E)。在设计中使用带有Fc的全长重链将针对三个结合域中的每一个将三特异性抗体二聚化为天然IgG双价，这将大大提高药物的耐用性、生产率和有效性。
A：基于单结合域的Fab和IgG抗体形式。
本发明基于单个结合结构域的组合提供了各种抗体，例如Fab和IgG抗体。
A1：单价双特异性抗体
在一个方面，本发明提供了一种工程化的单价双特异性抗体，其包括：(1)第一链，该第一链包含第一抗原结合单结构域，该第一抗原结合单结构域结合第一靶标并与Fab重链的CH1的N末端连接，亲和力约10-5～10-8M，优选为10-5～10-7；(2)第二链，其包含第二抗原结合单结构域，该第二抗原结合单结构域连接至轻链(κ或λ链)的CL的N端，结合第二靶标，并具有约10-5～10-8M的第二亲和力，优选为10-5～10-7M。
在一些实施例中，在将表达盒中的两个基因共转染到表达细胞系统中之后，工程抗体仅具有共价连接的两条单链，例如一条轻链和一条重链。图2A示出了一个例子。
通常，如本发明所提供的，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与相同疾病有关的免疫调节功能靶标。
A2：双二价双特异性抗体
在另一方面，本发明提供了工程化的双二价双特异性抗体(DBB)抗体，其包含(1)第一链，其包含结合第一靶标的与IgG重链的CH1的N末端连接的第一抗原结合单结构域，且具有约10-5～10-8M的第一亲和力；(2)第二链，其包含第二抗原结合单结构域，该第二抗原结合单结构域连接至轻链(κ或λ链)的CL的N端，结合第二靶标，并具有约10-5～10-8M的第二亲和力；(3)与第一链相同的第三链，和(iv)与第二链相同的第四链，其中所述第一链与所述第二链连接形成第一臂，所述第三链与所述第四链连接形成第二臂，所述第一臂和所述第二臂连接，通过IgG Fc二聚连接。在图2B中示出了一个例子。
在一些实施例中，工程抗体具有总共四条链，例如两条轻链(各自包含一个结合域和一条CL)和两条重链(各自包含一个结合域和一个CH1)。两条轻链具有相同的序列，两条重链具有相同的序列。每条轻链与重链连接形成两个臂。两条臂连接至Fc片段，优选IgG Fc片段。可以通过本领域中常见的抗体生产技术来生产工程抗体，该技术通常包括构建重链和轻链基因的表达盒，将两个基因共转染到合适的细胞系统中以产生重组抗体的步骤来制作稳定高产的细胞克隆，发酵产生cGMP最终抗体产物。
通常，如本发明所提供的，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与相同疾病有关的免疫调节功能靶标。
A3：单价三特异性抗体
在另一方面，本发明提供了工程化的单价三特异性抗体，其包含：(1)第一链，其包含结合第一靶标的与Fab重链的CH1的N末端连接的第一抗原结合单结构域，并具有第一亲和力约为10-5～10-8M，优选为10-5～10-7M；(2)第二链，其包含第二抗原结合单结构域，该第二抗原结合单结构域与轻链(κ或λ链)的CL的N末端连接，结合第二靶标，并具有约10-5～10-8M的第二亲和力，优选为10-5～10-7M，以及与轻链(κ或λ链)的CL的C端连接的第三抗原结合单结构域，其结合第三抗原并具有约10-5～10-7M的第二亲和力。图2C示出了一个例子。
在一些实施例中，工程抗体仅具有两条链，例如通过CH1和CL1的Fab恒定区共价连接的一条轻链和一条重链。
通常，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与相同疾病相关的免疫调节功能靶标，第三抗原是效应子功能靶标。
A4：单价四特异性抗体
在一方面，本发明提供了工程化的单价四特异性抗体，其包含：(1)第一链，其包含连接至Fab重链的CH1的N末端的第一抗原结合单结构域，其结合第一靶标，具有约10-5～10-8M的第一亲和力；第四抗原结合单结构域，其与Fab重链的CH1的C末端连接，结合第四靶标，具有约10-5～10-8M的第四亲和力；(2)第二链，其包含连接至轻链(κ或λ链)的CL的N末端的第二抗原结合单结构域，其结合第二靶标，并且也具有约10-5～10-8M的第二亲和力，和与轻链(κ或λ链)的CL的C末端连接的第三抗原结合单结构域，其结合第三靶标，具有约10-5～10-8M的第三亲和力。图2D示出了一个例子。
通常，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与疾病相关的免疫调节功能靶标，第三抗原是效应子功能靶标，第四抗原是第四功能靶标，例如白蛋白或其他靶标。结合后，可以安全地延长抗体的体内半衰期。
A5：单价三特异性抗体-白蛋白药物
一方面，本发明提供了工程化的单价三特异性抗体-白蛋白偶联物，其包括：(1)第一链，其包含结合第一靶标的与Fab重链的CH1的N末端连接的第一抗原结合单结构域，并具有第一亲和力约为10-5～10-8M；以及与Fab重链的CH1的C末端连接的第四蛋白质片段，其可以延长功能性蛋白质的体内半衰期(2)第二链，其包含连接至轻链(κ或λ链)的CL的N末端的第二抗原结合单结构域，其结合第二靶标，并且具有约10-5～10-8M的第二亲和力和(3)连接至轻链(κ或λ链)的CL的C末端的第三抗原结合单结构域，其结合第三抗原，并且具有约10-5～10-8M的第三亲和力。图2E示出了一个例子。
通常，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与疾病相关的免疫调节功能靶标，第三抗原是效应子功能靶标，第四片段是白蛋白或其他结合后可以安全地延长抗体的体内半衰期的靶标。
A6：精确制导的多功能治疗抗体(GCT Ab)
在一个方面，本发明提供了一种工程化的精确制导的多功能治疗抗体，其包含(1)第一链，该第一链包含第一抗原结合单结构域，该第一抗原结合单结构域与IgG重链的CH1的N末端连接，结合第一靶标，并具有约10-5～10-8M的第一亲和力；(2)第二链，其包含第二抗原结合单结构域，该第二抗原结合单结构域连接至轻链(κ或λ链)的CL的N端，结合第二靶标，并具有约10-5～10-8M的第二亲和力，以及连接至轻链(κ或λ链)的CL的C末端的第三抗原结合单结构域，其结合第三抗原，并且具有约10-5～10-8M的第三亲和力。(3)与第一条链相同的第三条链；(4)与第二链相同的第四链，其中所述第一链与所述第二链连接以形成第一臂，所述第三链与所述第四链连接以形成第二臂，并且其中所述第一臂和所述第二臂通过IgG Fc二聚连接。(5)修饰的Fc区，除了FcRn结合的半衰期长，其没有Fc介导的所有效应子功能。图2F示出了一个例子。
通常，第一抗原是疾病特异性靶标，第二抗原是与疾病相关的免疫调节功能靶标，第三抗原是效应子功能靶标，如果包含P329G-LALA修饰的IgG Fc，则是Fc。
在一些实施例中，第一链和第三链具有相同的序列。
在一些实施例中，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域具有相同的序列。
在一些实施例中，第二链和第四链具有相同的序列。
在一些实施例中，当应用时时，第一亲和力、第二亲和力、第三亲和力或第四亲和力中的每一个小于10-8M，例如10-5～10-8M，优选约10-5～10-7M。
B：疾病特异性靶标
通常，第一抗原是疾病特异性靶标。
疾病特异性靶标可以是肿瘤靶标(例如Her2，Jamnani,F.R.等，T cellsexpressing VHH-directed oligoclonal chimeric HER2 antigen receptors:towardstumor-directed oligoclonal T cell therapy.Biochimica et biophysica acta 1840,378-386(2014),Even-Desrumeaux,K.,Fourquet,P.,Secq,V.,Baty,D.&Chames,P.Single-domain antibodies:a versatile and rich source of binders for breast cancerdiagnostic approaches.Molecular bioSystems 8,2385-2394(2012))，新抗原(例如TRK(US 7750122B2))或疾病特异性受体(例如EGFR，参见专利WO2010037838和Bell，A等人Differential tumor-targeting abilities of three single-domain antibodyformats.Cancer letters 289,81-90(2010))。
在一些实施例中，疾病特异性靶标选自表1中的疾病标记、细胞因子或趋化因子，或者表2中的靶标。
表1：靶标清单
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表2
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在一些实施例中，疾病特异性靶标选自在癌细胞中过表达的抗原，包括细胞间粘附分子1(ICAM-1)，ephrin A型受体2(EphA2)，ephrin A型受体3(EphA3)，ephrin A型受体4(EphA4)或活化的白细胞粘附分子(ALCAM)。
在一些实施例中，疾病特异性靶标选自与癌症或肿瘤相关的指导抗原，包括CD30，CD33，PSMA，间皮素，CD44，CD73，CD38，与粘蛋白1细胞表面相关的(MUC1)，粘蛋白2寡聚粘液凝胶-成型(MUC2)和MUC 16(CA-125)。
在一些实施例中，疾病特异性靶标选自CD30，CD33，癌胚抗原(CEA)，间皮素，组织蛋白酶G，CD44，CD73，CD38，Mucl，Muc2，Mucl 6，优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，碳酸酐酶IX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂，Lewis-Y，未成熟层粘连蛋白受体，BING-4，钙激活的氯离子通道2(CaCC)，gp100，滑膜肉瘤X断点2(SSX-2)，或SAP-I。
在一些实施例中，疾病特异性靶标选自CD30，CD33，肺胚张力抗原(CEA)，间皮素，组织蛋白酶G，CD44，CD73，CD38，Mucl，MucI6，优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂或Lewis-Y，ICAM-1，EphA2或ALCAM。
C.免疫调节功能靶标
通常，第二抗原是与疾病靶标有关的免疫调节功能靶标。免疫调节功能的靶标可以是检查点受体(例如PD-L1(专利WO201702080 1-PAMPH-866和Zhang，F等人Structuralbasis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade.Cell discovery3,17004(2017).8)或调节性细胞因子受体等。
在一些实施例中，免疫调节功能靶标选自表1中提供的受体之一。
在一些实施例中，免疫调节功能靶标与NK细胞激活或抑制途径有关，并且选自CD16、CD38、NKG2D、NKG2A、NKp46或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。
在一些实施例中，免疫调节功能靶标与检查点抑制途径(其可以在T细胞，NK细胞或补体系统中有活性)有关，并且选自但不限于PD1、CTLA4、CD47、CD59和Tim3。
D.效应子功能靶标
通常，第三抗原是效应子功能靶标。
定义的效应子功能靶标可以是T细胞标记，例如CD3(专利WO2010037838)，NK细胞(例如CD16，Behar，G等，Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII(CD16)llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.Proteinengineering,design&selection:PEDS21,1-10(2008))，巨噬细胞，例如CD47(US8377448B2)等。将效应细胞与疾病特异性靶标配对可以在阻断抑制性免疫调节靶标的帮助下将效应细胞定向到疾病部位，以介导对疾病靶标的有效作用。此外，效应子功能靶向结构域与阻断性抑制性免疫调节靶标的配对的微调亲和力还可以如上所述提高效应子靶向的安全性。
在一些实施例中，效应子功能靶标选自表格1中的受体之一。
E.单域抗体结合片段
通常，本发明提供的抗体包含多个单结构域抗原结合片段。
可以通过本领域已知的针对所需抗原的直接筛选方法，通过修饰所选靶标、抗原或表位的已知抗体来获得单域抗体。
VH或VL结合结构域可源自任何单个结构域结合来源，包括但不限于动物来源(骆驼、羊驼、工程小鼠/大鼠、人Ig转基因小鼠/大鼠等)，工程化的仅重链抗体库、工程化的仅轻链抗体库、人源化抗体结合结构域，或通过针对所选靶标、抗原或表位的可溶性因子的结合结构域等设计已知的受体和配体。
大多数抗体具有在纳摩尔(10-7至10-9)范围内的KD值。高亲和力抗体的KD值通常在皮摩尔范围(10-9至10-11)内，而非常高亲和力抗体在低皮摩尔范围(10-11至10-12)内。
具有较低亲和力的单域抗体可通过微调现有抗体来产生，例如通过改变一个或多个氨基酸序列，从而将亲和力改变至所需范围，但仍保留特异性。这种改变可以在现有抗体的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中，也可以在VH或VL的框架区中。可以基于蛋白质3D结构信息合理地设计修饰，这取决于每种抗体。通常，亲和力和特异性的精细调整可以通过工程化和筛选包含各个修饰的文库来实现。
本发明中的单结构域能够与靶标特异性结合。本发明中的“靶标”或“标志物”是指能够特异性结合特定靶标治疗剂的任何实体，例如Her2/Neu。在一些实施例中，靶标与一种或多种特定细胞或组织类型具体相关。在一些实施例中，靶标与一种或多种特定疾病状态特异性相关。在一些实施例中，靶标与一个或多个特定发育阶段具体相关。例如，细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常比参考细胞群体高至少2倍。在一些实施例中，细胞类型特异性标志物比其在对照人群中的平均表达量大至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可以把一种或多种目的细胞类型与许多、大多数或所有其他类型的细胞区分开。如本发明所述，在一些实施例中，靶标可包含蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸。
本发明中的“特异性结合”或“优选结合”是指两个结合伴侣之间(例如靶向部分与其结合伴侣之间)的结合对于两个结合伴侣是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。例如抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测定。表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))。“抗[抗原]抗体”和“与[抗原]结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合相应抗原的抗体，使得该抗体靶向抗原用作诊断和/或治疗剂。在一些实施例中，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的，抗[抗原]抗体与无关蛋白的结合程度比抗体与抗原的结合少约10％。
在一些实施例中，与抗原结合的的解离常数(KD)小于100μM，小于10μM，小于1μM，小于100nM，小于10nM，小于1nM，小于0.1nM，小于0.01nM。或小于0.001nM(例如10-4M或更小，例如10-4M至10-12M，例如10-9M至10-13M)，优选10-5M至10-8M。
在一些实施例中，靶向治疗剂包含抗体或其功能片段。在某些特定的实施例中，靶标是肿瘤标志物。在一些实施例中，肿瘤标志物是存在于肿瘤中的抗原，而该抗原不存在于正常器官、组织和/或细胞中。在一些实施例中，肿瘤标志物是在肿瘤中比在正常器官、组织和/或细胞中更普遍的抗原。在一些实施例中，肿瘤标志物是在恶性癌细胞中比在正常细胞中更普遍的抗原。
本发明中的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原性物质，即它触发宿主中的免疫应答。人体中的正常蛋白质由于自身耐受性而不具有抗原性，在此过程中，自我反应产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和产生自身抗体的B淋巴细胞在原发性淋巴组织(BM)在“中心”被剔除，次生淋巴组织(T细胞主要为胸腺，B细胞为脾/淋巴结)在外周血中被“外围”剔除。因此，任何未暴露于免疫系统的蛋白质都会触发免疫反应，这可能包括与免疫系统隔离的正常蛋白质、产生量极少的蛋白质、仅在某些发育阶段产生的蛋白质或结构因突变而被修改的蛋白质。
在一些实施例中，与正常组织和/或细胞相比，靶标优先在肿瘤组织和/或细胞中表达。
在本发明的一些实施例中，标志物是肿瘤标志物。标记可能是在分裂时比在非分裂细胞中表达水平更高的的多肽。例如，Her-2/neu(也称为ErbB-2)是EGF受体家族的成员，并在与乳腺癌有关的肿瘤的细胞表面表达。另一个例子是称为F3的肽，它是将纳米颗粒引导至核仁素的合适靶向剂(Porkka等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:7444；和Christian等,2003,J.Cell Biol.,163:871。)已经显示，包含纳米颗粒和A10适配体(特异性结合PSMA)的靶向颗粒能够特异和有效地将多西他赛递送至前列腺癌肿瘤。
特异性靶向这些肿瘤靶标的抗体或其他药物特异性干扰并调节肿瘤细胞生物学行为的信号传导途径，直接调节或阻断信号传导途径以抑制肿瘤细胞生长或诱导细胞凋亡。迄今为止，已经批准了数十种针对实体瘤或血液恶性肿瘤的临床研究和治疗的靶标药物，还有针对血液恶性肿瘤的许多靶向药物。
在一些实施例中，肿瘤抗原(或肿瘤靶标)选自：CD2，CD19，CD20，CD22，CD27，CD33，CD37，CD38，CD40，CD44，CD47，CD52，CD56，CD70，CD79，和CD137。
在一些实施例中，肿瘤抗原(或肿瘤靶标)选自：4-1BB，5T4，AGS-5，AGS-16，血管生成素2，B7.1，B7.2，B7DC，B7H1，B7H2，B7H3，BT-062，BTLA，CAIX，癌胚抗原，CTLA4，Cripto，EDB，ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，EGFL7，EpCAM，EphA2，EphA3，EphB2，FAP，纤连蛋白，叶酸皂苷3，GD2，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，gp100，gpA33，GPNMB，ICOS，IGF1R，整联蛋白an，整联蛋白anb，KIR，LAG-3，Lewis Y抗原，间皮素，c-MET，MN碳酸酐酶IX，MUC 1，MUC 16，Nectin-4，NKGD2，Notch，OX40，OX40L，PD-1，PDL1，PSCA，PSMA，RANKL，ROR1，ROR2，SLC44A4，Syndecan-1，TACI，TAG-72，腱生蛋白，TIM3，TRAILR1，TRAILR2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3及其变体。肿瘤抗原的变体包括本领域已知和/或天然存在的各种突变体或多态性。
本发明中的“免疫球蛋白”或“抗体”是指全长(即天然产生或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白的免疫活性(即特异性结合)部分。一个免疫球蛋白分子，例如抗体片段，可以在要求保护的主题的范围内偶联或衍生抗体或抗体片段。这样的抗体包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4(和IgG4亚型)以及IgA同型。
本发明中“抗体”以最广义的范围使用，并且涵盖各种抗体结构，只要它们表现出所需的抗原结合活性并包含Fc区或等同于免疫球蛋白Fc区的区域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。本发明使用“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”可互换地指具有基本类似于天然抗体的结构或具有包含本发明定义的Fc区的重链的抗体。
本发明中的“天然抗体”是指具有变化结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端到C端，每条重链都有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变域，其后是三个恒定结构域(CHI，CH2和CH3)，也称为重链链恒定区。同样，从N端到C端，每个轻链都有一个可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，其后是恒定轻(CL)结构域，也称为轻链常数区域。抗体的轻链可以根据其恒定域的氨基酸序列分为两种类型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
本发明的“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该完整抗体结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)，单域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，Nat Med 9，129-134(2003)。有关scFv片段的评论，参见Pliickthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.1 13,Roscnburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)，另见WO 93/16185和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于挽救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双抗体是具有两个可以是二价或双特异性的抗原结合位点的抗体片段。例如EP 404,097、EP 404,097、WO1993/01161；Hudson等，Nat Med 9，129-134(2003)；Nat Med 9：129-134(2003)。参见Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也在Hudson等人Nat Med 9，129-134(2003)中有所描述。单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分轻链可变域的抗体片段。在一些实施例中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。如本发明所述，抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(如大肠杆菌或噬菌体)的生产。
本发明中的“抗原结合结构域”是指包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域的蛋白质结构域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区或单域抗体或结构域抗体)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。抗原结合结构域可以是例如由受体或配体的可溶性结构域提供的，例如，可溶性PD-1结构域结合的PD-L1/L2或可溶性SIRPA结构域结合的CD47。
本发明的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，参与抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域均包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H。Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。
本发明中的“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的序列上高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常天然的四链抗体包含六个HVR，VH(HI，H2，H3)中的三个和VL(LI，L2，L3)中的三个。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性并参与抗原的识别。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)，这些术语在本发明中可互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区部分。Kabat等人1983年在U.S.Dept.ofHealth and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest和Chothia等人1987年在J Mol Biol 196：901-917中已经对该特定区域进行了描述。当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，任何一种定义的应用均指抗体或其变体的CDR，旨在落入本发明所定义和使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基包含特定的CDR。
本发明的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白。
本发明中的“嵌合抗体”是指包含抗体重链和轻链可变区的重组蛋白，包括衍生自一个物种的抗体，优选啮齿动物抗体，更优选鼠源抗体的互补决定区(CDR)。抗体的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定结构域可以衍生自其他物种的结构域，例如亚人类灵长类动物，猫或狗。
本发明的“人源化抗体”是指重组蛋白，其来自一个物种的抗体的CDR，例如将啮齿动物抗体从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移到人的重链和轻链可变域中。抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。在一些实施例中，可以修饰人源化抗体的框架区的特定残基，特别是那些接触或接近CDR序列的残基，例如用来自原始啮齿动物、亚人灵长类动物或其他抗体的相应残基代替。
本发明中的“人抗体”是指例如从转基因小鼠获得的抗体，所述转基因小鼠已经被“工程化”以响应抗原攻击而产生出特异性的人抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因位点的元件引入衍生自包含内源性重链和轻链基因位点的定向破坏的胚胎干细胞系的小鼠品系中。转基因小鼠可以合成对人抗原具有特异性的人抗体，并且这些小鼠可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。1994年Green等人在Nature Genet.7:13中、1994年Lonberg等人在Nature 368:856中和1992年Taylor等人在Int.Immun.6:579中都对从转基因小鼠中获得人抗体的方法进行了描述。也可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建完整的人抗体，所有这些都是本领域已知的。例如1990年McCafferty等人在Nature 348：552-553中的报道，从未经免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因库中体外生产人抗体及其片段。在该技术中，将抗体可变域基因框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性导致选择性编码表现出那些特性的抗体的基因。这样，噬菌体就模仿了B细胞的某些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，例如1993年JohnsonandChiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571中的报道。人抗体也可以由体外活化的B细胞产生。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全部内容通过引用合并于此。
本发明中的“抗体融合蛋白”是指重组产生的抗原结合分子，其中两个或多个相同或不同的天然抗体、单链抗体或具有相同或不同特异性的抗体片段连接在一起。融合蛋白包含至少一个特异性结合位点。融合蛋白的化合价表明融合蛋白与抗原或表位的结合臂或结合位点总数；即一价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价性意味着它可以利用与抗原结合的多种相互作用，从而提高与某种抗原或与不同抗原结合的亲和力。特异性表明抗体融合蛋白能够结合多少种不同类型的抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性和多特异性。根据以上定义，自然抗体(例如IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但它是单特异性的，因为它与一种类型的抗原或表位结合。单特异性多价融合蛋白对同一抗原或表位具有一个以上的结合位点。例如，单特异性双抗体是具有两个与相同抗原具有反应性的结合位点的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗体组分或同一抗体组分的多个拷贝的多价或多特异性组合。融合蛋白可另外包含治疗剂。
本发明中的“靶”或“标记”是指能够特异性结合特定靶向部分的任何实体。在一些实施例中，靶标与一种或多种特定细胞或组织类型具体相关。在一些实施例中，靶标与一种或多种特定疾病状态特异性相关。在一些实施例中，靶标与一个或多个特定发育阶段具体相关。例如，细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常比对照细胞群高至少2倍。在一些实施例中，细胞类型特异性标志物比其在对照人群中的平均表达量大至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可以把一种或多种目的细胞类型与许多、大多数或所有其他类型的细胞区分开。如本发明所述，在一些实施例中，靶标可包含蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸。
如果一种物质特异性结合核酸靶向部分，则该物质被认为是“靶向的”。在一些实施例中，核酸靶向部分在严格条件下特异性结合靶标。如果靶向部分特异性结合靶标，从而将整个复合物或化合物组合物递送至特定的器官、组织、细胞、细胞外基质组分和/或细胞内区室，则认为本发明的包含靶向部分的复合物或化合物被“靶向”。
在一些实施例中，本发明的抗体包含与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室相关的一个或多个靶标(例如抗原)特异性结合的单域抗体或片段。在一些实施例中，化合物包含特异性结合特定器官或器官系统相关的靶标的靶向部分。在一些实施例中，本发明的化合物包含特异性结合一种或多种细胞内靶标(例如细胞器，细胞内蛋白)的核靶向部分。在一些实施例中，化合物包含特异性结合患病的器官、组织、细胞、细胞外基质组分和/或细胞内区室相关的靶标的靶向部分。在一些实施例中，化合物包含特异性结合特定细胞类型(例如内皮细胞、癌细胞、恶性细胞、前列腺癌细胞等)相关靶标的靶向部分。
在一些实施例中，本发明的抗体包含对一种或多种特定组织类型(例如肝组织对前列腺组织)具有特异性的靶标结合的结构域抗体或片段。在一些实施例中，本发明的化合物包含结合至一种或多种特定细胞类型(例如T细胞对B细胞)特异性的靶标的结构域。在一些实施例中，本发明的抗体包含对一种或多种特定疾病状态(例如肿瘤细胞对健康细胞)具有特异性的靶标结合的结构域。在一些实施例中，本发明的化合物包含对一个或多个特定发育阶段(例如干细胞对分化的细胞)特异性的靶标结合的靶向部分。
在一些实施例中，靶标可以是与一种或几种细胞类型、一种或几种疾病和/或一种或几种发育阶段排他或主要相关的标志物。细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常比对照细胞群体高至少2倍，对照细胞群体可以由例如包含多个细胞(例如5-10个或更多)的数量大致相等的混合物组成不同组织或器官。在一些实施例中，细胞类型特异性标志物比其在对照人群中的平均表达量大至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可以把一种或多种目的细胞类型与许多、大多数或所有其他类型的细胞区分开。
在一些实施例中，靶标包含蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸。在一些实施例中，靶标包含蛋白质和/或其特征部分，例如肿瘤标志物、整联蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白、糖蛋白等。在一些实施例中，靶标包含碳水化合物和/或其特征部分，例如糖蛋白、糖(例如单糖、二糖和多糖)、糖萼(即大多数真核细胞外表面富含碳水化合物的外围区域等)。在一些实施例中，靶标包含脂质和/或其特征部分，例如油、脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如胆固醇和胆汁酸)、维生素(例如维生素E)、磷脂、鞘脂、脂蛋白等。在一些实施例中，靶标包含核酸和/或其特征部分，例如DNA核酸，RNA核酸，修饰的DNA核酸，修饰的RNA核酸，和包含DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA任意组合的核酸。
许多标志物是本领域已知的。典型的标志物包括细胞表面蛋白比如受体。示例性的受体包括但不限于转铁蛋白受体、LDL受体、生长因子受体(例如表皮生长因子受体家族成员EGFR，Her2，Her3，Her4)或血管内皮生长因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、整联蛋白、选择蛋白和CD分子。标记物可以是仅存在于或以更高的量存在于恶性细胞上的分子，例如肿瘤抗原。
在一些实施例中，结合结构域与肿瘤细胞特异性结合或与非肿瘤细胞相比优选与肿瘤细胞结合。
靶标部分与肿瘤细胞的结合可以使用本领域已知的测定来测量。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞是癌、肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤或中枢神经系统癌。
在一些实施例中，与非肿瘤抗原相比，结合结构域能够特异性地或优选地与肿瘤抗原结合。
在某些特定的实施例中，靶标是肿瘤标志物。在一些实施例中，肿瘤标志物是存在于肿瘤中的抗原，而该抗原不存在于正常器官、组织和/或细胞中。在一些实施例中，肿瘤标志物是在肿瘤中比在正常器官、组织和/或细胞中更普遍的抗原。在一些实施例中，肿瘤标志物是在恶性癌细胞中比在正常细胞中更普遍的抗原。
在一些实施例中，靶向部分包含叶酸或其衍生物。
近年来，叶酸的研究取得了长足的进步。叶酸是细胞分裂所必需的小分子维生素。肿瘤细胞分裂异常，并且在肿瘤细胞表面高水平表达叶酸受体，以捕获足够的叶酸来支持细胞分裂。
数据表明肿瘤细胞中的FR表达比正常细胞高20-200倍。FR在各种恶性肿瘤中的表达率分别为：卵巢癌82％，非小细胞肺癌66％，肾癌64％，结肠癌34％和乳腺癌29％(Xia W,Low PS.Late-targeted therapies for cancer.J Med Chem.2010；14；53(19):681 1-24)。FA的表达率与上皮肿瘤的侵袭和转移的恶性程度呈正相关。FA通过FR介导的内吞作用进入细胞，FA通过其羧基与进入细胞的药物形成FA复合物。在酸性条件下(pH值为5)FR与FA分离，FA将药物释放到细胞质中。
临床上，该系统可用于输送选择性攻击肿瘤细胞的药物。叶酸分子量小，具有非免疫原性和高稳定性，并且合成便宜。更重要的是，药物与载体之间的化学偶联很简单，因此以FA为靶分子构建药物传递系统已成为癌症治疗的研究热点。目前，在临床试验中的EC145(FA化疗药物偶联物)可以有效地攻击癌细胞(Pribble P and Edelman MJ.EC 145:anovel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.ExpertOpin.Investig.Drugs(2012)21:755-761)。
在一些实施例中，靶向部分包括细胞外结构域(ECD)或PD-1，PDL-1，CTLA4，CD47，BTLA，KIR，TTM3、4-IBB和LAG3的可溶性形式，表面配体双调蛋白全长，细胞素，EGF，Ephrin，Epigen，上皮调节蛋白，IGF，神经调节蛋白，TGF，TRAIL或VEGF。
在一些实施例中，靶向部分包含Fab，Fab'，F(ab’)2，单域抗体，T和Abs二聚体，Fv，scFv，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，小抗体，双抗体，双特异性抗体片段，双抗体，三抗体，sc双抗体，κ(lamda)抗体，BiTE，DVD-Ig，SIP，SMIP，DART或包含一个或多个CDR的抗体类似物。
在一些实施例中，靶向部分是抗体或抗体片段，其基于在目的靶细胞或靶位点上表达的抗原的特异性来选择。已经鉴定了多种肿瘤特异性或其他疾病特异性抗原，并且已经或提议将针对那些抗原的抗体用于治疗此类肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可以用于本发明的化合物中，特别是用于治疗与靶抗原相关的疾病。本发明的抗体-接头-药物偶联物可以靶向的靶抗原(及其相关疾病)的实例包括：CD2，CD19，CD20，CD22，CD27，CD33，CD37，CD38，CD40，CD44，CD47，CD52，CD56，CD70，CD79，CD137、4-1BB，5T4，AGS-5，AGS-16，血管生成素2，B7.1，B7.2，B7DC，B7H 1，B7H2，B7H3，BT-062，BTLA，CAIX，癌胚抗原，CTLA4，Cripto，EDB，ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，EGFL7，EpCAM，EphA2，EphA3，EphB2，FAP，纤连蛋白，叶酸受体，神经节苷脂GM3，GD2，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，gp100，gpA33，GPPNB，ICOS，IGF1R，整联蛋白an，整联蛋白anb，KIR，LAG-3，Lewis Y，间皮素，c-MET，MN Carbonic酸酐酶IX，MUC 1，MUC16，Nectin-4，NK.GD2，Notch，OX40，OX40L，PD-1，PDL1，PSCA，PSMA，RANKL，ROR1，ROR2，SLC44A4，Syndecan-1，TACI，TAG-72，腱生蛋白，TIM3，TRAILR1，TRAILR2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3。
F.抗体生产
所有抗体形式均基于IgG抗体的重链和轻链，可以使用本领域已知的方法生产，通常包括以下步骤：构建重链和轻链基因表达盒，将两个基因整合到合适的细胞系统中，以产生重组抗体并产生稳定且高产的细胞克隆，然后通过细胞发酵产生cGMP终抗体产物。
3.药物制剂和给药
本发明进一步涉及一种药物制剂，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体。
本发明所述的化合物包括药学上可接受的载体，例如其加成盐或水合物，可以使用多种途径或方式递送给患者。合适的给药途径包括但不限于吸入，经皮，口服，直肠，透粘膜，肠和肠胃外给药，肌内、皮下和静脉内注射。优选地，本发明的包含抗体或抗体片段作为靶向部分的化合物经肠胃外施用，更优选静脉内施用。
如本发明所用，“施用”旨在涵盖用于将化合物直接和间接递送至其预期作用位点的所有方式。
本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以与本发明的其他化合物组合单独给药，和/或与其他治疗剂组合的混合物中给药。当然，如何选择与本发明化合物共同施用的治疗剂将部分取决于所治疗的病症。
例如，当向患有由依赖自诱导物的生物体引起的疾病状态的患者给药时，本发明的化合物可以在混合物中给药，这种混合物通常含有用于治疗与疼痛、感染和其他症状及副作用有关的药剂。这样的药剂包括例如止痛药和抗生素等。
当向接受癌症治疗的患者给药时，这些化合物可以在含有抗癌药和/或辅助增强剂的混合物中服用。化合物也可以在含有治疗放射疗法副作用的药物的混合物中服用，例如止吐药和放射防护剂等。
可与本发明化合物共同施用的补充增强剂包括，例如，三环类抗抑郁药(例如，丙咪嗪，地昔帕明，阿米替林，氯米帕明，曲米帕明，多塞平，去甲替林，普罗替林，阿莫沙平和马普替林)；非三环类和抗抑郁药(例如舍曲林，曲唑酮和西酞普兰)；Ca2+拮抗剂(例如维拉帕米，硝苯地平，尼群地平和卡洛维汀)；两性霉素，三苯乙醇类似物(例如他莫昔芬)；抗心律失常药物(例如奎尼丁)；降压药(例如利血平)；硫醇消耗剂(例如丁硫氨酸和亚磺酰亚胺)和亚叶酸钙。
本发明的一种或多种活性化合物可以自身给药，或与其他药物组合物混合的形式给药。其中活性化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。通常，使用一种或多种包含赋形剂和助剂的生理上可接受的载体以常规方式配制本发明使用的药物组合物，所述赋形剂和助剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于粘膜给药，要在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
对于口服给药，可以简单的将活性化合物与药学上可接受的本领域中众所周知的载体组合来配制化合物。这些载体可使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液以供待治疗的患者口服。口服药物制剂可获得固体赋形剂，可选地研磨产生的混合物，并在添加适当的助剂后加工该混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠。
糖衣丸芯需要有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合胶囊以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推合胶囊可以包含与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。所有口服给药的制剂应以适合于这种给药方式的剂量。
对于口腔给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
通过吸入给药，需要使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，方便地从加压包装或喷雾器以气雾剂形式递送本发明使用的化合物。在加压气雾剂的情况下，可以通过阀递送测量的量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的的胶囊和药筒(例如明胶)，其包含化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以将化合物配制成通过注射(例如通过推注或连续输注)进行肠胃外给药的形式。注射是本发明组合物的优选给药方法。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓶或多剂量容器中，并添加防腐剂。该组合物可以采用诸如在油性或水性运载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂，例如可以添加悬浮剂、稳定剂和/或分散剂，例如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐(例如海藻酸钠)。
肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)，或脂质体。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或试剂，其增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液。对于注射，可以将本发明的试剂配制成水溶液，优选配制成生理相容的缓冲液，例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。
或者，活性成分可以是粉末形式，以便在使用前与合适的载体例如无菌的无热原水一起配制。
化合物也可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯。
除了之前描述的制剂外，化合物还可以配制成贮库制剂。这样的长效制剂可以通过植入或经皮递送(例如皮下或肌内)、肌内注射或经皮贴剂来施用。因此可以将化合物与合适的聚合或疏水材料(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶衍生物(例如微溶盐)。
药物组合物还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(例如聚乙二醇)。
优选的药物组合物是配制用于注射例如静脉内注射的组合物，并且基于总药物组合物重量的100％，其包含约0.01％重量至约100％重量的本发明的化合物。药物-配体偶联物可以是抗体-细胞毒素偶联物，其中已经选择了针对特定癌症的抗体。
在一些实施例中，本发明的药物组合物还包含另外的治疗剂。
在一些实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂。
在一些实施例中，另外的抗癌剂选自抗代谢物，拓扑异构酶I和II的抑制剂，烷化剂，微管抑制剂，抗雄激素剂，GNRh调节剂或其混合物。
在一些实施例中，另外的治疗剂是化学治疗剂。本发明中的“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。实例包括但不限于：吉西他滨，伊立替康，阿霉素，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷(“Ara-C”)，环磷酰胺，噻托帕，白消安，细胞毒素，TAXOL，甲氨蝶呤，顺铂，美法仑，长春碱和卡铂。
在一些实施例中，第二化学治疗剂选自他莫昔芬，雷洛昔芬，阿那曲唑，依西美坦，来曲唑，依马他尼，紫杉醇，环磷酰胺，洛伐他汀，米诺斯丁，吉西他滨，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，多西他赛，多西他赛，长春花碱，诺考达唑，替尼泊苷依托泊苷，吉西他滨，埃博霉素，长春瑞滨，喜树碱，柔红霉素，放线菌素D，米托蒽醌，a啶，阿霉素，表柔比星或伊达比星。
4.试剂盒
在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包含本发明提供的治疗组合和使用治疗组合的说明书。该试剂盒还可以包括一个容器以及可选的一个或多个小瓶，试管，烧瓶，瓶或注射器。试剂盒的其他形式对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在本发明的范围内。
5.医疗用途
在另一方面，本发明提供了一种在需要治疗的对象中治疗疾病的方法，该方法包括：向该对象施用包含治疗有效量的本发明化合物的治疗组合或药物组合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
除了上述组合物和构建，本发明还提供了本发明组合的多种用途。本发明的组合的用途包括：杀死或抑制肿瘤细胞或癌细胞的生长、增殖或复制，治疗癌症，治疗癌前状态，防止肿瘤细胞或癌细胞的增殖，预防癌症，防止表达自身免疫抗体的细胞繁殖。这些用途包括对需要的动物(例如哺乳动物或人)给予有效量的本发明化合物。
本发明的组合可用于治疗受试者例如人类的疾病例如癌症。提供了通过以药学上可接受的方式向受试者提供组合物以及药学有效量的本发明的组合物来治疗肿瘤的组合和用途。
本发明中的“癌症”是指以细胞增殖不受控制为特征的人的病理状况。实例包括但不限于：癌，淋巴瘤，母细胞瘤和白血病。癌症的更具体例子包括但不限于：肺癌(小细胞和非小细胞)，乳腺癌，前列腺癌，类癌，膀胱癌，胃癌，胰腺癌，肝癌(肝细胞癌)，肝母细胞瘤，大肠癌，头颈鳞状细胞癌，食道癌，卵巢癌，宫颈癌，子宫内膜癌，间皮瘤，黑素瘤，肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌，硬纤维瘤，急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。
本发明的“抑制”或“治疗”是指减少治疗性用药和预防性治疗，其目的是减少或预防目标病理上的失调或状态。在一个实例中，在施用本发明的化合物之后，癌症患者的肿瘤尺寸会减小。“治疗”包括(1)在经历或显示疾病的病理或症状的受试者中抑制疾病，(2)在经历或显示疾病的病理或症状的受试者中减轻疾病痛苦，和/或(3)影响正在经历或表现出疾病的病理或症状的受试者或患者的任何疾病的明显减少。在一定程度上，本发明的化合物可以抑制癌细胞的生长并杀死癌细胞，它具有细胞生长抑制作用和/或细胞毒性。
本发明的“治疗有效量”是指本发明提供的化合物有效“治疗”受试者或哺乳动物疾病的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤的大小、抑制癌细胞侵入到周围器官、抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤的生长和/或缓解在某种程度上与癌症有关的一种或多种症状。
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任何顺序同时和连续施用。本发明所用的“药物组合”是指通过混合或组合活性成分而获得的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。“固定组合”是指活性成分，例如式(1)的化合物和助剂均以单一实体或剂量同时给患者施用。“非固定组合”是指活性成分，例如式(1)的化合物和助剂均作为单独的实体同时，同时的或先后的在没有特定时间限制的情况下给患者施用，其中，该给药在患者体内提供了有效的治疗水平的活性成分。后者也适用于混合物疗法，例如三种或三种以上有效成分的给药。
在一些实施例中，疾病状况是肿瘤或癌症。在一些实施例中，所述癌症或肿瘤选自胃，结肠，直肠，肝，胰腺，肺，乳腺，宫颈，子宫体，卵巢，睾丸，膀胱，肾，脑/CNS，头颈，咽喉，霍奇金氏疾病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病，黑素瘤，非黑素瘤皮肤癌，急性淋巴细胞白血病，急性骨髓性白血病，尤因肉瘤，小细胞肺癌，绒毛膜癌，横纹肌肉瘤，威尔姆斯瘤，成神经细胞瘤，毛状细胞白血病，口腔/咽，食道，喉，肾癌或淋巴瘤。
在一些实施例中，疾病状况包括异常细胞增殖，例如癌前病变。
本发明对于治疗癌症和抑制动物中肿瘤细胞或癌细胞的增殖尤其有效。癌症或癌前状态包括肿瘤、转移瘤或以细胞生长不受控制为特征的任何疾病或失调，可以通过施用本发明的药物-配体复合物来治疗或预防。该化合物将活化部分递送至肿瘤细胞或癌细胞。在一些实施例中，靶向部分与癌细胞或与肿瘤细胞相关的抗原特异性结合或缔合。由于其与配体非常接近，因此在被内化之后，可以通过例如受体介导的内吞作用将活化部分吸收进肿瘤细胞或癌细胞内部。抗原可以附着于肿瘤细胞或癌细胞，或者附着于与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。一旦进入细胞内，该接头就被肿瘤细胞或癌细胞相关的蛋白酶水解或酶解，从而释放活化部分。之后释放的活化部分自由扩散并诱导或增强免疫细胞或肿瘤细胞的免疫活性。在另一个实施例中，活化部分从化合物肿瘤微环境中切割下来，然后药物穿透细胞。
可以被本发明的化合物靶向的癌前病状的代表性实例包括：转生，增生，发育异常，结肠直肠息肉，光化性酮症，光化性唇炎，人乳头瘤病毒，白斑，扁平苔藓和鲍恩氏病。
本发明化合物可靶向的癌症或肿瘤的代表性实例包括：肺癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤，黑素瘤，乳腺癌，卵巢癌，睾丸癌，CNS癌，肾癌，肾癌，胰腺癌癌症，胃癌，口腔癌，鼻癌，宫颈癌和白血病。对于普通技术人员显而易见的是，可以选择化合物中使用的特定靶向部分，使其将活化部分靶向到要用药物治疗的肿瘤组织(即选择对肿瘤特异性抗原的特定靶向剂)。这样的靶向部分的实例是本领域众所周知的，其实例包括用于治疗乳腺癌的抗Her2，用于淋巴瘤的抗CD20，用于前列腺癌的抗PSMA和用于淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤)的抗CD30。
在一些实施例中，异常增殖是癌细胞的。
在一些实施例中，所述癌症选自：乳腺癌，结肠直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，滤泡性淋巴瘤，胃癌，胶质母细胞瘤，头颈癌，肝细胞癌，肺癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和肾细胞癌。
在一些实施例中，本发明提供了用于杀死细胞的化合物。以足以杀死所述细胞的剂量将化合物施用于细胞。在一个典型的实施例中，将化合物施用给具有该细胞的受试者。在另一个典型的实施例中，所述给药用于延迟或停止包括所述细胞(所述细胞可以是肿瘤细胞)的肿瘤的生长。为了使给药能够延迟生长，细胞的生长速率应至少比给药前的生长速率低10％。优选地，生长速率将被延迟至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或完全停止。
另外，本发明提供了用作药物的本发明化合物或药物组合物。本发明还提供了用于杀死、抑制或延迟肿瘤或癌细胞的增殖的化合物或药物组合物。
6.有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其含有在治疗上有效含量的活性成分，比如有效地达到其预期目的的量。对于特定应用的实际有效量尤其取决于所治疗的病症。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本发明的详细公开内容。
对于本发明所述的任何化合物，治疗有效量可以首先从细胞培养测定中确定。目标血浆浓度是能够抑制细胞生长或分裂的活性化合物的浓度。在优选的实施例中，细胞活性至少被抑制25％。目前优选的活性化合物的靶血浆浓度能够诱导至少约30％，50％，75％或90％甚至更高的细胞活性抑制。可以监测患者体内细胞活性的抑制百分比来评估所达到的血浆药物浓度是否合适，并且可以向上或向下调节剂量以获得所需的抑制百分比。
如本领域众所周知的，还可以从动物模型中确定用于人类的治疗有效量。例如，可以根据已在动物中发现有效的循环浓度来配制用于人的剂量。如上所述，可以通过监测细胞抑制并向上或向下来调整人的剂量。
还可从人类数据中确定已知具有相似药理活性的化合物来确定治疗的有效剂量。与已知化合物相比，可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力来调节给药的剂量。
基于上述方法和本领域公知的其他方法，调整剂量以在人体内达到最大功效，这在普通技术人员的能力范围内。
在局部给药的情况下，给药化合物的系统性循环浓度不是特别重要。在这种情况下，给药化合物在局部区域达到一定浓度从而达到预期结果。
还可以将本发明公开的特异性抗体的治疗量作为免疫组合物的组分以单一混合物形式或分开施用。在一些实施例中，治疗量是消除或减少患者的肿瘤负荷或预防或减少转移性细胞增殖的量。剂量取决于许多参数，包括肿瘤的性质、患者的病史、患者的病情、可能与其他溶瘤剂共同使用以及给药方法。给药方法包括注射(例如，肠胃外、皮下、静脉内和腹膜内等)，抗体以药学上可接受的无毒的载体提供，例如水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、5％人血清白蛋白、固定油，油酸乙酯或脂质体。典型剂量可在约0.01至约20mg/kg的范围内，例如约0.1mg/kg至约10mg/kg。其他有效的给药方法和剂量可以通过常规实验确定，并且在本发明的范围内。
当将其用于多功能疗法时，给药的治疗有效量(本发明公开)可以根据所需的效果和待治疗的受试者而变化。例如，受试者可以静脉注射至少1mg/kg(例如1mg/kg至20mg/kg，2.5mg/kg至10mg/kg或3.75mg/kg至5mg/kg)抗体剂。剂量可以分几个剂量(例如每天2、3或4个分剂量)或单次剂量给药。
在组合给药的方法中，试剂可以与本发明中使用的抗体同时施用，也可以在本发明中使用的抗体给药之前或之后施用。
对于其他给药方式，可以单独调节剂量和间隔时间来提供对所治疗的特定临床适应症有效的给药化合物的血浆水平。例如，在一个实施例中，可以对本发明的化合物每天多次以相对高的浓度给药。或者，更可取的可能是本发明的化合物以较低的有效浓度给药，并使用较不频繁的给药方案。这有利于提供与个体疾病的严重程度相对应的治疗方案。
利用本发明提供的内容，可以计划有效的治疗方案，有效的治疗方案不会引起实质性毒性，但是对于治疗由特定患者表现出的临床症状是完全有效的。该方案应考虑诸如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重程度、优选的给药方式以及所选药物的毒性特征等因素来谨慎选择活性化合物。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，但本发明不受其限制，这些实施例说明了本发明的化合物的制备方法。
实施例1
靶向HER2+CD47+双阳性细胞的双特异性GCT抗体(GCT Ab)。
为了实现概念验证的目的，生产出一种靶向HER2+CD47+双阳性细胞的双特异性精确制导的多功能治疗抗体(GCT Ab)(图4)。该GCT Ab包含与CH1的N末端连接的针对HER2的工程化的单域抗体和与CK的N末端连接的针对CD47的工程化的SIRPa的单一结合结构域。IgG 1的Fc保持为野生型，用于测试相对于HER2+或CD47+单阳性细胞GCT Ab是否可以选择性结合HER2+CD47+双阳性细胞。
根据专业知识，我们通过设计和基因合成从赫赛汀的VH基因工程化生产了抗HER2单域抗体(基因069，SEQ ID No.1和No.2)。其次，基于已发表的sdAb C7b(Even-Desrumeaux,K.et al:Molecular bioSystems,2012,p.2385-2394,Vol.8,No.9)设计并合成了部分人源化的抗HER2单域抗体。它们通过以下接头(接头SEQ ID No.13～No.27，包括天然的VH-CH1接头、嵌合的VH-CK接头、GS-flexible接头、IgG1和IgG3的上和中铰链接头等)之一被工程化至人IgG1重链的CH1的N末端。
人CD47受体SIRPa的结合域被合成为CD47结合域。首先合成人SIRPa的结合域的野生型变体1(基因007，SEQ ID No.5和6，具有4.5×10-7M的亲和力)和变体2(基因012，SEQ IDNo.7和8，具有2.8x10-7M的亲和力)(Weiskopf,K.et al:Science 341(6141),88-91,2013)，它们通过SEQ ID No.13～No.27中的一种接头被工程化至人κ轻链CK的N端。
通过用空κ链(没有V区)共转染到Expi293F细胞(特指H069和H016)中来表达重链中的两种抗Her2的单域抗体。通过ELISA检测重组HER2胞外结构域蛋白的外观结合亲和力。如图5A所示，部分人源化的抗HER2sdAb C7b的H016具有约10-6M的表观EC50，而赫赛汀的单结构域VH的H069具有小于约10-6M的表观EC50。
通过与空IgGl重链(无VH区)共转染到Expi293F细胞(特指S007和S012)中，表达了κ链中的两个CD47拮抗剂SIRPa变体。通过ELISA检测重组CD47胞外结构域蛋白的外观结合亲和力。如图5B所示，SIRPa变体2的S007抗体和SIRPA变体1的S012抗体均显示出小于约10- 7M的EC50结合亲和力，而高亲和力SIRPa突变体CV1的阳性对照表现出比10-10M高的EC50结合亲和力。
然后，我们设计了一系列重组双特异性抗体，抗HER2单结构域通过不同的接头与IgG1重链相连，而SIRPa变体的CD47结合结构域通过不同的接头与κ链相连。在初步筛选了不同重链和轻链结构组合的基质共转染的Expi293F细胞培养物后，我们确定了可提供一致的产量和ELISA结合活性的两对组合，并命名为抗体AbD066(适用于重链的SEQ ID No.36、No.37和适用于轻链的SEQ IDNo.38，No.39)和AbD068-1(适用于重链的SEQ ID No.40，No.41和适用于轻链的SEQ IDNo.42、No.43)。如图5C和5D所示，与H069和S012亲本抗体相似，在ELISA中AbD066保留了对CD47或HER2的小于约10-7M的结合活性，而AbD068-1保留了H16对HER2的10-7M的结合活性和S007对CD47小于约10-7M的结合活性。
为了检查靶向HER2和CD47靶标的双特异性抗体在细胞表面的结合能力，我们制备了一组稳定的CHO-K1细胞库，这些细胞库均为HER阳性、CD47阳性或HER和CD47双阳性以及对照。我们用重组抗体进行了细胞表面染色实验。如图6A和6B所示，AbD066和AbD068-1都可以高浓度结合细胞表面CD47，但是染色的CD47单阳性CHO细胞池的百分比和MFI随着抗体的滴定而急剧下降。AbD066和AbD068-1显示出对HER2单特异性CHO细胞库的差异染色。AbD066仅以非常高的浓度(100nM)对细胞进行部分染色，这与其在ELISA测定法中对HER2的弱结合是一致的。AbD068-1显示出与CD47相比更低但相似的细胞表面HER2染色模式，即随着抗体的滴定，染色的HER2单阳性CHO细胞池的百分比和MFI急剧下降。值得注意的是，AbD066和AbD068-1均对HER2和CD47双阳性CHO细胞池显示出强染色。AbD066和AbD068-1在HER2和CD47双阳性CHO细胞上的MFI明显高于单独在HER阳性或CD47阳性CHO细胞上的MFI，并且也高于它们的累加值。AbD066和AbD068-1染色的HER2和CD47双阳性CHO细胞的百分比比低浓度的1nM的AbD066(图6A)和0.1nM的AbD068-1(图6B)高。双靶阳性CHO细胞的染色强度比单靶阳性CHO细胞强约100倍。
因此，这些实验表明，使用我们的GCT-Ab平台，针对同一细胞上两个不同表面靶标的两个微调低亲和力单结合域的组合，对具有双靶标的细胞产生了协同结合亲和力效应，该效应优于与仅表达两个靶标之一的细胞。这表明通过我们的GCT Ab方法生产的双特异性抗体将优先靶向表达两种抗原的细胞，而不是仅表达靶标之一的细胞。被设计为ABP366(AbD066和AbD068-1)的新型双特异性GCT Ab是潜在有效的抗体药物，可更安全有效地治疗HER2/CD47双阳性癌症。它提供了高效多功能的靶向效应：(1)通过HER2和CD47的协同结合选择性靶向肿瘤，所述HER2和CD47富集在某些肿瘤而非正常细胞上；(2)通过肿瘤结合阻断CD47/SIRPa的相互作用选择性吸引巨噬细胞侵袭肿瘤；(3)保留长的PK和Fc效应子功能。它还提供了安全的、可微调的亲和力组合：(1)CD47结合的亲和力低(～lμM)，不能单独将CD47与正常细胞紧密结合，但是当富集于肿瘤时足以阻断CD47的抑制作用；(3)对肿瘤靶标HER2的亲和力很低(～lμM)，单独不能与正常细胞上的低水平HER2紧密结合。
实施例2
双特异性GCT Ab靶向PD-L1+CD47+双阳性细胞。
PD-L1和CD47都是癌细胞用来避免免疫效应细胞攻击的免疫调节表面蛋白。PD1/PD-L1靶标在该领域已被证明是有价值的，而CD47靶标则还在广泛测试中。但是，两个靶标均起着重要的免疫调节功能作用，阻止其中任何一个通常可能会产生不利影响。我们的GCTAb策略能选择性地靶向表达PD-L1和CD47的癌细胞，而不会伤害正常细胞。为了证明这一概念，我们设计并生成了双特异性GCT Ab靶向PD-L1和CD47双阳性细胞。此GCT Ab包含工程化的单个结合域，针对CD47的SIRPa和针对PD-L1的PD-1的单个IgV结构域，它们分别与CH1和CK的N端相连(图4)。IgG1的Fc部分被设计为P329G-LALA突变体，以消除所有效应细胞的功能同时保留FcRn结合持久的PK以及蛋白A结合特性来进行标准生产和纯化。我们旨在测试相对于PD-L1+或CD47+单阳性细胞GCT Ab是否可以选择性结合PD-L+CD47+双阳性细胞。
由于PD-1对PD-L1的亲和力较低(3.88μM)(Maute，R.et al：Proc Natl Acad SciUS A.112(47)：E6506-14.2015)，我们选择了天然的PD-1与PD-L1的胞外结合域作为GCT Ab的单结合域片段，这可能是我们GCT Ab设计的理想选择。我们改造了PD-1的IgV结构域(基因048，SEQ ID No.11和No.12)及其较低亲和力的L128R突变体(基因050，SEQ ID No.9和No.10)。我们选择将PD-L1结合结构域连接至CL链，因为我们的初始实验表明PD-1结构域的位置将影响其与PD-L1的结合功能。
κ链中的两个PD-1IgV通过与空IgG 1重链(无VH区)共转染到Expi293F细胞中表达，命名为P048和P050。通过ELISA对重组PD-L1胞外域蛋白检测得出它们的外观结合亲和力。如图7所示，PD-1突变体的P048和P050均表现出比10-7M低的EC50结合亲和力，而作为阳性对照的高亲和力PD-1突变体HAC表现出比10-10M高的EC50结合亲和力。
SIPRa的两个抗CD47单结构域(基因007和基因012)是在重链中设计的，并通过与空κ链(没有V区)共转染到Expi293F细胞中而表达。通过ELISA检测它们对重组CD47胞外域蛋白的外观结合亲和力，与图5B中的S007和S012相似。
然后，我们设计了一系列重组双特异性抗体，其SIRPa变体的CD47结合结构域通过不同的接头与IgG1的重链连接，PD-1变体的PD-L1结合结构域通过不同的接头与κ链连接。在初步筛选了不同重链和轻链结构组合的基质共转染的Expi293F细胞培养物后，我们鉴定出可提供一致产量和ELISA结合活性的两对组合，并命名为抗体AbD036(对于重链是SEQ IDNo.28，No.29，对于轻链是SEQ ID No.30，No.31)和AbD037(对于重链是SEQ ID No.32，No.33，对于轻链是SEQ ID No.34，No.35)。如图7所示，在ELISA中，AbD036显示出对CD47或PD-L 1的结合活性小于约10-7M，而AbD037也显示出对P048的结合活性小于1×10-7M。抗PD-L1的活性和S007的抗CD47的结合活性小于约10-7M。
为了检查靶向PD-L1和CD47靶标的双特异性抗体在细胞表面的结合能力，我们制备了一个稳定的CHO-K1细胞系，该细胞系是PD-L1单阳性或CD47单阳性或PD-L1和CD47双阳性。我们用重组抗体进行了细胞表面染色实验。如图8A和8B所示，AbD036和AbD037都可以很好地结合细胞表面的CD47，而染色的CD47单阳性CHO细胞池的百分比和MFI随着抗体的滴定而下降。AbD036和AbD037显示出PD-L1单特异性CHO细胞库的差异染色。AbD036仅以非常高的浓度(100nM)对细胞进行部分染色，这与ELISA分析中PD-L1的弱结合是一致的。AbD037显示出比CD47更低但相似的细胞表面PD-L1染色模式，即随着抗体的滴定，染色的PD-L1单阳性CHO细胞池的百分比和MFI急剧下降。值得注意的是，AbD036和AbD037均表现出PD-L1和CD47双阳性CHO细胞池的强染色。PD-L1和CD47双阳性CHO细胞的AbD036和AbD037的MFI明显高于单独的PD-L1阳性或CD47阳性CHO细胞的MFI，也高于它们的累加值。AbD036和AbD037染色的PD-L1和CD47双阳性CHO细胞的百分比在1nM低浓度的AbD036(图8A)和0.1nM AbD037(图8B)中都保持较高。双靶阳性CHO细胞上的染色比单靶阳性细胞上的染色强约10倍。
因此，我们生产了可以选择性结合PD-L1和CD47双阳性细胞的AbD036和AbD037的新型双特异性GCT Ab。由于许多癌细胞会同时上调PD-L1和CD47的表达来避免免疫监视和消除，因此我们针对PD-L1和CD47的GCT Ab通过在肿瘤细胞上选择性阻断PD-L1和CD47抑制途径，有望成为许多肿瘤疾病的有效治疗药物。
实施例1和2的这些实验证明，由我们的GCT Ab方法生产的双特异性抗体通常可以选择性地靶向表达两种抗原的细胞，而不是仅表达靶标之一的细胞。这对于开发抗癌抗体药物具有重要意义。癌细胞通常过度表达多个细胞表面靶标，这些靶标也可能单独存在于某些正常组织上。在正常组织存在时选择性结合双抗原癌细胞的双特异性GCT-Ab的使用可以大大减少脱靶不良反应，扩大给药窗口并提高总体治疗效力和功效。
SEQUENCE LISTING
<110> Antibody BioPharm, Inc.
<120> GUIDED COMBINATIONAL THERAPEUTIC ANTIBODY
<130> 1023-701WO
<140> TBA
<141> 2018-06-07
<150> US 62/516,583
<151> 2017-06-07
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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ggtttcgcac ctgtagaaga aaggcagtat gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Val Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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atcacccctg ctgacgcagg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg cagccctgac 300
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Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
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Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
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Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
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Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
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Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
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Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
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Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
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Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
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Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 27
tcgagcgaca agacacgtac ggcgtcgacc 30
<210> 28
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 28
gaagaggaac tccaggtgat ccagcccgac aagtccgtga gcgtggctgc tggagagagc 60
gccatcctgc actgtaccgt gacctccctg atccctgtgg gacccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac ctgcaagaga actgatctac aaccagaagg agggacactt ccctagagtg 180
accacagtga gcgagtccac caagcggaat aacatggact tctccatcag aatcggcaac 240
atcacccctg ctgacgcagg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg cagccctgac 300
gatgtcgagt tcaagtccgg cgctggaacc gagctgagcg tgagagccaa gccctcgagc 360
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgctggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc cagggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 1350
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 29
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 30
<211> 705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 30
gactccccag acaggccctg gaaccccccc accttctccc cagccctgct cgtggtgacc 60
gaaggggaca acgccacctt cacctgtagc ttctccaaca catcggagag cttcgtgcta 120
aactggtatc gcatgagccc cagcaaccag acggacaagc tggccgcctt ccccgaggac 180
cgcagccagc ccggccagga ctgccgcttc cgtgtcacac aactgcccaa cgggcgtgac 240
ttccacatga gcgtggtcag agcccggcgc aatgacagcg gcacctacct ctgtggagct 300
atctcccggg cccccaaggc gcagatcaaa gagagcctgc gggcagagct gagggtgaca 360
gagagaaggg cagaagtctc gagccgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
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ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
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<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 31
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Arg Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Ser Ser
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 32
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 32
gaagaggaac tccaggtgat ccagcccgac aagtccgtga gcgtggctgc tggagagagc 60
gccatcctgc actgtaccgt gacctccctg atccctgtgg gacccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac ctgcaagaga actgatctac aaccagaagg agggacactt ccctagagtg 180
accacagtga gcgagtccac caagcgggag aacatggact tctccatcag catctccaac 240
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aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
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tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
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aagagcctct ccctgtctcc cgggaaa 1347
<210> 33
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 33
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 34
<211> 705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 34
gactccccag acagaccttg gaacccacct accttctccc cagcactgct cgtcgtgacc 60
gaaggagaca acgcaacctt cacctgtagc ttctccaaca catcggagag cttcgtgcta 120
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atctccctgg ctcccaaggc acagatcaaa gagagcctga gggcagagct gagggtgaca 360
gagagaaggg cagaagtctc gagccgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
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<210> 35
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 35
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Ser Ser
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 36
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 36
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccct cctccaagag cacctctggg 420
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tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
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aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc cagggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 1350
<210> 37
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 38
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 38
gaagaggaac tccaggtgat ccagcccgac aagtccgtga gcgtggctgc tggagagagc 60
gccatcctgc actgtaccgt gacctccctg atccctgtgg gacccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac ctgcaagaga actgatctac aaccagaagg agggacactt ccctagagtg 180
accacagtga gcgagtccac caagcggaat aacatggact tctccatcag aatcggcaac 240
atcacccctg ctgacgcagg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg cagccctgac 300
gatgtcgagt tcaagtccgg cgctggaacc gagctgagcg tgagagccaa gccctcgagc 360
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 420
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 480
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agcttcaaca ggggagagtg ttag 684
<210> 39
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 39
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 40
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 40
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agttatgcca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagctgga gtggtgcaaa catatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagga cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agtaaagctc 300
ggtttcgcac ctgtagaaga aaggcagtat gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcgagcg cgtcgaccaa gggcccatcg gtcttcccgc tagcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacctgtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
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agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
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cactacacgc agaagagcct ctccctgtct cccgggaaa 1359
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Val Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Lys Leu Gly Phe Ala Pro Val Glu Glu Arg Gln Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Pro Gly Lys
450
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<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 42
gaagaggaac tccaggtgat ccagcccgac aagtccgtga gcgtggctgc tggagagagc 60
gccatcctgc actgtaccgt gacctccctg atccctgtgg gacccatcca gtggttcaga 120
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atcacccctg ctgacgcagg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg cagccctgac 300
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acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 420
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ttcaacaggg gagagtgt 678
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 43
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
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Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
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Val Arg Ala Lys Pro Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys
225
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 44
gactccccag acaggccctg gaaccccccc accttctccc cagccctgct cgtggtgacc 60
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cgcagccagc ccggccagga ctgccgcttc cgtgtcacac aactgcccaa cgggcgtgac 240
ttccacatga gcgtggtcag agcccggcgc aatgacagcg gcacctacct ctgtggagct 300
atctcccggg cccccaaggc gcagatcaaa gagagcctgc gggcagagct gagggtgaca 360
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<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 45
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Arg Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Ser Ser
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val Leu Gly Gln
225 230 235 240
Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
275 280 285
Trp Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
305 310 315 320
Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Gly Glu Gly Gly Trp Gly Ala Asn
340 345 350
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
<400> 46
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
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Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
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Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
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Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
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Leu Cys Gly Ala Ile Ser Arg Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
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Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Ser Ser
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val Leu Gly Gln
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Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ala Gly Ser
260 265 270
Ile Phe Ser Phe Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
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Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Gly Ser Asp Asp Arg Val Thr Tyr Ala
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Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Arg
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Thr Ala Gly Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Asn Ala Gln Thr Asp Leu Arg Asp Trp Thr Val Arg Glu
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 48
gactccccag acagaccttg gaacccacct accttctccc cagcactgct cgtcgtgacc 60
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Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
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275 280 285
Trp Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr
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325 330 335
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Ser Ser
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val Leu Gly Gln
225 230 235 240
Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ala Gly Ser
260 265 270
Ile Phe Ser Phe Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
275 280 285
Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Gly Ser Asp Asp Arg Val Thr Tyr Ala
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Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Arg
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Tyr Tyr Cys Asn Ala Gln Thr Asp Leu Arg Asp Trp Thr Val Arg Glu
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 52
gaagaggaac tccaggtgat ccagcccgac aagtccgtga gcgtggctgc tggagagagc 60
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ggagctggac ctgcaagaga actgatctac aaccagaagg agggacactt ccctagagtg 180
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caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 53
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
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Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
260 265 270
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Trp Leu Glu Trp Val Ser
275 280 285
Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
290 295 300
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Lys Met Gly Glu Gly Gly Trp Gly Ala Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
355
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<223> Synthetic polypeptide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
<400> 56
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<223> Synthetic polypeptide
<400> 57
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met
260 265 270
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275 280 285
Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
290 295 300
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
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Met Gly Glu Gly Gly Trp Gly Ala Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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355
<210> 58
<211> 1071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
<400> 58
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<220>
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275 280 285
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 61
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 1098
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 62
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt cgccgctgca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgggagcg ggtcgcaaag ctgctgacca ctagcggtag cacatacctg 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc ggccgacagc 300
ttcgaggacc ccacctgcac cctggtgacc agcagcggcg cctttcagta ctggggccag 360
ggcaccctgg tcaccgtgtc ctcacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtaccgt cctaggtcag 720
cccaaggcgg ccgctgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt acagcctggg 780
gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct ttgacgacta tggcatgagc 840
tgggtccgcc aggctccagg gaagtggctg gagtgggtct cagatattag ctggaatggt 900
ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag ggccggttca ccatctccag agacaatgcc 960
gagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgaaacctg acgacacggc cgtgtattac 1020
tgtgcgaaaa tgggtgaagg gggatggggt gcaaatgact actggggcca ggggacccag 1080
gtcaccgtgt cctcataa 1098
<210> 63
<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Arg
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser
100 105 110
Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val Leu Gly Gln
225 230 235 240
Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
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275 280 285
Trp Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
305 310 315 320
Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Gly Glu Gly Gly Trp Gly Ala Asn
340 345 350
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 64
<211> 1095
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 64
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt cgccgctgca tggcctggtt ccgccaggct 120
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ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
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cccaaggcgg ccgctgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttagt gcagcctggg 780
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accgtctcct cataa 1095
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Arg
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Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser
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Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val Leu Gly Gln
225 230 235 240
Pro Lys Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ala Gly Ser
260 265 270
Ile Phe Ser Phe Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
275 280 285
Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Gly Ser Asp Asp Arg Val Thr Tyr Ala
290 295 300
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Arg
305 310 315 320
Thr Ala Gly Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Cys Asn Ala Gln Thr Asp Leu Arg Asp Trp Thr Val Arg Glu
340 345 350
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
355 360
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 66
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agttatgcca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagctgga gtggtgcaaa catatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagga cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agtaaagctc 300
ggtttcgcac ctgtagaaga aaggcagtat gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg gtcttcccgc tagcaccctc ctccaagagc 420
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acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagct 720
gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcggagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
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cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260
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cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1362
<210> 67
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Val Ala Asp Ser Val
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
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245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
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325 330 335
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 68
<211> 1368
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 68
gatgtgcagc tgcaggcktc tggaggaggc tcggtgcagg cgggagggtc tctgaggctc 60
tcctgtgcag cggatgcata catctacagt aggaaccgtc tggcctggtt ccgccggtct 120
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gtcaccgtct cctcagcgtc gaccaagggc ccatcggtct tcccgctagc accctcctcc 420
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ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
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<220>
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<400> 69
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asp Ala Tyr Ile Tyr Ser Arg Asn
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Arg Leu Ala Trp Phe Arg Arg Ser Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
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Ala Thr Met Cys Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Glu Leu Ile Leu Gln
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455

Claims (15)

1.一种工程化的双特异性抗体，包括：(1)包含第一抗原结合结构域的第一链，该第一抗原结合结构域结合第一靶标，并且具有约10-5～10-8M的亲和力；(2)包含第二抗原结合结构域的第二链，该第二抗原结合结构域结合第二靶标，并且具有约10-5～10-8M的亲和力；其中所述第一抗原结合结构域连接至所述双特异性抗体的重链第一恒定区的N末端，其中所述第二抗原结合结构域连接至所述双特异性抗体的轻链的N末端，其中所述第一靶标和第二靶标均共定位在靶细胞上；并且其中所述双特异性抗体能达到约10-9～10-12M的协同亲和力来选择性结合含所述双靶的细胞，而不是仅表达所述第一靶标或所述第二靶标的单靶细胞。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一靶标和第二靶标选自肿瘤靶标，疾病特异性受体和免疫调节功能靶标。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述肿瘤靶标选自Her2，CEA，ROR2，TROP2，mGluR1和EGFR等。
4.根据权利要求2所述的抗体，其中所述检查点受体选自PD-L1，CD47，LAG3，CD59和Tim3等。
5.一种工程化的三特异性抗体，其包括：(1)包含第一抗原结合结构域的第一链，该第一抗原结合结构域结合第一靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力；(2)包含第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的第二链，该第二抗原结合结构域结合第二靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力，该第三抗原结合结构域结合第三靶标，具有约10-5～10-8M的亲和力；其中所述第一抗原结合结构域连接至所述三特异性抗体的重链第一恒定区的N末端，其中所述第二抗原结合结构域连接至所述三特异性抗体的轻链的N末端，其中所述第一靶标和第二靶标均共定位在相同的靶细胞上；并且其中所述三特异性抗体能达到约10-9～10-12M的协同亲和力来选择性结合含所述双靶的细胞，而不是仅表达所述第一靶标或所述第二靶标的单靶细胞；其中所述第三抗原结合结构域为与所述三特异性抗体的轻链的C末端连接；并且其中所述第三靶标是效应子功能靶标或调节因子；并且其中所述第三抗原结合结构域能有效介导对靶细胞的效应细胞功能或调节因子功能。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述第三效应子功能靶标选自CD3，CD16a和CD59等。
7.根据权利要求2所述的抗体，其中所述重链包含以下序列中的任何一个：Seq IDNo.1,Seq ID No.2,Seq ID No.3,Seq ID No.4,Seq ID No.5,Seq ID No.6,Seq ID No.7,Seq ID No.8,Seq ID No.9,Seq ID No.10,Seq ID No.11,Seq ID No.2,Seq ID No.28,Seq ID No.29,Seq ID No.32,Seq ID No.33,Seq ID No.36,Seq ID No.37,Seq IDNo.40,Seq ID No.41,Seq ID No.60,Seq ID No.61,Seq ID No.66,Seq ID No.67,Seq IDNo.68,和Seq ID No.69。
8.根据权利要求2所述的抗体，其中所述轻链包含以下序列中的任何一个：Seq IDNo.1,Seq ID No.2,Seq ID No.3,Seq ID No.4,Seq ID No.5,Seq ID No.6,Seq ID No.7,Seq ID No.8,Seq ID No.9,Seq ID No.10,Seq ID No.11,Seq ID No.12,Seq ID No.30,Seq ID No.31,Seq ID No.34,Seq ID No.35,Seq ID No.38,Seq ID No.39,Seq ID No.42和Seq ID No.43。
9.根据权利要求6所述的抗体，其中所述轻链包含以下序列中的任一个：Seq IDNo.44,Seq ID No.45,Seq ID No.46,Seq ID No.47,Seq ID No.48,Seq ID No.49,Seq IDNo.50,Seq ID No.51,Seq ID No.52,Seq ID No.53,Seq ID No.54,Seq ID No.55,Seq IDNo.56,Seq ID No.57,Seq ID No.58,Seq ID No.59,Seq ID No.62,Seq ID No.63,Seq IDNo.64和Seq ID No.65。
10.根据权利要求2所述的抗体，其中(1)所述重链包含以下序列中的任何一个：SEQ IDNo.1，No.2，No.3，No.4，No.36，No.37，No.40，No.41；(2)所述轻链包含以下序列中的任何一个：SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.38，No.39，No.42，No.43，其中所述抗体结合Her2和CD47双阳性靶细胞。
11.根据权利要求2所述的抗体，其中(1)所述重链包含SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.28，No.29，No.32，No.33序列中的任何一个；(2)所述轻链包含SEQ ID No.9，No.10，No.11，No.12，No.30，No.31，No.34，No.35序列中的任何一个，其中所述抗体结合PD-L1和CD47双阳性靶细胞。
12.根据权利要求6所述的抗体，其中(1)所述重链包含SEQ ID No.1，No.2，No.3，No.4，No.36，No.37，No.40，No.41序列中的任何一个；(2)所述轻链包含SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.52，No.53，No.54，No.55，No.56，No.57，No.58，No.59序列中的任何一个，所述抗体结合Her2和CD47双阳性靶细胞。
13.根据权利要求6所述的抗体，其中(1)所述重链包含SEQ ID No.5，No.6，No.7，No.8，No.28，No.29，No.32，No.33序列中的任何一个；(2)所述轻链包含SEQ ID No.9，No.10，No.11，No.12，No.44，No.45，No.46，No.47，No.48，No.49，No.50，No.51序列中的任何一个，其中所述抗体结合PD-L1和CD47双阳性靶细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体，其用于制造治疗癌症或与之相关的病症的药物的用途。
15.权利要求1-13中任一项的抗体在制备治疗癌症或与其相关的病症的药物中的用途。
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