WO2023216623A1 - SARS-CoV-2α、γ、δ和ο突变株骆驼源高亲和力纳米抗体 - Google Patents

SARS-CoV-2α、γ、δ和ο突变株骆驼源高亲和力纳米抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种SARS-CoV-2α、γ、δ和ο突变株骆驼源高亲和力纳米抗体，具体涉及与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白特异性结合的抗体及其抗原结合片段，更具体涉及能以高亲和力结合冠状病毒例如SARS-CoV-2 Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株表面S蛋白的抗体或其抗原结合片段，其氨基酸序列包含由SEQ ID NO:9-15任一所示的CDR1、由SEQ ID NO:16-21任一所示的CDR2、由SEQ ID NO:22-29任一所示的CDR3；其能够用于预防、检测、诊断或治疗由冠状病毒尤其是SARS-CoV-2病毒引起的感染。

Description

SARS-CoV-2α、γ、δ和ο突变株骆驼源高亲和力纳米抗体 技术领域
本发明属于生物技术、免疫检测和生物医药领域，具体涉及特异性纳米抗体或抗原结合片段、抗原识别表位及其在冠状病毒例如SARS-CoV-2的检测、诊断、预防、治疗中的用途，尤其涉及在SARS-CoV-2 Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株的检测、诊断、预防、治疗中的用途。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2是一种β冠状病毒属RNA病毒。该病毒具有传播性强、致死率高和突变速度快等特点。SARS-CoV-2会引起呼吸道感染，从而导致一些患者出现病毒性肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。同时还会引发细胞因子风暴，引起多器官损伤。新冠病毒原始毒株被分离至今，在全球传播过程中不断出现的新型突变株病毒如D614G突变株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、B.1.429突变株、P.1突变株、B.1.617.2突变株、B.1.1.529突变株等，不仅大大增强了病毒的传播性和致死率，同时也造成了疫苗保护力的不断降低。
在COVID-19患者治疗中使用一些小分子药物和干扰素进行抗病毒治疗，然而临床结果均显示无效或仅能在病毒感染的早期能起到有限的治疗效果,同时还会伴随一系列严重的药物副作用。已有研究证明抗体治疗策略是治疗冠状病毒患者，尤其是中晚期患者的最佳解决方案。利用含有大量中和抗体的COVID-19愈后患者血清治疗新冠病毒患者是行之有效的治疗策略。但患者血清疗法的局限性在于康复者血浆较难获得，数量较少，不能满足庞大患者群体需求，所以需要替代性的工程抗体进行治疗。
纳米抗体(Nanobody)是只含有重链抗体抗原结合域VHH的单域抗体，与传统多克隆抗体、单克隆抗体和单链抗体相比具有诸多明显优势，比如体积小，可以穿过常规抗体无法进入的组织和器官(如鞘膜、脊髓、大脑等)中；稳定性强，无需冷链运输和冷藏保存；免疫原性低， 易于进行人源化改造。本发明将SARS-CoV-2病毒表面突刺蛋白(Spike蛋白，即S蛋白)做为靶标，通过构建噬菌体展示纳米抗体免疫文库、生物淘选研制出可同时识别多种新型冠状病毒例如Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株的骆驼源高亲和力纳米抗体，为新冠肺炎的机理研究、临床诊断和治疗打下基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种针对冠状病毒的广谱型、高亲和力抗体，该抗体可有效检测、阻断、和治疗冠状病毒尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株。
在本发明的具体实施方案中，提供了抗SARS-CoV-2纳米抗体，其可以和Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S蛋白的S1亚基(也称为S1蛋白)结合，亲和力均达到纳摩尔级别。
在本发明的具体实施方案中，提供了抗冠状病毒例如SARS-CoV-2的纳米抗体，其能够有效阻断SARS-CoV-2假病毒对hACE2过表达的293T细胞的感染，半有效中和浓度达到纳摩尔级别。
在本发明的具体实施方案中，可以进行多种基于抗原/抗体反应的酶联免疫分析检测方法的建立和检测产品的开发。
在本发明的具体实施方案中，可以进行同种或多种基于纳米抗体的多价化等基因工程改造。
在本发明的具体实施方案中，提供了针对冠状病毒例如SARS-CoV-2的纳米抗体，所述纳米抗体包含如下的氨基酸序列和功能特性：
i)SEQ ID NO:1-8所示的氨基酸序列；或者所述抗体可具有SEQ ID NO:9-15任一所示的高度可变区CDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:16-21任一所示的高度可变区CDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:22-29任一所示的高度可变区CDR3氨基酸序列；
ii)所述纳米抗体与冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株具有纳摩尔级别的亲和力；
iii)所述纳米抗体有效阻断SARS-CoV-2假病毒对hACE2过表达的293T细胞的感染。
iiii)所述纳米抗体特异性识别SARS-CoV-2病毒表面S蛋白的抗原表位，该抗原表位包括RBD结构域保守区的位于345-356位的TR氨基酸序列，位于第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列，和位于第499-500位的PT氨基酸序列，特别是包括氨基酸残基K444，N450，N448，R346，T345，L441，V445，P499，N440，V445和T500；
本发明还提供一种含有所述编码所述抗体的核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
本发明还提供所述抗体的以下任一应用：
1)用于冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株相关的科学研究；
2)用于冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株表面S蛋白的检测；
3)用于研制冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株检测试剂或ELISA检测试剂。
本发明中，分析检测时，向包被有冠状病毒例如所述SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株抗原的酶标板的各孔中加入不同浓度所述纳米抗体，由于每个孔中的固相抗原含量均一致，因此当结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被结合的纳米抗体结合量少，最后加入底物液和显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低；反之，当所述纳米抗体和固相抗原结合多时，则所测的OD值高，根据加入的纳米抗体量和对应孔的OD值绘制纳米抗体和SARS-CoV-2的结合曲线。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
1、一种抗体或其抗原结合片段，其氨基酸序列包含由SEQ ID NO:9-15任一所示的CDR1、由SEQ ID NO:16-21任一所示的CDR2、和由SEQ ID NO:22-29任一所示的CDR3；
优选地，所述抗原结合片段例如为Fv、Fab、Fab'、scFv、F(ab') 2、多价化或多特异片段。
2、根据项目1所述的抗体或抗原结合片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-8任一所示；
或者所述抗体或抗原结合片段是包含将SEQ ID NO:1-8任一所示序列自N末端起第1位至121位氨基酸进行截短所获得的序列的抗体或抗原结合片段，或者是将SEQ ID NO:1-8任一所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的抗体或抗原结合片段。
3、基因工程抗体，其包含项目1或2所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述基因工程抗体为人源化抗体、嵌合抗体、多价化或多特异性抗体。
4、融合蛋白，其包含项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体；优选地，所述融合蛋白还包含标签多肽、检测蛋白或辅助蛋白。
5、偶联物，其包含项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体或项目4所述的融合蛋白；优选地，所述偶联物还包含可检测标记物、造影剂、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、脂质体、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
6、核酸分子，其编码如项目1-2所述的抗体或抗原结合片段、如项目3所述的基因工程抗体、如项目4所述的融合蛋白或如项目5所述的偶联物，其中所述核酸分子为RNA、DNA或cDNA。
7、表达载体，其包含项目6所述的核酸分子；
任选地，所述表达载体可以是DNA、RNA、病毒载体、质粒、表达盒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；
优选地，所述表达载体包括病毒载体，如噬菌体载体、慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、其他蛋白表达系统、或其组合。
8、宿主细胞，其包含项目7所述的表达载体；其中，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如原核表达细胞、真核表达细胞、转基因细胞系；优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞。
9、组织样本或培养物，其通过培养项目8所述的宿主细胞获得。
10、蛋白或抗原结合片段，其从项目9所述的组织样本或培养物中分离获得。
11、制备项目1-2所述的抗体或抗原结合片段、如项目3所述的基因工程抗体、如项目4所述的融合蛋白或如项目5所述的偶联物的方法，包括从项目9所述的组织样本或培养物中分离/回收目的蛋白或多肽。
12、药物组合物，其包含项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体或项目4所述的融合蛋白或项目5所述的偶联物作为活性成分；例如，所述药物组合物为吸入式雾化药物、粘膜或表皮外用型药物、皮下注射型药物、血管输入型药物、或其组合；优选地，所述药物组合物还包括药用赋形剂或载体。
13、含有项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体或项目4所述的融合蛋白或项目5所述的偶联物的产品；例如，所述产品为口罩或空气净化器滤芯，环境、物体或人体表面消毒剂，或其组合；优选地，所述产品涂布在净化器滤芯中或溶解于消毒剂中用于雾化喷洒或表面擦拭。
14、项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体或项目4所述的融合蛋白或项目5所述的偶联物在制备用于预防、治疗和/或诊断冠状病毒感染的产品或药物中的用途。
15、项目1或2所述的抗体或抗原结合片段或项目3所述的基因工程抗体或项目4所述的融合蛋白或项目5所述的偶联物在制备用于以下功能的产品中的应用：
1)检测冠状病毒抗原，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
2)阻断冠状病毒感染，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
3)消杀冠状病毒颗粒，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
4)诊断冠状病毒引起的相关疾病，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
5)治疗冠状病毒引起的相关疾病，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
6)进行冠状病毒相关的基础科学研究，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株。
16、位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域保守区的抗原表位及其组合，其中所述抗原表位具有以下氨基酸序列：
1)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第345-346位的TR氨基酸序列；
2)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列；和
3)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第499-500位的PT氨基酸序列。
17、项目16所述抗原表位在制备用于以下功能的产品中的应用：
1)研制广谱型冠状病毒抗原或疫苗，尤其是针对SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株的抗原疫苗；
2)制备用于预防、治疗和/或诊断广谱型冠状病毒感染的抗体、抗原结合片段、药物或产品，尤其是针对SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
3)进行冠状病毒相关的基础科学研究，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株相关的基础科学研究。
在本发明的具体实施方案中，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、HCoV-229E、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1或其他具有相似表面S蛋白结构的冠状病毒。
在本发明的具体实施方案中，SARS-CoV-2病毒的突变株包括B.1.1.7突变株、P.1突变株、B.1.617.2突变株、B.1.1.529突变株等。
在本发明的具体实施方案中，所述标签多肽包含纯化标签、检测标签、鉴定标签、偶联标签、功能验证标签等功能多肽，例如His标签、HA标签、Flag标签、c-Myc标签、Avi标签等。
在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白中所包含的检测蛋白包括荧光蛋白、荧光素标记蛋白、过氧化物酶等功能蛋白，例如FPs蛋白、HRP蛋白、Alexa Fluor标记蛋白、或FITC标记蛋白等。
在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白中所包含的辅助蛋白为用于辅助折叠、辅助表达、辅助溶解、屏蔽毒性蛋白等功能的蛋白，例如GST蛋白、MBP蛋白、SUMO蛋白、或NusA蛋白。
技术效果
本发明提供的用于抗冠状病毒例如SARS-CoV-2的抗体，有效克服目前冠状病毒例如SARS-CoV-2康复患者血清来源少，成本高，结构不稳定等缺点，具有高亲和力、高灵敏度、高中和能力、高产量、高稳定性，低成本并能进行大批量快速生产。本发明提供的抗体除了可以用于初期感染阻断、早期感染诊断、中晚期感染治疗外，还可以用于科研工具和体外快速检测，例如生产ELISA检测/诊断试剂盒、胶体金检测/诊断试剂盒。本发明提供的抗原表位可以用于研发冠状病毒广谱型抗原和疫苗，还可以用于科研工具和体外快速检测，例如生产ELISA检测/诊断试剂盒、胶体金检测/诊断试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下 面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述纳米抗体与SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白的结合曲线；
图2为本发明所述纳米抗体与SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白的亲和力曲线(以A1为例)；
图3为本发明所述纳米抗体对SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株假病毒的中和抑制曲线。
图4显示了本发明所述抗体的序列及其CDR区；
图5为实施例1中所使用的pComb3Xss的质粒图谱；
图6为本发明所述纳米抗体与SARS-CoV-2病毒S蛋白(三聚体)的复合物(以抗体A1为例)；
图7为本发明所述纳米抗体与SARS-CoV-2病毒RBD亚基的结合模式图(以抗体A1为例)。
图8为本发明所述纳米抗体CDR与SARS-CoV-2病毒RBD亚基结合表位(以抗体A1为例)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者， 均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
根据本发明的一些优选实施例，所述纳米抗体可以按如下方法进行制备：将原始毒株SARS-CoV-2蛋白作为免疫原免疫实验动物骆驼，提取外周血淋巴细胞的总RNA，经反转录及巢式PCR，克隆出纳米抗体重链(VHH)基因片段，通过酶切连接，将基因片段克隆至噬菌粒载体，高效电转化至大肠杆菌，经辅助噬菌体拯救，构建得到噬菌体纳米抗体库，筛选出SARS-CoV-2纳米抗体，将其进行表达纯化，得到灵敏度高的SARS-CoV-2纳米抗体，并且与流行的突变毒株有较高的交叉反应。制备的纳米抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达。
根据本发明的一些优选实施例，所述SARS-CoV-2病毒wild type原始株S蛋白和RBD蛋白作为免疫原，SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白作为包被的抗原，均购买于北京义翘神州生物有限公司。
所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度为1ug/mL。
所述酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗HA标签抗体，浓度为0.1μg/mL。购自Abcam公司，商品编号:ab1265。
所述显色液A液由过氧化脲1g、柠檬酸10.3g、Na 2HPO 4·12H 2O 35.8g、吐温-20 100μL和蒸馏水1000mL配制而成，pH值5。
所述显色液B液由四甲基联苯胺700mg、DMSO 40mL、柠檬酸10.3g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值2.4。
所述反应终止液为2M的硫酸液。
实施例1、SARS-CoV-2纳米抗体库的构建
取200ug SARS-CoV-2病毒Wild Type原始株S蛋白和RBD蛋白(北京义翘神州生物有限公司)与等体积完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射至骆驼，以后每隔两周加强免疫一次，其中在加强免疫中使用不完全弗氏佐剂与免疫原的混合液，颈背部皮下多点免疫，共免疫5次。从第三次免疫开始，每次免疫后一周从颈锁静脉采血并检测血清效价。
从第5次免疫后的外周血中分离白细胞，提取总RNA，经反转录PCR及巢式PCR(其中，反转录PCR和巢式PCR的体系和参数如下所述)，克隆出VHH基因片段，用限制性内切酶SfiI修饰粘性末端，通过T4连接酶将VHH基因片段连接至噬菌粒pComb3Xss(UC Davis的Bruce D Hammock教授实验室惠赠，其质粒图谱参见图5)，高效电转化至大肠杆菌ER2738(实验室保存，也可商购获得，例如购自英国NEB公司)，构建SARS-CoV-2的噬菌体纳米抗体库。经测定，初级库容量达10 9cfu，加入辅助噬菌体(感染复数为20:1)M13KO7(购自NEB公司，货号：N0315S)进行拯救，得到噬菌体纳米抗体库，库容量为10 12pfu/mL，库的多样性较好。
反转录PCR：
反转录试剂盒采用PrimeScript TM RT-PCR Kit，购自TaKaRa公司，商品编号：AK2701。
反转录体系如下：
Figure PCTCN2022143348-appb-000001
65℃，反应5min。取出置于冰上，按以下体系加样，进行cDNA第一链合成。
Figure PCTCN2022143348-appb-000002
Figure PCTCN2022143348-appb-000003
30℃10min；42℃1h；72℃5min。
巢式PCR：(购自TAKATA公司，货号：6210A)
第一轮PCR：
反应体系如下：
Figure PCTCN2022143348-appb-000004
反应程序如下：
Figure PCTCN2022143348-appb-000005
第二轮PCR：
反应体系如下：
Figure PCTCN2022143348-appb-000006
Figure PCTCN2022143348-appb-000007
反应程序如下：
Figure PCTCN2022143348-appb-000008
巢式PCR引物序列如下(5′-3′)：
GSP-RT：CGCCATCAATRTACCAGTTGA(SEQ ID NO:30)
LP-leader：GTGGTCCTGGCTGCTCTW(SEQ ID NO:31)
R：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG(SEQ ID NO:32)
F：CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC(SEQ ID NO:33)
其中，R表示碱基A/G，W表示碱基A/T，K表示碱基G/T。
实施例2、SARS-CoV-2纳米抗体的筛选
在96孔酶标板的第1个孔包被SARS-CoV-2病毒S蛋白抗原，包被浓度为1ug/mL，4℃过夜；次日，倒出包被液，用PBST洗涤3次，将酶标板第1、2两个孔用BSA封闭，室温孵育2h；倒出封闭液，用PBST洗涤3次；将实施例1获得的噬菌体纳米抗体库加入第1个孔，反应2h；倒出液体，在洁净的吸水纸上拍干，用PBST洗涤5次；将100μL SARS-CoV-2病毒Wild type原始株S1蛋白添加到第1个孔中，反应1h；吸出第1个孔中的液体，加入第2个孔，反应1h，除去与BSA结合的噬菌体；收集洗脱液，取5μL用于滴度测定，其余用于扩增。
将噬菌体洗脱液加入新鲜的大肠杆菌ER2738菌液(实验室保存，也可商购获得，例如购自NEB公司)，37℃，静置15min；加入羧苄青霉素和SB培养基，37℃，220rpm，培养2h；加入辅助噬菌体M13KO7 (感染复数MOI＝20:1)(购自NEB公司，货号：N0315S)和卡那霉素，培养过夜；次日，离心取上清，加入PEG-NaCl溶液沉淀纯化噬菌体。
将扩增产物进行下一轮筛选，保证每轮筛选的加入量相同，抗原包被浓度及S蛋白竞争洗脱浓度按2倍递减，计算每轮的滴度，挑取单克隆进行扩增及ELISA鉴定。经3轮淘选得到阳性单克隆。
实施例3、SARS-CoV-2纳米抗体的表达
提取阳性单克隆质粒，转化至大肠杆菌TOP10F’感受态细胞(购自Thermo Fishier)，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。次日，挑取单个克隆于SB-羧苄培养基中培养，加入IPTG诱导过夜表达；次日，用高压均浆仪裂解细胞，滤膜过滤后用镍柱纯化，即利用组氨酸标签与镍柱中氯化镍的亲和层析对纳米抗体进行分离纯化，得到高纯度的抗SARS-CoV-2纳米抗体，即抗体A1-A8，经氨基酸测序分析，所得纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-8所示。
实施例4、纳米抗体与SARS-CoV-2病毒S1蛋白的结合曲线
将SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白(北京义翘神州生物有限公司)分别包被于96孔酶标板上，每个孔包被浓度为1ug/mL，4℃过夜反应；次日，甩出孔中的液体，用含0.05％吐温的PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入封闭液，37℃孵育30分钟，甩出孔中的液体，用0.05％PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；分别加入100μL不同稀释倍数的实施例3所得的纳米抗体液，37℃孵育30分钟；甩出孔中的液体，用PBST洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的抗HA标签抗体，购自Roche公司)，37℃孵育30分钟；甩出孔中的液体，用PBST洗板3次，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加100μL，避光显色10～15分钟，加入终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。根据抗体浓度和对应孔中的OD值绘制纳米抗体和SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白的结合曲线(参见图1)。实验结果表明这8个纳米抗体 与Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白均有较强的亲和力，说明所述纳米抗体具有一定的广谱性。
实施例5、纳米抗体与SARS-CoV-2病毒S1蛋白的亲和力曲线
亲和力检测使用的是亲和素探针，利用Octet red 96仪器进行检测，所述亲和力检测方法是本领域常规技术操作，具体操作如下。向黑色无结合力的96孔板第一列的8个孔中加入0.02％吐温-20的PBST；再向第二列8个孔中加入浓度为15ug/ml生物素标记的SARS-CoV-2病毒Alpha(B.1.1.7)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)突变株S1蛋白。第三、五、七、九，十一列中加入PBST,第四、六、八，十列中加入倍比稀释的本发明所述的纳米抗体，其中每列的第8个孔加入PBST，第十二列中加入甘氨酸2.0，所述上述液体均200ul每孔。大致程序如下：
1)先将8根亲和素探针(streptavidin-sensor，购自FORTEBIO,货号：18-5019)浸入到第一列PBST中进行平衡60s；
2)再将亲和素探针浸入到SARS-CoV-2 S蛋白稀释液中结合3min；
3)再回到第一，三列PBST中进行两次平衡；
4)平衡后的探针浸入到第四列纳米抗体稀释液中，进行抗原抗体的特异性结合，结合3min；
5)再回到第三列PBST中进行解离，解离10min。
6)解离后探针在第十二列甘氨酸2.0中再生5s，将结合的纳米抗体完全洗脱下来；
7)再回到第十一列PBST中进行中和5s；
8)重复6)7)两步；
9)再将探针浸入第五列PBST中进行平衡；重复4)5)6)7)8)步骤依次检测其他纳米抗体与SARS-CoV-2 S蛋白结合能力；
10)最后将实验数据导入到excel表中；
结果参见图2和表1，结果显示八个纳米抗体对SARS-CoV-2病毒Alpha突变株S1蛋白亲和力范围为：0.18-0.9nM，对Gamma突变株S1 蛋白亲和力范围为：0.52-9.3nM，对Delta突变株S1蛋白亲和力范围为:0.53-7.79nM，对Omicron突变株S1蛋白亲和力范围为:0.88-9.9nM。
表1纳米抗体与SARS-CoV-2病毒Alpha突变株S1蛋白，Gamma突变株S1蛋白，Delta突变株S1蛋白和Omicron突变株S1蛋白的亲和力常数K D(M)
Figure PCTCN2022143348-appb-000009
实施例6、纳米抗体对SARS-CoV-2假病毒感的中和能力检测
首先用DMEM培养基将本发明所述的八种纳米抗体倍比稀释10个浓度梯度，每个浓度的终体积为50ul，其中，第10个梯度中只含有DMEM培养基且纳米抗体浓度为0，并将其作为对照组，再将3ul能够产生约1x10 5 RLUs(相关荧光素酶活性)的SARS-CoV-2 Alpha突变株假病毒(中国科学院上海巴斯德研究所王海坤研究员惠赠，或者也可购自北京云菱生物技术有限公司)加入纳米抗体稀释液中，混匀后37度孵育60min，再将50ul含有10000个HEK293T-hACE2细胞(中国科学院上海巴斯德研究所王海坤研究院惠赠，或者也可购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)加入到病毒-抗体复合物中，充分混匀再加入到96孔细胞培养板中，每个浓度的抗体设置3个重复孔。将细胞培养板放置于37℃培养箱中，培养48h后，将细胞上清弃去，每孔加入100ul Bright-Glo(Promega)，反应2min，转移到白色96孔板中使用Varioskan Flash多功能读数仪检测萤火虫荧光素酶活性值(SARS-CoV-2病毒Gamma突变株、Delta突变株和Omicron突变株假病毒中和实验与Alpha突变株假病毒中和实验 步骤一致，仅加入的假病毒不同；假病毒和HEK293T-hACE2细胞均由上海巴斯德所王海坤研究员惠赠，或购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。以加入抗体后SARS-CoV-2 S假病毒对HEK293T-hACE2细胞感染率和纳米抗体浓度为横纵坐标绘制中和抑制曲线，最后根据曲线计算EC 50值。感染率＝(实验孔RLUs值-本底值)/(对照孔RLUs值-本底值)x100％，本底值为只加100ul Bright-Glo读取的值。结果参见图3，实验结果表明八种纳米抗体都能特异性中和SARS-CoV-2 S蛋白假病毒。对Alpha突变株假病毒的中和EC 50范围为：0.56-9.91nM,对Gamma突变株假病毒的中和EC 50范围为：0.56-7.73nM,对Delta突变株假病毒的中和EC 50范围为：0.67-6.26nM，对Omicron突变株假病毒的中和EC 50范围为：3.07-31.38nM。
实施例7、纳米抗体与SARS-CoV-2病毒S糖蛋白复合物的结构解析
本实施例以抗体A1为例，研究了纳米抗体与SARS-CoV-2病毒S糖蛋白复合物的结构解析，本实施例的数据结果同样适用于抗体A2-A8。
运用昆虫-杆状病毒表达系统(实验室保存，也可商购获得，例如购自美国invitrogen公司，catalog nos.A11100)对SARS-CoV-2病毒S糖蛋白胞外区进行分泌表达，从培养物上清中利用镍亲和层析柱富集S蛋白，用咪唑梯度洗脱目的蛋白，将含有目的蛋白的组分收集浓缩后进行凝胶过滤层析(superdex 200 increase层析柱)并通过SDS-PAGE进行蛋白质鉴定，获得高纯度、高均一度的S糖蛋白三聚体。向S蛋白液中加入戊二醛(终浓度0.25％)，在冰上交联固定30分钟。将铺设有带孔连续碳膜的冷冻制样载网(GIG 411)用氧气，氩气，50瓦辉光放电处理1分钟备用。向固定好的S蛋白中以1:3摩尔比例加入纳米抗体并在EP管中迅速吹打混匀，立即用EMGP(莱卡)制样仪制备冷冻电镜样品。蛋白液终浓度为0.7mg/mL，上样体积3微升，冻样设置乙烷杯温度-183℃，腔室温度10℃，湿度85％，preblot 0秒，blot 4秒。将制备好 的冷冻电镜样品用Talos 200 KV冷冻电镜进行样品筛查，将颗粒衬度、完整性和均一性好的样品留存备用。
将筛查好的冷冻电镜样品用配备有K2相机的高端冷冻电镜Titan Krios 300 KV进行数据收集。数据收集条件为pixel size 1.04，32帧，总电子剂量
Figure PCTCN2022143348-appb-000010
将冷冻电镜数据用Relion 3.0软件进行数据处理后获得高分辨率的冷冻电镜电子密度图。S蛋白以PDB 7DK3为初始模型，纳米抗体采用manifold软件预测获得的模型作为初始模型，将上述初始模型用Chimera软件Fit到电子密度图中后，用Coot软件进行手动调整和模型搭建。通过PHENIX软件进行模型修正，最终获得各项参数良好的S蛋白与纳米抗体复合物的结构模型。
由图6-图8可知，SARS-CoV-2糖蛋白与纳米抗体P2-1的复合物冷冻电镜结构模型显示本实施例捕捉到的复合物由一个S糖蛋白三聚体和两个纳米抗体P2-1组成。S糖蛋白三聚体呈部分打开构象：一个RBD结构域为“半打开”状态；两个RBD结构域为“闭合”状态。两个纳米抗体P2-1分别独立与“半打开”RBD结构域和相邻的“闭合”RBD结构域结合。纳米抗体P2-1主要通过其CDR3区域与RBD相互作用，其CDR1、FR2和FR3的部分区域也参与了复合物的结合。P2-1的CDR3区域的氨基酸残基D99，S101，A103，D104，W105，R106，A107，W109可能与SARS-CoV-2糖蛋白RBD结构域的第345-346位的TR氨基酸序列，第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列和第499-500位的PT氨基酸序列中的氨基酸残基K444，N450，N448，R346，T345，L441，V445，P499相互作用；CDR1区域的氨基酸残基D33可能与SARS-CoV-2糖蛋白RBD结构域的第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列中的氨基酸残基K444和V445相互结合；FR2区域的氨基酸残基Y47和T50可能与SARS-CoV-2糖蛋白RBD结构域的第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列和第499-500位的PT氨基酸序列中的氨基酸残基P499，N440和V445相互作用；FR3区域的氨基酸残基Y60和S61可能与SARS-CoV-2糖蛋白RBD结构域的第499-500位的PT氨基酸序列中的氨基酸残基T500之间存在相互作用。上述抗体结合位点 均位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域保守区，这也证明了本发明的抗体对SARS-CoV-2原始株和各突变株具有广谱性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
Figure PCTCN2022143348-appb-000011
Figure PCTCN2022143348-appb-000012

Claims (17)

  1. 一种抗体或其抗原结合片段，其氨基酸序列包含由SEQ ID NO:9-15任一所示的CDR1、由SEQ ID NO:16-21任一所示的CDR2、和由SEQ ID NO:22-29任一所示的CDR3；
    优选地，所述抗原结合片段例如为Fv、Fab、Fab'、scFv、F(ab') 2、多价化或多特异片段。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-8任一所示；
    或者所述抗体或抗原结合片段是包含将SEQ ID NO:1-8任一所示序列自N末端起第1位至121位氨基酸进行截短所获得的序列的抗体或抗原结合片段，或者是将SEQ ID NO:1-8任一所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的抗体或抗原结合片段。
  3. 基因工程抗体，其包含权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述基因工程抗体为人源化抗体、嵌合抗体、多价化或多特异性抗体。
  4. 融合蛋白，其包含权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体；优选地，所述融合蛋白还包含标签多肽、检测蛋白或辅助蛋白。
  5. 偶联物，其包含权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体或权利要求4所述的融合蛋白；优选地，所述偶联物还包含可检测标记物、造影剂、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、脂质体、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
  6. 核酸分子，其编码如权利要求1-2所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求3所述的基因工程抗体、如权利要求4所述的融合蛋白或如权利要求5所述的偶联物，其中所述核酸分子为RNA、DNA或cDNA。
  7. 表达载体，其包含权利要求6所述的核酸分子；
    任选地，所述表达载体可以是DNA、RNA、病毒载体、质粒、表达盒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；
    优选地，所述表达载体包括病毒载体，如噬菌体载体、慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、其他蛋白表达系统、或其组合。
  8. 宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体；其中，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如原核表达细胞、真核表达细胞、转基因细胞系；优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞。
  9. 组织样本或培养物，其通过培养权利要求8所述的宿主细胞获得。
  10. 蛋白或抗原结合片段，其从权利要求9所述的组织样本或培养物中分离获得。
  11. 制备权利要求1-2所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求3所述的基因工程抗体、如权利要求4所述的融合蛋白或如权利要求5所述的偶联物的方法，包括从权利要求9所述的组织样本或培养物中分离/回收目的蛋白或多肽。
  12. 药物组合物，其包含权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的偶联物作为活性成分；例如，所述药物组合物为吸入式雾化药物、粘膜或表皮外用型药物、皮下注射型药物、血管输入型药物、或其组合；优选地，所述药物组合物还包括药用赋形剂或载体。
  13. 含有权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的偶联物的产品；例如，所述产品为口罩或空气净化器滤芯，环境、物体或人体表面消毒剂，或其组合；优选地，所述产品涂布在净化器滤芯中或溶解于消毒剂中用于雾化喷洒或表面擦拭。
  14. 权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的偶联物在制备用于预防、治疗和/或诊断冠状病毒感染的产品或药物中的用途。
  15. 权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段或权利要求3所述的基因工程抗体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的偶联物在制备用于以下功能的产品中的应用：
    1)检测冠状病毒抗原，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    2)阻断冠状病毒感染，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    3)消杀冠状病毒颗粒，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    4)诊断冠状病毒引起的相关疾病，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    5)治疗冠状病毒引起的相关疾病，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    6)进行冠状病毒相关的基础科学研究，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株。
  16. 位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域保守区的抗原表位及其组合，其中所述抗原表位具有以下氨基酸序列：
    1)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第345-346位的TR氨基酸序列；
    2)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第440-450位的NLDSKVGGNYN氨基酸序列；和
    3)位于SARS-CoV-2病毒表面Spike蛋白RBD结构域第499-500位的PT氨基酸序列。
  17. 权利要求16所述抗原表位在制备用于以下功能的产品中的应用：
    1)研制广谱型冠状病毒抗原或疫苗，尤其是针对SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株的抗原疫苗；
    2)制备用于预防、治疗和/或诊断广谱型冠状病毒感染的抗体、抗原结合片段、药物或产品，尤其是针对SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株；
    3)进行冠状病毒相关的基础科学研究，尤其是SARS-CoV-2病毒原始株及其突变株相关的基础科学研究。
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