CN114805578B

CN114805578B - 一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN114805578B
Application number: CN202210488451.9A
Authority: CN
Inventors: 赵鹏; 阮健; 盛剑鹏; 徐帅帅
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2042-05-06
Also published as: CN114805578A

Abstract

本发明提供了一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用，属于抗体制备技术领域。本发明提供的LILRB2羊驼纳米抗体不同于现有的抗体，碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示，可应用于制备检测LILRB2的试剂或制备控制炎症反应、控制细胞毒性以及肿瘤治疗的药物中，并且具有分子结构简单，易于大量表达，可单独稳定存在于体外，节省工序，操作、控制、使用简便等的优点。此外，本发明的抗体还具有高亲和性，抗体噬菌体对LILRB2的结合效率明显高于HLA，识别LILRB2的能力强，重复性好。

Description

一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用。

背景技术

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LILRB2，Leukocyte ImmunoglobulinLike Receptor B2)，是白细胞免疫球蛋白样受体家族的成员，该家族存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。编码的蛋白质包含两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。该受体主要在单核细胞、B淋巴细胞、树突细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞上表达，与Fcα受体和自然杀伤抑制性受体超家族相关，可与抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合，并转导抑制免疫反应刺激的信号。一方面，它被认为可以控制炎症反应和细胞毒性，以帮助免疫反应集中并限制机体自身反应性。另一方面，它和CTLA4，PD-1等免疫检查点蛋白具有相同的ITIM基序，是一类新型的免疫检查点蛋白分子，可与配体相互作用，抑制免疫细胞的杀伤肿瘤细胞的功能，增加肿瘤的免疫逃逸，从而促进肿瘤进展。

羊驼与人和小鼠等动物有明显的物种差异和进化差异，因此羊驼抗体能够识别人类不同的抗原表位决定簇，而且这些抗体同时能够识别啮齿类动物和人的同源抗原，对于生物学、医学、药学等专业的基础研究和临床研究有重要应用价值。而且，目前大多数实验用小鼠的品系都是通过近交繁殖而来的纯系小鼠，往往对外源性抗原的免疫应答比较弱，同时产生的抗体多样性和亲和力都比较低，不一样的是，羊驼一般都不是由近交繁殖而来，使其非常容易产生高亲和力、多样化程度高的抗体。重链抗体为驼类天然存在的仅由两条重链组成的特殊抗体，包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，CH1区天然缺失。重链抗体通过重链上的一个VHH结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，被称为驼类单域抗体(SdAb)或者纳米抗体。纳米抗体晶体直径为2.5nm，长约4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10(约15kD)，但依然具有完整的抗原识别能力。和结构相当保守的由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的蛋白分子的传统抗体相比，纳米抗体分子量小，亲水性佳，并且可以通过大肠杆菌等微生物进行体外重组表达进行大量生产，有效避免传统抗体的批次间差异问题。得益于以上特征，使得纳米抗体在新药物发现方面具有一系列优势，表现出极大的潜力：由于纳米抗体的独特结构和较小的尺寸，它有可能结合常规抗体难以结合的位点，与常规抗体相比，纳米抗体对抗原具有更好的识别能力，和靶点结合特异性更强；组织穿透力更高；它们耐受极端的温度和pH值、有机溶剂和蛋白酶，有助于提高结构稳定性、保证其生物活性并增强生物识别的动力学；简单分子结构也使其易于在微生物表达系统中大量表达，从而实现低成本的工业化大规模生产；纳米抗体的亲和力可以通过聚合具有短连接序列的单价纳米抗体形成多价纳米抗体或通过抗体的体外亲和力成熟来进一步提高，更容易改造和优化，更容易人源化。

目前，针对LILRB2的抗体都是小鼠、大鼠或兔来源，目前尚缺乏羊驼来源的抗体。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用。本发明提供的LILRB2羊驼纳米抗体不同于现有的抗体，碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.3～SEQ IDNo.4所示，可应用于制备检测LILRB2的试剂或制备控制炎症反应、控制细胞毒性以及肿瘤治疗的药物中，并且具有分子结构简单，易于大量表达，可单独稳定存在于体外，节省工序，操作、控制、使用简便等的优点。此外，本发明的抗体还具有高亲和性，抗体噬菌体对LILRB2的结合效率明显高于HLA，识别LILRB2的能力强，重复性好。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体，其碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种所述羊驼纳米抗体的制备方法，包括：A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；D)经诱导表达和纯化获得白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体。

优选的，所述步骤A)中免疫羊驼是经抗原和佐剂体积1:1乳化好抗原免疫的羊驼，免疫时所述乳化好抗原的剂量为2.4～3.2mg/只，每隔2周进行一次免疫，在第4次免疫5～7d后获得免疫羊驼。

优选的，免疫时所述乳化好抗原的剂量为2.8mg/只。

优选的，所述步骤A)中RNA分为两步反转录扩增成cDNA：第一步PCR反应体系为：cDNA模板2μL，Alpa001F引物2μL，Alpa001R引物2μL，10×TaqBuffer 5μL，dNTP 4μL，Taq(HS)0.25μL，ddH₂O补足到50μL；第一步PCR的反应条件为：98℃条件下3分钟；95℃条件下30秒，57℃条件下30秒，72℃条件下40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；72℃条件下5分钟；第二步PCR反应体系为：DNA模板2ul，Alpa002F引物2μL，Alpa002R引物2μL，10×TaqBuffer 5μL，dNTP 4μL，Taq(HS)0.25μL，ddH₂O补足到50μL；第二步PCR的反应条件为：98℃条件下3分钟；95℃条件下50秒，55℃条件下30秒，72℃条件下40秒，重复12个循环；72℃条件下10分钟。

优选的，所述步骤B)中构建噬菌体文库的步骤为：首先将步骤A)扩增得到的多样化抗体基因序列和噬菌体载体进行酶切，各自纯化并进行连接反应，得到连接产物；然后将连接产物转化至TG1感受态细胞中，培养至OD600达到0.4～0.6，加入辅助噬菌体继续培养，获得噬菌体文库。

优选的，将所述连接产物转化至TG1感受态细胞中，培养至OD600达到0.5。

优选的，所述步骤C)中噬菌体库筛选至抗原效价和对照相差100～1000倍，富集程度达到10^-3得到阳性克隆菌。

优选的，还包括利用ELISA单克隆进行验证的过程。

本发明还提供了一种所述羊驼纳米抗体或制备方法在制备检测白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2试剂或制备控制炎症反应、控制细胞毒性以及肿瘤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

(1)本发明提供了LILRB2的羊驼抗体，不同于已有的小鼠、大鼠或兔来源的抗体，具有分子结构简单的特点，也构建成噬菌体使其易于在微生物表达系统中大量表达，工序的节省，操作、控制、使用的简便。

(2)本发明的抗体通过重链上的一个VHH结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，不同于已有的抗体。

(3)本发明的抗体具有高亲和性，并且抗体噬菌体对LILRB2的结合效率明显高于HLA，识别LILRB2的能力强，重复性好，并且抗体的氨基酸序列组成不同于现有的抗体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1LILRB2羊驼抗体的获得

(1)获得抗原

从商家购买纯抗原LILRB2，接收时检查状态良好并将抗原冷冻于-80℃，管标LILRB2。

(2)羊驼免疫

一只未免适龄羊驼可以同时免疫1-3个抗原，每次免疫每种抗原剂量保持在0.5mg左右，总体积在1.5mL以下，免疫前将抗原和佐剂体积1:1乳化使其形成均匀混合物。

选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的未免羊驼，记录未免羊驼耳号。每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧皮下注射，每侧分2点注射，每点注射约0.35mL乳化好的抗原。免疫后观察半小时，确认羊驼状态良好，无不适症状。每2周免疫一次，至少进行4次免疫。每次抗原免疫前进行采血用于免疫评价，每次取5mL血液；血液当天使用预冷25℃离心机，4000rpm离心10分钟，分离冻存上层血清，用于后续抗体效价检测。

在第4次免疫后间隔5-7天从羊驼颈部静脉进行采血50mL。在50mL的离心管中先加入15mL细胞分离液，然后缓慢加入15mL血液。加入血液时小心缓慢以防止血液和分离液混匀。之后离心机预冷至25℃，400g离心30分钟后，观察离心管中血液分离情况，上层血清保存在新的离心管中，-80℃保存，用移液器小心吸取出中间棉状上层免疫细胞至新的50mL离心管中。每管加入室温放置的10mL PBS缓冲液，25℃，400g离心20分钟。去除上清液，每管加入室温放置的5mL PBS缓冲液，轻轻混匀后，使用血球计数板计算细胞数目，然后25℃，400g离心20分钟。去除上清液，根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞得到10⁷/mL细胞溶解液，-80℃保存。

(3)克隆至噬菌体质粒

将用Trizol保存的外周血淋巴细胞冰上溶解后转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿震荡混匀；室温静置5分钟后4℃，12000g离心15分钟；将离心后的上清液转移到新的离心管；往新离心管中加入等体积的异丙醇；颠倒混匀室温静置10分钟后4℃，12000g离心10分钟；弃上清后用75％乙醇清洗沉淀，4℃和7500g的条件下离心5分钟后弃去上清，沉淀室温晾干后溶解于适量的无RNA酶的水中。

将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用Oligo dT及random primers。从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片段，使用Taq DNA Polymerase HotStart酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，Alpa001F引物(SEQ ID No.5：5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3')2μL，Alpa001R引物(SEQ ID No.6：5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3')2μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP 4μL，Taq(HS)0.25μL，ddH2O补足到50μL。PCR的反应条件为：98℃条件下3分钟；95℃条件下30秒，57℃条件下30秒，72℃条件下40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；72℃条件下5分钟。将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可以看到一条1.0kb左右一条0.7kb左右的PCR条带，对0.7kb大小的条带切胶进行DNA纯化回收。

以上一步PCR扩增并回收后的DNA片段作为模板再次扩增特定的抗体片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：DNA模板2ul，Alpa002F引物(SEQ ID No.7：5'-GATGTGCAGCTGCAGGTCTGGAGGAGG-3')2μL，Alpa002R引物(SEQ ID No.8：5′-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGTGGGT-3′)2μL，10×TaqBuffer 5μL，dNTP4μL，Taq(HS)0.25μL，ddH2O补足到50μL。PCR的反应条件为：98℃条件下3分钟；95℃条件下50秒，55℃条件下30秒，72℃条件下40秒，重复12个循环；72℃条件下10分钟。将得到的PCR扩增产物进行DNA纯化回收。

将上一步扩增得到的多样化抗体基因序列和噬菌体载体使用PstⅠ、BstEⅡ进行双酶切，各自纯化并进行连接反应。将连接产物进行DNA纯化回收，并使用超纯水溶解。

(4)构建噬菌体库

提前将无菌的电转杯置于冰上预冷，待TG1感受态细胞50μL融化后加入100ng回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的Bacteria转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入1mL SOC培养基，至少进行20个电转，将细胞37℃复苏60分钟后涂在含有氨苄抗性的LB培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20％的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为菌库。

将上一步刮下的菌体混匀后将数目约为10⁹个细菌转移到100mL预先加入氨苄抗生素的2×YT培养液中，37℃条件下220rpm培养直至OD600nm达到0.5。

按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，30℃过夜摇床培养。将过夜培养的细菌在4℃条件下13000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的5×PEG8000/NaCl，在冰上孵育30-60分钟。4℃条件下13000rpm离心10分钟去除上清后加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入250μL 5×PEG8000/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃条件下16000g离心15分钟后去除上清液并将沉淀溶解在1mLPBS中得到噬菌体库，长期-80℃保存。

(5)噬菌体库筛选

在已建立的容量为10⁹的噬菌体库中使用免疫管法筛选方法进行LILRB2抗原天然库筛选。将50μg抗原加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，包被总体积为2mL。同时平行包被牛血清白蛋白(BSA)以作为筛选富集对照。4℃缓慢旋转，过夜孵育包被蛋白。

将适量扩增和纯化的噬菌体加入到1mL 3％BSA中，室温旋转孵育2小时。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3％BSA，室温旋转孵育2小时。将封闭后的免疫管用含有0.01％吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1小时。将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.1％吐温的PBS洗20次，每次5分钟。将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1mL 0.25mg/mL胰蛋白酶溶液，室温旋转洗脱30分钟，加入10μL 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。

取第一轮噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，在每个稀释离心管中加入90μL OD600为0.5-0.55的TG1菌液，混匀后37℃孵育30分钟，将各个梯度的菌液涂布到2×YT氨苄青霉素固体培养基中，37℃倒置过夜培养，第二天统计培养板上的单菌落个数并计算噬菌体洗脱液效价。取500μl第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至5mL OD600为0.5-0.55的菌液中，37℃条件下250rpm继续培养30分钟，将全部菌液均匀涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2％琼脂糖的固体培养板中，37℃过夜培养。第二天将培养板的菌落刮下来收集至离心管中，即为扩增后的细菌子文库。

按照噬菌体文库扩增和纯化方法，再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗原量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。当筛选3轮后，当抗原效价和对照相差100–1000倍时，富集程度达到10^-3次方，可能会有阳性克隆，因此进行ELISA单克隆验证。

(6)ELISA检测

从筛选后的细菌涂板中挑单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板中，每孔加入200μL已添加100μg/mL的氨苄青霉素和10μg/mL的四环素的2×YT培养基，37℃过夜静置培养。第二天将培养的菌液以1:100转接于新的96孔细胞培养板中，即每孔已添加100μg/mL的氨苄青霉素和10μg/mL的四环素的200μL 2×YT接种2μL过夜菌液。37℃静置培养3小时后加入辅助噬菌体，37℃孵育30min。添加50μg/mL的卡那霉素和0.2μmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，30℃静置过夜培养扩增噬菌体。在96孔ELISA板中，每孔包被100ng抗原蛋白，同时每孔包被100ng BSA作为平行阴性对照，4℃过夜包被。第三天弃掉ELISA板内液体，每孔加入200μLPBS洗涤三次后，每孔加入200μL 3％脱脂牛奶，室温封闭1小时。丢弃封闭液，每孔加入200μL PBS洗涤三次后，再加入100μL细菌培养板离心后上清液，室温孵育2小时。丢弃ELISA板内液体，用PBST(PBS+0.1％吐温20)清洗三遍后，每孔加入100μL稀释8000倍M13Bacteriophage Antibody(HRP)，Mouse Mab，室温孵育1小时。洗涤三次后每孔加入100μLTMB单组份显色液，避光显色5分钟。待蓝色显色后，每孔加入100μL ELISA终止液，用酶标仪读OD450nm值。

(7)单克隆测序

选取显色值大于0.5且与BSA对照的比值大于3的ELISA读数阳性克隆菌接种于已添加100μg/mL的氨苄青霉素和10μg/mL的四环素的2mL 2×YT培养基，37℃条件下250rpm培养。直至OD600到达0.8-1.0，取菌液送测序。分析后筛选得2条可用序列，如表1所示。分析测序结果后，取阳性克隆加入甘油保存。

表1两条独立不重复序列的具体序列

实施例2竞争性结合ELISA验证

(1)第一轮ELISA验证

对酶标板进行包被，每孔包被100ng抗原(包被液为CBS)，4℃过夜。丢弃酶标板中液体，在室温下，每孔加入200μl PBS清洗3次。每孔加入200μl 3％的PBSTB(PBST+1％BSA)，室温封闭1小时。PBST清洗3次。按照表中方案进行第一轮孵育(抗体噬菌体的加入量均为100μl/孔，抗原加入量均为100ng/孔)，孵育时间为2小时。PBST清洗3次。进行第二轮孵育，孵育时间为2小时。PBST清洗3次。每孔加入100μL稀释8000倍M13 Bacteriophage Antibody(HRP)，Mouse Mab，室温孵育1小时。清洗酶标板6次后，进行显色，OD450读数。具体方案和结果如表2所示。

表2第一轮ELISA验证结果

由表2可知：ABC方案对比可以看出，抗体噬菌体对抗原LILRB2有结合，ADE方案对比可以看出，抗体噬菌体与HLA针对抗原LILRB2存在竞争性结合，FGH方案对比可以看出，抗体噬菌体可以部分阻断HLA与抗原LILRB2的结合。显然，抗体噬菌体对LILRB2的结合效率较高，抗体噬菌体与HLA针对LILRB2存在竞争性结合，且抗体噬菌体对LILRB2的结合效率要高于HLA。

(2)第二轮ELISA验证

根据第一轮ELISA的验证结果调整实验方案，将HLA抗原量增加为原本的4倍，使用同样的方法再次进行第二轮ELISA验证，具体方案和具体结果如表3所示。

表3第二轮ELISA验证结果

由表3可知：ABCD方案对比进一步说明，抗体噬菌体与HLA针对抗原LILRB2存在竞争性结合，并且抗体噬菌体可以部分阻断HLA与抗原LILRB2的结合。所以筛选出的抗体噬菌体与HLA针对LILRB2存在竞争性结合，且对LILRB2的结合效率要高于HLA。

综上可知，本发明提供的LILRB2羊驼纳米抗体序列不同于现有的抗体，可应用于制备检测LILRB2的试剂或制备控制炎症反应、控制细胞毒性以及肿瘤治疗的药物中，并且具有分子结构简单，易于大量表达，可单独稳定存在于体外，节省工序，操作、控制、使用简便等的优点。此外，本发明的抗体还具有高亲和性，抗体噬菌体对LILRB2的结合效率明显高于HLA，识别LILRB2的能力强，重复性好。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用

<130> 2022.04.29

<141> 2022-05-06

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

atggcggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc aggctggggg gtcactgaga 60

ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttg gaatattata gcatagcgtg gttccgccag 120

gccccaggga aggagcgcga gggggtctca tgtattaatc tgagtggtga taccagagag 180

tatttagact ccgtgaaggg ccgattcgcc atctccagag acaacgccaa gaacacggtg 240

tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tttattactg tgcagcagcc 300

tggggcggag tagttgcaag ttttttggat gagtatgagt actggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct cctcaggcgc acgc 384

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

atggcggtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggttggggg ctctctgaga 60

ctctcctgtg cagcctctgg acgcgccttc agtggttatt acatgggctg gttccgccag 120

gctccaggga aggagcgtgt gtttgtagca gttattagct ggacaggtgc attcacatac 180

tatgcagacg gcgcgagggg ccgattcacc atctccagag acaccgccaa gaacacggtg 240

tatctgcaag tgaacagcct gaaacctgag gacacggcca tttattactg tgcggcagta 300

gaaggtcggc gtagcatact ccctagggac tataactact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct caggcgcacg c 381

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 3

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ser Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ser Cys Ile Asn Leu Ser Gly Asp Thr Arg Glu Tyr Leu Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ala Trp Gly Gly Val Val Ala Ser Phe Leu Asp Glu Tyr

100 105 110

Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Arg

115 120 125

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 4

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Phe

35 40 45

Val Ala Val Ile Ser Trp Thr Gly Ala Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Gly

50 55 60

Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Val Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Val Glu Gly Arg Arg Ser Ile Leu Pro Arg Asp Tyr Asn

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Arg

115 120 125

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

gatgtgcagc tgcaggtctg gaggagg 27

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct ggtgggt 37

Claims

1.一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2的羊驼纳米抗体，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；或其碱基序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的羊驼纳米抗体在制备检测白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2试剂中的应用。