WO2013185193A1 - Método de produção e obtenção de variáveis de fragmento fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina a partir da técnica de clonagem em biologia molecular. - Google Patents

Método de produção e obtenção de variáveis de fragmento fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina a partir da técnica de clonagem em biologia molecular. Download PDF

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Lilian RUMI TSURATA
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to the method for producing and obtaining clones of the anti-digoxin antibody Fab fragment using phage display technology and characterizing its antigen binding;
  • the present innovation is dedicated to the development of a product for therapeutic use with specific potency and more precise dose for detoxification of patients under digoxin treatment.
  • digoxin is a drug used to treat cardiac disorders. It is a digitalis, that is, a cardiotonic glycoside, and comes from the Digitalis lanata plant. Has positive inotropic effect, ie increases the force of cardiac contraction. Its mode of action is through reversible binding to Na + / K + ATPase. By inhibiting it, digoxin increases the amount of sodium in the cardiomocyte. This will stimulate the sodium-calcium pump (exchanging 3 Na + for 1 Ca 2+ ) to expel sodium in exchange for calcium. The consequent increase in calcium within the cell causes an increased excitability of the cardiomyocyte, producing an increase in cardiac contractility.
  • Digoxin has a narrow therapeutic window with a therapeutic level very close to the toxic level. To counter their toxic effect, they may be
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) Fab polyclonal anti-digoxin antibody fragments that are commercially available are used.
  • digoxin is the most commonly used cardiac glycoside in the treatment of congestive heart failure and atrial fibrillation ( Figure 1). Digitalis, the group to which digoxin belongs, are the oldest compounds in cardiovascular medicine that continue to be used in contemporary clinical practice (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002). Research and experimentation with digoxin began more than 200 years ago (WITHERING, 1785) and its applications in heart failure patients were described only in the 20th century, defining its ability to increase heart contractility. Digoxin binds to the cardiac glycoside binding site present in the Na + K + -ATPase enzyme subunit, also known as the sodium potassium pump, inhibiting its activity.
  • This membrane protein is responsible for the transport of sodium to the extracellular medium and when inhibited generates an increase in intracellular sodium. This increase stimulates the sodium-calcium pump exchange, increasing the concentration of intracellular calcium used by contractile proteins. As a consequence there is an increase in myocardial contraction (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002). Its application in heart failure was approved in 1998 by the Food and Drug Administration (FDA). Its use has diminished with the emergence of new therapies such as ⁇ -blockers, angiotensin receptor blockers (ARBs), aldosterone blockers, and cardiac resynchronization (CRT) therapy. therapy). However, it is still used in about 30% of heart failure patients. It is a low-cost drug and is important in developing countries where patients lack access to sophisticated therapies (GHEORGHIADE et al., 2006).
  • FDA Food and Drug Administration
  • Serum digoxin concentration not only depends on the dose administered, but is also related to interactions with other medications and patient conditions (ANTMAN, SMITH, 1985).
  • the incidence of digoxin poisoning increases in situations where digoxin excretion by the kidneys is prevented (SMITH; BUTLER; HABER, 1970).
  • Toxic doses of digoxin can lead to severe and fatal arrhythmias (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002).
  • Digoxin is not antigenic because it is a small molecule (780.92 Daltons) and needs to be covalently linked to appropriate immunogenic proteins (carriers) to produce specific anti-digoxin antibodies.
  • Digoxin was conjugated to BSA in 1967 to obtain specific antibodies in rabbits (BUTLER, CHEN, 1967).
  • Smith et al. documented the high affinity and specificity of selected antibody populations for cardiac glycoside haptens.
  • Fab Fram antigen binding
  • the Fab fragment of the sheep-generated anti-digoxin polyclonal antibody is being manufactured only by one company (Protherics) by the name of DigiFab and received FDA approval in 2001.
  • the anti-digoxin Fab antibody can be imported in accordance with Resolution RDC No. 28 of May 09, 2008 of the National Health Surveillance Agency that authorizes the importation of drugs listed in the list of medicines released on an exceptional basis. intended solely for hospital or prescription use, the importation of which is linked to a particular hospital entity and / or representative civil entity for their exclusive use and is not intended for resale or trade.
  • the antibodies are glycoproteins formed by two identical light chains (LC) of approximately 24 kDa each, and two identical heavy chains (HC) of 55 to 70 kDa each.
  • a light chain is covalently linked to a heavy chain by a disulfide bridge, while the two heavy chains are linked together by disulfide bridges.
  • the carboxyterminal regions of the heavy chains exert effector functions.
  • Light and heavy chains have a variable aminoterminal region (VL, variable light and VH, variable heavy) that participates in antigen recognition.
  • VL variable light and VH, variable heavy
  • Each variable region of light and heavy chains contains three hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs), named from the amino-terminal portion, CDR1, CDR2 and CDR3, with CDR3 being the most variable (ABBAS).
  • LICHTMAN 2005. Between these regions more conserved sequences called framework regions or framework regions are present: FR1, FR2, FR3 and FR4 (TONEGAWA, 1983). Mice have two families of light chain genes, lambda ( ⁇ ) and kappa ( ⁇ ) that differ in their constant regions. The ⁇ chain constitutes only 5% of the total light chain genes, and is much less heterogeneous than the ⁇ chain or heavy chain. (TONEGAWA, 1983). The heavy chain constant region is divided into 5 classes, IgG; IgA; IgM; IgD and IgE. IgG, with a molecular weight of 150 kDa, is the most abundant in mammalian serum.
  • IgG1 is the most commonly found in human serum (ABBAS, LICHTMAN, 2005) and has a well-defined structure, with two disulfide bridges joining heavy chains in the hinge region (between CHI and CH2).
  • HAMA human anti-mouse antibody
  • Antibody fragments are most advantageous for some clinical applications that do not depend on whole antibody. They maintain antigen binding sites, are less immunogenic than whole IgG, diffuse better into the interstitial space, are easily eliminated via glomerular filtration and are more stable in stocks than IgG (FLANAGAN, JONES, 2004). They can be obtained by digesting the immunoglobulin with the pepsin enzyme that produces two divalent F-ab (ab ') 2 bridge-linked Fab fragments, approximately 110 kDa in weight and fragmented Fc, or by the papain enzyme that produces two Fab fragments. , monovalent, with molecular weight of 50 kDa and entire Fc portion ( Figure 2).
  • Anti-digoxin Fab fragments were obtained by digesting IgG using the papain enzyme. Antibody fragments can also be obtained by expression in Escherichia coli, offering the advantage of obtaining large amounts at low cost. Recombinant DNA technology also provides the opportunity for introducing mutations into gene sequences, which may be advantageous. In the case of fragments Fab can increase expressed quantity, stability, solubility and facilitate humanization and affinity maturation (K ONG, RADER, 2009).
  • Phage Display technology comprises a methodology widely used in the generation of antibody fragments. It appeared in 1985, when George Smith demonstrated that the correlation between phenotype and genotype could be established in filamentous bacteriophages (phages) ( Figure 3). Smith showed that exogenous DNA fragments could be inserted into gene III, which encodes the capsid protein (pIII) of these phages, creating a fusion protein. Exogenous peptides exposed on the surface of the phages could be selected by affinity for the specific antibody, allowing them to be enriched with respect to the original peptide by a process commonly called panning.
  • phages filamentous bacteriophages
  • Immunoglobulin variable genes can be amplified from hybridomas or B-lymphocyte cells using universal primer oligonucleotides and polymerase chain reaction (PCR), enabling cloning into expression vectors (ORLANDI et al., 1989). . cCafferty et al.
  • Filamentous phages of class Ff have 11 genes (I - XI) and of these 5 encode capsid proteins that can be fused to recombinant proteins of interest with greater or less success, pIII being most used for phage display. Proteins can also be exposed to small phage particles called phagomids, which are plasmids that carry the recombinant capsid protein gene and contain origin of replication of phage M13 (BARBAS et al., 2001). Phagemid DNA can be packed into viral particles with the help of a helper phage that provides all the wild phage proteins and enzymes needed for phage replication.
  • Fusion protein of the capsid is exposed to particles containing the phagemid and helper phage genomes. These particles containing both genomes can be selected by selection markers (BARBAS et al., 1991). Helper phage has poor replication origin and its genome is inefficiently packaged when compared to phagemid (BARBAS et al., 2001).
  • phage display technology allows the manipulation of antibody genes through generation of mutants. This enables the selection of new antibody variants, some with increased affinity and specificity over the original clone (Krykbaev et al., 2002).
  • Phage display is a technology accessible in Molecular Biology laboratories. However, it is not banal technology and many details need to be worked out to achieve a good result.
  • CN 1375505 (2002 - GEN HOSPITAL PLA) refers to a monoclonal engineered human anti-digoxin gene and single chain antibody. Its structure is: sequential signature: length: 684 bp, class type, nucleic acid, number of chains: geometric structure; linearity; molecule type: DNA (genome); source: positive variable region cloned respectively; belongs to human antibody and VH5 V lambda subgroup I; host carrier containing Escherichia coli, CGMCC and No.0542. It is genetically engineered for human monoclonal chain digoxin antibody used to detect the concentration of digoxin application in the patient serum and to detect the toxic effect of digoxin poisoned patient antagonist against digoxin.
  • the present invention is a broader view of a method of producing and obtaining clones of the anti-digoxin antibody Fab fragment using phage display technology and characterizing its antigen binding. More specifically, the invention has the following objectives:
  • the invention is directed in particular to the development of a product for therapeutic use with specific potency and more accurate dose for detoxification of patients receiving digoxin treatment.
  • FIG. 1 Chemical structure of digoxin (C41H64014), a cardiac glycoside of 780.92 Da;
  • FIG. 1 Figure 2 - Structure of the IgG molecule and its fragments that maintain antigen binding sites; displayed immunoglobulin fragments: Fab, F (ab ') 2.
  • FIG. 3 Schematic representation of class Ff filamentous bacteriophage and its capsid proteins;
  • the presented capsid proteins may be used for the expression of recombinant proteins in the form of fusion protein by phage display technology;
  • Figure 4 Schematic of pComb3XTT phagemid vector used in the phage display system; the vector contains the LC and HC genes from the human Fab fragment for tetanus toxin -TT
  • the light chain was cloned at the Saci and Xbal restriction sites and the Fab fragment heavy chain was cloned at the XhoI and Spel restriction sites;
  • FIG. 5 Schematic representation of the main stages of phage display and panning; the Fab fragment library was transformed into E. coli XL1-Blue cells infected by the helper phage and the phages exposing anti-digoxin Fab fragments were selected by panning rounds by ligation to the immobilized Dig-BSA plaque. Unbound phages were washed away and bound phages were eluted and used to re-infect E. coli XL1-Blue.
  • FIG. 6 Binding profile of Dig-BSA antigen to anti-digoxin IgG present in hybridoma culture supernatant by ELISA, where Dig-BSA conjugate was immobilized at four concentrations: 1, 2, 4 and 8 pg / mL .
  • the anti-digoxin hybridoma culture supernatant was used as the primary antibody.
  • FIG. 7 Electrophoretic profile of anti-digoxin IgG purified by protein A affinity chromatography, where Coomassie stained 12% SDS-PAGE Gel.
  • M Molecular mass marker LMW (Amersham)
  • 1 purified non-reduced IgG
  • 2 purified ⁇ -ME reduced IgG;
  • FIG. 8 Profile of binding of purified anti-digoxin IgG to Dig-BSA immobilized at different concentrations for standardization of ELISA assays, where Dig-BSA conjugate was immobilized at six concentrations: 0.5; 1; 2; 4; 8 and 10 pg / ml.
  • Hybridoma purified anti-digoxin IgG was used as the primary antibody at the initial concentration of 500 ng / mL.
  • As a secondary antibody peroxidase-conjugated mouse anti-IgG was used;
  • Figure 9 Products of anti-digoxin hybridoma cDNA amplifications using murine immunoglobulin oligonucleotides, where the amplifications were done by PCR and analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • A Products of HC gene amplifications using the 3 'MoIgG1 oligonucleotide and the seven 5' oligonucleotides.
  • M 100 bp molecular mass marker (Invitrogen), 1: oligonucleotide 5'1A + 1B, 2: 2A, 3: 2B, 4: 2C, 5: 3A, 6: 3B + 3G and 7: 3D.
  • FIG 10 Restriction analysis of the LC library constructed from cloning the repertoire of LC genes in the pComb3X vector to verify the presence of the LC insert; ten randomly selected LC clones (numbered 1 to 10) and the pComb3XTT vector used as control (C) were digested with restriction enzymes Saci and Xbal and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.
  • M 1 kb molecular mass marker (Invitrogen).
  • FIG 11 Constraint analysis of the Fab fragment combinatorial library constructed in the pComb3X vector to verify the presence of the LC and HC inserts; ten clones (numbered 1 to 10) from the combinatorial library were randomly selected, digested with restriction enzymes Spel and Xhol to verify the presence of insert HC (A) and with Saci and Xbal to verify the presence of insert LC (B ). The digested samples were submitted to 1% agarose gel electrophoresis, M: 1 kb molecular mass marker (Invitrogen);
  • Figure 12 ⁇ - Constraint analysis of the combinatorial library diversity constructed in the pComb3X vector by digestion with the restriction enzyme BstNI; the ten clones randomly selected and analyzed in Figure 11 and the pComb3XTT vector, used as control (C), underwent 3% agarose gel electrophoresis after digestion with the restriction enzyme BstNI.
  • M 100 bp molecular mass marker (Promega);
  • Figure 13 Restriction analysis of the anti-digoxin Fab fragment library after 3 rounds of phage display followed by panning to verify presence of LC and HG genes; ten clones (numbered 1 to 10) randomly selected from the library and the pComb3XTT vector used as a control (C) were digested with Spel and Xhol restriction enzymes to verify the presence of the HC insert (A) and with Saci and Xbal. to verify the presence of the LC (B) gene and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.
  • M 1 kb molecular mass marker (Invitrogen);
  • Figure 14 Restriction analysis of the anti-digoxin Fab fragment library diversity after 3 rounds of phage display followed by panning by restriction enzyme digestion BstNI / the ten clones (numbered from 1 to 10) refer to the clones analyzed Figure 13 underwent 3% agarose gel electrophoresis. M: 100 bp molecular mass marker (Promega); '
  • Figure 15 Symbolic representation of the deduced LC amino acid sequences of clones 1, 2, 9 and 10, selected after phage display; amino acid residues were replaced by symbols in the FR1 and CDR2 regions to highlight the different sequences. The other regions have identical sequences to each other.
  • Figure 16 Electrophoretic profile of clones 1, 2,
  • FIG. 18 Immunodetection of Dig-BSA and BSA antigen by anti-digoxin Fab fragments expressed in E. coli by the 4 clones selected after phage display; (A) 7.5% SDS-PAGE analysis of Dig-BSA and BSA (control) in reduced form. After electrophoresis the gel was stained with silver.
  • M HW marker (GE Healthcare); 1: Dig-BSA 0.025 mg / mL; 2: Dig-BSA 0.0125 mg / mL; 3: Dig-BSA 0.0063 mg / mL; 4: 0.01 mg / ml BSA.
  • FIG 19 Profile of binding of the anti-digoxin Fab fragments expressed in E. coli by the 4 clones to Dig-BSA and BSA by ELISA assay; the microplate was sensitized with 4 ⁇ g / ml Dig-BSA or BSA.
  • Fab fragments present in the crude extract from E. coli cultures were serially diluted 1: 2, starting with antibody concentration at 50 ng / mL.
  • the secondary antibody used was peroxidase-conjugated F (ab ') 2 fragment specific mouse anti-IgG; and
  • Dig-BSA was immobilized on a CM5 sensor chip at 9259.8 RU.
  • Crude extracts from clones containing Fab fragments expressed in E. coli were injected at a concentration of 2.0 g / mL. Relative response was measured 5 seconds after analyte completion at the point indicated by the red arrow (clone 1 - 495.9 UK; clone 2 - 476.3 UK; clone 9: 206.9 UK; clone 10 - 1.023 , 5 UK.
  • the present invention relates to "METHOD OF PRODUCTION AND OBTAINING FAB FRAGMENT OF THE MONOCLONAL ANTI-DIGOXIN ANTIBODY FROM THE CLONING TECHNIQUE IN BIOLOGY MOLECULAR ", more particularly the method for producing and obtaining clones of the anti-digoxin antibody Fab fragment using phage display technology and characterizing its antigen binding, which comprises the following steps:
  • Step 1) Obtaining and characterization of digoxin-conjugated bovine albumin (Dig-BSA)
  • Step 2) Obtaining the anti-digoxin monoclonal antibody; Stage 2.1 - Purification of the anti-digoxin monoclonal antibody;
  • Step 3 Construction of Fab library on pComb3X phagemid from anti-digoxin hybridomas
  • Step 3.1 Obtaining cDNA from anti-digoxin hybridomas; Phase 3.2 - Amplification of LC genes and Fd portion of HC;
  • Step 4) Phage display and Fab library enrichment
  • Step 5 Expression of soluble Fab fragments; Phase 5.1 - Quantification of soluble Fab fragments by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sandwich;
  • Step 6 Characterization of crude extracts containing Fab fragments of clones obtained by phage display
  • Step 6.1 Antigen-soluble Fab fragment binding assay by ELISA test
  • Step 6.2 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE);
  • Step 1) Obtaining and characterization of digoxin-conjugated bovine albumin (Dig-BSA)
  • the protocol was based on the technique described by Erlanger and Beiser (1964). Forty-four milligrams of digoxin was resuspended in 2 mL of 95% ethanol, 2 mL of 0.1 NaCl was added and the solution was kept at room temperature for 30 minutes. After 30 minutes of interaction, 60 ⁇ l of 1 M glycerol was added to inactivate excess periodate, and the solution was stirred for a further 5 minutes. Fifty-six milligrams of BSA (Sigma) was dissolved in 2 mL of PBS and the pH was adjusted to 9.5 with 5% Na 2 CO 3 solution. The periodate oxidized digoxin solution was added to the BSA solution slowly and slowly.
  • the absorbance at the wavelength of 388 nm of a duplicate digoxin solution of known concentration was used as a reference.
  • the reference and Dig-BSA sample were completed with water to 2 mL, then 10 mL of H2 SO4 were added and the tubes were allowed to stand at room temperature for 4 hours.
  • the absorbance was read and the number of moles of digoxin present in the Dig-BSA conjugate was calculated.
  • Estimation of the number of digoxin molecules present in the conjugate was obtained through the relationship between the number of digoxin mols of Dig-BSA and the number of moles of BSA added to obtain the conjugate.
  • Step 2) Obtaining the anti-digoxin monoclonal antibody
  • Anti-digoxin hybridoma cells were cultured in two 500 mL Spinner Flask flasks (Waric Glass, Inc., USA), one containing 400 mL medium and one containing 300 mL culture medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium and Ham's F -12 Nutrient Mixture (DME / F12) (Sigma-Aldrich, Inc., USA) supplemented with 3% fetal bovine serum (Cultilab, Brazil) and 4 mM L-glutamine (Merck KGaA, Germany) in a greenhouse (Forma Scientific Inc ., USA) at 37 ° C and 5% CO2. Viable cells were counted with Trypan blue exclusion dye and Neubauer chamber. Cells were precipitated in Centrifuge 5804 R (Eppendorf AG, Germany) at 5,000 x g for 10 minutes at 4 ° C.
  • DME / F12 Dulbecco's Modified Eagle's Medium and Ham's F -12
  • the culture supernatants were purified by affinity chromatography on 245 ml protein A-Sepharose 4FF resin (GE Healthcare) packed in a 5 cm diameter x 30 cm high XK 50/30 column (GE Healthcare).
  • the column was connected to a P50 peristaltic pump (GE Healthcare) which promotes pumping of the sample through the column, the column output was connected to a 280 nm UV1 UV monitor (GE Healthcare), which in turn was connected to a REC 101 (GE Healthcare).
  • Column equilibration was performed by buffer 1.5 M glycine / 3 M sodium chloride pH 8.3, then the column was loaded with the culture supernatant diluted 1: 1 in the equilibration buffer.
  • the equilibration buffer was passed to remove possible nonspecific binding and rebalance the column.
  • 50 mM sodium citrate / 150 mM sodium chloride pH3 buffer was used.
  • the eluate was dialyzed twice against PBS overnight.
  • the column was regenerated with 50 mM glycine buffer / 150 mM sodium chloride pH 2, followed by 50 mM Tris buffer / 1 M sodium chloride pH 8.6.
  • the column was rinsed with 50 mM Tris / 150 mM sodium chloride pH 8.6 buffer.
  • the flow rate of 1 mL / min was used, the other steps were performed with a flow rate of 10 mL / min.
  • Anti-digoxin hybridoma cells were cultured in a 250 mL Spinner Flask flask (Bellic Glass, Inc) under the same conditions as described in Step 2. The culture was precipitated at 5,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. Total RNA from hybridoma cells was extracted using Trizol ® Reagent (Invitrogen Corporation, USA) based on the method of isolating RNA by phenol, guanidine isothiocyanate and chloroform (CHOMCZYNSKI and SACCHI, 1987) according to the manufacturer's manual.
  • CDNA synthesis was performed by reverse transcription of total RNA using the SuperScript TM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR kit (Invitrogem Corporation) using Oligo (dT) 20 and following the manufacturer's manual. Reactions were performed on the GeneAmp ® PCR System 9100 thermal cycler (Applied Biosystems, USA).
  • the anti-digoxin hybridoma cDNA was used as a template to amplify the LC and HC Fd (VH and CHI) portion genes using LC kappa ( ⁇ ) -specific primer oligonucleotides and HC IgGl ( ⁇ ) subclass of murine immunoglobulins, based on the Kabat database (KABAT et al., 1991).
  • Oligonucleotides containing restriction sites specific for cloning into the pComb3 vector (BARBAS et al., 1991), were synthesized by Invitrogen Brasil Ltda. Six 5 'LC oligonucleotides ( ⁇ ; K2; K3; K4; K5 and ⁇ ) were used, containing restriction site for Saci enzyme and seven for the Fd portion (1A + 1B; 2A; 2B; 2C; 3B + 3C and 3D), with site for Xhol (ITOH et al., 1999) and the oligonucleotides 3 'Mok3' and MoIgGl, containing restriction sites for Xbal and Spel, respectively (BARBAS et al., 2001). The oligonucleotide sequences used are shown in Table 1.
  • Bold, underlined, double underlined and dashed are respectively the restriction enzyme sites Xhol, Saci, Spel and Xbal.
  • the LC and HC genes were amplified by PCR reaction using the recombinant Taq DNA Polymerase - BR (Invitrogen Brasil Ltda.) In the GeneAmp ® PCR System 9100 apparatus (Applied Biosystems, USA) starting at 94 ° C for 2 minutes. followed by 40 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 57 ° C for 1 minute and stretching at 72 ° C for 1 minute. A final stretch of 5 minutes at 72 ° C was performed after the cycles (TSURUTA et al., 2003). PCR amplified DNA fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis using LCH 7x8 Horizontal Electrophoresis System (Loccus Biotechnology, Brazil).
  • the 1.5% agarose gel was prepared in TAE buffer (40 mM Tris-EDTA; 5 mM sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0) and stained with SYBR ® Safe DNA gel stain (Invitrogen Corporation). Samples were prepared with 6x Blue / Orange Loading Dye (Promega Corporation, USA) and a 100bp DNA Ladder molecular mass marker (Promega Corporation) was used. The run was performed for 40 minutes at 90 V.
  • the bacterial strain of Escherichia coli used for cloning and expression of the recombinant antibody was XLl-Blue: endAl recAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 reiAl lac [F 'proAB lacIqZlSM15 ⁇ (Tetr)].
  • the suspension was centrifuged at 900 xg for 10 minutes at 4 ° C, cells were resuspended in 25 mL of sterile, cold 0.1 M CaCl2 and incubated on ice for 20 minutes. A further centrifugation at 900 xg for 10 minutes at 4 ° C was done, scbrenadant discarded and cells Resuspended in 2.4 mL 0.1 M CaCl2 followed by the addition of 0.6 mL glycerol. The suspension was divided into 110 ⁇ l aliquots into ice-cold ethanol bath frozen tubes and stored at -80 ° C. The titer of the competent cells was determined by heat shock transformation with a control DNA.
  • the pComb3XTT phagemid vector (BARBAS et al., 2001) ( Figure 4) was provided by Dr. Carlos Barbas of the Scripps Institute (The Scripps Research Institute, USA), together with the license for its use. It belongs to the pComb3X vector family (Genbank AF268281) and can be used to clone Fab, scFv, peptide and protein fragments for the phage display system.
  • This vector contains the LC and HC genes from the human tetanus toxin Fab fragment —TT
  • outer membrane protein for LC and pectate lyase B (pelB) for HC, which direct polypeptide chains to the periplasma.
  • the tail of 6 histidines (His6) and 10 hemagglutinins (HA) enable purification and detection of recombinant protein.
  • His6 histidines
  • HA hemagglutinins
  • TAG amber-terminated codon
  • the pIII protein gene can also be removed by digestion with restriction enzymes Spel and Nhel.
  • Sub-Phase 3.3.3 - Thermal Shock Transformation Amplification of the vector was done by heat shock transformation of the E. coli XL1-Blue Competent Celis bacterium (Stratagene Corporation) with the pComb3XTT vector. Fifty microliters of XL1-Blue bacteria were incubated with 0.5 ⁇ ⁇ of the pComb3XTT vector for 10 minutes on ice, 45 seconds at 42 ° C in the Thermomixer compact (Eppendorf AG) and 5 minutes on ice.
  • SOC medium 2% tryptone; 0.5% yeast extract; 0.05% NaCl; 20mM KCl; 1mM MgCl2; 20mM glucose
  • SOC medium 2% tryptone; 0.5% yeast extract; 0.05% NaCl; 20mM KCl; 1mM MgCl2; 20mM glucose
  • Plasmids were purified with Maxiprep HiSpeed ® Plasmid Maxi kit (Qiagen Sciences, Inc., USA) and Miniprep Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation) as per manufacturer's protocol.
  • Precipitation with ethanol was done by adding absolute ethanol (2.2 x sample volume) and ammonium acetate (10% of sample volume) and incubating for 1 hour at -80 ° C. After incubation, the samples were centrifuged at 20,800 xg for 15 minutes at 4 ° C and the pellets were washed twice with ice cold 70% ethanol and centrifuged at 20,800 xg for 5 minutes at 4 ° C after each wash. Samples were resuspended in autoclaved Milli-Q water. Sub-Fase 3.3.6 - DNA analysis by restriction enzyme digestion
  • DNAs were digested for 2 hours at 37 ° C with Saci and Xbal restriction enzymes (New England Biolabs Inc., USA) to check for the presence of the light chain and with Xhol and Spel enzymes (New England. Biolabs Inc. ) to verify the heavy chain insert. Then the DNAs were analyzed by agarose gel electrophoresis. Molecular mass markers used were 1 kb DNA Ladder (Promega Corporation) or Ikb DNA Ladder (Invitrogen).
  • the culture was incubated on ice for 20 minutes and centrifuged at 900 xg for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded and the cells were resuspended in 100 mL of sterile ice cold 10% glycerol. The suspension was centrifuged at 1,500 xg for 20 minutes at 4 ° C, resuspended in 50 mL of 10% glycerol and centrifuged at 2,500 xg for 30 minutes at 4 ° C. The sediment was again Resuspended in 50 mL of 10% glycerol and centrifuged at 3,000 xg for 30 minutes at 4 ° C.
  • the cells were then resuspended in 2 mL of 10% glycerol and divided into 150 ⁇ L aliquots in ice-dry bath / ethanol tubes and stored at -80 ° C.
  • the titer was determined by electroporation with a control DNA.
  • the LC gene repertoire was cloned into the pComb3X vector for the construction of the LC library. Fifteen micrograms of the LC genes and the pComb3XTT vector were digested with the restriction enzymes Saci (10 U / ⁇ g) and Xbal (13 U / ⁇ g) at 37 ° C overnight. The next day, the samples were ethanol precipitated and resuspended in 20 L of autoclaved Milli-Q water. The DNAs were applied to UltraPure ® LMP Agarose - Low Melting Point agarose gel (Invitrogen Corporation) and electrophoresed at 50 V for about 3 hours. As standard the Ikb DNA Ladder marker (Promega Corporation) was used.
  • E. coli XL1-Blue Seventy microliters of electrocompetent E. coli XL1-Blue were incubated with 2 ⁇ l of the above binding reaction in 0.4 cm Electroporation cuvettes (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) for 10 minutes on ice. After incubation, the samples received a 2500 V pulse for 5.0 ms in the Multiporator ® device (Eppendorf AG). Immediately 3 mL of SOC medium was added and incubated with shaking for 1 hour at 37 ° C. 200 ⁇ l of the culture was plated on ampicillin-containing LB-agar plate (100 ⁇ g / mL) and the plates were incubated overnight at 37 ° C.
  • Colony Forming Unit CFU
  • Colonies were also randomly chosen, inoculated into 5 mL of SB medium containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) and incubated overnight at 37 ° C with shaking. The next day .
  • the inocula were centrifuged and the plasmids were purified with the Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification System kit (Promega Corporation). Digestions with restriction enzymes Saci and Xbal were made to verify the presence of the light chain.
  • the LC gene library was amplified by electroporation transformation by incubating 2 ⁇ of the 70 L E. coli LC library. XLl-Blue Electrocompetent. After electroporation and incubation for 1 hour at 37 ° C, 20 mL of SB medium containing ampicillin (100 ⁇ g / mL) was added and incubated at 37 ° C for one hour. night. Plasmids were purified with the Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification System kit (Promega Corporation) and quantified by absorbance at 260 nm on the Ultrospec 6300 Pro spectrophotometer (Biochrom Ltd.).
  • coli XLl-Blue with 2 ⁇ l of the ligation reaction was electroporated in a Multiporator ® (Eppendorf AG), 2500 V, 5.0 ms, 0.4 cm cuvettes (Bio-Rad Laboratories , Inc.). After electroporation, 3 mL of SOC medium was added and incubated with shaking for 1 hour at 37 ° C. 200 ⁇ L of the culture was plated on LB-agar plate containing ampicillin (100 g / mL) and incubated overnight at 37 ° C.
  • the combinatorial library analysis was done similarly to the library LC, adding digestions with Xhol and Spel restriction enzymes to detect the presence of the Fd moiety and combinatorial library diversity analysis by restriction enzyme digestion BstNI, which recognizes the CC / WGG site (New England Biolabs Inc.). Clones presenting the LC and HC inserts were quantified by spectrophotometry and sequenced.
  • DNA sequencing of the clones presenting the two inserts was performed using the ompseq primer oligonucleotide (5'-AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G-3 ') for the light chain and the pelseq oligonucleotide (5'-ACC TAT TGC CTA CGG CAG CCG-3 ') for the heavy chain (BARBAS et al., 2001).
  • Samples were prepared with BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
  • the DNA Sequencing Service (SSDNA) of the Department of Biochemistry - IQUSP which performs sequencing by the Sanger method through the ABI PRISM ® 3100 GeneticAnalyzer / HITACHI capillary sequencer, was used. Nucleotide sequences were analyzed using the Chromas lite program (Technelysium Pty Ltd.) and amino acids were deduced using the Expert Institute Protein Analysis System (ExPASy) translation program from the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB).
  • the combinatorial library of anti-digoxin Fab fragments was enriched by phage display and panning with the immobilized antigen.
  • a scheme showing the main steps of library enrichment is depicted in Figure 5.
  • E. coli XL1-Blue Competent Celis bacterium (Stratagene) was plated on an LB-agar plate containing tetracycline (10 g / mL) and incubated overnight at 37 ° C.
  • An XL1-Blue colony was inoculated into 10 mL SB containing 10 ⁇ g / mL tetracycline and incubated with shaking at 37 ° C until OD 600 nm reached 1.0.
  • 1 plate of VCSM13 Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene Corporation) was then added and incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • 2 ml of the infected culture was transferred to a 1 L Erlenmeyer containing 100 ml SB with 10 g / ml tetracilcine and 70 ⁇ g / ml kanamycin and incubated with shaking at 37 ° C overnight (20 hours).
  • the culture was centrifuged at 1,600 x g for 25 minutes at 4 ° C and the supernatant incubated in a water bath for 25 minutes at 70 ° C followed by a further centrifugation at 1,600 x g for 25 minutes at 4 ° C.
  • Supernatants were stored at 4 ° C (stable for months).
  • Agar tryptone 1%; yeast extract 0.5%; NaCl 0.5%; Agar 0.65% preheated (42 ° C) and poured onto preheated LB-agar plate (37 ° C The plates were incubated overnight at 37 ° C. Each lysis plate formed represents a viral particle of the suspension.
  • the phage titer was calculated in Plaque Forming Units (PFU) / ml: no lysis plates / v. ( ⁇ ) phage x dilution factor x 10 3 ⁇ L.
  • Two microliters of the combinatorial library obtained above were transformed by electroporation into 70 ⁇ L of electrocompetent E. coli XLl-Blue. After incubation for 1 hour at 37 ° C, 50 ⁇ L of the culture was plated on ampicillin-containing LB-agar plate (100 ⁇ g / ml) and incubated overnight at 37 ° C to confirm the size of the combinatorial library. 7 ml SB containing 100 g / ml ampicillin, 10 ⁇ g / ml tetracycline and 40 nM glucose were added to the culture.
  • the culture was centrifuged at 4,500 xg for 10 minutes at 4 ° C and the supernatant was transferred to a new tube.
  • To the supernatant were added 2 mL of 20,000 polyethylene glycol (PEG) 20% / 2.5 M NaCl.
  • the mixture was incubated for 30 minutes on ice and centrifuged at 4,500 xg for 30 minutes at 4 ° C, the pellet was resuspended at 400 ° C. ⁇ l 2% BSA / TBS and centrifuged at 20,800 xg for 5 minutes at 4 ° C. 5 ⁇ l of the supernatant was separated to determine the titer (10 8 , 10 9 dilution) and the remainder was aliquoted and stored at 4 ° C (phage library).
  • a 96-well plate (Nunc, USA) was sensitized with 50 ⁇ l of the previously prepared Dig-BSA conjugate (see Phase 1.1) at 4 ⁇ g / ml. The plate was incubated at 4 ° C overnight followed by 3 washes with PBS. Blocking was performed with 150 ⁇ L 1% BSA / PBS and the plate was incubated for 1 hour at 37 ° C. To each well was added 50 ⁇ l of the phage suspension, which was incubated for 2 hours at 37 ° C and after incubation the wells were washed 5x with 2% BSA / TBS.
  • Elution was by incubation for 10 minutes at room temperature with 50 ⁇ l elution buffer (0.1 M HCl - glycine, pH 2.2). Neutralization was performed with 3 ⁇ L of 2 M Tris-base, and the contents of the wells were transferred to 1.5 mL tubes. An aliquot 5 was separated to determine titer (dilution IO '2, IO "4.) A new cycle of panning was initiated by infecting 0.5 ml culture of E. coli XLI-Blue 100 ⁇ . of phage eluted.
  • Binding (%) phage titer after panning x 100
  • the library enrichment factor was obtained by the ratio of the percentage of binding of the last panning cycle to the previous one.
  • the vector without gene III was religated using 2 U Taq DNA ligase (Invitrogen Corporation) overnight at 16 ° C ( ⁇ 20 hours).
  • electroporation transformations were performed on XLl-Blue.
  • the plasmids were purified by Minprep Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation), ethanol precipitated and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis after restriction enzyme digestion and also by double digestion with restriction enzymes. Saci and Xbal.
  • each vector was transformed by thermal shock in 50 ⁇ ; of XL1-Blue for the expression of soluble Fab fragments.
  • 20 ⁇ l and 100 ⁇ l were plated in Petri dishes containing ampicillin LB-agar (100 g / ml) and the plates were incubated overnight at 37 ° C. The following day, colonies were removed, inoculated into 10 mL of SB medium with ampicillin (100 ⁇ g / mL) and incubated for 2 hours at 37 ° C. 2 ml of this culture was inoculated into a vial containing 100 mL of SB medium with ampicillin (100 ⁇ / ⁇ and 20 mM MgCl2.
  • Quantifications were done on 96-well MaxiSorp microplates (Nunc-Immuno TM Plates). To each well were added 100 L of sensitizing solution (pH 9.6 coating buffer: 0.16 g of 15 mM sodium carbonate (Na2 CO3); 0.30 g of 35 mM sodium bicarbonate (NaHCO3); water qsp 100 AffiniPure F (ab ') 2 Fragment Rabbit-Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 Specific Antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., USA), diluted 1/400 (1.5 pg / mL) ) ; that were incubated in a chamber wet overnight at 4 ° C.
  • sensitizing solution pH 9.6 coating buffer: 0.16 g of 15 mM sodium carbonate (Na2 CO3); 0.30 g of 35 mM sodium bicarbonate (NaHCO3); water qsp 100 AffiniPure F (ab
  • Step 6) Characterization of crude extracts containing Fab fragments of clones obtained by phage display Step 6.1 - Antigen-soluble Fab fragment binding assay by ELISA.
  • the conjugated antibody used was Peroxidase-conjugated AffiniPure F (ab ') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluted 1/8000.
  • a similar assay was done with the hybridoma produced anti-digoxin monoclonal antibody.
  • Step 6.2 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
  • the electrophoresis was made with polyacrylamide gels in concentrations ranging from 7.5% to 12%, with 0.75 mm or 1.0 mm thickness depending on the experiment.
  • Samples were diluted in PBS when necessary and prepared with sample buffer with or without reducing agent ( ⁇ -Mercaptoethanol).
  • the molecular mass markers used were the Low Molecular Weight Calibration Kit. for SDS Electrophoresis (Amersham Biosciences UK Limited) and HMW-SDS Marker kit (GE Healthcare). Samples were reduced by incubation for 5 minutes at 100 ° C.
  • the system used was the Mini-PROTEAN ® Tetra Celi (Bio-Rad). The gels were stained by silver nitrate or Coomassie R250 Blue Dye.
  • the membrane was blocked with 10% skimmed milk / PBS, washed 3x with 0.1% Tween / PBS and incubated with Peroxidase-conjugated conjugated antibody AffiniPure F (ab ') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F (ab' ) 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluted 1 / 20,000, for 1 hour at 37 ° C. Developing was done with the Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents kit (GE Healthcare).
  • Antigen binding of Fab fragments present in cell extracts was performed using BIAcore ' 5 ' T100 (GE Healthcare) by surface plasmon resonance (SPR). Dig-BSA conjugate, used as a binder, was diluted in pH 4.0 acetate buffer to a concentration of 50 pg / ml.
  • the immobilization was performed on a CM5-type carboxymethyl dextran coated sensor chip (GE Healthcare) by the amine coupling method (covalent binding to the dextran contained on the chip), targeting 10,000 RU, using the covalent immobilization kit reagents [ 1-ethyl -3 - (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), ethanolamine-HCl pH 8.5] (GE Healthcare) and HBS-EP buffer (10 mM HEPES, NaCl 150 mM, 3 mM EDTA, 0.05% Tween 20 pH 7.4) as running buffer.
  • EDC 1-ethyl -3 - (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • HBS-EP buffer 10 mM HEPES, NaCl 150 mM, 3 mM EDTA, 0.05% Tween
  • Fab fragments of crude extracts were quantified by ELISA (item 3.5.1), diluted in 2 g / mL HBS-EP buffer and used as analyte in the binding assay with the immobilized Dig-BSA conjugate on the chip.
  • the assay was performed with a flow rate of 15 pL / min, 40 s of surface contact time and 40 s of dissociation. Regeneration was done with 50 mM NaOH for 60 s in a 30 L / min flow.
  • Digoxin has been conjugated to bovine serum albumin (BSA) for use in panning enrichment of the anti-digoxin Fab fragment library and in binding assays to the monoclonal antibody produced by the anti-digoxin hybridoma and Fab fragments produced by clones.
  • BSA bovine serum albumin
  • the number of digoxin residues for each BSA molecule was estimated at 5.8 and was calculated as described in step 1.2.
  • the protein concentration obtained by the Bradford method was 10 mg / mL.
  • the anti-digoxin monoclonal antibody present in the hybridoma culture supernatant was purified to be used as a reference in part of the conjugate binding assays.
  • Anti-digoxin hybridoma cells were cultured in two flasks containing 400 mL and 300 mL medium at concentrations of 0.74x10 6 cells / mL with 98% viability and 0.94x10 6 cells / mL with 97% viability, respectively. . After purification by protein A affinity chromatography, the eluate was concentrated and analyzed by 12% polyacrylamide gel electrophoresis in the reduced ⁇ - ⁇ and non-reduced form (Figure 7). We can see a single band in the unreduced sample (channel 1), representing the entire antibody. In the reduced sample it is possible to visualize the two characteristic bands representing the IgG light and heavy chains. A weak band corresponding to unreduced IgG can also be seen.
  • Purified anti-digoxin monoclonal antibody was also used to standardize the concentration of immobilized Dig-BSA in ELISA assays. Antigen concentrations of 0.5 to 10 ⁇ g / mL were immobilized and purified IgG was used as the primary antibody, with an initial concentration of 5500 ng / mL. The secondary antibody used was mouse anti-IgG conjugated to peroxidase, diluted 1 / 10,000.
  • Figure 8 shows the anti-digoxin binding profile for 6 Dig-BSA concentrations. The 4 g / mL concentration was chosen for immobilization of Dig-BSA and BSA in all ELISA assays.
  • FIG. 9A Amplification of the HC genes is depicted in Figure 9A, where it can be seen that cDNA was not amplified using oligonucleotide 1A + 1B (channel 1); oligonucleotides 2A, 2B, 2C had a band of approximately 650 bp (channels 2, 3 and 4), oligonucleotides 3A, 3B + 3C had a band of approximately 750 bp (channels 5 and 6) and 3D oligonucleotide did not amplify (channel 7).
  • the LC gene repertoire was the first to be cloned into the pComb3X vector for the construction of the LC library.
  • the LC library was constructed by double digesting the LC gene repertoire and the pComb3X vector with Saci and Xbal restriction enzymes followed by 1% agarose gel electrophoresis for extraction and purification of the bands and ligation thereof.
  • the library obtained was transformed into E.coli XL1-Blue. Its size has been estimated at 3x10 5 clones. Ten randomized clones were chosen for DNA extraction and the presence of the LC insert was verified by 1% agarose gel electrophoresis after digestion with restriction enzymes Saci and Xbal.
  • the LC library and HC gene repertoire were double-digested with Spel and Xhol restriction enzymes and electrophoresed. The bands were extracted, purified and ligated to obtain the combinatorial library.
  • the library obtained was estimated to be 5 x 10 6 clones. Ten randomized clones were chosen to verify the presence of HC and LC inserts by digestion with specific restriction enzymes. After agarose gel electrophoresis, 6 of the 10 clones analyzed showed bands of approximately 700 bp, related to HC ( Figure 11A) and LC ( Figure 11B) inserts.
  • the 10 selected clones were also digested with the restriction enzyme BstNI to analyze the diversity of the combinatorial library obtained. Looking at the 6 clones that presented both inserts, it was not possible to notice apparent differences in the restriction pattern between clones.2, 3, 6, 8 and 10 ( Figure 12). Clone 4 presented a different profile from the others.
  • the combinatorial library of anti-digoxin Fab fragments obtained by sequential cloning of the LC and HC gene repertoires was enriched after a few rounds of phage display and panning, which selected the phages by exposing anti-digoxin Fab fragments by binding to the Dig2-antigen. BSA.
  • the library phagomids were transformed into E. coli XL1-Blue cells, which were infected by the helper phage VCSM13.
  • Antibody-exposed phages were recovered from the culture and selected in panning rounds with plaque-immobilized Dig-BSA.
  • Clones containing the HC and LC inserts were analyzed by sequencing of the HC and LC genes. The deduced amino acid sequences were aligned using the program ClustalW2. Amino acid numbering and CDR deduction were based on the scheme by Kabat et al. (1991). All clones had identical amino acid sequences in HC. Analysis of LC sequencing revealed that clone 3 was a pseudogene and by comparing its nucleotide sequence with sequences deposited with GenBank using the BLASTn program, we found 100% identity with the Mus musculus immunoglobulin aberrantly rearranged kappa chain mRNA gene, partial sequence ( GenBank: U56414.1). Clones 5 and 10 had identical LC amino acid sequences.
  • Clone 9 has a glutamine residue (Q) at position 54 of the CDR2 region of LC while the other clones have an arginine (R).
  • Clones 1, 2, 9 and 10 showed variations in the amino acid sequence of the framework1 region ( Figure 15).
  • LC and HC amino acid sequences of clones 1, 2, 9 and 10 were analyzed for homology by the BLASTp program, compared to sequences deposited with GenBank.
  • the sequences with the highest clone identity are shown in Table 3 (LC) and Table .4 (HC), in percent identity (number of identical amino acids / number of total amino acids in the sequences). Comparing LC CDRs, we observed over 77.8% identity across all CDRs, with CDR2 from clones 1, 2 and 10 having 100% identity with the three sequences found.
  • GenBank AAG12167.1 (unpublished); (2) GenBank: CAA72328.1 (BONG et al., 1998); (3) GenBank: AAN86781.1 (LAI et al., 2002).
  • Clones 1, 2, 9 and 10 which had distinct amino acid sequences in the FR1 region of LC, were chosen to express soluble Fab using the E. coli XL1-Blue strain. For this, it was necessary to remove gene III from the pComb3X vector from each clone by digestion with restriction enzymes Spel and Nhel, allowing Fab fragments to be expressed in soluble form without pIII.
  • the vector bands ( ⁇ 4 kb) were separated from the gene III band (612 bp) by 1% agarose gel electrophoresis ( Figure 16).
  • Plasmid DNA from each clone was purified, transformed into E. coli XL1-Blue, and soluble Fab expression was induced by the addition of IPTG. After induction, bacteria were lysed by sonication and crude extracts containing Fab fragments of different clones were used in ELISA, Western blotting and SPR assays.
  • Fab fragments were initially expressed in 100 ml medium to verify the binding of antibodies to digoxin by ELISA and the amount of antibody expressed by each clone (data not shown). Expression of Fab fragments was then performed on 1 L of medium to obtain antibody amount for antigen binding assays. The results presented in this work refer to the Fab fragments of. second expression.
  • a Western blotting assay was performed to verify the expression of Fab fragments in the crude extracts of the four clones. Unreduced samples of the clone crude extract were diluted 1/2, applied to 12% polyacrylamide gel and electrophoresed.
  • the concentration of Fab fragments expressed by clones was determined by sandwich ELISA by immobilizing F (ab ') 2 fragment specific mouse anti-IgG antibody on microplates. the car.iundongo Fab fragment was used for the construction of the standard curve. Fab fragment concentrations after the second induction were calculated from the standard curve resulting in: clone 1 - 6.67 g / mL, clone 2 - 10.08 pg / mL, clone 9 - 0.61 pg / ml and clone 10 - 1.73 pg / ml. Clone 9 showed the lowest yield among clones.
  • the RUs measured 5 seconds after the application of the fragments on the immobilized chip with Dig-BSA, were: clone 1 - 495.9 RU; clone 2 - 476.3 UK; clone 9 - 206.9 RU; clone 10 - 1,023.5 UK ( Figure 20).
  • Clone 9 which has in its deduced amino acid sequence, a different amino acid residue in the CDR2 region of LC compared to the other clones, showed the lowest response among the analyzed clones.
  • the four clones differ in amino acid sequences in the FR1 region of LC.
  • Phage display technology has shown many advantages, such as selection of monoclonal antibodies from human variable gene libraries (MARKS et al., 1991) and identification of in vivo therapeutic markers (ARAP, 2005).
  • Fab fragments can be expressed in Escherichia coli in large quantities and recombinant DNA technology provides the opportunity for the introduction of mutations that can optimize the Fab, increasing the expressed amount, stability, solubility and facilitating humanization and affinity maturation (KWONG). , RADER, 2009).
  • the amount of Fab obtained per liter of culture in E. coli depends mainly on the amino acid sequence of Fab (KWONG, RADER, 2009) and therefore may vary between clones.
  • BIAcore is a system that features high sensitivity for real-time biomolecular interaction analysis. SPR measures the change in angle of the refractive index according to the mass of the molecule present. Detection occurs on the surface of a chip, where a binder is immobilized. The analyte passes through channels of the chip, interacting with the ligand and generating a response, measured in resonance units (RU) (SCHASFOORT, ALL, 2008). Relative response cannot be measured during analyte application as there may be a change in refractive index caused by the crude extract on the surface (bulk effect) rather than a specific interaction between binder and analyte.
  • RU resonance units
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Abstract

"MÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE VARIÁVEIS DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI -DIGOXINA A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR", mais precisamente, a presente patente de invenção trata de método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia de 'phage display' e a caracterização da sua ligação ao antígeno; a presente inovação se dedica ao desenvolvimento de produto para uso terapêutico com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.

Description

"MÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE VARIÁVEIS DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-DIGOXINA A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR" .
CAMPO DE APLICAÇÃO
A presente patente de invenção trata de método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia de ^phage display' e a caracterização da sua ligação ao antígeno; a presente inovação se dedica ao desenvolvimento de produto para uso terapêutico com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
De uma forma geral, a digoxina é um fármaco utilizado no tratamento de distúrbios cardíacos. É um digitálico, ou seja, um glicosídeo cardiotônico, e é proveniente da planta Digitalis lanata . Tem efeito inotrópico positivo, ou seja, aumenta a força de contração cardíaca. Seu modo de ação se dá por meio da ligação reversível à Na+/K+ATPase . Ao inibi-la, a digoxina aumenta a quantidade, de sódio no cardiomócito . Isto vai estimular a bomba de sódio-cálcio (troca 3 Na+ por 1 Ca 2+) a expulsar sódio em troca de cálcio. O aumento consequente de cálcio no interior da célula provoca um aumento de excitabilidade do cardiomiócito , produzindo um aumento da contractilidade cardíaca .
A digoxina possui uma janela terapêutica estreita, com nível terapêutico muito próximo ao nível tóxico. Para combater seu efeito tóxico, podem ser
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) utilizados fragmentos Fab de anticorpo policlonal anti- digoxina que estão disponíveis comercialmente.
De uma forma mais específica, a digoxina é o glicosídeo cardíaco mais usado no tratamento de falência cardíaca congestiva e fibrilação atrial (Figura 1) . Os digitálieos, grupo ao qual a digoxina pertence, são os compostos mais antigos na medicina cardiovascular que continuam em uso em práticas clínicas contemporâneas (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002) . Pesquisas e experiências com a digoxina iniciaram há mais de 200 anos (WITHERING, 1785) e suas aplicações em pacientes com falência cardíaca foram descritas apenas no século 20, definindo sua capacidade de aumentar a contratilidade do coração. A digoxina se liga ao sítio de ligação para glicosídeos cardíacos, presente na subunidade da enzima Na+ K+-ATPase, também conhecida como bomba de sódio-potássio, inibindo sua atividade. Esta proteína de membrana é responsável pelo transporte de sódio para o meio extracelular e ao ser inibida, gera um aumento do sódio intracelular. Este aumento estimula o intercâmbio pela bomba de sódio-cálcio, aumentando a concentração do cálcio intracelular, utilizado pelas proteínas contráteis. Como consequência ocorre aumento da contração no miocárdio (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002) . Sua aplicação em falência cardíaca foi aprovada em 1998 pela Food and Drug Administration (FDA) . Seu uso diminuiu com o aparecimento de novas terapias, como β -bloqueadores , bloqueadores de receptor da angiotensina (ARBs, angio ensin receptor blockers) , bloqueadores de aldosterona e terapia de resincronização cardíaca (CRT, cardiac resynchronization therapy) . Contudo, ainda é usada em cerca de 30% dos pacientes com falência cardíaca. É uma droga de baixo custo, sendo importante em países em desenvolvimento onde os pacientes não têm acesso a terapias sofisticadas (GHEORGHIADE et al . , 2006).
A concentração da digoxina no soro não depende apenas da dose administrada, mas também está relacionada com interações com outras medicações e às condições do paciente (ANTMAN, SMITH, 1985) . A incidência de intoxicação com digoxina aumenta em situações onde a excreção da digoxina pelos rins é impedida (SMITH; BUTLER; HABER, 1970) . Doses tóxicas de digoxina podem acarretar arritmias graves e fatais (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002) .
0 uso de digitálicos tem sido facilitado pela geração de anticorpos, usados para monitorar as concentrações da droga no soro de pacientes, com a finalidade de manter níveis seguros. A digoxina não é antigênica por ser uma molécula pequena (780,92 Daltons) e precisa ser ligada covalentemente a proteínas imunogênicas apropriadas (carreadores) para produzir anticorpos específicos anti -digoxina . A digoxina foi conjugada a BSA em 1967, para obtenção de anticorpos específicos em coelhos (BUTLER, CHEN, 1967) . Em 1970, Smith et al . documentaram a alta afinidade e especificidade de populações de anticorpos selecionados para haptenos de glicosídeos cardíacos. Fragmentos Fab (Fragment antigen binding) de anticorpos específicos para digoxina obtidos em ovelhas demonstraram habilidade de reverter intoxicações pela digoxina (SMITH et al . , 1976). Um estudo realizado em cães mostrou que a administração intravenosa da porção purificada do fragmento Fab de anticorpos policlonais anti -digoxina de ovelha pode rapidamente reverter a cardiotoxicidade , ligando-se â digoxina livre no plasma e fazendo a redistribuição da droga dos tecidos, de volta para a circulação sanguínea. Os fragmentos Fab são excretados relativamente rápidos pela urina, por isso os fragmentos Fab de alta afinidade, que retêm ligação com a droga, podem fornecer uma rota de eliminação da droga, assim como meio de neutralizá-la (BUTLER et al . , 1977). Terapias com potássio e agentes bloqueadores beta adrenérgicos têm sido usados como alternativa para combater a intoxicação digitálica, mas a administração de fragmentos Fab de anticorpos é a principal terapia para reverter a intoxicação (ANTMA et al . , 1990) . Um estudo retrospectivo, com 141 pacientes intoxicados pela digoxina, avaliou os resultados de 66 pacientes tratados com fragmentos Fab e sugeriu seu uso como terapia de primeira linha única, pela baixa taxa de mortalidade dos pacientes tratados pelos fragmentos (LAPOSTOLLE et al . , 2008) .
O fragmento Fab do anticorpo policlonal anti-digoxina gerado em ovelha está sendo fabricado somente por uma empresa (Protherics) com o nome de DigiFab, tendo recebido aprovação do FDA em 2001.
No Brasil o anticorpo anti-digoxina Fab pode ser importado conforme a Resolução RDC n° 28, de 09 de maio de 2008 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária que autoriza a importação dos medicamentos constantes na lista de medicamentos liberados em caráter excepcional destinados unicamente, a uso hospitalar ou sob prescrição médica, cuja importação esteja vinculada a uma determinada entidade hospitalar e/ou entidade civil representativa, para seu uso exclusivo, não se destinando à revenda ou ao comércio.
O uso de fragmentos Fab em casos de intoxicação por digoxina é seguro e efetivo, porém a neutralização com fragmentos Fab é uma terapia cara, sendo utilizada apenas quando outras opções de tratamento parecem falhar. Seu alto custo também limita sua disponibilidade a todos os hospitais ou países. (ANDRÉS, 2000; FLANAGAN, JONES, 2004) .
A saber, os anticorpos são glicoproteínas formados por duas cadeias leves (LC, light chain) idênticas de aproximadamente 24 kDa cada, e duas cadeias pesadas (HC, heavy chain) idênticas de 55 a 70 kDa cada. Uma cadeia leve está ligada covalentemente a uma cadeia pesada por uma ponte dissulfeto, enquanto as duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por pontes dissulfeto. As regiões carboxiterminais das cadeias pesadas exercem funções efetoras. As cadeias leves e pesadas possuem uma região aminoterminal variável (VL, va iable light e VH, variable heavy) que participa no reconhecimento dos antígenos. Cada região variável das cadeias leves e pesadas contém três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs, complementarity determining regions) , nomeadas a partir da porção aminoterminal, de CDR1, CDR2 e CDR3 , sendo CDR3 a mais variável (ABBAS, LICHTMAN, 2005) . Entre essas regiões estão presentes sequências mais conservadas chamadas de arcabouço ou framework regions: FR1 , FR2 , FR3 e FR4 (TONEGAWA, 1983) . Os camundongos possuem duas famílias de genes da cadeia leve, a lambda (λ) e kappa (κ) que se diferenciam por suas regiões constantes. A cadeia λ constitui apenas 5% do total de genes da cadeia leve, além de ser muito menos heterogénea do que a cadeia κ ou cadeia pesada. (TONEGAWA, 1983) . A região constante da cadeia pesada se divide em 5 classes, IgG; IgA; IgM; IgD e IgE. A IgG, com peso molecular de 150 kDa, é a mais abundante no soro de mamíferos. Nos humanos é subdividida em IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. A IgGl é a mais encontrada no soro humano (ABBAS, LICHTMAN, 2005) e possui estrutura bem definida, com duas pontes dissulfeto unindo as cadeias pesadas na região da dobradiça (entre CHI e CH2) .
Em 1975, Kohler e Milstein desenvolveram a tecnologia de produção de anticorpos monoclonais (AcMos) , que lhes rendeu o Nobel de Fisiologia e Medicina em 1984. A técnica consiste na geração de hibridomas, que são células originárias da fusão de células mielômicas, com capacidade de reprodução indefinida, aos linfócitos B retirados do baço de um animal previamente imunizado, que secretam anticorpos (KOHLER, MILSTEIN, 1975). Em 1986, foi aprovado pelo FDA o primeiro AcMo para uso terapêutico em humanos (0KT3). Anticorpos terapêuticos e seus fragmentos, obtidos por todas as tecnologias disponíveis representam o mercado mais promissor entre os biofármacos movimentando em 2009 nos EUA, $16,9 21 bilhões (AGGARWAL, 2010) . Muitos anticorpos monoclonais murinos têm sido produzidos para tratamento ou diagnóstico de doenças humanas. Contudo, seu uso é limitado por apresentar meia- vida curta no soro e devido a sua alta imunogenicidade , podendo gerar uma reação conhecida como human anti-mouse antibody (HAMA) . Para superar esses problemas, iniciou-se a busca para gerar anticorpos menos imunogênicos como os quiméricos, humanizados, totalmente humanos e os fragmentos de anticorpos (MORO, RODRIGUES, 2001) .
Os fragmentos de anticorpos são mais vantajosos para algumas aplicações clínicas que não dependem de anticorpo inteiro. Mantêm os sítios de ligação ao antígeno, são menos imunogênicos do q e o IgG inteiro, se difundem melhor no espaço intersticial, são facilmente eliminados via filtração glomerular e são mais estáveis em estoques do que o IgG (FLANAGAN, JONES, 2004) . Podem ser obtidos pela digestão da imunoglobulina com a enzima pepsina que produz dois fragmentos Fab ligados por ponte dissulteto, F(ab')2 divalente, com peso aproximado de 110 kDa e porção Fc fragmentada, ou pela a enzima papaína que produz dois fragmentos Fab, monovalentes, com peso molecular de 50 kDa e porção Fc inteira (Figura 2) . Os fragmentos Fab anti-digoxina disponíveis comercialmente, foram obtidos pela digestão de IgG utilizando a enzima papaína. Os fragmentos de anticorpos também podem ser obtidos através da expressão em Escherichia coli, oferecendo a vantagem de obtenção em grandes quantidades, a baixo custo. A tecnologia de DNA recombinante oferece ainda a oportunidade para a introdução de mutações nas sequências gênicas, que podem ser vantajosas. No caso dos fragmentos Fab pode aumentar a quantidade expressa, a estabilidade, a solubilidade e facilitar a humanização e maturação de afinidade (K ONG, RADER, 2009) .
TECNOLOGIA ' PHAGE DISPLAY'
A tecnologia Phage Display compreende uma metodologia muito utilizada na geração de fragmentos de anticorpos. Surgiu em 1985, quando George Smith demonstrou que a correlação entre fenótipo e genótipo podia ser estabelecida em bacteriofagos (fagos) filamentosos (Figura 3) . Smith mostrou que fragmentos de DNA exógeno podiam ser inseridos no gene III, que codifica a proteína do capsídeo (pIII) destes fagos, criando uma proteína de fusão. Os peptídeos exógenos expostos na superfície dos fagos podiam ser selecionados através da afinidade pelo anticorpo específico, permitindo que fossem enriquecidos em relação ao peptídeo original, por um processo usualmente denominado panning.
Em 1989, Huse e colaboradores reportaram a geração de uma biblioteca de fragmentos Fab em fago lambda, a partir da combinação ao acaso das cadeias leve e pesada do anticorpo murino, como método que poderia substituir a tecnologia de hibridomas . Os genes variáveis de imunoglobulinas podem ser amplificados a partir de hibridomas ou células de linfócitos B, usando oligonucleotídeos iniciadores universais e reação em cadeia da polimerase (PCR, polymerase chaín reaction) , possibilitando clonagem em vetores de expressão (ORLANDI et al., 1989) . cCafferty e colaboradores (1990) demonstraram que os domínios variáveis completos de um anticorpo podiam ser expostos na forma de fragmento variável de cadeia única (scFv, single chain variable fragment) fundidos à pIII na superfície do fago fd, permitindo a seleção do fago pela afinidade ao antígeno, dando início ao uso da tecnologia de phage display para a produção de anticorpos. A construção do vetor pComb3 , permitiu que fragmentos Fab fundidos à pIII fossem expostos na superfície do fago M13 (BARBAS et al . , 1991) . A tecnologia permite a seleção de um clone de fago expondo fragmentos de anticorpo de alta afinidade e especificidade para um determinado antígeno dentro de uma biblioteca de fagos construída a partir de rearranjo dos domínios variáveis (CLACKSON et al . , 1991) . A construção do anticorpo pela tecnologia de phage display se inicia com a construção de uma biblioteca de imunoglobulinas , que pode ser gerada a partir de animais imunizados, não imunizados ou uma biblioteca sintética (STRACHAN et al . , 2002) .
Os fagos filamentosos da classe Ff (fl, fd e M13) possuem 11 genes (I - XI) e destes, 5 codificam proteínas do capsídeo que podem ser fundidas às proteínas recombinantes de interesse com maior ou menor grau de êxito, sendo a pIII a mais usada para phage display. Proteínas também podem ser expostas em pequenas partículas de fagos chamadas de fagomídeos, que são plasmídeos que carregam o gene da proteína recombinante do capsídeo e contém origem de replicação do fago M13 (BARBAS et al . , 2001) . O DNA do fagomídeo pode ser empacotado em partículas virais com a ajuda de um fago auxiliar {helper phage) que fornece todas as proteínas e enzimas do fago selvagem, necessárias para a replicação do fago. A proteína de fusão do capsídeo é exposta em partículas que contêm os genomas do fagomídeo e do fago auxiliar. Estas partículas contendo os dois genomas podem ser selecionadas através de marcadores de seleção (BARBAS et al . , 1991) . O helper phage possui origem de replicação deficiente e seu genoma é ineficientemente empacotado quando comparado ao fagòmídeo (BARBAS et al . , 2001) .
Após a seleção e a caracterização do anticorpo monoclonal, a tecnologia de phage display permite a manipulação dos genes do anticorpo através da geração de mutantes . Isto possibilita a seleção de novos variantes de anticorpos, alguns com afinidade e especificidade aumentadas em relação ao clone original (KRYKBAEV et al . , 2002) .
Phage display é uma tecnologia acessível em laboratórios de Biologia Molecular. Não se trata, porém, de tecnologia banal e muitos detalhes precisam ser trabalhados para se chegar a um bom resultado.
Devido às vantagens da tecnologia do phage display e à importância dos anticorpos anti -digoxina em casos de intoxicação e de sua produção comercial ser estrangeira e de alto custo, os requerentes acreditam na necessidade do desenvolvimento e da produção desse medicamento no Brasil. O anticorpo anti-digoxina produzido pela tecnologia de phage display é uma alternativa para o tratamento de i toxicação por digitálicos, já que pode diminuir consideravelmente os custos do medicamento, considerados elevados por se tratar de medicamento importado. j ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA
Uma breve pesquisa aos bancos de dados de patentes acerca do tema "ant i -digoxina monoclonal" resultou em alguns documentos, tais como o norte americano US 4803167 (1989 - The General Hospital Co.) que revela uma cultura de hibridoma, de alta afinidade de anti -digoxina e anticorpos monoclonais, produzidos por fusão de células somáticas.
O documento CN 1375505 (2002 - GEN HOSPITAL PLA) refere -se a um gene humano de engenharia monoclonal anti -digoxina e anticorpo de cadeia única. Sua estrutura é: assinatura sequencial: comprimento: 684 pb, tipo de classe, de ácido nucléico, número de cadeias: estrutura geométrica; linearidade; tipo de molécula: DNA (genoma) ; fonte: região variável positiva clonado respectivamente; pertence ao anticorpo humano e VH5 V lambda subgrupo I; transportador anfitrião contendo Escherichia coli, CGMCC e No.0542. Trata-se de engenharia genética para anticorpo humano digoxina de cadeia monoclonal utilizado para detectar a concentração de aplicação de digoxina no soro do paciente e detectar o efeito tóxico resultante de antagonista contra a digoxina de paciente envenenado por digoxina.
BREVE DESCRIÇÃO DO INVENTO
A presente patente de invenção trata, numa visão mais ampla, de um método de produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti- digoxina utilizando a tecnologia de phage display e a caracterização da sua ligação ao antigeno. Mais especificamente, o invento tem os seguintes objetivos:
Extrair RNA total dos hibridomas anti-digoxina e amplificar os genes da LC e da HC, porção Fd (VH e CHI) das imunoglobulinas por PCR;
- Construir a biblioteca combinatória de fragmentos Fab no vetor de phage display;
- Selecionar os clones de anti-digoxina através da ligação com o antígeno;
- Expressar fragmentos Fab solúveis de anti-digoxina; e
- Caracterizar a ligação dos fragmentos Fab anti-digoxina dos clones ao antígeno.
Foram empregados, materiais e método especialmente desenvolvido para a obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia de 'phage display' . Uma série de variantes foi obtida e quatro delas foram caracterizadas pela ligação à digoxina conjugada a BSA (Dig-BSA) . Diferente dos produtos comerciais importados., este anticorpo é monoclonal e não é produzido em animais. Assim, o invento dedica-se, em particular, ao desenvolvimento de produto para uso terapêutico com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina .
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A complementar a presente descrição de modo a obter uma melhor compreensão das características do presente invento e de acordo com uma preferencial realização prática do mesmo, acompanha a descrição, em anexo, um conjunto de desenhos, onde, de maneira exemplificada, embora não limitativa, se representou seu funcionamento:
Figura 1 - Estrutura química da digoxina (C41H64014), um glicosídeo cardíaco de 780,92 Da;
Figura 2 - Estrutura da molécula de IgG e de seus fragmentos que mantém sítios de ligação ao antígeno; fragmentos de imunoglobulina apresentados: Fab, F(ab')2.
Figura 3 - Representação esquemática de bacteriófago filamentoso da classe Ff e suas proteínas do capsídeo; as proteínas do capsídeo apresentadas podem ser usadas para a expressão de proteínas recombinantes , na forma de proteína de fusão, através da tecnologia de phage dísplay;
Figura 4 - Esquema do vetor fagomídeo pComb3XTT usado no sistema de phage display; o vetor possui os genes de LC e HC do fragmento Fab humano para a toxina tetânica -TT||. A cadeia leve foi clonada nos sítios de restrição Saci e Xbal e a cadeia pesada do fragmento Fab foi clonada nos sítios de restrição Xhol e Spel ;
Figura 5 - Representação esquemática das principais etapas do phage display e panning; a biblioteca de fragmentos Fab foi transformada em células E. coli XL1- Blue, infectada pelo fago auxiliar e os fagos expondo fragmentos Fab anti-digoxina foram selecionados por rodadas de panning através de ligação à Dig-BSA imobilizada em placa. Os fagos que não ligaram foram descartados por lavagem e os f agos i que ligaram foram eluídos e usados para re-infectar E. coli XLl-Blue. Figura 6 - Perfil da ligação do antígeno Dig-BSA à IgG anti -digoxina presente no sobrenadante do cultivo de hibridoma pelo teste de ELISA, onde o conjugado Dig-BSA foi imobilizado em quatro concentrações: 1, 2, 4 e 8 pg/mL. 0 sobrenadante do cultivo do hibridoma anti -digoxina foi usado como anticorpo primário. Como anticorpo secundário foi utilizado anti -IgG de camundongo conjugado com peroxidase ;
Figura 7 - Perfil eletroforético da IgG anti- digoxina purificada por cromatografia de afinidade pela proteína A, onde Gel de SDS-PAGE 12% corado por Coomassie. M: Marcador de massa molecular LMW (Amersham) , 1: IgG purificado não reduzido, 2: IgG purificado reduzido com β- ME ;
Figura 8 - Perfil da ligação da IgG anti -digoxina purificada à Dig-BSA imobilizada em diferentes concentrações para padronização dos testes de ELISA, onde o conjugado Dig-BSA foi imobilizado em seis concentrações: 0,5; 1; 2; 4; 8 e 10 pg/mL. A IgG anti -digoxina purificada do hibridoma foi usada como anticorpo primário na concentração inicial de 500 ng/mL. Como anticorpo secundário foi usado anti -IgG de camundongo conjugado com peroxidase ;
Figura 9 - Produtos das amplificações dos cDNAs do hibridoma anti -digoxina usando oligonucleotídeos de imunoglobulina murina, onde as amplificações foram feitas por PCR e analisadas por eletroforese em gel de agarose 1,5%. (A) Produtos das amplificações dos genes HC usando o oligonucleotídeo 3' MoIgGl e os sete oligonucleotídeos 5' . M: Marcador de massa molecular de lOOpb ( Invitrogen) , 1: oligonucleotídeo 5' 1A+1B, 2: 2A, 3: 2B, 4: 2C, 5: 3A, 6: 3B+3G e 7: 3D. (B) Produtos das amplificações dos genes LC usando o oligonucleotídeo Mok 3' e os seis oligonucleotídeos 5'. M: Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega) , 1: oligonucleotídeo 5' κΐ, 2: κ2, 3: 3, 4:
4, 5: 5 e 6: κβ. A sequência dos oligonucleotídeos encontra-se na Tabela 1. ;
Figura 10 - Análise de restrição da biblioteca LC construída a partir da clonagem do repertório dos genes LC no vetor pComb3X para verificar presença do inserto LC; dez clones (numerados de 1 a 10) da bibliteoca LC selecionados ao acaso e o vetor pComb3XTT, usado como controle (C) , foram digeridos com as enzimas de restrição Saci e Xbal e analisados por eletroforese em gel de agarose 1%. M: Marcador de massa molecular de 1 kb (Invitrogen) .
Figura 11 - Análise de restrição da biblioteca combinatória de fragmentos Fab construída no vetor pComb3X para verificar presença dos insertos LC e HC; dez clones (numerados de 1 a 10) da biblioteca combinatória foram selecionados ao acaso, digeridos com as enzimas de restrição Spel e Xhol para verificar a presença do inserto HC (A) e com Saci e Xbal para verificar a presença do inserto LC (B) . As amostras digeridas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1%, M: Marcador de massa molecular de 1 kb (Invitrogen);
Figura 12 ■- Análise de restrição da diversidade da biblioteca combinatória construída no vetor pComb3X pela digestão com a enzima de restrição BstNI; os dez clones selecionados ao acaso e analisados na Figura 11 e o vetor pComb3XTT, usado como controle (C) , foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3% após digestão com a enzima de restrição BstNI . M: Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega) ;
Figura 13 - Analise de restrição da biblioteca de fragmentos Fab anti -digoxina após 3 rodadas de phage display seguido de panning para verificar presença dos genes LC e HG; dez clones (numerados de 1 a 10) selecionados aleatoriamente da biblioteca e o vetor pComb3XTT, usado como controle (C) foram digeridos com as enzimas de restrição Spel e Xhol para verificar a presença do inserto da HC (A) e com Saci e Xbal para verificar a presença do gene LC (B) e analisados por eletroforese em gel de agarose 1%. M : Marcador de massa molecular de 1 kb (Invitrogen) ;
Figura 14 - Análise de restrição da diversidade da biblioteca de fragmentos Fab anti -digoxina após 3 rodadas de phage display seguido de panning pela digestão com a enzima de restrição BstNI/ os dez clones (numerados de 1 a 10) referem-se aos clones analisados na Figura 13, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3%. M: Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega) ; '
Figura 15 - Representação simbólica das sequências de aminoácidos deduzidos da LC dos clones 1, 2, 9 e 10, selecionados após phage display; os resíduos de aminoácidos foram substituídos por símbolos nas regiões FR1 e CDR2 para destacar as diferentes sequências. As demais regiões possuem sequências idênticas entre si. Figura 16 - Perfil eletroforético dos clones 1, 2,
9 e 10 digeridos com as enzimas de restrição Spel e Nhel para a remoção do gene III que codifica a proteína pIII; as bandas de aproximadamente 4 kb (vetores) e 612 pb (gene III) foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1% e a banda do vetor foi purificada do gel para a obtenção do vetor de expressão do fragmento Fab solúvel. M: Marcador de massa molecular de 1 kb (Invitrogen) ;
Figura 17 - Western blotting de extratos brutos contendo fragmentos Fab anti -digoxina dos clones 1, 2, 9 e
10 expressos em E. coli XLl-Blue; os extratos foram diluídos 1/2 e aplicados no gel de poliacrilamida 12% na forma não reduzida. Após eletroforese, o gel foi transferido para membrana de PVDF . A membrana foi incubada com o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidase e detectada com o sistema ECL;
Figura 18 - Imunodetecção do antígeno Dig-BSA e BSA pelos fragmentos Fab anti -digoxina expressos em E. coli pelos 4 clones sèlecionados após phage display; (A) Análise por SDS-PAGE 7,5% da Dig-BSA e BSA (controle) na forma reduzida. Após a eletroforese o gel foi corado por prata. M: H W marker (GE Healthcare); 1: Dig-BSA 0,025 mg/mL; 2: Dig-BSA 0,0125 mg/mL; 3: Dig-BSA 0,0063 mg/mL; 4: BSA 0,01 mg/mL. (B) Western blotting para verificar ligação dos fragmentos Fab anti-digoxina dos extratos brutos dos 4 clones ao antígeno Dig-BSA. Quatro géis com as mesmas amostras usadas em (A) , foram transferidos para membranas de PVDF e cada membrana foi incubada com o extrato bruto de E.coli contendo fragmentos Fab anti -digoxina de cada um dos 4 clones. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidase e reveladas com o sistema ECL.
Figura 19 - Perfil da ligação dos fragmentos Fab anti-digoxina expressos em E. coli pelos 4 clones à Dig-BSA e BSA pelo teste de ELISA; a microplaca foi sensibilizada com Dig-BSA ou BSA a 4 yg/mL. Os fragmentos Fab presentes no extrato bruto de culturas de E. coli foram diluídas serialmente 1:2, iniciando com a concentração do anticorpo em 50 ng/mL. O anticorpo secundário utilizado foi anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidase; e
Figura 20 - Sensorgrama do BIAcore° do ensaio de ligação dos fragmentos Fab expressos em E.coli pelos 4 clones ao antígeno Dig-BSA; Dig-BSA foi imobilizada em um sensor chip CM5 a 9259,8 RU. Os extratos brutos dos clones contendo os fragmentos Fab expressos em E. coli foram injetados a uma concentração de 2,0 g/mL. A resposta relativa foi medida 5 segundos após o término da aplicação do analito, no ponto indicado pela seta vermelha (clone 1 - 495,9 RU; clone 2 - 476,3 RU; clone 9: 206,9 RU; clone 10 - 1.023, 5 RU.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
De acordo com as ilustrações, a presente invenção se refere a "MÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO ANTI-DIGOXINA MONOCLONAL A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR" , mais particularmente a método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti- digoxina utilizando a tecnologia de 'phage display' e a caracterização da sua ligação ao antígeno, o qual compreende as seguintes etapas :
Etapa 1) - Obtenção e caracterização de albumina bovina conjugada com digoxina (Dig-BSA)
Fase 1.1 - Obtenção dos conjugados Dig-BSA;
Fase 1.2 - Caracterização dos conjugados Dig-BSA;
Etapa 2) - Obtenção do anticorpo monoclonal anti -digoxina ; Fase 2.1 - Purificação do anticorpo monoclonal anti- digoxina ;
Etapa 3) - Construção da biblioteca de Fab no fagomídeo pComb3X a partir de hibridomas anti -digoxina
Fase 3.1 - Obtenção de cDNA dos hibridomas anti -digoxina ; Fase 3.2 - Amplificação dos genes da LC e da porção Fd da HC;
Fase 3.3 - Obtenção de células competentes e vetor;
Fase 3.4 - Clonagem do repertório de genes LC no vetor pComb3X;
Fase 3.5 - Clonagem do repertório de genes HC na biblioteca LC;
Etapa 4) - Phage display e enriquecimento da biblioteca Fab;
Fase 4.1 - Preparação de fago auxiliar (helper phage);
Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab an i -digoxina (phage display) ;
Etapa 5) - Expressão de fragmentos Fab solúveis; Fase 5.1 - Quantificação dos fragmentos Fab solúveis por Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sanduíche;
Etapa 6) - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage display
Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel ao antigeno pelo teste de ELISA;
Fase 6.2 - Eletroforese em gel de pol iacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ;
Fase 6.3. - Ensaios de Western Blotting;
Fase 6.4. - Análise de afinidade no BIAcore0 T100.
Para melhor definir cada etapa e sua respectiva fase, é abaixo descrito o método em sua característica detalhada, o qual pode ser acompanhado das ilustrações já relacionadas:
Etapa 1) Obtenção e caracterização de albumina bovina conjugada com digoxina (Dig-BSA)
Fase 1.1 Obtenção dos conjugados Dig-BSA
O protocolo baseou-se na técnica descrita por Erlanger e Beiser (1964) . Quarenta e quatro miligramas de digoxina foram ressuspendidos em 2 mL de etanol 95%, foram adicionados 2 mL de NaI04 0,1 e a solução foi mantida em repouso a temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos de interação, 60 ^L de glicerol 1 M foi adicionado para inativar o excesso de periodato, e a solução foi mantida sob agitação por mais 5 minutos. Cinquenta e seis miligramas de BSA (Sigma) foram dissolvidos em 2 mL de PBS e o pH foi acertado em 9,5 com a solução Na2C03 5%. A solução de digoxina oxidada pelo periodato foi adicionada à solução de BSA, lentamente e gota a gota, mantendo o pH entre 9,3 e 9,5 pela adição de Na2C03 5%. A solução continuou sob agitação por 1 hora a temperatura ambiente, mantendo o pH estável por 30 minutos na faixa de 9,3 a 9,5. Adicionou-se 6 mg de NaBH4 dissolvido em 2 mL de água deionizada preparada de imediato. A solução foi coberta com parafilme (a liberação de H2 poderia causar explosão) e mantida em repouso por 24 horas a 4 °C. A solução foi dialisada em 2 L de PBS com 20- 30% de etanol a 4 °C por dois dias. Foram feitas duas trocas do tampão, sendo que na última utilizou-se somente PBS. A amostra foi centrifugada , quantificada através do método de Bradford e estocada a -20 °C .
Fase 1.2 Caracterização dos conjugados Dig-BSA
Para estimar o número de moléculas de digoxina conjugada a BSA, usou-se como referência a absorbância no comprimento de onda de 388 nm de uma solução de digoxina de concentração conhecida, em duplicata. A referência e a amostra de Dig-BSA foram completados com água até 2 mL, em seguida 10 mL de H2S04 foram adicionados e os tubos foram mantidos em repouso a temperatura ambiente por 4 horas. Foi feita a leitura da absorbância e calculado o número de mols de digoxina presente no conjugado Dig-BSA. A estimativa do número de moléculas de digoxina presente no conjugado foi obtida através da relação entre o número de mols de digoxina do Dig-BSA e o número de mols da BSA adicionado para a obtenção do conjugado.
Etapa 2) Obtenção do anticorpo monoclonal anti -digoxina
Um anticorpo monoclonal anti -digoxina foi gerado pela tecnologia de hibridoma, a partir da imunização de camundongos Balb/c com conjugado ovalbumina- digoxina, no Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (PAULA, 1993) , sob orientação do Prof. Jorge Kalil.
Células do hibridoma anti -digoxina foram cultivadas em dois frascos Spinner Flask, 500 mL (Bélico Glass, Inc., EUA) , um contendo 400 mL de meio e outro com 300 mL de meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle's Médium and Ham ' s F-12 Nutrient Mixture (DME/F12) (Sigma-Aldrich, Inc., EUA) suplementado com soro fetal bovino 3% (Cultilab, Brasil) e L-glutamina 4 mM (Merck KGaA, Alemanha), em estufa (Forma Scientific Inc., EUA) a 37 °C e C02 5%. A contagem das células viáveis foi feita com o auxílio do corante de exclusão azul de Trypan e câmara de Neubauer. As células foram precipitadas em Centrifuge 5804 R (Eppendorf AG, Alemanha) a 5.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
Fase 2.1 Purificação do anticorpo monoclonal anti -digoxina
Os sobrenadantes dos cultivos foram purificados por cromatografia de afinidade em 245 mL de resina proteína A-Sepharose 4FF (GE Healthcare) empacotada em coluna XK 50/30 de 5 cm de diâmetro x 30 cm de altura (GE Healthcare) . A coluna foi conectada a uma bomba peristáltica P50 (GE Healthcare) que promove o bombeamento da amostra pela coluna, a saída da coluna foi conectada a um monitor de UV a 280 nm UV1 (GE Healthcare) , que por sua vez foi ligado a um registrador REC 101 (GE Healthcare) . 0 equilíbrio da coluna foi realizado através do tampão glicina 1,5 M/cloreto de sódio 3 M pH 8,3, posteriormente a coluna foi carregada com o sobrenadante do cultivo diluído 1:1 no tampão de equilíbrio. Após o carregamento, passou-se pela coluna tampão de equilíbrio para remover possíveis ligações inespecíficas e reequilibrar a coluna. Para a eluição utilizou-se o tampão citrato de sódio 50 mM/cloreto de sódio 150 mM pH , 3. O eluato foi dialisado duas vezes contra PBS durante uma noite. Após a eluição a coluna foi regenerada com tampão glicina 50 mM/cloreto de sódio 150 mM pH 2 , 3 seguida do tampão Tris 50 mM/cloreto de sódio 1 M pH 8,6. 0 enxágue da coluna foi efetuado com a passagem do tampão Tris 50 mM/cloreto de sódio 150 mM pH 8,6. Durante a etapa de carregamento foi utilizado o fluxo de 1 mL/min, as demais etapas foram realizadas com fluxo de 10 mL/min.
Etapa 3) Construção da biblioteca de Fab no fagomídeo pComb3X a partir de hibridomas anti -digoxina
Fase 3.1 - Obtenção de cDNA dos hibridomas anti -digoxina
Células do hibridoma anti -digoxina foram cultivados em um frasco Spinner Flask, 250 mL (Bélico Glass, Inc) , nas mesmas condições descritas na Etapa 2. O cultivo foi precipitado a 5.000 x g por 10 minutos a 4 °C . 0 RNA total das células dos hibridomas foi extraído utilizando o Trizol® Reagent (Invitrogen Corporation, EUA) , baseado no método de isolamento de RNA por fenol, isotiocianato de guanidina e clorofórmio (CHOMCZYNSKI e SACCHI, 1987), conforme manual do fabricante. A concentração do RNA foi determinada por espectrofotometria , através da absorbância a 260 nm (A260) no aparelho Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech (Biochrom) Ltd. , Inglaterra) e a equação utilizada para o cálculo foi: [RNA (pg/mL) ] = 40 x A260 x diluição. A pureza do material também foi verificada pela relação entre a absorbância a 260 nm e 280 nm (A260/A280) . A razão ótima entre A260/A280 para o RNA varia de 1,9 a 2,0.
A síntese de cDNA foi feita por transcrição reversa do RNA total, utilizando o kit SuperScript™ III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogem Corporation), usando o Oligo (dT)20 e seguindo o manual do fabricante. As reações foram feitas no aparelho termociclador GeneAmp® PCR System 9100 (Applied Biosystems, EUA) .
Fase 3.2 Amplificação dos genes da LC e da porção Fd da HC
0 cDNA dos hibridomas anti-digoxina foi usado como molde para amplificar os genes da LC e da porção Fd (VH e CHI) da HC, usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para o tipo kappa (κ) da LC e subclasse IgGl (γΐ) da HC de imunoglobulinas murinas, com base no banco de dados de Kabat (KABAT et al . , 1991) .
Os oligonucleotídeos, contendo sítios de restrição específicos para clonagem no vetor pComb3 (BARBAS et al . , 1991), foram sintetizados pela Invitrogen Brasil Ltda. Foram usados seis oligonucleotídeos 5' para a LC (κΐ; K2; K3; K4; K5 e κβ), contendo sítio de restrição para a enzima Saci e sete para a porção Fd (1A+1B; 2A; 2B; 2C; 3B+3C e 3D) , com sítio para Xhol (ITOH et al . , 1999) e os oligonucleotídeos 3' Mok3 ' e MoIgGl, contendo sítios de restrição para Xbal e Spel, respectivamente (BARBAS et al . , 2001) . As sequências dos oligonucleotídeos utilizados estão representadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Sequência dos oligonucleotídeos usados para amplificação do gene da porção Fd da cadeia pesada e da cadeia leve :
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Em negrito, sublinhado, duplamente sublinhado e tracejado estão representados, respectivamente, os sítios das enzimas de restrição Xhol , Saci, Spel e Xbal .
Os genes da LC e HC foram amplificados através de reação de PCR usando a Taq DNA Polymerase, recombínant - BR (Invitrogen Brasil Ltda . ) , no aparelho GeneAmp®PCR System 9100 (Applied Biosystems, EUA) iniciando a 94 °C por 2 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 1 minuto, anelamento a 57 °C por 1 minuto e alongamento a 72 °C por 1 minuto. Um alongamento final de 5 minutos a 72 °C foi realizado após os ciclos (TSURUTA et al . , 2003) . Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram analisados através de eletroforese em gel de agarose, utilizando Sistema Horizontal de Eletroforese LCH 7x8 (Loccus Biotecnologia, Brasil) . O gel de agarose 1,5% foi preparado com tampão TAE (Tris-EDTA 40 mM; acetato de sódio 5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e corado com SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen Corporation) . As amostras foram preparadas com Blue/Orange Loading Dye , 6x (Promega Corporation, EUA) e um marcador de massa molecular lOObp DNA Ladder (Promega Corporation) foi usado. A corrida foi realizada por 40 minutos a 90 V. O resultado foi visualizado no aparelho transiluminador de luz azul, Safe Imager™ Blue Light Transilluminator (Invitrogen Corporation) e as imagens foram capturadas pelo sistema KODAK Gel Logic 100 Imaging System e o KODAK Molecular Image Software (Carestream Health, Inc., EUA) . Após a análise, os produtos da amplificação dos genes LC e HC foram separadamente misturados, obtendo-se os repertórios para a construção da biblioteca combinatória.
A concentração de DNA foi determinada pela absorbância a 260 nm no espectrofotômetro Ultrospec 6300 Pro (Biochrom Ltd. Inglaterra) . As medições foram feitas em amostras diluídas em água Milli-Q, usando cubetas de quartzo de 10 mm. 0 cálculo utilizado foi: [dsDNA ( g/mL) ] = 50 x A260 x diluição. A pureza do material também foi verificada pela relação A260/A280. A razão ótima para o DNA varia de 1,8 a 1,9.
Fase 3.3 - Obtenção de células competentes e vetor Sub-Fase 3.3.1 Preparo de células de Escherichia coli XL1- Blue para transformação por choque térmico
A linhagem bacteriana de Escherichia coli utilizada para clonagem e expressão do anticorpo recombinante foi a XLl-Blue: recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 reiAl lac [F' proAB lacIqZlSM15 ΎτιΙΟ (Tetr) ] .
Uma alíquota da bactéria E. coli XLl- Blue Competent Celis (Stratagene Corporation, EUA) foi plaqueada em uma placa de meio Luria-Bertani (LB) - ágar (triptona 1%; extrato de levedura 0,5%; NaCl 1%; ágar 1,5%; glicose 0,1 M) , contendo tetraciclina a 10 μg/mL· e incubada durante uma noite a 37 °C . No dia seguinte, uma colónia foi inoculada em 10 mL de meio Super Broth (SB) (triptona 3%; extrato de levedura 2%; MOPS 1%, pH 7,0), contendo tetraciclina a 40/g/mL e incubada durante uma noite a 37 °C sob agitação. Desta cultura foi retirado 0,4 mL e inoculado em 200 mL de SB contendo glicose 0,04 M e MgC12 0,01 M e incubada a 37 °C sob agitação até a absorbância no aparelho Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech (Biochrom) Ltd.) a 600 nm atingir 0,8-0,9. A cultura foi incubada no gelo por 20 minutos e centrifugada a 900 x g por 10 minutos a 4 °C (Centrifuge 5804 R - Eppendorf AG) . O sobrenadante foi descartado, as células foram ressuspendidas em 50 mL de MgCl2 0,1 M estéril e gelado e incubadas no gelo por 20 minutos. A suspensão foi centrifugada a 900 x g por 10 minutos a 4 °C, as células foram ressuspendidas em 25 mL de CaC12 0,1 M estéril e gelado e incubadas no gelo por 20 minutos. Uma nova centrifugação a 900 x g por 10 minutos a 4 °C foi feita, o scbrenadante descartado e as células ressuspendidas em 2,4 mL de CaCl2 0,1 M seguido pela adição de 0,6 mL de glicerol. A suspensão foi dividida em alíquotas de 110/iL em tubos gelados em banho de etanol com gelo seco e estocadas a -80 °C. O título das células competentes foi determinado através da transformação por choque térmico com um DNA controle.
Sub-Fase 3.3.2 - O vetor pComb3X
0 vetor fagomídeo pComb3XTT (BARBAS et al . , 2001) (Figura 4) foi fornecido pelo Dr . Carlos Barbas do Instituto Scripps (The Scripps Research Institute, EUA), junto com a licença para sua utilização. Pertence à família de vetores pComb3X {Genbank AF268281) e pode ser usado na clonagem de fragmentos Fab, scFv, peptídeos e proteínas para o sistema de phage display. Este vetor possui os genes de LC e HC do fragmento Fab humano para a toxina tetânica —TT||, um único promotor lacZ, origem de replicação Fl Ori e resistência à ampicilina ampR. Contém duas sequências de peptídeo sinal, outer membrane protein (ompA) para LC e pectate lyase B (pelB) para HC, que direcionam as cadeias polipeptídicas para o periplasma. A cauda de 6 histidinas (His6) e de 10 hemaglutininas (HA) possibilitam a purificação e a detecção da proteína recombinante. Possui um códon de terminação âmbar (TAG) , que permite a expressão de proteína solúvel sem a pIII em linhagens não supressoras. Para a expressão da proteína solúvel, pode-se também remover o gene da proteína pIII pela digestão com as enzimas de restrição Spel e Nhel .
Sub-Fase 3.3.3 - Transformação por choque térmico A amplificação do vetor foi feita através da transformação por choque térmico da bactéria E. coli XLl-Blue Competent Celis (Stratagene Corporation) com o vetor pComb3XTT. Cinquenta microlitros da bactéria XL1- Blue foram incubados com 0,5 μΐ^ do vetor pComb3XTT por 10 minutos no gelo, 45 segundos a 42 °C no aparelho Thermomixer compact- (Eppendorf AG) e 5 minutos no gelo. Foram adicionados 450μΙ_ de meio SOC (triptona 2%; extrato de levedura 0,5%; NaCl 0,05%; KC1 20 mM; MgC12 1 mM; glicose 20 mM) e incubado por 1 hora sob agitação a 37 °C . Dessa cultura foram plaqueados 200 μ1> em uma placa de meio LB-ágar, contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubados durante uma noite a 37 °C .
Sub-Fase 3.3.4 - Extração plasmidial
Os plasmídeos foram purificados com os kits Maxiprep HiSpeed® Plasmid Maxi kit (Qiagen Sciences, Inc., EUA) e Miniprep Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation), conforme protocolo do fabricante.
Sub- Fase 3.3.5 - Precipitação com etanol
A precipitação com etanol foi feita adicionando etanol absoluto (2,2x o volume da amostra) e acetato de amónio (10% do volume da amostra) e incubação por 1 hora a -80 °C . Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 20.800 x g por 15 minutos a 4 °C e os sedimentos foram lavados duas vezes com etanol 70% gelado e centrifugados a 20.800 x g por 5 minutos a 4 °C após cada lavagem. As amostras foram ressuspendidas em água Milli-Q autoclavada . Súb-Fáse 3.3.6 - Análise do DNA através da digestão com enzimas de restrição
Os DNAs purificados foram digeridos por 2 horas a 37 °C com as enzimas de restrição Saci e Xbal (New England Biolabs Inc., EUA) para verificar a presença da cadeia leve e com as enzimas Xhol e Spel (New England. Biolabs Inc.) para verificar o inserto da cadeia pesada. Em seguida os DNAs foram analisados através de eletroforese em gel de agarose . Os marcadores de massa molecular utilizados foram 1 kb DNA Ladder (Promega Corporation) ou Ikb DNA Ladder (Invitrogen) .
Sub-Fase 3.3.7 - Preparo de células de Escherichia coli XLl-Blue eletrocompetentes
Uma alíquota da bactéria E. coli XL1- Blue Competent Celis (Stratagene Corporation) foi plaqueada em uma placa de meio LB-ágar, contendo tetraciclina (10 μg/mL) e incubada durante uma noite a 37 °C . No dia seguinte, uma colónia foi inoculada em 10 mL de meio SB, contendo tetraciclina (40 μg/mL) e incubada durante uma noite a 37 °C sob agitação. Desta cultura foi retirado 0,4 mL e inoculado em 200 mL de SB contendo glicose 0,04 M e MgC12 0,01 M e incubada a 37 °C sob agitação até a DO a 600 nra atingir 08-09. A cultura foi incubada no gelo por 20 minutos e centrifugada a 900 x g por 20 minutos a 4 °C. 0 sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 100 mL de glicerol 10% estéril e gelado. A suspensão foi centrifugada a 1.500 x g por 20 minutos a 4 °C, ressuspendida em 50 mL de glicerol 10% e centrifugada a 2.500 x g por 30 minutos a 4 °C . O sedimento foi novamente ressuspendido em 50 mL de glicerol 10% e centrifugado a 3.000 x g por 30 minutos a 4 °C. As células foram então ressuspendidas em 2 mL de glicerol 10% e divididas em alíquotas de 150 μL em tubos gelados em banho de gelo seco/etanol e estocadas a -80 °C . O título foi determinado através de eletroporaçao com um DNA controle.
Fase 3.4 - Clonagem do repertório de genes LC no vetor pComb3X
O repertório de genes LC foi clonado no vetor pComb3X para a construção da biblioteca LC. Quinze microgramas dos genes LC e do vetor pComb3XTT foram digeridos com as enzimas de restrição Saci (10 U/^g) e Xbal (13 U/^g) a 37 °C durante uma noite. No dia seguinte, as amostras foram precipitadas com etanol e ressuspendidas em 20 L de água Milli-Q autoclavada. Os DNAs foram aplicados no gel de agarose UltraPure® L.M.P. Agarose - Low Melting Point (Invitrogen Corporation) e submetidos à eletroforese a 50 V por cerca de 3 horas. Como padrão foi usado o marcador Ikb DNA Ladder (Promega Corporation) . As bandas com o peso aproximado de 4.000 pb (vetor) e de 700 pb (inserto) foram extraídas do gel, com auxílio de um bisturi e purificadas com o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation) , seguindo instruções do fabricante. As amostras purificadas foram precipitadas com etanol e ressuspendidas em 10 L de água Milli-Q autoclavada. A determinação da concentração do DNA foi feita utilizando o aparelho QubitTM Fluoroweter (Invitrogen Corporation) e o kit Quant-iT dsDNA BR Assay kits (Invitrogen Corporation) . Quinhentos nanogramas dos genes LC foram ligados a 100 ng de vetor pComb3X durante uma noite a 23 °C, utilizando 2 U de Taq DNA ligase (Invitrogen Corporation) .
Sub-Fase 3.4.1 Transformação por eletroporaçao
Setenta microlitros de E. coli XLl-Blue eletrocompetentes foram incubados com 2 ^L da reação de ligação acima em cubetas de Eletroporação 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc., EUA) durante 10 minutos no gelo. Após a incubação, as amostras receberam um pulso de 2.500 V por 5,0 ms no aparelho Multiporator® (Eppendorf AG) . Imediatamente foram adicionados 3 mL de meio SOC e incubados sob agitação por 1 hora a 37 °C . Foram plaqueados 200 L da cultura em placa LB-ágar contendo ampicilina (100 μg/mL) e as placas foram incubadas durante uma noite a 37 °C.
0 tamanho da biblioteca foi estimado pelo cálculo do número de colónias em Unidade Formadora de Colónia (UFC) . Também foram escolhidas colónias aleatoriamente, inoculadas em 5 mL de meio SB contendo ampicilina (100 9/ηΛ) e incubadas durante uma noite a 37°C sob agitação. No dia seguinte . os inóculos foram centrifugados e os plasmídeos foram purificados com o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation) . Foram feitas digestões com as enzimas de restrição Saci e Xbal para verificar a presença da cadeia leve .
A biblioteca dos genes LC foi amplificada através de transformação por eletroporaçao, incubando-se 2 μΐ, da biblioteca LC com 70 L de E. coli XLl-Blue eletrocompetente . Após eletroporação e incubação por 1 hora a 37 °C, adicionou-se 20 mL de meio SB contendo ampicilina (100 /xg/mL) e incubou-se a 37 °C durante uma. noite. Os plasmídeos foram purificados com o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation) e quantificados pela absorbância a 260 nra no espectrofotometro Ultrospec 6300 Pro (Biochrom Ltd.) .
Fase .3.5 Clonagem do repertório de genes HC na biblioteca LC
Para a clonagem dos genes da porção Fd no vetor pComb3X contendo os genes LC, foram utilizados os mesmos materiais e métodos da clonagem do repertório de genes LC (Fase 3.4), com exceção das enzimas de restrição. Dez microgramas do repertório de genes HC e da biblioteca dos genes LC contida no vetor pComb3X foram digeridas com as enzimas de restrição Spel {3\J/μg) e Xhol (6\J/μg) durante 3 horas a 37 °C . Na reação de ligação utilizou-se 300 ng dos genes HC, 100 ng de vetor e 2 U de Taq DNA ligase (Invitrogen Corporation) . A reação ocorreu durante uma noite a 23 °C . Foram eletroporados a mistura de 70 L de E. coli XLl-Blue com 2 /iL da reação de ligação em um aparelho Multiporator® (Eppendorf AG), 2.500 V, 5,0 ms , cubetas 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc.) . Após a eletroporação, foi adicionado 3 mL de meio SOC e incubado sob agitação por 1 hora a 37 °C . Foram plaqueados 200 μL da cultura em placa LB-ágar, contendo ampicilina (100 g/mL) e incubados durante uma noite a 37 °C .
A análise da biblioteca combinatória foi feita de forma parecida como a feita para a biblioteca LC, acrescentando as digestões com as enzimas de restrição Xhol e Spel para detectar a presença da porção Fd e a análise da diversidade da biblioteca combinatória, feita pela digestão com a enzima de restrição BstNI, que reconhece o sítio CC/WGG (New England Biolabs Inc.) . Os clones que apresentaram os insertos da LC e da HC foram quantificados por espectrofotometria e sequenciados.
Sub-Fase 3.5.1 Sequenciamento e análise de DNA
O sequenciamento de DNA dos clones que apresentaram os dois insertos foi feito usando o oligonucleotídeo iniciador ompseq (5'-AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G-3') para a cadeia leve e o oligonucleotídeo pelseq (5'- ACC TAT TGC CTA CGG CAG CCG-3') para a cadeia pesada (BARBAS et al . , 2001) . As amostras foram preparadas com BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencíng Kit (Applied Biosystems) . Foi utilizado o Serviço de Sequenciamento de DNA (SSDNA) do Departamento de Bioquímica - IQUSP, que realiza os sequenciamentos pelo método de Sanger, através do sequenciador capilar ABI PRISM® 3100GeneticAnalyzer / HITACHI. As sequências nucleotídicas foram analisadas através do programa Chromas lite (Technelysium Pty Ltd.) e os aminoácidos foram deduzidos utilizando o programa de tradução Expert Protein Analysis System (ExPASy) , do Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) . As sequências dos clones foram comparadas com sequências do GenBank usando o programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) , do National Center for Biotechnology Information (NCBI) , Bethesda, MD, EUA (ALT3CHUL et al . , 1990) e foram alinhadas usando o programa de alinhamento para DNA e proteínas ClustalW2, do European Bioinformatics Institute (EBI ) , pertencente ao European Molecular Biology Laboratory (EMBL) (LARKIN et al . , 2007) . A identificação dos CDRs foi baseada no esquema de numeração de Kabat (1991) .
Etapa 4) Phage display e enriquecimento da biblioteca Fab
A biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti -digoxina foi enriquecida através de phage display e panning com o antígeno imobilizado. Um esquema mostrando as principais etapas do enriquecimento da biblioteca está representado na Figura 5.
Fase 4.1 Preparação de fago auxiliar (helper phage)
Uma alíquota da bactéria E. coli XL1- Blue Competent Celis (Stratagene) foi plaqueada em placa LB-ágar contendo tetraciclina (10 g/mL) e incubada durante uma noite a 37 °C . Uma colónia de XLl-Blue foi inoculada em 10 mL de SB contendo 10 μg/mL de tetraciclina e incubada sob agitação a 37 °C até a DO a 600 nm atingir 1,0. Foi então adicionada 1 placa de VCSM13 Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene Corporation) e incubada por 2 horas a 37 °C . Foram transferidos 2 mL da cultura infectada para um Erlenmeyer de 1 L contendo 100 mL de SB com 10 g/mL de tetracilcina e 70 ^g/mL de canamicina e incubada sob agitação a 37 °C durante uma noite (20 horas) . A cultura foi centrifugada a 1.600 x g por 25 minutos a 4 °C e o sobrenadante incubado em banho-maria por 25 minutos a 70 °C seguido por mais uma centrifugação a 1.600 x g por 25 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram estocados a 4 °C (estáveis por meses) .
Sub-Fase 4.1.1 Determinação de título do fago auxiliar Foi feito um inoculo de 10 L de E. coli XLl-Blue eletrocompetente em 10 mL de SB com 10 μ9/ιπΙ-] de tetraciclina e incubado por 5-6 horas a 37 °C . Diluições de 10"6, IO"7 e IO"8 do VCSM13 foram preparadas. Foram adicionados 5 μΐ-ι de cada diluição a 100 ΐ, de XLl-Blue e incubados por 15 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionado 3 mL de soft ágar (triptona 1%; extrato de levedura 0,5%; NaCl 0,5%; Ágar 0,65%) pré-aquecido (42 °C) e derramado sobre a placa de LB-ágar pré-aquecido (37 °C) . As placas foram incubadas durante uma noite a 37 °C . Cada placa de lise formada representa uma partícula virai da suspensão. O título do fago foi calculado em Unidades Formadoras de Placa (UFP)/mL: n° placas de lise/v (μ∑ι) fago x fator diluição x IO3 μL.
Sub-Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab anti- digoxina (phage display)
Dois microlitros da biblioteca combinatória obtida acima foram transformados por eletroporação em 70 μL de E. coli XLl-Blue eletrocompetentes . Após incubação por 1 hora a 37 °C, foram plaqueados 50 μL da cultura em placa LB-ágar contendo ampicilina (100 ug/mL) e incubados durante uma noite a 37 °C para confirmar o tamanho da biblioteca combinatória. Adicionou-se à cultura 7 mL de SB contendo ampicilina 100 g/mL, tetraciclina 10 μg/mL e glicose 40 nM. Após incubação por 2 horas a 37 °C, foram adicionados aproximadamente 1 x 1011 UFP de fago auxiliar, seguindo por mais uma incubação por 2 horas a 37 °C. 0 cultivo foi centrifugado a 2.200 x g por 10 minutos a 4 °C . O sedimento foi ressuspendido em 10 mL SB e centrifugado a 2.200 x g por 10 minutos a 4 °C. O sedimento foi novamente ressuspendido em 10 mL SB contendo ampicilina 100 yg/mL e canamicina 70 μg/mL e incubado durante uma noite (20 horas) a 30 °C. 0 cultivo foi centrifugado a 4.500 x g por 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. Ao sobrenadante foram adicionados 2 mL de polietilenoglicol (PEG) 6.000 20%/NaCl 2,5 M. A mistura foi incubada por 30 minutos no gelo e foi centrifugada a 4.500 x g por 30 minutos a 4 °C, o sedimento foi ressuspendido em 400 yL de BSA 2%/TBS e centrifugado a 20.800 x g por 5 minutos a 4 °C . Foram separados 5 yL do sobrenadante para determinar o título (diluição IO"8, IO"9) e o restante foi aliquotado e armazenado a 4 °C (biblioteca de fagos) .
Sub-Fase 4.2.1 - Enriquecimento da biblioteca de fagos Fab anti -digoxina {panning) .
Uma placa de 96 poços (Nunc, EUA) foi sensibilizada com 50 yL do conjugado Dig-BSA previamente preparado (ver Fase 1.1) a 4 yg/mL. A placa foi incubada a 4 °C durante uma noite, seguida por 3 lavagens com PBS . Foi feito o bloqueio com 150 μL de BSA 1%/PBS e a placa foi incubada por 1 hora a 37 °C . Em cada poço foram adicionados 50 yL da suspensão de fagos, que foram incubados por 2 horas a 37 °C e após incubação os poços foram lavados 5x com BSA 2%/TBS. A eluição foi feita através da incubação por 10 minutos a temperatura ambiente com 50 yL de tampão de eluição (HC1 0,1 M - glicina, pH 2,2) . Foi feita a neutralização com 3 yL de Tris-base 2 M, e os conteúdos dos poços foram transferidos para tubos de 1,5 mL . Uma alíquota de 5 foi separada para determinar título (diluição IO'2, IO"4). Um novo ciclo de panning teve início, infectando 0,5 mL de cultura de E. coli XLl-Blue com 100 μΐ. de fagos eluídos . Após incubação por 15 minutos a temperatura ambiente, 100 yL foram plaqueados em LB-ágar contendo ampicilina (100 g/mL) e incubados durante uma noite a 37 °C, enquanto ao restante, adicionou-se 10 mL de SB, 100 g/mL de ampicilina, 10 yg/mL de tetraciclina e glicose 40 nM, dando continuidade ao procedimento de panning.
A partir do segundo ciclo de panning, a eficiência de cada ciclo foi calculada, em porcentagem de ligação, como mostrado abaixo:
Ligação (%) = título de fagos depois do panning x 100
título de fagos antes do panning
O fator de enriquecimento da biblioteca foi obtido pela razão entre a porcentagem de ligação do último ciclo de panning em relação ao ciclo anterior.
Após o terceiro ciclo de panning da biblioteca combinatória, 10 clones foram aleatoriamente selecionados da placa de diluição 10"4 para serem analisados conforme descrito na análise da biblioteca combinatória (item fase 3.5) e os clones que apresentaram os dois insertos foram sequenciados como já descrito anteriormente. Após análise dos dados de sequenciamento , 4 clones foram selecionados para expressar fragmentos Fab solúveis .
Etapa 5) - Expressão de fragmentos Fab solúveis
A expressão de fragmentos Fab solúveis em bactérias E. coli da linhagem XLl-Blue é possível após a retirada do gene III do vetor pComb3X através de dupla digestão com as enzimas de restrição Spel e Nhel (New England Biolabs Inc.) . Após a digestão com as enzimas por 2 horas a 37 °C, foi realizada uma precipitação com etanol. As amostras foram então submetidas â eletroforese em gel de agarose UltraPure® L.M.P. Agarose - Low Melting Point (Invitrogen Corporation) 1%. Bandas de aproximadamente 4.100 bp foram isoladas, purificadas com o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation) e precipitadas com etanol. 0 vetor sem o gene III foi religado utilizando 2 U de Taq DNA ligase (Invitrogen Corporation) durante, uma noite a 16 °C (~ 20 horas) . Para analisar os vetores preparados e confirmar a retirada do gene III, foram feitas transformações por eletroporação em XLl-Blue. Os plasmídeos foram purificados por Míníprep Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation) , precipitados com etanol e analisados por eletroforese em gel de agarose 1% após digestão com a enzima de restrição Xhol e também por dupla digestão com as enzimas de restrição Saci e Xbal .
Após as análises, 1 μ de cada vetor foi transformado por choque térmico em 50 μΐ; de XLl-Blue para a expressão dos fragmentos Fab solúveis. Foram plaqueados 20 iL e 100 em placas de Petri contendo LB- ágar com ampicilina (100 g/mL) e as placas foram incubadas durante uma noite a 37 °C . No dia seguinte, as colónias foram removidas, inoculadas em 10 mL de meio SB com ampicilina (100 ^g/mL) e incubadas por 2 horas a 37 °C. Foram inoculados 2 mL dessa cultura num frasco contendo 100 mL de meio SB com ampicilina (100 ο/πιΐ e MgCl2 20 mM. Seguiu-se uma incubação a 37 °C até a DO a 600 nm atingir aproximadamente 1,0, momento em que se adicionou Isopropyl- β-D-Thiogalactoside (IPTG) a 0,5 mM . O cultivo foi Induzido durante uma noite (~ 16 horas) a 30 °C . Após o término da indução, o cultivo foi centrifugado a 2.200 x g a 4 °C por 15. minutos. O precipitado foi fessuspendido em 5 mL de PBS e lisado por sonicação (Microson™, Ultrasonic Celi Disruptor - Misonix, Inc., EUA) : 10 pulsos de 10 segundos, intercalados com incubações de 2 minutos no gelo. A suspensão foi centrifugada a 20.800 x g a 4 °C por 30 minutos .· O sobrenadante foi armazenado a -20 °C e utilizado para confirmar a ligação ao antígeno. Uma segunda indução foi realizada em maior escala (1 L) a fim de obter fragmentos Fab para a realização de ensaios de ligação ao antígeno, inoculando- se 10 mL do pré inoculo em 500 mL de meio SB com ampicilina (100 μg/mL) e MgCl2 20 mM (2 frascos) .
Fase 5.1 - Quantificação dos fragmentos Fab solúveis por Enzy e-linked immunosorbent assay (ELISA) sanduíche
As quantificações foram feitas em microplacas MaxiSorp de 96 poços (Nunc- Immuno™ Plates,). Em cada poço foram adicionados 100 L de solução sensibilizadora (tampão de revestimento pH 9,6: 0,16 g de carbonato de sódio 15 mM (Na2C03); 0,30 g de bicarbonato de sódio 35 mM (NaHC03) ; água qsp 100 mL) , com o anticorpo AffiniPure F(ab')2 Fragment Rabbit-Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., EUA), diluído 1/400 (1,5 pg/mL) ; que foram incubados em câmara úmida durante uma noite a 4 °C. No dia seguinte a placa foi lavada três vezes com PBS, cada poço foi bloqueado com 300 ΐ) de BSA 1%/PBS e a placa foi incubada por 2 horas a 37 °C . Após o bloqueio, a placa foi lavada três vezes com PBS. A curva-padrão foi preparada com o ChromPure Mouse IgG, Fab fragment (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) na concentração inicial de 0,01 g/mL e diluição seriada 1/2 com BSA 1%/PBS. O extrato bruto contendo fragmentos Fab também foi diluído na concentração apropriada em BSA 1%/PBS. A placa foi incubada por 1 hora a 37 °C e depois lavada três vezes com PBS. Foram adicionados 100 Σι por poço do anticorpo conjugado Peroxidase-conj ugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluído 1/7.000 em BSA 1%/PBS e incubados por 1 hora a 37 °C. A placa foi lavada três vezes com PBS. Foram adicionados em cada poço 100 L da solução reveladora [10 mL de tampão de acetato/ácido cítrico 0,1 M pH 6,0 (1,36 g de acetato de sódio em água qsp 100 mL, pH acertado para 6,0 com ácido cítrico 100 mM) ; 100 L de 3, 3', 5,5'- tetrametilbenzidina (TMB) a 1% em dimetilsulfóxido (DMSO) ; 1,5 .μ-L de água oxigenada] e a placa foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz. A reação foi interrompida com 50 L de H2S04 4,7 N e então foi feita a leitura da absorbância a 450 nm usando o leitor de placas (Labsystems iEMS Analyzer) e software Génesis Lite (Labsystems and Life Sciences International UK LTD.) .
Etapa 6) - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage display Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel ao antígeno pelo teste de ELISA.
Os extratos brutos dos quatro clones foram usados para analisar a ligação dos fragmentos Fab pela digoxina através do teste de ELISA, como descrito anteriormente (Fase 5.1), com algumas alterações. A sensibilização foi feita com Dig-BSA e BSA (controle negativo) na concentração de 4 g/mL. Em uma placa auxiliar, foram colocados 260 μL do Fab solúvel no Io poço de cada coluna e os demais foram preenchidos com 130 de BSA 1%/PBS. Foi feita uma diluição seriada 1/2 ao longo da coluna. Foram transferidos 100 μL de cada poço para a placa sensibilizada. 0 anticorpo conjugado utilizado foi Peroxidase-conj ugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluído 1/8.000. Um ensaio semelhante foi feito com o anticorpo monoclonal anti -digoxina produzido pelo hibridoma.
Fase 6.2 - Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
As eletroforeses foram feitas com géis de poliacrilamida em concentrações que variavam de 7,5% a 12%, com 0,75 mm ou 1,0 mm de espessura dependendo do experimento. As amostras foram diluídas em PBS quando necessário e preparadas com tampão de amostra com ou sem agente redutor ( β -Mercaptoetanol ) . Os marcadores de massa molecular utilizados foram o Low Molecular Weight Calibratíon Kit . for SDS Electrophoresis (Amersham Biosciences UK Limited) e HMW-SDS Marker kit (GE Healthcare) . As amostras foram reduzidas pela incubação por 5 minutos a 100 °C . O sistema utilizado foi o Mini -PROTEAN® Tetra Celi (Bio-Rad) . Os géis foram corados por nitrato de prata ou Corante Azul de Coomassie R250.
Fase 6.3. - Ensaios de Western Blotting
Os ensaios de Western blotting eram sempre realizados após SDS-PAGE de dois géis idênticos. Um gel era corado com nitrato de prata ou Coomassie, funcionando como referência do outro, que era transferido para uma membrana.
Um ensaio foi feito para detectar fragmentos Fab expressos pelos quatro clones. Os extratos brutos dos clones foram aplicados em dois géis de poliacrilamida 12%, que foram submetidos à eletroforese . Em um gel foi realizada a coloração por Coomassie (referência) , enquanto o outro foi transferido para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, EUA) utilizando o sistema Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Celi (Bio-Rad) . O marcador de massa molecular usado no gel transferido foi o Kaleidoscope (Bio-Rad) . A membrana foi bloqueada com leite desnatado 10%/PBS, lavada 3x com Tween 0,1%/PBS e incubada com o anticorpo conjugado Peroxidase-conj ugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F (ab' ) 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluído 1/20.000, por 1 hora a 37 °C . A revelação foi feita com o kit Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) . Para analisar a ligação dos fragmentos Fab pela digoxina, foi feito um ensaio para cada um dos quatro clones, aplicando Dig-BSA e BSA em dois géis de poliacrilamida 7,5%, que foram submetidos à eletroforese . Em um gel foi realizada a coloração por nitrato de prata (referência) , enquanto o outro foi transferido para uma membrana de PVDF, como descrito anteriormente. Após o bloqueio, cada membrana foi incubada com o extrato bruto de um dos clones por 1 hora a 37 °C. A imunodetecção e a revelação foram feitas utilizando os mesmos reagentes e condições já mencionados.
Fase 6.4. - Análise de afinidade no BIAcore* T100
O ensaio de ligação dos fragmentos Fab presentes nos extratos celulares pelo antígeno foi realizada usando do BIAcore'5' T100 (GE Healthcare) por ressonância plasmônica de superfície (SPR, surface plasmon resonance) . O conjugado Dig-BSA, usado como ligante, foi diluído em tampão acetato pH 4,0 numa concentração de 50 pg/mL. A imobilização foi feita em um chip sensor revestido por carboximetil dextrana, tipo CM5 (GE Healthcare) pelo método de amine coupling (ligação covalente com a dextrana contida no chip), com alvo de 10.000 RU, usando os reagentes do kit de imobilização covalente [ 1 -ethyl -3 - ( 3 - dimethylamino-propyl ) carbodiímide hydrochloride (EDC) , N- hydroxysuccinimide (NHS) , ethanolamine-HCl pH 8,5] (GE Healthcare) e tampão HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 0,05% pH 7,4) como tampão de corrida. Os fragmentos Fab dos extratos brutos foram quantificados por ELISA (item 3.5.1), diluídos em tampão HBS-EP a 2 g/mL e usados como analito no ensaio de ligação com o conjugado Dig-BSA imobilizado no chip. O ensaio foi feito com fluxo de 15 pL/min, com tempo de 40 s de contato do analito na superfície, e 40 s de dissociação. A regeneração foi feita com NaOH 50 mM por 60 s num fluxo de 30 L/min.
Os resultados do método acima relacionado e detalhado podem ser assim definidos:
Resultado 1 - Obtenção e caracterização do conjugado Dig- BSA
A digoxina foi conjugada à albumina sérica bovina (BSA) para ser utilizada no enriquecimento da biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti -digoxina por panning e nos ensaios de ligação ao anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma anti -digoxina e aos fragmentos Fab produzidos pelos clones.
0 número de resíduos de digoxina para cada molécula de BSA foi estimado em 5,8 e foi calculado conforme descrito na fase 1.2. A concentração de proteína obtida pelo método de Bradford foi de 10 mg/mL.
Foi feito um teste de ELISA para verificar a ligação do conjugado Dig-BSA ao anticorpo monoclonal anti-digoxina . 0 conjugado foi imobilizado nas concentrações de 1 , 2, 4 e 8 ug/mL em uma microplaca e o sobrenadante do cultivo do hibridoma anti-digoxina foi diluído seriadamente com fator de diluição 2 e aplicado como anticorpo primário. O anticorpo secundário utilizado foi o anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase . A Figura 6 mostra as absorbâncias obtidas a 450 nm em função da diluição do sobrenadante do hibridoma para cada concentração do antígeno. 0 anticorpo monoclonal apresentou o mesmo perfil de ligação ao conjugado Dig-BSA nas quatro concentrações do antígeno.
Resultado 2 - Obtenção e purificação do anticorpo monoclonal anti -digoxina
0 anticorpo monoclonal anti -digoxina , presente no sobrenadante do cultivo do hibridoma, foi purificado para ser utilizado como referência em parte dos ensaios de ligação ao conjugado. As células do hibridoma anti-digoxina foram cultivadas em dois frascos contendo 400 mL e 300 mL de meio, nas concentrações de 0,74xl06 cél/mL com 98% viabilidade e de 0,94xl06 cél/mL com 97% viabilidade, respectivamente. Após a purificação por cromatografia de afinidade pela proteína A, o eluato foi concentrado e analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% na forma reduzida por β-ΜΕ e não reduzida (Figura 7) . Podemos observar uma única banda na amostra não reduzida (canaleta 1), representando o anticorpo inteiro. Na amostra reduzida é possível visualizar as duas bandas características representando as cadeias leve e pesada de IgG. Pode-se visualizar ainda uma banda fraca correspondente à IgG não reduzida.
0 anticorpo monoclonal anti-digoxina purificado foi usado também para padronizar a concentração da Dig-BSA imobilizada nos testes de ELISA. Foram imobilizadas concentrações do antígeno de 0,5 a 10 yg/mL e a IgG purificada foi usada como anticorpo primário, com concentração inicial de 5500 ng/mL. O anticorpo secundário utilizado foi o anti -IgG de camundongo conjugado com peroxidase, diluído 1/10.000. Na Figura 8 é apresentado o perfil de ligação da anti -digoxina para 6 concentrações de Dig-BSA. A concentração de 4 g/mL foi escolhida para a imobilização da Dig-BSA e da BSA em todos os testes de ELISA.
Resultado 3 - Construção da biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti -digoxina
A construção da biblioteca combinatória foi iniciada com a obtenção dos repertórios dos genes da LC e da HC a partir do hibridoma anti -digoxina , seguida por clonagem sequencial desses genes no vetor pComb3X.
Células do hibridoma anti -digoxina na concentração de 0,95xl06 células/mL, com 96% viabilidade, foram utilizadas para a extração do RNA total das células. Após a extração do RNA total a concentração obtida foi de 2,6 pg/mL e a razão A260/A280 foi de 1,93. 0 cDNA sintetizado através de transcrição reversa do mRNA foi utilizado para amplificar genes da LC e HC, usando oligonucleotídeos iniciadores específicos de genes para imunoglobulinas murinas da LC (κ) e porção Fd (VH e CHI) da HC (γΐ) . Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram analisados através da eletroforese em gel de agarose 1,5% (Figura 9) . A amplificação dos genes da HC está representada na Figura 9A, onde se pode observar que o cDNA não foi amplificado usando o oligonucleotídeo 1A+1B (canaleta 1); os oligonucleotídeos 2A, 2B, 2C apresentaram uma banda de aproximadamente 650 pb (canaletas 2, 3 e 4), os oligonucleotídeos 3A, 3B+3C apresentaram uma banda de aproximadamente 750 pb (canaletas 5 e 6) e o oligonucleotídeo 3D não amplificou (canaleta 7) . Na amplificação dos genes da LC (Figura 9B) , pode-se observar que houve amplificação usando os oligonucleotídeos kl e k3 , que apresentaram bandas de aproximadamente 700 pb (canaletas 1 e 3) e κ6, que apresentou banda de aproximadamente 600 pb (canaleta 6) . Após a análise por eletroforese, os fragmentos de DNA da LC e HC foram separadamente misturados, formando os repertórios de genes da LC e HC. Estes repertórios foram clonados sequencialmente no vetor para a construção da biblioteca combinatória .
0 repertório de genes da LC foi o primeiro a ser clonado no vetor pComb3X para a construção da biblioteca LC . A biblioteca LC foi construída através de dupla digestão do repertório de genes LC e do vetor pComb3X com enzimas de restrição Saci e Xbal seguido de eletroforese em gel de agarose 1% para extração e purificação das bandas e ligação dos mesmos. A biblioteca obtida foi transformada em E.coli XLl-Blue. O seu tamanho foi estimado em 3xl05 clones. Foram escolhidos 10 clones ao acaso para extração do DNA e a presença do inserto LC foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%, após digestão com as enzimas de restrição Saci e Xbal. Dos 10 clones analisados, apenas o clone 8 não apresentou uma banda de aproximadamente 700 pb, correspondente ao inserto LC (Figura 10) . De acordo com a amostragem que foi analisada, 90% dos: clones da biblioteca LC apresentou o inserto LC. A biblioteca LC foi amplificada para a clonagem do repertório de genes HC neste vetor e obtenção da biblioteca combinatória de fragmentos Fab.
A biblioteca LC e o repertório de genes da HC foram duplamente digeridos com as enzimas de restrição Spel e Xhol e submetidos à eletroforese . As bandas foram extraídas, purificadas e ligadas para a obtenção da biblioteca combinatória. A biblioteca obtida teve o tamanho estimado em 5 x IO6 clones. Foram escolhidos 10 clones ao acaso para verificar a presença dos insertos HC e LC pela digestão com enzimas de restrição específicas. Após eletroforese em gel de agarose, verificou-se que, dos 10 clones analisados, 6 apresentaram bandas de aproximadamente 700 pb, relativas aos insertos HC (Figura 11A) e LC (Figura 11B) . Os 10 clones selecionados também foram digeridos com a enzima de restrição BstNI para analisar a diversidade da biblioteca combinatória obtida. Observando os 6 clones que apresentaram os dois insertos, não foi possível notar diferenças aparentes no padrão de restrição entre os clones.2, 3, 6, 8 e 10 (Figura 12) . O clone 4 apresentou um perfil diferente dos demais.
Os seis clones que apresentaram os genes LC e HC foram sequenciados. A partir das sequências nucleotídicas obtidas de cada clone, foram deduzidas as sequências de resíduos de aminoácidos e foram detectados códons de parada nos genes da LC de todos os clones analisados, indicando que nenhum dos clones era funcional, todos eram pseudogenes . O clone 3 também possuía um códon de parada no gene; da HC. Os clones 2, 6, 8 e 10 apresentaram sequências de aminoácidos idênticas na HC. 0 clone 4 possuía um resíduo de ácido glutamico (E) na região CDR2 , enquanto os demais possuíam uma lisina (K) (dados não mostrados) . Essa biblioteca foi utilizada para o prosseguimento dos experimentos.
Resultado 4 - Phage display e enriquecimento da biblioteca Fab anti -digoxina
A biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti -digoxina obtida pela clonagem sequencial dos repertórios de genes da LC e HC foi enriquecida após algumas rodadas de phage display e panning, que selecionaram os fagos expondo fragmentos Fab ant i -digoxina através da ligação ao antígeno Dig-BSA.
Os fagomídeos da biblioteca foram transformados em células E. coli XLl-Blue, que foram infectadas pelo fago auxiliar VCSM13. Os fagos expondo anticorpos foram recuperados da cultura e selecionados em rodadas de panning com Dig-BSA imobilizada em placa.
O número de UFC antes e após seleção com o antígeno foi calculado em cada rodada, para estimar o fator de enriquecimento da biblioteca. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.
Um aumento de cerca de 36 vezes no fator de enriquecimento pode ser notado na segunda rodada e apenas cerca de 1 vez na terceira rodada, indicando que duas rodadas de pan ing foram suficientes para obter o enriquecimento da biblioteca Fab anti -digoxina .
Tabela 2 - Títulos dos fagomídeos antes e depois de cada rodada de panning e determinação da eficiência do panning (% ligação) e do enriquecimento da biblioteca a: número de UFC de fagomídeos incubados com Dig-BSA.
b: número total de UFCs de fagos contidos nos eluatos c: (fagos depois do panning / fagos antes do panning) x
100.
d: Enriquecimento da biblioteca comparado à rodada anterior de panning.
Figure imgf000053_0001
Após a terceira rodada de panning, 10 clones foram selecionados aleatoriamente e a presença dos insertos HC e LC foi verificada através da digestão com as enzimas de restrição e analisada por eletroforese em gel de agarose 1%. Dos 10 clones analisados, 6 apresentaram os dois insertos (Figura 13A e 13B) . Esses 10 clones também foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% após a digestão com a enzima de restrição BstNI para verificar a diversidade da biblioteca. Observando os 6 clones que apresentaram os dois insertos, não foi possível notar diferenças aparentes no padrão de restrição entre os clones 1, 2, 5, 9 e 10 (Figura 14) . O clone 3 apresentou um perfil diferente dos demais clones.
Os clones que continham os insertos HC e LC (clones 1, 2, 3, 5, 9, 10) foram analisados por sequenciamento dos genes HC e LC. As sequências dos aminoácidos deduzidos foram alinhadas usando o programa ClustalW2. A numeração dos aminoácidos e dedução dos CDRs teve como base o esquema de Kabat et al . (1991) . Todos os clones apresentaram sequências de aminoácidos idênticas na HC . A análise do sequenciamento da LC revelou que o clone 3 era um pseudogene e ao compararmos sua sequência nucleotídica com sequências depositadas no GenBank utilizando o programa BLASTn, encontramos 100% de identidade com o gene Mus musculus immunoglobulin aberrantly rearranged kappa chain mRNA, partial sequence (GenBank: U56414.1) . Os clones 5 e 10 apresentaram sequências de aminoácidos da LC idênticas.
0 clone 9 possui um resíduo de glutamina (Q) , na posição 54 da região CDR2 da LC, enquanto os outros clones possuem uma arginina (R) . Os clones 1, 2, 9 e 10 apresentaram variações na sequência de aminoácidos da região do frameworkl (Figura 15) .
As sequências dos aminoácidos deduzidos da LC e HC dos clones 1, 2, 9 e 10 foram analisadas quanto à homologia pelo programa BLASTp, comparando com sequências depositadas no GenBank. As sequências que apresentaram maior identidade com os clones estão apresentadas na Tabela 3 (LC) e Tabela .4 (HC) , em porcentagem de identidade (quantidade de aminoácidos idênticos/quantidade de aminoácidos totais das sequências) . Comparando os CDRs da LC, observamos mais de 77,8% de identidade em todos os CDRs, chegando o CDR2 dos clones 1, 2 e 10 a apresentarem 100% de identidade com as três sequências encontradas
(Tabela 3) , enquant) CDRs da HC dos clones apresentaram porcentagens mais baixas de identidade com as sequências encontradas, ficando abaixo de 80%, chegando a apenas 18,2% de identidade no CDR3 em uma das sequências (Tabela 4) . Tabela 3 - Análise de homologia da LC dos fragmentos Fab dos quatro clones anti -digoxina utilizando BLASTp .
LC kappa IgM MP-18-3-117 [Mus musculus]'1»
Identidade CDR I CDR2 CDR3
Clone 1 96% (149/156)
Clone 2 92% (144/157) 90,9% (10/11 ) 100% (7/7) 88,9% (8/9)
Clone 10 92% (159/172)
Clone 9 95% (164/173) 90,9% (10/11 ) 85,7% (6/7) 88,9% (8/9)
LC AcMo aglutinador [Mus musculus]'2'
Identidade CDR CDR2 CDR3
Clone 1 96% (149/156)
Clone 2 91 % (145/160) 81 ,8% (9/11 ) 100% (7/7) 77,8% (7/9)
Clone 10 92% (159/172)
Clone 9 94% (165/175) 81 ,8% (9/11 ) 85,7% (6/7) 77,8% (7/9)
kappa imunoglobulina anti-YGNNV [Mus musculus]'3'
Identidade CDR I CDR2 CDR3
Clones 1 95% (148/ 56)
Clone 2 91 % (143/157) 81 ,8% (9/1 1 ) 00% 88,9% (8/9)
Clone 10 92% ( 58/172)
Clone 9 94% ( 63/173) 81 ,8% (9/11 ) 85,7% (6/7) 88,9% (8/9)
GenBank: AAG12167.1 (não publicado); (2) GenBank : CAA72328.1 (BONG et al . , 1998); (3) GenBank: AAN86781.1 (LAI et al . , 2002) .
Tabela 4 - Análise de homologia da HC dos fragmentos Fab dós quatro clones anti -digoxina utilizando BLASTp
HC, Estrutura Cristalográfica 11-18 Humano Complexado ao Anticorpo de
Referência Murina 125-2h Fab'1'
Identidade CDR1 CDR2 CDR3
86% ( 148/173) 80% (8/10) 58,8% ( 10/17) 27,3% (3/1
HC, Anticorpo Catalítico 4b2 em Complexo com seu Hapteno Amidino l2)
Identidade CDR1 CDR2 CDR3 87% (150/174) 70% (7/10) 64,7% (1 1/17) 18,2% ( 2/1 )
HC, região variável da imunoglobulina anti-TSHr [Mus musculus]'3'
Identidade CDR1 CDR2 CDR3
84% (144/173) 50% (5/10) 70,6% (12/17) 36,4% (4/1 1 )
(1) PDB:2V*T_H (ARGIRIADI et al . , 2009); <2) PDB :
1F3D_H (GONÇALVES et al . , 2 000 ; GOLINELLI -PI PANEAU et al . , 2000); (3> GenBank: AAU816647.1 (COSTAGLIOLA et al . , 2004) .
Resultado 5 - Expressão e caracterização da ligação dos fragmentos Fab anti -digoxina
Os clones 1, 2, 9 e 10, que apresentaram sequências de aminoácidos distintas na região FR1 da LC, foram escolhidos para expressar Fab solúvel usando a linhagem XLl-Blue de E. coli. Para isso, foi necessário remover o gene III do vetor pComb3X de cada clone através da digestão com as enzimas de restrição Spel e Nhel, permitindo que os fragmentos Fab fossem expressados na forma solúvel sem a pIII. As bandas dos vetores (~ 4 kb) foram separados da banda do gene III (612 pb) através de eletroforese em gel de agarose 1% (Figura 16) .
O DNA plasmidial de cada clone foi purificado, transformado em E. coli XLl-Blue e a expressão de Fab solúvel foi induzida pela adição de IPTG. Após a indução, as bactérias foram lisadas por sonicação e os extratos brutos contendo os fragmentos Fab dos diferentes clones foram utilizados nos ensaios de ELISA, Western blotting e SPR.
Inicialmente foi feita a expressão dos fragmentos Fab em 100 mL de meio para verificar a ligação dos anticorpos à digoxina por ELISA e a quantidade de anticorpo expresso por cada clone (dados não apresentados) . Em seguida foi realizada a expressão dos fragmentos Fab em 1 L de meio para obter quantidade de anticorpo para a realização dos ensaios de ligação ao antígeno. Os resultados apresentados neste trabalho referem-se aos fragmentos Fab da. segunda expressão . Um ensaio de Western blotting foi realizado para verificar a expressão dos fragmentos Fab nos extratos brutos dos quatro clones. As amostras não reduzidas do extrato bruto dos clones foram diluídas 1/2, aplicadas em gel de poliacrilamida 12% e submetidas à eletroforese . O gel foi transferido para uma membrana de PVDF, que foi incubada com o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidase . Em todos os clones foi reconhecida uma banda de aproximadamente 50 kDa, correspondente ao tamanho do fragmento Fab e também bandas de 25 kDa, tamanho referente à HC e LC do fragmento Fab, separadamente (Figura 17) .
Após a. confirmação da expressão dos fragmentos Fab nos extratos brutos, foi feito um Western blotting para verificar a ligação do anticorpo anti- digoxina dos 4 clones ao antígeno. O conjugado Dig-BSA e o controle negativo BSA foram aplicados em géis de poliacrilamida 7,5% e submetidos à eletroforese . Os géis foram transferidos para membranas de PVDF, que foram incubadas com os extratos brutos dos 4 clones. 0 anticorpo anti -digoxina presente nos 4 extratos reconheceu uma banda de aproximadamente 67 kDa, correspondendo ao conjugado Dig- BSA, mas não apresentou ligação à BSA, como esperado (Figura 18) .
A concentração dos fragmentos Fab expressados pelos clones foi determinada por ELISA sanduíche, imobilizando o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 em microplacas. o fragmento Fab de car.iundongo foi utilizado para a construção da curva-padrão . As concentrações de fragmentos Fab, após a segunda indução, foram calculadas a partir da curva-padrão, resultando em: clone 1 - 6,67 g/mL, clone 2 - 10,08 pg/mL, clone 9 - 0,61 pg/mL e clone 10 - 1,73 pg/mL. O clone 9 apresentou o menor rendimento entre os clones.
A ligação dos fragmentos Fab dos diferentes clones ao antígeno foi analisada por ELISA. O conjugado Dig-BSA e a BSA (controle) foram imobilizados a 4 pg/mL em microplacas, incubados com os extratos brutos contendo os fragmentos Fab dos clones, diluídos serialmente 1/2 com concentração inicial de 50 ng/mL, e incubados com anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado à peroxidase . Os valores das absorbâncias foram plotados em gráfico em função da titulação das concentrações dos fragmentos Fab dos clones. Os resultados mostram ligação específica dos quatro clones â Dig-BSA, sem evidência de ligação à BSA (Figura 19) .
Pelos resultados dos imunoensaios não foi encontrada diferença de ligação entre os quatro fragmentos Fab, quando analisados em relação ao antígeno. O ranqueamento foi possível através da análise por SPR no BIAcore°, um sistema que apresenta alta sensibilidade para análises de interações biomoleculares em tempo real. Este sistema mede a alteração do ângulo do índice de refração conforme a massa da molécula presente na superfície de um chip .
Antes de realizar o ensaio de ligação, foi verificada a ausência de ligação inespecífica dos fragmentos Fab â dextrana contida na superfície do chip. Após o teste acima, o conjugado Dig-BSA foi imobilizado no chip com alvo de 10.000 RU e teve como resultado final a densidade de proteína imobilizada de 9.259,8 RU. Os extratos brutos dos quatro clones, contendo os fragmentos Fab na concentração de 2,0 g/mL, foram aplicados nas canaletas do chip, interagindo com a Dig-BSA e gerando uma resposta, medida em unidades de ressonância (RU, ressonance units) . As RUs, medidas 5 segundos após o término da aplicação dos fragmentos no chip imobilizado com Dig-BSA foram: clone 1 - 495,9 RU; clone 2 - 476,3 RU; clone 9 - 206,9 RU; clone 10 - 1.023,5 RU (Figura 20) . O clone 9, que possui em sua sequência de aminoácidos deduzidos, um resíduo de aminoácido diferente na região CDR2 da LC em relação aos demais clones, apresentou a resposta mais baixa entre os clones analisados. Os quatro clones diferem entre si nas sequências de aminoácidos na região FR1 da LC .
Restou provado que o método permitiu a obtenção de fragmentos Fab do anticorpo monoclonal :anti- digoxina pela utilização da tecnologia de phage display. Após o enriquecimento da biblioteca de fagos, 10 clones foram selecionados aleatoriamente e destes, 6 apresentaram os insertos LC e HC e tiveram as regiões dos genes LC e HC analisadas por sequenciamento. Quatro clones apresentaram diferenças na sequência de aminoácidos da LC, todos na região do framework 1. Esses clones foram expressados e apresentaram ligação ao antígeno Dig-BSA, em ensaios de ELISA, Western blotting e SPR. Nenhum dos clones apresentou ligação a BSA isolada. A tecnologia de phage display tem apresentado muitas vantagens, como a seleção de anticorpos monoclonais a partir de biblioteca de genes variáveis humanos (MARKS et al . , 1991) e identificação de marcadores terapêuticos -in vivo (ARAP, 2005) . Fragmentos Fab podem ser expressados em Escherichia coli em grandes quantidades e a tecnologia de DNA recombinante fornece a oportunidade para a introdução de mutações que podem otimizar o Fab, aumentando a quantidade expressada, estabilidade, solubilidade e facilitando a humanização e a maturação de afinidade (KWONG, RADER, 2009) .
A quantidade de Fab obtida por litro de cultura em E. coli depende principalmente da sequência de aminoácidos do Fab (KWONG, RADER, 2009) e, portanto, pode variar entre clones.
Para a expressão de proteínas solúveis em E.coli XLl-Blue utilizando o vetor pComb3X, foi preciso remover o gene III do vetor e com isso, a cauda de histidina que possibilitaria a purificação por cromatografia de metais quelados foi perdida.
Apesar desta desvantagem, esta estratégia foi escolhida por permitir a obtenção do fragmento Fab isolado, sem a necessidade da retirada da cauda de histidina após a expressão. Desta forma, o método de purificação deverá levar este aspecto em consideração. Metodologias convencionais como ELISA e Western blotting confirmaram a especificidade da ligação dos fragmentos Fab ao antígeno Dig-BSA, mas não foram capazes de discriminar diferenças entre as ligações dos 4 clones. Uma técnica mais poderosa e sensível como a SPR permitiu mostrar diferenças e classificar os
®
clones. BIAcore e um sistema que apresenta alta sensibilidade para análises de interações biomoleculares em tempo real . SPR mede a alteração do ângulo do índice de refração conforme a massa da molécula presente. A detecção ocorre na superfície de um chip, onde é imobilizado um ligante. O analito passa através de canais do chip, interagindo com o ligante e gerando uma resposta, medida em unidades de ressonância (RU, resonance units) (SCHASFOORT, TUDOS, 2008) . A resposta relativa não pode ser medida durante a aplicação do analito, pois pode haver uma alteração do índice de refração provocada pelo extrato bruto na superfície (efeito de bulk) , e não uma interação específica entre ligante e analito. Esta diferença é anulada quando a resposta relativa é medida após 5 segundos do término da injeção do analito. Uma célula de fluxo contendo- BSA imobilizado como referência foi utilizada para análise de ligação dos clones anti -digoxina , com resultado negativo. O ensaio indicou diferenças na ligação entre os clones anti -digoxina e o antígeno, com resultados variando de 206,9 RU a 1023,5 RU. O clone 9, que possui uma glutamina (Q) substituindo uma arginina (R) na posição 54 na região CDR2 da LC, apresentou a ligação mais baixa entre os clones analisados. 0 clone 10 apresentou a maior afinidade de ligação, enquanto os clones 1 e 2 apresentaram afinidade intermediária e semelhante entre si . Os clones obtidos por phage display apresentam afinidade de ligação maior que a obtida pelo anticorpo original produzido pelo hibridoma murino que deu origem ao trabalho.
Acredita-se, desta forma, que o invento em questão possibilita gerar fragmentos Fab anti -digoxina monoclonais com maior afinidade e especificidade do que os policlonais fornecidos pelo soro de animais. A tecnologia de phage display foi usada para atingir este objetivo. Fragmentos Fab monoclonais obtido com o presente método representam potencial de um produto com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1) wMÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE VARIÁVEIS DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI -DIGOXINA A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR" caracterizado pelo método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti-digoxina, utilizando a tecnologia de clonagem em biologia molecular por "phage display' e a caracterização da sua ligação ao antígeno, compreender as seguintes etapas:
Etapa 1) - Obtenção e caracterização de albumina bovina conjugada com digoxina (Dig-BSA)
Fase 1.1 - Obtenção dos conjugados Dig-BSA;
Fase 1.2 - Caracterização dos conjugados Dig-BSA;
Etapa 2) - Obtenção do anticorpo monoclonal anti-digoxina; Fase 2.1 - Purificação do anticorpo monoclonal anti- digoxina;
Etapa 3) - Construção da biblioteca de Fab no fagomídeo pComb3X a partir de hibridomas anti-digoxina
Fase 3.1 - Obtenção de cDNA dos hibridomas anti-digoxina; Fase 3.2 - Amplificação dos genes da LC e da porção Fd da HC;
Fase 3.3 - Obtenção de células competentes e vetor;
Fase 3.4 - Clonagem do repertório de genes LC no vetor pComb3X;
Fase 3.5 - Clonagem do repertório de genes HC na biblioteca LC;
Etapa 4) - Phage display e enriquecimento da biblioteca Fab;
Fase 4.1 - Preparação de fago auxiliar (helper phage);
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab anti-digoxina (phage display) ;
Etapa 5) - Expressão de fragmentos Fab solúveis;
Fase 5.1 - Quantificação dos fragmentos Fab solúveis por
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sanduíche;
Etapa 6) - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage display
Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel ao antígeno pelo teste de ELISA;
Fase 6.2 - Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ;
Fase 6.3. - Ensaios de Western Blotting;
Fase 6.4. - Análise de afinidade no BIAcore* T100.
2) "MÉTODO" , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo método extrair RNA total dos hibridomas anti-digoxina e amplificar os genes da LC e da HC, porção Fd (VH e CHI) das imunoglobulinas por PCR.
3) "MÉTODO" , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo enriquecimento da biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-digoxina por panning e nos ensaios de ligação ao anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma anti-digoxina e aos fragmentos Fab produzidos pelos clones compreender que a digoxina é conjugada à albumina sérica bovina (BSA) .
4) "MÉTODO " , de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo método selecionar os clones de anti- digoxina através da ligação com o antígeno. 5) "MÉTODO " , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo método expressar fragmentos Fab solúveis de anti -digoxina .
6) "MÉTODO" , de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelas concentrações de fragmentos Fab resultarem em: clone 1 - 6,67 g/mL; clone 2 - 10,08 yg/mL; clone 9 - 0,61 g/mL e clone 10 - 1,73
Figure imgf000073_0001
7 ) "MÉTODO" , de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ocorrer ligação específica dos quatro clones à Dig-BSA, sem evidência de ligação à BSA.
PCT/BR2013/000164 2012-05-15 2013-05-15 Método de produção e obtenção de variáveis de fragmento fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina a partir da técnica de clonagem em biologia molecular. WO2013185193A1 (pt)

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