BR102012011493A2 - Método de produção e obtenção de fragmento fab do anticorpo anti-digoxina monoclonal a partir da técnica de clonagem em biologia molecular - Google Patents

Abstract

Método de produção e obtenção de fragmento fab do anticorpo anti-digoxina monoclonal a partir da técnica de clonagem em biologia molecular, mais precisamente, a presente patente de invenção trata de método para produção e obtenção de clones do fragmento fab do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia de 'phage display' e a caracterização da sua ligação ao antígeno; a presente inovação se dedica ao desenvolvimento de produto para uso terapêutico com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.

Description

"MÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE VARIÁVEIS DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO MONOCLONAL ΑΝΤΙ-DIGOXINA A PARTIR DA TÉCNICA DE PHAGE DISPLAY" .

CAMPO DE APLICAÇÃO A presente patente de invenção trata de método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo antí--digoxina utilizando a tecnologia de spk&ge áisplay' e a caracterização da sua ligação ao antígeno; a presente inovação se dedica ao desenvolvimento de produto para uso terapêutico com potência especificei e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

De uma forma geral , a digoxina é um fármaco utilizado no tratamento de distúrbios cardíacos. É um digitãlico, ou seja., iam gliçosídea cardiotônico, e é proveniente da planta Digitalis lanmta, Tem efeito inotrópico positivo·, ou seja, aumenta a força de cantra.çáo .cardíaca. Seu modo de ação se dá por meio da ligação reversível à Nâ.:V KlATPase ■ Ao inibi-la, .a digoxina aumenta a, quantidade de sódio no cardiomõcito. Isto vai estimular a bomba de sódio-cálcio (troca 3 Na* por 1 Ca 2') a -expulsar sódio em troca de cálcio,. O aumento consequente de cálcio no interior da célula provoca um aumento de excitabilidade do cardicmiócitoproduzindo um aumento da co.ntr.acti!idade cardíaca. A. digoxina possui uma j anela, terapêutica estreita, com nível terapêutico muito próximo ao nível tóxico. Para combater seu efeito tóxico, podem ser ut il-iz-adoe. fragmentos Pab cie anticorpo ppl iclonal ant-i-digoxina .que estão disponíveis coniercíalmente.

De uma forma mais. específ iça, .a. digoxina é o glicosíde© cardíaco, mais usado no trct.atnep.co de falência cardíaca congestiva e £ibr-ilaçSo. atrial (Figura 1) . Os digital.ícos, grupo- ao qual a digoxina pertence, são os compostos mais antigos na medicina cardiovascular que continuam em uap em práticas clínicas contemporâneas {SICMHDRN, GHEOR-GBIftDS, 20 0-2} . Pesquisas e -experiências com a digoxina iniciaram bã mais de %O:Q. anos (WX.tkbr:NG,. 1,78-5) e tuas aplicações e.m pacientes com .falência sarclíaca -foram descritas apenas no- século 2-0, definindo sua capacidade de aumentar a .contratilidade do coração, A digoxina se liga ao sítio de ligação para, glicosldeos cardíacos, presente, na sub unidade α da enzima N:a+ K+-ATPas-e,, também conhecida como bomba de sódio-potássio, inibindo sua atividade, Esta proteína de membrana ê responsável pelo transporte de? sódio para o meio- extracelular e ao ser inibida, gera um aumento do sódio intracelular. Este aumento estimula o intercâmbio pela bomba de sódio-cálcio, aumentando a concentração do cálcio intracelular, utilizado pelas proteínas contrateis. Como consequência ocorre aumento da contração no miocárdio (EICHHORN, GHEGRGHIADE, 2002). .Sua .aplicação em falência cardíaca foi aprovada em ISSS pela Food- and Itrwg Admínostration. (PDA) . Seu .us.o diminuiu com o aparecimento de novas terapias, como p-bloqueadore-s, blaqueadores de receptor- da angiotensina (ARBs, angi od&npin receptor .bíoc/cere) , bloqueadores de a-ldosterona e terapia de resineroni zaçã-o cardíaca. (CRT,. cardíac resynchroniza tion therapy) , Contudo, ainda é usada em cerca de 30% dos pacientes com falência cardíaca. É uma droga de baixo custo, sendo importante em países em desenvolvimento onde os pacientes não têm acesso a terapias sofisticadas (GHEORGHIADE et al , 2006), A concentração da digoxina no soro não depende apenas da dose administrada, mas também está relacionada com interações com outras medicações e às condições do paciente (ANTMAN, SMITH, 1985) . A incidência de intoxicação coro digoxina aumenta em situações onde a excreção da digoxina pelos rins é impedida (SMITH; BUTIiER; haber, 1:9 7.0;) , Doses toxicas de digoxina podem acarretar êirritmias graves e fatais (EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002), O uso de digi-t áli cos tem sido facilitado pela geração de anticorpos, usados para monitorar as concentrações droga no· soro de pacientes., com a finalidade de manter níveis seguros. A digoxina não é antigênica por ser uma molécula pequena {780,92 Daltons} e precisa ser ligada cova1entemente a proteínas imunogênicas apropriadas (carreadores) para produzir anticorpos específicos anti-digoxina. A digoxina foi conjugada a BSA 'em 1567, para obtenção de anticorpos específicos em coelhos (BUTLER, CHEN, 1967). Em 1970, Smith et al. documentaram a. alta afinidade e especificidade de populações de anticorpos selecionados para haptenos de glicosídeos cardíacos.

Fragmentos ;Fab {Fragment antigen hinding) de anticorpos específicos para digoxina obtidos em ovelhas demonstraram habilidade de reverter intoxicações pela digoxina (SMITH et al. , 1976) . Um estudo realizado." em cães mostrou que a administração intravenosa da porção purificada do fragmento Fab de anticorpos poli c lona is anti -digoxma de ovei tia pode rapidamente reverter a cardiotoxicidade, ligando-se à digoxina livre no plasma e fazendo a redistribuição da droga dos tecidos, de volta para a circulação sanguínea. Os fragmentos Fab são excretados relativamente rápidos pela urina., por isso o.s fragmentos Fab de alta afinidade, que retêm, ligação com·, a droga, podem fornecer uma rota de eliminação da droga., assim como meio de neutrallssá- la (BUTXtER et a!. , 1977) . Terapias com. potássio e agentes biogueadores beta adrenérgicos têm sido usados como alternativa para., combater a intoxicação digitál.ica, mas a. administração de fragmentos Fab de anticorpos é a principal terapia, .para reverter a intoxicação (AWTMAN et al. , 1990), Pm estudo retrospectivo·.., com. 141 pacientes intoxicados pela .digoxina, avaliou os resultados de 6:.6 pacientes tratados com fragmentos Fab e sugeriu seu uso como terapia de primeira linha tônica, pela baixa taxa de mortalidade dos pacientes tratados pelos fragmentos CLAPOSTObLE et al . , 2:0-0:8:) . O fragmento· Fab do anticorpo, policlonal anti-digoxír,a gerado etn ovelha está, sendo fabricado· somente por .uma empresa (.Protherac:a)com. o nome de GigíPab, tendo recebido aprovação do PDA em 2001.

No Brasil o anticorpo anti-digoxina Fab pode. ser importado conforme a Resolução RDC n' 28, de. 09 de mal© de 2008 da. Agência Nacional de Vigilância Sanitária que autoriza, a importação, dos medicamentos constantes na lista de medicamentos liberados .em. caráter excepcional destinados unicamente, a uso hospitalar ou sob prescrição médica, cuja importação esteja vinculada a uma determinada entidade hospitalar e/ou entidade civil representativa, para seu uso exclusivo, .não se destinando à .revenda ou ao comércio·, O· uso de fragmentos p-ab em, casos de intoxicação ' por digoxina é seguro e efetivo., porém a neutralização com fragmentos Fab é uma terapia cara, sendo utilizada apenas guando outras opções de tratamento parecem: falhar. Seu alto custo também limita sua disponibilidade a todos os hospitais ou países. (ANDRÉS, 2000; FLANAGAN, JONES, 2004}. A saber, os anticorpos são. glâcoproteínas formados por duas .cadeias leves {LC, light chain) idê-ntica.s de aproximadamente 24 kDa cada, e du.as cadeias pesadas (HC, heavy Chain) idênticas de 55 a 70 kDa cada. Lima cadeia leve está ligada covalentemente a uma cadeia pesada por uma ponte dissulEeto, enquanto· as duas .cadeias pesadas estão ligadas. entre si por pontes dissulfeto., As., "regiões carboxiterminais das cadeias pesadas exercem .funções efetoras. As cadeias leves .e. pesadas possuem, uma região- aminoterminal. variável (VL, variablm light e VH, variabie heawy.) que participa no reconhecimento dos antí-genos., Cada região- variável da-s cadeias leves e pesadas contém tris regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDF.s, complementaríty determiníng régions) , nomeadas a partir da porção aminoterminal, de: GDR1, ÇDR.2 e CDR3, sendo CDR3 a mais variável (ABBAS, LICHTMAN, 2005). Entre essas regiões estão presentes sequências mais conservadas chamadas de arcabouço ou framework regi ons ·. FRl, FR 2, FR3 e FR4 (TGNEGAWA, 1983). Os camundongos possuem duas famílias de genes da cadeia leve, a lambda λ) e kappa (k) que se diferenciam, por .suas regiões constantes. A cadeia λ constituí apenas 5% do total de genes da cadeia leve, além de ser muito' menos heterogênea do que a cadeia, x. ou cadeia pesada. (.TONEGAWA, 198:31 . A região constante da cadeia pesada, se divide em 5 ciasses, IgG; IgA; IgM; IgP. e igE., A IgG, cora peso molecular de 153 kDa, é a mais abundante no soro de mamíferos. Nos humanos é subdividida em IgGl, I gG2, lgG3 e XgG4... A .IgGl. é a roais encontrada no soro humano (ftBBAS, LICHTMAN, 2005) e possui estrutura bem definida., com duas pontes dissulfeto unindo as cadeias pesadas na região da dobradiça (entre CH.l e. CH2) . 3m 1975, :Kohler e Milstein desenvolveram, a tecnologia de produção· de anticorpos monoclonais (AcMos) , que lhes rendeu o Nobel de Fisiologia e Medicina em 1984. A técnica consiste na geração de hibridomas, que são células originárias da fusão de células mielêmicas, com capacidade de reprodução indefinida, aos linfócitos B retirados do baço de um animal previamente imunizado, que secretam anticorpos (KÕHIER, MILSTEIN, 1975), Em 1985, foi aprovado pelo PDA o primeiro AcMo para uso terapêutico em humanos (0KT3). Anticorpos terapêuticos e seus fragmentos, obtidos por todas as tecnologias disponíveis representam o mercado mais promissor entre os biofármacos movimentando em 2009 nos EUA, $16,S 21 bilhões tftGQARWAb, 2010;) . Muitos anticorpos raonoclonais murinos têm sido produzidos para .tratamento ou diagnóstico de doenças humanas. Contudo, seu uso é limitado por apresentar meia-vida curta no soro e devido a sua alta imunogeni cidade, podendo gerar uma reação conhecida como humar. anti ~ muuse antibody (HAMA) . Para superar esses· problemas, Iniciou--se a·, busca para gerar anticorpos menos imurogênicos como os quiméricos, humanizados, totalmente. .humanos e os fragmentos de.· anticorpos {MORO, RODRIGUES, 200.1.) .

Os fragmentos de ant.icorpos são mais vantajosos para algumas aplicações clínicas que não. •dependem de anticorpo· inteiro. Mantêm os sítios de ligação ao antígeno, sío menos ' inmnogênicoa. do que o IgG inteiro, se difundem melhor no espaço intersticial, são facilmente eliminados via filtração glome.rular e são mais estáveis em. estoques do que o IgG (FLANAGAN, JONES, 2004) , Podem ser obtidos pela digestão da imunoglcfoulina com a enzima pepsina que produz dois fragmentos Pab ligados, por ponte dissulteto, P{ab')2 divalente, com peso aproximado de 110 kDa e porção Fc fragmentada, ou pela a enzima papaína que produz dois fragmentos Fab, monovalentes, com peso molecular de 50 kDa e porção Fc inteira (Figura 2) . Os fragmentos Fab ant i-digoxina disponíveis comercialmente, foram obtidos pela digestão de IgG utilizando a enzima papaína. Os fragmentos de anticorpos também podem ser obtidos através da expressão· em Escherichia coll, oferecendo a vantagem de obtenção em grandes quantidades, a. baixo custo. A tecnologia de: DNA recombinante oferece ainda a oportunidade para a introdução de mutações nas sequências genicas, que podem ser vantajosas. No caso dos fragmentos Fab pode aumentar a -qua»cidade expressa, a. estabilidade, a solubilidade e facilitar a humanização e maturação de afinidade (KWONG, RADSR, 2009), TECNOLOGIA 'PHAGE PISPLAY' A tecnologia Phage Display compreende uma metodologia muito utilizada na geração de fragmentos de anticorpos. Surgiu .em 19SS, quando George Smith demonstrou que a correlação entre f-.enot.ipo e ge nó tipo podia ser estabelecida era bacterlõtagos (fagos) filamentosos {Figura 3;) , Smith mostrou qu-e fragmentos- d-e ,DNA exógeno podiam ser inseridos no gene III, que codifica a proteína, do capsídeo (pXXX.) destes lagos-, criando uma - proteína- de fusão. Os peptideos exógenos expostos na superfície dos f-ag.o.s. podiam ser . sei e-ei o-nados através- da afinidade pelo anticorpo: específico, permitindo que fossem enriquecidos em relação ao peptídeo original, por um processo usualmente denominado pannlng.

Em .1-989, Huse e colaboradores reportaram a geração de uma biblioteca de fragmentos Fab em fago lambda, a partir da combinação ao acaso das cadeias leve e pesada, do anticorpo murino, como método que poderia substituir a tecnologia de ba.-br ido mas. Os genes variáveis -de imunoglobul-irias podem ser ampl í f i cados a partir de. ■hibridomas ou células de 1 inf ócito-s B, -usando olígonucleotídeos iniciadores universais -e -reação, em- cadeia.-, da poli me rase ÍFCR,- polymerase ehain reaction) , possibilitando clonagem em vetores de expressão. (ORLAREI et al. , 19,89.). McGafferty ■-e colaboradores. (-1,9-9.6) demonstraram que os domínios variáveis completos de um anticorpo podiam ser expostos na forma de fragmento variável da cadeia única (scPv, single Chain variable fragment) fundidos à pXII na superfície do fago fd, permitindo a seleção do fago pela afinidade ao antígeno, dando início ao uso da tecnologia de phac/e display para a produção de anticorpos. A construção do vetor pCotnb3, permitiu que fragmentos. Pato-. fundidos à ρϊ.ϊϊ fossem expostos na. superfície do fago Ml3 (BARBAS et al. , 1991.). . A tecnologia, permite a seleção- de um clone de fago expondo- fragmentos de anticorpo de alta afinidade e especificidade para um determinado antígeno dentro -de uraa biblioteca -de fagos construída a partir de rearranj© dos domínios variáveis. (CLACKSQN et al - , 1991} . A -construção do anticorpo pel-a. tecnologia -de phage display se inicia com a construção de uma biblioteca de imunoglobulinas, que pode ser gerada a partir de animais imunizados, não imunizados ou uma biblioteca sintética (STRACHAN et al., 2002), Cs fagos filamentosos da classe Ff (f1, fd e M13} possuem 11 genes (I - XI) e destes, 5 codificam proteínas do .caps-ídeo que podem -ser fundidas às. proteínas recorrí napt.es de interesse com maior ou menor grau de êxito-, sendo-, .a pll.l -a mais usada- para phage display. Proteínas também, podem ser expostas em. pequenas partículas de fagos chamadas de fagomídeos, que são plasmídeos que carregam o gene dai proteína recombinante do capsí.deo e contém prige-m de replicação- do fago. Ml..3 (BARBAS et al. , 2:001) . O DNA do fagomídeo pode ser empacotado em .partículas virais com a ajuda de um fago auxiliar (helper phage) que fornece todas as proteínas e enzimas do fago selvagem, necessárias para a replicação do fago. A proteína de fusão do capsídeo é exposta em partículas que contêm os genomas do fagortiídeo e do fago auxiliar. Estas partículas contendo os·. dois genomas . podem ser selecionadas através de marcadores de seleção (BARBAS et al . , 1591), O helper phag-a possui origem de replicação deficiente e seu ; anoma é ineficientemente empacotado quando comparado ao fagomídeo {'BARBAS et al., 2001.}., Apôs a seleção e a caracterização, do anticorpo tnonoalonal, a tecnologia de phape dispàmy permite a manipulação dos genes do anticorpo através da geração de mutantes. Isto possibilita a seleção de novos variantes de anticorpos, alguns com afinidade e ■especificidade aumentadas em relação ao clone original (KRYKBAEV et al. , 2:00.2;) .

Pia.;çre display· ê uma tecnologia acessível em laboratórios de Biologia Molecular, Mão se exata, porém, cie tecnologia banal. e muitos detalhes precisam ser trabalhados para .se chegar a um bom resultado., Devido às vantagens, da tecnologia do pljage dísplmy e à importância dos anticorpos antd-dágox-ina em casos de· intoxicação· e de sua produção comercial ser estrangeira e de alto custo, os requerentes acreditam na necessidade do desenvolvimento e da produção. desse medicamento, no Brasil. G anticorpo antí-digoxina produzido pela tecnologia de phage pisplay é uma alternativa para o tratamento de intoxicação por dig itálicos, jã que pode diminuir consideravelmente os custos do .medicamento, considerados elevados por se tratar de. me.dí.eament o i mportado.

ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA

Uma breve pesquisa aos bancos de dados de patentes acerca do tema "ar.ti·· digoxina monoclonal'' resultou em alguns documentos» tais como o norte americano US 480316? <1989 - The General Hospital Co.) que. revela uma cultura de hibridoma, de alta afinidade de ' anti-digoxina e anticorpos monoclonais, produzidos por fusão de células somáticas* ■O' documento CN 1375505 {2002 - GEN HQSPJTAL PLA) refere - se a um gene humano de engenharia monoclonal anti-digoxina e anticorpo de cadeia única. Sua estrutura é: assinatura sequencial.: comprimento: 684 pb, tipo de classe, de ácido nucléico, número de cadeias.: estrutura geométrica.,* linearidade; tipo de molécula; D NA (genoma); fonte; região variável positiva clonado respectivamente; pertence ao .anticorpo humano e VK5 ¥ lambda subgrupo I; transportador anfitrião contendo Escherichia ço.li, CGMCC e No.0542. Trata-se de engenharia genética para anticorpo humano digoxina de cadeia monoclonal utilizado para detectar .a concentração de aplicação de digoxina no soro. do paciente e detectar o efeito toxico resultante de antagonista contra a digoxina de paciente envenenado por digoxina.

BREVE DESCRIÇÃO D0 INVENTO "A presente patente de invenção trata, numa visão mais ampla, de um método de produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia de phage display e a caracterização da sua ligação ao. antígeno.

Mais especificamente, o invento tem os seguintes obj et ívos: Extrair ΚΝΆ total dos hibridomas anti-digoxina e amplificar os genes da LC e da HC, porção Fd ÍVH e CHI) das imunoglobulinas por PCR; - Construir a biblioteca combinatória de fragmentos Fab no vetor de phage display; - Selecionar os clones de anti-digoxina através da ligação com o antígeno; - Expressar fragmentos Fab solúveis de anti-digoxina; e - Caracterizar a ligação dos fragmentos Fab anti-digoxina dos clones ao antígeno.

Foram e mp regado s materiais e método espacial mente desenvolvido, para a obtençãf de clones do fragmento Fab- do anticorpo anti-digoxina utilizando a tecnologia, de. ' phage dl spíay' . Uma serie de variantes foi obtida, e .quatro, delas foram caracterizadas pela. ligação â digoxina conjugada a BSA. (Dig-B-SA) , Diferente dos produtos comerciais importados., este -anticorpo ê mono.çiona.] e não ê produzido· em .animais.. Assim, o invento ded.rc.a--se, em, particular, ao desenvolvimento de .produto para uso. terapêutico com potência especifica e dose mais precisa para a desintoxicação- de. pacientes sob tratamento de digoxina.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A. complementar a presente descri ç-ã.-o de modo a. obter urna. melhor compreensão das características do presente invento e .de acordo com, uma preferencial realização prática do- mesmo, acompanha a descrição, em anexo, um conjunto de desenhos, onde, de maneira exemplificada, embora não limitativa, se .representou seu funcionamento: Figura 1 - Estrutura química da digoxina (C41.H64014) , um glicosí.de©·' cardíaco de 780, 92 Da;

Figura 2, - Estrutura da molécula de XgG e de seus fragmentos que mantém sítios de 1igação ao antígeno; fragmentos de imunpglotoulina apresentados: Fab, F{ab') 2 .

Figura 3: - Representação esquemática de baeteriõfago .filamentoso da classe· F.f e suas proteínas do çapsídeo; a© proteínas do caps.ídeo apresentadas podem ser usadas para a expressão, de proteínas recombinantes, na forma de .proteína de fusão., através da tecnologia de phage dísplay;

Figura 4 - Esquema do vetor fagomídeo pComb3XTT usado no sistema de phage dísplay, o vetor possui os genes de IjC e HC do fragmento Fab humane para a toxina tetânica -TT||. A cadeia leve foi clonada nos sítios de restrição Saci e Xbal e a cadeia pesada do fragmento Fab foi clonada nos sítios de restrição Xhol e Spel;

Figura 5 - Representação esquemática das principais etapas do phage dísplay e panning; a biblioteca de fragmentos Fab foi transformada em células E. coli XL1 -Blue, infectada pelo fago auxiliar e os fagos expondo fragmentos Fab anti-digoxina foram selecionados por rodadas de panning através de ligação à. Dig-.BSA imobilizada em placa.. Os fagos que não ligaram foram descartados por lavagem e os fagos que ligaram foram· eluídos e usados para re~infectar M. coll .XLl-Blue.

Figura, 6' - Perfil cia ligação do antigeno Dig-BSA â IgG anti-digoxina presente no sobrenadante do cultivo de híbridoma pelo teste de ELISA» onde o conjugado Dig-BSA foi imobilizado em quatro concentrações s 1, 2» 4 e 8 pg/aiL. O sobrenadante do cultivo do hibridoma anti-digoxina foi usado como anticorpo primário. Como anticorpo secundário foi utilizado anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase ;

Figura 7 - Perfil eletroforético da IgG anti · digoxina. purificada por cromatografia de afinidade pela proteína· A, onde Gel de SDS - PAGE 12% corado· por Çoomassi©.. ■Mf Marcador de massa molecular LMW (Amersham) , 1; IgG purificado não reduzido., 2: IgG purificado, reduzido com. β -ME; .Figura. S - Perfil d.a ligação da. IgG anti-digoxina pur.i.f içada â Dig-BSA imobilizada em diferentes concentrações para padronização dos testes de ELISA, onde o conjugado Dig-BSA foi imobilizado em seis concentrações: 0,5; 1; 2; 4; 8 e 10 çg/mL. A IgG anti- digoxina purificada do hibridoma foi usada como anticorpo primári na concentração inicial de 500 ng/mL. Como anticorpo secundário foi usado anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase;

Figura 9 - Produtos das amplificações dos cDNAs do bibridoma anti-digoxina usando oiigonucleotídeos de imunoglobulina murina, onde as amplificações foram feitas por PCR e analisadas por eletroforese em gel de agarose 1,5%. (A) Produtos das amplificações dos genes HC usando o oiigonucleotideo 3' MolgGl e os sete oiigonucleotídeos 5#. Μ: Marcador de massa molecular de l.OQpfa {invitrogen) , 1: ol ígonucleotídeo 5' 1A+1B, 2; 2ft, 3: 2B, 4: 2Ç, 5;.:· 3 A, 6,·: 3B+3C e 7{. 3D. {B) Produtos das amplificações dos. genes LC usando _ o ' ol igonuoleotXdea Mdk 3' e. os seis. oligcziuçleotídeos 5/ . M: Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega) , lí ol ígonucleotídeo. S:,f kí, 2.: κ2» 3: κ·3./ 4.: κ4, 5: κ5 ©. €■: κβ. A sequência dos oligonucieotídeos encontra-se na. Tabela I.;

Figura, 10 -■ Análise de restrição da biblioteca LC construída a partir da clonagem, .do repertório·. dos genes LC no vetor $>G©mb3X para. verificar presença do· ineerto. LC?. dez clones .{numerados de 1 a 10) da bibliteoca L.C selecionados ao acaso e o vetor pCorob3XTT, usado como controle (C) , foram digeridos com as enzimas de restrição Saci e Xbal e analisados por eletroforese em gel de agarose .1.%, M; Marcador de massa molecu:la..r de 1. kb {Invitrogen) , Figura 1.1 - Análise de restrição da biblioteca combinatória de fragmentos Fab construída no vetor pComb3X para verificar presença dos l.nsertos LG e HG; dez clones (numerados de 1 a 10) .da. biblioteca combinatória foram selecionados ao· acaso, digeridos com as enzimas de restrição· Spel e Xhoi para verificar a presença do insecto BC (A) e com Sac:l e Xbal para verificar a presença .do tnsertô LC (;B) . As amostras digeridas foram submetidas·· â eletroforese, em gel de agarose L%, M: Marcador de massa molecular de 1. kb fInvitrogen) ;

Figura 12 - Análise .de restrição da diversidade da biblioteca, combinatória construída no vetor p€o.mb3X peia digestão com a enzima de restrição BstNiç os dez clones selecionados ao acaso e analisados na Figura IX e o vetor pComb3XTT, usado como controle (C) , foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3% apôs digestão com a enzima de restrição BstNI. M: Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega ;

Figura 13 - Analise de restrição da biblioteca de fragmentos Fab anti-digoxina após 3 rodadas de phage dxsplay seguido de panning para verificar presença dos genes LC e HC; dez clones {numerados de 1 a 10) selecionados aleatoriamente da biblioteca e o vetor pComfo3XTT» usado como controle (C) foram digeridos com as enzimas de restrição Spel e Xhol para verificar a presença do. inserto da HC (A) e com Saci e Xbal para verificar a presença do gene LC (B) e analisados, por eletroforese em gel de agarose. 1%, M.·; Marcador de massa molecular de 1 kb (Iavátrogen);

Figura 14 ~ Análise de restrição da .diversidade da biblioteca de fragmentos Fab anti-dlgaxina após 3 rodadas de phage display seguido de panning pela digestão com a enzima de restrição .BstNI/ os. dez clones (numerados de 1 a 10) referem-se aos clones analisados na Figura 13, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3%. M; Marcador de massa molecular de 100 pb (Promega);' Figura 15 - Representação simbólica das sequências de aminoácidos deduzidos da LC dos clones 1, 2, 9 e 10, selecionados após phage dxsplay; os resíduos de aminoácidos foram substituídos por símbolos nas regiões FR1 e CDR2 para destacar as diferentes sequências. As dema i s regiões possuem sequências idênticas entre si,.

Figura 16 - Perfil .eletroforêtίσο dos clones X, 2, 9 e 10 digeridos com as enzimas de restrição Spel e Mliel para a remoção do gene III que codifica a proteína piII; as bandas de aproximadamente 4 kb {vetores) e 612 pb .(gene III) foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1% e a banda do vetor foi purificada do gel para a obtenção do vetor de expressão do fragmento Fab solúvel. M; Marcador de massa molecular de 1 kb (Invitrogen);

Figura 17 - Western blotting de extratos brutos contendo, fragmentos Fab anti-digoxina dos. clones 1, -2., 9 e 10: expressos etn E, coli XL1 -B1 ue; os extratos foram diluídos 1/2 e aplicados no gel de pol íacrilamida 12% na forma não reduzida. Após eletroforese, p gel. foi transferido para membrana de PVDF, A membrana foi incubada com o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidase e detectada com o sistema ECL;

Figura 18 - Imunodetecção do antígeno Dig-BSA. e BSA pelos fragmentos Fab anti-digoxina expressos em E, coli pelos 4 clones selecionados após phage display; (A) Análise por SDS-PAGE 7, 5% da Dig-BSA e BSA (controle) na forma reduzida. Apos a eletroforese o gel fox corado por prata. M: HMW marker (GE Healthcare) ; 1: Dig-BSA 0,025 mg/mL; 2 : Dig-BSA 0,0125 mg/mL; 3: Dig-BSA 0,0063 mg/mL; 4: BSA 0,01 mg/mL. (B) Western blotting para verificar ligação dos fragmentos. Fab anti-digoxina dos extratos brutos dos 4 clones ao antígeno Dig-BSA, Quatro géis com as mesmas amostras usadas em (A) , foram transferidos para membranas de PVDF e cada membrana foi incubada com o extrato bruto de Ε.cp;Xi contendo fragmentos Fato anti.-digoxi.na de cada um dos 4 clones. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ato')2 conjugado a peroxídase e reveladas com o sistema ECL.

Figura 19 - Perfil da ligação. dos fragmentes Fato anti-digoxina. expressos em E, colá pelos 4 clones â Dig-BSA e BS A pelo teste de- ELISA; a. mlcroplaea fox sensibil azada coro Dig-BSA, ou BSA a 4 μ-g/mL. .Os. fragmentos Fato presentes no: extrato bruto de culturas, de E. eoii foram diluídas, serialmente .1:..2, iniciando com a concentração do anticorpo em 50 ng/mli... O anticorpo secundário, utilizado foi anti-IgG, de. camundongo específico para fragmento Flato'··).2 conjugado·, a peroxidase; e Figura 20 - Sensorgrama do BIAcore* do ensaio de ligação dos fragmentos Fato expressos em E.aoli pelos 4 clones ao antígeno Dig-BSA; Dig-BSA foi imobilizada em um sensor chip CM5 a 9259,8 RU. Qs extratos brutos dos clones contendo os fragmentos Fato expressos em E, coli foram injetados a uma concentração de 2,0 ug/mL. A resposta relativa foi medida 5 segundos apôs o término da aplicação do analíto, no ponto indicado pela seta vermelha (clone 1 - 4·95,9 RU; clone 2 - 476, 3 RU; clone 9: 2 06,9 RU; clone 10 - 1.0:23,5 RU.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo· com as ilustrações, a. presente, invenção se refere a "MÉTODO .DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO ΑΝΤΙ-DIGOXINA

MONOCLONAL A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR", maia part icularmente a 'método· para produção e obtenção de clones· do fragmento Fab d.o •anticorpo artfci-digoxina utilizando a tecnologia de '-pliage di splay."· e a· caracterização da sua ligação ao antígeno, o qual compreende as seguintes etapas: Etapa 1) - Obtenção· e eara.cteri..zaç.ão de. albumina bovina conjugada com digoxina ÇDig-BSA) Fase 1,1 - Obtenção dos conjugados Dág.-BSA;

Fase 1,2 - Caracterização dos conjugados Dig-BSA;

Etapa 2) - Obtenção do anticorpo monoclona1 anti-digoxina;

Fase 2.1 - Purificação do anticorpo monoclonal anti- digoxina;

Etapa 3) - Construção da biblioteca de Fab no fagomídeo pComb.3X a partir de hibrídomas anti-digoxina Fase 3.1 - Obtenção de cDNA dos hibridomas ant:-digoxina; Fase 3,2 - Amplificação dos genes da LC e da porção Fd da HC ;

Fase 3,3 - Obtenção de células competentes e vetor;

Fase 3.4 - Clonagem do repertório de genes LC no vetor pCombBX;

Fase 3,5 - Clonagem do repertório de genes HC na biblioteca LC;

Etapa 4) - phage display e enriquecimento da biblioteca Fab;

Fase 4.1 - Preparação de fago auxiliar (helper phage) Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab anti-digoxina (phage display);

Etapa 5) - Expressão de fragmentos Fab solúveis;

Fase 5.1 - Quantificação dos fragmentos Fab solúveis por Enzyme-1inked immunosorbent assay (ELISA) sanduíche;

Etapa 6) - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage display Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel, ao antlgeim pelo reste de BLXSAf .Fase 6.2 - Eletroforese em .gel de., poi iacri 1 a-mi da coto dode.cdl sulfato de sódio (SDSmPAQE:) j Fase 6.3. - Ensaios de Western BlofetAng;

Fase 6,4. - Análise de af inidade,no BXAcore* T100.

Para melhor definir' cada etapa e. sua. respectiva fas-c·:;, é abaixo descrito o método em sua característ ica. detalhada, o qual pode ser acompanhado das i 1 ust rações jã relacionadas Etapa. 1.) Obtenção e. caracterização de; albumina bovina .conjugada com digoxina Fase 1,1 Obtenção dos conjugados Dig^BSA O protocolo baseou-se na técnica descrita por Erianger e Beiser (1964). Quarenta e quatro miligramas d.e digoxina foram ressuspendídos em 2 mh de etanol 95%, foram adicionados. 2 rnL de· Na.lQ4 0,1 M e a solução· .foi mantida e» repouso a temperatura ambiente por 30 minutos, .ftpbs 30 minutos de interação, 60 p,L, de glicerol 1 M fo.í adicionado para inaííivar o- excesso de periodato, e a .solução foi mantida sob agitação por mais 5 minutos. Cinquenta. e- seis miligramas. de BSA (Sigma-) foram dissolvidos em 2 m.L de PBS e o pH foi acertado em 9,5 com a solução Na2CC3 5%. A solução de dígoxina oxidada pelo periodato foi adicionada â solução de BSA, lentamente e gota a gota, mantendo o pH entre 9,3 e 9,5 pela adição de Na2CG3 5%, A solução continuou sob agitação por 1 hora a temperatura ambiente, mantendo o pH estável por 30 minutos na faixa de 9,3 a :9.,5> Adicionou-se 6 mg de- MaBH4 dissolvido em 2 mL de água de.ionizada preparada de imediato·, A solução foi coberta com para filme ía liberação de H2 poderia causar explosão) e mantida em repouso, por 24 horas a 4 °C. A solução foi dialisada em 2 L de PBS com 20-3 0% de etanol a 4 °C por dois dias. Foram feitas duas trocas do tampão, sendo que na última utilizou-se somente PBS. A amostra foi centrifugada, quantificada através do método de Bradford e estocada a -20 °C.

Fase 1.2 Caracterização dos conjugados Dig-BSA

Para estimar o número de moléculas de digoxina conjugada a BSA, usou-.se como referência a absorbânçia no comprimento de onda de 3"8·8 M de uma solução de digoxina de. concentração conhecida, em duplicata.. A referência e a amostra -de Oig-BSA. foram completados com ágya até' .2. ml», em seguida 10 mh de H2-SC4 foram adicionados-e os tubos foram.mantidos: em repouso, a temperatura ambiente por 4 horas,, Foi. feita a leitura da absorbânçia e calculado o número de mols de digoxina presente .no conjugado Dig-BSA. h. estimativa do número de moléculas de digoxina presente no. conjugado foi obtida através da relação entre o número de mols de digoxina do Dig-BSA e o número de mols da BSA adicionado para a obtenção do conjugado.

Etapa 2) Obtenção do· anticorpo monoclonal anti-digoxina Um anticorpo monoclonal anti-digoxina foi gerado pela tecnologia de hibridoma, a partir da imunização de camundongos Balb/e com conjugado ovalbumína~ digoxina, no Laboratório de Imunologia do. Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo (PAULA, 1993.) ,. sob orientação do Prof, Jorge Kslàl. Células do hibridoma anti-digoxina. foram cultivadas em dois fiascos Spánno, r FX&skf 500 «X. (..Bellc© Glass, Inc, , EUA), um contendo 4 00 .ml* de 'meio e outro com 3.00 m.L de meio de. cultura Dulfeceo "s Modifi&é· Ea-grlm*® Médium and Ham’s F-12 Nutrient Mixtura (DMB/F12) C Sigma-Aldti oh, Inc. , BUA,) suplementado com soro fetal bovino· 3%; -{Cult ilab» Brasil..) e: ii-glutamina 4 wiM (Merck ICGaA, Alemanha).« em estufa ; Forma Scientific Inc., EUA) a 37 ,0Ç e ;GQ2 S%., A contagem das células viáveis foi feita com o auxílio do corante de exclusão azul de Trypan e câmara de Neubauer. As células foram precipitadas em Centrifuge 5804 R (Eppendorf AG, Alemanha) a 5,000 x g por 10 minutos a 4 °C, Fase 2.. 1 Purificação do anticorpo monoclonal anti-digoxina.

Os sobrenadantes dos cultivos foram purificados por cromatografia de afinidade en 245 mL de resina proteína Ã~Sepharose 4FF (GE Healthcare) empacotada .em coluna XK 50/30 de 5 cm de diâmetro x 30 cm de altura (GE Healthcare) » A coluna foi conectada a uma bomba peristáltica. P5Q (GE Healthcare) que promove o bombeamento da amostra pela coluna, a saída da coluna foi conectada a um monitor de UV a 280 nm UV1 (GE Healthcare), que por sua vez foi ligado a· um registrador REC 101 (GE Healthcare) . O equilíbrio .da coluna foi. realizado através do tampão g] icina i, 5 M/cloreto de pó d io 3 M pH 8,3.., posteriormente a coluna £©i carregada com o edbrenadante do cultivo- diluído 1:1 no tampão de equilíbrio·, Após o carregamento., passou-se .peia coluna tampão de equilíbrio para remover po.se ivei.s ligações ihespecíficas -«· 'íreequiliJorar a coluna, -Para. a. eluígio utilizou-se o. tampão citrato· de sódio· 50 niM/cloreto de sódio 1-5:0 mM pff 4.,3., O eluato foi cl i-alisad© duas vezes contra PBS durante uma noite. Após a e-lui-ção a coluna foi regenerada com tampão glicina 50 mM/cloreto de sódio 150 tnM pH 2,3 seguida do tampão Tris 50 mM/cloreto de sódio 1 M pH .8,0. © enxégue da coluna foi efetuado coro a passagem, do tampão- Tris 50 trtM/cloreto, cie sódio 158; mM pH 8,6, Durante a .etapa, de carregamento foi utilizado o fluxo de 1 mL/min, as ' .demais, etapas foram realizadas com fluxo de 10 mb/min.

Etapa 3) Construção da biblioteca de Fab no f agomídeo pCorrJb3X a partir de hibridomas arit i -digoxina Fase 3,1 - Obtenção de- cDNA dos- hibridomas ant i -digoxina Células do hibridoma anti-digoxina foram cultivados em. um. frasco Spínner Flask, 250 mL {Bell.co Gla-ss, Incí , nas mesmas- condições descritas na Etapa 2, -O cultivo foi precipitado a 5-,.00-0 x. g por .10 minutos a 4 -eC, O R.MA total das células doe hibridomas- foi extraído utilizando o TrlzcJ® Meagent íIrtvitrogen Corporation, EDA)., baseado no método de isolamento de RUA. por fenol., isotiocianato de guanidin-a e. clorofórmio. Í-CBQ.M-C-ZYNSKI e SACCHI, 19-8:7) , conforme manual do fabricante, A concentração do RNA foi de termina cia por espect.rofot^oroet-ria, através -da. absorbância a 260 nm (Ά-2-.β-Ο) np aparelho Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech {BloçhrQm} Ltd, , Inglaterra·} e a equação .utilizada para o cálculo foi;· [.'RNA fp.g/i»L··) J » 40 x. :ft.2:&0 x 'diluição., A pureza do .mataria! também foi verificada, pela relação entra a afosorbância a. 2:6Q: nm e 2;8D; nrn (A260/A26G·:): . A razão ótima entre- Α260/Α28Ό para o RNA varia de l, 9 a. 2 /0 . A síntese de cDNA foi feita por transcrição reversa do RNA. total, utilizando o kit SuperScr.ipt™ 111 E’i rst -Strand Synthesis System foz- RT-PCR ÍXnvitrogem Corporation), usando o Oligo (dT} 2 0 e ..seguindo.·, o manual do· fabricante. As reações foram feitas no· aparelho termociclâdor Qmne&mp9 PGM System 9700 (Appl ied Bi.osyst.ems, EUA) .

Fase 3..2 Amplificação dos genes da LC e da porção Fd. da HC O cDNA dos hibridomas anti-digoxina foi usado como molde para amplificar os genes, da BÇ e da porção Fd (VH e GUI·) da HC, usando· oligonucleot.ídeos iniciadores específicos para o tipo kappa (x) da LC- e subclasse IgG.l (yl) da HC de imunoglobulin-as muri-nas·., com base no· banco de dados, de Kabat f.KABAT et al. , 199.1) .

Os oligonucleotídeos, contendo sítios de restrição· específicos para clonagem no vetor pCombl (BARBAS et al , , 1991), fotatn sintetizados pela Invitrogen Brasil Ltda, Foram usados- seis oligonucleotídeos 5:·' para a IC K ίκΐ; k2; k3; xi; ó e k6) , contendo sítio de restrição para a enzima Saci e sete para a porção Fd (1A+1B; 2A#* 2B; 2C; 3B+3C e 3D), cpm sítio para Xhol (ITOH et al., 1999} e os oligonucleotídeos 3' Mok.3' e MolgGl, contendo sítios de restrição para Xbal e Spel. respectivamente (BARBAS et al., 2001), As sequências dos oligonucleotídeos utilizados estão .representadas na Tabela 1.

Tabela 1 - Sequência dos oligonucleotídeos usados para amplificação do gene da porção Fd da cadeia pesada e da cadeia leve : Em negrito, sublinhado, duplamente sublinhado e tracejado estão representados, respectivamente, os. sítios das enzimas de restrição Xhol, Saci, Spel e XbaX.

Os genes da LC e ÜÇ foram amplificados através de reação de PCR usando a Taq DNA Polymerase, zecombínant - BR (Invitrogen Brasil Ltda.), no aparelho GeneAmp-PCR System 9700 {Applied Biosystems, EUA) iniciando a 94 °C por 2 minutos, seguido por 4 0 ciclos de desnaturação a 94 °Ç por 1 minuto, anelamento a 57 °c por l minuto e alongamento a 72 °C por 1 minuto, Um alongamento final de 5 minutos a 72 °C foi realizado apôs os ciclos (TSURUTA et al,, 2003).

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram analisados através de eletroforese em gel de: agarose, utilizando Sistema Horizontal de Eletroforese LCH 7x8 (Loccus Biotecnologia, Brasil). O gel de agarose 1,5% foi preparado com tampão TAE (Trís-EDTA 4 0 mM; acetato de sódio 5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e corado com SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen Corporation). As amostras foram preparadas com Blue/Orange Loaclinçr Dye6x {Promega Corporation, EUA) e um marcador de massa molecular lOObp DNA Ladder (Promega Corporation) foi usado. A corrida foi realizada por 40 minutos a 90 V. O resultado foi visualizado no aparelho transilumínador de luz azul, Safe Imagefm Blue Light TransiIlumina tor (Invitrogen Corporation) e as imagens foram capturadas pelo sistema KODAK Gel Logic 100 Imaging System e o KODAK Molecular Image Software (Carestream Health, Inc., EUA). Após a análise, os produtos da amplificação dos .genes LC e HC foram separadamente misturados, obtendo-se os repertórios para a construção da biblioteca combinatória. A concentração de DNA foi determinada pela absorbâncía a 260 nm no espectrofotômetro Ultrospec 6300 Pro (Bíochrom Ltd. Inglaterra) . As medições foram feitas em amostras diluídas em agua Mílli-Q, usando cubetas de quartzo de 10 mm, O cálculo utilizado foi: (dsDNA (pg/mL) ] - 50 x A260 x diluição. A pureza do material também foi verificada pela relação A260/A280, A razão ótima para o DNA varia de 1,8 a 1,9.

Fase 3.3 - Obtenção de células competentes e vetor Sub-.Fase 3.3.1 Preparo de células de Escheri chra. coli XLl-Blue para transformação por choque térmico .A linhagem bacteriana de Esc. hezichiM coli utilizada para clonagem e expressão do anticorpo reçombinante foi a Xbl-BIue.í recAl endAl gyrãSS fcfti-l hsdRlJ ampB4 4 rei Al Jaç IF' proAB laçlqmms TnlO (Tetr)'! . 'Uma alíquota da· bactéria JEL coli Xbl....

Biue Competent Célia (Stratagene Corporation, EUA·} foi plaqueada em unia placa de meio Luría-Bertani (LB} - ágap Itripfepna 1%; extrato de levedura .0 ,,&%■.■? NaCl 1%.; ãgar 1,5:%:.·; glicose 0,1 M) , contendo t.etraciclina a 10 pg/mL e- incubada durante uma noite a 37 °C, No dia seguinte, uma colônia foi inoculada em.. 10 mL de meio Super Broth (SB) (triptona 3% ; extrato de levedura 2%; mops l%-, pH 7,01, contendo tetraercl-ina a 4-0#g/mL e incubada., durante uma noite a 37 ■°C aob agitação. Desta cultura foi'retirado 0,4 mL e inoculado-em: 200 mL de SB contendo glicose 0,04 K e MgCl2 0,01 M e incubada a 37 °C sob agitação até a absorbância no aparelho Ultrospec 1000 {Pharmacia Biotech (Biochrom) Ltd. : s 600 nm atingir 0,8-0,9. A cultura foi incubada no gelo por 20 minutos e centrifugada a 900 x g por 10 minutos a 4 cC (Centrifuge .3604 R - Eppendorf AG) . O sobrenadante foi descartado, as células.· foram re.ssnspendxd-as em 50 mL: de MgCl2 0,1 M estéril e gelado e incubadas no gelo por 20 minutos. A suspensão foi centrifugada a 900 x g por 1.0 minutos a 4 °C, as células foram ressuspendidas em 25 mL de CaCl2 0,1 M estéril e. .gelado e incubadas no gelo por 2Ό minutos. Ume nova centrifugação a 900 x g por 10 minutos a 4 °C. foi feita, o sobrenadante descartado e as células ressuspendidas em 2,4 mL· de CaC12 0,1 M seguido pela adição, de· ¢)...,6- mL de gli cerol.. A suspensão -foi dividida em alíquotas .de l.lOpL em tubos gelados em banho de. etanol com .gelo .seco e estocadas a -80 °C» O título das células· .competentes foi determinado acravés da tianeíormaçâo por choque térmico com um DMA controle, Sub-Fase 3.3.2 - O vetor pComb3X O vetor fagomídeo pComb3XTT (BARBAS et ■al. , 2001) -(Figura 4) foi fornecido pelo Dr. Carlos Barbas do Instituto Scripps (The Scnpps Research Instítuc-e, BUA) , junto-com a licença para sua utilização. Pertence à família de vetores pCcmb3X (GenJbank AF2 58281) e pode ser usado na clonagem de fragmentos Fab, scFv, peptídeos e proteínas para o. sistema de phage dísplay, Este vetor possui os genes de LC e BC do .fragmento Fab humano para a toxina tetânica ~TT||, um único promotor laçZ·., origem de replicação F1 Orí e resistência à ampiciiina ampR,. Contém duas sequências de pept ideo sinal, ou ter memhxane protein (pmpA?· para LC e pectate. lyase .& (pelB) para HG, que direcionam a-s cadei-as polip.eptídicas para o. períplasma.. A cauda de .€ hi-s.tidina® (His.6-.) e de 10 hemaglutiní na.s {HA) possibilitam. a purificação e a detecção da proteína retowbiaanre- Possui um côdon de. terminação âmbar (TAG), que permite a expressão de proteína solúvel sem a plli em linha geris nao supressoras, Para a expressão da proteína sol Cível, pode-se também remover o gene da. proteína plil pela. digestão- com as enzimas de restrição Soei e Mhel.

Sub-Fase 3.3.3 - Transformação por choque térmico. A arnpi ificaçâo do. vetor foi feita através da transformação, por choque térmico da bactéria E. coíl XLl-Blue Competsat Cells (Stratagene Corporation} com. o vetor pComb3XTT. Cinquenta microlitros da bactéria XL1-Blue foram, incubados com 0,5 μ%> do vetor pCQtnbSXTT por 10. minutos no gelo, 4 5 segundos a. 42 °C. no aparelho .ffte.rmppixer compmct (Eppendorf :AG) e 5 minutos no gelo. Foram adicionados 450/iib de meio SOC (trxptona 2ft; extrato de levedura 0:.,54,- Na,C?l 0,0 5:%? KOI 20 mM; MgC12 1 mM; glicose 2 0 mM} « incubado por 1 hora sob agitação a .3'? °C. Dessa cultura foram plaqueados 200 pL etn uma placa de meio LB-ágar, contendo ampicilina (100 pg/mL») e incubados durante uma noite, a 3 7 °G» iSub-Fase .3.3..4 - Extração plasmidial Os plascoídeos foram purificados com os kits MaxjLpzep. EíSpeed® Plawmié. Maxi kit CQiagen Sciences.., ;i.n.ç. , EUA} e Miaàprep PízardfB PI us $V Miaipreps DNA Purification System {procnega Corporation), conforme protocolo do fabricante.

Sub- -Fase 3.3,5- Precipitação com etanol A precipitação çpm etanol foi feita adicionando etanol absoluto (2.·,.2x o- volur»; da amosira) e acetato de amorno (:10:% do volume da amostra), e incubação por 1 .hora a -.8.0 °C. Apôs a incubação, as amestras foram, centrifugadas a 20.800 x g por 15 minutos a 4 °G e cs sedimentos foram lavados duas vezes com etanol 70% gelado e centrifugados a 20.800 x g por 5 minutos a 4 °C após. cada lavagem. As amostras foram ressuspendidas em agua Milli-Q autoclavada..

Sub-Fase 3.3,6 - Análise do DNA através da digestão com enzimas de .restrição .Os DNAs purificados foram digeridos, por 2 horas a 37 °c com as enzimas de restrição Saci e Xbai (New England Bio Labs Inc., EUA) para verificar a presença da cadeia leve e com as enzimas Xhol e Spe.I {New England Bi o latos Inc.) para ve.ri.fi.car o inserto da cadeia pesada. Em seguida os DNAs foram analisados através de eletroforese em gel de agarose. Os marcadores de massa molecular utilizados foram 1 kb DMA Ladeie r (Promega Corporation) ou Ikb DNA Ladder (:l-nvitrogerv) .

Sub-Fase 3.3,7 - Preparo de células de Encherichia coli .XI» 1 -Blue e 1 e irocompeientes Urna alíquota da bactéria E, coli XL1-Bl.xae Competeat Cells· í.Sfcrat.agene Corporation) foi plaqueada em. uma .placa de meio LB-ágar, contendo, tetraciclina (10 ^g/ttíli) e incubada durante uma noite a 3 7 °C. No dia seguinte, uma colônia foi inoculada em 10 mL de meio SB, contendo tetraciclina (40 μg/mL} e incubada durante uma noite a 37 °C sob agitação. Desta cultura foi retirado 0,4 mL e inoculado em 200 mL de .SB .contendo, glicose 0,04 M e MgCl2 0,01 Me incubada a 37 °C sob agitação até a DO a 600 nm atingir QS-09, A cultura foi. incubada no gelo por .20 minutos e centrifugada a. 90 0 x g por 2.0 minutos a 4 °C. 0 sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 100 mL de gl-icerol 10% estéril e gelado. A suspensão foi centrifugada a 1.500 x. g por 20 minutos a 4 °C, reasuspendida, em 50 mL de glicerol 10% e· centrifugada a. 2.50 0 x g por 3.0 minutos a 4 cC. O sedimento foi novamente ressuspendido em SO mL de glieerol 10% e centrifugado a 3,000 x 9 por 30 minutos a 4 °C. As células foram então res suspendidas em 2 mL de gl ieerol 10% e divididas em 'alíquotas de 150 aL em tubos gelados em banho de gelo seco/etanol e- estocadas a -80 O título foi determinado através de eletroporaçã© com um DNA controle.

Fase 3.4 - Clonagem do repertório de genes LC no vetor pGotnh&X .0' repertório de genes LC fox danado no vetor pCamhSX para a construção da biblioteca LC. Quinze mi cr ©gramas dos genes LC e do vetor pComb3XTT foram digeridos com as enzimas de restrição Saci {10 U/pg) e Xbal (13 U//.tg> a 3 7 SC durante uma noite. No dia seguinte, as amostras foram precipitadas com etanol e ressuspendidas em 2 0 pL óe água Mi,Xli~Q autoclayada. Os DNAs foram aplicados no gel de agarose Ultra Pyire® L. Μ. P, Agarose. - Low Meltxng Poi.pt (Invitrogen Corporation) e submetidos à eletroforese a 50 Ψ por cerca, de 3 horas. Gomo. padrão foi usado ’ o marcador Ikb DMA Ladder (Promega Corporation), As bandas com o peso aproximado de 4.000 pb (vetor) e de 7 00 pfo (inserto) foram extraídas do gel, com auxílio de um bisturi e purificadas com o kit Wizard® SV Gel and PCR Cl ean-Up System (Promega Corporation), seguindo- instruções do fabricante, As amostras purificadas foram precipitadas com etanol e ressuspendidas em 10 μΐ de água Milli-Q autoclavada. A determinação da concentração do DNA foi feita utilizando o aparelho QubitTM Fluorometer (Invitrogen Corporation) e o kit Quan t~iT dsDNA BR Assay kits (Invitrogen Corporation), Quinhentos nanogramas dos genes LC foram ligados a 100 ng d® vetor pComb3X durante uma noite a .23. °C, utilizando 2 U de Taq DMA. liasse (Invitrogen ■Corporation) .

Sub-.Pa.se .3.,4.1 'Transformação por eleiroporação Setenta micro', i tros de E. colí XLl-Blue eietrocompetentes foram incubados com 2 pL da reação de ligação acima em cubetas de Eletroporação 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc., EUA) durante 10 minutos no gelo. Após a incubação, as amostras .receberam um pulso de 2..:00 0 V por: S., 0 ms no aparelhe (Eppendorf AO:'·)·.

Imediatamente foram adicionados 3 mL de meio SOC e •incubados, sob agitação por 1 hora a 37 °C.. Foram plaqueadps 2.0:0 juL d,a cultura em placa. X»B.ligar contendo ampicilina C.l00 gg/rnli). e as placas foram incubadas· durante urna noite a 37 °C. O tamanho .da biblioteca foi estimado pelo cálculo do número de colbnias em Unidade Formadora de. Colônia fUFC). Também foram escolhidas colônias .aleatoriamente, .inoculadas em Ç mL de meio. SB contendo aiTipioiiina CXQ.Q gg/mL) e incubadas durante uma noite a 3 7°G sob agitação, No dia seguinte os inôculos foram centrifugados· e os plaswfaeos foram purificados com o kit wizard®·' Hts SV Minipreps DMA, Purif.icatí.o.n System íPromega Corporation). Foram feitas digestões com as enzimas de restrição Saci e Xbal para verificar a presença da cadeia leve . A biblioteca. dos genes LC foi amplificada através de transformação por eletroporação-, incubando-se. 2 gL da biblioteca· LC com 70. μΙ> de E., coi,í XLl-Blue eletrocompetente. Após eletroporação e incubação por 1 hora a 37 °C, adícíonou-se 20 mL de meio SB contendo ampicilina (100 ptg/mL) e incubou-se a 37 °C durante uma noite. Os plasmídeos foram purificados com o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purífication System (Promega Corporation) e quantificados pela absorbância a 260 nm no espectrofotômetro UItrospec 6300 Pro (Biochrom Ltd.), Fase..3,5 Clonagem do repertório de genes HÇ na biblioteca LC

Para a clonagem dos genes da porção Fd no vetor pCombSX contendo os genes LC, foram utilizados os mesmos materiais e métodos da clonagem do repertório de genes LC (Fase 3,4), com exceção das enzimas de restrição. Dez microgramas do repertório de genes HC e da biblioteca dos genes LC contida no vetor pComb3X foram digeridas com as enzimas de restrição Spel (3U//zg) e Xhol (6U/pg) durante 3 horas a 37 °C. Na reação de ligação utilizou-se 300 rig dos genes HC, 100 ng de vetor e 2 U de Taq DMA liga se (Invitrogen Corporation). A reação ocorreu durante uma noite -a 23 °C, Foram eletroporados a mistura de 70 μία de E. coli XLl-Blue com 2 μL da reação de ligação em um aparelho Multiporator® {Eppendorf AG), 2:.5 0.0 V, 5,0 ms, cube tas 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc.), Apôs a eletroporação, foi adicionado 3. mL de meio; SGC e incubado sob agitação por 1 hora a 3 7 °C. Foram plaqueados 20 0 μΡ> da cultura em placa LB-ágar, contendo ampicilina (100 μg/mL·) e incubados durante uma noite a 3 7 °C. A análise da biblioteca combinatória foi feita de'forma parecida como a feita para a biblioteca IjC, acrescentando as digestões cora as enzimas de restrição Xhol e Spe I para detectar a presença da porção Fd e a análise da diversidade da biblioteca combinatória, feita pelai digestão com a enzima de restrição BstNl, que reconhece o sítio CC/WGG (New England Bioiabs Inc.). Os clones· que apresentaram os ínsertps da LC e da HC. foram quantificados por espectrofotornetria e sequenciados.

Sub-Fase 3,5.,1 Sequenciatnento e análise, de DNA O1 sequênciamento de DNA dos clones que apresentaram os. dois insertoe foi feito usando o oiigonucleorideo iniciador ompseq (5’-AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G - 3 ') para a cadeia leve e o oligonucleot ideo peãseq C 5 AGG TAT TGG CTA CGG CAG CGG--3:') para a cadeia pesada (BARBAS et al. , 2Q01). As amostras foram preparadas com BígDye®Terminator v3,l. Cycle Sequençing Kit (Applied Biosystems) . Foi utilizado o Serviço de Sequenciamento cie DNA CSSDJfA) do Departamento de Bioquímica - IQUSP, que realiza os- seqüenciamentos pelo método de Sanger, através do· seqiienciador capilar ABI PRISM® 3 lOOGenet icAnalyzer / HITACHI, As sequências nucleotídicas foram analisadas através do programa. ChXom&s lí te (Techne1ysiutn Pty Ltd.) e os. .ami;.noá.cidos foram, deduzidos utilizando o programa de tradução Expert: Pretein Aaãlysis System. (ExPASy) , do $:wi:ss Ins-tM ute of Bâpinfoxm-a-tfc-s· (SIB.) , As sequências doe clones foram comparadas .com. sequências do. GenBank usando o programa Basic Local Alípaient Search Tool (BLAST.) , do National Centex· fox Bioteçbnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EUA (ALTSCHUL et al., 1990) e foram alinhadas usando o programa de alinhamento para DNA e proteínas Gl-.i:st.alW2, do European J3i oin forma txcs Instítuta· {EB -1)-, pertencente ao European Molecular Bíology laòor-atcry {-EMBíi (:IARKIN et ai.., 2 007). A identificação dos GDRs foi baseada no esquema de numeração de Kafoat (19-915 , .Etapa- 4) Phage diaplay e enriquecimento da biblioteca. Pab A biblioteca combinatória de .fragmentos Fab antí-digqxína foi enriquecida através de phage display e pa.nni.ng com o antígeno imobilizado. Um esquema mostrando as principais etapas do- enriquecimento da biblioteca está representado na. Figura 5.

Fase 4.1 Preparação de fago auxiliar (heiper phage) Uma alíquota da bactéria E. coli XL1-Blue Cornpafeen-tl Çel.ls CStratagenel foi plaqueada em placa LB-ãgar contendo fcetra-ciclina (.10. ^g/mb) e incubada durante uma norte a 3-7 °C. Uma colônia de Xbl-BIue foi inoculada em. 10. mL de SB contendo 10 pg/mL de tetraciclina e incubada sob agitação a 3 7 °c até a jDD a 600 nm atingir 1..,.0-.. Foi então adicionada l placa de VCSM13 In te rfe r:&n ce-Resi s t a;; o Helper Phage (Strafcagene Corporation) €5 incubada por 2 hora.s a 3 7 Foram transferidos 2 mL· da cultura infectada para um E.ri-enmeye-r de 1 L contendo 100 mL de SB com 10 μα,/mL de tetracilci.na e 7 0 μ-g/mL de cana-mícina. -e incubada sob agitação a 3 7 °C durante uma noite (:2-0 horas;. A cultura foi e-enprif ug.ada a 1.600 x g por 2.:-5 mi nu t.os a 4 °C e o sobranadant.-e-. incubado em banho-maria por 25 minutos; a 7-Ό :0Ç seguido- por mais uma centrifugação, a -1.600 x g por 25 minutos a 4- °e. Os sobrenade-nfces foram estocados a 4. °€. (estáveis por meses).

Sub-Fase 4.1.1 Determinação de título do fago auxiliar Foi feito um inoculo de 10 μ1* de E. coll .XLl-Blue eletrocompetente em 10 mL cie SB com 10 pg/m.h des tetraciclina e incubado por 5-6 horas a 37 °C. Diluições de 10"®» 10~7 e 10‘® do VCSH13 foram preparadas. Foram adicionados 5 μη de cada diluição a 100 μη de XLl-Blue e incubados por 15 minutos a temperatura ambiente. Poi adicionado 3 mL de soft ãgar {.triptona 1%·»· extrato de.· levedura .0.., 5.%.; MaCl 0,5%; Ágar 0,65·%} prei-aquecido (.4,2· C) e derramado sobre; a placa de UB-ãgar pré-aquecido (37 °<2.) . As. placas foram incubadas durante uma noite a 37 °C·. Cada placa de lise formada representa uma partícula virai da suspensão;, O título do fago foi calculado em. Unidade© Formadoras .de Placa {UFP) /mL: m° placas de lise/v (μΐυ fago x .fator diluição x 103 pL.

Sub-Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab ant i - digoxina (phage display) .•Dois ‘ micro litros da biblioteca combinatória obtida acima foram transformados por ele tropo ração em 70 ' μΐ . de E. coli XLl-Blue eletrocompetentes. Após incubação por 1 hora a 37 °C, foram pia queados 50 pL da. cultura em placa LB-á.gar contendo ampiç.il.i-na (100 pg/iaL)· e incubado» durante uma noite a 37 °C para confirmar o .tama.n.ho dei biblioteca combina fcôri a. Adicionou·-se .à ’ cultura 7 mL de SB contendo ampiçilúna LQ0 .pg/mL., tetraciclina 10 yg/mL e gi.ico.se 40 nll, Após incubação· por 2 .horas a. 37 °C, foram. adicionados aproximadamente 1 x i£T‘ UFP de fago auxiliar, seguindo por mais: uma incubação por .2' horas a. 3·.7 °c. O cultivo foi centrifugado a 2·. 2 00 x g .por 10 minutos a 4. °G. 0. sedimento. f.ci ressuspendid© era 10· ffl£* SB e centrifugado a 2.200 x g por .10 minutos a 4 °C, O. sedimento. foi novamente ressuspendido em 1.0 mL SB. contendo ampxciJ ira TOO p.g/mL e canamiaina 7 0 pg/ral, e incubado, durante uma noite (;2 0 horas) a 30 °C. O cultivo foi centrifugado, a 4. S00 x. g por 10 minutos a 4. °C e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. Ao sobrenadante foram adicionados 2 mL- de polietilencglicol PEG) 6.000 20%/MuC! 2,5 M. A mistuia foi incubada por 3 0 minutos n© gelo· e foi centrifugada, a 4 .. SOO x g por 30 minutos a 4 o sedimento foi ressuspendido em 400 pL de BS A 2%/TBS e centrifugado a 20.800 x g por 5 minutos·.' a 4 °G. Foram separados -5 pL do sobrenadante para determinar © titulo (diluição. l.O’0., .Ι.<Γ"®> e o .restante foi •aliguota.do e armazenado a 4 °C (biblioteca. de fagos) .

Sub-Fase 4.2.1 --Enriquecimento da biblioteca de fagos Fab anti-digoxína (pannin r .

Uma placa de 96 poços (Mune., EUA} foi sensibilizada com 50 uL do conjugado Dig-BSA previamente preparado (ver Fase 1.15 a 4 ug/rr.L. A placa foi incubada a 4 °C durante uma noite, seguida por 3 lavagens com PBS, Foi feito- o bloqueio com 150 pL de BS A 1%/PBS e a placa foi incubada por 1 hora a 37 °C. Em cada poço foram adicionados 50 pL da suspensão de fagos, que foram incubados por 2 horas a 37 °C e apôs incubação os poços foram lavados 5x com BSA 2%/TBS. A eluição foi feita através da incubação por 10 minutos a temperatura ambiente com 5 0 μΧ. de tampão de eluição (HC1 0,1 M ~ glicina, pH 2,2). Foi feita a neutral i zação. som 3 pL de Tris - base. 2 M, e os·.· conteúdos.· dos. poços· foram transferidos, para tubos de 1,5 ml*. Uma alíquota de S. pL fox separada para. determinar título (diluirão IO*2,, IO'4':)·, Um novo ciclo de panning teve inicio, infectando Q.,..5 rnL de cultura de E, coli XL-i-Blue com 100 pl de fagos eluídos, .Após- incubação por 15 minutos a, temperatura ambiente, 100 pL foram, plaqueados em LB-âgar contendo arnp ici li na {10:0 ag/mL): e incubados durante urna noite a 37 °C, enquanto ao restante, adicionou-se .10 mL -de SB, 100 pg/irtL de ampicí 1 xna, 1.0. pg/mL de letracielina e glicose 40 nM, dando continuidade ao procedimento de panning. A partir do segundo ciclo de panning, a eficiência de cada ciclo foi calculada, em porcentagem de ligação, como mostrado abaixo; 0' fator de enriquecimento da biblioteca foi obtido pela razão entre a porcentagem de ligação do últ. imo ciclo de panning em. relação ao ciclo anterior.

Após o terceiro ciclo de panning da biblioteca combinatória, 10 clones foram aleatoriamente selecionados da. placa de diluição 10."* para serem analisados conforme descrito na análise da biblioteca combinatória (item fase 3·..5} e os clones que apresentaram os· dois insertos foram seguenciados como j;â descrito anterior mente. Após análise dos. dados d.e seqüeneiamento, 4 clones foram selecionados para expressar· fragmentos Pab solúveis.

Etapa 5} - Expressão de. fragmentos Fafe .solúveis A expressão de. fragmentos F.ab solúveis em bactérias E. coli da linhagem XLl-Blue á possível após a retirada do gene III 4o vetor pC.omb3X através de dupla digestão : com as encimas de restrição· Spel e Nh&I (New· Bngland Biolaba Inc,}, Após a digestão com as enzimas por 2 'noras a 37. °G., foi realizada uma precipitação cs» etanol . As amostras foram então submetidas· ã eletroforese era. gel de agarose UltraPurem Agarose. - Low Meliirtg Poirit (invitro.gen 'Corporation.) lie Bandas de aproxi madamen t e 4..100 bp foram isoladas, purificadas com. o· kit fSizsrctI> SV Geâ and PCE Clean.-C/p System ('Promega .Corporation) -e precipitadas com etanol. O vetor sem o gene IZI foi religado utilizando 2 U de Taq ONA ligase (Invitrogen Corporation) durante uma noite à." 1.6" ,0C í~ 2 0 horas) . Para analisar os vetores preparados e confirmar a retirada do gene III, foram, feitas transformações por eletroporação em Xbi-Blue,. Os plasmídeos foram puri.fi ca.dos por Mlníprep üízard® Plus SV Mínipreps DMA. Pari ficatSon System (Promega .Corporation), precipitados com etanol e analisados por eletroforese em gel de agarose 1% após digestão com a enzima de restrição Xhol e também por dupla digestão com as enzimas de restrição Saci. e Xbal.

Após as análises, 1 μΙ> de cada vetor foi transformado por choque térmico em 50 uL de XLi-Blue para a expressão dos fragmentos Fab solúveis. Foram plaqueadoa 20 μΐ e 100 yL em placas de· Betri contendo LB-ágar com ampicilina (100 ug/mh) e as placas foram incubadas durante uma noite a 37 °C. No. dia seguinte, as colônias foram removidas, inoculadas em 10 mL de meio SB com ampicilina (100 μα/mL·) e incubadas por: 2 horas .a .37 4,Ç.. Foram, inoculados 2 mL dessa, cu.1. tu.r.a num. frasco contendo 1.0.0 mL de meio SB com ampicilina {100 jug/mL·} e MgCl2 2 0 mM, Seguiu-se uma incubação a. 37 °C até a DO a 600 nm atingir aproximadamente 1,0, momento em que se adicionou Isopropyl-P- D-Thiogalsctoside (IPTG) a 0,5 mM. O cultivo foi Induzido durante uma noite (~ 16 horas) a 30 °C. Após o. término da indução, o cultivo foi centrifugado a 2.200 x g a 4 °<3 por 15 minutos. O precipitado foi ressuspendido em 5 mL de PBS e lisado por sonicação (Mícroson™, Ultrasonic Cell ,'Disrup.tor . Misonix, Inc, , EUA) : 10- pulsos de 10 segundos, intercalados com incubações de 2 minutos no gelo.- A suspensão foi centrifugada a 20.600 x g a 4 °C por 30 minutos. O sobrenadante .foi armazenado a -20 °C e utilizado para confirmar a ligação ao antígeno. Uma segunda indução foi realizada em. .maior escala (1 L) a fim de obter fragmentos Fab para. a realização de ensaios de ligação ao. antígeno, inoculando - se 10 mL do pré inoculo em 5;0.Q mL de meio SB com ampicilina (100 μ$/πιΙ,) e MgCl2 20 mM (2 frascos).

Fase 5.1 - Quantificação dos fragmentos Fab solúveis por Enzyme-1 inked immunosorhen t a ssay (ELISA) sanduíche As quantificações foram feitas em microplaças MaxiSorp de 96 poços (Kunc-Immuno”1 Plates,). Em cada poço foram adicionados 100 pL de solução sensibilizacora {tampão de revestimento pH 9,6; 0,16 g de carbonato de. sódio 15 mM (Na2C03); 0,30 g de bicarbonato de sódio 35 mM (NaHCQ3) ; água qsp 100- mL) , com o anticorpo AffiniPure F(ab') 2 Fragmen t Rabbit-Anti -Mouse IgG, F(ab') 2 Specific {Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc,, EUA), diluído 1/400 (1,5. pg/reL), que foram incubados em câmara úmida durante unta .noite a 4 °C, 'No dia- seguinte a placa .foi lavada três vezes com BBS, cada poço fox .bloqueado com 300 μ L :de BSA. 1 % /PBS. e a placa foi incubada por 2 horas a 37 °C, Após o 'bloqueio.., a placa foi lavada três vezes com BBS.. A curva-padrào foi preparada com o. CfroíRPure Mouse. igG, Fab fragroent (Jackson ImmunoResearch .Laboratories, Inc.) na concentração inicial de 0, 01 pg/mL· e diluição serrada 1/2 com B.SA l-%-/PBS·. O· extrato bruto contendo fragmentos Fab também fo,í diluído na concentração apropriada em BSA 1%/FBS. A placa foi incubada por 1 .hera a 37 °C .e depois lavada três vezes com PBS, Foram, adicionados 1,0o pL por poço do anticorpo conjugado B&r<>Kidas&-ccmjMqated AffinlPuxm F (ajb0 ) 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgGf F(ab') 2 Fxagment Speeífxc (Jackson ImmunoResearch Laboratories., Inc.), diluído 1/7,000 em BSA 1%/PBS e incubados por 1 hora a 3 7 °C» A placa foi lavada três vezes .com PBS, Foram adicionados em cada poço 100 uL da solução reveladora {10 mL de tampão de acetato/ácido cítrico 0,1 M pH 6,0 ¢1,36 g de acetato de sódio em agua qsp 100 mL, pH acercado para I 6,0 com ácido cítrico 100 raM) ; 100 μΐ} de 3,3', 5,5f - fcetrametílbenzidína (TMB) a 1% em diraet11Sulfóxido (DMSCj ; 1,5 μΐί de água oxigenada] e a placa foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz. A reação foi interrompida com 50 μΏ de H2S04 4,7 N e então foi feita a leitura da absorbância a 450 nm usando o leitor de placas {Labsystems IEMS Analyzer) e software Genes,ie Lite (Labsystems and Life Sciences International UK LTD. )■ .

Etapa 6} - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage ciisplay Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel ao antígeno pelo teste de ELISA.

Os extratos brutos dos quatro clones foram usados para analisar a ligação dos fragmentos Fab pela digoxina através do teste de ELISA, como descrito anteriormente {Fase 5.1), com algumas alterações. A sensibilização foi feita com Díg-BSA e BSA (controle negativo) na concentração de 4 pg/mL, Em uma placa auxiliar, foram colocados 260 μΐ* do Fab solúvel no 1° poço de cada coluna e os demais foram preenchidos com 130 μh de BSA 1%/PBS. Foi feita uma diluição seriada 1/2 ao longo da coluna. Foram transferidos 100 de cada poço para a placa sensibilizada. O anticorpo conjugado utilizado foi Per oxidase-conjuga teci Affi rs i Pure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgGr F(ah') 2 Fragment Specxfic (Jackson ItnmunoResearch Laboratories, Inc,), diluído 1/8.000. Um ensaio semelhante foi feito com. o anticorpo monoclonal anti-digoxina produzido pelo hibridoma.

Fase 6,2 - Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodeai 1 sulfato de sódio (SDS-PAGB) As eletroforeses foram fe.lta© com géis de poliacrilamida em. concentrações que variavam de 7.,5% a 12%, com 0,75 mm ou 1,0 mm de espessura dependendo cio experimento. As amostras foram diluídas em PBS quando necessário e preparadas com tampão de amostra .com. ou. sem agente redutor (β-Mereaptaetanol). Gs marcadores de massa molecular .utilizados foram. o Low Molecular fmight CalSbra tion Kit for SDS Eleatrophoresls [Amersham Bíosciences UK Limited) e HMW-SDS Marker kit (GE

Healthcare}. As amostras foram reduzidas pela incubação por 5 minutos a 100 °C. O sistema utilizado foi o Mini-PROTEAN® Tetra Ce 11 (Bio-Rad) . Os géis. foram corados por nitrato· de prata ou Corante Azul de. Coomassie R250.

Fase $:.3,. ~ Ensaies de. Western Slotüíng Os ensaios de Western .blofcting eram sempre realizados após SDS-PAGE de dois .géis idênticos.. Um. gel era corado com nitrato de prata ou Coomassie., funcionando como referência do oufe.ro, que era transferido-para urna membrana .

Um ensaio foi feito para detectar fragmentos Pab expressos .pelos quatro clones. Os extratos brutos dos clones foram aplicados em. dois géis de ppliacrilaraida 12%, que foram submetidos à eletroforese. Em um gel foi realizada a coloração por Coomassie (referência), enquanto o outro foi transferido para uma-membrana de fluoreto de polivinilídeno (PVDF> (Millipore, EUA} utilizando o sistema Tra-ns■ Blot SD Semi -Dry Electrophoretic Transfer Ce 11 (Bio-Rad) . O marcador de massa molecular usado no gel transferido foi o- Kaleidosegpe (Bio-Rad). A membrana foi bloqueada com leite desnatado 10%/PBS, lavada 3x com Tween 0,1%/PBS e incubada com o anticorpo conjugado Peroxida se-conjugated AffiniPure F (ab'}2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Fragment Speelfio (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc,), diluído 1/2:0.000., por 1 hora a 37 °C. A revelação foi feita com © kit Ame rs ha m ECL Plus Western Slotting Detection Reagents (GE Healthcare).

Para analisar a ligação dos fragmentos Fab pela digoxina, foi feito um ensaio para cada um dos quatro clones, aplicando Dig-BSA e BSA em dois géis de poliacrilamida 7,5%, que foram submetidos à eletroforese. Em ura gel foi realizada a coloração por nitrato de prata (referência), enquanto o outro foi transferido para uma membrana de PVDF, como descrito anteriormente, Após o bloqueio, cada membrana foi incubada com o extrato bruto de ura dos clones por 1 hora -a 3 7 °c. A imunodetecção e a revelação foram feitas utilizando os mesmos reagentes e condições jã mencionados.

Fase 6...4, - Análise de afinidade no BIAcore TI00 O ensaio de ligação dos fragmentos. Fab. presente® nos extratos celulares pelo. antígeno foi φ realizada· usando, do. BIAcore TI 00 (GB Healt hcare.) por ressonância plasmônica de -superfície (SPR, surface plasmon rp-sonanae) , O .conjugado· Dig-BSA, usado como ligaste, foi diluído em tampão acetato pH: 4,0 numa concentração de 50 yg/faL.. A iiTObili-zação foi feita em um chip sensor revestido por çarboximefcil dextra na., tipo CM 5 (GE Healthcare), pelo método de amine coupjing (ligação covalente com a dextrana contida no· chip) , com alvo- de 10.,0.00 RU, usando os reagentes do kit de imobilização covalente (l-ethyl-3 - (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochlori.de (EDO , N-hydroxysuccinimide -(NHS) , e t hanol amine - HC1 pH 8,5-1 (GB Healthcare} e tampao HBS-EP (HEPES 10 mH, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 0,05% pH 7,4) como tampão de corrida. Os fragmentos Fab dos extratos brutos foram quantifiçados por ELISA (item 3.5,1), diluídos em tampão HBS-EP a .2 pg/mL e usados como analito no ensaio de ligação com o conjugado Díg-.BSA. imobilizado- no chip. O ensaio foi feito com fluxo de IS pL/min, com tempo de 40 s de contato do analito na superfície, e 40 s de dissociação, A regeneração foi feita com NaOH 5.0. mM por 60 s mim fluxo de 30 yl/min.

Os resultados do método acima relacionado e detalhado podem ser assim definidos: Resultado 1 - Obtenção e caracterização do conjugado Dig-BSA A digoxina foi conjugada à albumina .sérica bovina (BSA) para ser utilizada no enriquecimento da biblioteca combinatória de fragmentos Bab anti-digoxina por panníogr e nos ensaios de ligação ao anticorpo monoelona.1 produzido pelo hibridom.a anti-digoxina e ap.s: fragmentos Rafo produzidos pelos clones, O número de' resíduos de digoxina para cada molécula de BSA foi estimado em 5,8 e foi calculado conforme descrito na -fase 1,.2. A concentração de proteína obtida pelo método de Bradford foi de 10 rag/mL, Foi feito um teste de .Rii.lSA para verificar a ligação do conjugado .Dig-BSA ao anticorpo monoclonal anti»digoxina, O conjugado foi imobilizado nas concentrações de .1, 2, 4 e 8 pg/mL em uma m icro.pl a ca e .o· sGbrenaàante do cultivo do hiforidoma anti.-digoxina foi diluído seriadamente com fator de diluição 2 e aplicado como anticorpo primário, O anticorpo, secundário utilizado foi o anti-igG de camundongo conjugado com. peroxídase, A Figura € mostra as. absorbâncias obtidas, a 45Ό nm em função da. diluição do sobrenadante. do 'hiforidoma para cada concentração do antigeno, O anticorpo monoc1ona1 apresentou o mesmo perfil de ligação ao conjugado Dig-BSA nas quatro concentrações do antigeno.

Resultado 2 - Obtenção e purificação do anticorpo- ■ monoclonai anti-digoxina. O anticorpo monoclonai anti-digoxina, presente no sobrenatíante do· cultivo -do bibrídoma, fox purificado para ser utilizado como referência em parte dos ensaios -de ligação ao conjugado. As células do hlbridorna anti-digpxi.im foram, cultivadas era dois frascos contendo 4 00 ml e 3 Q:0 ml* de mexo., nas concentrações de -0,7 4x1.0'* cél./ml. com 98·% viabilidade -e de 0.,. 94-xiO6 cél/mL· com 9.7% viabilidade., respectivamente. Apôs a purificação por cromat ogra fia de afinidade- pela proteína A, o eluato fo-.i concentrado e-, amalísado por eletroforese -em. gel de. polia.crilamida 12% na forma reduzida por β-ΜΕ e não reduzida {Figura 7) . Podemos observar uma única banda na amostra não reduzida (canalete 1) , representando o anticorpo inteiro. Na amostra reduzida é possível ■visualizar as duas bandas características representando as cadeias leve e pesa.da de XgG. Pode-se visualizar ainda uma banda fraca correspondente à igG não reduzida. O anticorpo monoclonai anti-digoxina purificado fbí usado também para. padronizar a concentração da Díg-BSA imobilizada nos testes de ELISA,· Foram imobilizadas concentrações do .antigeno de .0,5 a 10 ug/mL ,e a -IgG purificada foi usada como anticorpo pr imã-rio,, com concentração inicial de 5Q.-Q ng/rnL. O anticorpo secundário utilizado foi o- ant-i-lgG de camundongo conjugado com. peroxidase, diluído 1/10.000, Na Figura 8 é apresentado o perfil de ligação da anr.i-d.igoxina para 6 concentrações de Dig-BSA.. A concentração de 4 pg/mL· foi escolhida para a imobil i zação da pig-B-SA, e da. BS A em todos- os testes de ELISA.

Resultado 3- - Construção da biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-dígoxina A construção da biblioteca combinatória foi iniciada com a obtenção dos repertórios dos genes da LC e da HC a partir do hibndoma anti digox .na, seguida por clonagem sequencial desses genes no vetor p€omb3X, Células do hibridoma anti-digoxina na concentração de 0,95x10® células/mL, com 96% viabilidade, foram utilizadas para a extração do RNA total das células. Após a extração -do RNA total a. concentração obtida foi de 2:.,6 pg/iTiIb e m razão A26.0/A28G foi de 1,193. O cDNA. sintetizado através d.e transcrição reversa do mRNA for utilizado para amplificar genes da LC e HG, -usando oligonucleot-f deos iniciadores especí f: cos de genes para imunoglobulinas, murinas da LC ík.) ■©· porção Fd (¥H e CHI) da HC tyt-1 * Os fragmentos de DMA amplificados por PCS .foram, analisados através da eletroforese era gel de agaro.se 1.,5:% (Figura 9). A amplificação dos genes da -HÇ esta representada na Figura 9A, onde se pode observar que o cDMft não- foi amplificado usando o oligonueleotldeo 1Α+ΊΒ (canaleta 1-5-..; os ol. igonucleot.ideas :2A, 2B-, 2C apresentaram uma banda, de aproximadamente 650 pfe (ca-naleta-s 2, 3 e 4) , os oligonucle.otídeos 3A, 3-B+3G aprese nt a ram uma banda de aproximadamente 75© ,pb ícanaletas 5 e- 6} e o oligonuçleotfdep 3D não amplificou (canaie-fca 7) , Na amplificação., dos genes- da 1«Ç: (Figura 9B-) , pode-se observar que houve amplificação usando os oligonucieotídeos kl e k3, que apresentaram bandas de aproximadamente 700 pb (canaletas .1 e 3) e k6, que apresentou banda de aproximadamente 600 pb (canaleta 6) . Após a análise por eletroforese, os fragmentos de DNA da LC e HC foram separadamente misturados, formando os repertórios de genes da LC. e HC. .Estes repertórios. foram clonados sequencialmente no. vetor para a construção da biblioteca combinatória. O repertório de genes da LC foi o primeiro a .ser clonado no vetor pComb3X para a construção da biblioteca LC.. A biblioteca LC foi construída através de .dupla digestão do repertório- de genes LC. e do vetor pComb3X com enzimas de restrição Saci © xbal seguido- de eletroforese em' gel de. agarose 1%1 para extração e. purificação -das bandas e ligação dos mesmos, A biblioteca obtida, foi transformada, era E.coli Xil-Blue.. o seu tamanho foi, estimado- em Sael-O5 clones.. Foram escolhidos 10 clones ao -acaso para extração do DNA e a presença, do iaeerto LC foi veri.f.-içada. por eletroforese., em. gel. de. agarose 1%, apôs digestão com as enzimas- de restrição. Saci e- Xbal. Dos .1.0 clones analisados, apenas o- clone 8 não apresentou uma banda de aproximadamente 70-0 pb, correspondente ao ins.ert©. .LC (Figura 10) . De ..acordo -com a amostragem que foi analisada, 90% dos clones da biblioteca LC apresentou o ínserto. LC- A biblioteca LC foi amplifícada para a clonagem do repertório de genes HC neste vetor e obtenção da biblioteca combinatória de fragmentos Fab. A biblioteca LG e .o repertório de genes da. HG foram.' duplamente digeridos com as enzimas de restrição Spel e Xhol e submetidos à eletroforese. As bandas foram extra idas, purificadas e ligadas para a obtenção da biblioteca combinatória. A biblioteca obtida-teve .©■ tamanho estimado em 5 x 10® clones., Foram escolhidos 1,0 clones ao acaso .para verificar a presença dos insertos HC e. LC peia digestão, com enzimas de restrição específicas.. Após eletroforese em gel de ag-arose, verificou-se que, dos 10. clones analisados, 6· apresentaram bandas de aproximadamente 7 0-0 pb, relativas- aos insertos HC {Figura 11 A) e BC (Figur-a 1.1B-1 . Os 1Q clones aelecionados também, foram digeridos com a enzima de restrição BstNI para analisar a diversidade da. biblioteca .combinatória obtida... Observando, os 6 clones, que apresentaram os dois. insertos,, não foi possível notar diferenças aparentes no padrão de restrição entre os clones 2, 3., 6:, 8 e 10 {Figura 12). O clone 4 apresentou um perfil diferente dos demais.

Os seis clones gue apresentarem os genes BC e HC. ..foram, .sequencíados. A partir das sequências nuqleot. idicas obtidas de cada clone, foram deduzidas as sequências de resíduos de amiacãcidos, e foram, detectados ■oódons de -parada nos genes da LC -de todos os clones analisados,- indicando que nenhum dos .cl-on.es era. funcional, todos eram pseudogenes. O clone 3 tambéni possuía um çódon. de parada no gene da HC, Os. clones 2, 6, 8 e 10 apresentaram sequências de aminoãcidcs idênticas na HG, O clone 4 possuía utn resíduo de ãcído glutâmico (E) na região CDR2, enquanto os demais possuíam uma lisina (K) (dados não mostrado») · Essa biblioteca fox utilizada para o prosseguimento dos experimentos.

Resultado..4 - Phagm cli&play e enrique cimento da biblioteca Fab anti-d-igoxi na A biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-digoxina obtida pela clonagem sequencial dos repertórios de genes da LC e HC foi enriquecida após algumas rodadas de phage dxsp. ay e panníng, que selecionaram os fagos expondo fragmentos Fab anti-digoxina através da ligação ao antígeno Dig-BSA.

Qs f agomxdeos da biblioteca foram transformados em células E, coli 3£L1-Blue, que. foram infectadas, pelo fago a-.uxiX.iar VCSM1.3. Os fagos. expondo anticorpos foram. ..recuperados da cultura e selecionados, em rodadas de pa:mong com Dig-BSA imobilizada em. placa. O número cie UPC antes e após seleção σοιη o antígeno fpi calculado em -cada rodada, para estimar o fator de enriquecimento da. biblioteca. Os resultados estão apresentados- na Tabela 2. 'Um aumento de cerca de 3 6 vezes· no fator de .enriquecimento poda ser notado na segunda rodada e apenas cerca -de 1 vez na terceira rodada, indicando que duas rodadas de panr: ipg foram suficientes para obter O. enriquecimento da biblioteca Fab anti-digoxina.

Tabela 2 - Títulos dos fagomídeos antes e depois de cada rodada de pmnning e determinação da eficiência do panning (% ligação) e do enriquecimento da biblioteca a; número, de PFC de fagomídeos incubados com Dig-BSA. b; número total de UFCs .de fiagos contidos nos eluatos c; (fagos depois do pannâng / fagos antes do panning.) x 10.0. d: Enriquecimento da biblioteca comparado à rodada, anterior de panr.ing·.

Após. a terceira rodada de panning, 1.0 .clones fora,m: se'lecionados aleatoriamente m a presença dos insertog ,HC e LC foi verificada. através· da. digestão cora as enzimas de restrição e analisada por .eletroforese em gel de agarose 1%. Dos 10 clones analisados, 6 apresentaram os dois insertos (Figura 13A e 13B). Esses 10 clones também foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% após a digestão qom a enzima de restrição BstNI para verificar a diversidade da biblioteca. Observando os 6 clones que apresentaram os dois insertos, não foi possível notar diferenças aparentes no padrão de restrição entre os clones l., 2-, 5., 9 e. 10 (Figura 1.4) . O clone 3 apresentou um perfil diferente dos demais clones..

Os clones .que continham os insertos HC e LC (clones 1, 2, .3, 5, 9, 1.0) foram analisados por s-equeneiameapo dos genes' HC e LC. As sequências cios aminoácidos deduzidos focam alinhadas usando o programa C-lnstal'W2. A numeração, dos atninoácidos e dedução· dos. CDRe. te.eve como. base o ■esquema.· de. .Kabat et ai. 1:1331), Todos os .clones apresentaram sequências de aminoácido-s idênticas na HC, A análise do- sequenciamento da LC revelou que -o clone 3 exa. um pseudogene e ao compararmos sua sequência nucleotídica com sequências depositadas no GenBank utilizando· o programa. BLftSTn, encontramos 10.0% de identidade cora o gene Mus muscuívs immunoglobulin aherrantly rearranged kappa. çthain mRNA, partia 1 sequence (GenBank: 1)56414,1). Os clones 5 e 10 apresentaram sequências de aminoáaidps da LC idênticas. O clone 9 possui um resíduo de glut.amina (Q) , na posição 54 da região CDR2 da LC, enquanto os outros clones possuem uma argmina (R) . Os clones 1, 2, $ e 10 apresentaram variações na sequência de aminoáeidos da região do frameworkl {Figura 15).

As sequências dos aminoácidos deduzidos da LC e HC dos clones X, 2, 9 e 10 foram analisadas quanto â homologia pelo programa BLASTp, comparando com· sequências depositadas no· ■GenBank, As. .sequências que apresentaram maior identidade-- com- os -clones estão apresentadas na Tabela 3 (LC) ‘ e Tabela 4 {HOΛ em porcentagem de identidade (quantidade de aminoãc idos í,dênfciç-o.s/:quant.i-dade de aminoáci-do-s totais das sequências). Cçmp.arando o-s e-DR-s. da LC, observamos mais de 71,8% de identidade em todos os CDRs, chegando o CDR2 -dos clones 1-, 2 e 10 a apresentarem 100.% de identidade com as três sequências encontradas {.Tabela 3-'·) , enquanto, cs CDRs da. HC dos- clones apresentaram porcentagens mais baixas de identidade .com a-s- sequências encontradas, f.içando abaixo de 80%, chegando a apenas 18,2·% de identidade no CDR3 em uma das sequências {ladeia 4), Tabela 3 - Análise de homologia da LC dos fragmentos Fab dos ..quatro clones an ti - d igoxir. a utilizando BJLASTp, «3en,Ba.nki AAG 12:16 7.1 f.ntâ© publicado:)· ; (2) GenBank,: CAA72328.1 CBQNG et al, # 1.998'}j 0} GsnBs.nk:: AAN86 781.1 (IAI. et al.. , 2 002} .

Tabela 4: - Analise de homologia da HG dos fragmentos Fab dos quatro· clones anti-digomna utilizando BLASTp- (1) ®Br2:¥3CTJ-í {ARC3IRIADI. et al.. , 200:9) ; {21 BDB·; 1F3DJÍ (GONÇALVES et. al . , 200Q; GOLIMBLLI-PIMPANBftC et al. , 2000); ^ GenBank; AAU816647.1 (CQSTAGLIGLA et al , , 2004) .

Resultado g. - Expressão e caracterização da. ligação dos fragmentos Fab anti-digoxina Os clones 1, 2, 9 e 3.0·.., que apresentaram .sequ.ênc ias de aminoácidos distintas na região FRl da LC, foram· esco.lh.idos parei expressar Fa.'b solúvel usando a linhagem XLl-Blue de E. coli. Para isso, foi necessário remover o gene ΙΧΪ do vetor pCombiX de cada clone através da digestão com a.s enzimas de restrição Spel e AíheJ, permitindo, que os. fragmentos Pab fossem, expressados na forma solúvel sem a pIII. As 'bandas dos vetores (~ 4 kb) .foram separados da. banda do gene ΙΓ! C 6:1:2 pb) através de eletroforese em -gel. de agaro.se 1% (Figura l.€) . O DMA plae.mldia.l de cada clone foi purificado, transformado em E. coli XLl-Blue e a expressão de Fab solúvel foi induzida pela adição de IPTG. Após a indução, as bactérias foram líaadas por sonicação e os extratos brutos contendo os fragmentos Fab dos diferentes clones foram utilizados nos ensaios de ELISA, Western hlottxng e SPR.

Iníciãlmente foi feita a expressão dos fragmentos Fab em .100 mL de meio para verificar a ligação dos ant içorpos à digoxina por ELISA e a quantidade de anticorpo expresso por cada clone (dados não apresentados·) „ ..Em., seguida foi realizada a expressão dos fragmentos Fab em 1 L de meio para obter quantidade de anticorpo para a realização dos ensaios de ligação ao antígeno. 0s resultados apresentados neste t:abalho referem-se aos fragmentos Fab da segunda expressão.

Um ensaio de Western blottdng foi realizado para verificar a expressão dos fragmentos Fab nos extratos brutos dos quatro clones. As amostras não reduzidas do extrato bruto dos clones foram diluídas 1/2, aplicadas em gel de pcliacrilamida 12% e submetidas à eletroforese. O gel foi transferido para uma membrana de PVDJF, que foi incubada com o anticorpo anti-IgG de camundongo especifico para fragmento P(ab')2 conjugado a peroxidase. Em todos os clones foi reconhecida uma banda de aproximadamente 50 kDa, correspondente· ao tamanho do fragmento Fab e também bandas de 2 5 kDa, tamanho referente à HC e LC do fragmento Fab, separadamente (Figura 17), Apôs a confirmação da expressão dos fragmentos Fab nos extratos brutos, foi feito ura Western blocting .para. verificar a. ligação do anticorpo anfeí-dígoxína dos 4 clones ao antig.eno. O conjugado Dig-BSA e o controle negativo BSA foram aplicados em géis de políacrilamida 7,5% e submetidos à eletroforese. Os géis foram transferidos para membranas de PVDF, que foram incubadas com. os extratos .brutos do® 4 clones. O anticorpo ant i-digoxina presente nos 4 extratos reconheceu uma banda de aproximadamente 67 kDa, correspondendo ao conjugado Dig-BSA, mas não apresentou ligação à BSA, como esperado. (Figura IS). A concentração dos fragmentos Fab expressados pelos clones foi determinada por ELISA sanduíche, imobilizando o anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento. F ,(ab') 2 em mícroplacas. O' fragmento Fab de camundongo- foi utilizado para a construção.· da curva-padrão. As concentrações de fragmentos Fab, após a segunda indução, foram calculadas a partir da curva-padrão, resultando enu clone 1 - 6,67 pg/mL, clone .2 - 10, 08 pg/mL, clone 9 - 0,61 yg/mL e clone 10 - 1,73 yg/irtf, O clone 9 apresentou o menor rendimento entre os clones, A ligação dos fragmentos Fab dos diferentes clones ao antígeno foi analisada por ELISA, O conjugado Dig-BSA e a BSA {controle) foram imobilizados a 4 ug/rnL em microplacas, incubados com, os extratos brutos contendo os fragmentos Fab. dos clones, diluídos serialmente 1/2 com concentração inicial de 50 ng/mL, e incubados com anticorpo anti-IgG de camundongo específico para fragmento F(ab')2 conjugado à peroxidase. Os valores das absorbâncias foram plo ·: ados em gráfico em função da titulação das •concentrações dos fragmentos Fab dos clones-, Os resultados mostram ligação específica dos quatro clones â Dig-BSA, sem evidência de ligação à BSA (Figura 19), Pelos resultados dos i munoens aios não foi' encontrada diferença' - de. · ligação .entre os quatro fragmentos Fab, quando analisados em, relação ao antígeno, O ranqueamento foi possível através da análise por -SPR. no BlAcore", um sistema que apresenta alta sensibilidade para análises de interações bi.om.ol.eculares em tempo real, Este sistema mede a alteração do ângulo do índice de raf,ração conforme a massa da molécula presente na superfície de. um chi-p.

Antes cie realizar o ensaio de. ligação, foi verificada a ausência de ligação i.nespec.iíf ica dos fragmentos Fab à dextrana contida na superfície do chip.

Apôs o teste acimaf o- conjugado Dig~.B:SA. foi imobilizado no etiíp. com alvo de lO.QQO RU e- teve como resultado final a. densidade de· proteína.. imobilizada de 9.259,8 RU, ps exb.rat.os brutos dos quatro- .clones, contendo o-s fragmentos Fato na .concentração de 2,0 pg/mL, foram aplicados fias. canaletas do chijp, interagindo .com. a Dig - BSA e gerando uma. resposta·, medida, em, unidades de ressonância ÍRU, ressonante tialts), As RUs, medidas 5 segundos após o término da apl-icação dos fragmentos, no ehip imobilizado com .Pig-BSA foram-: clone 1 - 4 95,9 RU,· clone .2 - 475,3 RU.; clone .9 - .2 0-6,,9 .RU; clone l.o - 1.02-3,5 RU (Figura 20.). 0 clone 9, que possui em. sua sequência de ame noâ eidos, deduzidos, -um resíduo de aminoâcido diferente na região CDR2 da L€ em .relação aos demais clones, apresentou a resposta mais baixa entre o-s, çlones analisados-. ps quatro clones diferem entre, si. nas. sequências de aminoácidos na região. FR 1 da LC.

Restou provado que o método permitiu a obtenção de fragmentos Fab do anticorpo monoclonal anti · digoxina pela utilização da tecnologia de phage display. Após o enriquecimento da biblioteca de fagos, 10 clones foram selecionados aleatoriamente e destes, 6 apresentaram os insertos LC e HC e tiveram as regiões dos genes LC e HC analisadas por sequenciamento. Quatro clones apresentaram diferenças na sequência de aminoácidos da LC, todos na região do framçwork 1. Bases clones for-am expressados e apresentaram ligação ao antlge.no- Dig-BSA, em ensaios de ELISA, Western hlotcing e SRR- Nenhum dos clones apresentou ligação- à BSA isolada.. A tecnologia de phage dà&píay tem apresentado muitas vantagens, como a seleção de anticorpos monoclonaís a partir de biblioteca de genes variáveis humanos (MARKS et ai.., 1991) e identificação de marcadores terapêuticos —In vá vo (ARAP, 200 5·) . .'Fragmentos Eab podem ser expressados em Escherichia col: em grandes quantidades e a tecnologia de DNA recombinante fornece a oportunidade para a introdução de mutações que podem otimizar o Fab, aumentando a quantidade expressada, estabilidade., solubilidade e facilitando a. humanização e a. maturação de afinidade (K.WOMG,. RADBR, 2,00.9). . A quantidade de Fab obtida por litro de cultura em E, .c.oli depende prineipalmentre da sequência de aminoácidos do Fab ÍKWOMG, RADER, 200 9} e, portanto, pode variar entre elon.es.

Para a expressão de proteínas solúveis em E.coli Xbl-Blue utilizando o vetor pComb3X, foi preciso remover o gene III do vetor e com isso, a cauda de histidina que possibilitaria ~ a purificação por croma tograf ia de metais que lados foi perdida..

Apesti r desta desvantagem, esta estratégia foi escolhida por permitir a obtenção do fragmento Fab isolado, sem a necessidade da retirada da cauda de hist idina apôs a expressão, Desta forma, o método de purificação deverá levar este aspecto ern consideração. Metodologias convencionais, como ELISA e Western bJotting confirmaram a especificidade da ligação dos fragmentos Fab ao -antxge.no Dig-BSA» mas não foram capazes de discriminar diferenças entre as ligações dos 4 clones. : ; · 'Uma. técnica , .mais poderosa, e sensível como a SPR permitiu, mostrar diferenças e classificar os clones.. BIAcore :é um sistema que apresenta alta sensibilidade para análises de interações bioraoleculares em tempo real. SPR ' mede a ..alteração- do ângulo do índice de ref.ração . conforme a massa da molécula, presente. A detecção ocorre na superfície de um chip, onde é imobilizado um Ixgante, O analí to passa através de canais do chip, interagindo com o ligante e gerando uma resposta, medida em unidades de ressonância. CRU, resonance uni-ta) tS.GHASFQQRT, TUDOS, 2:008}.. A resposta relativa não pode ser medida durante a. aplicação do analito# pois pode haver uma alteração do índice de retração provocada pelo extrato bruto na superfí-cíe (efeito de bulk) , e n-ão uma interação, específica entre ligante e analito. Esta diferença .é. anulada quando, a resposta relativa é medida, após 5 segundos do término· da injeção cio analito. Uma célula de fluxo, contendo SSA imobilizado como referência foi utilizada para análise de ligação dos clones anti-digoxina, com resultado negativo, O ensaio indicou diferenças na ligação entre os clones anti-digoxina e o antígeno, com resultados variando de 206,9 RU a 1023,5 RU.. O clone 9, que possui uma giutamína (Q) substituindo uma arginina (R na posição .54 na região CDR2 da I.C. apresentou a ligação onais baixa entre os clones analisados.·. O clone 1.0 apresentou a maior afinidade de ligação, enquanto os clones 1 e .2 apresentaram afinidade intermediária e semelhante entre si, Os clones obtidos por phage display apresentam afinidade de ligação maior que a obtida pelo anticorpo original produzido pelo hibridoma murino que deu origem ao trabalho.

Acredita-se, desta forma, que o invento em questão possibilita gerar fragmentos Fab anti-digoxina monoclonais com maior afinidade e especificidade do que os policlonais fornecidos pelo soro de animais. A tecnologia de phage díspíay foi usada para atingir este objetivo. Fragmentos Fab monoclonais obtido com o presente método representam potencial de um produto com potência específica e dose mais precisa para a desintoxicação de pacientes sob tratamento de digoxina.

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Claims (7)

1) "MÉTODO DE PRODUÇÃO E OBTENÇÃO DE FRAGMENTO FAB DO ANTICORPO ΑΝΤΙ-DIGOXINA MONOCLONAL A PARTIR DA TÉCNICA DE CLONAGEM EM BIOLOGIA MOLECULAR", caracterizado pelo método para produção e obtenção de clones do fragmento Fab do anticorpo ant i-digoxina, .utilizando a tecnologia de clonagem em biologia molecular por ‘phage displayf e a caracterização da sua ligação ao antígeno, compreender as seguintes etapas: Etapa 1): - Obtenção e caracterização de albumina bovina, conjugada com digoxina (Dig-BSA) Fase. 1.1 - Obtenção dos conjugados Dig-BSA; Fase 1.2 - Caracterização dos conjugados Dig-BSA; Etapa 2) - Obtenção do anticorpo monoclonal anti-digoxina; Fase 2.1 - Purificação do anticorpo monoclonal anti- digoxina; Etapa 3). - Construção da biblioteca de Fab no fagomídeo pCombSX a partir de hibridomas antí-digoxina Fase 3.1 - Obtenção de cDWA dos hibridomas anti-digoxina; Fase 3.2 - Amplificação dos genes da LC e da porção Fd da HC; Fase: 3.3 - Obtenção de células competentes e vetor; Fase: 3.4 - Clonagem do repertório de gerxes í.C no vetor pCombSX; Fase 3.5 - Clonagem do repertório de genes HC na biblioteca LC; Etapa 4) - Phage display e enriquecimento da biblioteca Fab; Fase 4.1 - Preparação de fago auxiliar' (helper phage); Fase 4.2 - Geração da biblioteca de fagos Fab anti-digoxina (phage display); Etapa 5} - Expressão, de fragmentos Fab solúveis; Fase 5.1· - Quantificação dos. fragmentos Fab solúveis por' Enzyme-linked ímraunosorbent assay (ELISA) sanduíche; Etapa 6.) - Caracterização dos extratos brutos contendo fragmentos Fab dos clones obtidos por phage display Fase 6.1 - Ensaio de ligação do fragmento Fab solúvel ao antígeno pelo teste de ELISA; Fase 6.2 - Eletroforese em gel de poliacrllamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE); Fase. 6.3. - Ensaios de Western Blotting; Fase 6.4. - Análise de afinidade no BIAçore* T100.

2) "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo método extrair RNA total dos hibridomas anti--digoxina e amplificar os genes da LC e da HG, porção Fd (VH e CHI) das imunoglofeulinas por PCR.

3) "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo enriquecimento da biblioteca combinatória de fragmentos F.ab anti-digoxina por panning e nos ensaios de ligação ao anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma anti-digoxina e aos fragmentos Fab produzidos pelos clones compreender que a digoxina ê conjugada à albumina sérica bovina (BSA).

4) "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo método selecionar os clones de anti-dígoxina através da ligação com o antígeno,

5) "MÉTODO",· de? acordo com a reivindicação 1, caracterízaào pelo método expressar fragmentos Fab solúveis de ant x **digoxx na.

6) "MÉTODO"* de acordo· com .as. reivindicações anteriores, ca raccerizado pelas concentrações. de fragmentos Fab resultarem em: clone l - 6,67 pg/rnL; clone 2 ~ 10,Gi pg/rnL; clone 9 - 0,61 pg/mL e clone 10 - 1,7 3 μ-g/roL,

7) "MÉTODO", de acordo com as reivindicações anteriores-, caracterizado por ocorrer ligação específica dos quatro clones à Dig-BSA, sem evidência de- ligação, à BSA.