JP7173964B2 - 抗ｐ５３抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを対象とする抗体、およびこの抗体を作製するための方法に関する。
免疫応答は、克服されうる高度に特異的な認識イベントが、ほぼ全ての種類の外因性抗原を回避するように闘うことを目的として、進化の過程によって完全無欠なものとなった（ＦｌａｊｎｉｋおよびＫａｓａｈａｒａ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅ（２０１０）、１１（１）：４７～５９）。脊椎動物では、Ｔリンパ球およびＢリンパ球のいずれも、抗原に誘導される選択的な再配列を経る受容体を発達させて、類似する種に由来する高度に類縁の抗原性タンパク質内で生じうる可変性のうちで最も微細な可変性をも検出し（ＣｏｏｐｅｒおよびＡｌｄｅｒ、Ｃｅｌｌ（２００６）、１２４（４）：８１５～８２２）、これにより、外来からの侵入に対する障壁を確立した。この生得的能力は、わずかな構造的変動を伴う、高度に類似するタンパク質に対して多数の抗体を作出するのに利用されている（Ｌｏら、２０１４、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．、２、ＡＩＤ－０００７－２０１２）。さらにまた、標的アミノ酸残基上の、リン酸化、ユビキチン化、およびアセチル化など、わずかな翻訳後修飾を検出する抗体も作製され、これは、多種多様な生理学的過程および病理学的過程の機構的理解をもたらした。しかし、がんゲノム内のミスセンス突然変異のために注目されることが多い単一のアミノ酸変化の検出は、親タンパク質におけるフランキング領域の高度な相同性のために、選択的抗体の作出にとっての大きな難題となっている。突然変異していない天然タンパク質と交差反応しない突然変異特異的抗体を作製する試みがなされているが、これまでのところ、大半の取組みは、成功していない（Ｂｏｎｄｇａａｒｄら、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１４）、２７：１５９０～１５９８）。
ＥＧＦＲ、ＰＤ－１などの表面抗原に対するｍＡｂは、臨床状況で、処置のために使用され成功を収めているが（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉら、２００９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８（１）：１～９；ＰｈｉｌｉｐｓおよびＡｔｋｉｎｓ、２０１４、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７（１）：３９～４６）、核抗原に対するｍＡｂは一般に、有効となるために細胞膜を通過する上で難関に直面する。しかし、近年の研究は、核抗原に対する抗体が、実際に、治療的に有効であることを示しており（ＨｏｎｇおよびＺｅｎｇ、２０１２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（１１）：３７１５）、この手法が、将来的に成功しうることを約束している。
ｐ５３は、全てのがん型にわたり、最も突然変異する遺伝子であり、全ての腫瘍のうちの５０％を超える腫瘍が、これにおける遺伝子変更の何らかの形態を呈する（Ｆｏｒｂｅｓら、２０１５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３、Ｄ８０５～Ｄ８１１）。ｐ５３内の大半の突然変異は、約２００アミノ酸にわたる、中央のＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に見出され、同定された全てのｐ５３突然変異のうちの、約９０％を占める。ほぼ全てのＤＢＤ突然変異は、ゲノムの保護におけるｐ５３の多機能的な役割のために、腫瘍の抑制および治療に対する効果的な応答に不可欠な、野生型ｐ５３の機能の喪失をもたらす（ＶｏｕｓｄｅｎおよびＬｕ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００２）、２（８）：５９４～６０４；Ｆｒｅｅｄ－ＰａｓｔｏｒおよびＰｒｉｖｅｓ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（２０１２）、２６（１２）：１２６８～１２８６）。野生型機能の喪失の他に、ｐ５３内の突然変異はまた、がんの発症を促進し、また治療に対する効果的な応答も阻害する２つの主要な現象ももたらす。１つは、ｐ５３の突然変異体対立遺伝子が、野生型対立遺伝子と共存する場合に生じ、これにより、ヘテロオリゴマーを形成し、この結果として、残りの野生型ｐ５３機能の減弱化をもたらすドミナントネガティブ（ＤＮ）効果である（Ｋｅｒｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）、２５６：８２７～８３０）。加えて、とりわけ、野生型ｐ５３対立遺伝子が、ヘテロ接合性喪失のために失われる、がんの後期段階では、突然変異体ｐ５３対立遺伝子が単独で存在する結果として、がん細胞は、生存および浸潤特性を促進する、突然変異体ｐ５３による新規発がん機能の獲得（ＧＯＦ）に起因して、生存のために、突然変異体ｐ５３タンパク質に依存するようになる（Ｓａｂａｐａｔｈｙ、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）、５：２７６）。これらの過程における突然変異体ｐ５３の因果的役割は、その発現の低減、またはその機能の不活化により裏付けられており、この発現の低減または機能の不活化においては、ＤＮ機能およびＧＯＦ機能のいずれもがレスキューされえ、これは、がん細胞が治療的処置に対してより感受性となることを可能とする（Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１２）、２２：７５１～７６４）。これらのデータは、突然変異体ｐ５３をターゲティングする興味深い可能性を開くが、突然変異体ｐ５３の不活化を成功させるには、いくつかの難関が存在する。最も重要なこととして、ｐ５３内の全ての突然変異は、その野生型活性の喪失、および大半の場合に、ＤＮ効果を明白にもたらすが、ＧＯＦ特性は、全てではなく、一部の突然変異体に選択的なものであるようである（Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１２）、２２：７５１～７６４；Ｈａｎｅｌら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ（２０１３）、２０：８９８～９０９）ことに注目すべきであり、突然変異体ｐ５３のターゲティングは、各個別のｐ５３突然変異体を選択的に検出し、不活化させるために、より洗練された手法を必要とすることが強調される。
突然変異体ｐ５３の生物学を理解することは、突然変異体ｐ５３の、発がんおよび治療への応答における役割の解明にとっての基礎となっている。突然変異体ｐ５３が、どのようにして、その生存促進機能を果たすのかについての知見に関して、著しい進歩があったが、限界も存在する。例えば、全ての突然変異が、機能的に同様であるわけではなく（Ｓａｂａｐａｔｈｙ、２０１５、Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．５：２７６）、ｐ５３のトランス活性化ドメインおよびオリゴマー化ドメインにおいて見出される突然変異（これは、ある特定の集団では、極めて一般的である（Ａｃｈａｔｚら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、２４５：９６～１０２））は、さらなる評価を必要とする。
現行の技術は、ノックインマウスモデル、または野生型タンパク質を伴わずに、突然変異体タンパク質だけを発現するヒト腫瘍細胞系を用いているが、これらは、野生型タンパク質との共存における突然変異体タンパク質の役割を十全には反映しない場合がある。
数十年にわたり、突然変異体ｐ５３に対する抗体を作出しようとする試みがなされており、ｐ５３の、突然変異体コンフォメーションに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＰＡｂ２４０）、または野生型コンフォメーションに対するｍＡｂ（ＰＡｂ２４６）が利用可能である（Ｇａｎｎｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９９０）、９（５）：１５９５～１６０２）。しかし、これらの抗体は、十分に特異的ではなく、交差反応性を呈し、適正なコンフォメーションの検出に、極めて選択的な条件を必要とするので、それらの使用は限定されている。
ＶｏｊｔｅｓｅｋおよびＬａｎｅ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ（１９９３）、１０５（３）：６０７～６１２は、ＤＯ－１と称する、ヒトｐ５３のアミノ末端領域に対する抗体について記載しており、この抗体は、マウスｐ５３との交差反応性を伴わずに、ヒトｐ５３に対して高レベルの特異性を示す。
第１の態様では、本発明は、野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的な抗体を作製するための方法であって、免疫原として、（ｉ）突然変異と、突然変異に直接隣接する少なくとも１つのアミノ酸とを含む、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含むペプチドまたはポリペプチドを使用するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、足場配列は、溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドに由来し、抗原配列は、ペプチドもしくはポリペプチドの溶媒に接触可能な配列に挿入されるか、またはその全部もしくは一部を置換する。一部の実施形態では、溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドは、チオレドキシンであり、溶媒に接触可能な配列は、チオレドキシンの活性部位配列である。一部の実施形態では、免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドは、さらに、抗原配列と足場配列との間に、１または複数のリンカー配列を含む。一部の実施形態では、免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドは、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドは、さらに、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列の間に、リンカー配列を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列は、非同一である。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも５つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１つから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、配列番号３～１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
別の態様では、本発明は、本発明に従う抗体を作製するための方法により得られるか、または得ることが可能な抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的である抗体または抗原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１つから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、配列番号３～１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
別の態様では、本発明は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた、そのバリアント［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ；Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］を提供する。
一部の実施形態では、ＬＣ－ＣＤＲ１は、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つである。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つである。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ２は、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つである。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ］が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ （配列番号１９）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ （配列番号２３）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
［配列中、Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＴＥＹＴ （配列番号２５）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＮＮＧＶＴ （配列番号２６）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＥＹＴ （配列番号２９）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＮＰＹＳＧＧＴ （配列番号３０）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ］を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
一部の実施形態では、ＬＣ－ＣＤＲ１は、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つである。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
［配列中、Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つである。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ２は、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つである。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、本明細書で記載される、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１（配列番号３１）、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）、またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つ；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ（配列番号２０）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ（配列番号２１）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ（配列番号３２）、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ（配列番号３３）、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）、またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ（配列番号２７）［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ；Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号１８もしくは２２（図２４）、または配列番号２３７もしくは９４（図４９）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号２４もしくは２８（図２５）、または配列番号２３９、２４０、もしくは２４１（図５０）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）本明細書で記載される抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた、そのバリアント［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］を提供する。
一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ２は、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つである。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ３は、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）のうちの１つである。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＨＰＫＮＧＧＴ （配列番号４７）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ （配列番号４８）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＫＮＧＧＴ （配列番号５０）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＱＧＧＦＤＤＹ （配列番号５１）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ２は、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つである。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ３は、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）のうちの１つである。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、本明細書で記載される、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ（配列番号４１）；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ（配列番号４２）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ（配列番号４３）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号４６）；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ（配列番号５２）、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ（配列番号５３）、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］のうちの１つに対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号４０もしくは４４（図２８）、または配列番号２５１もしくは２５２（図５７）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号４５もしくは４９（図２９）、または配列番号２５３もしくは２５４（図５８）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）本明細書で記載される抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた、そのバリアントを提供する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）
を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、本明細書で記載される、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ（配列番号５９）；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ（配列番号６０）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ（配列番号６１）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ（配列番号６３）；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ（配列番号６４）；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ（配列番号６５）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号５８（図３２）または配列番号２４７（図５３）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号６２（図３３）または配列番号２４８（図５４）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）本明細書で記載される抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、薬物部分または検出用部分へとコンジュゲートさせた、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗原結合性断片またはポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される核酸を含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するための方法であって、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートをコードするベクターの発現に適する条件下で、宿主細胞を培養するステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートを回収するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、治療、または医学的処置の方法における使用のための、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、医学的処置の方法における使用のための医薬の製造における使用を提供する。
別の態様では、本発明は、疾患を処置する方法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、疾患を患う患者へと投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの処置または防止における使用のための、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、がんの処置または防止における使用のための医薬の製造における使用を提供する。
別の態様では、本発明は、がんを処置する方法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、がんを患う患者へと投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんを防止するか、またはがんの再発を防止する方法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、がんの危険性があるか、またはがんの再発の危険性があると考えられる患者へと投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法、任意に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象における疾患または状態を診断する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドターゲティング剤による処置のために、対象を選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの検出のための使用を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、診断剤または予後診断剤としての使用を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における使用を提供する。
別の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、対象へと投与するステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を検出するステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される免疫原を含むワクチン、任意に、がんワクチンを提供する。
別の態様では、本発明は、任意に、がんに対する、ワクチン接種の方法における使用のための、本明細書で記載される免疫原を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される免疫原の、任意に、がんに対する、対象のワクチン接種における使用のための医薬の製造における使用を提供する。
別の態様では、本発明は、任意に、がんに対して、対象にワクチン接種するための方法であって、対象へと、本明細書で記載される免疫原を投与するステップを含み、これにより、対象に、がんに対してワクチン接種する方法を提供する。
本発明の多様な態様に従う、一部の実施形態では、がんは、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現するか、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を含む、１または複数の細胞を含むがんである。突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、選択された抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、細胞、または免疫原に対応しうる。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドおよび野生型ｐ５３ポリペプチド
ｐ５３腫瘍抑制因子は、ヒトでは、ＴＰ５３遺伝子によりコードされるタンパク質である。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷および他のゲノム異常に対する細胞の応答において、最重要の役割を果たす。ｐ５３の活性化は、細胞周期の停止、ＤＮＡの修復、またはアポトーシスをもたらす。ｐ５３をコードする遺伝子の突然変異は、様々ながんの発生および進行に関与している（ＭｕｌｌｅｒおよびＶｏｕｓｄｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１４）、２５：３０４～３１７）。
ホットスポット突然変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、およびＲ２７３Ｈ）を含む、ある特定のｐ５３突然変異は、ｐ５３依存性腫瘍抑制因子活性の喪失を結果としてもたらすだけでなく、発がん活性の獲得も結果としてもたらす。
本明細書で言及される野生型ｐ５３ポリペプチドは、所与の動物についての、ｐ５３の基準アミノ酸配列を含みうるか、またはこれからなりうる。ｐ５３の基準アミノ酸配列は、当業者に公知のデータベースから、検索することができる。このようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、およびＩｎｔｅｒＰｒｏを含む。
動物は、哺乳動物でありうる。一部の実施形態では、動物は、ヒトでありうる。一部の実施形態では、動物は、非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯動物（Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば、乳牛、またはＢｏｓ目の任意の動物を含む）、ウマ（Ｅｑｕｉｄａｅ目の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長動物）でありうる。
一部の実施形態では、野生型ｐ５３ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６３７（Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ）のアミノ酸配列：
Figure 0007173964000001
を含みうるか、またはこれからなりうる。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、例えば、野生型ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列の、１または複数のアミノ酸の、挿入、欠失、または置換の結果として、野生型ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、ｐ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子突然変異であって、ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こす突然変異の結果として生じうる。ｐ５３の突然変異は当技術分野では公知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＭｕｌｌｅｒおよびＶｏｕｓｄｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１４）、２５：３０４～３１７において記載されており、例えば、３０５～３０８頁にわたる表１を参照されたい。
本発明は、特に、野生型ｐ５３ポリペプチドと、極めてわずかだけ異なり、野生型ｐ５３ポリペプチドへの著しい結合を呈さない、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体に関する。
一部の実施形態では、抗体は、野生型ｐ５３ポリペプチドと、１０アミノ酸またはこれより少数、例えば、５、４、３、もしくは２アミノ酸またはこれより少数だけ異なる突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、野生型ｐ５３ポリペプチドと、１アミノ酸だけ異なる突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能である。
すなわち、本発明は、ｐ５３の、単一アミノ酸突然変異バリアントを認識することが可能な抗体を提供する。
一部の実施形態では、野生型ｐ５３のアミノ酸配列と異なる、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸は、ＤＮＡ結合性ドメインの配列内にある。
ｐ５３のＤＮＡ結合性ドメインは、進化において保存されており、当業者は、例えば、ヒト野生型ｐ５３ポリペプチドの、ＤＮＡ結合性ドメイン配列を参照することにより、所与の野生型ｐ５３ポリペプチドのＤＮＡ結合性ドメインを同定することが可能である。ヒト野生型ｐ５３ポリペプチドの、ＤＮＡ結合性ドメインは、以下の配列：
Figure 0007173964000002
を有する、配列番号１（例えば、Ｆｒｅｅｄ－ＰａｓｔｏｒおよびＰｒｉｖｅｓ、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１２）、２６：１２６８～１２８６を参照されたい）の１０１～３０６位に対応する。
ｐ５３のＤＮＡ結合性ドメイン内の、ｐ５３の突然変異の、９つのホットスポットであって、配列番号１と比べて番号付けされた、２４８、２７３、１７５、１７６、１７９、２２０、２４５、２４９、２８２位に対応する、９つのホットスポットが同定されており、さらなるホットスポットが、３３７位において同定されている。一部の実施形態では、本発明に従う抗体が特異的に結合する、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、２４８、２７３、１７５、１７６、１７９、２２０、２４５、２４９、２８２、および３３７位のうちの１または複数において、野生型ｐ５３の配列と比べた、アミノ酸の差違を含む。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドは、２４８、２７３、１７５、１７６、１７９、２２０、２４５、２４９、２８２、または３３７位のうちの１つにおいて、野生型ｐ５３の配列と比べた、アミノ酸の差違を含む。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、特異的な、公知の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、配列番号１と比べて番号付けされた、以下のアミノ酸置換：Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、Ｒ３３７Ｈのうちの１つを含むｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうる。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、以下の配列のうちの１つを含むか、またはこれらのうちの１つからなる、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうる。
Figure 0007173964000003
Figure 0007173964000004
Figure 0007173964000005
Figure 0007173964000006
当業者は、例えば、配列アライメントにより、他の種のｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列内の、ｐ５３ポリペプチドの、同等な突然変異を、たやすく決定することが可能である。
ヒト野生型ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に従い番号付けされた、所与のｐ５３突然変異に対する言及は、他の種、例えば、マウスまたはラットにおける、ｐ５３と相同なタンパク質内の同等な突然変異を含む。
例えば、本明細書における、「Ｒ１７５Ｈ」に対する言及は、ｐ５３のマウス相同体のアミノ酸配列の１７２位における、アルギニンから、ヒスチジンへの、同等な突然変異（すなわち、Ｒ１７２Ｈ）を包含し、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｏｌｉｖｅら、２００４、Ｃｅｌｌ、１１９、８４７～８６０を参照されたい。同様に、本明細書における、「Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチド」に対する言及は、ｐ５３のマウス相同体の、同等なＲ１７２Ｈ突然変異体ポリペプチドを含むポリペプチドを包含する。
免疫原
本発明に従う抗体は、本明細書で記載される方法に従い作製され、免疫原を使用して惹起される。
本発明では、免疫原とは、ペプチド分子またはポリペプチド分子である。本明細書で使用される「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結された、２つまたはこれを超えるアミノ酸モノマーの鎖である。ペプチドは、典型的に、約２～５０アミノ酸の範囲の長さを有する。「ポリペプチド」とは、２つまたはこれを超えるペプチドによるポリマー鎖である。ポリペプチドは、典型的に、約５０アミノ酸を超える長さを有する。
本発明の方法では、免疫原として、（ｉ）突然変異と、突然変異のいずれかの側の少なくとも１つのアミノ酸とを含む、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含むペプチドまたはポリペプチドを使用する方法により、抗体を惹起する。
抗原配列
抗原配列は、方法により作製された抗体が、結合することが可能な、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異を含む、すなわち、抗原配列は、野生型ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて突然変異した、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの位置を含む。
抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、突然変異に直接隣接する少なくとも１つのアミノ酸を含む。すなわち、配列は、突然変異したｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列内の、突然変異した位置のすぐ上流（すなわち、これに対するＮ末端）またはすぐ下流（すなわち、これに対するＣ末端）に、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。こうして、突然変異は、それが、突然変異体ｐ５３ポリペプチド内で生じるアミノ酸のすぐの配列の文脈で提示される。
例示を目的として、上記の配列番号１により表された、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に言及すると、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも「ＲＨ」または「ＨＣ」を含む。
一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸のうちの１つを含みうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ下流に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸のうちの１つを含みうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸のうちの１つを含むことが可能であり、かつ、突然変異した位置のすぐ下流に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のアミノ酸のうちの１つを含みうる。
一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１２、１１、または１０以下のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ下流に、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１２、１１、または１０以下のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１２、１１、または１０以下のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなることが可能であり、かつ、突然変異した位置のすぐ下流に２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１２、１１、または１０以下のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。
一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、１つ～２つ、１つ～３つ、１つ～４つ、１つ～５つ、１つ～６つ、１つ～７つ、１つ～８つ、１つ～９つ、１つ～１０、１つ～１１、１つ～１２、１つ～１３、１つ～１４、１つ～１５、または１つ～２０のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ下流に、１つ～２つ、１つ～３つ、１つ～４つ、１つ～５つ、１つ～６つ、１つ～７つ、１つ～８つ、１つ～９つ、１つ～１０、１つ～１１、１つ～１２、１つ～１３、１つ～１４、１つ～１５、または１つ～２０のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流に、１つ～２つ、１つ～３つ、１つ～４つ、１つ～５つ、１つ～６つ、１つ～７つ、１つ～８つ、１つ～９つ、１つ～１０、１つ～１１、１つ～１２、１つ～１３、１つ～１４、１つ～１５、または１つ～２０のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなることが可能であり、かつ、突然変異した位置のすぐ下流に、１つ～２つ、１つ～３つ、１つ～４つ、１つ～５つ、１つ～６つ、１つ～７つ、１つ～８つ、１つ～９つ、１つ～１０、１つ～１１、１つ～１２、１つ～１３、１つ～１４、１つ～１５、または１つ～２０のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。
一部の実施形態では、抗原配列の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、突然変異した位置のすぐ上流および下流に、７つ～１１、３つ～７つ、または２つ～５つのアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列（突然変異と、上流／下流のアミノ酸とを含む）は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０のアミノ酸のうちの１つを含みうるか、またはこれからなりうる。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、５０、４５、４０、３５、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１２、１１、または１０以下のアミノ酸を含みうるか、またはこれらからなりうる。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、２～５０、５～４０、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、８～３０、８～２５、８～２０、８～１５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、または１０～１５アミノ酸の長さでありうる。一部の好ましい実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列は、５～２０または８～２０アミノ酸の長さでありうる。
一部の実施形態では、免疫原の抗原配列は、単一コピーを超える突然変異を含む。すなわち、一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、２つまたはこれを超えるアミノ酸配列を含む。抗原配列が、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、複数のアミノ酸配列を含む実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、各アミノ酸配列は、本明細書で記載される実施形態に従い、独立に規定されうる。
例示を目的として、上記の配列番号１により表された、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に言及すると、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、１つを超えるアミノ酸配列を含む抗原配列は、配列「ＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤｇｓｇＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ」（配列番号９０）（小文字は、可撓性のセリン／グリシンリンカー配列を指し示す）を含みうる。この配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、２つのアミノ酸配列である、（１）ＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤと、（２）ＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲとを含むことが明らかであろう。
一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸配列のうちの１つを含む。一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つ、３つ、または４つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、６つ、５つ、４つ、または３つ以下のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、２つまたは３つのアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
抗原配列が、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、１つを超えるアミノ酸配列を含む実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、各アミノ酸配列は、同一でありうる。一部の実施形態では、抗原配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、非同一のアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、各アミノ酸配列は、非同一でありうる。
抗原配列が、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、１つを超えるアミノ酸配列を含む、一部の実施形態では、抗原配列は、さらに、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列の間に、リンカー配列を含む。リンカー配列については、本明細書の下記で記載される。
足場配列
免疫原はまた、溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列も含む。
溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすことにより、足場配列は、免疫原の抗原配列に対して方向付けられた抗体を惹起する機会をもたらす。とりわけ、このような立体配置は、抗体が、抗原配列に、物理的に接触することを可能とする。
足場配列が、溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすのかどうかは、免疫原のアミノ酸配列に基づき、決定または予測されうる。
溶媒に接触可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列、および／または溶媒に接触不可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列は、アミノ酸の配列に基づき、予測される場合もあり、アミノ酸配列の三次元構造に基づき、予測される場合もある。溶媒への接触可能性は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ａｌｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４、１５（３）において総説されている通り、接触可能表面積（ＡＳＡ）を計算することにより、予測されうる。ＡＳＡは、例えば、シュレーク－ラプリー（ローリングプローブ）アルゴリズム、Ｚレイヤー積分、交差部、ＬＣＰＯ（ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｏｖｅｒｌａｐ）、または出力線図を使用して計算されうる。アミノ酸配列のＡＳＡを予測するためのツールは、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、およびマルコフ連鎖モデル（ＭＣＭ）を含む。溶媒への接触可能性を予測するのに使用されうるソフトウェアは、ＡＳＡｖｉｅｗ、ＡＣＣｐｒｏ、ＰＤＢｅＰＩＳＡ、ＣＣＰ４、ＧＥＴＡＲＥＡ、ＤＳＳＰ、ＰｒｏｔＳＡ、ＮＡＣＣＥＳＳ、ＡＣＣＥＳＳ、ＰＯＰＳ－Ｒ、ＳＥＲＦ、ＮｅｔＳｕｒｆＰ、ＡＳＡＰ、ＳＡＮＮ、およびＳＡＢＬＥを含む。ＡＣＣＰｒｏ５．１は、１Ｄ再帰型ニューラルネットワークアルゴリズムを実装する。
一部の実施形態では、足場配列は、溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドに由来する。
一部の実施形態では、抗原配列が、ペプチドもしくはポリペプチドの溶媒に接触可能な配列に挿入されるか、またはその全部もしくは一部を置換することにより、溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列がもたらされる。このような実施形態では、足場配列が、抗原配列により中断されることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、抗原配列は、ペプチドまたはポリペプチドの溶媒に接触可能な配列であって、足場配列が由来する配列内の２つのアミノ酸の間に挿入されうる。一部の実施形態では、抗原配列は、溶媒に接触可能な配列の、１または複数の残基に代えて挿入されうる。
一部のペプチド／ポリペプチドについては、溶媒に接触可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列、および／または溶媒に接触不可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列は、公知であるか、または予測され、当業者に公知のデータベースであって、ＡＳＡｖｉｅｗを含むデータベースを参照することにより、当業者により同定されうる。溶媒に接触可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列、および／または溶媒に接触不可能なアミノ酸もしくはアミノ酸の配列はまた、ペプチド／ポリペプチドのアミノ酸の配列に基づいて予測される場合もあり、本明細書の上記で記載されたツールを使用して、ペプチド／ポリペプチドのアミノ酸配列の三次元構造に基づいて予測される場合もある。
本発明に従う免疫原では、任意の適切な足場配列が使用されうる。一部の実施形態では、足場配列は、
ａ）足場配列内に挿入された抗原配列が、フォールディングした足場配列の表面上に提示され；かつ／または
ｂ）足場配列のフォールディングおよび／もしくは三次元構造が、抗原配列により、実質的に変化しないか、もしくは破壊されず；かつ／または
ｃ）足場配列が、免疫原の高度な発現および／もしくは容易な精製をもたらし；かつ／または
ｄ）足場配列が、免疫原性である
ように選択されうる。
当業者は、例えば、アミノ酸配列／タンパク質構造、データベースの参照、または経験的解析による、アルゴリズムベースの予測を使用する、足場／免疫原配列の解析により、上記で列挙された特性を保有する足場配列を、たやすく同定することが可能である。
一部の実施形態では、足場配列が由来する、溶媒に接触可能な配列を含むペプチド／ポリペプチドは、チオレドキシンである。チオレドキシンの構造および機能については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｅｔ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｓ、Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ（２０１０）、１３：１２０５～１２１６において記載されている。Ｂａｒｒｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ（２００４）、３３（１）：１５３～１５９（参照により全体において本明細書に組み込まれる）は、挿入されたアミノ酸配列に特異的な抗体を作製するための、細菌チオレドキシンの活性部位への、アミノ酸配列の挿入について記載する。
一部の実施形態では、チオレドキシンは、配列番号１７に従うアミノ酸配列、またはこの断片であって、少なくとも２０のアミノ酸（任意に、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００のアミノ酸のうちの１つ）を有し、これに対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、アライメントに従う）を有し、活性部位のモチーフである、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号９１）を有する、断片を含む：
ＭＳＤＫＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＣＧＰＣＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＡ （配列番号１７）
一部の実施形態では、チオレドキシンの溶媒に接触可能な配列は、活性部位配列である。チオレドキシンの活性部位配列は、多様な由来のチオレドキシン中に保存されたモチーフである、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓに対応する。一部の実施形態では、抗原配列が、この配列に挿入されるか、またはその全部または一部を置換する。一部の実施形態では、抗原配列は、活性部位配列のＮ末端Ｃｙｓ残基の後方、またはＧｌｙ残基の後方、またはＰｒｏ残基の後方に挿入される。一部の実施形態では、抗原配列は、チオレドキシンのアミノ酸配列内の活性部位配列の、Ｎ末端のＣｙｓ残基のすぐ上流に挿入される。一部の実施形態では、抗原配列は、チオレドキシンのアミノ酸配列内の活性部位配列の、Ｃ末端のＣｙｓ残基のすぐ下流に挿入される。
一部の実施形態では、足場配列は、配列番号１７を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列番号１７、または少なくとも２０のアミノ酸（任意に、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００のアミノ酸のうちの１つ）を有する、この断片に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、足場配列は、免疫原の抗原配列の表面における配向および／または溶媒への露出を容易とするように、１または複数の、さらなるアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、足場は、免疫原の配列中に提供される抗原配列の表面における配向および／または溶媒への露出を容易とするように、抗原配列の各末端のうちの１つにおいて、アミノ酸残基を含みうる。
例示を目的として、図１Ａ（すなわち、配列番号８０）に示された、Ｒ１７５Ｈ免疫原に言及すると、免疫原の足場（配列番号８０の１～３５および９１～１６５位）は、抗原配列が、免疫原の配列内で、プロリン残基（配列番号８０の３５および９１位）により挟まれるように、抗原配列のインサートに隣接する、さらなるプロリン残基を含む。
リンカー配列
免疫原は、アミノ酸配列の間に、１または複数のリンカー配列を含みうる。上記で説明した通り、免疫原は、抗原配列内の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列の間に、リンカー配列を含みうる。
一部の実施形態では、免疫原は、さらに、抗原配列と足場配列との間に、１または複数のリンカー配列を含みうる。抗原配列が、足場配列に挿入されるか、またはその全部もしくは一部を置換する実施形態では、リンカー配列は、抗原配列の、一方または両方の「末端」に提供されうる。例示を目的として述べると、免疫原は、以下の構造：
［足場配列］－｛リンカー｝－［抗原配列］－｛リンカー｝－［足場配列］
を含みうる。
当業者には、リンカー配列が公知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）、６５（１０）：１３５７～１３６９において記載されている。
一部の実施形態では、リンカー配列は、可撓性のリンカー配列でありうる。可撓性のリンカー配列は、リンカー配列により連結された、アミノ酸配列の相対的運動を可能とすることから、配列の、抗原結合性分子への接触可能性を増強すると有利である。当業者には、可撓性のリンカーが公知であり、いくつかは、上記で、参照により本明細書に組み込まれた、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）、６５（１０）：１３５７～１３６９において同定される。可撓性のリンカー配列は、高比率のグリシン残基および／またはセリン残基を含むことが多い。
一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基および／または少なくとも１つのセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、グリシン残基およびセリン残基からなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、交互に現れるグリシン残基およびセリン残基（すなわち、「ＧＳＧＳ」（配列番号９２）など）を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、または１～２０アミノ酸の長さを有する。
本発明に従う抗原配列内の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの複数の配列の間に提供される可撓性のリンカー配列は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列の柔軟な相対的配置を可能とする。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列の間のリンカー配列は、グリシン残基およびセリン残基を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、交互に現れるグリシン残基およびセリン残基を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１～２、１～３、１～４、または１～５アミノ酸の長さの、交互に現れるグリシン残基およびセリン残基を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列の間のリンカー配列は、配列ＧＳＧ（配列番号８９）を含むか、またはこれからなる。
免疫原は、抗原配列、足場配列、および任意のリンカー配列に加えて、さらなるアミノ酸またはアミノ酸配列を含みうる。例えば、免疫原は、免疫原の、発現、フォールディング、トラフィッキング、プロセシング、または精製を容易とするアミノ酸配列を含みうる。例えば、免疫原は、任意に、Ｎ末端またはＣ末端において、Ｈｉｓ（例えば、６×Ｈｉｓ）、Ｍｙｃ ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｅ、またはビオチンタグをコードする配列を含みうる。
免疫原についての例示的な実施形態
本発明は、（ｉ）Ｒ１７５Ｈ突然変異を含むＲ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と、突然変異のいずれかの側の少なくとも１つのアミノ酸とを含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含む免疫原を提供する。一部の実施形態では、免疫原は、１つを超える、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含み、一部の実施形態では、免疫原は、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのこのような配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、異なる長さの、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチド（Ｒ１７５Ｈ突然変異を含む）の配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、抗原配列は、５～２２、７～２０、または９～１８アミノ酸の長さの、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、ＱＨＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲＣＳＤ（配列番号７７）、ＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ（配列番号７８）、およびＶＲＨＣＰＨＨＥＲ（配列番号７９）のうちの１または複数を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号７７、７８、および７９を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号７７、７８、および７９を含み、かつ、配列番号７７、７８、および７９の間に、本明細書の上記で記載されたリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号７７、７８、および７９を含み、抗原配列と足場配列との間にリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、以下の配列：
Figure 0007173964000007
を含むか、またはこれからなる。
本発明は、（ｉ）Ｒ２４８Ｑ突然変異を含むＲ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と、突然変異のいずれかの側の少なくとも１つのアミノ酸とを含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含む免疫原を提供する。一部の実施形態では、免疫原は、１つを超える、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含み、一部の実施形態では、免疫原は、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのこのような配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、異なる長さの、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３ポリペプチド（Ｒ２４８Ｑ突然変異を含む）の配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、抗原配列は、１０～２２、１２～２０、または１５～１８アミノ酸の長さの、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、ＳＣＭＧＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤ（配列番号８１）、ＭＧＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤ（配列番号８２）、およびＮＳＳＣＭＧＧＭＮＱＲＰＩＬＴ（配列番号８３）のうちの１または複数を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８１、８２、および８３を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８１、８２、および８３を含み、かつ、配列番号８１、８２、および８３の間に、本明細書の上記で記載されたリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８１、８２、および８３を含み、抗原配列と足場配列との間にリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、以下の配列：
Figure 0007173964000008
を含むか、またはこれからなる。
本発明は、（ｉ）Ｒ２７３Ｈ突然変異を含むＲ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と、突然変異のいずれかの側の少なくとも１つのアミノ酸とを含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含む免疫原を提供する。一部の実施形態では、免疫原は、１つを超える、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含み、一部の実施形態では、免疫原は、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのこのような配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、異なる長さの、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチド（Ｒ２７３Ｈ突然変異を含む）の配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、抗原配列は、５～２０、６～１８、または１０～１５アミノ酸の長さの、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３ポリペプチドの配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、ＲＮＳＦＥＶＨＶＣＡ（配列番号８５）、ＮＬＬＧＲＮＳＦＥＶＨＶＣＡＣ（配列番号８６）、およびＧＲＮＳＦＥＶＨＶＣＡＣＰ（配列番号８７）のうちの１または複数を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８５、８６、および８７を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８５、８６、および８７を含み、かつ、配列番号８５、８６、および８７の間に、本明細書の上記で記載されたリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、配列番号８５、８６、および８７を含み、抗原配列と足場配列との間にリンカー配列を含む抗原配列を含む。一部の実施形態では、免疫原は、以下の配列：
Figure 0007173964000009
を含むか、またはこれからなる。
抗体を作製するための方法
本発明は、抗体を作製するための方法を提供する。方法は、典型的に、動物の免疫系により、外来（すなわち、非宿主）であると認識される素材を、動物へと導入する結果として、動物による、素材に結合することが可能な抗体の選択的産生をもたらすステップを伴う。
本明細書では、免疫応答を引き起こすのに使用される素材は、免疫原と称される。免疫原は、抗原を含むか、またはこれからなる場合もあり、これへとプロセシングされる場合もある。本明細書で使用される「抗原」とは、獲得免疫応答、特に、Ｂリンパ球媒介性（体液性）獲得免疫応答を刺激することにより、抗体の産生を刺激することが可能な分子を指す。本明細書で使用される「抗原性」という用語は、獲得免疫応答、特に、Ｂリンパ球媒介性獲得免疫応答を刺激することにより、抗体の産生を刺激する、分子の能力を指す。
本発明では、免疫原は、ペプチド分子またはポリペプチド分子でありうる。
抗原に特異的に結合することが可能な抗体を産生する、動物免疫系の能力は、多様な調査研究、診断、および治療への適用において、目的の分子を検出するための抗体を作出するのに使用されうる。
当技術分野では、動物の免疫化により、抗体を作製するための方法が周知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて記載されている。特に、第６章は、抗体の作製のための、動物の免疫化についての詳細な記載を提示する。
抗体の作製は、動物に、免疫原を投与して、抗原特異的抗体の産生を刺激するステップを伴い、次いで、抗原特異的抗体は、動物から回収されうる。
本明細書で使用される抗体を「作製するステップ」とは、抗体を創出する工程であって、例えば、免疫化のための免疫原を調製するステップ、動物を免疫化するステップ、ハイブリドーマの形成、抗体を回収するステップ、標的への結合についてスクリーニングするステップ、抗体をアイソタイピングするステップ、抗体を精製するステップ、または抗体を標識化するステップのうちの１または複数を含みうる工程を指す。
本発明の方法では、抗体は、動物を、免疫原で免疫化することにより作製される。免疫原による免疫化に応答して、抗体を産生することが可能な、任意の動物が、本方法に従い、有用である。本発明の方法は、疾患を診断または処置するための方法でも、手術の方法でもないことが理解されるであろう。一部の実施形態では、動物は、非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯動物（Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば、乳牛、またはＢｏｓ目の任意の動物を含む）、ウマ（Ｅｑｕｉｄａｅ目の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長動物）でありうる。特に、動物は、マウス（例えば、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（例えば、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）でありうる。特定の実施形態では、動物は、マウスである。本方法では、免疫原は、免疫化を目的として、動物へと投与される。
本発明に従う免疫原による、動物の免疫化は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（参照により全体において本明細書に組み込まれる）、特に、第６章に記載された手段など、任意の適切な手段によりなされうる。免疫化のための素材は、必要に応じて製剤化されうる。例えば、免疫原ペプチド／ポリペプチドは、滅菌生理食塩液中で希釈される場合があり、安定的なエマルジョンを形成するように、アジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバントおよび／またはＣｐＧ）と組み合わされうる。個々の免疫化のための、免疫原の適量は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（上記で、参照により本明細書に組み込まれた）を参照することにより、当業者により、たやすく決定されうる。免疫化に適切な容量および濃度もまた、当業者により、たやすく決定されうる。
本発明に従う抗体を作製するための方法は、抗体の産生のためのスクリーニングのステップを含む場合があり、例えば、試料（例えば、血液試料）は、投与後の適切な時間に、動物から得られる場合があり、抗体の産生について解析されうる。当業者には、抗体の産生の検出および定量化のためのイムノアッセイが周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１４（上記で、参照により本明細書に組み込まれた）、特に、第１５章において記載されている。例えば、血液試料、血漿試料、血清試料、または腹水試料は、動物から回収される場合があり、例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーにより解析されうる。
本発明に従う方法により作製される抗体は、当業者に公知の方法により、突然変異体ｐ５３ポリペプチドおよび／または野生型ｐ５３ポリペプチドへの結合について解析されうる。例えば、解析は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、ＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により実施されうる。
解析はまた、方法により作製される抗体についてのエピトープの解析も含むことが可能であり、抗体の同一性（例えば、配列）を決定する解析を含みうる。このような解析は、例えば、質量分析による、抗体のシーケンシングを含みうる。
一部の実施形態では、抗体を作製するための方法は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体を単離するステップを含みうる。一部の実施形態では、１または複数の抗体は、動物から単離される。抗体は、例えば、動物の血液、血漿、血清、または腹水から回収されうる。一部の実施形態では、抗体は、本発明に従う免疫原で免疫化された動物から得られた細胞から単離されうる。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球である。一部の実施形態では、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＢリンパ球に由来する細胞培養物上清から単離されうる。
ポリクローナル抗体は、本発明に従う投与後、適切な時点において、動物から得られた血液または血清から、直接回収されうる。
一部の実施形態では、抗体は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、１または複数の抗体を産生するハイブリドーマから得られる。一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマの培養物の細胞培養物上清から得られる。一部の実施形態では、抗体は、目的の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、１または複数の抗体を産生するハイブリドーマで免疫化された動物の、血液、血漿、血清、または腹水から得られる。
当業者には、抗体を、抗体を含有する試料（例えば、細胞、細胞抽出物、細胞培養培地、血液、血漿、血清、腹水）から単離する（すなわち、精製する）ための方法が周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（上記で、参照により本明細書に組み込まれた）、特に、第１０章において詳細に記載されている。方法は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧベースの精製、ゲル電気泳動、透析、および標的への結合に基づくアフィニティー精製を含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、目的の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、１または複数の抗体を産生するハイブリドーマを作製するステップを含む。方法は、動物から単離された、目的の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、１または複数の抗体を産生することが可能な細胞を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製するステップを含む。
特に、本発明の方法は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能なモノクローナル抗体を作製するための方法である。これは、動物を、本発明に従う免疫原により免疫化し、その後、動物から単離された細胞から、モノクローナルハイブリドーマを作出し、ハイブリドーマが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、単一種類（すなわち、単一特異性）の抗体を作製することにより達成される。
当業者には、ハイブリドーマを形成するための方法が周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、２０１４；Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（上記で、参照により本明細書に組み込まれた）、特に、第７章において記載されている。略述すると、本発明に従い、動物を免疫化し、獲得免疫応答を刺激し、Ｂリンパ球を、動物から単離し、ハイブリドーマを作製するのに適する骨髄腫細胞系と融合させる。Ｂリンパ球と、骨髄腫細胞とは、当業者に公知の方法を使用して、融合されうる。例えば、細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中の共遠心分離により、融合されうる。融合後、細胞を、限界希釈により、組織培養物プレートに、ウェル１つ当たり、およそ単一の細胞へと播種し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。ハイブリドーマは、当技術分野で公知の選択用培地（例えば、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）を含有する培地）であって、融合しなかったリンパ球および骨髄腫細胞は、増殖または存続することが不可能な培地を使用する培養により選択されうる。
本発明の方法により作製される抗体は、当業者に公知の方法を使用して、大スケールで作製されうる。ハイブリドーマは、細胞培養の標準的な方法を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で繁殖する場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、宿主動物の腹水として繁殖する場合もある。一部の実施形態では、本発明の方法は、ハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物によって繁殖させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、宿主動物に、ハイブリドーマを注射することにより、ハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて繁殖させるステップを含む。
本発明に従う抗体はまた、本明細書の下記で記載される通り、組換えによっても作製されうる。例えば、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅する、オリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により、抗体を産生するＢ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離される場合があり、ポリヌクレオチドの配列が決定されうる。重鎖および軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主細胞、または他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞へとトランスフェクトされると、モノクローナル抗体を産生する、適切な発現ベクターへとクローニングされうる。
抗体
本発明の抗体は、野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的である。
抗体は、特定の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、野生型ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。「結合することが可能でない」とは、抗体が、ペプチド／ポリペプチドへの結合を、実質的に呈さないか、または例えば、非特異的結合レベルを上回る、ペプチド／ポリペプチドへの著しい結合を呈さないことを意味する。
本明細書で使用された、所与のポリペプチド／ペプチド「に特異的」な抗体は、ポリペプチド／ペプチドに対する特異的結合を提示する。「特異的結合」とは、非特異的ではない相互作用である。特異的結合は、ファンデルワールス力、静電相互作用、水素結合、および疎水性相互作用などの非共有結合的相互作用により媒介される。本発明の抗体は、好ましくは、抗体が、野生型ｐ５３および／またはｐ５３の他の異なる突然変異体より特異的な、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対する特異的結合を提示する。
別の基準ペプチド／ポリペプチドより、所与のペプチド／ポリペプチドに特異的な抗体は、基準ペプチド／ポリペプチドに対する、抗体の結合のアフィニティーより大きなアフィニティーで、所与のペプチド／ポリペプチドに結合しうる。所与のペプチド／ポリペプチドに対して「より大きなアフィニティー」を提示する抗体は、このペプチド／ポリペプチドに、基準ペプチド／ポリペプチドへの結合の強度と比較して、より大きな強度で結合する。本発明の抗体は、抗体が特異的な突然変異体ｐ５３ポリペプチドに、抗体による、野生型ｐ５３および／またはｐ５３の他の異なる突然変異体への結合のアフィニティーと比較して、より大きなアフィニティーで結合しうる。
抗体の、その抗原に対するアフィニティーとは、抗体が抗原に結合する強度を指す。抗体のアフィニティーは、当業者に周知の方法により決定されうる。このような方法は、例えば、精製された抗原を伴うＳＰＲアッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ解析を含む。結合は、以下の用語：抗体／抗原複合体が、どのくらい迅速に形成されるのかを表す定数である、「オン速度」のｋｏｎ；抗体／抗原複合体が、どのくらい迅速に解離するのかを表す定数である、「オフ速度」のｋｏｆｆ；および式ＫＤ＝（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）に従い計算される平衡解離定数のＫＤにより表されうる。
抗体の、ペプチド／ポリペプチドに対する結合のアフィニティーは、定量的に決定されうる。一部の実施形態では、所与のペプチド／ポリペプチドに対して、基準ペプチド／ポリペプチドと比較して、より大きなアフィニティーを提示する抗体は、所与のペプチド／ポリペプチドに、抗体の、基準ペプチド／ポリペプチドへの結合についての値未満のＫＤ値またはＥＣ５０値で結合する。
「交差反応性」とは、１つを超えるペプチド／ポリペプチドに結合する、抗体の能力を指す。すなわち、２つまたはこれを超えるペプチド／ポリペプチドへの結合を提示する抗体は、これらのペプチド／ポリペプチドに対して、「交差反応性」であるという。本発明に従う抗体は、好ましくは野生型ｐ５３、および／または抗体が特異的な突然変異体ｐ５３ポリペプチド以外の、ｐ５３の突然変異体に対して、小さな交差反応性を提示するか、または交差反応性を提示しない。「交差反応性ではない」とは、抗体が、それぞれのペプチド／ポリペプチドに対して、小さな交差反応性を呈するか、交差反応性を呈さないか、または実質的に結合しないことを意味する。
本発明に従う抗体は、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対して、野生型ｐ５３ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトｐ５３ポリペプチドの、所与の突然変異体に対して、野生型ヒトｐ５３ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。一部の実施形態では、抗体は、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、またはＲ３３７Ｈのうちの１つに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のうちの１つのアミノ酸配列、またはこの断片を含むペプチド／ポリペプチドに対して、配列番号１のアミノ酸配列、またはこの断片を含むペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
本発明に従う抗体は、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対して、他の突然変異体ｐ５３ポリペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。一部の実施形態では、抗体は、ヒトｐ５３ポリペプチドの、所与の突然変異体に対して、ヒトｐ５３ポリペプチドの、他の突然変異体に対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ１７５Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ１７５Ｈ突然変異を含む、配列番号３のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｑに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｑ突然変異を含む、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｈ突然変異を含む、配列番号５のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｗに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｗ突然変異を含む、配列番号６のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｓに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｓ突然変異を含む、配列番号７のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｃに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｃ突然変異を含む、配列番号８のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２８２Ｗに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２８２Ｗ突然変異を含む、配列番号９のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４９Ｓに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４９Ｓ突然変異を含む、配列番号１０のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｄに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｄ突然変異を含む、配列番号１１のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｃ１７６Ｆに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｃ１７６Ｆ突然変異を含む、配列番号１２のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｙに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｙ突然変異を含む、配列番号１３のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｒに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｒ突然変異を含む、配列番号１４のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｙ２２０Ｃに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｙ２２０Ｃ突然変異を含む、配列番号１５のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ３３７Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対して、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、もしくはＹ２２０Ｃのうちの１または複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに対するアフィニティーと比較して大きなアフィニティーを提示する。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ３３７Ｈ突然変異を含む、配列番号１６のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに対して、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドと比較して大きなアフィニティーを提示しうる。
本発明は、特に、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であるが、野生型ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能ではない抗体に関する。すなわち、本発明は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型ｐ５３ポリペプチドと交差反応性ではない（すなわち、野生型ｐ５３ポリペプチドに結合することもない）抗体に関する。
本発明はまた、所与の特定のｐ５３突然変異体に結合することが可能であるが、ｐ５３の、他の異なる突然変異体に結合することが可能ではない抗体にも関する。すなわち、本発明は、所与の特定のｐ５３突然変異体に特異的に結合するが、ｐ５３の、他の異なる突然変異体と交差反応性ではない（すなわち、ｐ５３の、他の異なる突然変異体に結合することもない）抗体に関する。
一部の実施形態では、抗体は、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、別の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
抗体が、所与の分子に結合することが可能であるのかどうかは、当業者に周知の方法により決定されうる。例えば、方法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫蛍光法などのイムノアッセイ、ならびに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）など、他の方法による解析を含む。
所与のペプチドまたはポリペプチドに結合する、抗体の能力は、抗体と、対照ペプチド／ポリペプチドとの非特異的相互作用より、アフィニティーが大きな、抗体とペプチド／ポリペプチドとの相互作用の検出により決定されうる。対照ペプチド／ポリペプチドは、抗体が特異的に結合しないことが公知であるか、または抗体が特異的に結合しないことが決定されているペプチドまたはポリペプチドでありうる。
一部の実施形態では、所与のペプチドまたはタンパク質に結合する、抗体の能力は、抗体と、ペプチド／ポリペプチドとの相互作用が、抗体と、陰性対照ペプチド／ポリペプチドとの非特異的相互作用より強力であるか、より安定的であるか、より長く存続するか、またはより小さな平衡解離定数（ＫＤ）を有するという観察により決定されうる。
一部の実施形態では、抗体の、非類縁の標的への結合の程度は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）、またはＲＩＡにより測定される、抗体の、標的への結合の、約１０％未満である。代替的に、結合特異性は、結合アフィニティーとして反映される場合もあり、この場合、本発明に従う抗体は、そのコグネイトの突然変異体ｐ５３ポリペプチドに、抗体の、別の標的分子（例えば、他の突然変異体ｐ５３ポリペプチドおよび／または野生型ｐ５３ポリペプチド）に対するＫＤの、１０の累乗倍の、少なくとも０．１（すなわち、０．１×１０ｎ［ここで、ｎは、桁数を表す整数である］）倍のＫＤで結合する。これは、任意に、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、または２．０のうちの１つでありうる。
本発明の一部の実施形態では、方法は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの、全長アミノ酸配列の文脈で、抗原配列に結合することが可能な抗体を作製する。すなわち、一部の実施形態では、方法は、抗原配列への結合を介して、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合しうる抗体を作製する。
ペプチド／ポリペプチド内の部位であって、抗体が結合する部位は、当技術分野で周知の、多様な方法であって、抗体－抗原複合体についてのＸ線共結晶構造解析、ペプチド走査、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素－重水素交換解析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質分解ベースの「保護」法を含む方法を使用して、当業者により決定されうる。このような方法については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５～１５６において記載されている。
好ましくは、抗体は、それらが特異的な突然変異体ｐ５３ポリペプチドに、１μＭまたはこれ未満、好ましくは、≦１００ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５００ｐＭのうちの１つのＫＤで結合する。抗体の、その標的に対する結合アフィニティーは、その解離定数（ＫＤ）として記載されることが多い。結合アフィニティーは、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）、９０７：４１１～４４２を参照されたい）、ＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（例えば、Ｌａｄら（２０１５）、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ、２０（４）：４９８～５０７を参照されたい）、または抗体のＦａｂ形および抗原分子を伴って実施される放射性標識化抗原結合性アッセイ（ＲＩＡ）など、当技術分野で公知の方法により測定されうる。
本発明に従う抗体は、単離形態および／または精製形態で提供されうる。
「抗体」により、この断片もしくは誘導体、または合成抗体もしくは合成抗体断片を含める。
モノクローナル抗体技術と関連する最新の技法を念頭に置くと、大半の抗原に対する抗体が調製されうる。抗原結合性部分は、抗体（例えば、Ｆａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）の一部でありうる。選択された抗原に適するモノクローナル抗体は、公知の技法、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）において開示されている技法により調製されうる。キメラ抗体については、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８、８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ ２、７９２～７９９）により論じられている。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において、有用であり、抗原上の、単一のエピトープを特異的にターゲティングする、抗体の均質な集団である。
ポリクローナル抗体は、本発明の方法において有用である。単一特異的ポリクローナル抗体が好ましい。適切なポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して調製されうる。
抗体および抗体断片が遺伝子操作されうるように、Ｆａｂ断片およびＦａｂ２断片など、抗体の抗原結合性断片もまた、使用／提供されうる。早期のプロテアーゼ消化実験により、まず認識された事実であるが、抗体／断片の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与する。さらなる確認は、齧歯動物抗体の「ヒト化」により見出された。結果として得られる抗体が、齧歯動物親抗体の抗原特異性を保持するように、齧歯動物由来の可変ドメインは、ヒト由来の定常ドメインへと融合されうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、８１、６８５１～６８５５）。
抗原特異性が、可変ドメインにより付与され、定常ドメインに依存しないことは、全てが、１または複数の可変ドメインを含有する抗体断片の、細菌による発現を伴う実験から公知である。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３８）；ＶＨおよびＶＬのパートナードメインが、可撓性のオリゴペプチドを介して連結された、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、８５、５８７９）、および単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４）を含む。それらの特異的結合性部位を保持する、抗体断片の合成に関与する技法についての一般的な総説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３～２９９において見出されるであろう。
「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬのパートナードメインが、例えば、可撓性のオリゴペプチドにより、共有結合的に連結された分子を意味する。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂの抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌されうるので、大量の前記断片の容易な作製が可能となる。
全抗体およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が、２つの抗原結合性部位を有することを意味する。これに対し、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、およびｄＡｂ断片は、一価であり、抗原結合性部位を１つだけ有する。当技術分野で周知の通り、ファージディスプレイ技術使用して、合成抗体もまた作製されうる。
本出願はまた、任意に単離され、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）本発明に従う、抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体／抗原結合性断片である抗体または抗原結合性断片も提供する。
一部の実施形態では、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片は、別の、異なる突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうる。
本発明に従う二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片の抗原結合性断片は、抗原に結合することが可能な、ポリペプチドの任意の断片でありうる。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、併せて、抗体または抗原結合性断片の抗原結合性領域を規定する、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３）と、３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３）とを含む。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、抗体または抗原結合性断片の、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含みうる。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、抗体または抗原結合性断片の、軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを含みうる。
本発明に従う二特異性抗体および二特異性抗原結合性断片は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＭＡｂｓ、２０１２、４（２）：１８２～１９７において記載されたフォーマットなど、任意の適切なフォーマットで提供されうる。例えば、二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片は、二特異性抗体コンジュゲート（例えば、ＩｇＧ２、Ｆ（ａｂ’）２、またはＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ）、二特異性ＩｇＧまたはＩｇＧ様分子（例えば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓＶＤ、ｓＶＤ－ＩｇＧ、ツーインワンＩｇＧ、ｍＡｂ２、またはＴａｎｄｅｍａｂ（一般軽鎖））、非対称性の二特異性ＩｇＧまたは二特異性ＩｇＧ様分子（例えば、ｋｉｈ ＩｇＧ、ｋｉｈ ＩｇＧ（一般軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ｋｉｈ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｍＡｂ－Ｆｖ、チャージペア、またはＳＥＥＤ－ｂｏｄｙ）、二特異性抗体低分子（例えば、ダイアボディー（Ｄｂ）、ｄｓＤｂ、ＤＡＲＴ、ｓｃＤｂ、ｔａｎｄＡｂ、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）、タンデムｄＡｂ／ＶＨＨ、トリプルボディー、トリプルヘッド、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２）、二特異性ＦｃとＣＨ３との融合タンパク質（例えば、ｔａＦｖ－Ｆｃ、ジダイアボディー、ｓｃＤｂ－ＣＨ３、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ＨＣＡｂ－ＶＨＨ、ｓｃＦｖ－ｋｉｈ－Ｆｃ、またはｓｃＦｖ－ｋｉｈ－ＣＨ３）、または二特異性融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ２－アルブミン、ｓｃＤｂ－アルブミン、ｔａＦｖ－毒素、ＤＮＬ－Ｆａｂ３、ＤＮＬ－Ｆａｂ４－ＩｇＧ、ＤＮＬ－Ｆａｂ４－ＩｇＧ－サイトカイン２）でありうる。特に、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＭＡｂｓ、２０１２、４（２）：１８２～１９の図２を参照されたい。
当業者は、本発明に従う二特異性抗体および二特異性抗原結合性断片をデザインおよび調製することが可能である。二特異性抗体を作製するための方法は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＳｅｇａｌおよびＢａｓｔ、２００１、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１～２．１３．１６に記載された、抗体または抗体断片の化学的架橋、例えば、還元性のジスルフィド結合または非還元性のチオエーテル結合を含む。例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、例えば、ヒンジ領域のＳＨ基を介して、Ｆａｂ断片を化学的に架橋して、ジスルフィド連結された二特異性Ｆ（ａｂ）２ヘテロ二量体を創出するのに使用されうる。二特異性抗体を作製するための他の方法は、例えば、Ｄ．Ｍ．およびＢａｓｔ，Ｂ．Ｊ．、２００１、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１～２．１３．１６において記載されている通り、抗体を産生するハイブリドーマを、例えば、ポリエチレングリコールと融合させて、二特異性抗体を分泌することが可能なクァドローマ細胞を作製するステップを含む。
本発明に従う二特異性抗体および二特異性抗原結合性断片はまた、例えば、いずれの全内容も、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）、第４０章：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ（ＨｏｒｎｉｇおよびＦａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ）、またはＦｒｅｎｃｈ、Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２０００；４０：３３３～３３９において記載される通り、例えば、抗原結合性分子のためにポリペプチドをコードする核酸構築物の発現を介して、組換えによっても作製されうる。例えば、２つの抗原結合性断片のための軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン（すなわち、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片のための軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン、ならびに別の標的タンパク質に結合することが可能な抗原結合性断片のための軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン）をコードし、適切なリンカーまたは抗原結合性断片の間の二量体化ドメインをコードする配列を含むＤＮＡ構築物は、分子クローニング法により調製されうる。その後、組換え二特異性抗体は、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物の宿主細胞）内の構築物の発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける）により作製される場合があり、次いで、発現した組換え二特異性抗体は、任意に、精製されうる。
抗体は、抗原に対する抗体のアフィニティーが、非修飾親抗体と比較して改善された、修飾抗体が作出されるアフィニティー成熟の工程により作製されうる。アフィニティー成熟抗体は、当技術分野で公知の手順、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｒｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９～７８３（１９９２）；Ｂａｒｂａｓら、ＰｒｏｃＮａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９～３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７～１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４～２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０～１５９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９～８９６（１９９２）により作製されうる。
本発明に従う抗体は、好ましくは、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対する特異的結合を呈する。標的分子に特異的に結合する抗体は、好ましくは、標的に、他の標的に結合するより大きなアフィニティー、および／またはより長い持続時間で結合する。本抗体は、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに、他の突然変異体ｐ５３ポリペプチドおよび野生型ｐ５３ポリペプチドより大きなアフィニティーで結合しうる。
抗体、断片、またはポリペプチドは、野生型ｐ５３ポリペプチド、例えば、ヒトｐ５３ポリペプチドへの結合を実質的に提示しない。これは、野生型ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列と、単一のアミノ酸残基だけ異なりうる、本明細書で記載される、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対して方向付けられた抗体について、予測外の特徴である。すなわち、ポリペプチドに結合することが可能な抗体であれば、単一のアミノ酸だけ異なる、別のポリペプチドに対する交差反応性を提示することが予測されるであろう。ｐ５３の単一アミノ酸の突然変異体に特異的な本抗体は、突然変異体ｐ５３を、野生型ｐ５３から区別するのに有用であるので、調査研究への適用、治療適用、および診断適用など、広範にわたり使用される。
本明細書で使用される「実質的に結合しないこと」とは、陰性対照抗体（例えば、野生型ｐ５３ポリペプチドと類縁でない標的に対して方向付けられた抗体、または野生型ｐ５３ポリペプチドに結合しないことが公知の抗体）による結合のレベルを、著しく超えない結合を指す。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、野生型ｐ５３ポリペプチド（例えば、ヒト野生型ｐ５３ポリペプチド）への結合であって、所与のアッセイまたは所与の濃度において、陰性対照抗体（例えば、野生型ｐ５３ポリペプチドと類縁でない標的に対して方向付けられた抗体、または野生型ｐ５３ポリペプチドに結合しないことが公知の抗体）により提示される、野生型ｐ５３ポリペプチドへの結合の、≦５００％、≦４００％、≦３００％、≦２５０％、≦２００％、≦１５０％、または≦１００％である結合を呈しうる。結合は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）、フローサイトメトリー、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む、当業者に周知の技法により測定されうる。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、腫瘍の増殖またはがんの進行を阻害することが可能でありうる。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、抗がん活性を提示しうる。一部の実施形態では、腫瘍の増殖またはがんの進行の阻害は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける阻害でありうる。「阻害」は、腫瘍の増殖の低減もしくは制御、またはがん細胞の数の低減もしくは制御でありうる。腫瘍の増殖またはがんの進行の阻害は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、本明細書で記載されるがんの動物モデルにおいて評価されうる。
抗がん活性は、本発明に従う抗体／断片による処置後における、腫瘍細胞数および／または腫瘍体積の、処置の非存在下、または陰性対照抗体による処置後における腫瘍細胞数および／または腫瘍体積と比較した低減の検出により決定されうる。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号３に示される、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ１７５Ｈ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号４に示される、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２４８Ｑ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号５に示される、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２７３Ｈ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号６に示される、Ｒ２４８Ｗ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２４８Ｗ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号７に示される、Ｇ２４５Ｓ ｐ５３ポリペプチド、またはＧ２４５Ｓ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号８に示される、Ｒ２７３Ｃ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２７３Ｃ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号９に示される、Ｒ２８２Ｗ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２８２Ｗ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１０に示される、Ｒ２４９Ｓ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ２４９Ｓ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１１に示される、Ｇ２４５Ｄ ｐ５３ポリペプチド、またはＧ２４５Ｄ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１２に示される、Ｃ１７６Ｆ ｐ５３ポリペプチド、またはＣ１７６Ｆ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１３に示される、Ｈ１７９Ｙ ｐ５３ポリペプチド、またはＨ１７９Ｙ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１４に示される、Ｈ１７９Ｒ ｐ５３ポリペプチド、またはＨ１７９Ｒ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１５に示される、Ｙ２２０Ｃ ｐ５３ポリペプチド、またはＹ２２０Ｃ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、例えば、配列番号１６に示される、Ｒ３３７Ｈ ｐ５３ポリペプチド、またはＲ３３７Ｈ突然変異を含むこの断片に結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、特定の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的である。すなわち、一部の実施形態では、抗体は、特定の突然変異体ｐ５３ポリペプチドだけに結合することが可能であるが、野生型ｐ５３ポリペプチドまたは他の突然変異体ｐ５３ポリペプチドなど、前記突然変異体ｐ５３ポリペプチド以外のｐ５３ポリペプチドに結合することが可能ではない。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトｐ５３ポリペプチドの、所与の突然変異体に結合することが可能であるが、野生型ヒトｐ５３ポリペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗体は、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、またはＲ３３７Ｈのうちの１つに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能であるが、前記突然変異を含まないｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のうちの１つのアミノ酸配列、またはこの断片を含むペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１のアミノ酸配列、またはこの断片を含むペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
本発明に従う抗体は、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、他の突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、ヒトｐ５３ポリペプチドの、所与の突然変異体に結合することが可能でありうるが、ヒトｐ５３ポリペプチドの、他の突然変異体に結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ１７５Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号３のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｑに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号５のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２４８Ｗに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号６のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｓに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号７のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２７３Ｃに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号８のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ２８２Ｗに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号９のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｓに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１０のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｇ２４５Ｄに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１１のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｃ１７６Ｆに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１２のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｙに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１３のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１７９Ｒに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｙ２２０Ｃ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１４のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｙ２２０Ｃに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、もしくはＲ３３７Ｈのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１５のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
一部の実施形態では、抗体は、Ｒ３３７Ｈに対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でありうるが、前記突然変異を含まないか、またはＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、もしくはＹ２２０Ｃのうちの１もしくは複数に対応する突然変異を含む、ｐ５３ペプチド／ポリペプチドに結合することが可能でないことがありうる。一部の実施形態では、抗体は、突然変異を含む、配列番号１６のアミノ酸配列、またはこの断片を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でありうるが、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチド／ペプチドに結合することが可能でないことがありうる。
本発明に従う抗体が結合することが可能な、本発明の突然変異体ｐ５３ポリペプチドの断片は、突然変異を含む。一部の実施形態では、本発明に従う抗体が結合することが可能な、本発明の突然変異体ｐ５３ポリペプチドの断片は、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、または５０のアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、断片は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列のうちの、５つ～３００、５つ～２５０、５つ～２００、５つ～１５０、５つ～１００、５つ～７５、５つ～５０、５つ～４０、５つ～３０、５つ～２０、または５つ～１０のアミノ酸からなりうる。
一部の実施形態では、本発明に従う抗体は、抗体が結合する、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのエピトープを参照することにより規定されうる。一部の実施形態では、抗体は、連続アミノ酸配列（すなわち、アミノ酸一次配列）からなる直鎖状エピトープに結合しうる。一部の実施形態では、抗体は、アミノ酸配列のアミノ酸による不連続配列からなる、コンフォメーションエピトープに結合しうる。アミノ酸の不連続配列のアミノ酸は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの異なる領域内に配置される可能性があり、配列が、例えば、そのネイティブ構造へとフォールディングした場合に、近接して位置しうる。
一部の実施形態では、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号３の１００～２５０位、１１０～２４０位、１２０～２３０位、１３０～２２０位、１４０～２１０位、１５０～２００位、１６０～１９０位、または１７０～１８０位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号４の１７３～３２３位、１８３～３１３位、１９３～３０３位、２０３～２９３位、２１３～２８３位、２２３～２７３位、２３３～２６３位、または２４３～２５３位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号５の１９８～３４８位、２０８～３３８位、２１８～３２８位、２２８～３１８位、２３８～３０８位、２４８～２９８位、２５８～２８８位、または２６８～２７８位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２４８Ｗ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号６の１７３～３２３位、１８３～３１３位、１９３～３０３位、２０３～２９３位、２１３～２８３位、２２３～２７３位、２３３～２６３位、または２４３～２５３位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｇ２４５Ｓ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号７の１７０～３２０位、１８０～３１０位、１９０～３００位、２００～２９０位、２１０～２８０位、２２０～２７０位、２３０～２６０位、または２４０～２５０位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２７３Ｃ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号８の１９８～３４８位、２０８～３３８位、２１８～３２８位、２２８～３１８位、２３８～３０８位、２４８～２９８位、２５８～２８８位、または２６８～２７８位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２８２Ｗ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号９の２０７～３５７位、２１７～３４７位、２２７～３３７位、２３７～３２７位、２４７～３１７位、２５７～３０１位、２６７～２９７位、または２７７～２８７位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２４９Ｓ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１０の１７４～３２４位、１８４～３１４位、１９４～３０４位、２０４～２９４位、２１４～２８４位、２２４～２７４位、２３４～２６４位、または２４４～２５４位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｇ２４５Ｄ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１１の１７０～３２０位、１８０～３１０位、１９０～３００位、２００～２９０位、２１０～２８０位、２２０～２７０位、２３０～２６０位、または２４０～２５０位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｃ１７６Ｆ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１２の１０１～２５１位、１１１～２４１位、１２１～２３１位、１３１～２２１位、１４１～２１１位、１５１～２０１位、１６１～１９１位、または１７１～１８１位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｈ１７９Ｙ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１３の１０４～２５４位、１１４～２４４位、１２４～２３４位、１３４～２２４位、１４４～２１４位、１５４～２０４位、１６４～１９４位、または１７４～１８４位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｈ１７９Ｒ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１４の１０４～２５４位、１１４～２４４位、１２４～２３４位、１３４～２２４位、１４４～２１４位、１５４～２０４位、１６４～１９４位、または１７４～１８４位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｙ２２０Ｃ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１５の１４５～２９５位、１５５～２８５位、１６５～２７５位、１７５～２６５位、１８５～２５５位、１９５～２４５位、２０５～２３５位、または２１５～２２５位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ３３７Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号１６の２６２～４１２位、２７２～４０２位、２８２～３９２位、２９２～３８２位、３０２～３７２位、３１２～３６２位、３２２～３５２位、または３３２～３４２位のうちの１つに対応するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号３の１７５～１７９位に対応するアミノ酸位置、すなわち、ＨＣＰＨＨ（配列番号６８）、または配列番号３の１７５位（すなわち、Ｈ）および１７７～１７９位（すなわち、ＰＨＨ（配列番号６９））に対応するアミノ酸位置、または配列番号３の１７５位（すなわち、Ｈ）および１７８～１７９位（すなわち、ＨＨ（配列番号７０））に対応するアミノ酸位置を含むか、またはこれらからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。すなわち、一部の実施形態では、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、以下：
Figure 0007173964000010
の通りのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号４の２４７～２４９位に対応するアミノ酸位置、すなわち、ＮＱＲ（配列番号７１）、または配列番号４の２１５～２１６位（すなわち、ＳＶ（配列番号７２））および２３３～２３４位（すなわち、ＨＹ（配列番号７３））に対応するアミノ酸位置、または配列番号４の２４９～２５０位に対応するアミノ酸位置、すなわち、ＲＰ（配列番号７４）を含むか、またはこれらからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。すなわち、一部の実施形態では、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、以下：
Figure 0007173964000011
の通りのエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体は、配列番号５の２７２～２７３位に対応するアミノ酸位置、すなわち、ＶＨ（配列番号７５）を含むか、またはこれらからなるポリペプチドのエピトープに結合しうる。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである４Ｈ５またはＭＨ ４Ｈ５である。抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである４Ｈ５およびＭＨ ４Ｈ５は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ （配列番号１９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＴＥＹＴ （配列番号２５）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＮＮＧＶＴ （配列番号２６）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
を含む。
本明細書で記載される抗体の全てについて、ＣＤＲは、ＶＢＡＳＥ２ ＣＤＲ予測ツール（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）３３（データベース特集）：Ｄ６７１～６７４）に従い、規定される。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである７Ｂ９またはＭＨ ７Ｂ９である。抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである７Ｂ９およびＭＨ ７Ｂ９は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ （配列番号２３）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＥＹＴ （配列番号２９）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＮＰＹＳＧＧＴ （配列番号３０）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
を含む。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである１０Ｃ８またはＭＨ １０Ｃ８である。抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである１０Ｃ８およびＭＨ １０Ｃ８は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ （配列番号２３）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＥＹＴ （配列番号２９）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＮＰＹＳＧＧＴ （配列番号３０）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
を含む。
本発明の多様な態様に従う、ＨＣ－ＣＤＲ２が、ＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）である、一部の実施形態では、この配列は、配列ＩＮＰＹＳＧＧＴＶ（配列番号７６）に含まれうる。一部の実施形態では、ＨＣ－ＣＤＲ２は、ＩＮＰＹＳＧＧＴＶ（配列番号７６）である。
本発明に従う抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体は、クローン４Ｈ５、７Ｂ９、もしくは１０Ｃ８、または配列番号１８もしくは２２；および２４もしくは２８のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
本発明に従う抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体は、クローンＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、もしくはＭＨ １０Ｃ８、または配列番号２３７もしくは２３８；および２３９、２４０、もしくは２４１のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンの、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のアミノ酸配列は、図２４、２５、４９、および５０に示される。コードするヌクレオチド配列は、図２７、５１、および５２に示される。
抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体は、配列番号１８、２２、２３７、および２３８；または２４、２８、２３９、２４０、もしくは２４１のＶＬおよび／またはＶＨのアミノ酸配列のうちの１または複数、あるいは図２４、２５、４９、および５０に示されるＶＬおよび／またはＶＨのアミノ酸配列のうちの１つに対して、高百分率の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖および／またはＶＨ鎖を有しうる。例えば、本発明に従う抗体は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合し、配列番号１８、２２、２３７、２３８、２４、２８、２３９、２４０、もしくは２４１のうちの１つのＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列、または図２４、２５、４９、および５０に示されるＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列のうちの１つに対する、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖またはＶＨ鎖を有する抗体を含む。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである３Ｇ１１またはＭＨ ３Ｇ１１である。抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである３Ｇ１１およびＭＨ ３Ｇ１１は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＨＰＫＮＧＧＴ （配列番号４７）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ （配列番号４８）
を含む。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである４Ｈ２またはＭＨ ４Ｈ２である。抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである４Ｈ２およびＭＨ ４Ｈ２は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＫＮＧＧＴ （配列番号５０）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＱＧＧＦＤＤＹ （配列番号５１）
を含む。
本発明に従う抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体は、クローン３Ｇ１１もしくは４Ｈ２、または配列番号４０もしくは４４；および４５もしくは４９のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
本発明に従う抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体は、クローンＭＨ ３Ｇ１１もしくはＭＨ ４Ｈ２、または配列番号２５１もしくは２５２；および２５３もしくは２５４のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンの、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のアミノ酸配列は、図２８、２９、５７、および５８に示される。コードするヌクレオチド配列は、図３１、５９、および６０に示される。
抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体は、配列番号４０、４４、２５１、および２５２；または４５、４９、２５３、もしくは２５４のＶＬおよび／またはＶＨのアミノ酸配列のうちの１または複数、あるいは図２８、２９、５７、および５８に示されるＶＬおよび／またはＶＨのアミノ酸配列のうちの１つに対して、高百分率の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖および／またはＶＨ鎖を有しうる。例えば、本発明に従う抗体は、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合し、配列番号４０、４４、２５１、２５２、４５、４９、２５３、もしくは２５４のうちの１つのＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列、または図２８、２９、５７、および５８に示されるＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列のうちの１つに対する、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖またはＶＨ鎖を有する抗体を含む。
一部の態様では、抗体は、抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４またはＭＨ １３Ｅ４である。抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４およびＭＨ １３Ｅ４は、以下のＣＤＲ配列：
軽鎖：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）
重鎖：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
を含む。
本発明に従う抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体は、クローン１３Ｅ４、または配列番号５８および６２のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
本発明に従う抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体は、クローンＭＨ １３Ｅ４、または配列番号２４７および２４８のうちの１つのＣＤＲを含みうる。
抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンの、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のアミノ酸配列は、図３２、３３、５３、および５４に示される。コードするヌクレオチド配列は、図３４、５５、および５６に示される。
抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体は、配列番号５８、２４７、６２、および２４８のＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列のうちの１もしくは複数、または図３２、３３、５３、および５４に示されるＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列のうちの１つに対して、高百分率の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖および／またはＶＨ鎖を有しうる。例えば、本発明に従う抗体は、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合し、配列番号５８、２４７、６２、および２４８のうちの１つのＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列、または図３２、３３、５３、および５４に示されるＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖のアミノ酸配列のうちの１つに対する、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖またはＶＨ鎖を有する抗体を含む。
本発明に従う抗体では、６つのＣＤＲ配列のうちの、１つまたは２つまたは３つまたは４つは、変動しうる。バリアントは、６つのＣＤＲ配列のうちの１つまたは２つにおいて、１つまたは２つのアミノ酸置換を有しうる。
軽鎖および重鎖のＣＤＲはまた、特に、多数の異なるフレームワーク領域と併用すると、有用でありうる。したがって、ＬＣ－ＣＤＲ１～３またはＨＣ－ＣＤＲ１～３を有する軽鎖および／または重鎖は、代替的なフレームワーク領域を有しうる。当技術分野では、適切なフレームワーク領域が周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．ＬｅｆｒａｎｃおよびＧ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１）、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて記載されている。
本発明に従う抗体は、検出可能に標識化される場合もあり、少なくとも、検出が可能でありうる。例えば、抗体は、放射性原子または有色分子または蛍光分子で標識化される場合もあり、他の任意の方法でたやすく検出されうる分子で標識化される場合もある。適切な検出用分子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、および放射性標識を含む。結合性部分は、検出用標識で、直接的に標識化される場合もあり、間接的に標識化される場合もある。例えば、結合性部分は、それ自体標識化された、別の抗体により検出されうる、非標識化抗体でありうる。代替的に、二次抗体が、ビオチンに結合しており、一次抗体を間接的に標識するのに、標識化されたストレプトアビジンの、ビオチンへの結合が使用される場合もある。
キメラ抗原受容体
本発明は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、本発明に従う、抗原結合性断片またはポリペプチドを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、抗原結合性およびＴ細胞活性化機能の両方をもたらす、組換え受容体である。ＣＡＲの構造および操作については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）、２５７（１）において総説されている。
本明細書では、本発明に従う抗原結合性断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合性ドメインとして提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドの、任意の実施形態に従う、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。したがって、本発明に従うＣＡＲに結合させる抗原は、本明細書で記載される、突然変異体ｐ５３ポリペプチドである。
ＣＡＲは、Ｔ細胞の効力、特異性、および安全性を、さらに増強するように、共刺激リガンド、キメラ共刺激受容体、またはサイトカインと組み合わされうる（参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎら、Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｄｅｓｉｇｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．、２０１３年４月；３（４）：３８８～３９８．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１２－０５４８）。
本発明はまた、本発明に従うＣＡＲを含む細胞も提供する。本発明に従うＣＡＲは、腫瘍ターゲティングＴ細胞、例えば、ＣＡＲが特異的である突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する腫瘍細胞へとターゲティングされたＴ細胞を作出するのに使用されうる。
ＣＡＲの、Ｔ細胞への操作は、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞の拡大時になされるなど、形質導入および拡大のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養時に実施されうる。形質導入は、様々な方法を用いうるが、クローン的に拡大および存続するＴ細胞における、持続的なＣＡＲ発現を可能とするために、安定的な遺伝子移入が必要とされる。
本明細書で記載される、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの特異性を決定する要素に加えて、ＣＡＲ分子は、腫瘍細胞に遭遇したときに、Ｔ細胞の増殖および存続を促進するよう、ＣＤ２８および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９；４－１ＢＢ）に由来する共刺激エンドドメインなどの共刺激エンドドメインを発現するようにさらに操作されうる（ＮｉｓｈｉｏおよびＤｏｔｔｉ、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４：２、ｅ９８８０９８；２０１５年２月）。
ＣＡＲは、典型的に、抗原結合性ドメインを、ＣＤ３ゼータ鎖タンパク質またはＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインと、単一のキメラタンパク質内で組み合わせる。ＣＡＲの構造的特徴は、Ｓｊｏｕｋｅら（Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１４、４９９５０９（２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４５９７）により記載されている。ＣＡＲは、典型的に、膜貫通ドメインおよびエンドドメインへと連結された、細胞外抗原結合性ドメインを有する。任意選択のヒンジドメインまたはスペーサードメインは、結合性部分と、膜貫通ドメインとの分離をもたらすことが可能であり、可撓性のリンカーとして作用しうる。
本発明に従い、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、本明細書で記載される、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドであるか、またはこれに由来する。
ヒンジ領域またはスペーサー領域は、結合性部分が、異なる方向に向くことを可能とする可撓性のドメインでありうる。ヒンジ領域またはスペーサー領域は、ＩｇＧ１に由来する場合もあり、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域に由来する場合もある。
膜貫通ドメインは、細胞膜にわたる、疎水性アルファヘリックスでありうる。エンドドメインと会合する膜貫通ドメインが、一般に、使用される。
エンドドメインは、抗原の結合の後における受容体のクラスタリング／二量体化、および細胞へのシグナル伝達の開始の一因となる。一般に使用される、１つの膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータの膜貫通ドメインおよびエンドドメインである。ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳなど、１または複数の共刺激タンパク質受容体に由来する細胞内ドメインは、抗腫瘍活性に関して有益でありうる、さらなる共刺激シグナル伝達をもたらすように、ＣＡＲの細胞質テールへと、任意に、組み込まれうる。
一実施形態では、ＣＡＲは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。ＣＡＲ内のドメインの１つと天然で会合する膜貫通ドメインが使用される場合もあり、このようなドメインの、表面膜タンパク質が同じでまたは異なる膜貫通ドメインへの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように、膜貫通ドメインが、アミノ酸置換により、選択または修飾される場合もある。細胞質ドメインは、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを、それら自体で、または他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わされて含むようにデザインされうる。細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように、さらにデザインされうる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ、およびＣＤ２８のシグナル伝達モジュール、ならびにこれらの組合せを含みうるがこれらに限定されない。
本発明はまた、ＣＡＲとして、本発明に従う突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含むＣＡＲ Ｔ細胞も提供する。
本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、所望のＣＡＲ、例えば、抗突然変異体ｐ５３、ＣＤ８ａヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞へと導入することにより作出されうる。本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、複製されることが可能である結果として、長期にわたる存続をもたらし、これにより、持続的な腫瘍制御をもたらしうる。
一実施形態では、本発明は、リンパ球の輸注を使用して、がんを有するか、またはがんを有する危険性がある患者を処置するために、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能なＣＡＲを発現する、遺伝子改変されたＴ細胞を投与することに関する。好ましくは、処置では、自家リンパ球の輸注が使用される。自家ＰＢＭＣを、処置を必要とする患者から回収し、本明細書で記載され、当技術分野でも公知の方法を使用して、Ｔ細胞を活性化させ、拡大させ、次いで、患者へと輸注し戻す。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドを検出するための方法
本明細書で記載される抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞は、抗体または抗原結合性断片の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドへの結合を伴う方法において使用されうる。このような方法は、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞と、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの、結合複合体の検出を伴いうる。したがって、一実施形態では、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、本明細書で記載される、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞と、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法が提供される。
本発明の態様では、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞が特異的である、突然変異体ｐ５３ポリペプチド（または突然変異を含むこの断片）に結合した（すなわち、これと複合した）、本発明に従う抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体が提供される。
当技術分野では、サンドイッチアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを含む、適切な方法フォーマットが周知である。方法は、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、もしくは細胞、または突然変異体ｐ５３ポリペプチド、あるいはこれらの両方を、検出用標識、例えば、蛍光標識、発光標識、または放射性標識で標識化するステップを伴いうる。突然変異体ｐ５３ポリペプチドの発現は、例えば、生検により得られた組織試料についての免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定されうる。
特に、本発明の抗突然変異体ｐ５３抗体は、本明細書で例示される通り、免疫ブロット、免疫蛍光、免疫沈降、免疫組織化学、およびｉｎ ｖｉｖｏイメージングによる解析において、有用である。
この種の方法は、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの検出および／または定量化を必要とする疾患または状態を、診断または予後診断的に評価する方法の基盤をもたらしうる。このような方法は、患者試料に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合もあり、患者試料を加工した後で実施される場合もある。試料が回収されたら、患者は、診断または予後診断的評価のｉｎ ｖｉｔｒｏ法が実施されるのに立ち会うことが必要とされないので、方法は、ヒトまたは動物の身体に対して実施されることがない方法でありうる。
方法は、患者試料中の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの存在を検出するステップを伴いうる。
方法は、患者試料中に存在する、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの量を決定するステップを伴いうる。一部の実施形態では、方法は、診断に到達する過程の一部として、決定された量を、標準値または基準値に照らして比較するステップをさらに含みうる。診断もしくは予後診断の精度を増強するか、または本明細書で記載される検査を使用することにより得られた結果を確認するように、他の診断検査も、本明細書で記載される診断検査と共に使用されうる。
試料中の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの検出は、患者におけるがん性状態の診断、がん性状態への素因の診断、またはがん性状態の予後診断をもたらすこと（予後診断すること）を目的として使用されうる。診断または予後診断は、良性または悪性でありうる、既存の（既に診断された）がん性状態に関する場合もあり、疑われたがん性状態に関する場合もあり、患者におけるがん性状態（かつて、診断されていない可能性がある）についてのスクリーニングに関する場合もある。
試料中の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの検出は、患者が、抗突然変異体ｐ５３抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞による処置に応答しうることを指し示しうる。試料中の、所与の突然変異体ｐ５３ポリペプチドの存在は、所与の抗突然変異体ｐ５３抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞による処置のために、患者を選択するのに使用されうる。したがって、本発明の抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞は、抗突然変異体ｐ５３抗体治療による処置のために、患者を選択するのに使用されうる。
試料は、任意の組織または体液から採取されうる。試料は、ある量の血液；個体の血液に由来する、ある量の血清であって、フィブリンによる凝血および血液細胞を除去した後に得られる、血液の流体部分を含みうる血清；組織試料もしくは生検；または前記個体から単離された細胞を含むか、またはこれに由来しうる。
本発明に従う方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施される。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語が、培養物中の細胞を伴う実験を包含することが意図されるのに対し、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、無傷の多細胞性生物を伴う実験を包含することが意図される。
本発明はまた、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がん（例えば、腫瘍）を検出、位置特定、またはイメージングするための方法における使用のための、本発明に従う抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞も提供する。
本発明に従う抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞は、検出のために、放射性同位体または非同位体性実体などの検出用標識（例えば、シグナル発生標識）で、適切な形で、直接的または間接的に標識されうる。放射性同位体は、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネシウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀２０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、銅６７、フッ素１８、イットリウム９０、パラジウム１００、ビスマス２１７、およびアンチモニー２１１を含む。非同位体性実体は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）、色素、ハプテン、放射性発光、化学発光（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール）、生物発光剤、蛍光剤（例えば、フルオレセイン、ローダミン、エオシン、およびＮＤＢ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、およびサマリウム（Ｓｍ）など、希土類のキレート剤、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、４－メチルウンベリフェロン、７－アミノ－４－メチルクマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、またはリン光発光剤などの発光剤、抗体、受容体、およびビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはジゴキシゲニンなどのリガンドから選択されうる。
当業者には、検出法が周知であり、標識化剤に対応するように選択されうる。適切な技法は、ＰＣＲによるオリゴヌクレオチドタグの増幅、質量分析、例えば、基質の酵素的転換時における、レポータータンパク質による、蛍光もしくは色彩の検出、または放射能の検出を含む。
一部の実施形態では、方法は、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を、対象、例えば、がんを伴うと診断されたか、またはこれを有することが疑われる患者へと投与するステップと、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を検出するステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、抗体、抗体断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞からのシグナルを検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、シグナルの、画像への変換を含む。
本発明はまた、本発明に従う抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を使用して 突然変異体ｐ５３ポリペプチドターゲティング剤による処置のための対象を選択／層別化する方法も提供する。一部の実施形態では、対象を、本発明に従う処置のために選択するか、または、例えば、個体から得られた試料中の、突然変異体ｐ５３ポリペプチド、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸の存在の検出に基づき、このような処置から利益を得る対象として同定する。
治療適用
本発明に従う、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、および細胞、ならびにこのような薬剤を含む組成物は、医学的処置の方法における使用のために提供されうる。処置は、処置を必要とする疾患または状態を有する対象に対して施されうる。疾患または状態は、がんでありうる。
一部の実施形態では、がんは、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する細胞を含みうる。一部の実施形態では、がんは、本発明に従う、抗突然変異体ｐ５３抗体、断片、またはポリペプチドが特異的である突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する細胞を含みうる。
例えば、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する、このような腫瘍細胞は、本発明に従う抗体を伴う処置により、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、相補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）により、または抗体－薬物コンジュゲートを使用して、直接殺滅されうる。
処置は、がんの発症または進行の防止を目的としうる。したがって、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートは、医薬組成物または医薬を製剤化するのに使用される場合があり、対象は、疾患状態の発症に対して、予防的に処置されうる。これは、疾患状態の症状の発生の前になされる場合もあり、および／またはがんの発症または進行の危険性が大きいと考えられる対象に対して施される場合もある。
抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドの投与は、好ましくは、「治療有効量」であり、これは、個体に対して有益性を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば、投与量についての決定などは、一般的な従事者および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的に、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法、および従事者に公知の他の因子を考慮に入れる。上記で言及された技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊において見出されうる。
抗体コンジュゲート
本発明はまた、化学的部分へとコンジュゲートさせた、本発明に従う、抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、抗体コンジュゲートも提供する。
一部の実施形態では、化学的部分は、治療効果をもたらすための部分でありうる。一部の実施形態では、化学的部分は、薬物部分（例えば、細胞傷害剤）でありうる。一部の実施形態では、薬物部分は、本明細書の下記で記載される化学療法薬でありうる。
一部の実施形態では、化学的部分は、検出用部分でありうる。当業者には、それらの検出に適する部分および手段が周知であり、本明細書の上記で記載された、放射性同位体または非同位体性実体を含む。
薬学的に有用な組成物および医薬の製剤化
本発明に従う、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、および細胞は、臨床使用のための医薬組成物として製剤化される場合があり、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含みうる。
本発明に従い、また、薬学的に有用な組成物の作製法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、もしくは細胞を単離するステップ；および／または単離された本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、もしくは細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、もしくは希釈剤と混合するステップから選択される、１または複数のステップを含みうる作製法も提供される。
例えば、本発明のさらなる態様は、がんの処置における使用のための、医薬または医薬組成物を製剤化または作製する方法であって、本明細書で記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、または細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤と混合することにより、医薬組成物または医薬を製剤化するステップを含む方法に関する。
組成物は、単独で投与される場合もあり、他の処置と組み合わされて、処置される状態に応じて同時にまたは逐次的に投与される場合もある。
本明細書では、本発明の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、または細胞と、化学療法剤とは、同時に投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もある。
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、または細胞による処置は、化学療法を伴いうる。
同時的投与とは、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、または細胞と、治療剤との、例えば、両方の薬剤を含有する医薬組成物（組み合わされた調製物）として併せた投与、または互いの直後に、任意に、同じ投与経路を介する投与、例えば、同じ動脈、静脈、もしくは他の血管への投与を指す。
逐次的投与とは、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、もしくは細胞、または治療剤のうちの１つの投与であって、所与の時間間隔の後で、他の薬剤の別個の投与に後続される投与を指す。２つの薬剤が、同じ経路により投与されることは必要とされないが、一部の実施形態では、２つの薬剤が、同じ経路により投与される。時間間隔は、任意の時間間隔でありうる。
がん
がんは、任意の、望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖により顕示される、任意の疾患）、新生物、または腫瘍の場合もあり、望ましくない細胞増殖、新生物、または腫瘍の危険性、またはこれらに対する素因の増大の場合もある。がんは、良性の場合もあり、悪性の場合もあり、原発性の場合もあり、続発性（転移性）の場合もある。新生物または腫瘍は、細胞の、任意の異常な増殖または増殖であることがあり、任意の組織内に位置しうる。組織の例は、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、または除外する）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎臓上皮）、胆嚢、食道、神経膠細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、顎、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、綱、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ字結腸、皮膚、小腸、軟部組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰、白血球を含みうる。
処置される腫瘍は、神経系腫瘍の場合もあり、非神経系腫瘍の場合もある。神経系腫瘍、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、および希突起神経膠腫は、中枢神経系に由来する場合もあり、末梢神経系に由来する場合もある。非神経系がん／腫瘍は、他の任意の非神経組織に由来する場合があり、例は、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肝がん、類表皮癌、前立腺癌、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液がん、および肉腫を含む。一部の実施形態では、がんは、乳がんでありうる。
一部の実施形態では、がんは、突然変異体ｐ５３のペプチドまたはポリペプチドをコードするか、またはこれを発現するがんである。一部の実施形態では、がんは、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現するがんである。
一部の実施形態では、がんは、２４８、２７３、１７５、１７６、１７９、２２０、２４５、２４９、２８２、および３３７位のうちの１または複数において、野生型ｐ５３の配列と比べた、アミノ酸の差違を含む、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現するがんである。
一部の実施形態では、がんは、以下の突然変異：Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１または複数を含む、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現するがんである。
がんは、当業者に周知である、任意の適する手段により、例えば、生物学的試料の解析に基づき、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現することが決定されうる。
突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードするがんは、例えば、ＤＮＡシーケンシングなどにより、突然変異をコードする核酸の検出に基づき同定されうる。突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する細胞を含むがんは、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドの発現の検出により同定されうる。発現は、遺伝子の発現の場合もあり、タンパク質の発現の場合もある。遺伝子の発現は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を介する、例えば、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出により決定されうる。タンパク質の発現は、例えば、抗体ベースの方法、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡを介する、例えば、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドの検出により決定されうる。
本明細書における、「突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現するがん」は、突然変異体ｐ５３ペプチド／ポリペプチドをコードするか、またはこれを発現する任意の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞でありうる。
化学療法／放射線療法
化学療法および放射線療法は、それぞれ、薬物またはイオン化放射線（例えば、Ｘ線またはγ線を使用する放射線療法）による、がんの処置を指す。
薬物は、化学的実体、例えば、低分子医薬、抗生剤、ＤＮＡ挿入剤、タンパク質阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤）、または生物学的薬剤、例えば、抗体、抗体断片、核酸またはペプチドアプタマー、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質でありうる。薬物は、医薬組成物または医薬として製剤化されうる。製剤は、１または複数の薬物（例えば、１または複数の活性の薬剤）を、１または複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と共に含みうる。
処置は、１つを超える薬物の投与を伴いうる。薬物は、単独で投与される場合もあり、他の処置と組み合わされて、処置される状態に応じて同時にまたは逐次的に投与される場合もある。例えば、化学療法は、１または複数が、がんを処置するように意図されうる、２つの薬物の投与を伴う共治療でありうる。
化学療法は、１または複数の投与経路、例えば、非経口経路、静脈内注射、経口経路、皮下経路、皮内経路、または腫瘍内経路により投与されうる。
化学療法は、処置レジメに従い投与されうる。処置レジメは、医師または医療従事者により作成されうる、化学療法投与の、所定の時程表、計画、スキーム、またはスケジュールであってもよく、処置を必要とする患者に適するように、調整されうる。
処置レジメは、患者へと投与される化学療法の種類；各薬物または放射線の用量または線量；投与間の時間間隔；各処置の長さ；存在する場合、任意の休薬期間の回数および性質などのうちの１または複数を指し示しうる。共治療のために、各薬物が、どのように投与されるべきであるのかを指し示す、単一の処置レジメが用意されうる。
化学療法薬および生物学的薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロランブシル、イホスファミドなどのアルキル化剤；アザチオプリンまたはメルカプトプリンなど、プリンまたはピリミジンによる代謝拮抗剤；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）、ポドフィロキシン、エトポシド、テニポシドなどのアルカロイドおよびテルペノイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ドセタキセルなどのタキサン；Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤である、カンプトテシン、イリノテカン、およびトポテカン、またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤である、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ダクチノマイシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標））、エピルビシン、ブレオマイシン、ラパマイシンなどの抗腫瘍性抗生剤（例えば、アントラサイクリン系抗生剤）；抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４、抗４－１ＢＢ、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＢＬＴＡ、抗ＯＸ４３、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＮＦα、抗ＩＬ－２、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＣＤ－５２、抗ＣＤ２０、抗ＲＳＶ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）、抗ＴＮＦ受容体、抗ＥＧＦＲ抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片など、抗体ベースの薬剤であって、例が、セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ニモツズマブを含む薬剤；ＥＧＦＲ阻害剤など、エルロチニブ、セツキシマブ、およびゲフィチニブ；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））などの抗血管新生剤；シプリューセルＴ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））などのがんワクチンから選択されうる。
さらなる化学療法薬は、１３－ｃｉｓ－レチノイン酸、２－クロロデオキシアデノシン、５－アザシチジン５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、Ａｂｒａｘａｎｅ、Ａｃｃｕｔａｎｅ（登録商標）、アクチノマイシン－Ｄ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）、Ａｇｒｙｌｉｎ（登録商標）、Ａｌａ－Ｃｏｒｔ（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＡＬＩＭＴＡ、アリトレチノイン、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）、ａｌｌ－ｔｒａｎｓレチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、Ａｎａｎｄｒｏｎ（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）、Ａｒｒａｎｏｎ（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）、ロイコボリンカルシウム、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）、カンプトテシン－１１、カペシタビン、Ｃａｒａｃ（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）、ＣＣ－５０１３、ＣＣＩ－７７９、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）、ＣＰＴ－１１、シクロホスファミド、Ｃｙｔａｄｒｅｎ（登録商標）、シタラビン Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｄａｃｏｇｅｎ、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシンリポソーム剤、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）、Ｄｅｃａｄｒｏｎ、デシタビン、Ｄｅｌｔａ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、デニロイキン・ディフティトックス、ＤｅｐｏＣｙｔ（商標）、デキサメタゾン、デキサメタゾン酢酸塩、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、Ｄｅｘａｓｏｎｅ、デキスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Ｄｉｏｄｅｘ、ドセタキセル、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム剤、Ｄｒｏｘｉａ（商標）、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｅｌｉｇａｒｄ（商標）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標）、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｅｍｃｙｔ（登録商標）、Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ、エポエチンアルファ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、エルロチニブ、エルウィニアＬ－アスパラギナーゼ、エストラムスチン、Ｅｔｈｙｏｌ、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）、エベロリムス、Ｅｖｉｓｔａ（登録商標）、エキセメスタン、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）、Ｆｅｍａｒａ（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリジン、Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）、フルダラビン、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標）、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）、Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）ウェハー剤、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｄｒｏｌ、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、ヘキサメチラミン、ＨＭＭ、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標）、Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｏｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、イダルビシン、Ｉｆｅｘ（登録商標）、ＩＦＮ－アルファ、イホスファミド、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、イマチニブメシル酸塩、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート剤）、インターロイキン２、インターロイキン１１、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ２ｂ）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、Ｉｘｅｍｐｒａ（商標）、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ、Ｌａｎａｃｏｒｔ（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、Ｌｅｕｋｅｒａｎ、Ｌｅｕｋｉｎｅ（商標）、ロイプロリド、Ｌｅｕｒｏｃｒｉｓｔｉｎｅ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（商標）、Ａｒａ－Ｃリポソーム剤、Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｄ（登録商標）、ロムスチン、Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標）、Ｍａｘｉｄｅｘ、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸塩、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍｅｇａｃｅ（登録商標）、メゲストロール、メゲストロール酢酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（商標）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン－Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ－Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）、ムスチン、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）、Ｍｙｌｏｃｅｌ（商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）、Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（登録商標）、ニルタミド、Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標）、窒素マスタード、Ｎｏｖａｌｄｅｘ（登録商標）、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）、オクトレオチド、オクトレオチド酢酸塩、Ｏｎｃｏｓｐａｒ（登録商標）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）、Ｏｎｔａｋ（登録商標）、Ｏｎｘａｌ（商標）、オプレベルキン、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｏｒａｓｏｎｅ（登録商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合剤、パミドロネート、パニツムマブ、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（登録商標）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ－ＩＮＴＲＯＮ（商標）、ＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ、Ｐｒｅｌｏｎｅ（登録商標）、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、カルムスチンインプラント剤を伴うプロリフェプロサン２０、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標）、ラロキシフェン、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、リツキシマブ、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ２ａ）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標）、ルビドマイシン塩酸塩、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ ＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、Ｓｏｌｕ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、ソラフェニブ、ＳＰＲＹＣＥＬ（商標）、ＳＴＩ－５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、タモキシフェン、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標）、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）、ＴｈｅｒａＣｙｓ（登録商標）、チオグアニン、Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ Ｔａｂｌｏｉｄ（登録商標）、チオホスファミド、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）、チオテパ、ＴＩＣＥ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）、トレチノイン、Ｔｒｅｘａｌｌ（商標）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）、ＴＳＰＡ、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＶＣＲ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、Ｖｅｌｂａｎ（登録商標）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（登録商標）、Ｖｉａｄｕｒ（商標）、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃａｓａｒ Ｐｆｓ（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＬＢ、ＶＭ－２６、ボリノスタット、ＶＰ－１６、Ｖｕｍｏｎ（登録商標）、ゼローダ（登録商標）、Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）、Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標）、ゾレドロン酸、Ｚｏｌｉｎｚａ、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）から選択されうる。
投与経路
本発明の態様に従う、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、細胞、ならびに他の治療剤、医薬、および医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、筋内、皮下、皮内、腫瘍内、および経口を含むがこれらに限定されない、多数の経路による投与のために製剤化されうる。抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、細胞、および治療剤は、流体形態で製剤化される場合もあり、固体形態で製剤化される場合もある。流体製剤は、ヒトまたは動物の身体の、選択された領域への注射による投与のために製剤化されうる。
投与レジメ
抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の複数回投与を行うことができる。投与のうちの１回もしくは複数回、または各回は、別の治療剤の同時的投与または逐次的投与を伴いうる。
複数回投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月間のうちの１つに選択されうる、所定の時間間隔だけ隔てることができる。例を目的として述べると、投与は、７、１４、２１、または２８日間（±３、２、または１日間）ごとに１回施されうる。
キット
本発明の一部の態様では、キットオブパーツが提供される。一部の実施形態では、キットは、所定量の、本発明に従う、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を有する、少なくとも１つの容器を有しうる。キットは、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞を、医薬または医薬組成物の形態で提供することが可能であり、指定された疾患または状態を処置するための、患者への投与のための指示書と共に提供されうる。抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドは、腫瘍または血液への注射または注入に適するように製剤化されうる。
一部の実施形態では、キットは、所定量の別の治療剤（例えば、化学療法剤）を有する、少なくとも１つの容器をさらに含みうる。このような実施形態では、キットはまた、２つの医薬または医薬組成物が、それらが、特異的疾患または特異的状態のために組み合わされた処置をもたらすよう、同時に投与される場合もあり、個別に投与される場合もあるように、第２の医薬または医薬組成物も含みうる。治療剤はまた、腫瘍または血液への注射または注入に適するようにも製剤化されうる。
対象
本発明に従う、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞により処置される対象は、任意の動物またはヒトでありうる。対象は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物でありうるが、より好ましくは、ヒトである。対象は、男性の場合もあり、女性の場合もある。対象は、患者でありうる。対象は、処置を必要とする疾患もしくは状態を伴うと診断されているか、またはこのような疾患もしくは状態を有することが疑われる。
配列同一性
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性の決定を目的とするアライメントは、当業者に公知の、多様な方法で、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２ソフトウェア、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成されうる。このようなソフトウェアを使用する場合、例えば、ギャップペナルティーおよび拡張ペナルティーについては、デフォルトパラメータが使用されることが好ましい。ＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２のデフォルトパラメータは、タンパク質ギャップ開始ペナルティー＝１０．０、タンパク質ギャップ拡張ペナルティー＝０．２、タンパク質行列＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ＝－１、タンパク質／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
組換え体の作製
本発明に従う方法において使用される免疫原、ならびに本発明に従う抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、およびＣＡＲは、当業者に公知である、組換え体の作製のための方法に従い調製されうる。
目的のペプチド／ポリペプチドは、化学合成、例えば、液相合成または固相合成により調製されうる。例えば、ペプチド／ポリペプチドは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒｕｄｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１３）、１８：４３７３～４３８８において記載された方法を使用して合成されうる。
本発明に従う免疫原、抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、およびＣＡＲは、組換え発現により作製されうる。当技術分野では、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２０１２において明示された分子生物学法など、組換え体の作製に適する分子生物学法が周知である。
発現は、ヌクレオチド配列からの発現でありうる。ヌクレオチド配列は、ベクター内に含有されうる。本明細書で使用される「ベクター」とは、外来の遺伝子素材を、細胞へと移入するための媒体として使用されるオリゴヌクレオチド分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞内の、外来の遺伝子素材の発現のための発現ベクターでありうる。このようなベクターは、発現させる配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、プロモーター配列を含みうる。ベクターはまた、終止コドンおよび発現エンハンサーも含みうる。当技術分野で公知の、任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサー、および終止コドンが、ペプチドまたはポリペプチドを、本発明に従うベクターから発現させるのに使用されうる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ＭＡＣ、ウイルスなどでありうる。一部の実施形態では、ベクターは、真核発現ベクター、例えば、真核細胞内の、ベクターからのタンパク質の発現に必要な要素を含むベクターでありうる。一部の実施形態では、ベクターは、例えば、タンパク質の発現を駆動するように、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０のプロモーターを含む、哺乳動物発現ベクターでありうる。
「作動可能に連結された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列と、調節的ヌクレオチド配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）とが、ヌクレオチド配列の発現を、調節配列の影響下または制御下に置くような形で、共有結合的に連結された（これにより、発現カセットを形成する）状況を含みうる。したがって、調節配列が、ヌクレオチド配列の転写を行うことが可能である場合、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。次いで、結果として得られる転写物は、所望のペプチドまたはポリペプチドへと翻訳されうる。
本発明に従う組換え体の作製のために、ポリペプチドの発現に適する、任意の細胞が使用されうる。細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。一部の実施形態では、細胞は、古細菌または細菌の細胞など、原核細胞である。一部の実施形態では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌でありうる。
一部の実施形態では、細胞は、真核細胞など、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＣＯＳ細胞である。
場合によって、一部の原核細胞は、真核細胞と同じフォールディングまたは翻訳後修飾を可能としないため、細胞は、原核細胞ではない。加えて、真核細胞では、極めて高度な発現レベルが可能であり、適切なタグを使用すると、タンパク質は、真核細胞から精製することが、より容易でありうる。タンパク質の、培地への分泌を増強する、特異的なプラスミドもまた、用いられうる。
作製は、ペプチドまたはポリペプチドを発現するように修飾された真核細胞の培養または発酵を伴いうる。培養または発酵は、栄養物、空気／酸素および／または増殖因子の適切な供給がなされたバイオリアクター内で実施されうる。分泌されたタンパク質は、培養培地／発酵培養液を、細胞から分割し、タンパク質内容物を抽出し、個々のタンパク質を分離して、分泌されたペプチドまたはポリペプチドを単離することにより回収されうる。当業者には、培養法、発酵法、および分離法が周知であり、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版；上記で、参照により本明細書に組み込まれた）において記載されている。
バイオリアクターは、細胞が培養されうる、１または複数の反応槽を含む。バイオリアクター内の培養は、反応物の、リアクターへの、持続的な流入と、培養された細胞の、リアクターからの、持続的な流出とにより、持続的に生じうる。代替的に、培養は、バッチ内で生じうる。バイオリアクターは、培養される細胞に、最適の条件がもたらされるように、環境条件、例えば、ｐＨ、酸素、反応槽への流入および反応槽からの流出の流量、ならびに反応槽内の攪拌をモニタリングし、制御する。
免疫原、抗体、断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはＣＡＲを発現する細胞の培養の後、目的のペプチド／ポリペプチドが単離されることが好ましい。当技術分野で公知の、細胞培養物から、タンパク質を分離するための、任意の適切な方法が使用されうる。ペプチド／ポリペプチドを、培養物から単離するために、まず、培養された細胞を、目的のペプチド／ポリペプチドを含有する培地から分離することが必要でありうる。目的のペプチド／ポリペプチドが、細胞から分泌される場合、細胞は、分泌された目的のペプチド／ポリペプチドを含有する培養培地から、遠心分離により分離されうる。目的のペプチド／ポリペプチドが、細胞内に集まる場合、遠心分離の前に、例えば、超音波処理、急速な凍結－融解、または浸透圧溶解を使用して、細胞を破壊することが必要となるであろう。遠心分離は、培養された細胞、または培養された細胞の細胞破砕物を含有するペレットと、培養培地および目的のペプチド／ポリペプチドを含有する上清とをもたらすであろう。
次いで、目的のペプチド／ポリペプチドを、他のタンパク質および非タンパク質成分を含有しうる、上清または培養物培地から単離することが所望されうる。タンパク質成分を、上清または培養培地から分離するための、一般的な手法は、沈殿である。可溶性が異なるタンパク質は、硫酸アンモニウムなど、異なる濃度の沈殿剤で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性のタンパク質が抽出される。したがって、増大させる、異なる濃度の沈殿剤を添加することにより、可溶性の異なるタンパク質が、識別されうる。その後、分離されたタンパク質から、硫酸アンモニウムを除去するのに、透析が使用されうる。
当技術分野では、異なるタンパク質を識別するための他の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズクロマトグラフィーが公知である。これらは、沈殿に対する代替法として使用される場合もあり、沈殿に後続して実施される場合もある。
目的のペプチド／ポリペプチドは、培養物から単離されたら、ペプチドまたはポリペプチドを濃縮することが所望または必要でありうる。当技術分野では、限外濾過または凍結乾燥など、タンパク質を濃縮するための多数の方法が公知である。
ワクチン接種
本発明の方法において、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対する抗体を惹起するのに使用される免疫原はまた、ワクチンとしても有用である。免疫原は、ｐ５３の突然変異と関連するがんに対する免疫を発生させるのに使用されうる。
したがって、本発明は、本明細書で記載される、任意の実施形態に従う免疫原を使用する、ワクチン接種のための方法と、そのワクチンとしての使用とを含むワクチンを提供する。
ワクチンの免疫原／ワクチン接種において使用される免疫原は、同じ突然変異を含むがんに対する免疫を発生させる、ｐ５３の突然変異を含みうる。例えば、Ｒ１７５Ｈを含む抗原配列を含む免疫原は、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３を発現する、１もしくは複数の細胞を含むか、またはＲ１７５Ｈ ｐ５３をコードする核酸を含むがんに対するワクチン接種のための方法において有用でありうる。
一部の実施形態では、本発明に従うワクチンまたはワクチン接種において、複数の、異なる免疫原が使用されうる。一部の実施形態では、ワクチン／ワクチン接種は、異なるｐ５３の突然変異を含む免疫原を使用することが可能であり、したがって、１つを超えるｐ５３突然変異を含むがん、および／または異なるｐ５３突然変異を含むがんに対するワクチン接種に、有用でありうる。
当業者は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（第６版）Ｐｌｏｔｋｉｎら、２０１２、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓを参照することにより、本発明に従う、ワクチンに適する製剤、およびワクチン接種のためのスケジュールを、たやすく決定することが可能である。
ワクチン接種の方法および関連する使用は、予防的処置および／または防止的処置を含む。例えば、がんを発症する危険性があるか、または処置後において再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅまたはｒｅｌａｐｓｅ）の危険性があると考えられる対象には、本明細書で記載されるワクチンが投与されうる。このような投与は、対象が、がんを伴わないと考えられる場合にもなされうる。危険性状態およびがん状態についての評価は、相応の資格を有する医療従事者により、実施されうる。このような方法は、がんの発症、増殖、転移、または再発の可能性を低減しうる。
本発明は、このような組合せが、明らかに許容されないか、または明示的に回避される場合を除き、記載される態様と好ましい特徴との組合せを含む。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される対象物を限定するものと見なすべきではない。
ここで、付属の図面を参照しながら、例を目的として、本発明の態様および実施形態を例示する。当業者には、さらなる態様および実施形態は、明らかであろう。本文で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含むこと」などの変化形は、言明された整数またはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意し、他の任意の整数またはステップまたは整数もしくはステップの群の除外は含意しないものと理解される。
そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値からの範囲、および／または「約」別の特定の値までの範囲として表される。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からの範囲、および／または他の特定の値までの範囲を含む。同様に、値が、先行詞である「約」の使用により、近似値として表される場合、特定の値が、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
ここで、付属の図面を参照しながら、本発明の原理を例示する実施形態および実験について論じる。
ｐ５３突然変異体に特異的な抗体を惹起するのに使用される免疫原のアミノ酸配列を示す図である。（１Ａ）Ｒ１７５Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８０）を示す図である。長さが可変的な、突然変異体ｐ５３の配列の、３つのコピーであって、各々が、突然変異のうちの１つを擁するコピーを、ＴｒｘＡの活性部位へと挿入した。（１Ｂ）Ｒ２４８Ｑ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８４）を示す図である。（１Ｃ）Ｒ２７３Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８８）を示す図である。突然変異体ｐ５３のアミノ酸配列は、強調され（ライトグレー）、突然変異体の残基は、表示される（ダークグレー）。可撓性のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー配列は、下線を付される。精製のために使用される、Ｃ末端の６－Ｈｉｓタグは、イタリック体で示される。 ｐ５３突然変異体に特異的な抗体を惹起するのに使用される免疫原のアミノ酸配列を示す図である。（１Ａ）Ｒ１７５Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８０）を示す図である。長さが可変的な、突然変異体ｐ５３の配列の、３つのコピーであって、各々が、突然変異のうちの１つを擁するコピーを、ＴｒｘＡの活性部位へと挿入した。（１Ｂ）Ｒ２４８Ｑ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８４）を示す図である。（１Ｃ）Ｒ２７３Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原の配列（配列番号８８）を示す図である。突然変異体ｐ５３のアミノ酸配列は、強調され（ライトグレー）、突然変異体の残基は、表示される（ダークグレー）。可撓性のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー配列は、下線を付される。精製のために使用される、Ｃ末端の６－Ｈｉｓタグは、イタリック体で示される。 図２Ａ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される３Ｄ構造のＳｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌを示す図である。Ｒ１７５Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される構造を示す図である。チオレドキシン配列および抗原配列に対応する構造は、突然変異と同様に表示される。 図２Ｂ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される３Ｄ構造のＳｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌを示す図である。Ｒ２４８Ｑ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される構造を示す図である。チオレドキシン配列および抗原配列に対応する構造は、突然変異と同様に表示される。 図２Ｃ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される３Ｄ構造のＳｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌを示す図である。Ｒ２７３Ｈ ｐ５３に対する抗体を惹起するのに使用される免疫原について予測される構造を示す図である。チオレドキシン配列および抗原配列に対応する構造は、突然変異と同様に表示される。 ＩＰＴＧによる誘導の前（０時間後）および４時間後に、（３Ａ）ＴｒｘＲ１７５Ｈ、（３Ｂ）ＴｒｘＲ２４８Ｑ、（３Ｃ）ＴｒｘＲ２７３Ｈ、を発現するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株から単離される、全タンパク質、可溶性タンパク質、および不溶性タンパク質についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１６％）プロファイルの写真である。発現が予期されるタンパク質は、矢印で表示される。ＭＷ＝タンパク質の分子量ラダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標） Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）である。 ＩＰＴＧによる誘導の前（０時間後）および４時間後に、（３Ａ）ＴｒｘＲ１７５Ｈ、（３Ｂ）ＴｒｘＲ２４８Ｑ、（３Ｃ）ＴｒｘＲ２７３Ｈ、を発現するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株から単離される、全タンパク質、可溶性タンパク質、および不溶性タンパク質についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１６％）プロファイルの写真である。発現が予期されるタンパク質は、矢印で表示される。ＭＷ＝タンパク質の分子量ラダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標） Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）である。 図４Ａ 表示の分子量の、主要なタンパク質実体を示す、精製ＴｒｘＲ１７５Ｈの質量スペクトルを示す図である。 図４Ｂ 表示の分子量の、主要なタンパク質実体を示す、精製ＴｒｘＲ２４８Ｑの質量スペクトルを示す図である。 図５Ａ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示すグラフである。ＴｒｘＲ１７５Ｈで免疫化されたマウスの脾臓から作出された、個々のハイブリドーマクローンから得られる、細胞培養物上清を、表示の全タンパク質およびペプチド断片に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 図５Ｂ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示すグラフである。ＴｒｘＲ２４８Ｑで免疫化されたマウスの脾臓から作出された、個々のハイブリドーマクローンから得られる、細胞培養物上清を、表示の全タンパク質およびペプチド断片に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 図５Ｃ ｐ５３突然変異体に特異的な抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示すグラフである。ＴｒｘＲ２７３Ｈで免疫化されたマウスの脾臓から作出された、個々のハイブリドーマクローンから得られる、細胞培養物上清を、表示の全タンパク質およびペプチド断片に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 ｐ５３突然変異体に特異的な抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す棒グラフである。（６Ａ）ＴｒｘＲ１７５Ｈ、（６Ｂ）ＴｒｘＲ２４８Ｑ、（６Ｃ）ＴｒｘＲ２７３Ｈ、で免疫化されたマウスの脾臓から作出された、個々のハイブリドーマクローンから得られる、細胞培養物上清を、表示の全タンパク質およびペプチド断片に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 ｐ５３突然変異体に特異的な抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す棒グラフである。（６Ａ）ＴｒｘＲ１７５Ｈ、（６Ｂ）ＴｒｘＲ２４８Ｑ、（６Ｃ）ＴｒｘＲ２７３Ｈ、で免疫化されたマウスの脾臓から作出された、個々のハイブリドーマクローンから得られる、細胞培養物上清を、表示の全タンパク質およびペプチド断片に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 抗突然変異体ｐ５３抗体が結合するエピトープを決定するためのファージディスプレイ実験の結果を示す配列アライメントを示す図である。（７Ａ）抗Ｒ１７５Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号７７、および９３～１０１）、（７Ｂ）抗Ｒ２４８Ｑ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号１０２～１１０）、（７Ｃ）抗Ｒ２７３Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号１１１～１１９）である。コンセンサス配列が示される。 抗突然変異体ｐ５３抗体が結合するエピトープを決定するためのファージディスプレイ実験の結果を示す配列アライメントを示す図である。（７Ａ）抗Ｒ１７５Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号７７、および９３～１０１）、（７Ｂ）抗Ｒ２４８Ｑ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号１０２～１１０）、（７Ｃ）抗Ｒ２７３Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号１１１～１１９）である。コンセンサス配列が示される。 図８Ａ 抗突然変異体ｐ５３抗体が結合するエピトープを決定するためのファージディスプレイ実験の結果を示す配列アライメントを示す図である。抗Ｒ１７５Ｈ抗体を産生する、表示のハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号７７、９３、および１２０～１３５）である。コンセンサス配列が示される。 図８Ｂ 抗突然変異体ｐ５３抗体が結合するエピトープを決定するためのファージディスプレイ実験の結果を示す配列アライメントを示す図である。抗Ｒ２４８Ｑ抗体を産生する、表示のハイブリドーマ細胞培養物上清により捕捉されるペプチドの配列（配列番号１０２、１０３、および１３６～１４４）である。コンセンサス配列が示される。 図９Ａ 抗Ｒ１７５Ｈ抗体クローンである、４Ｈ５が結合するエピトープ（配列番号１４５～１５９）を決定するためのアラニン走査ＥＬＩＳＡの結果を示す、表および棒グラフである。突然変異したホットスポット（Ｈｉｓ １７５）を取り囲む、個別にアラニン置換された１３マーのペプチドを使用して、突然変異体ｐ５３に結合する突然変異体抗体に必要とされる最重要のアミノ酸残基を決定した。吸光度は、ＴＭＢ基質を伴う、５分間にわたるインキュベーションの後において、６５０ｎｍで測定した。個々の、アラニン置換されたペプチドについての、光学密度の読取りを示す。抗体の結合に最重要の残基は、示したモチーフである。 図９Ｂ 抗Ｒ１７５Ｈ抗体クローンである、７Ｂ９が結合するエピトープ（配列番号７９、および１４５～１５９）を決定するためのアラニン走査ＥＬＩＳＡの結果を示す、表および棒グラフである。突然変異したホットスポット（Ｈｉｓ １７５）を取り囲む、個別にアラニン置換された１３マーのペプチドを使用して、突然変異体ｐ５３に結合する突然変異体抗体に必要とされる最重要のアミノ酸残基を決定した。吸光度は、ＴＭＢ基質を伴う、５分間にわたるインキュベーションの後において、６５０ｎｍで測定した。個々の、アラニン置換されたペプチドについての、光学密度の読取りを示す。抗体の結合に最重要の残基は、示したモチーフである。 図９Ｃ 抗Ｒ１７５Ｈ抗体クローンである、１０Ｃ８が結合するエピトープ（配列番号１４５～１５９）を決定するためのアラニン走査ＥＬＩＳＡの結果を示す、表および棒グラフである。突然変異したホットスポット（Ｈｉｓ １７５）を取り囲む、個別にアラニン置換された１３マーのペプチドを使用して、突然変異体ｐ５３に結合する突然変異体抗体に必要とされる最重要のアミノ酸残基を決定した。吸光度は、ＴＭＢ基質を伴う、５分間にわたるインキュベーションの後において、６５０ｎｍで測定した。個々の、アラニン置換されたペプチドについての、光学密度の読取りを示す。抗体の結合に最重要の残基は、示したモチーフである。 図９Ｄ 抗Ｒ２７３Ｈ抗体クローンである、１３Ｅ４が結合するエピトープ（配列番号１６０～１７３）を決定するためのアラニン走査ＥＬＩＳＡの結果を示す、表および棒グラフである。突然変異したホットスポット（Ｈｉｓ ２７３）を取り囲む、個別にアラニン置換された１３マーのペプチドを使用して、突然変異体ｐ５３に結合する突然変異体抗体に必要とされる最重要のアミノ酸残基を決定した。吸光度は、ＴＭＢ基質を伴う、５分間にわたるインキュベーションの後において、６５０ｎｍで測定した。個々の、アラニン置換されたペプチドについての、光学密度の読取りを示す。抗体の結合に最重要の残基は、示したモチーフである。 抗体により認識される最重要の残基についてのアラニン走査解析により同定される、抗体のエピトープを示す配列（配列番号１７４）を示す図である。 突然変異体ｐ５３特異的抗体を使用する免疫ブロットの結果を示す写真である。ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞に、表示のｐ５３突然変異体または野生型ｐ５３ポリペプチドをコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトし、タンパク質溶解物を、表示の抗体による直接的免疫ブロット法のために使用した。ＤＯ１とは、ヒトｐ５３の全ての形態を検出するマウスｍＡｂであり、ＣＭ１とは、ヒトｐ５３に対するウサギポリクローナル抗体である。 突然変異体ｐ５３特異的抗体を使用する免疫沈降アッセイの結果を示す写真である。ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞に、表示のｐ５３突然変異体または野生型ｐ５３ポリペプチドをコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトし、タンパク質溶解物を、免疫沈降アッセイのために使用した。ＤＯ１とは、ヒトｐ５３の全ての形態を検出するマウスｍＡｂであり、ＣＭ１とは、ヒトｐ５３に対するウサギポリクローナル抗体である。両方のｐ５３突然変異体特異的ｍＡｂにより、プルダウンを実施するのに続き、ＣＭ１抗体による免疫ブロット、逆の順序で、ＣＭ１によるプルダウン、突然変異体特異的ｍＡｂによる免疫ブロット法を行った。 図１４および１５における、ｐ５３特異的抗体についての解析のために使用される細胞系の、ｐ５３突然変異状態を示す表である。 突然変異体ｐ５３特異的抗体を使用する免疫ブロットの結果を示す写真である。表示の細胞系のタンパク質溶解物を、表示の抗体による直接的免疫ブロット法のために使用した。Ａ５４９およびＭＣＦ－７は、内因性のｐ５３発現を誘導するのに、ＵＶ照射を伴わずに、またはこれを伴って使用される、野生型ｐ５３保有細胞系である。 突然変異体ｐ５３特異的抗体を使用する免疫沈降アッセイの結果を示す写真である。表示の細胞系のタンパク質溶解物を、表示の抗体を使用する免疫沈降アッセイのために使用した。Ａ５４９およびＭＣＦ－７は、内因性のｐ５３発現を誘導するのに、ＵＶ照射を伴わずに、またはこれを伴って使用される、野生型ｐ５３保有細胞系である。両方のｐ５３突然変異体特異的ｍＡｂにより、プルダウンを実施するのに続き、ＣＭ１抗体による免疫ブロット、逆の順序で、ＣＭ１によるプルダウン、突然変異体特異的ｍＡｂによる免疫ブロット法を行った。 免疫蛍光解析の結果を示す写真である。ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞に、表示のｐ５３突然変異体または野生型ｐ５３ポリペプチドをコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトし、免疫蛍光解析にかけた。 免疫蛍光解析の結果を示す写真である。ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞に、表示のｐ５３突然変異体または野生型ｐ５３ポリペプチドをコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトし、免疫蛍光解析にかけた。 図１７Ａ及びＢ 免疫蛍光解析の結果を示す写真である。表示の抗体を使用する、免疫蛍光解析のために、表示の細胞系を使用したことを示す写真である。Ｄａｐｉ染色は、核を強調する。 図１７Ａ及びＢ 免疫蛍光解析の結果を示す写真である。Ｒ２４８ＱまたはＲ２４８Ｗの突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する、ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞内の、Ｒ２４８Ｑ ｍＡｂを示す写真である。Ｄａｐｉ染色は、核を強調する。 図１８Ａ 突然変異体特異的抗ｐ５３抗体を使用する、免疫組織化学解析に関する写真である。ｐ５３について、突然変異状態を決定するための、ヒト結腸腫瘍試料についての配列解析（配列番号１７５～１８６）を示す写真である。 図１８Ｂ 突然変異体特異的抗ｐ５３抗体を使用する、免疫組織化学解析に関する写真である。表示の抗ｐ５３抗体を使用する、パラフィン包埋腫瘍試料の染色を示す写真である。 Ｒ１７５Ｈ突然変異体特異的抗ｐ５３抗体を使用するヒト腫瘍マイクロアレイの結果を示す写真である。トリプルネガティブ乳がん、結腸直腸がん、腎臓がん、および肺がんに由来するヒト腫瘍マイクロアレイを、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３特異的ｍＡｂ、および汎ｐ５３ ｍＡｂであるＤＯ７で染色した。二重陽性は、ＤＯ７および突然変異特異的ｍＡｂの両方で染色した試料を指し、単一陽性は、ＤＯ７だけで染色した。ＤＯ７染色を伴わずに、突然変異特異的ｍＡｂ染色だけを伴う試料は存在しなかった。 図２０Ａ 腫瘍試料中のｐ５３配列、ならびに免疫組織化学による、抗ｐ５３抗体および抗Ｒ１７５Ｈ抗体についての染色を示すクロマトグラムである。ヒトトリプルネガティブ乳がん試料を、抗ｐ５３（ＤＯ７および１１Ｄ１）抗体および抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体で染色した。Ｒ１７５Ｈ抗体の他、抗ｐ５３抗体である、ＤＯ７および１１Ｄ１の両方による陽性染色を示す、試料Ｂ４１、Ｂ８９、およびＢ９８を示す図である。配列は、試料が、Ｒ１７５Ｈ突然変異を含む（ＣＡＧ：下線が付される）こと（配列番号１８７～１８９）を示す。 図２０Ｂ 腫瘍試料中のｐ５３配列、ならびに免疫組織化学による、抗ｐ５３抗体および抗Ｒ１７５Ｈ抗体についての染色を示すクロマトグラムである。ヒトトリプルネガティブ乳がん試料を、抗ｐ５３（ＤＯ７および１１Ｄ１）抗体および抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体で染色した。抗ｐ５３抗体である、ＤＯ７および１１Ｄ１だけによる陽性染色を示す（抗Ｒ１７５Ｈ抗体による陽性染色は示さない）試料Ｂ２７、ならびに抗ｐ５３抗体のうちのいずれによっても染色されない、試料Ｂ５２を示す図である。配列は、Ｂ２７およびＢ５７が、１７５位において突然変異を含まない（ＣＧＣ：下線が付される）こと（配列番号１９０および１９１）を示す。 免疫組織化学による、ヒト腫瘍マイクロアレイ解析の結果をまとめる表である。 多様な種に由来するｐ５３の、アミノ酸配列のアライメントを、Ｒ１７５残基（配列番号１９２～２１４）、Ｒ２４８残基、またはＲ２７３残基（配列番号２１５～２３５）（矢印で表示する）を含有する領域と、下線を付された、これらを取り囲む残基と共に示す図であり、種間の強力な保存を示すことから、突然変異体特異的ｍＡｂが、全ての種にわたり働きうることが指し示される。 多様な種に由来するｐ５３の、アミノ酸配列のアライメントを、Ｒ１７５残基（配列番号１９２～２１４）、Ｒ２４８残基、またはＲ２７３残基（配列番号２１５～２３５）（矢印で表示する）を含有する領域と、下線を付された、これらを取り囲む残基と共に示す図であり、種間の強力な保存を示すことから、突然変異体特異的ｍＡｂが、全ての種にわたり働きうることが指し示される。 多様な種に由来するｐ５３の、アミノ酸配列のアライメントを、Ｒ１７５残基（配列番号１９２～２１４）、Ｒ２４８残基、またはＲ２７３残基（配列番号２１５～２３５）（矢印で表示する）を含有する領域と、下線を付された、これらを取り囲む残基と共に示す図であり、種間の強力な保存を示すことから、突然変異体特異的ｍＡｂが、全ての種にわたり働きうることが指し示される。 図２３Ａ－２３Ｄ Ｒ１７５Ｈ突然変異のマウス同等物（すなわち、Ｒ１７２Ｈ）についての解析の結果を示す写真である。表示の遺伝子型による、マウス胎仔線維芽細胞を、（２３Ａ）直接的免疫ブロット法（Ｉ．Ｂ．）（２３Ｂ）免疫沈降（Ｉ．Ｐ．）、（２３Ｃ）免疫蛍光、または、（２３Ｄ）抗Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂによる免疫組織化学解析のために使用した。マウスｐ５３に対するポリクローナル抗体である、ＣＭ５は、免疫沈降研究内のＩ．Ｂ．のために使用した。Ｒ２４６Ｓ突然変異体によるＭＥＦは、異なるホットスポット突然変異体によるノックインマウス株に由来する。 図２３Ａ－２３Ｄ Ｒ１７５Ｈ突然変異のマウス同等物（すなわち、Ｒ１７２Ｈ）についての解析の結果を示す写真である。表示の遺伝子型による、マウス胎仔線維芽細胞を、（２３Ａ）直接的免疫ブロット法（Ｉ．Ｂ．）（２３Ｂ）免疫沈降（Ｉ．Ｐ．）、（２３Ｃ）免疫蛍光、または、（２３Ｄ）抗Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂによる免疫組織化学解析のために使用した。マウスｐ５３に対するポリクローナル抗体である、ＣＭ５は、免疫沈降研究内のＩ．Ｂ．のために使用した。Ｒ２４６Ｓ突然変異体によるＭＥＦは、異なるホットスポット突然変異体によるノックインマウス株に由来する。 抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の、軽鎖および重鎖のＣＤＲをまとめ、コンセンサス配列は、表示される表である。 抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１、および４Ｈ２の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１、および４Ｈ２の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１、および４Ｈ２の、軽鎖および重鎖のＣＤＲをまとめ、コンセンサス配列は、表示される表である。 抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１、および４Ｈ２の重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１、および４Ｈ２の重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４の重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 ４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８による、ハイブリドーマ細胞培養物上清を使用する、Ｒ１７２Ｈのマウス胸腺リンパ腫初代細胞系である、Ｔ４７Ｄ細胞、ＷｉＤｒ細胞、およびＤＫＯ細胞からの抽出物についての免疫ブロットの結果を示す写真である。 Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３のタンパク質を発現する細胞、およびこれを発現しない細胞についての、クローンである（３６Ａ）４Ｈ５、（３６Ｂ）７Ｂ９及び（３６Ｃ）１０Ｃ８に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清による免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３のタンパク質を発現する細胞、およびこれを発現しない細胞についての、クローンである（３６Ａ）４Ｈ５、（３６Ｂ）７Ｂ９及び（３６Ｃ）１０Ｃ８に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清による免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 クローンである４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清を使用する、マウス腸組織切片（ｐ５３ノックアウトマウス、または照射された、ｐ５３ Ｒ１７２Ｈ陽性マウス）についての解析の結果を示す写真である。 ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０コンジュゲート４Ｈ５ ｍＡｂによる腫瘍ターゲティングを示す写真である。マウスを、１００ｕｇのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０標識化４Ｈ５ ｍＡｂによるｉ．ｖ．注射の、６、２４、４８、７２時間後、および７日間後にイメージングし、イメージングは、ＩＶＩＳにより行った。Ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／Ｒ１７２Ｈマウスに由来するマウス腫瘍細胞に、ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトし、腫瘍モデルを確立するのに使用した。 ３Ｇ１１および４Ｈ２によるハイブリドーマ細胞培養物上清を使用する、ＴＫＯ細胞およびＨＣＣ７０細胞からの抽出物についての免疫ブロットの結果を示す写真である。 図４０Ａ Ｒ２４８Ｑ ｐ５３を発現する細胞、およびＲ２４８Ｑ ｐ５３を発現しない細胞についての、クローンである３Ｇ１１に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清による免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 図４０Ｂ Ｒ２４８Ｑ ｐ５３を発現する細胞、およびＲ２４８Ｑ ｐ５３を発現しない細胞についての、クローンである４Ｈ２に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清による免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 １３Ｅ４によるハイブリドーマ細胞培養物上清を使用する、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＢ４６８細胞からの抽出物についての免疫ブロットの結果を示す写真である。 Ｒ２７３Ｈ ｐ５３を発現する細胞（ＷｉＤｒ）、およびＲ２７３Ｈ ｐ５３を発現しない細胞（Ｔ４７Ｄ）についての、クローンである１３Ｅ４に由来する、ハイブリドーマ細胞培養物上清による免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０コンジュゲート１３Ｅ４ ｍＡｂによる腫瘍ターゲティングを示す写真である。マウスを、１００ｕｇのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０標識化１３Ｅ４ ｍＡｂによるｉ．ｖ．注射の、７２時間後にイメージングし、イメージングは、ＩＶＩＳにより行った。ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトした、ｐ５３－Ｒ２７３Ｈ突然変異体のＨＴ２９腫瘍細胞系を使用して、腫瘍モデルを確立した。 精製された、マウスＦＶ－ヒトＩｇＧ１キメラの、４Ｈ５抗体、７Ｂ９抗体、および１０Ｃ８抗体を使用する、マウス腸組織切片（ｐ５３ノックアウトマウス、または照射された、ｐ５３ Ｒ１７２Ｈ陽性マウス）についての解析の結果を示す写真である。 ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｒ１７５Ｈ陽性がんの増殖を制御する、抗Ｒ１７５Ｈ抗体についての解析の結果を示すグラフである。ルシフェラーゼを保有するＳＫＢＲ－３細胞を使用して、ヒト異種移植がんモデルを確立し、抗Ｒ１７５Ｈ抗体（ａ１７５；点線）による処置の、腫瘍の増殖に対する影響を、ＩｇＧ対照（ＩｇＧ、実線）と比較した。 図４６Ａ ｐ５３のＲ１７５Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ１７５Ｈに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。図４６Ｂ ｐ５３のＲ１７５Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。図４６Ｃ ｐ５３のＲ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ２７３Ｈに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｄ ｐ５３のＲ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｅ ｐ５３のＲ２４８Ｑ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ２４８Ｑに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。図４６Ｅ ｐ５３のＲ２４８Ｑ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ａ ｐ５３のＲ１７５Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ１７５Ｈに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｂ ｐ５３のＲ１７５Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｃ ｐ５３のＲ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ２７３Ｈに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｄ ｐ５３のＲ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｅ ｐ５３のＲ２４８Ｑ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、ｐ５３突然変異体である、Ｒ２４８Ｑに対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 図４６Ｅ ｐ５３のＲ２４８Ｑ突然変異体に対応する免疫原を注射されたマウスにおける、ｐ５３突然変異体または野生型ヒトｐ５３に対応するペプチドに対する抗体応答についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。免疫化されたマウスに由来する血清を、全長の野生型ヒトｐ５３（ＷＴ ＨＰ５３）に対応するペプチドに結合することが可能な抗体について解析した。 ｐ５３の（４７Ａ）Ｒ１７５Ｈ突然変異体、（４７Ｂ）Ｒ２４８Ｑ突然変異体、または、（４７Ｃ）Ｒ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原による免疫化に応答して産生された抗体が、対応する、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する細胞を認識する能力についての免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 ｐ５３の（４７Ａ）Ｒ１７５Ｈ突然変異体、（４７Ｂ）Ｒ２４８Ｑ突然変異体、または、（４７Ｃ）Ｒ２７３Ｈ突然変異体に対応する免疫原による免疫化に応答して産生された抗体が、対応する、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現する細胞を認識する能力についての免疫蛍光解析の結果を示す写真である。 抗Ｒ１７５Ｈ抗体の、ＳＫＢＲ細胞の増殖に対する効果を示すグラフである。マウスに、ＳＫＢＲルシフェラーゼレポーター細胞５×１０６個を注射し、規則的な間隔（注射を、矢印で表示する）で、１００μｌの、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的なモノクローナル抗体（ａ１７５）、またはアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ）を注射した。ＳＫＢＲ細胞の増殖は、ルシフェラーゼ活性の解析により測定した。 マウスヒトキメラ抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８の、軽鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 マウスヒトキメラ抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８の、重鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ １３Ｅ４の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ １３Ｅ４の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ １３Ｅ４の、軽鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ １３Ｅ４の、重鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２の軽鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２の重鎖可変ドメイン配列を示す図である。ＣＤＲは、下線を付され、別個に示される。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２の、軽鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 マウスヒトキメラ抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３抗体クローンである、ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２の、重鎖可変ドメイン配列の、ヌクレオチド配列と、コードされるアミノ酸配列とを示す図である。 キメラマウスヒト抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８による、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３への特異的結合を確認するＥＬＩＳＡ解析の結果を示す棒グラフである。平均ＯＤ４５０の読取りをプロットした。キメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体（ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、ＭＨ １０Ｃ８）抗体は、０．１～１ｎｇ／μｌの間の濃度で、陽性シグナルをもたらした。この図で示されるデータは、１ｎｇ／μｌの抗体濃度についてのものであった。全てのキメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体は、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈ全長タンパク質だけを特異的に認識および検出し、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈ全長タンパク質、ヒトｐ５３野生型全長タンパク質、またはマウスｐ５３野生型全長タンパク質（単一のアステリスク）は、認識および検出しなかった。市販の抗ｐ５３抗体（１ｃ１２）を、陽性対照抗体として含めた（ｎ＝３）。 キメラマウスヒト抗体クローンである、ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、およびＭＨ １０Ｃ８による、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３への特異的結合を示すウェスタンブロットである。この実験では、ヒト細胞系：Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）、ＭＣＦ７、Ａ５４９（いずれも、野生型ｐ５３）、ＳＫＢＲ３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）、Ａ４３１、およびＳＷ４８０（いずれも、ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ）について調べた。全てのキメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体は、内因性ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈタンパク質（ＳＫＢＲ３）だけを認識および検出し、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈタンパク質、またはヒトｐ５３野生型タンパク質（黒矢印）は、認識および検出しなかった。全ての抗体を、１ｎｇ／μｌの濃度で調べた。 ＭＨ ７Ｂ９による、ヒト細胞系内の、内因性ｐ５３タンパク質の検出を示す代表的画像である。細胞は、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。以下のヒト細胞系：Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）、ＭＣＦ７（野生型ｐ５３）、ＳＫＢＲ３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）、およびＡ４３１（ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ）を使用して、免疫組織化学アッセイを実施した。写真は、１．６７ｎｇ／μｌのＭＨ ７Ｂ９抗体による、全ての細胞系の染色を示す。全てのキメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体は、内因性ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈタンパク質（ＳＫＢＲ３）だけを特異的に認識および検出した（左上パネル）。 キメラマウスヒト抗体クローンであるＭＨ １３Ｅ４による、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３への特異的結合を確認するＥＬＩＳＡ解析の結果を示す棒グラフである。平均ＯＤ４５０の読取りをプロットした。この図で示されるデータは、１ｎｇ／μｌの抗体濃度についてのものであった。ＭＨ １３Ｅ４は、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈ全長タンパク質だけを、特異的に認識および検出し、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈ全長タンパク質、またはヒトｐ５３野生型全長タンパク質は、認識および検出しなかった（単一のアステリスク）。 キメラマウスヒト抗体クローンである、ＭＨ １３Ｅ４による、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３への特異的結合を示すウェスタンブロットである。この実験では、ヒト細胞系：Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）、ＭＣＦ７、Ａ５４９（いずれも、野生型ｐ５３）、ＳＫＢＲ３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）、Ａ４３１、およびＳＷ４８０（いずれも、ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ）について調べた。ＭＨ １３Ｅ４は、内因性ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈタンパク質（Ａ４３１およびＳＷ４８０）だけを、特異的に認識および検出し、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈタンパク質、またはヒトｐ５３野生型タンパク質は、認識および検出しなかった（黒矢印）。ＭＨ １３Ｅ４を、１ｎｇ／μｌの濃度で調べた。 ＭＨ １３Ｅ４による、ヒト細胞系内の、内因性ｐ５３タンパク質の検出を示す代表的画像である。細胞は、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。以下のヒト細胞系：Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）、ＭＣＦ７（野生型ｐ５３）、ＳＫＢＲ３（ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ）、およびＡ４３１（ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ）を使用して、免疫組織化学アッセイを実施した。写真は、５ｎｇ／μｌのＭＨ １３Ｅ４抗体による、全ての細胞系の染色を示す。ＭＨ １３Ｅ４抗体は、内因性ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈタンパク質（Ａ４３１（右上パネル））を発現する細胞核だけを特異的に認識および検出した。 キメラマウスヒト抗体クローンである、ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２による、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３への特異的結合を確認するＥＬＩＳＡ解析の結果を示す棒グラフである。平均ＯＤ４５０の読取りをプロットした。キメラ抗ｐ５３ Ｒ２４８Ｑ抗体は、１ｎｇ／μｌの濃度で使用したが、３Ｇ１１および４Ｈ２ハイブリドーマ上清は、正味濃度で調べた。ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２のいずれも、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈ全長タンパク質、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈ全長タンパク質、ヒトｐ５３野生型全長タンパク質、およびマウスｐ５３野生型全長タンパク質に対して、ヒトｐ５３ Ｒ２４８Ｑ全長タンパク質だけを、特異的に認識および検出した（単一のアステリスク）。ハイブリドーマ上清および市販の抗ｐ５３抗体（１Ｃ１２）を、陽性対照抗体として含めた（ｎ＝３）。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＭＨ １３Ｅ４による、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３の検出を示す画像である。１００ｕｇの蛍光標識Ｒ２７３Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ １３Ｅ４または ＩｇＧ対照抗体を、ｐ５３Ｒ２７３Ｈ突然変異体ＨＴ２９腫瘍保有マウスに、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、抗体注射後７２時間において、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムにより、ｍＡｂのトラフィッキングについてイメージングした。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＭＨ ４Ｈ５およびＭＨ ７Ｂ９による、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３の検出を示す画像である。１００ｕｇの蛍光標識Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ ４Ｈ５もしくはＭＨ ７Ｂ９または ＩｇＧ対照を、ｐ５３Ｒ１７５Ｈクローン３２腫瘍保有マウスに、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、抗体注射後６時間、２４時間、２日目、３日目、および７日目に、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムにより、ｍＡｂのトラフィッキングについてイメージングした。生物発光は、クローン３２腫瘍の位置を指し示す。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＭＨ ４Ｈ５による、自然発生のマウスＲ１７２Ｈ突然変異体ｐ５３の検出を示す画像である。１００ｕｇの蛍光標識Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ ４Ｈ５を、腫瘍を保有する突然変異体ｐ５３Ｒ１７２Ｈマウスへと、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、抗体の注射後２および３日目において、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムによりイメージングした。 図７１Ａ ｍＡｂ １３Ｅ４を伴う処置による、ＨＴ２９異種移植腫瘍の増殖の阻害を示す、概略図および画像である。実験スケジュールについての概略表示である。 図７１Ｂ ｍＡｂ １３Ｅ４を伴う処置による、ＨＴ２９異種移植腫瘍の増殖の阻害を示す、概略図および画像である。平均光子強度を測定することにより決定される腫瘍サイズを示す画像である。 ｍＡｂ １３Ｅ４を伴う処置による、ＨＴ２９異種移植腫瘍の増殖の阻害を示す、概略図、棒グラフ、画像、およびグラフである。（７２Ａ）実験スケジュールについての概略表示である。（７２Ｂ）実験の終了時における腫瘍量を示す棒グラフである。（７２Ｃおよび７２Ｄ）平均光子強度を測定することにより決定される腫瘍サイズを示す画像およびグラフである。 ｍＡｂ １３Ｅ４を伴う処置による、ＨＴ２９異種移植腫瘍の増殖の阻害を示す、概略図、棒グラフ、画像、およびグラフである。（７２Ａ）実験スケジュールについての概略表示である。（７２Ｂ）実験の終了時における腫瘍量を示す棒グラフである。（７２Ｃおよび７２Ｄ）平均光子強度を測定することにより決定される腫瘍サイズを示す画像およびグラフである。 ｍＡｂ １３Ｅ４を伴う処置による、ＨＴ２９異種移植腫瘍の増殖の阻害を示す、概略図、棒グラフ、画像、およびグラフである。（７２Ａ）実験スケジュールについての概略表示である。（７２Ｂ）実験の終了時における腫瘍量を示す棒グラフである。（７２Ｃおよび７２Ｄ）平均光子強度を測定することにより決定される腫瘍サイズを示す画像およびグラフである。 図７３Ａ マウスｐ５３ Ｒ１７２Ｈ陽性がんに対する、抗ｐ５３ 突然変異体Ｒ１７５抗体の治療効果を示す、概略図および棒グラフである。実験スケジュールについての概略表示である。 図７３Ｂ マウスｐ５３ Ｒ１７２Ｈ陽性がんに対する、抗ｐ５３ 突然変異体Ｒ１７５抗体の治療効果を示す、概略図および棒グラフである。実験の終了時における腫瘍量を示す棒グラフである。 図７４Ａ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。実験スケジュールについての概略表示である。 図７４Ｂ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。免疫化されたマウスに由来する血清が、表示の抗原に結合する能力であって、ＥＬＩＳＡにより決定される能力を示すグラフである。 図７４Ｃ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。免疫化されたマウスに由来する血清が、ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈを発現する細胞に結合する能力を示す画像である。 図７４Ｄ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。免疫化されたマウスに由来する血清が、ｐ５３陰性ＴＫＯ細胞に結合しない能力を示す画像である。 図７４Ｅ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。ＴｒｘＲ１７５Ｈで免疫化されたマウスから得られた血清の、ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈに対する反応性を示す画像である。 図７４Ｆ 突然変異体ｐ５３ Ｒ１７５タンパク質に結合することが可能な抗体を惹起する、ＴｒｘＲ１７５Ｈによる免疫化の能力を示す、概略図、グラフ、画像、および棒グラフである。表示の抗原で免疫化されたマウスの脾臓細胞中の、異なる免疫細胞サブセットの百分率であって、フローサイトメトリーにより決定される百分率を示す棒グラフである。
本発明者らは、以下の実施例において、ｐ５３の、ＤＢＤ領域における点突然変異体に対するモノクローナル抗体の作出および特徴付けについて記載する。抗体は、個々のｐ５３ホットスポット突然変異について、高度に特異的であることが示され、様々な生化学アッセイおよび組織学アッセイにおける抗体の有用性が裏付けられる。
実施例１
免疫原のデザインおよび作製
一連のプロトコールを使用して、特異的ｐ５３突然変異体に対する抗体を作出しようとする試みは、おそらく、突然変異体エピトープの効率的な発現の欠如、この結果としてもたらされる突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対する特異性の欠如のために、完全には成功していない。
したがって、本発明者らは、突然変異を挟むアミノ酸配列の長さが可変的な、突然変異体ｐ５３突然変異（すなわち、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８ＱまたはＲ２７３Ｈ）の３つのコピーが配置された突出部を伴うＴｒｘＡタンパク質を用いた。突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列を、抗原配列を挟み抗原配列とＴｒｘＡ配列とを隔てる可撓性のＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２３６）リンカーと共に、ＴｒｘＡの活性部位へと挿入した。より短い、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカーもまた、各突然変異体ｐ５３の配列の間に挿入した。
ＴｒｘＡは、タンパク質の発現レベル、可溶性、および熱安定性を増強するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系内で広く使用され、活性部位（Ｃｙｓ３３－Ｇｌｙ３４－Ｐｒｏ３５－Ｃｙｓ３６）（配列番号９１）がタンパク質本体から溶液へと突出する融合パートナーである（ＬａＶａｌｌｉｅら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６：３２２～３４０；Ｙｏｕｎｇら、２０１２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、７：６２０～６３４）。この活性部位をコードするＤＮＡ配列上の制限（ＲｓｒＩＩ）部位の存在は、ＴｒｘＡの表面上に提示されうる内部ペプチド融合体のための挿入点をもたらし、これは、ＴｒｘＡ足場上の、溶媒に接触可能なループ内への抗原の挿入による抗体の産生のために利用され成功を収めている（Ｂａｒｒｅｌｌら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、３３：１５３～１５９）。
ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４ベクターへとクローニングされた、突然変異体ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２７３Ｈ、およびＲ２４８Ｑ）のトリペプチド配列を擁するＴｒｘＡ足場は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。コード配列は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるタンパク質の精製を容易とするように、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを伴ってデザインし、Ｅ．ｃｏｌｉに好ましいコドンへと、カスタムで最適化した。合成コード断片の真正性は、ＤＮＡシーケンシングにより検証した。
抗体を惹起するのに使用された免疫原のアミノ酸配列は、図１Ａ～１Ｃに示される。
相同性のモデル化は、突然変異体ｐ５３抗原配列の、ＴｒｘＡ足場の活性部位への挿入が、ＴｒｘＡタンパク質から突然変異体ｐ５３抗原配列が伸長し、溶媒に接触可能なループ内の突然変異残基が露出した形で、ペプチド配列の免疫原性を増大させる、実行可能な提示戦略をもたらすことを予測した。Ｓｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌにより予測される、ＴｒｘＲ１７５Ｈ免疫原、ＴｒｘＲ２４８Ｑ免疫原、およびＴｒｘＲ２７３Ｈ免疫原の３Ｄ構造を示す（図２Ａ～２Ｃ）が、これにより、露出した、溶媒接触可能な突然変異体ｐ５３の抗原性領域が明らかになる。
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｒｘＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、組換えＴｒｘｐ５３突然変異体構築物の発現のために使用した。タンパク質の可溶性を決定するミニスケールの発現研究を、Ｌｉｅｗら、２０１４、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８９、２１～２９において記載される通りに実施した。大スケールの精製には、Ｌｉｅｗら、２０１４において記載されている通りに実施される可溶性ペプチドおよび不溶性ペプチドを、それぞれ、リン酸緩衝液中への統合型オンカラムリフォールディングを伴うネイティブＩＭＡＣおよび変成ＩＭＡＣにより回収した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質の定量化を実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により純度を評価した。
ＴｒｘＲ１７５Ｈ免疫原の発現を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて誘導し、可溶性形態および不溶性形態のいずれにおいても発現する（図３Ａ）が、不溶性画分への分配率が大きいＴｒｘＲ１７５Ｈについて、約１８．８ｋＤａであると予測した。精製ＴｒｘＲ１７５Ｈについての、質量分析による解析は、実際の分子量が、約１８，７００Ｄａであり、第１のメチオニン残基の喪失と符合する（計算による質量：約１８，７０７Ｄａ）ことを明らかにした（図４Ａ）。かつての報告は、そのアミノ酸配列の２位にＳｅｒ残基を含有するＴｒｘＡ融合体は、おそらく、Ｅ．ｃｏｌｉにおける内因性のメチオニンアミノペプチダーゼにより、第１のメチオニン（１３１Ｄａ）の効率的な切断を可能とすることを示した（Ｌｉｅｗら、２００７）。同様に、ＴｒｘＲ２７３Ｈも、主に、不溶性画分として封入体内に、約１８，２００Ｄａの予測サイズで発現した（図３Ｃ）。ＴｒｘＲ２４８Ｑは、不溶性タンパク質画分へと分配されることが見出され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上では、予測外に、１５ｋＤａの低分子量位置に泳動し（図３Ｂ）、質量分析による解析は、１７，３５２Ｄａの質量を明らかにした（図４Ｂ）。構築物のコード配列は、ＤＮＡシーケンシングにより検証し、発現させるタンパク質は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、精製することができ、これは、ＴｒｘＲ２４８Ｗのカルボキシル末端に配置されたＨｉｓ６タグが無傷であり、全長タンパク質が翻訳されることを指し示し、低分子量は、Ｎ末端のＡｌａ２０の下流において、裏付けられた通り、Ｅ．ｃｏｌｉプロテアーゼによる、予測外のタンパク質分解性切断の結果である可能性があり（Ｃａｒｒｉｏら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４３４、１７０～１７６；Ｃｏｒｃｈｅｒｏら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３７、３２５～３３０）、１６６残基のタンパク質部分、およびそのナトリウム形態（１７，３２４／１７，３４７Ｄａ）に対応することを示唆した。いずれにせよ、Ｅ．ｃｏｌｉプロテアーゼによる、予測外のタンパク質分解は、抗原配列を、融合タンパク質の末端領域ではなく、ＴｒｘＡ内で入れ子にする、顕著な利点を強調する。
実施例２
特異的ｐ５３突然変異体に対するｐ５３モノクローナル抗体を同定する、初期スクリーニング
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）５匹ずつの３群に、Ｔｒｘｐ５３突然変異体ペプチドを接種した。初回の免疫化を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）により、腹腔内で実施するのに続き、５回にわたる腹腔内注射および皮下注射を、３週間隔で行った。４回目の免疫化の１週間後、ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を使用する、頬からの採血を介して、血液を、各マウスから採取した。血液試料を、１６００ｒｐｍで、１０分間にわたり遠心分離し、血清を吸引し、全長の、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２７３Ｈ、およびＲ２４８Ｑの突然変異体ｐ５３タンパク質に対する、後続の酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）解析のために、４℃で保管した。
血清中の抗体力価が最高であるマウスを、融合のための脾臓ドナーとして選択した。選択されたマウス（各ｐ５３突然変異について、１匹ずつ）に、アジュバントを伴わない、Ｔｒｘｐ５３突然変異体ペプチドの静脈内注射により、最終回の追加投与を施した。マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞系を、融合パートナーとして使用した。融合の１週間前に、細胞を、それらが、対数期において、＞７０％のコンフルエンシーに達するまで、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％のＦＢＳ中で培養した。免疫マウスの脾臓細胞は、滅菌条件下で採取した。ハイブリドーマ細胞の作出、選択、およびクローニングは、製造元のプロトコールに従い、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用して実施した。
抗突然変異体ｐ５３ ｍＡｂを分泌するハイブリドーマクローンを、それぞれ、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２７３Ｈ、およびＲ２４８Ｑの突然変異を擁する組換え全長ｐ５３タンパク質でコーティングされた、９６ウェルプレートを伴うＥＬＩＳＡにより選択した。チオレドキシンペプチドを、陰性対照として使用した。個々のハイブリドーマウェルから回収された上清を、ＥＬＩＳＡプレート上で調べた。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を、ブロッキングおよび抗体の希釈のために使用した。０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を伴うＰＢＳを、洗浄のために使用した。洗浄の後、１０％ＦＣＳを伴うＰＢＳＴ中に、１：５０００の、ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ）へとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、ＩｇＧを検出した。プレートは、１倍濃度のＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｓｉｇｍａ）で現像した。吸光度は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により、６５０ｎｍで測定した。
各突然変異について、少なくとも３匹ずつの、独立のマウスからのデータを提示する。突然変異体もしくは野生型のｐ５３タンパク質、または突然変異体ｐ５３ペプチド断片を使用する初期ＥＬＩＳＡスクリーニングは、突然変異体ｐ５３を認識する抗体を産生するハイブリドーマの各々について、抗体は、それぞれの突然変異について特異的であり、野生型ｐ５３タンパク質と交差反応しないことを明らかにした（図５Ａ～５Ｃ）。抗体は、突然変異体ｐ５３全タンパク質に対して、ペプチド断片と比較して、より感受性であった。
特異性をさらに確認するのに、全てのペプチドおよび突然変異体タンパク質を使用する、さらなる解析はまた、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に対するモノクローナル抗体を産生する３つのハイブリドーマクローンが、高度に特異的であり（クローン７Ｂ９、１０Ｃ８、および４Ｈ５）、Ｒ２４８Ｑ突然変異体またはＲ２７３Ｈ突然変異体のタンパク質およびペプチドと交差反応しないことも示した（図６Ａ）。同様の結果は、Ｒ２４８Ｑに対するクローン（クローン４Ｈ２および３Ｇ１１）およびＲ２７３Ｈに対するクローン（クローン１３Ｅ４）についても得られた（図６Ｂおよび６Ｃ）。
個々のハイブリドーマクローンによりターゲティングされるエピトープを決定するために、３つのｐ５３突然変異体に対する抗体を使用して、ペプチドファージディスプレイ解析を実施した。
ｐＩＩＩコートタンパク質のＮＨ２末端において、ランダムな１２マーのペプチド（２．７×１０９の配列）をコードするＭ１３ファージライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０ｎＭの精製抗体でコーティングした。ウェルを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０、２％のＢＳＡ）と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％のＴｗｅｅｎ２０、２％のＢＳＡ）で洗浄し、洗浄緩衝液中、室温で、４×１０１０のファージと共にインキュベートした。結合したファージを、０．２Ｍのグリシン（ｐＨ２．２）で溶出させ、１Ｍのトリス（ｐＨ９．１）で中和した。製造元の指示書に従い、溶出させたファージを増幅した。
選択工程は、３つのサイクルにわたり繰り返した。最終ラウンドからのファージプラークを選択し、製造元により記載される通りに増幅し、シーケンシングした。選択されたファージ上に提示されたペプチドは、ＤＮＡシーケンシングからの結果についての解析から推定した。個々の抗体によりターゲティングされるエピトープは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多重配列アライメントツールを使用する、ペプチド配列のアライメントからの、コンセンサス配列の決定により得た。
Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に対するハイブリドーマでは、コンセンサス配列は、第１のヒスチジンが、野生型ｐ５３内のアルギニン残基を置きかえる突然変異である「ＨＣＰＨＨ」（図７Ａ）であった。Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に対する全てのハイブリドーマに由来する、ほぼ全てのクローンは、この配列を捕捉した（図８Ａ）。Ｒ２４８Ｑ抗体クローンのコンセンサス配列は、クローン３Ｇ１１については、「ＳＶ・・・ＨＹ」（２１５～２１６および２３３～２３４位；図８Ａ）であり、クローン４Ｈ２については、「ＲＰ」（２４９～２５０位；図７Ｂ）であった。抗Ｒ２７３Ｈクローン１３Ｅ４のコンセンサス配列は、「ＶＨ」（２７２～２７３位；図７Ｃ）であった。
エピトープの最重要のアミノ酸を決定するために、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３タンパク質の、Ｍｅｔ１６９～Ａｒｇ１８１（ＭＴＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ）、およびＲ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３タンパク質の、Ａｒｇ２６７～Ｇｌｙ ２７９（ＲＮＳＦＥＶＨＶＣＡＣＰ）に対応する、個々にアラニン置換された１３アミノ酸のペプチドの２つのセットは、化学合成され、Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．から得られた。ペプチドを、Ｎ末端のビオチンとコンジュゲートさせ、９６ウェルの、ストレプトアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、１０ｕｇ／ｍｌで、１時間にわたり、個々にインキュベートした。３ラウンドにわたる洗浄の後、プレートを、抗Ｒ１７５Ｈである、１０Ｃ８、４Ｈ５、および７Ｂ９、ならびに抗Ｒ２７３Ｈである１３Ｅ４と共に、それぞれ、１ｕｇ／ｍｌ、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、二次抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰと共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、３回にわたり洗浄してから、可溶性ＨＲＰ基質を、５分間にわたり適用し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により、６５０ｎｍにおける吸光度を決定した。
Ｒ１７５Ｈ抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８についてのアラニン走査の結果は、図９Ａ～９Ｃに示され、Ｒ２７３Ｈ抗体クローン１３Ｅ４についての結果は、図９Ｄに示される。ｐ５３ペプチド配列内の突然変異は、被験ｍＡｂの反応性を支援しなくとも、他の抗体の反応性を支援すれば、ｍＡｂエピトープにとって、極めて重要であると同定した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．２５ｍＬの、フロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の、単回腹腔内（ＩＰ）注射を施した。１４日後、マウスに、０．５ｍＬの容量中のハイブリドーマ細胞４×１０５個の、単回ＩＰ注射を行い、その後、マウスを、毎日、腹部の膨張により決定される、腹水の発症について検討した。ハイブリドーマ細胞注射の７～１０日後、マウスに麻酔をかけ、麻酔をかけたマウスから、１８～２２ゲージの注射針を伴う、腹部穿刺により、重力流を介して、腹水を、滅菌遠心管へと、無菌的に回収した。腹部へと、静かに指圧を加え、腹水の採取を容易とする必要に応じて、マウスの体位を変更した。マウスの各個別のケージについて、腹水をプールした。製造元の指示書に従い、マウスｍＡｂアイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ハイブリドーマ上清から、抗体クローンのアイソタイプを決定した。腹水を、ＰＢＳにより、１：１０の比で希釈し、ＩｇＧを、プロテインＧカラムクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。抗体は、０．２Ｍのトリス－グリシン、ｐＨ２．７を含有する、５ｍｌの溶出緩衝液により、カラムから溶出させた。溶出させた画分は、０．０５ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。精製された抗体の確認は、還元条件下の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより実施した。
実施例３
生化学法による、特異的ｐ５３ホットスポット突然変異体に対するｍＡｂの特異性についての評価
ｐ５３ホットスポット突然変異体特異的抗体の特異性を決定する、第１の試みは、免疫ブロットアッセイにおいて、それらの有効性を評価することにより行った。６つの一般的なホットスポットｐ５３突然変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４５Ｓ、Ｒ２４８ＱおよびＲ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、ならびにＲ２８２Ｗ）を安定的に発現するか、またはこれらを一過性にトランスフェクトされたｐ５３ヌルＨ１２９９細胞を、初期解析のために使用した。
５０μｇの細胞溶解物を、各ウェルの、４～１２％のビス－トリスＳＤＳポリアクリルアミドプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとロードした。使用したタンパク質マーカーは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｕｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、タンパク質バンドが、スタッキングゲルを越えるまで、６０ボルト（Ｖ）の定電圧で泳動させ、その後、色素の前線が、底部に達するまで、ゲルは、１００Ｖで、持続的に泳動させた。免疫ブロット法のために、ｉＢｌｏｔ（商標）Ｄｒｙｉｎｇ Ｂｌｏｔｔｉｎｇシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上、２０～２５Ｖで、１０分間にわたり、ニトロセルロース膜へのタンパク質の転写を実行した。膜を、各回、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））で、１０分間ずつ、３回にわたり洗浄し、非特異的結合は、ＰＢＳＴ緩衝液中に４％の脱脂粉乳を使用して、静かに攪拌しながら、１時間にわたりブロッキングした。その後、膜を、各回、ＰＢＳＴで、１０分間ずつ、３回にわたり洗浄した。洗浄ステップの後、過剰量のＰＢＳＴを除去してから、ハイブリドーマ上清を添加した。一次抗体を、静かな攪拌下、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。膜を、各回、ＰＢＳＴで、１０分間ずつ、３回にわたり洗浄して、結合しなかった一次抗体を除去した。１０％ＦＣＳを伴うＰＢＳＴ中に、１：５０００の、ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ）へとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧを、検出のために使用した。二次抗体を、静かな攪拌下、室温で、１時間にわたりインキュベートした。結合しなかった二次抗体は、上記で言及した方法で洗い落としてから、ＣｌａｒｉｔｙウェスタンブロットＥＣＬ基質（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して視覚化した。Ｏｄｅｓｓｅｙ Ｆｃ（Ｌｉｃｏｒ）を使用して、密度解析を実施した。
３つの突然変異体特異的抗体の全ては、汎ｐ５３抗体であるＤＯ１を使用して決定される通り、夥多に発現する、他の突然変異体ｐ５３または野生型ｐ５３を検出せずに、Ｈ１２９９細胞内で発現する、それらの対応する突然変異体ｐ５３タンパク質を検出することが可能であった（図１１）。
抗Ｒ２４８Ｑ抗体は、同じ残基において異なる突然変異を含む近縁のＲ２４８Ｗ突然変異体を検出することが不可能であったことから、抗体の極めて高度な特異性が強調された知見は、特に、重要であった。
ｐ５３突然変異体特異的抗体を使用して、免疫沈降解析もまた実施するのに続き、抗ｐ５３ウサギ抗体であるＣＭ１による検出を行ったところ、ここでもまた、抗体は、それぞれの突然変異体タンパク質だけを沈降させることにおいて、特異的であることが明らかにされた（図１２）。ＣＭ１抗体による逆免疫沈降に続き、突然変異体特異的抗体による免疫ブロット法もまた、極めて大きな特異性を伴う、同様の結果をもたらした（図１２）。
次に、本発明者らは、野生型タンパク質または多様なホットスポット突然変異体を発現する、多数のヒト腫瘍細胞系内で、内因性ｐ５３を認識する、これらのｍＡｂの能力を決定した（図１３）。全ての細胞系は、ＵＶ照射により誘導され、ＤＯ１抗体により検出される、多様な突然変異体ｐ５３、または野生型ｐ５３を、大量に発現したが、突然変異体特異的ｍＡｂによる直接的免疫ブロット法は、腫瘍細胞系内で、それぞれの突然変異体ｐ５３タンパク質だけを検出することが可能であった（図１４）ことから、抗体の特異性が確認された。
内因性タンパク質の免疫沈降は、Ｒ１７５Ｈ特異的抗体についても、同じ傾向を指し示した（図１５、左パネル）。Ｒ２４８Ｑ抗体およびＲ２７３Ｈ抗体のいずれもまた、汎ｐ５３ＣＭ１抗体による一次免疫沈降の後に、免疫ブロットの検出に使用したところ、それらのそれぞれの突然変異体タンパク質だけを、特異的に検出することが可能であった（図１５、中パネルおよび右パネル）。しかし、免疫沈降に直接使用するのに続き、ＣＭ１による免疫検出にかけたところ、これらの２つ抗体は、おそらく、被験条件下におけ、非特異的結合のために、他の一部のｐ５３突然変異体も検出した。それにもかかわらず、直接的免疫ブロット法および汎ｐ５３抗体による免疫沈降における高レベルの特異性は、これらの抗体の、それらのそれぞれの突然変異体ｐ５３抗原に対する特異性を強調する。
実施例４
免疫蛍光解析における、特異的ｐ５３ホットスポット突然変異体に対するｍＡｂの特異性
免疫蛍光染色により、突然変異体特異的抗体の特異性について調べるために、本発明者らは、再度、野生型ｐ５３もしくは多様なｐ５３突然変異体を過剰発現するＨ１２９９細胞、または内因性の突然変異体ｐ５３タンパク質を発現する腫瘍細胞系を用いた。
９６ウェルプレート上に固定されたトランスフェクト細胞を、２０分間にわたり、０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による透過処理にかけた。ＰＢＳですすいだ後、細胞を、ＰＢＳＴｒｉｔｏｎＸ（ＰＢＳＴＸ）中に５％のＢＳＡで、２０分間にわたりブロッキングするのに続き、ハイブリドーマ上清中、４℃で、一晩にわたるインキュベーションを行った。１％のＢＳＡを伴うＰＢＳＴＸ中に１：１０００のｇｏａｔ Ａｌｅｘａｆｌｏｒ ４８８ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＩｇＧを検出した。次いで、細胞を、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｉｎｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精査した。
全ての細胞は、ＤＯ１抗体またはＣＭ１抗体を伴う染色により決定される存在度で、多様なｐ５３形態を発現したが、過剰発現させた場合（図１６）、または腫瘍細胞系内の内因性状態（図１７Ａおよび１７Ｂ）において、それらのそれぞれの突然変異体タンパク質だけを検出する突然変異特異的抗体を用いると、顕著に異なる核染色パターンが観察された。
免疫ブロットおよび免疫沈降を介する解析により観察される通り、Ｒ２４８Ｑ突然変異体に対する抗体は、特異性が極めて大きく、近縁のＲ２４８Ｗ突然変異体タンパク質を検出することが可能ではなかった（図１７Ｂ）。
実施例５
免疫組織化学による、特異的ｐ５３ホットスポット突然変異体に対するｍＡｂを使用する、ヒト腫瘍試料についての解析
パラフィン包埋組織内の、ｐ５３突然変異体特異的抗体の有効性を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学（ＩＨＣ）解析により、多数のヒト腫瘍試料について解析した。まず、突然変異体特異的抗体を使用して、ＤＮＡシーケンシングにより、公知のｐ５３突然変異を伴うことが確認された、一連の腫瘍試料（図１８Ａ）について検討した。
ｐ５３ Ｒ２７３Ｈの遺伝子型を伴うＨＴ２９異種移植マウスモデルからのマウス腫瘍切片と、ｐ５３ Ｒ１７２Ｈ突然変異体細胞系から発生させた腫瘍切片は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＭＰＬ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙにより、パラフィンブロックへと加工された。次いで、５μｍの蝋切片を、ガラススライド（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へと包埋し、５０℃のホットプレート上で、１時間にわたり乾燥させた。切片を、キシレン（ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ）中で、脱パラフィン化し、百分率を低下させるエタノール（ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ）を介して、水へと戻した。組織切片を、抗原露出のための標的賦活化溶液、ｐＨ９（Ｄａｋｏ）と共に加熱し、次いで、ＰＢＳ中ですすいだ。内因性ペルオキシダーゼを、ＰＢＳ中に２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ）で、３０分間にわたりブロッキングし、ＰＢＳですすいだ。切片を、ＰＢＳ中に１０％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（Ｄａｋｏ）で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、ビオチニル化一次抗体クローンと共に、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。切片を、水で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中ですすいでから、ストレプトアビジン－ＨＲＰ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）による検出を行った。次いで、３，３－ジアミノベンジジンを、基質として使用して、抗原－抗体間相互作用を可視化させ、切片を、ヘマトキシリンにより、薄色で対比染色してから、脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ６０合成樹脂（Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にマウントした。ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｚｅｉｓｓ）光学顕微鏡を使用して、スライドを、明視野下でイメージングし、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ ４．８ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）により解析した。
免疫蛍光解析の場合と同様に、３つの突然変異体特異的抗体は、ｐ５３内にそれぞれの突然変異を伴う試料を染色したが、野生型ｐ５３または他の突然変異を伴う試料は染色しなかった（図１８Ｂ）ことから、ＩＨＣ状況下における特異性が裏付けられた。
本発明者らは、結腸、乳腺（トリプルネガティブ）、肺、前立腺、および腎臓の腫瘍に由来する、いくつかの腫瘍マイクロアレイについて、これらの抗体を伴う染色により、さらに評価した。ＩＨＣ染色に適する汎ｐ５３抗体（ＤＯ７）およびＲ１７５Ｈ特異的抗体による染色からの代表的結果が示される（図１９）。３群：ＤＯ７およびＲ１７５Ｈ ｍＡｂの両方により染色された群；ＤＯ７だけについて陽性の群；ならびに両方の抗体について陰性である最後の群の試料が現出した（図２１）。ＤＯ７染色のレベルは、トリプルネガティブ乳がん群、肺がん群、および結腸がん群について、最高であったことから、これらのがんは、ｐ５３について、突然変異率が高く（Ｏｌｉｖｉｅｒら、２００４、ＩＡＲＣ Ｓｃｉ Ｐｕｂｌ、１５７：２４７～２７０）、したがって、抗ｐ５３抗体による染色について陽性であるというかつてのデータが確認される。Ｒ１７５Ｈ－ｍＡｂによる染色は、第１の群における、ＤＯ７による染色を反映したことから、いずれの抗体も、この群内の同じ細胞を認識していたことが示唆された。数例の試料をシーケンシングして、ｐ５３突然変異の状態を決定し、いずれの抗体によっても染色される全ての試料が、Ｒ１７５Ｈ突然変異を保有することを見出した。対照的に、ＤＯ７だけにより染色される試料は、ｐ５３の他の残基における突然変異を有するが、Ｒ１７５における突然変異は有さず、いずれの抗体についても陰性である試料は、ｐ５３内の突然変異を有さなかった。
ヒトトリプルネガティブ乳がん試料である、Ｂ４１、Ｂ８９、Ｂ９８、Ｂ２７、およびＢ５２を、免疫組織化学による解析のために、抗ｐ５３抗体である、Ｄ０７、１１Ｄ１、または抗Ｒ１７５Ｈ抗体で染色した。Ｒ１７５Ｈ突然変異を含む腫瘍試料である、Ｂ４１、Ｂ８９、およびＢ９８（ＣＡＧ：下線が付される）は、３つの抗体全てによる染色について、陽性であった（図２０Ａ）。Ｒ１７５Ｈ突然変異を含まない腫瘍試料であるＢ２７（ＣＧＣ：下線が付される）は、抗ｐ５３抗体である、ＤＯ７および１１Ｄ１だけにより染色され（かつ、抗Ｒ１７５Ｈ抗体により染色されず）、試料Ｂ５２は、抗ｐ５３抗体のうちのいずれによっても染色されなかった（図２０Ｂ）。
これらのデータは、まとめて、パラフィン包埋臨床試料中の、これらの突然変異体特異的抗体の特異性を指し示す。
実施例６
ヒトｐ５３突然変異体特異的抗体の有効性についての、同等なマウス突然変異体との比較
最後に、本発明者らは、抗体が、対応するマウス突然変異を検出することが可能であるのかどうかについて調べた。本実施例で研究される３つの突然変異に対応するヒト配列は、マウスｐ５３において、高度に相同であり（図２２）、Ｒ１７５残基の近傍の配列は、同等なマウスＲ１７２残基と同様である（Ｏｌｉｖｅら、２００４、Ｃｅｌｌ、１１９、８４７～８６０）。よって、本発明者らは、ヒトにおけるＲ１７５Ｈと同等の突然変異を含有する（Ｌａｎｇら、２００４、Ｃｅｌｌ、１１９、８６１～８７２）、Ｒ１７２Ｈマウスに由来する、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、またはヒトＲ４２４９Ｓと同等である、非類縁の突然変異であるＲ２４６Ｓを伴うＭＥＦ（Ｌｅｅら、２０１２、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２２、７５１～７６４）を用いた。
直接的な免疫ブロット法は、抗Ｒ１７５Ｈ抗体が、Ｒ１７２Ｈ ＭＥＦからの突然変異体ｐ５３だけを検出することが可能であり、Ｒ２４６Ｓ ＭＥＦまたは野生型ＭＥＦは、汎ｐ５３抗体であるＣＭ５により決定される通り、著しい量のｐ５３を発現するが、これらからのｐ５３は検出しえないことを指し示した（図２３Ａ）。Ｒ１７５Ｈ特異的抗体による免疫沈降に続き、免疫ブロット法もまた、抗体は、実際、特異的であり、マウスＲ１７２Ｈ突然変異体タンパク質を検出しうることを裏付けた（図２３Ｂ）。本発明者らはまた、Ｒ１７５Ｈ特異的抗体の能力を、免疫蛍光解析（図２３Ｃ）およびＩＨＣ解析（図２３Ｄ）によっても調べたが、これらにより、その特異性が確認されたことから、異なる種における、これらの抗体の有用性が強調された。
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の５μｍ切片に対して、ＩＨＣ解析のための免疫染色を実施した。Ｄａｋｏ製のトリス／ＥＤＴＡ標的賦活化溶液、ｐＨ９を使用して、抗原賦活化を実施した。ブロッキングは、ＤＡＫＯ製の１０％ヤギ血清により実施した。二次抗体は、Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）＋／ＨＲＰであった。ＤＡＫＯ ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋により現像した。画像は、４０倍の対物レンズを使用する、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ正立顕微鏡により捕捉した。
実施例７
抗突然変異体ｐ５３モノクローナル抗体
７．１ Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８
実施例１（図１Ａを参照されたい）で記載された通りに、ＴｒｘＡの活性部位配列に挿入した、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３突然変異の３つのコピーを含む免疫原で、マウスを免疫化することにより、抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を惹起した。
抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマクローンを得た。軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列のアミノ酸配列を決定し、これらは、図２４および２５に示される。抗体の、軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列は、図２７に示される。
ＣＤＲは、ＶＢＡＳＥ２（上記で、参照により本明細書に組み込まれた、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）３３（データベース特集）：Ｄ６７１～６７４）を使用して予測した。
７．２ Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３抗体クローン ３Ｇ１１および４Ｈ２
実施例１（図１Ｂを参照されたい）で記載された通りに、ＴｒｘＡの活性部位配列に挿入した、Ｒ２４８Ｑ ｐ５３突然変異の３つのコピーを含む免疫原で、マウスを免疫化することにより、抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を惹起した。
抗Ｒ２４８Ｑ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマクローンを得た。軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列のアミノ酸配列を決定し、これらは、図２８および２９に示される。抗体の、軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列は、図３１に示される。
ＣＤＲは、上記の通り、ＶＢＡＳＥ２を使用して予測した。
７．３ Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４
実施例１（図１Ｃを参照されたい）で記載された通りに、ＴｒｘＡの活性部位配列に挿入した、Ｒ２７３Ｈ ｐ５３突然変異の３つのコピーを含む免疫原で、マウスを免疫化することにより、抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を惹起した。
抗Ｒ２７３Ｈ ｐ５３マウスモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマクローンを得た。軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列のアミノ酸配列を決定し、これらは、図３２および３３に示される。抗体クローンである１３Ｅ４の、軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列は、図３４に示される。
ＣＤＲは、上記の通り、ＶＢＡＳＥ２を使用して予測した。
実施例８
抗突然変異体ｐ５３モノクローナル抗体の特徴付け
８．１ Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８
ハイブリドーマクローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の細胞培養物上清を使用して、Ｒ１７２Ｈマウス胸腺リンパ腫細胞系細胞である、Ｔ４７Ｄ細胞、ＷｉＤｒ細胞、およびＤＫＯ細胞から得られた細胞抽出物に対して、ウェスタンブロット解析を実施した。結果は、図３５に示される。各クローンに由来する抗体は、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
免疫蛍光解析もまた、ハイブリドーマクローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の細胞培養物上清を使用し、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３を発現させる構築物をトランスフェクトしたＲ１７２Ｈマウス胸腺リンパ腫細胞系細胞である、ＴＫＯ細胞、Ｃ６細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、およびＨ１２９９細胞を使用して実施した。結果は、図３６Ａ～３６Ｃに示される。各クローンに由来する抗体は、マウスＲ１７２Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
抗体である、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８により認識されたエピトープは、ヒトＲ１７５Ｈ ｐ５３との関連で、図１０に示される。
ハイブリドーマクローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の細胞培養物上清を使用する、ｐ５３ノックアウトマウス、または照射された、Ｒ１７２Ｈ ｐ５３陽性マウスから得られた、マウス腸組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析により、抗体クローンを、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３を認識するそれらの能力について、さらに調べた。結果は、図３７に示される。抗体は、ＩＨＣにより、マウス腸組織切片内の、Ｒ１７２Ｈ突然変異体ｐ５３を検出することが可能であった。
抗体クローンである４Ｈ５を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｒ１７５Ｈ陽性がんを視覚化し、モニタリングする能力について、さらに解析した。Ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／Ｒ１７２Ｈマウスに由来するマウス腫瘍細胞に、ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトし、腫瘍モデルを確立するのに使用した。マウスに、１００μｇの、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０で標識化された、抗Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである４Ｈ５を、ＩＶ注射し、注射の、６、２４、７２時間後、および７日後に、ＩＶＩＳ解析によりイメージングした。実験の結果は、図３８に示される。抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍を視覚化し、モニタリングするのに適することが裏付けられた。
８．２ Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３抗体クローンである、３Ｇ１１および４Ｈ２
ハイブリドーマクローンである、３Ｇ１１および４Ｈ２の細胞培養物上清を使用して、ＴＫＯ細胞およびＨＣＣ７０細胞（Ｒ２４８Ｑ突然変異を有する）から得られた細胞抽出物に対して、ウェスタンブロット解析を実施した。結果は、図３９に示される。抗体は、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
免疫蛍光解析もまた、ハイブリドーマクローンである、３Ｇ１１および４Ｈ２の細胞培養物上清を使用し、ＴＫＯ細胞、ＨＣＣ７０細胞、およびＯＶＣＡＲ３細胞（Ｒ２４８Ｑ突然変異を有する）を使用して実施した。結果は、図４０Ａおよび４０Ｂに示される。各クローンに由来する抗体は、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
抗体クローン３Ｇ１１および４Ｈ２により認識されたエピトープを、ペプチドファージディスプレイ解析により解析した（図８Ｂおよび７Ｂ）。抗体により認識されたエピトープは、ヒトＲ２４８Ｑ ｐ５３との関連で、図１０に示される。
８．３ Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである、１３Ｅ４
ハイブリドーマクローンである１３Ｅ４の細胞培養物上清を使用して、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＢ４６８細胞（Ｒ２７３Ｈ突然変異を有する）から得られた細胞抽出物に対して、ウェスタンブロット解析を実施した。結果は、図４１に示される。クローン１３Ｅ４に由来する抗体は、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
免疫蛍光解析もまた、ハイブリドーマクローンである１３Ｅ４の細胞培養物上清を使用し、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３を発現する、Ｔ４７Ｄ細胞およびＷｉＤｒ細胞を使用して実施した。結果は、図４２に示される。クローン１３Ｅ４に由来する抗体は、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的であった。
１３Ｅ４抗体により認識されたエピトープは、ヒトＲ２７３Ｈ ｐ５３との関連で、図１０に示される。
抗体クローンである１３Ｅ４を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｒ２７３Ｈ陽性がんを視覚化し、モニタリングする能力について、さらに解析した。ｐ５３－Ｒ２７３Ｈ突然変異体の細胞である、ＨＴ２９腫瘍細胞系に、ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトし、腫瘍モデルを確立するのに使用した。マウスに、１００μｇの、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ７５０で標識化された、抗Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３抗体クローンである１３Ｅ４を、ＩＶ注射し、注射の７２時間後に、ＩＶＩＳ解析によりイメージングした。実験の結果は、図４３に示される。抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍を視覚化し、モニタリングするのに適することが裏付けられた。
実施例９
マウスＦｖ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ抗突然変異体ｐ５３抗体
抗突然変異体ｐ５３抗体の、マウスＦｖ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ形を調製した。
重鎖および軽鎖の可変領域を、マウスモノクローナル抗体の親クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、１０Ｃ８、３Ｇ１１、４Ｈ２、および１３Ｅ４から、各々がヒトＩｇＧ１定常領域を含有するｐＴＴ５ベクターへとクローニングした。
マウス－ヒトキメラの重鎖および軽鎖のプラスミドを、プラスミド１μｇ当たり、２μＬの２９３－ＦｅｃｔＩｎトランスフェクション試薬を使用して、細胞１００万個当たりの総プラスミド１μｇで、ＨＥＫ２９３－６ｅ細胞へと共トランスフェクトした。トランスフェクションの４～６日後、分泌されたキメラ抗体を含有する培養物上清を採取し、プロテインＧアガロースビーズを使用して、精製した。
キメラ抗体は、１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）により中和され、ＰＢＳへと透析された、０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を使用して、ビーズから溶出させた。
キメラ抗体は、ＥＬＩＳＡ（被験濃度：１ｎｇ／μＬ）により、それぞれの突然変異体ｐ５３を認識することが可能であると決定された。
照射された、Ｒ１７２Ｈ ｐ５３陽性マウスから得られた、マウス腸組織切片のＩＨＣ解析により、抗Ｒ１７５Ｈ ｐ５３抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８の、マウスＦｖ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ形を、Ｒ１７５Ｈ ｐ５３を認識する能力についてもまた調べた。結果は、図４４に示される。抗体のキメラ形は、ＩＨＣにより、マウス腸組織切片内の、Ｒ１７２Ｈ突然変異体ｐ５３を検出することが可能であった。
実施例１０
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗ｐ５３突然変異体抗体が、がんを処置する能力についての解析
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗突然変異体ｐ５３モノクローナル抗体が、がんを処置する能力について調べた。
略述すると、マウスに、ルシフェラーゼ遺伝子を保有するＳＫＢＲ３細胞（ヒト乳がん細胞）５×１０６個を注射した。ＳＫＢＲ３細胞は、ｐ５３内に、Ｒ１７５Ｈ突然変異を保有する（例えば、図１３を参照されたい）。ルシフェラーゼ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ルシフェラーゼ活性の検出による、腫瘍の増殖のモニタリングを可能とした。４日後、マウスに、ＳＫＢＲ－３細胞を注射し、マウスを、１００μｌの抗Ｒ１７５Ｈ抗体または１００μｌのＩｇＧ抗体対照で処置した。注射は、４日ごとに（図４５における矢印により指し示される）繰り返した。腫瘍の増殖は、ルシフェラーゼの発光を測定することにより、実験を通してモニタリングした。結果は、図４５に示されるが、これは、ルシフェラーゼ活性の、対照処置群と比較したレベルの低減により証拠立てられる通り、抗Ｒ１７５Ｈ抗体で処置されたマウスにおける抗がん効果を裏付ける。
実施例１１
使用される免疫原が、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに対する免疫応答を発生させる能力についての解析
本発明者らはまた、ｐ５３突然変異体ポリペプチドに対する免疫応答を刺激するために、ワクチンとして使用される、実施例１で記載された免疫原の能力についても調べた。
マウスの群を、免疫原で免疫化し、ＥＬＩＳＡにより、ポリクローナル抗体応答を解析して、免疫原が、抗体応答を誘発するワクチンとして使用されうるのかどうかを決定した。
結果は、図４６Ａ～４６Ｆに示される。異なる突然変異体ｐ５３の免疫原による免疫化は、それぞれのｐ５３突然変異体に対応するペプチドに対して、高度に特異的であり（図４６Ａ、４６Ｃ、および４６Ｅ）、野生型ヒトｐ５３との、最小の相互作用を提示する（図４６Ｂ、４６Ｄ、および４６Ｆ）抗体の産生を誘導することが示される。これらの結果は、突然変異体ｐ５３免疫原が、抗体応答を誘発することが可能であり、この免疫が、それぞれのｐ５３突然変異体に特異的であることを裏付ける。
本発明者らは、次に、免疫原による免疫化に応答して発生した抗体が、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを認識することが可能であるのかどうかについて調べた。血清を、実施例１で記載された、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、またはＲ２７３Ｈの免疫原を注射されたマウスから得、免疫蛍光解析により、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを認識する能力について解析した。結果は、図４７Ａ～４７Ｃに示されるが、これは、免疫原による免疫化に応答して、マウスにおいて発生した抗体が、対応する突然変異体ｐ５３ポリペプチドを認識することが可能であったことを裏付ける。
実施例１２
結論
本発明者らは、ＤＢＤ領域内で一般に生じる、３つのｐ５３ホットスポット突然変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、およびＲ２７３Ｈ）（Ｖｉｋｈａｎｓｋａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００７）、３５：２０９３～２１０４）に対するｐ５３突然変異体特異的抗体を作出することに成功した。抗体が特徴付けられ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がんを処置するそれらの有用性が裏付けられるのと同様に、様々な生化学アッセイおよび組織学アッセイにおいても、それらの有用性が裏付けられている。
本発明者らは、初めて、ｐ５３の単一点突然変異体に特異的に結合することが可能であるが、野生型ｐ５３とは交差反応しない抗体であって、ＴｒｘＡを融合パートナーとして使用して、タンパク質本体から溶液への突出により提示される突然変異を含有する領域の複数のコピーを用意することにより、抗原の発現を増強する免疫原を使用して惹起される抗体を作出することが可能であった。この手法は、いくつかのｐ５３突然変異体に対する、特異性および選択性が大きなｍＡｂクローンの作出を一貫してもたらした。
本実施例は、ｐ５３内で見出される、最も一般的なホットスポット突然変異のうちの３つ、すなわち、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、およびＲ２７３Ｈに対する抗体の作出を裏付ける。これらの突然変異体に対して作出されたｍＡｂは、免疫ブロット法、免疫沈降、免疫蛍光、および免疫組織化学にわたる様々な技法において、意図された抗原と、他の突然変異または野生型ｐ５３タンパク質とを区別する、それらの能力において特異的であった。ｉｎ ｖｉｖｏの、ヒト異種移植がんマウスモデルでは、本発明者らはさらに、対応するｐ５３突然変異を含む腫瘍細胞の増殖を阻害する能力も裏付けた。
さらに、抗体は、Ｒ１７５Ｈ突然変異について裏付けられる通り、マウスなど、他の種において、対応する突然変異を検出することが可能であり、したがって、種を越えた配列の保存（例えば、図２２を参照されたい）を踏まえれば、他のマウス突然変異体へも適用可能なはずであり、これにより、基礎的な調査研究のための貴重なツールであることを実証する。
突然変異体特異的抗体は、潜在的には単一細胞レベルにすらおいても、またがん細胞のクローン的進化において、同じ細胞内の野生型および突然変異体両方のｐ５３タンパク質の個々の役割および組み合わされた役割を腑分けするのに有用なツールである。
ヒト腫瘍試料のＩＨＣ解析のための、突然変異体特異的ｍＡｂの有用性から、これらのｍＡｂが、ｐ５３状態を決定するときの病理学的解析において、極めて有用なツールであることが強調され、このツールは、実現が容易であり、ＤＮＡシーケンシング技術と比較して、費用効果が著しく高い。
本実施例で用いられたＴｒｘＡ提示系は、臨床的に有用でありうる、ｐ５３内の他の突然変異に対するｍＡｂを作出するためにも有用であり、また、腫瘍抑制因子およびがん遺伝子において見出される、他の突然変異に対するｍＡｂを作出するためにも有用であろう。単一のアミノ酸だけ異なるタンパク質を区別することが可能なモノクローナル抗体であれば、診断剤および治療剤として、臨床的に有用でありうる。
さらに、本発明者らが、ワクチン接種戦略のための免疫原の有用性を裏付けたことから、ｐ５３の突然変異体を認識することが可能な抗体応答を誘導する能力が裏付けられる。
治療の文脈では、このような突然変異体特異的抗体は、突然変異を保有しない、患者の正常細胞内では、いかなる副作用も及ぼさないので、極めて安全である可能性が高い。このような抗体であれば、疾患において、過剰発現するか、または調節異常となるタンパク質に対する、現在利用可能な、一般的な抗体に優ることが予測される。
実施例１３
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、突然変異体特異的抗ｐ５３抗体の、腫瘍増殖に対する効果
本発明者らは、次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｐ５３突然変異体特異的モノクローナル抗体の投与の、がん細胞の増殖に対する効果について調べた。
略述すると、ＳＣＩＤマウスの脇腹に、ルシフェラーゼ標識化ＳＫＢＲ細胞５×１０６個（ｐ５３内に、Ｒ１７５Ｈ突然変異を保有する（例えば、図１３を参照されたい））を、皮下注射した。４日目から、マウスに、４日ごとに、１００μｌの、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的なモノクローナル抗体（ａ１７５）、またはアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ）を、静脈内注射した。ルシフェラーゼ活性を測定することにより、腫瘍の増殖をモニタリングした。
実験の結果は、図４８に示される。Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的なモノクローナル抗体で処置されたマウスでは、強力な抗がん効果が観察された。
実施例１４
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３突然変異体抗体の調製
本発明者らは、抗Ｒ１７５Ｈ抗体クローンである、４Ｈ５、７Ｂ９、および１０Ｃ８、抗Ｒ２７３Ｈ抗体クローンである１３Ｅ４、ならびに抗Ｒ２４８Ｑ抗体クローンである、３Ｇ１１および４Ｈ２の、マウス－ヒトキメラ形を調製した。
マウスモノクローナル親抗体の、可変重鎖および可変軽鎖をコードするＤＮＡを、マウスモノクローナル親抗体から、各々がヒト定常領域を含有する、個別のｐＴＴ５ベクターへとクローニングした。マウス－ヒトキメラの重鎖および軽鎖のプラスミドを、プラスミド１マイクログラム当たり、２μｌの２９３－ＦｅｃｔＩｎトランスフェクション試薬を使用して、細胞１×１０６個当たりの総プラスミド１μｇで、ＨＥＫ２９３－６ｅ細胞へと共トランスフェクトした。
トランスフェクションの４～６日後、分泌された、マウス－ヒトキメラ抗体を含有する細胞培養物上清を採取し、プロテインＧアガロースビーズを使用して、抗体を精製した。マウス－ヒトキメラ抗体は、１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）により中和され、ＰＢＳへと透析された、０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を使用して、ビーズから溶出させた。マウス－ヒトキメラ抗体は、マウスＦｖおよびヒトＦｃを含む。
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈ抗体のクローンのＶＬ配列は、図４９および５１に示され、ＶＨ配列は、図５０および５２に示される。
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３突然変異体Ｒ２７３Ｈ抗体のクローンである１３Ｅ４のＶＬ配列は、図５３および５５に示され、ＶＨ配列は、図５４および５６に示される。
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３突然変異体Ｒ２４８Ｑ抗体のクローンのＶＬ配列は、図５７および５９に示され、ＶＨ配列は、図５８および６０に示される。
実施例１５
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３突然変異体抗体の特徴付け
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体
マウスヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体を、ＥＬＩＳＡにより、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３への結合について解析した。
結果は、図６１に示される。キメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体（ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、ＭＨ １０Ｃ８）抗体は、０．１～１ｎｇ／μｌの間の濃度で、陽性シグナルをもたらし、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈ全長タンパク質だけに、特異的に結合し、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈ全長タンパク質、ヒトｐ５３野生型全長タンパク質、またはマウスｐ５３野生型全長タンパク質には結合しなかった。市販の抗ｐ５３抗体（１Ｃ１２）を、陽性対照抗体として含めた。
結合はまた、ウェスタンブロットによっても解析され、結果は、図６２に示される。ウェスタンブロットを介する、ヒト細胞系内の、変成させた、内因性ｐ５３の検出（抗体を、１ｎｇ／μｌの濃度で使用した）は、キメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体（ＭＨ ４Ｈ５、ＭＨ ７Ｂ９、ＭＨ １０Ｃ８）の特異性を確認した。抗体は、ｐ５３内に、Ｒ１７５Ｈ突然変異を擁するＳＫＢＲ３細胞系に由来するｐ５３だけを検出し、ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞系に由来するｐ５３も、野生型ｐ５３細胞系であるＭＣＦ７およびＡ５４９に由来するｐ５３も、Ｒ２７３Ｈ細胞系であるＡ４３１およびＳＷ４８０に由来するｐ５３も検出しなかった。
抗体を、４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、パラフィン中に包埋された、異なるがん細胞系への結合についての免疫組織化学解析により、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的に結合するそれらの能力についてさらに解析した。マウスヒトキメラ抗Ｒ１７５Ｈ抗体は、ＳＫＢＲ３細胞だけを染色することが示された。ＭＨ ７Ｂ９を使用する解析による代表的画像は、図６３に示される。
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ抗体
マウスヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ２７３Ｈ抗体である、１３Ｅ４を、ＥＬＩＳＡにより、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３への結合について解析した。
結果は、図６４に示される。キメラ抗ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ抗体であるＭＨ １３Ｅ４は、ヒトｐ５３ Ｒ２７３Ｈ全長タンパク質に、チオレドキシン、ヒトｐ５３ Ｒ１７５Ｈ全長タンパク質、およびヒトｐ５３野生型全長タンパク質に結合するより、はるかに強く結合した。
結合はまた、ウェスタンブロットによっても解析され、結果は、図６５に示される。ウェスタンブロットを介する、ヒト細胞系内の、変成させた、内因性ｐ５３の検出（抗体を、１ｎｇ／μｌの濃度で使用した）は、ｐ５３内に、Ｒ２７３Ｈ突然変異を擁するＡ４３１細胞系およびＳＷ４８０細胞系に由来するｐ５３だけを検出し、ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞系に由来するｐ５３も、野生型ｐ５３細胞系であるＭＣＦ７およびＡ５４９に由来するｐ５３も、Ｒ１７５Ｈ細胞系であるＳＫＢＲ３に由来するｐ５３も検出しない、ＭＨ １３Ｅ４の特異性を確認した。
抗体を、４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、パラフィン中に包埋された、異なるがん細胞系への結合についての免疫組織化学解析により、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３に特異的に結合する能力についてさらに解析した。ＭＨ １３Ｅ４は、Ｒ２７３Ｈ突然変異を擁する細胞（すなわち、Ａ４３１細胞）だけを染色することが見出された（図６６を参照されたい）。
マウス－ヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ２４８Ｑ抗体
マウスヒトキメラ抗ｐ５３ Ｒ２４８Ｑ抗体を、ＥＬＩＳＡにより、Ｒ２４８Ｑ突然変異体ｐ５３への結合について解析した。抗体を、実験において、１ｎｇ／μｌの最終濃度で使用した。
結果は、図６７に示される。キメラ抗ｐ５３ Ｒ２４８Ｑ（ＭＨ ３Ｇ１１およびＭＨ ４Ｈ２）抗体は、全長Ｒ２４８Ｑ ｐ５３に結合するが、全長Ｒ１７５Ｈ ｐ５３もしくは全長Ｒ２７３Ｈ ｐ５３、または全長野生型ヒトｐ５３もしくは全長野生型マウスｐ５３には結合しないことが見出された。市販の抗ｐ５３抗体（１Ｃ１２）を、陽性対照抗体として含めた。
実施例１６
抗ｐ５３突然変異体抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングのための診断用抗体としての評価
本発明者らは、次に、抗ｐ５３突然変異体抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングに有用であるのかどうかについて調べた。
略述すると、１００ｕｇの蛍光標識Ｒ２７３Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ １３Ｅ４（または蛍光標識化ＩｇＧ対照）を、ＨＴ２９腫瘍（ｐ５３内にＲ２７３Ｈ突然変異を擁する）を保有するマウスへと、静脈内注射した。マウスを、抗体注射後７２時間において、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して、ｍＡｂのトラフィッキングについてイメージングした。
結果は、図６８に示される。ＭＨ １３Ｅ４は、ヌードマウスにおいて、Ｒ２７３Ｈ突然変異体ｐ５３陽性ＨＴ２９異種移植腫瘍を特異的に検出した。
別個の実験では、１００ｕｇの蛍光標識Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ ４Ｈ５またはＭＨ ７Ｂ９を、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３陽性クローン３２腫瘍を保有するマウスへと、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、抗体注射後６時間および２４時間、ならびに２、３、および７日目に、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して、ｍＡｂのトラフィッキングについてイメージングした。クローン３２細胞は、ルシフェラーゼを発現するので、腫瘍細胞の位置を、ルシフェラーゼ活性の検出により解析することができた。
結果は、図６９に示される。ＭＨ ４Ｈ５抗体およびＭＨ ７Ｂ９抗体は、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３を検出し、最長で、７日間にわたり、腫瘍内に保持された。腫瘍細胞に対する抗体の特異性は、抗体と同じ位置における、ルシフェラーゼの検出により裏付けられる。
さらなる実験では、抗ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈ抗体が、自然発生のＲ１７５Ｈ ｐ５３腫瘍を検出しうるのかどうかについて調べた。１００ｕｇの蛍光標識Ｒ１７５Ｈ特異的ｍＡｂであるＭＨ ４Ｈ５を、マウスｐ５３内の、マウスＲ１７２Ｈ突然変異を有するマウスへと、ｉ．ｖ．注射した。突然変異体ｐ５３Ｒ１７２Ｈマウスは、マウスｐ５３内に、Ｒ１７２Ｈ突然変異を擁する腫瘍の自然発生に対して、高度に感受性である。マウスを、抗体注射後２および３日目に、ＩＶＩＳ Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して、ｍＡｂのトラフィッキングについてイメージングした。
結果は、図７０に示される。ＭＨ ４Ｈ５は、自然発生の突然変異体マウスｐ５３ Ｒ１７２Ｈ腫瘍を検出することが可能であった。
実施例１７
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗ｐ５３突然変異体抗体が、がんを処置する治療有用性の評価
本発明者らは、次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗ｐ５３突然変異体抗体が、がんの処置に有用であるのかどうかについて調べた。
抗ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈ抗体
第１の実験では、モノクローナル抗体である、１３Ｅ４の投与の治療効果を、ＨＴ２９－ルシフェラーゼ異種移植腫瘍モデルにおいて解析した。略述すると、０日目、ヌードＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、ＨＴ２９－ｌｕｃ細胞５×１０６個を、皮下接種するのに続き、３、７、１１、１４、１８、および２１日目に、１５ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧまたは１３Ｅ４ ｍＡｂを、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、２８日目に解析した。腫瘍の増殖は、平均光子強度を測定することにより決定した。
処置スケジュールの概略表示は、図７１Ａに示される。実験の結果は、図７１Ｂに示される。１３Ｅ４ ｍＡｂで処置されたマウスは、ＩｇＧ対照抗体で処置されたマウスと比較して、８１．６２％の腫瘍サイズの阻害を示した。
第２の実験でも、モノクローナル抗体である、１３Ｅ４の投与の治療効果を、ＨＴ２９－ルシフェラーゼ異種移植腫瘍モデルにおいて解析した。略述すると、０日目、ヌードＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）の各脇腹に、ＨＴ２９－ｌｕｃ細胞５×１０６個を、皮下接種するのに続き、４、７、１１、１４、１８、２１、２５、２８、３２、および３５日目に、１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧまたは１３Ｅ４ ｍＡｂを、ｉ．ｖ．注射した。マウスを、７、１４、２１、２８、および３５日目に解析した。腫瘍体積は、接種後、毎週、ルシフェラーゼを発現するＨＴ２９腫瘍細胞の発光イメージングにより測定した。実験の終了時において、腫瘍をマウスから切り出し、腫瘍量を記録した。
処置スケジュールの概略表示は、図７２Ａに示され、実験の結果は、図７２Ｂ、７２Ｃ、および７２Ｄに示される。１３Ｅ４ ｍＡｂで処置されたマウスは、ＩｇＧ対照抗体で処置されたマウスと比較して、８７．３％の腫瘍サイズの阻害を示し、腫瘍量は、対照ＩｇＧで処置されたマウスから得られた腫瘍の重量の、約２．５分の１であった。図７２Ｄは、時間経過にわたる、１３Ｅ４による腫瘍増殖の阻害を示す。
さらなる実験では、抗ｐ５３突然変異体Ｒ１７５Ｈ抗体である４Ｈ５を、自然発生のマウスｐ５３突然変異体Ｒ１７２Ｈ陽性がんの増殖を阻害する、その能力について解析した。略述すると、マウス腫瘍細胞系である、クローン３２を、ｐ５３Ｒ１７２Ｈ突然変異体マウスから作出した。０日目に、クローン３２細胞３×１０６個を、同系Ｂ６マウスへと注射し、３、６、９、１２、１５、１８、２１、および２４日目に、１００ｕｇの４Ｈ５、７Ｂ９（Ｒ１７５Ｈに特異的なｍＡｂ）、１３Ｅ４（Ｒ２７３Ｈに特異的である）、および１１Ｄ１０（ヒトｐ５３およびマウスｐ５３のいずれにも反応性である）を、マウスへと、ｉ．ｖ．注射した。解析および腫瘍の測定のために、２５日目に、マウスを屠殺した。
処置スケジュールの概略表示は、図７３Ａに示され、実験の結果は、図７３Ｂに示される。４Ｈ５（Ｒ１７５Ｈ ｍＡｂ）で処置されたマウスにおける腫瘍重量の平均は、対照ＩｇＧ処置群における腫瘍の重量より７５％小さかった。７Ｂ９（Ｒ１７５Ｈ ｍＡｂ）、１３Ｅ４（Ｒ２７３Ｈ ｍＡｂ）、１１Ｄ１０（ｐ５３ ｍＡｂ）は、同系マウス腫瘍の重量に対して、著しい効果を示さなかった。
実施例１８
ｐ５３突然変異体抗体を惹起するのに使用された免疫原の、ワクチン候補物質としての評価
本発明者らは、次に、本発明のｐ５３突然変異体特異的抗体を惹起するのに使用された免疫原が、ｐ５３突然変異体がんの発症に対して、対象にワクチン接種することが可能であるのかどうかについて調べた。
０、２１、４２、６３、および８４日目に、野生型のＢＡＬＢ／ＣマウスまたはＢ６マウスおよび突然変異体ｐ５３Ｒ１７２Ｈマウスに、ＴｒｘＲ１７５Ｈタンパク質（実施例１を参照されたい）を注射した。各注射の７日後に、血清を回収し、ＥＬＩＳＡ、細胞染色、およびウェスタンブロットにより解析した。ＥＬＩＳＡ解析のために使用された抗原は、チオレドキシンタンパク質（Ｔｒｘ）、Ｔｒｘ－Ｒ１７５Ｈタンパク質、またはＲ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３の全長タンパク質であった。８７日目に、ｐ５３ Ｒ１７５Ｈ陽性腫瘍細胞を、マウスへと注射した。
実験手順についての概略表示は、図７４Ａに示される。ＥＬＩＳＡ解析の結果を、図７４Ｂに示すが、これは、表示の時点（１回目および２回目の免疫化の後）で得られた血清が、ＴｒｘＲ１７５Ｈタンパク質およびＲ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３の全長タンパク質と反応したことを示す。
図７４Ｃおよび７４Ｄは、１０匹の異なるマウス（Ｍ１～Ｍ１０）からの、１回目および２回目の採血から得られた血清による、ＳＫＢＲ３細胞（Ｒ１７５Ｈ突然変異を擁する）およびＴＫＯ細胞（ｐ５３ヌル）の染色の結果を示す。ＴｒｘＲ１７５Ｈ免疫化マウスの血清中の抗体は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈを発現するＳＫＢＲ３細胞では、陽性染色を示したが、ｐ５３ノックアウトＴＫＯ細胞では、これを示さなかった。
図７４Ｅは、ＴｒｘＲ１７５Ｈで免疫化されたマウスの血清中の抗ｐ５３Ｒ１７５Ｈ抗体の、ＳＫＢＲ３細胞に由来する細胞溶解物に対する反応性についてのウェスタンブロット解析の結果を示す。血清は、１：１０００の希釈率で使用した。レーンＡ～Ｅは、５匹の異なるマウスに由来する血清を含有し、レーンＦは、抗体であるＤ０１を含有する陽性対照である。結果は、２回目の注射の後、解析されたマウスの全てが、Ｒ１７５Ｈ突然変異体ｐ５３の全長タンパク質に特異的な抗体を含有したことを示す。
図７４Ｆは、Ｔｒｘ、ＴｒｘＲ１７５Ｈ、またはＰＢＳによる免疫化の後における、異なる免疫細胞サブセットの細胞のレベルについての解析の結果を示す。５回目の注射の３日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を、フローサイトメトリーにより解析した。Ｔ細胞の百分率は、ｐ５３ Ｒ１７２Ｈ／Ｒ１７２Ｈ突然変異体マウスにおいて、ＴｒｘＲ１７５ＨまたはＴｒｘによる免疫化により、ＰＢＳと比較して増大することが見出された。
まとめると、ＥＬＩＳＡ、細胞染色、ウェスタンブロット、およびフローサイトメトリーのデータは、ＴｒｘＲ１７５Ｈが、突然変異体Ｒ１７５Ｈ ｐ５３に対するＴ細胞およびＢ細胞両方の応答を、効果的に誘発しうることを裏付ける。
まとめると、ＥＬＩＳＡ、細胞染色、ウェスタンブロット、およびフローサイトメトリーのデータは、ＴｒｘＲ１７５Ｈが、突然変異体Ｒ１７５Ｈ ｐ５３に対するＴ細胞およびＢ細胞両方の応答を、効果的に誘発しうることを裏付ける。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的な抗体を作製するための方法であって、免疫原として、（ｉ）突然変異と、突然変異に直接隣接する少なくとも１つのアミノ酸とを含む、突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗原配列、および（ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列を含むペプチドまたはポリペプチドを使用するステップを含む方法。
［態様２］
足場配列が、溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドに由来し、抗原配列が、ペプチドもしくはポリペプチドの溶媒に接触可能な配列に挿入されるか、またはその全部もしくは一部を置換する、態様１に記載の方法。
［態様３］
溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドが、チオレドキシンであり、溶媒に接触可能な配列が、チオレドキシンの活性部位配列である、態様２に記載の方法。
［態様４］
免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドが、さらに、抗原配列と足場配列との間に、１または複数のリンカー配列を含む、態様１から３のいずれか一項に記載の方法。
［態様５］
免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列を含む、態様１から４のいずれか一項に記載の方法。
［態様６］
免疫原として使用されるペプチドまたはポリペプチドが、さらに、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列の間に、リンカー配列を含む、態様５に記載の方法。
［態様７］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとも２つのアミノ酸配列が、非同一である、態様５または６に記載の方法。
［態様８］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも５つのアミノ酸を含む、態様１から７のいずれか一項に記載の方法。
［態様９］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１つから選択される突然変異を含む、態様１から９のいずれか一項に記載の方法。
［態様１１］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、配列番号３～１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、態様１から１０のいずれか一項に記載の方法。
［態様１２］
態様１から１１のいずれか一項に記載の方法により得られるか、または得ることが可能な抗体または抗原結合性断片。
［態様１３］
野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的である抗体または抗原結合性断片。
［態様１４］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む、態様１３に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様１５］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１つから選択される突然変異を含む、態様１３または１４に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様１６］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、配列番号３～１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、態様１３から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様１７］
Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた、そのバリアント［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ；Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］。
［態様１８］
ＬＣ－ＣＤＲ１が、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つである、態様１７に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様１９］
ＨＣ－ＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つである、態様１７または１８に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２０］
ＨＣ－ＣＤＲ２が、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つである、態様１７から１９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２１］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ］が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様１７から２０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２２］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ （配列番号１９）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様２１に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２３］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ （配列番号２３）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様２１に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２４］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
［配列中、Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様１７から２３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２５］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＴＥＹＴ （配列番号２５）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＮＮＧＶＴ （配列番号２６）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様２４に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２６］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＥＹＴ （配列番号２９）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＮＰＹＳＧＧＴ （配列番号３０）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様２４に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様２７］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１ （配列番号３１）；
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ （配列番号２０）；
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ （配列番号２１）
［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ］を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様２８］
ＬＣ－ＣＤＲ１が、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つである、態様２７に記載の、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様２９］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ （配列番号３２）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ （配列番号３３）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ （配列番号２７）
［配列中、Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様３０］
ＨＣ－ＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つである、態様２９に記載の、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様３１］
ＨＣ－ＣＤＲ２が、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つである、態様２９または３０に記載の、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様３２］
態様２９から３１のいずれか一項に記載の、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、態様２７または２８に記載の、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様３３］
Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＸ１（配列番号３１）、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＹ（配列番号１９）、またはＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＳＮ（配列番号２３）のうちの１つ；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＧＡＳ（配列番号２０）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＱＮＤＨＳＹＰＬＴ（配列番号２１）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＸ２ＴＦＴＥＹＴ（配列番号３２）、ＧＦＴＦＴＥＹＴ（配列番号２５）またはＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号２９）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ３ＰＸ４Ｘ５ＧＸ６Ｔ（配列番号３３）、ＩＤＰＮＮＧＶＴ（配列番号２６）、またはＩＮＰＹＳＧＧＴ（配列番号３０）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＲＷＧＧＤＹＶ（配列番号２７）［配列中、Ｘ１＝ＹまたはＮ；Ｘ２＝ＦまたはＹ；Ｘ３＝ＤまたはＮ；Ｘ４＝ＮまたはＹ；Ｘ５＝ＮまたはＳ；およびＸ６＝ＶまたはＧ］に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、
抗体または抗原結合性断片。
［態様３４］
Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号１８もしくは２２（図２４）、または配列番号２３７もしくは９４（図４９）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号２４もしくは２８（図２５）、または配列番号２３９、２４０、
もしくは２４１（図５０）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片。
［態様３５］
Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）態様１７から３４のいずれか一項に記載の抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片。
［態様３６］
Ｒ１７５Ｈ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、態様１７から３５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体。
［態様３７］
Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた、そのバリアント［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］。
［態様３８］
ＨＣ－ＣＤＲ２が、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つである、態様３７に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様３９］
ＨＣ－ＣＤＲ３が、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）のうちの１つである、態様３７または３８に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様４０］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様３７から３９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様４１］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様３７から４０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様４２］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＨＰＫＮＧＧＴ （配列番号４７）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ （配列番号４８）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様４１に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様４３］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＤＰＫＮＧＧＴ （配列番号５０）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＱＧＧＦＤＤＹ （配列番号５１）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様４１に記載の抗体または抗原結合性断片。
［態様４４］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ （配列番号４１）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ （配列番号４２）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ （配列番号４３）
を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様４５］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ （配列番号４６）；
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ （配列番号５２）；
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ （配列番号５３）
［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様４６］
ＨＣ－ＣＤＲ２が、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つである、態様４５に記載の、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様４７］
ＨＣ－ＣＤＲ３が、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）のうちの１つである、態様４５または４６に記載の、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様４８］
態様４５から４７のいずれか一項に記載の、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、態様４４に記載の、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様４９］
Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ（配列番号４１）；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＬＶＳ（配列番号４２）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ（配列番号４３）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号４６）；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＸ７ＰＫＮＧＧＴ（配列番号５２）、ＩＨＰＫＮＧＧＴ（配列番号４７）またはＩＤＰＫＮＧＧＴ（配列番号５０）のうちの１つ；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＡＫＸ８ＧＧＸ９ＤＤＹ（配列番号５３）、ＡＫＭＧＧＹＤＤＹ（配列番号４８）またはＡＫＱＧＧＦＤＤＹ（配列番号５１）［配列中、Ｘ７＝ＨまたはＤ；Ｘ８＝ＭまたはＱ；およびＸ９＝ＹまたはＦ］のうちの１つに対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、
抗体または抗原結合性断片。
［態様５０］
Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号４０もしくは４４（図２８）、または配列番号２５１もしくは２５２（図５７）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号４５もしくは４９（図２９）、または配列番号２５３もしくは２５４（図５８）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片。
［態様５１］
Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）態様３７から５０のいずれか一項に記載の抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片。
［態様５２］
Ｒ２４８Ｑ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、態様３７から５１のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体。
［態様５３］
Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、任意に単離されており、アミノ酸配列ｉ）～ｖｉ）：
ｉ） ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）；
ｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）；
ｉｉｉ） ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）；
ｉｖ） ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）；
ｖ） ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）；
ｖｉ） ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
を有する抗体もしくは抗原結合性断片、または配列ｉ）～ｖｉ）のうちの１もしくは複数
における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置きかえられた
、そのバリアント。
［態様５４］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）
が組み込まれた少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様５３に記載の抗体または抗
原結合性断片。
［態様５５］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
が組み込まれた少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様５３または５４に記載の抗
体または抗原結合性断片。
［態様５６］
以下のＣＤＲ：
ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ （配列番号５９）
ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ （配列番号６０）
ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ （配列番号６１）
を含む、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様５７］
以下のＣＤＲ：
ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ （配列番号６３）
ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ （配列番号６４）
ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ （配列番号６５）
を含む、単離された、重鎖可変領域のポリペプチド。
［態様５８］
態様５７に記載の、重鎖可変領域のポリペプチドと組み合わされた、態様５６に記載の、単離された、軽鎖可変領域のポリペプチド。
［態様５９］
Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖が、ＬＣ－ＣＤＲ１：ＱＳＩＶＨＮＮＧＤＴＹ（配列番号５９）；ＬＣ－ＣＤＲ２：ＫＶＳ（配列番号６０）；ＬＣ－ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＬＰＬＴ（配列番号６１）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ３を含み；そして
重鎖が、ＨＣ－ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＹＹ（配列番号６３）；ＨＣ－ＣＤＲ２：ＩＳＶＧＧＴＹＴ（配列番号６４）；ＨＣ－ＣＤＲ３：ＶＲＤＧＮＤＧＫＦＬＧ（配列番号６５）に対する、少なくとも８５％の、全体的な配列同一性を有するＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む、抗体または抗原結合性断片。
［態様６０］
Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列を含み、
軽鎖配列が、配列番号５８（図３２）または配列番号２４７（図５３）の軽鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有し；そして
重鎖配列が、配列番号６２（図３３）または配列番号２４８（図５４）の重鎖配列に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、
抗体または抗原結合性断片。
［態様６１］
Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドに結合することが可能であり、（ｉ）態様５３から６０のいずれか一項に記載の抗原結合性断片またはポリペプチド、および（ｉｉ）Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含む二特異性抗体または二特異性抗原結合性断片である、任意に単離された抗体または抗原結合性断片。
［態様６２］
Ｒ２７３Ｈ ｐ５３ポリペプチドまたはこの断片に結合した、態様５３から６１のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドを含む、任意に単離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合体。
［態様６３］
薬物部分または検出用部分へとコンジュゲートさせた、態様１７から３５、態様３７から５１、または態様５３から６１のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチド。
［態様６４］
態様１７から３５、態様３７から５１、または態様５３から６１のいずれか一項に記載の抗原結合性断片またはポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
［態様６５］
態様６４に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞。
［態様６６］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む組成物。
［態様６７］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、態様６３または６4のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸。
［態様６８］
態様６７に記載の核酸を含むベクター。
［態様６９］
態様６８に記載のベクターを含む宿主細胞。
［態様７０］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、態様６３または６4のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するための方法であって、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートをコードするベクターの発現に適する条件下で、態様６９に記載の宿主細胞を培養するステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートを回収するステップとを含む方法。
［態様７１］
治療、または医学的処置の方法における使用のための、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞。
［態様７２］
がんの処置における使用のための、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞。
［態様７３］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、がんの処置における使用のための医薬の製造における使用。
［態様７４］
がんを処置する方法であって、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、がんを患う患者へと投与するステップを含む方法。
［態様７５］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
［態様７６］
対象における疾患または状態を診断する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
［態様７７］
突然変異体ｐ５３ポリペプチドターゲティング剤による処置のために、対象を選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞と接触させるステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、ＣＡＲ、または細胞の、突然変異体ｐ５３ポリペプチドとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
［態様７８］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、突然変異体ｐ５３ポリペプチドの検出のための使用。
［態様７９］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、診断剤または予後診断剤としての使用。
［態様８０］
態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における使用。
［態様８１］
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法であって、態様１７から３５、態様３７から５１、態様５３から６１、または態様６３から６５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を、対象へと投与するステップと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または細胞を検出するステップとを含む方法。
［態様８２］
態様１から１１のいずれか一項に記載の免疫原を含むワクチン。
［態様８３］
がんに対するワクチン接種の方法における使用のための、態様１から１１のいずれか一項に記載の免疫原。
［態様８４］
態様１から１１のいずれか一項に記載の免疫原の、がんに対するワクチン接種における使用のための医薬の製造における使用。
［態様８５］
がんに対して、対象にワクチン接種するための方法であって、対象へと、態様１から１１のいずれか一項に記載の免疫原を投与するステップを含み、これにより、対象に、がんに対してワクチン接種する方法。
［態様８６］
がんが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現するか、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を含む、１または複数の細胞を含むがんである、態様８６から８５のいずれか一項に記載のがんワクチン、使用のための免疫原、使用、または方法。

Claims (12)

  1. 野生型ｐ５３ポリペプチドより、突然変異体ｐ５３ポリペプチドに特異的な抗体を作製するための方法であって、
    免疫原として
    （ｉ）突然変異を含む、前記突然変異体ｐ５３ポリペプチドの少なくとの２つの非同一のアミノ酸配列を含む抗原配列、ここにおいて、前記突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、５－２０のアミノ酸の長さであり、そして、抗原配列はさらに、前記突然変異体ｐ５３ポリペプチドのアミノ酸配列の間にリンカー配列を含む、
    および
    （ｉｉ）溶媒に接触可能な立体配置にある抗原配列をもたらすための足場配列、
    を含むペプチドまたはポリペプチド、を使用するステップを含む、
    ここにおいて、免疫原が、さらに、抗原配列と足場配列との間に、１または複数のリンカー配列を含む。
    前記方法。
  2. 足場配列が、溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドに由来し、抗原配列が、ペプチドもしくはポリペプチドの溶媒に接触可能な配列に挿入されるか、またはその全部もしくは一部を置換する、請求項１に記載の方法。
  3. 溶媒に接触可能な配列を含むペプチドまたはポリペプチドが、チオレドキシンであり、溶媒に接触可能な配列が、チオレドキシンの活性部位配列である、請求項２に記載の方法。
  4. 突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）内に、突然変異を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２８２Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｙ２２０Ｃ、およびＲ３３７Ｈのうちの１つから選択される突然変異を含む、請求項１から３いずれか一項に記載の方法。
  6. 突然変異体ｐ５３ポリペプチドが、配列番号３～１６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項１から６ のいずれか一項に記載の免疫原を含むがんワクチン。
  8. がんに対するワクチン接種の方法における使用のための、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原。
  9. 請求項１から６ のいずれか一項に記載の免疫原の、がんに対するワクチン接種における使用のための医薬の製造における使用。
  10. がんが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現するか、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を含む、１または複数の細胞を含むがんである、請求項７に記載のがんワクチン。
  11. がんが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現するか、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を含む、１または複数の細胞を含むがんである、請求項８に記載の免疫原。
  12. がんが、突然変異体ｐ５３ポリペプチドを発現するか、または突然変異体ｐ５３ポリペプチドをコードする核酸を含む、１または複数の細胞を含むがんである、請求項９に記載の使用。
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