CN117720659A - 一种抗cd28纳米抗体、编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种抗CD28纳米抗体、编码基因及应用。该抗CD28纳米抗体能够与CD28高效、特异性地结合，兼具纳米抗体的优势与免疫系统共刺激信号转导能力，由于可以获得完整的抗体序列，纳米抗体能够通过体外重组表达从而高质量、稳定的生产，具有广泛的应用前景。

Description

一种抗CD28纳米抗体、编码基因及应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种抗CD28纳米抗体、编码基因及应用。
本申请是专利申请日为2021年08月26日，专利申请号为202110987161.4，发明名称为“一种抗CD28纳米抗体、编码基因及应用”的发明专利申请的分案申请。
背景技术
免疫系统是淋巴细胞、器官、体液因子和细胞因子以及免疫活性物质相互作用的有机整体。白细胞可以在几分钟内完全重组其细胞骨架结构，这种可塑性促进了免疫系统整体的迁移和交流，也使它们能够对细胞相互识别和免疫功能的发挥形成强大的互作网络。免疫系统分为固有免疫(又称非特异性免疫)和适应免疫(又称特异性免疫)，其中适应免疫又分为体液免疫和细胞免疫。在癌症和感染性疾病患者中，免疫系统在宿主防御中的基本功能出现缺失，活动不足导致免疫调节机制缺陷的严重感染和肿瘤，甚至引发过敏和自身免疫疾病的过度活动。导致免疫系统低于功能缺失的原因主要有以下几种：(i)由于抗原可变表达或I类主要组织相容性复合体(MHCⅠ)在抗原表面表达降低导致免疫细胞的识别减弱或受损；(ii)免疫抑制性微环境，由于免疫抑制细胞或肿瘤细胞分泌多种抑制性细胞因子(例如，TGF-β等)使肿瘤微环境不利于免疫系统发挥功能；(iii)由于在感染细胞或肿瘤细胞表面缺乏共刺激分子或信号传递分子的表达导致免疫通路信号激活减弱以及肿瘤免疫原性降低，从而导致T细胞识别与激活减弱。通过共刺激分子或辅助因子在免疫细胞发挥功能的同时提供共刺激信号以维持与启动免疫系统对肿瘤等抗原的识别作用与增强杀伤与监控功能是增强免疫系统功能发挥的一种可行性策略。
CD28是一种44kDa的I型跨膜蛋白，表达于大部分幼稚CD4+和CD8+T细胞的表面，是由胞外同型二聚体组装而成的Ig-V样结构域蛋白。CD28作为T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，在T细胞的活化中起到重要作用。初始T细胞的完全活化通常需要三个信号，第一信号是抗原和抗原受体的结合，第二信号是共刺激信号，第三信号是细胞因子信号。CD28作为共刺激分子，参与了第二信号的转导过程。T细胞上CD28受体的连接与T细胞受体(TCR)连接共同提供关键的第二信号，用于初始T细胞激活。CD28与B7分子结合，B7-CD28家族中的共抑制通路提供了调节免疫稳态和防御并保护组织完整性的关键信号。对于T细胞，CD28共刺激转导能力可以极大的增强T细胞增值与分化，CD28在T细胞免疫应答过程中起着重要作用，CD28有多方面共刺激分子效应：(1)促进Th细胞驱化因子与细胞因子的分泌；(2)诱导T细胞表面表达IL-2R以增加对第三信号的接收；(3)上调免疫系统中其他共刺激和调节因子。目前尚未有以CD28为靶点的治疗药物上市，临床试验中以CD28为靶点的药物多应用于黑色素瘤、多发性骨髓瘤等多种血液瘤和实体肿瘤的免疫治疗。
发明内容
针对上述问题与不足，本申请提供一种工艺简单、成本低、特异靶向CD28的纳米抗体，可用于检测和制药领域。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之一为，提供一种抗CD28纳米抗体，是如下蛋白的一种：
P1-1C，由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-7C，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-1G，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-9E，由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-10B，由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-5C，由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-10A，由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之二为：提供该抗CD28纳米抗体的编码基因。
优选的，所述编码基因是如下基因：
P1-1C的编码基因为序列表中序列7；
P1-7C的编码基因为序列表中序列8；
P2-1G的编码基因为序列表中序列9；
P1-9E的编码基因为序列表中序列10；
P1-10B的编码基因为序列表中序列11；
P2-5C的编码基因为序列表中序列12；
P2-10A的编码基因为序列表中序列13。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之三为：提供含有该编码基因的重组表达载体或者重组菌株。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之四为：提供该抗CD28纳米抗体，在制备预防或治疗肿瘤、免疫缺陷疾病以及感染性疾病等药物中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明提供的抗CD28纳米抗体能够与CD28高效、特异性地结合，与细胞表面抗原亲和力高达4.12nM，为4.12～20.84nM；与CD28抗原亲和力高达0.12nM，为0.12～19.4nM。由于可以获得完整的抗体序列，纳米抗体能够通过体外重组表达从而高质量、稳定的生产，具有广泛的应用前景。
本发明的上述应用中，包括如下中的至少一种：
(1)直接应用于CD28抗原特异性结合，例如以CD28为靶点的肿瘤抗原特异性识别与杀伤；
(2)在本发明所述CD28纳米抗体上连接效应分子，例如化学小分子药物、细胞因子、毒性分子或放射性同位素，用于医药领域；
(3)以所述CD28纳米抗体作为药物递送载体，定点靶向肿瘤等抗原部位，以实现定点特异性治疗；
(4)在本发明所述CD28纳米抗体上添加化学发光基团或荧光分子，以制备特异性探针；
(5)将发明所述CD28纳米抗体用于免疫系统增强疗效，例如CAR-T，TCR-T，CAR-NK，CAR-DC等，用于免疫治疗领域。
附图说明
图1为本发明中羊驼抗CD28血清效价检测结果；
图2为本发明中第一轮PCR产物鉴定结果；
图3为本发明中第二轮PCR产物鉴定结果；
图4为本发明中阳性克隆率菌落PCR验证结果；
图5为本发明中一轮阳性菌落酶联免疫吸附实验结果；
图6为本发明中二轮阳性菌落酶联免疫吸附实验结果；
图7为本发明中抗CD28纳米抗体序列相似性示意图，包括图7a～7e，图7a显示出所列实施例中总序列相似性，图7b～7e显示出组间序列相似性；
图8为本发明中CD3/CD28融合抗体的ELISA检测结果，包括图8a和8b，其中图8a为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与靶抗原CD28抗原结合能力检测结果，图8b为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与不相关抗原4-1BB结合能力检测结果；
图9为本发明中CD3/CD28融合抗体与K562细胞表面受体的结合实验结果，包括图9a和9b，其中图9a为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与靶细胞K562/CD28的结合能力检测结果，图9b为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与不相关细胞K562/4-1BB的结合能力检测结果；
图10为本发明中CD3/CD28融合抗体对人PBMC的活化结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是所述实施例的说明，仅仅是本发明的一部分实施例，其中大部分并不仅限于此。
实施例1CD28蛋白的表达及纯化
1.1载体构建
以真核表达载体pFuse构建CD28-Fc融合蛋白，将CD28和人IgG1 Fc通过PCR方式串联起来，完整分子包括CD28分泌信号肽、CD28胞外结构域、凝血酶切位点、IEGRMD短肽、人IgG1铰链区以及CH2和CH3结构域。将CD28-Fc基因采用NcoI和NheI双酶切后使用T4 DNA连接酶克隆至pFuse载体，或者采用同源重组试剂盒构建载体。
1.2真核表达
接种1.5×106/mL 293F细胞于500mL摇瓶200mL培养基中。37℃，165rpm，5％CO2浓度的摇床培养箱中振摇培养24h，24h后进行细胞计数，将细胞密度调整至3×106/mL，将上述构建质粒与10mL opti-MEM混合均匀后室温静置5min，加入500μL(1:2.5)PEI40000于10mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，混合质粒和PEI混合液，轻柔混匀后室温静置20min。将上述混合液逐滴加入200mL 293F细胞培养液中，滴加的同时轻柔摇晃培养瓶，混合均匀后放入摇床，转染72h。转染结束后，100g离心5min，取上清液，向培养瓶中补加100mL培养基重新悬浮培养后3000rpm离心5min，取上清液。混合两次细胞上清液。
1.3蛋白纯化
取上述1.1步骤的细胞上清液400mL，15000rpm，4℃离心30min，收取上清液，0.45μm滤膜过滤，置于冰上备用。取4mL(20％乙醇/Protein G 1:1)Protein G于层析柱内，用Binding buffer冲洗3次后，使用垫片压住resin表面。用20mL Binding buffer平衡Protein G柱。每10mL上样一次，使样品匀速(约0.5mL/min)通过Protein G柱。40mLBindingbuffer匀速(约1mL/min)清洗Protein G柱。首先在洗脱管收集管中加入10％洗脱液体积的Buffer，柱中加入Elution buffer(5mL洗脱一次，直到无法定量蛋白浓度)洗脱4次。使用Amicon Ultra-15离心过滤器对收集的蛋白样品进行浓缩，4℃离心机3000rpm离心20分钟，定量蛋白浓度。
将蛋白样品进行缓冲液置换。放入透析袋(加超纯水微波炉煮十分钟)中，4℃，4L透析液(转子搅拌透析)，每4小时换一次液。两次换液后，收集透析袋内全部蛋白液体，4℃，8000rpm，15分钟离心，收集上清并定量。
首先进行酶切效率测试，取适量定量后的蛋白溶液，浓度稀释为1mg/mL，每管取100μL蛋白样品。加Thrombin(凝血酶)，浓度从10IU/mg开始，2倍稀释(使用透析液)，共10个梯度。设置不加Thrombin的对照组。室温振荡16小时。SDS-PAGE检测酶切效果。确定合适Thrombin酶切浓度，将剩余蛋白样品全部酶切。室温振荡16小时。SDS-PAGE检测大体系酶切效果。
将凝血酶酶切后蛋白样品缓慢匀速通过Protein G柱，并按照1.2所述方法进行洗脱，并用SDS-PAGE进行检测，直至样品中没有Fc，CD28 ECD纯度大于90％。
浓缩除标签后的CD28 ECD蛋白至1mg/mL，并取样进行SDS-PAGE进行最终鉴定(CD28 ECD-Fc分子量约为42kD，由于真核表达的糖基化作用，还原型SDS-PAGE最终表现应为55-65kD，Fc分子量约为30kD)。
实施例2抗CD28纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
2.1羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只，标记耳号。将CD28蛋白与弗氏佐剂按1:1的比例混合均匀，4℃保存。在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点，每次注射0.4mL混合佐剂抗原。免疫后观察半小时，确认羊驼状态良好且无不良反应。每2周免疫一次，一共进行7次免疫，免疫前及1-4次免疫之后，颈部静脉采集羊驼外周血，分离血清用于血清效价检测。第6、7次免疫后间隔5-7天，颈部静脉采集羊驼外周血，用于噬菌体展示文库构建。
2.2羊驼血清效价检测
抗原包被酶标板(2μg/mL，100μL/孔)，4℃过夜。弃抗原溶液，并用200μL PBST溶液(1×PBS加0.05％Tween20，下同)冲洗酶标板三次，每次5分钟。使用200μL封闭液(2％BSAinPBST)封闭酶标板，室温，1.5小时。弃封闭液，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板三次，每次5分钟。使用封闭液对各批次血清进行梯度稀释，并向酶标板对应孔中加入100μL未免疫、第1-4次免疫后所收集的羊驼血清，室温孵育2小时。弃血清，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板4次，每次5分钟。向每个孔中加入检测抗体(山羊抗美洲驼IgG，偶联HRP，1:10000稀释于封闭液中，100μL/孔)室温，1小时。弃检测抗体，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板4次，每次5分钟。向每孔加入100μL TMB底物溶液，显色2-3分钟。向每孔加入100μL反应终止液。30分钟内使用酶标仪测定450nm处吸光值。阳性孔标准：免疫血清样品OD450值大于未免血清OD4503倍且读值大于0.5，结果如图1所示。
2.3羊驼来源的淋巴细胞分离
在15mL离心管中加入3mL细胞分离液，缓慢加入3mL血样。离心机25℃预冷，400g离心30min，观察血样分离情况。使用200μL移液器小心吸取中间棉状上层免疫细胞至新的15mL离心管中，上层血清转移至新离心管后-80℃保存。向含免疫细胞的离心管中加入10mLPBS缓冲液，25℃，400g离心20min，去除上清液。每管加入5mL PBS缓冲液，25℃，400g离心20min，计数，去上清液。根据细胞计数结果使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞，得到溶解液，-80℃保存。
2.4RNA提取
将用Trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿混匀。室温静置5分钟后4℃12000g离心15分钟。小心将离心后的上清液转移到新的离心管。往新离心管中加入0.5-1倍体积的异丙醇。室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟。使用与Trizol保存的外周血淋巴细胞等体积的75％乙醇清洗沉淀，4℃7500g离心5分钟后溶解于适量的无RNA酶的水中，合并所有样品，即为提取得到的总RNA。
2.5反转录合成cDNA
使用Takara反转录试剂盒对得到的总RNA进行反转录。将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的总RNA反转录成cDNA，分别保存到2个离心管中。
2.6抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模板，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行两轮PCR扩增反应。
第一轮PCR反应条件和程序为：
为了确定最佳模板使用量，分别使用1μL，2μL，3μL，4μL，5μL的oligo dT Primer和random 6-mer的cDNA作为模板，按照下表配置PCR反应体系：
按照下表配置并进行PCR反应：
(1)反应结束后，取20μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的量为最佳模板量，将所有cDNA按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应；
(2)将所有PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带；
(3)将所有一轮PCR纯化回收产物收集至一个离心管中，即为第一轮PCR扩增产物，-20℃保存。
第一轮PCR产物鉴定如图2所示。
第二轮PCR反应条件和程序为：
将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.5μL，1μL，2μL，3μL，4μL，作为模板，按照下表配置PCR反应体系：
按照下表配置并进行PCR反应：
(1)反应结束后，取20μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮PCR扩增产物的约1/5体积共288个反应按照此模板量并使用4.1.(1)相同条件进行PCR反应后使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化；
(2)将回收产物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μL用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。
第二轮PCR产物鉴定如图3所示。
2.7载体构建
(1)使用pADL-10b作为噬菌体质粒载体，用BglI分别酶切10μg pADL-10b载体和5μg第二轮PCR扩增产物，37℃孵育4h；
(2)使用DNA回收纯化试剂盒对pADL-10b载体和第二轮PCR扩增产物进行纯化，4℃保存。
2.8连接
(1)载体和片段进行连接，按照下表配制连接反应体系：
(2)将连接反应4℃过夜(约16h)孵育；
(3)使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液，检测回收产物的浓度，4℃保存。
2.9验证连接产物转化率
(1)取一支50μL的SS320感受态细胞在冰上放置5-10min融化；
(2)加入100ng连接产物，转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数：1800V，1mm后，点击按钮点击转化；
(3)等待电转完成后立即加入37℃预热好的SOC培养液1mL，混匀后37℃，200rpm摇菌复苏1h；
(4)从1mL复苏后的菌液中取100μL进行10倍梯度稀释并涂板，根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目，即为连接产物的转化效率；
(5)同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落PCR，PCR产物有在500bp左右的单一条带认为是阳性克隆，由此估算单克隆阳性率，结果如图4所示。
2.10细菌文库构建
(1)取25组100ng连接体系按上述方法使用25管感受态细胞进行电转反应；
(2)37℃复苏1h后从中取100μL进行10梯度稀释后涂板，37℃过夜培养；
(3)收集剩下所有菌液并均匀涂布到5个245mm方形培养板(2×YT含有100μg/mLAmp，2％glucose)中，37℃正置培养过夜；
(4)根据稀释倍数和单菌落数计算获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；
(5)从梯度稀释板中随机挑选48个单克隆进行菌落PCR，验证细菌文库的克隆阳性率；
(6)将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2×YT液体培养基刮下，置于50mL离心管，测量其OD600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
2.11噬箘体文库制备
根据细菌文库的OD600计算在100mL 2×YT液体培养基需要加入的细菌文库体积，据计算结果接种细菌文库到100mL 2×YT液体培养基(含有10μg/μL Tet和100μg/μL Amp)中，37℃，250rpm培养直至OD600为0.5-0.55。根据辅助噬菌体效价，按照1：20(细菌个数：噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃，250rpm孵育30-60min。加入终浓度为50μg/mL和200μM的IPTG，30℃，250rpm过夜培养。将过夜培养的菌液4℃，8000rpm离心10min，然后将离心后的上清液转移到新的50mL离心管中。加入1/4的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上静置孵育30min。4℃，8000rpm离心10min后，弃上清，倒置控干2min。加入5mL PBS重悬至新的离心管，4℃，8000rpm离心10min。离心后转移上清至新的离心管中，再次加入1/4体积的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上孵育10min。4℃，8000rpm，10min离心，弃上清，用1mL PBS重悬后，8000rpm离心10min，转移上清至新的离心管，-80℃保存，即为纯化后的噬菌体文库。
2.12阳性噬菌体库筛选
第一轮筛选：从-80℃冰箱中取出筛选抗原，冰上放置解冻；将筛选抗原CD28及负筛抗原41BB分别包被免疫管(50μg/管，包被液转包被过夜；为PBS，2mL/管)，其中负筛抗原包被两个免疫管，一管做负筛，一管做对照，4℃缓慢旋转包被过夜。将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。加入2mL封闭液(3％脱脂奶粉)溶液，室温旋转封闭2h。先将封闭后的负筛免疫管中液体丢弃，并加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。弃掉负筛免疫管中的清洗液，加入2mL PBS，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库104μL作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育1h：
其中，V为加入的噬菌体体积(单位μL)，T library为噬菌体效价；
将包被抗原CD28和做对照的抗原41BB免疫管内封闭液弃掉，加入2mL PBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。将免疫管内液体弃掉，将负筛孵育结束后的噬菌体溶液均分成分别加入这两个免疫管中，室温旋转孵育1h；弃掉免疫管中的液体，加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min。将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1mL 0.25mg/mL Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min。加入10μL 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
第一轮噬菌体洗脱液效价检测：将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到含5mL含有10μg/mL Tet的2×YT液体培养基中，37℃，50rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55。取第一轮噬菌体洗脱液10μL在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，即将第一轮噬菌体洗脱液取10μL稀释至100μL，再从中取10μL稀释至100μL，依次类推，共稀释12个梯度至10-10，振荡混匀。在每个稀释离心管中加入90μL的SS320菌液，混匀后37℃孵育30min，从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中，37℃倒置过夜培养。统计可以明显区分单菌落的稀释度的平板上的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：
T(pfu/ml)＝N×D×400
其中，T为噬菌体效价(单位pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数上单菌落数。
第一轮噬菌体洗脱液的扩增：预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到含5mL含有10μg/mL Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55。加入500μL第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至OD600为0.5-0.55的菌液中(剩余的洗脱液于4℃保存)。37℃，250rpm继续培养30min。将全部菌液均匀涂布到含有100μg/mL Amp和2％葡萄糖的2％琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃过夜培养。取过夜培养的方形板，在培养板表面加入6mL 2×YT液体培养基(含10μg/mL Tet)，用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15mL离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液OD600值，即为洗脱液细菌文库OD600值，加入终浓度为20％的甘油，即为第一轮细菌文库。将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至100mL 2×YT液体培养基中(含10μg/mL Tet和100μg/mL Amp)，使初始OD600为0.1：
其中，V为转接菌液的体积(单位μL)，OD600为构建的洗脱液细菌文库的OD600。
37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55。按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数∶噬菌体数＝1∶20：
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值；
37℃，250rpm继续培养30min；分别加入终浓度为50μg/mL Kana和终浓度为0.2μMIPTG，30℃，250rpm过夜培养。
第一轮噬菌体纯化：将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中4000rpm，4℃离心10min。将离心后的上清液转移至新的50mL离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min。4000rpm，4℃离心20min，弃上清，并在纸上倒置2min。加入1mLPBS重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5mL离心管，13000rpm，4℃离心20min。将离心后的上清转移至新的1.5mL离心管，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min。13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1mL PBS重悬沉淀，13000rpm，4℃离心2min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库，100μL/管分装，长期-80℃保存，短期(1-2周)可于-20℃放置保存。一轮筛选噬菌体子文库效价检测，方法同上。
第二轮筛选：筛选方法同上，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液。
第二轮噬菌体洗脱液效价检测、洗脱液的扩增、纯化、筛选噬菌体子文库效价检测，方法同上。
单克隆ELISA检测：预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55。取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，振荡混匀。每个稀释离心管中加入90μL OD600值为0.5-0.55的菌液，混合均匀。37℃，250rpm继续培养30min。将菌液均匀涂布到含有100μg/mLAmp的固体培养基平板，37℃过夜培养。从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(P1-P2)中，每孔加入100μL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp和10μg/mL Tet)，37℃过夜静置培养。取过夜培养的菌液2μL转接至每孔250μL 2×YT液体培养基(含有100μg/mL Amp和10μg/mL Tet)的新96孔细胞培养板中，37℃静置培养3h，将转接前过夜培养的菌液4℃保存。按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数∶噬菌体数＝1∶20：
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价。
37℃孵育30min，加入终浓度为50μg/mL的Kana和0.2μM的IPTG，30℃静置过夜培养。将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用。将筛选抗原CD28及负筛抗原41BB分别包被酶标板(1ng/μL，包被液为pH9.4的CBS，100μL/孔)，同时平行包被BSA作对照，4℃包被过夜。将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200μL PBS缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min。每孔加入200μL封闭液(3％BSA)封闭酶标板，室温封闭1h。弃封闭液，每孔加入200μL PBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min。每孔加入120μL 3％BSA后再加入80μL离心后的上清液，室温孵育2h。弃掉酶标板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min。每孔加入M13BacteriophageAntibody(HRP)，Mouse Mab，1:8000稀释于封闭液中，100μL/孔，室温孵育1h。弃掉ELISA板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min。每孔加入100μLTMB单组份显色液避光显色2-3min，每孔加入100μL1M HCl终止，用酶标仪读取OD450值，记录并保存。一次验证以负筛抗原41BB、BSA做阴性对照。结果如图5所示。以OD600≥1.7133为阳性克隆范围。
阳性克隆ELISA二次验证：为了排除假阳性结果，将初步认定为阳性的克隆进行ELISA二次验证，方法同上，二次验证只做负筛抗原41BB对照，不做BSA对照。测序结果具有代表性的阳性单克隆二次验证原始数据使用GraphPad Prism处理，结果如图6所示。以OD600≥0.9927为阳性克隆范围。
实施例3测序
3.1阳性克隆测序
根据ELISA检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆。
从单克隆ELISA检测板中取阳性克隆菌液5μL接种至2mL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp和10μg/mL Tet)，37℃，250rpm培养直至OD600至0.8-1.0(约6-8h)，取1mL菌液测序，其余菌液4℃保存。
3.2序列分析
经测序的序列使用GENtle软件进行序列比对分析，并使用GENtle软件将抗体序列翻译成氨基酸。结果如图7a～7e，其中图7a显示出所列实施例中总序列相似性，图7b～7e显示出组间序列相似性。
实施例4CD3/CD28融合抗体的表达和纯化
4.1载体构建
以真核表达载体pFuse构建SP34-HC和SP34-LC-CD28(Nanobody)融合蛋白。对于SP34-HC，完整分子包括IL2分泌信号肽和SP-34-VH和SP-34-CH1；对于SP34-LC-CD28(Nanobody)的构建，将SP34-LC和抗CD28纳米抗体通过PCR方式串联起来，完整分子包括IL2分泌信号肽、SP34-LC、(G4S)3连接肽、抗CD28纳米抗体。将SP34-HC或者不同的SP34-LC-CD28(Nanobody)基因采用EcoRI和XhoI双酶切后使用T4DNA连接酶克隆至pFuse载体，或者采用同源重组试剂盒构建载体。
4.2真核表达
接种1.5×106/mL 293F细胞于250mL摇瓶50mL培养基中。37℃，165rpm，5％CO2浓度的摇床培养箱中振摇培养24h，24h后进行细胞计数，将细胞密度调整至3×106/mL，将上述4.1步骤所构建的质粒SP34-HC和SP34-LC-CD28(Nanobody)(25μg:25μg)于5mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，加入125μL(1:2.5)PEI 40000于10mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，混合质粒和PEI混合液，轻柔混匀后室温静置20min。将上述混合液逐滴加入50mL293F细胞培养液中，滴加的同时轻柔摇晃培养瓶，混合均匀后放入摇床，转染72h。转染结束后，100g离心5min，取上清液，向培养瓶中补加50mL培养基重新悬浮培养后3000rpm离心5min，取上清液。混合两次细胞上清液。
4.3蛋白纯化
取上述1.2步骤的细胞上清液50mL，15000rpm，4℃离心30min，收取上清液，0.45μm滤膜过滤，置于冰上备用。取3mL(20％乙醇/Protein G 1:1)Protein G于层析柱内，用Binding buffer冲洗3次后，使用垫片压住resin表面。用20mL Binding buffer平衡Protein G柱。每10mL上样一次，使样品匀速(约0.5mL/min)通过Protein G柱。40mLBindingbuffer匀速(约1mL/min)清洗Protein G柱。首先在洗脱管收集管中加入10％洗脱液体积的Buffer，柱中加入Elution buffer(5mL洗脱一次，直到无法定量蛋白浓度)洗脱4次。使用Amicon Ultra-15离心过滤器对收集的蛋白样品进行浓缩，4℃离心机3000rpm离心20分钟，并使用nanodrop测蛋白浓度。
实施例5CD3/CD28融合抗体与CD28抗原的结合能力验证
5.1本轮实验使用两种抗原，实验组CD28-Fc，对照组4-1BB-Fc，实验均为两组平行，每组均设置空白对照，CD3-Fab作为阴性对照。
5.2包被：包被液4℃过夜包被CD28抗原(10ug/mL)，每组2个平行，2个空白孔对照。同时以抗原4-1BB(10ug/mL)包被作为不相关抗原对照组。
5.3封闭：每孔加封闭液200uL，37℃封闭1h。
5.4加样：设置空白孔、待测样品孔。所有样品均用封闭液稀释。200nM浓度起始5倍梯度稀释7个点(100uL/孔)，起始孔配置550μL，后面6孔每孔加440μL封闭液，5倍依次向后梯度稀释，空白对照孔只加封闭液。37℃孵育1h。
5.5二抗作用：弃去液体(在纸上用力拍干)，200uL/孔PBST洗涤重复3次。每孔加入HRP-Anti kappa light chain antibody二抗100μL(1:5000)，37℃孵育1h。
5.6显色：弃去孔内液体，甩干，200uL/孔PBST洗板5次，每孔加显色底物TMB 100μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育，每孔加2M H2SO4终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔OD值。OD值检测数据使用GraphPad Prism处理，结果如图8a和8b所示，其中图8a为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与靶抗原CD28的结合能力检测结果，图8b为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与不相关抗原4-1BB的结合能力检测结果。实验组有明显的抗原结合能力，与对照组有显著差异。
实施例6CD3/CD28融合抗体与K562/CD28细胞的结合实验
6.1本轮实验使用两种细胞系，实验组K562/CD28细胞，对照组K562/4-1BB细胞，实验均为两组平行，每组均设置空白对照，CD3-Fab作为阴性对照。
6.2将两种细胞收起来，计数，调整细胞密度，0.3million/孔，100μL/孔，则浓度调为3million/mL，每组7孔，每孔100μL细胞，准备样品。
6.3样品准备：在EP管中，将CD28纳米抗体稀释到200nM的初始浓度，五倍梯度稀释7个点，即在前一管吸110μL抗体溶液，向后加入440μL FACS，依次梯度稀释，配置好后均分各取100μL加样。
6.4 2000rpm5min离心细胞托盘，吸走上清培养基后染色，即稀释的样品按照100μL/孔加入孔板重悬细胞，冰上孵育1h，托盘离心2000rpm 5min吸上清洗两次，离心过程配置二抗，二抗为Goat anti-human kappa-AF467，其终浓度为1μg/mL。
6.5加入稀释好的Goat anti-human kappa-AF467 100μL/孔，重悬细胞置于冰上避光孵育1h。加入200μL FACS清洗游离抗体，离心去上清洗两次，再用200μL FACS缓冲液重悬。
6.6流式检测：流式检测数据使用GraphPad Prism处理，结果如图9a和9b所示，其中图9a为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与靶细胞K562/CD28细胞的结合能力检测，图9b为CD3/CD28融合抗体和对照CD3抗体与不相关细胞K562/4-1BB的结合能力检测。实验组有明显的细胞表面抗原结合能力，与对照组有显著差异。
实施例7CD3/CD28融合抗体对人PBMC的活化能力验证
7.1本轮实验使用PBMC进行活化，实验均为两组平行，每组均设置空白对照，CD3-Fab作为阴性对照。
7.2细胞复苏：将PBMC细胞从液氮中取出，放入37℃水浴中快速解冻，使用RPMI1640培养基稀释解冻细胞(培养基：细胞＞10：1)，离心1500rpm 5min，去上清液，培养基重悬PBMC细胞，重复上述洗一次，调整PBMC细胞密度为1.5million/mL，48孔板每孔200μL即0.3million细胞/孔。
7.3CD3/CD28融合抗体：配置激活剂浓度梯度，三个梯度，两个平行，每孔加入50nM、5nM、0.5nM和0nM CD3/CD28抗体，100μL/孔。
7.4按浓度每孔加入细胞体积1/10抗体(20μL)，加入CD3/CD28抗体。
7.5 37℃培养24h，将细胞转移至U型板2000rpm离心5min，取走上清，加0.5μg/mLCD25/CD69双抗染色1h，阴性对照组使用FACS重悬，不染色，2000rpm离心5min洗一遍，96孔板进行流式CD25/CD69检测。流式检测数据使用GraphPad Prism处理，结果如图10所示。实验组有明显的T细胞活化能力，与对照组有显著差异。
本发明设计的抗CD28纳米抗体有较好的CD28抗原结合能力、细胞表面抗原结合能力以及对人PBMC细胞的活化能力，并且与CD3-Fab阴性对照组有明显差异。
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Claims (6)

1.一种抗CD28纳米抗体，其特征在于，是如下蛋白中的一种：
P1-1C，由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-7C，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-1G，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-9E，由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P1-10B，由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-5C，由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
P2-10A，由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的一种抗CD28纳米抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下的基因：其核苷酸序列是序列表中序列8、9、10、11、12、13、14。
4.如权利要求2-3任一项所述的编码基因的重组表达载体。
5.如权利要求2-3任一项所述的编码基因的重组菌株。
6.如权利要求1所述的抗CD28纳米抗体，在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
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