CN117534761A - 一种抗cd28纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗CD28纳米抗体及其制备方法与应用。本发明提供的抗CD28纳米抗体，氨基酸序列为SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.15中的一种。制备过程如下：构建CD28抗原对羊驼进行免疫，对免疫后的羊驼PBMC进行噬菌体文库构建，对噬菌体文库进行筛选，选择正确序列进行构建及表达纯化；经细胞功能检测筛选最终得到抗CD28纳米抗体。本发明提供的纳米抗体对CD28具有特异的识别和结合能力，具有特异性强、灵敏度高等优势；同时有效地降低了CD28抗体的开发和生产成本，缩减了抗体表达时间。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗CD28纳米抗体及其制备方法与应用。。
背景技术
白细胞表面分化抗原28（CD28）分子存在于大多数T细胞表面，被认为是T细胞特有的一种表面分子。T细胞对抗原的反应性主要通过CD3-T细胞抗原受体（TCR）复合物介导，但也有赖于T细胞表面其他分子的协同。CD28作为第一个被发现的共刺激受体，是以胞外变体免疫球蛋白样结构域为特征的共刺激分子亚家族的创始成员。CD28主要作为“第二信号”（与靶细胞表面的B7-1/ B7-2结合）降低有效活化T细胞所需的阈值，强化激活T细胞的“第一信号”（T细胞受体（TCR）- CD3复合物对靶细胞的MHC-多肽识别和结合），使T细胞进一步发育，增殖为具有免疫功能的细胞。基于CD28共刺激对于T细胞活化的重要性，因此通过激活或阻断CD28/B7-1（CD80）/ B7-2（CD86）途径进行免疫调节是一种有前途的方法：可以防止在移植过程中不适当地的T细胞活化排异反应，或治疗T细胞介导的自身免疫性疾病。
研究表明，CD28 mAb也能促进细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkiller cells，以下简称 CIK 细胞）增殖，对CIK细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2有促进作用，对CIK细胞的杀伤活性有增强作用。
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkiller cells）是一群具有多种细胞分型的免疫细胞，具有增殖能力高、细胞毒性强等优点，在肿瘤的生物治疗中具有极大的应用价值。CIK细胞由源于外周血的单个核细胞经多种细胞因子如 IL-2、IFN-γ等刺激而获得。目前对CIK细胞临床疗效的研究初步显示其对肺癌、乳腺癌、食管癌、肾癌等多种恶性肿瘤均有良好的疗效。
纳米抗体即重链单域抗体VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody），该类抗体只包含一个重链可变区（VHH）和CH2，CH3区，相比于其他抗体，轻链天然缺失。纳米抗体晶体直径2.5nm，长4nm，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。纳米抗体一般结构呈椭圆形，体积很小，分子质量为单克隆抗体的1/10（15kD），与普通抗体相比，化学性质更加活泼，具有亲和力强，能更有效地与抗原缝隙结合。纳米抗体的二级结构是2个β片层形成支架，3个高变区聚集在一侧参与抗原识别。相比于常规抗体，纳米抗体的优势有：分子量小，易于渗透进致密组织甚至是血脑屏障；亲和力高、特异性强、溶解性及稳定性好；人体的免疫原性弱，生物相容性好；原核或真核系统中高表达，易于生产；纳米抗体结构简单，易于工程化改造。基于纳米抗体的特性，使得其在疾病诊断与治疗中具有独特优势。纳米抗体体积小，使其能够以高密度牢固地结合于固相载体捕捉微量抗原，可以充分发挥以纳米抗体为基础的免疫检测方法的作用，检测与鉴别临床上较难检出的靶点以及外来病原物或毒素。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
噬菌体展示技术是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达，是一种将多肽或蛋白质展示在噬菌体的表面，从而将所需多肽或蛋白质进行体外筛选的技术。该技术将不同的外源基因分别插入噬菌体载体中，随着噬菌体的传代，外源蛋白会展现在噬菌体表面，形成噬菌体文库。随后用特定蛋白对噬菌体文库进行筛选，进过几轮亲和筛选（如生物淘选）得到一些噬菌体克隆，再将这些噬菌体克隆扩增，进行更多轮的筛选，便可进一步得到特异性较强的目的蛋白。
发明内容
本发明提供了一种抗CD28纳米抗体及其制备方法与应用，通过噬菌体展示与高通量哺乳动物细胞表达系统相结合的方式筛选获得抗CD28纳米抗体，进一步提供其在肿瘤治疗药物制备和肿瘤检测中的应用。
基于此，本发明采用的技术方案为：
一种抗CD28纳米抗体，所述抗CD28纳米抗体包括框架区和互补决定区（各氨基酸序列的互补决定区序列如下表1所示），所述互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3，其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6；或者所述互补决定区CDR1为SEQID NO.1，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.7，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.8。
表1 抗CD28纳米抗体互补决定区具体序列
优选地，所述抗CD28纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15。
优选地，编码所述抗CD28纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23中的核苷酸序列的一种。
本发明还提供了一种分子表达载体，所述载体包含所述SEQ ID NO.16~SEQ IDNO.23中的一种。
本发明还提供了一种含有所述分子表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为真核细胞。
本发明还提供了一种所述抗CD28纳米抗体的制备方法，制备过程如下：
S1、依据CD28的蛋白序列和基因序列信息，分析并设计免疫抗原，在其C端连接His-tag，获得经修饰的抗原；
S2、用步骤S1获得的抗原对羊驼进行免疫，通过对免疫后的羊驼分离血清进行效价检测，然后从外周血中提取效应B细胞，获得羊驼PBMC细胞；
S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，提取总RNA，通过逆转录PCR技术获得cDNA片段，以此为模板扩增出VHH基因片段，然后将目的基因片段克隆至噬菌粒载体中，并转化入感受态细胞，构建噬菌体文库；
S4、以步骤S3所构建的噬菌体文库进行噬菌体包装，通过淘选富集，并进一步挑取单克隆进行初筛，筛选阳性克隆送测，测序分析选择正确抗体序列进行真核表达；
S5、以步骤S4表达的抗体进行细胞功能检测，筛选特异性及灵敏度好的抗体，即得。
优选地，步骤S4所述真核表达载体为PcDNA3.4载体。
本发明还提供了一种所述抗CD28纳米抗体在制备预防和治疗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了一种所述的抗CD28纳米抗体在制备CD28类肿瘤检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的抗CD28纳米抗体具有如下优势：
（1）本发明结合使用细胞淘选流式分选技术，能够把与噬菌体结合的靶细胞分选出来再洗脱侵染，减少非特异结合的噬菌体；
（2）本发明利用高通量哺乳动物细胞表达系统对CD28纳米抗体表达，有效地降低了CD28抗体的开发和生产成本，缩减了抗体表达时间，同时增加了通量，提高了效率。
附图说明
图1为ELISA检测血清效价结果图；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图3为第一轮PCR检测结果图；
图4为第二轮PCR检测结果图；
图5为酶切反应体系检测结果图；
图6为流式细胞仪检测结果图；
图7、图8为ELISA抗原抗体检测结果图；
图9为细胞报告基因检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明首先构建CD28抗原对羊驼进行3次免疫后，获得羊驼PBMC细胞；对PBMC进行RNA的抽提并反转录，通过巢氏PCR的方法获得抗体基因片段，对载体和基因片段进行酶切连接转入大肠杆菌进行扩增，构建噬菌体文库，通过固相淘选与细胞分选的方式筛选与靶抗原或靶细胞特异性结合的抗体，再构建真核表达载体；然后通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗体高通量表达，获得了具有高的灵敏度和特异性抗CD28纳米抗体。
本发明涉及的引物如下：DFL-01、DFL-02、DFL-03、DFL-04、DFL-05、DFL-06、DFL-07、DFL-08、DFL-09、DFL-10、DFL-11、DFL-12、DFL-13、DFL-14、DFL-15、DFL-16。
实施例 一种抗CD28纳米抗体的制备方法
所述抗CD28纳米抗体共7种，分别为MY-92、MY-86、MY-36、MY-127、MY-78、MY-91、MY-119。
所述抗CD28纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、依据CD28的蛋白序列和基因序列信息，分析并设计可有效诱导羊驼产生针对human CD28的特异性抗体的抗原（可以是CD28蛋白的全序列），在其C端连接His-tag，获得经修饰的抗原；
S2、用步骤S1获得的抗原对羊驼进行免疫，通过对免疫后的羊驼分离血清进行效价检测，然后从外周血中提取效应B细胞，获得羊驼PBMC细胞：用步骤S1获得的经修饰的抗原与弗氏佐剂的混合液对羊驼进行3次免疫，记录空白羊驼耳号后开始免疫实验，每次免疫后观察半小时确认羊驼状态良好，无不适症状。每2周免疫一次，采血分离保存上层血清，用于后续抗体效价检测。
具体过程如下：免疫：用200μg的CD28/hFc蛋白与200μL完全弗氏佐剂混合，乳化后皮下多点注射，在第14天用200μg的CD28/hFc与不完全弗氏佐剂1:1混合，乳化后皮下多点注射，28天用200μg的CD28/hFc与不完全弗氏佐剂1:1混合，乳化后皮下多点注射，每次免疫1周后，采血检测Anti-CD28/His血清滴度；第3次免疫1周后，采血分离羊驼PBMC。
Anti-CD28/His血清效价通过ELISA检测，用浓度为2μg/mL的CD28/His蛋白包被酶标板，每孔加入2倍梯度稀释的血清100μL（对照为免疫前羊驼血清），25℃孵育1h，洗涤5次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Alpaca IgG(H+L)二抗，25℃孵育1h，洗涤5次后，加100μL TMB底物，25℃孵育，50μL 1M HCL终止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2倍以上的，具体结果如图1所示，ELISA检测血清效价为在OD450是空白对照的2倍的稀释数值，结果显示为3免后的抗血清效价为12800-25600之间。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对CD28蛋白的高滴度抗血清。
分离淋巴细胞：在50mL的离心管中先加入15mL细胞分离液（美国GE公司的淋巴细胞分离液Ficoll-Raque PLUS），然后缓慢加入15mL血液。加入血液时小心缓慢以防止血液和分离液混匀。之后离心机预冷至25℃，400g离心30min后，观察离心管中血液分离情况，上层血清保存在新的离心管中，-80℃保存，用移液器小心吸取出中间棉状上层免疫细胞至新的50mL离心管中。每管加入室温放置的10mL PBS缓冲液，25℃，400 g离心20min。去除上清液，每管加入室温放置的5mL PBS缓冲液，轻轻混匀后细胞计数，然后25℃，400 g离心20分钟。分离得到淋巴细胞含量为107/mL细胞溶解液，-80℃保存。
S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，提取总RNA，通过逆转录PCR技术获得cDNA片段，以此为模板扩增出VHH基因片段，然后将目的基因片段克隆至噬菌粒载体中，并转化入感受态细胞，构建噬菌体文库：
（1）RNA提取过程：
A.从-80℃冰箱里取出PBMC细胞，于冰上解冻后取500μL的PBMC加入500μL的TrizoL混匀，加入200μL的三氯甲烷（氯仿），震荡30s，静置3min，然后于4℃，12000g下离心15min；
B.离心后分三层，取上层水相，约500μL，加等体积的异丙醇，枪头混匀，室温10min静置，然后4℃，12000g离心10min，去上清，收集沉淀；
C.将沉淀用1mL的75%乙醇洗涤，振荡10s，4℃，12000g下离心10min，去上清液，重复一次清洗；
D.超净台晾干5-10min把残留的酒精挥发；
E.55℃预热RNA Free H2O，根据提取RNA量加入一定的预热RNA Free H2O溶解RNA。
用琼脂糖胶鉴定RNA的条带，然后保存至-80℃，鉴定胶图如图2所示。
鉴定后，利用TAKARA的PrimeScript™ II Reverse Transcriptase试剂盒将RNA反转录成cDNA。
然后进行两轮PCR扩增，第一轮PCR扩增体系如下表2所示，鉴定胶结果图如图3所示。
表2 第一轮PCR扩增体系
扩增程序为：98℃ 3min；98℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 30s，整个过程循环20次；72℃2min；4℃保存。
然后进行第二轮PCR，扩增体系如表3所示，鉴定胶结果图如图4所示。
表3 第二轮PCR扩增体系
扩增程序为：98℃ 3min；98℃ 10s，65℃ 15s，72℃ 30s，整个过程循环18次；72℃5min；4℃保存。
对二轮PCR产物进行酶切，酶切体系如表4所示，鉴定胶结果图如图5所示。
表4 酶切反应体系
将鉴定后正确的片段与载体进行连接，连接反应体系如表5所示。
表5 连接反应体系
然后将连接产物通过电转化的方式导入细胞，构建噬菌体文库：
1)将连接产物转入SS320感受态细胞中。
2)DNA和感受态预混，预设电转条件为2.5KV/5.8ms。
3)感受态与DNA混合物加入电击杯中进行电转化，再37℃复苏1小时。
4)Titer板稀释和涂板：将电转的库产物离心，离心3000rpm，5min，弃掉大部分上清，剩余300μL左右上清重悬菌液涂板。
5)培养：将涂好的板倒置放入37℃培养箱中，过夜培养15h。
6)第二天刮菌保存及挑取单克隆送测序，有效库容为1.50E+08。
经测序分析建库质量合格后入库保存以备后续筛选。
S4、以S3构建好的噬菌体文库进行淘选，前两轮采用固相淘选的方式，第三轮采用细胞淘选方式并利用流式细胞分选技术，把与噬菌体结合的细胞分选出来，再进行洗脱并侵染大肠杆菌进行扩增，通过挑取单克隆进行初筛，选择正确的羊驼的VHH基因克隆至真核表达载体pCDNA3.4中，并通过哺乳动物表达系统进行高通量表达，得到大量表达的抗体。
筛选具体步骤如下所示：
1、噬菌体包装：
1）将构建好的噬菌体文库从-80℃取出，冰上解冻；
2）接种到2YT培养基（12µg/mL四环素，50µg/mL氨苄青霉素）中，37℃，220rpm摇菌2h，使其OD值达到0.3-0.4，每瓶菌液分别加入解冻的辅助噬菌体M13KO7（加入量按照接菌量的100倍加入，确保辅助噬菌体是超量对数生长期的菌），37℃，80rpm培养0.5h；
3）加终浓度为50μg/mL的Kana+（卡那青霉素），37℃，220 rpm，0.5h，然后加入100μL浓度0.1M的IPTG诱导，30℃，220rpm，14-16h过夜；
4）第二天，4℃，12000rpm离心10min，用0.45μm的滤膜抽滤上清到预冷的50mL离心管中，向上清中分别加入1/4体积的PEG6000，颠倒混匀后将离心管平放，包埋在冰盒中，冰盒置于振荡器上80rpm震荡1h。
5）4℃，12000rpm离心10 min，弃上清并倒扣离心管使液体流净；吸取1mL预冷的PBS，用巴氏吸管轻轻吹打重悬噬菌体；12000rpm离心5min，将上清转移到1.5mL离心管中用于后续实验；
6）侵染：在96孔稀释板内，用对数期SS320做10倍梯度稀释噬菌体悬液（稀释12个梯度），37℃静置30min侵染点板便于第二天计算噬菌体滴度；
7）计数：次日，取出平板观察有无污染。若无，统计噬菌体滴度，计算1mL溶液含有的噬菌体个数。
2、淘选：分为两种方式，一种是3轮固相淘选，另一种为前两轮固相，第三轮细胞淘选策略。
1）固相淘选包被：用PBS稀释CD28-his抗原（稀释至10μg/mL）到5mL免疫管中，在4℃过夜旋转包被；
2）封闭噬菌体和空白免疫管：空白免疫管和所需上样噬菌体（phage）一同用1%的BSA室温1h旋转封闭；
3）封闭包被CD28-his的免疫管：去掉包被液，用PBST洗涤免疫管后用1%的BSA室温1h旋转封闭：
4）孵育：封闭后，取封闭后的phage管子里的上清，加入到CD28-his的免疫管中，室温，1h旋转孵育，去上清，加入PBST洗细胞8次，PBS洗2次，然后加入含0.25% EDTA的胰酶1mL洗脱结合的噬菌体；
5）侵染：在96孔稀释板内，用摇起来的对数期SS320菌稀释洗脱的phage,总共稀释8个梯度，首孔加入10μL的phage，按10倍梯度稀释，37℃静置30min，同时，取500μL洗脱液与5mL对数期SS320细胞混匀，37℃静置培养30min后，3000rpm，室温，离心5min，剩余300μL培养基重悬菌体，涂布于固体培养板（抗性：氨苄青霉素/盐酸四环素/终浓度2%的葡萄糖）上，平板倒置，37℃培养箱中过夜培养；
6）输出噬菌体库保存：余下约0.5mL输出噬菌体库洗脱液，加终浓度约15%甘油混匀冻存；
7）计数：次日，取出平板观察有无污染。若无，统计噬菌体滴度，计算1mL溶液含有的噬菌体个数，刮板并进行第二轮淘选噬菌体的制备；
8）经过3轮的吸附-洗脱-扩增，可富集与靶蛋白CD28-his结合的噬菌体。
细胞淘选：
1）消化未感染及感染human-CD28的CHOK1细胞，分别计数，感染human-CD28的细胞密度为5.00E+06/mL，终浓度为1μM的CFSE染色，37℃，7min避光染色，1mL的PBS重悬4℃备用；
2）未感染的CHOK1细胞密度为6.00E+06/mL，预冷PBS洗3次，去上清；
3）用未感染CHOK1细胞6.00E+06和所需上样Phage一同用1%的BSA封闭，4℃，1h旋转孵育；
4）封闭后，400g，5min取上清，加入到感染human-CD28细胞2.50E+06和未感染的细胞2.50E+06混合液中，4℃，1h旋转孵育，去上清，加入PBST洗细胞3次，离心去上清；
5）PBS洗细胞3次，离心去上清，用1mL含1mM EDTA的PBS重悬细胞上流式分选仪分选阳性细胞；
6）分选后的细胞800g，离心5min，弃上清，加入500μL的20mM柠檬酸PH2.3 buffer，室温孵育6min；
7）洗脱结合的噬菌体，800g，离心5min，上清转移至500μL的1M Tris-HCL PH8.0的缓冲液中，细胞侵染，500μL至5mL摇起的SS320菌液中，混匀，37℃恒温培养箱放置30min；
8）上步15mL离心管3000rpm，离心5min，富集菌体，余300μL培养基重悬菌体，涂板。平板倒置37℃恒温培养箱中，过夜。
单克隆初筛：
1）包被：前一天在96孔ELISA酶标板中，用1μg/mL的CD28-his每孔加入100μL，在4℃过夜包被；
2）洗板：第二天，去上清，200μL每孔的PBST洗板3次；
3）封闭：1% BSA 200μL/孔，室温1h。
4）样品准备:前一天在96孔深孔板中加入600μL 2YT培养基（12µg/mL四环素，50µg/mL氨苄青霉素），挑选第三轮的固相淘选的单克隆以及第三轮细胞淘选的单克隆，220rpm，37℃摇床中过夜培养，4000rpm，5min离心过夜的菌，100µL/孔用多道排枪将上清样品加入到相应孔板中，室温孵育1h。
5）加二抗：稀释足量的二抗（Anti-M13 Antibody (HRP), Mouse Monoclonal）），100µL/孔加入到相应96孔酶标板中，室温孵育1h，PBST洗板5次，然后加入室温下的TMB 100µL，室温，5min，进行显色；
6）终止反应：加TMB显色终止液（450nm，不含硫酸）100µL，终止反应；
7）数据采集与分析：酶标仪OD450读取数据，数据处理如表6-12所示，其中A12-D12孔为CD28阳性对照抗体，共筛到129个阳性克隆送测，测序分析有35条unique序列进行构建表达；
8）挑取筛到的阳性克隆送测序并测序分析所得的正确序列进行构建及大量表达。
表6 流式分选结果1
表7 固相淘选结果1
表8流式分选结果2
表9 流式分选结果3
表10 流式分选结果4
表11流式分选结果5
表12 流式分选结果6
S5、以步骤S4表达的抗体进行细胞功能检测，通过流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况，结果显示，有7个抗体与细胞有很好的结合活性用于后续实验，具体试验步骤如下：
FACS检测：
1）细胞悬浮液制备：在预冷的MACS缓冲液（PBS，2% FBS，2mM EDTA）中调整细胞数至4.00E+06/mL，在96孔板上加入50μL/孔的细胞悬液。
2）一抗孵育：用MACS缓冲液按首孔200nM，4倍梯度稀释待测抗体。稀释后加入50μL抗体稀释缓冲液进1）的细胞悬液中，混合均匀，在4℃孵育60min；
3）洗细胞：在96孔中加入100μL的MACS缓冲液，400g离心5min，弃上清，在孔中加入200μL的MACS缓冲液洗涤细胞，400g离心5min，弃上清，清洗两次；
4）二抗孵育：用100μL荧光二抗（Goat anti-Human Fc,Alexa Fluor 647，1:1000稀释）重悬细胞，在4℃孵育30min；
5）洗细胞：在96孔中加入100μL的MACS缓冲液，400g离心5min，弃上清，在孔中加入200μL的MACS缓冲液洗涤细胞，400g离心5min，弃上清，洗两次；
6）检测及数据分析：用200μL MACS缓冲液重悬细胞上流式细胞仪检测，数据处理如图6所示，有7个抗体与细胞有很好的结合效果，后面把这7个抗体分别与cyno-CD28抗原和mouse-CD28做ELISA检测，结果如图7、图8所示，结果显示，7个抗体均显示出与cyno-CD28很好的交叉反应活性，EC50在0.3nM左右，其中有两个抗体跟mouse-CD28有交叉反应活性。如图8所示，MY-36,MY-86能结合cyno-CD28且与mouse-CD28，显示出弱结合。
2、细胞报告基因测定：
1）制备1倍浓度的CD28 单克隆抗体CD28 Monoclonal Antibody（CD28.2）与CD3单克隆抗体Anti-Human CD3 epsilon OKT-3（muromonab）。浓度为0.01μg/mL的OKT-3和100nM抗CD28.2；
2）包被抗体：抗体以100μL/孔包被96孔平板，在4℃过夜包被；
3）细胞准备：加入100μL/孔制备的Jurkat-luc2p-IL2细胞到包被过的96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2培养箱中培养6小时；
4）加入Bio-Glo荧光素酶检测，室温下在摇床上以400转每分钟震荡，孵育10分钟上酶标仪检测荧光信号，数据处理如图9所示。由图9可知，在CD3抗体和CD28抗体同时存在的时候，CD28纳米抗体MY-92、MY-127、MY-91、MY-119显示出激活活性，且有浓度依赖效应。与参照抗体相比，MY-92、MY-127具有显著激活活性。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1. 一种抗CD28纳米抗体，其特征在于，所述抗CD28纳米抗体包括框架区和互补决定区，所述互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3，其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.7，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.8。
2. 如权利要求1所述的抗CD28纳米抗体，其特征在于，所述抗CD28纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15。
3. 如权利要求2所述的抗CD28纳米抗体，其特征在于，编码所述抗CD28纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23中的一种。
4. 一种分子表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述SEQ ID NO.16~SEQID NO.23中的一种。
5.一种含有权利要求4所述分子表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
6.一种如权利要求1-3任一项所述抗CD28纳米抗体的制备方法，其特征在于，制备过程如下：
S1、依据CD28的蛋白序列和基因序列信息，分析并设计免疫抗原，在其C端连接His-tag，获得经修饰的抗原；
S2、用步骤S1获得的抗原对羊驼进行免疫，通过对免疫后的羊驼分离血清进行效价检测，然后从外周血中提取效应B细胞，获得羊驼PBMC细胞；
S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，提取总RNA，通过逆转录PCR技术获得cDNA片段，以此为模板扩增出VHH基因片段，然后将目的基因片段克隆至噬菌粒载体中，并转化入感受态细胞，构建噬菌体文库；
S4、以步骤S3所构建的噬菌体文库进行噬菌体包装，通过淘选富集，并进一步挑取单克隆进行初筛，筛选阳性克隆送测，测序分析选择正确抗体序列进行真核表达；
S5、以步骤S4表达的抗体进行细胞功能检测，筛选特异性及灵敏度好的抗体，即得。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述真核表达载体为PcDNA3.4载体。
8.一种权利要求1所述抗CD28纳米抗体在制备预防和治疗肿瘤药物中的应用。
9.一种权利要求1所述的抗CD28纳米抗体在制备CD28类肿瘤检测试剂中的应用。
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| CN114605540A (zh) * | 2021-08-26 | 2022-06-10 | 北京大学深圳研究生院 | 一种抗cd28纳米抗体、编码基因及应用 |
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2023
- 2023-11-20 CN CN202311548011.9A patent/CN117534761A/zh active Pending
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