JP2008533986A - 変異型ｐ５３の共通エピトープに対するヒト合成単鎖抗体およびその使用 - Google Patents

変異型ｐ５３の共通エピトープに対するヒト合成単鎖抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

野生型ではなく、変異型ｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができる、単離されたポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド、またはそれをコードする発現ベクター、ウイルス呈示ビヒクルが提供される。また、本発明によって明らかにされた単離されたポリペプチドを使用する、アポトーシスを誘導する方法およびガンを治療する方法、ならびにｐ５３関連のガンを診断する方法が提供される。

Description

本発明は、ｐ５３変異型タンパク質に対する抗体を使用してガンを治療する方法に関連する。
腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３は、主としてアポトーシスの誘導によって腫瘍の成長を阻害する。ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子における変異は非常に一般的な遺伝子変化であり、すべてのヒト腫瘍の半数以上で生じている。これらの変化の約９０％が、標的遺伝子に対する野生型ｐ５３タンパク質の配列特異的な結合に関わるＤＮＡ結合コアドメインにおけるミスセンス変異である。これらの変異の多くが、ｐ５３タンパク質における共通した立体配座変化を引き起こし、この結果、そうでない場合には野生型ｐ５３分子の内部に隠されるエピトープの露出をもたらしている。
ガンの進行におけるｐ５３変異体の関与が、野生型ｐ５３のトランスドミナント抑制、または、野生型ｐ５３に依存しない発ガン性の「機能獲得」のいずれかと関連することが示唆されていた。野生型ｐ５３は四量体を形成して、その腫瘍サプレッサー活性を発揮するので、変異型ｐ５３が野生型ｐ５３とヘテロマー形成することにより、野生型タンパク質が、トランスドミナント抑制現象を生じさせる変異型の立体配座、または、そうでない場合には不活性な立体配座にされることが一般に受け入れられている。変異型ｐ５３の「機能獲得」は、２つの相互に可能性がある機構に起因すると考えられ得る。１つの機構が、野生型ｐ５３タンパク質とではなく、変異型ｐ５３と物理的に相互作用すること、および、その活性を妨害することが見出されたｐ５３ファミリーメンバー（ｐ６３およびｐ７３）の腫瘍サプレッサー活性の無効化である。第２の機構では、変異型ｐ５３により、これらの変異体の様々な発ガン活性を媒介する特定の遺伝子がトランス活性化または抑制され得ることが伴う。コアドメインのｐ５３変異体が、様々な遺伝子（例えば、多剤耐性（ＭＤＲ−１）、ｃ−ｍｙｃ、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および初期成長受容体（ＥＧＲ−１）など）をトランス活性化することが見出され、これらの遺伝子は、野生型ｐ５３によって再活性化される遺伝子とは異なっている。
腫瘍原性の促進におけるｐ５３変異体の積極的な役割を考えると、それらの機能を不活性化するために、または、それらを野生型の表現型に復帰させるための努力がなされている。これらには、変異型ｐ５３に対する特異的なＤＮＡ結合を少なくとも部分的に回復させることができる第二点サプレッサー変異（例えば、Ｎ２３９Ｙ、Ｎ２６８ＤおよびＨ１６８Ｒ）の導入が含まれる。加えて、ｐ５３タンパク質のＣ末端に由来する合成ペプチド、または、ＣＤＢ３（ｐ５３結合タンパク質（ｐ５３ＢＰ２）由来の化合物）は、ＤＮＡとの結合、それに続く、転写のトランス活性化、ならびに、腫瘍細胞に対するｐ５３依存的アポトーシスの誘導を回復させることが見出された。さらに、ＣＰ−３１３９８およびＰＲＩＭＡ−１などの低分子量化合物は、野生型の立体配座を元に戻すこと、転写のトランス活性化、ならびに、細胞におけるアポトーシス、および、変異型ｐ５３を有するヒト腫瘍異種移植片におけるアポトーシスを誘導することが見出された。しかしながら、そのようなペプチドおよび化合物は、目標とする治療のためには非常に重要な性質であるｐ５３の野生型形態および変異型形態を区別する能力を有していない。
従って、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、広範囲のｐ５３変異体を特異的に標的化する新規な抗ガン治療様式が所望される。
ｐ５３タンパク質に見出される変異の９０％以上において、そうでない場合には分子の疎水性コアに隠されるエピトープの露出をもたらす、ｐ５３タンパク質における立体配座変化が生じている。そのようなエピトープが、ヒトｐ５３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００５３７）のアミノ酸２１２〜２１７、または、マウスｐ５３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３５７７０）のアミノ酸２０９〜２１４に限局され、ＦＲＨＳＶＶの配列（配列番号１）を有する。以前の研究では、配列番号１により免疫化されたマウスから調製された単鎖ｓｃＦｖマウス抗体の単離が記載される。この抗体（ＭＥ１と呼ばれる）は、哺乳動物細胞の細胞質ゾルにおいて発現されること、および、野生型ｐ５３タンパク質とではなく、変異型ｐ５３タンパク質と１０−７Ｍの親和性で結合することが見出された（Ｇｏｖｏｒｋｏ Ｄ、Ｃｏｈｅｎ ＧおよびＳｏｌｏｍｏｎ Ｂ、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５８：１６９〜８１）。しかしながら、この抗体は、腫瘍の形質転換における変異型ｐ５３の役割を明確にするための有用なツールを提供するが、そのマウス起源、および、変異ｐ５３に対するその中程度の親和性のために、その治療的適用は制限される。
従って、変異型ｐ５３を大きな親和性で特異的に標的化することができるヒト由来抗体が必要であることが広く認識されており、また、そのようなヒト由来抗体を有することは非常に好都合であると考えられる。
本発明の１つの態様によれば、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、この場合、特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である。
本発明の別の態様によれば、ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むＣＤＲ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供され、この場合、特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である。
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、単離されたポリヌクレオチドを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、単離されたポリヌクレオチドと、細胞において、この単離されたポリヌクレオチドの発現を指向させるためのプロモーターとを含む核酸構築物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導する方法が提供され、この場合、この方法は、単離されたポリペプチドをガン細胞と接触させるか、または、単離されたポリペプチドをガン細胞において発現させ、それにより、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンに罹患しているか、または、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する対象を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、治療効果的な量の単離されたポリペプチドを対象に投与するか、または、治療効果的な量の単離されたポリペプチドを対象の細胞において発現させ、それにより、対象におけるｐ５３関連のガンを治療することを含む。
本発明のなおさらなる態様によれば、対象におけるｐ５３関連のガンを診断する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）対象の生物学的サンプルを、単離されたポリペプチドと、ｐ５３変異型タンパク質とを含む免疫複合体の形成のために好適な条件のもとで、単離されたポリペプチドと接触させること、および（ｂ）免疫複合体の形成を検出し、それにより、対象におけるガンを診断することを含む。
本発明のなおさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための単離されたポリペプチドの使用が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための単離されたポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための核酸構築物の使用が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるポリペプチドをその表面に発現するウイルス呈示ビヒクルを含む組成物が提供され、この場合、特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である。
本発明のなおさらなる態様によれば、ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むＣＤＲ含有ポリペプチドをその表面に発現するウイルス呈示ビヒクルを含む組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、ウイルス呈示ビヒクルを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導する方法が提供され、この場合、この方法は、ウイルス呈示ビヒクルをガン細胞と接触させ、それにより、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンに罹患しているか、または、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する対象を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、治療効果的な量のウイルス呈示ビヒクルを対象に投与し、それにより、対象におけるｐ５３関連のガンを治療することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するためのウイルス呈示ビヒクルの使用が提供される。
下記に記載される本発明（医薬組成物）の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、エピトープは配列番号１によって示される通りである。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリペプチドは、配列番号３９〜配列番号４１、配列番号４５〜配列番号４７および配列番号６０〜配列番号６２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体および抗体からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、単鎖抗体は、配列番号１１３、配列番号１１４および配列番号１１５からなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、核酸構築物はさらに、単離されたポリペプチドに融合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなる核酸配列を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＮＬＳは配列番号１３４によって示される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のポリヌクレオチドはさらに、薬物をコードするさらなる核酸配列を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のポリペプチドはさらに、薬物のアミノ酸配列を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のポリペプチドは薬物に結合されている。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、薬物はトキシンおよび／または化学療法薬物である。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のポリヌクレオチドはさらに、検出可能な標識をコードするさらなる核酸配列を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のポリペプチドはさらに、検出可能な標識を含む。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な標識はビオチンおよびジゴキシゲニンである。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生物学的サンプルは、血液、リンパ節生検物、骨髄吸引物および組織サンプルからなる群から選択される。
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体および抗体のそれぞれがヒト化されている。
本発明は、変異型ｐ５３タンパク質に対する抗体、および、変異型ｐ５３タンパク質に対する抗体を使用することにより細胞成長を阻害し、また、アポトーシスを誘導する方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ〜図１ｂは、変異型ｐ５３の共通エピトープ（ＦＲＨＳＶＶ；配列番号１）と結合することについて選択された２０個のヒトｓｃＦｖクローンのアミノ酸配列アラインメントを示す。これらのｓｃＦｖは配列番号１１３〜配列番号１３２によって示される。図１ａは可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸（１〜１１９）を示し、図１ｂは可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸（１３５〜２４５）を示す；変異型ｐ５３の共通エピトープに対する２０個のヒトｓｃＦｖ。赤色＝同一アミノ酸、青色＝低いコンセンサス値（５０％を超える同一性）を有するアミノ酸、黒色＝５０％未満の同一性を有するアミノ酸。ＣＤＲが黒色棒によって示される。
図２ａ〜図２ｂは、ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）エピトープに対するＦ２ｓｃＦｖクローン（これはまた本明細書中では「ＴＡＲ１」として示される）の結合（図２ａ）およびＥ６ｓｃＦｖクローンの結合（図２ｂ）を示す。抗体の指示された濃度においてＢＩＡＣｏｒｅを使用して、結合を測定した。Ｆ２ｓｃＦｖクローンおよびＥ６ｓｃＦｖクローンのＶＨ鎖およびＶＬ鎖の配列が図１ａ〜図１ｂに示される。ＲＵ＝共鳴ユニット。結合定数が、ＢＩＡＣｏｒｅ装置とともに供給されるソフトウエアを使用して求められた（ｗｗｗ．Ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍ）。
図３は、ＥＬＩＳＡを使用して明らかにされるような、完全なｐ５３分子に対するｓｃＦｖ Ｆ２の結合を示す棒グラフである。ＥＬＩＳＡプレートを、組換えバキュロウイルスを感染させたｓｆ９昆虫細胞（Ｈｕｐｐ Ｔ．Ｒ．およびＬａｎｅ Ｄ．Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９４、４．８６５〜８７５）から調製された野生型ｐ５３または変異型のｐ５３−Ｒ１７５Ｈ、ｐ５３−Ｒ２４８Ｈおよびｐ５３−Ｒ２７３Ｗの完全なｐ５３タンパク質で被覆し、２５０ｎｇのｓｃＦｖ Ｆ２を加えた。野生型ｐ５３に対する低い結合と比較して、Ｒ１７５Ｈの変異型ｐ５３分子に対するｓｃＦｖ Ｆ２の特異的な結合に留意すること。
図４ａ〜図４ｊは、ｐ５３ヌルヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９ｐ５３−／−；図４ｆ〜図４ｊ）、または、ホットスポット変異Ｒ１７５Ｈを有するヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ；図４ａ〜図４ｅ）におけるアポトーシスに対するｓｃＦｖ Ｆ２の影響を示すＦＡＣＳ分析である。細胞を下記の濃度でｓｃＦｖ−Ｆ２と２４時間インキュベーションした：０ｎＭ（非処理細胞、図４ａおよび図４ｆ）、２５０ｎＭ（図４ｂおよび図４ｇ）、５００ｎＭ（図４ｃおよび図４ｈ）、１μＭ（図４ｄおよび図４ｉ）および２μＭ（図４ｅおよび図４ｊ）。２４時間後、細胞をエタノールで固定処理し、ヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期プロフィルを明らかにした。数字は各調製物におけるアポトーシス細胞の％を示す［０．８％（図４ａ）、１．９％（図４ｃ）、２１．８％（図４ｄ）、３２．２％（図４ｅ）、０〜０．８％（図４ｆ〜図４ｊ）］。Ｒ１７５Ｈのｐ５３変異を発現する細胞におけるｓｃＦｖ−Ｆ２抗体の存在下でのアポトーシスの著しい増大に留意すること。
図５は、ｓｃＦｖ Ｆ２抗体を発現する細胞の、薬物処理に対する増大した感受性を示す棒グラフである。Ｒ１７５Ｈ変異を有するヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ）を、ｓｃＦｖ Ｆ２抗体（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ−Ｆ２）を発現させるために安定的にトランスフェクションし、（細胞カウント数による）細胞生存に対するエトポシドおよびシスプラチンの薬物の影響を薬物処理後４８時間で求めた。ｓｃＦｖＦ２抗体を発現する細胞における低濃度のシスプラチン（０．５μｇ／ｍｌ）またはエトポシド（１μＭ）に対する肺ガン細胞の増大した感受性に留意すること。
図６ａ〜図６ｄは、ｓｃＦｖ Ｆ２抗体を発現する肺ガン細胞におけるコロニー形成の阻害を示す。Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞を、ｓｃＦｖ Ｆ２抗体（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ−Ｆ２）を発現させるために安定的にトランスフェクションし、コロニー形成に対するｓｃＦＶ Ｆ２の細胞内発現の影響を求めた。プレートあたり５００細胞〜１０００細胞のＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞またはＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ−Ｆ２細胞を、ＲＰＭＩ培養培地を含有するプレートに播種し、２週間にわたって成長させた。図６ａ〜図６ｂは、２週間の培養の後で存在するギムザ染色されたコロニーの写真である。図６ａはＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞であり；図６ｂはＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ−Ｆ２細胞である。図６ｃ〜図６ｄは、２週間の培養の後におけるＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞またはＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ−Ｆ２細胞のコロニー数（図６ｃ）およびコロニー面積（図６ｄ）を示す棒グラフである。ｓｃＦＶ Ｆ２抗体を発現する細胞におけるコロニー数（図６ｃ）およびコロニー面積（図６ｄ）の両方での著しい減少に留意すること。
図７は、マウスにおけるヒト腫瘍細胞異種移植片に対するｓｃＦｖ Ｆ２の抗腫瘍効果を示すグラフである。ヌードマウスに５ｘ１０６個の肺ガンＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞を皮下注射した。３日後、マウスは、２００μｇのｓｃＦｖ Ｆ２またはコントロールとしてのＰＢＳ（５０μｌ）の腫瘍内注入を受けた。この腫瘍内注入を、２週間の期間中、１日おきに繰り返した。腫瘍サイズを、Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞による接種の後、６日後、１５日後、２１日後、２５日後、２８日後、３２日後および３６日後で測定し、腫瘍体積を計算した。結果が相対的体積Ｖｔ／Ｖ０として示される（式中、Ｖｔは、指示された日における体積であり、Ｖ０は、最初のｓｃＦｖ Ｆ２注入における体積である）。
図８ａ〜図８ｆは、インビボでの腫瘍成長に対するｓｃＦｖ Ｆ２抗体の影響を示す。マウスに、図７について記載されたように、Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞のヒト異種移植片を皮下注射し、その後、腫瘍内注射を行った。ｓｃＦｖ Ｆ２が注射されたマウス（図８ａ〜図８ｃ）と比較して、ＰＢＳが注射されたマウス（図８ｄ〜図８ｆ）の代表的な写真が示される。大きい腫瘍がＰＢＳ処理マウスに存在すること（図８ａ〜図８ｃ）、および、そのような腫瘍がｓｃＦｖ Ｆ２処理マウス（図８ｄ〜図８ｆ）には存在しないことに留意すること。
図９は、ｓｃＦｖの結合特異性を示す棒グラフである。ＥＬＩＳＡを、図１ａ〜図１ｂに示される単離されたｓｃＦｖ収集物から得られたＦ２ｓｃＦｖ、Ａ４ｓｃＦｖおよびＢ６ｓｃＦｖを使用して行った。結合抗原は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；レーン５）、ストレプトアビジン（レーン６）および下記ペプチドであった：ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１；変異型ｐ５３の共通エピトープ；レーン１）；βアミロイドペプチドのアミノ酸１〜１６、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号２；レーン２）；ヒトプリオンタンパク質を提示する多重抗原ペプチドのアミノ酸１４４〜１５３（ＭＡＰ−ＰｒＰＤＹＥＤＲＹＹＲＥ；配列番号３；レーン３）；および、前立腺ガン抗原に対応するペプチド（ＰａＰ ＩＬＬＷＱＰＩＰＶ；配列番号４；レーン４）。変異型ｐ５３の共通エピトープ（配列番号１）を表すペプチドに対するＦ２抗体およびＡ４抗体の大きい結合親和性に留意すること。
図１０ａ〜図１０ｄは、ＴＡＲ１抗体（図１０ａ）、または、野生型ｐ５３について特異的なｍＡＢ１６２０（図１０ｂ〜図１０ｄ）を使用して組換えｐ５３の野生型コアドメインまたは変異型コアドメインに対して行われたＥＬＩＳＡアッセイを示す棒グラフである。図１０ａは変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈのコアドメイン（黒色）および野生型ｐ５３のコアドメイン（灰色）に対するＴＡＲ１の結合である。ｐ５３の野生型コアドメイン（約０．０５のＯ．Ｄ．）と比較して、ｐ５３変異体Ｒ１７５Ｈのコアドメインに対するＴＡＲ１抗体の大きい特異性（約０．５のＯ．Ｄ．）に留意すること。図１０ｂは変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈのコアドメイン（黒色）および野生型ｐ５３のコアドメイン（灰色）に対するｍＡｂ１６２０の結合である。ｐ５３変異体Ｒ１７５Ｈのコアドメイン（約０．３のＯ．Ｄ．）と比較して、ｐ５３の野生型コアドメインに対するｍＡｂ１６２０の大きい特異性（約１．２のＯ．Ｄ．）に留意すること。図１０ｃおよび図１０ｄでは、ｐ５３変異体（Ｒ１７５Ｈ）のコアドメイン（図１０ｃ）またはｐ５３野生型のコアドメイン（図１０ｄ）を０．４μＭのＴＡＲ１の非存在下（灰色棒）または存在下（黒色棒）において３７℃で３０分間または６０分間加熱し、ｍＡｂ１６２０の結合を調べた。加熱後、および、ＴＡＲ１の存在下では、野生型に特異的な抗体（ｍＡｂ１６２０）に対する変異型ｐ５３の結合が、ＴＡＲ１の非存在下での場合よりも３倍大きいことに留意すること（図１０ｃ）。野生型ｐ５３のコアドメインに対するｍＡｂ１６２０の結合がＴＡＲ１の存在下ではより高かったことにもまた留意すること（図１０ｄ）。これらの結果から、ＴＡＲ１は変異型ｐ５３において立体配座変化を誘導し、野生型ｐ５３の立体配座を安定化することが明らかにされる。
図１１ａ〜図１１ｂは、野生型ｐ５３またはＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３に対するｍＡｂ ＤＯ−１２ｍＡｂ（ｐ５３変異体に特異的な抗体）の結合を示す免疫沈殿アッセイである。図１１ａでは、ｐ５３変異体のコアドメイン（Ｒ１７５Ｈ；レーン１およびレーン３）または野生型のコアドメイン（ＷＴ；レーン２およびレーン４）を、８０ｎＭのＴＡＲ１とのオーバーナイトのインキュベーションの前（レーン１およびレーン２）またはその後（レーン３およびレーン４）、ＤＯ−１２ｍＡｂを使用して免疫沈殿に供した。野生型ｐ５３のコアドメインに対する結合特異性が低いこと（レーン２）と比較して、Ｒ１７５Ｈのコアドメインに対するｍＡｂ ＤＯ−１２の結合特異性が高いこと（レーン１）には留意すること。８０ｎＭのＴＡＲ１とのオーバーナイトのインキュベーションの後では、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３コアドメインに対するｍＡｂ ＤＯ−１２の結合が著しく低下し（レーン３）、一方、野生型ｐ５３のコアドメインに対するｍＡｂ ＤＯ−１２の結合は影響を受けていない（レーン４）ことにもまた留意すること。図１１ｂ、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを発現するＨ１２９９細胞を１μＭのＴＡＲ１でオーバーナイトで処理し、抽出物をｍＡｂ１６２０（ｐ５３野生型に特異的な抗体）で免疫沈殿した。変異型ｐ５３を発現する細胞のタンパク質抽出物に対するｍＡｂ１６２０の結合における、ＴＲＡ１の量に依存する様式での著しい増大に留意すること。このことから、ＴＡＲ１は野生型ｐ５３の立体配座をｐ５３のＲ１７５Ｈ変異体においてインビボで回復させることができることが明らかにされる。
図１２は、ＴＡＲ１抗体の存在下における野生型またはＲ１７５Ｈ変異体のｐ５３コアドメインのスペクトルを示す円二色性分析である。円二色性測定を、野生型ｐ５３のコアドメインまたは変異型ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）のコアドメインのいずれかおよびＴＡＲ１について、別々に（ＴＡＲ１／ＷＴ；ＴＡＲ１／Ｒ１７５Ｈ）、または、免疫複合体（ＴＡＲ１＋ＷＴの複合体；ＴＡＲ１＋Ｒ１７５Ｈの複合体）として同時に行った。ＴＡＲ１の結合は変異型ｐ５３のスペクトルでの変化を引き起こし、一方、野生型コアドメインのスペクトルでは、ＴＡＲ１と変異型ｐ５３との複合体における立体配座変化を示す差がほとんど観測されなかったことに留意すること。両方のＴＡＲ１複合体（すなわち、野生型ｐ５３との複合体、および、変異型ｐ５３との複合体）のスペクトが非常に類似していることにもまた留意すること。これは立体配座の類似性を示す。
図１３ａ〜図１３ｈは、抗ｐ２１抗体（図１３ａ）、抗ＭＤＭ２抗体（図１３ｂ）、抗Ｅｇｒ１抗体（図１３ｃ）、抗Ｂａｘ抗体（図１３ｄ）および抗チューブリン抗体（図１３ｅ〜図１３ｈ）によりプローブされた、Ｈ１２９９細胞が発現するＲ１７５Ｈ変異体ｐ５３の抽出物のウェスタンブロット分析であり、変異型ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）の転写のトランス活性化に対するＴＡＲ１処理の影響が明らかにされる。変異型ｐ５３を安定的に発現するＨ１２９９細胞を０．５μＭ（レーン２）または１μＭ（レーン３）の最終濃度でＴＡＲ１により２４時間処理し、あるいは、非処理（レーン１）のままにし、その後、タンパク質サンプルを調製し、下記の抗体を使用してウェスタンブロット分析に供した：抗ｐ２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、１：１０００の希釈）、抗ＭＤＭ２（Ｍ．Ｏｒｅｎから譲渡されたもの、１：４０に希釈されたハイブリドーマ上清）、抗Ｅｇｒ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、１：５００の希釈）、抗Ｂａｘ（Ａｂｃａｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ（英国）、１：１０００の希釈）、抗チューブリン（Ｓｉｇｍａ、１：２５００の希釈）。チューブリンの発現レベルは負荷コントロールとして役立った。ＴＡＲ１処理後でのｐ２１、ＭＤＭ２およびＢａｘの発現レベルにおける濃度依存的な増大に留意すること。このことから、ＴＡＲ１は、変異型ｐ５３に対する転写のトランス活性化機能を回復させることができることが明らかにされる。対照的に、ＴＡＲ１処理はＥｇｒ１の発現レベルにおける低下をもたらしたことに留意すること。このことから、ＴＡＲ１はｐ５３変異型タンパク質の機能獲得活性を無効にすることが明らかにされる。
図１４は、図１３ａ〜図１３ｈに示されるウェスタンブロット分析の定量化を示す棒グラフである。処理細胞または非処理細胞における各タンパク質の発現レベルをチューブリンの発現レベルによって正規化した。白棒、非処理細胞；灰色棒、０．５μＭのＴＡＲ１で２４時間処理された細胞；黒色棒、１μＭのＴＡＲ１で２４時間処理された細胞。
図１５ａ〜図１５ｈは、ｐ５３ヌルＨ１２９９ヒト肺ガン細胞（図１５ｃ〜図１５ｄ）、変異型ｐ５３を発現するＨ１２２９−Ｒ１７５Ｈ細胞（図１５ａ〜図１５ｂ）、野生型ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６結腸ガン細胞（図１５ｇ〜図１５ｈ）、または、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３を発現するＨＣＴ１１６結腸ガン細胞（図１５ｅ〜図１５ｆ）におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示す蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析である。細胞を１μＭのＴＡＲ１と２４時間インキュベーションし（図１５ｂ、図１５ｄ、図１５ｆおよび図１５ｈ）、または、非処理のままにし（図１５ａ、図１５ｃ、図１５ｅおよび図１５ｇ）、その後、細胞をエタノールで固定処理し、ヨウ化プロピジウムで染色し、それらの細胞周期プロフィルを明らかにした。ヌルｐ５３の細胞、または、野生型ｐ５３タンパク質を発現する細胞（図１５ｄおよび図１５ｈ）と比較して、Ｒ１７５Ｈのｐ５３変異を発現する細胞におけるＴＡＲ１抗体の存在下でのアポトーシス（Ａｐ割合）の著しい増大（図１５ｂおよび図１５ｆ）に留意すること。
図１６ａ〜図１６ｄは、１μＭのＴＡＲ１の非存在下（図１６ａおよび図１６ｃ）または存在下（図１６ｂおよび図１６ｄ）における、ｐ５３についてヌルであるＨ１２９９細胞（図１６ｃ〜図１６ｄ）、または、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを発現する細胞（図１６ａ〜図１６ｂ）のＴｄＴ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）である。変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを発現させるために安定的にトランスフェクションされたＨ１２２９細胞（図１６ａ〜図１６ｂ）、または、トランスフェクションされていないＨ１２２９細胞（図１６ｃ〜図１６ｄ）をＴＡＲ１で（１μＭの最終濃度で）２４時間処理し（図１６ｂおよび図１６ｄ）、または、非処理のままにし（図１６ａおよび図１６ｃ）、処理の影響を、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用して明らかにした。
図１７ａ〜図１７ｒは、異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。ＬＡＮ１ガン細胞株（図１７ａ〜図１７ｂ）、Ｔ４７Ｄガン細胞株（図１７ｃ〜図１７ｄ）、ＳＫＢＲ３ガン細胞株（図１７ｅ〜図１７ｆ）、ＭＣＦ７ガン細胞株（図１７ｇ〜図１７ｈ）、ＫＭ１２−Ｃガン細胞株（図１７ｉ〜図１７ｊ）、ＳＷ４８０ガン細胞株（図１７ｋ〜図１７ｌ）、ＰＡＮＣ１ガン細胞株（図１７ｍ〜図１７ｎ）、Ｃｏｌｏｎ３２０ガン細胞株（図１７ｏ〜図１７ｐ）およびＭＤＡ２３１ガン細胞株（図１７ｑ〜図１７ｒ）を１μＭのＴＡＲ１で２４時間処理し（図１７ｂ、図１７ｄ、図１７ｆ、図１７ｈ、図１７ｊ、図１７ｌ、図１７ｎ、図１７ｐおよび図１７ｒ）、または、非処理のままにし（図１７ａ、図１７ｃ、図１７ｅ、図１７ｇ、図１７ｉ、図１７ｌ、図１７ｍ、図１７ｏおよび図１７ｑ）、その後、細胞を、図１５ａ〜図１５ｈで記載されたようにヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ分析に供した。亜Ｇ１画分における細胞の割合が示される。ＴＡＲ１抗体による処理の後でのアポトーシスの著しい増大に留意すること。
図１８ａ〜図１８ｂは、ＰＥＰ内在化ペプチドを含むファージの構築を示す概略的例示である。図１８ａは、ｆｄ−Ｔｅｔ ｆ８８−４ベクターへのファージＰＥＰクローニングの概略図（Ｃｈｅｎ，Ｌ．他、２００４、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．、１１、１０８１〜１０９１からの改変）である。ＰＥＰペプチドの配列もまた示される（ＥＦＧＡＣＲＧＤＣＬＧＡ；配列番号１３６）。図１８ｂは、ｔａｃプロモーターの調節下にあるｐＶＩＩＩ遺伝子の組み換えコピー体をＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＰｓｔＩ部位にクローン化することによって、約１５０コピーのｐＶＩＩＩに融合されたＰＥＰペプチドを呈示するｆｄ−Ｔｅｔファージｆ８８−４ベクターである。本発明の抗ｐ５３抗体（例えば、ＴＡＲ１）を核内に送達することをファージに行わせるために、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチド（配列番号１３４）を抗体に融合することができ、この融合タンパク質を、ＴＡＲ１−ＮＬＳをそのタンパク質ＩＩＩの表面に呈示するファージを作製するためにファージタンパク質ＩＩＩの上流側にクローン化することができること（図１８ｂ）に留意すること。
図１９ａ〜図１９ｃは、ＣＨＯ細胞におけるファージＰＥＰの免疫蛍光分析を示し、ファージの内在化がファージ濃度に依存することを明らかにする共焦点顕微鏡像である。ＣＨＯ細胞を、指示された濃度のファージＰＥＰの存在下（１０１１、図１９ａ；１０９、図１９ｂ；１０６、図１９ｃ；ウェルあたりのファージ数）、膜赤色分子色素（ＣＭ−Ｄｉｌ分子プローブ）と４８時間インキュベーションした。内在化されたファージ粒子（緑色）が、マウス抗Ｍ１３抗体、続いて、ヤギ抗マウスｃｙ２共役化抗体を用いて検出された。細胞を、共焦点顕微鏡を使用して可視化した。ファージＰＥＰの内在化が濃度依存的であることに留意すること；細胞内部における緑色の標識化の強度がより大きいことによって判断されるように、細胞内部で検出されたファージの数が培地におけるファージの濃度に対して直接に相関している。
図２０ａ〜図２０ｗは、ＣＨＯ細胞におけるファージＰＥＰの免疫蛍光分析を示し、ファージが哺乳動物細胞ＣＨＯ細胞の中に侵入することを明らかにする共焦点顕微鏡像である。膜分子色素および１０１１個／ウェルのファージの最終濃度でのファージＰＥＰと４８時間インキュベーションされたＣＨＯ細胞の深さ方向での細胞切片の一連の共焦点像が示される。内在化されたファージ粒子が、マウス抗Ｍ１３抗体、続いて、ヤギ抗マウスｃｙ２共役化抗体を用いて検出された（緑色）。膜をＣＭ−Ｄｉｌ分子プローブにより可視化した（赤色）。
図２１は、ファージＰＥＰとのインキュベーションの後でのＣＨＯ細胞のＭＴＴ分析を示す棒グラフである。ＣＨＯ細胞を、１０９ｐｆｕのファージＰＥＰ、野生型（Ｗ．Ｔ．）ファージ、チミロサール（細胞を殺すためのコントロール）およびＰＢＳ（細胞のみ）と４８時間インキュベーションし、細胞生存性をＭＴＴ分析によって測定した。誤差バーは、３つの独立した実験（それぞれにおいて４回の繰り返し）から計算された標準偏差値を表す。ファージＰＥＰはＣＨＯ細胞に対して非毒性であることに留意すること。
本発明は、野生型ではなく、変異型のｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができる単離されたポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたは発現ベクターに関する。具体的には、本発明は、アポトーシスを誘導するために、また、ｐ５３関連のガンを治療するために使用することができる。加えて、本発明は、対象におけるｐ５３関連のガンを診断するために使用することができる。
本発明による変異型のｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープと結合することができる単離されたポリペプチドの原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３は、主にアポトーシスの誘導によって腫瘍の成長を阻害する。ガンの進行におけるｐ５３変異体の関与が、野生型ｐ５３のトランスドミナント抑制、または、野生型ｐ５３に依存しない発ガン性の「機能獲得」のいずれかと関連することが示唆されていた。腫瘍原性の促進におけるｐ５３変異体の積極的な役割を考えると、それらの機能を不活性化するため、または、それらを野生型の表現型に復帰させるための努力がなされている。これらには、第二点サプレッサー変異の導入、ｐ５３タンパク質のＣ末端に由来する合成ペプチド、または、野生型の立体配座、転写のトランス活性化を回復させること、ならびに、細胞におけるアポトーシス、および、変異型ｐ５３を有するヒト腫瘍異種移植片におけるアポトーシスを誘導することが見出されたＣＤＢ３由来化合物および低分子量化合物が含まれる。しかしながら、そのようなペプチドおよび化合物は、目標とする治療のためには非常に重要な性質である、ｐ５３の野生型形態および変異型形態を区別する能力を有していない。
以前の研究は、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、広範囲の様々なｐ５３変異体を特異的に標的化／認識する新規な抗ガン治療／診断様式を開発することを目指していた。例えば、Ｇａｎｎｏｎ ＪＶおよび共同研究者らは、ｐ５３変異型タンパク質の共通エピトープに対するマウスモノクローナル抗体［ＰＡｂ−２４０、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９０、９（５）：１５９５〜６０２］を作製した。しかしながら、単鎖抗体をこのハイブリドーマクローンから製造する試みは失敗し、このために、そのような抗体の治療的適用は制限された。実際、この抗体の使用は診断用途のためにだけ提案された。近年、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）マウス抗体（ＭＥ１）が単離され、野生型ｐ５３タンパク質とではなく、独占的に変異型ｐ５３タンパク質と１０−７Ｍの親和性で結合できることが見出された（Ｇｏｖｏｒｋｏ Ｄ、Ｃｏｈｅｎ ＧおよびＳｏｌｏｍｏｎ Ｂ、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５８：１６９〜８１）。しかしながら、この抗体は、腫瘍の形質転換における変異型ｐ５３の役割を明確にするための有用なツールを提供するが、そのマウス起源、および、変異ｐ５３に対するその中程度の親和性のために、その治療的適用は制限される。
本発明を実施に移すと同時に、本発明者らは、野生型ｐ５３によってではなく、変異型ｐ５３タンパク質によって共有されるエピトープと、２５ナノモル濃度（ｎＭ）未満の結合親和性で特異的に結合することができるｓｃＦｖをヒト合成コンビナトリアルライブラリーから単離している［Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｒ他、２００４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３５（１）：１７７〜９２］。
図２ａ〜図２ｂ、図３および図９に示され、また、下記の実施例の節の実施例１および実施例２において記載されるように、Ｆ２（ＴＡＲ１）およびＥ６ｓｃＦｖは、野生型ではなく、変異型のｐ５３タンパク質によって共有される共通エピトープ（配列番号１）に対する１．１ｘ１０−８Ｍおよび４．６ｘ１０−１４Ｍの親和性をそれぞれ示した。加えて、Ａ６ｓｃＦｖのＢＩＡｃｏｒｅ分析では、共通エピトープ（配列番号１）に対する２．３ｘ１０−８Ｍの結合定数が明らかにされた（データは示さず）。同様に、Ｆ２ｓｃＦｖ（ＴＡＲ１）は、野生型ｐ５３タンパク質に対してではなく、大きい立体配座変異（Ｒ１７５Ｈ）または中間的な立体配座変化（Ｒ２４８Ｗ）を発現する完全なｐ５３タンパク質に対する大きい親和性を示した。加えて、ＴＡＲ１抗体は、野生型の立体配座を変異型ｐ５３のコアドメインに回復させることが可能であり（図１０ａ〜図１０ｄ、図１１ａ〜図１１ｂおよび図１２、下記の実施例の節の実施例５）、また、野生型ｐ５３の転写のトランス活性化機能（例えば、野生型に特異的な標的遺伝子（例えば、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＢａｘなど）の活性化）が可能であり、同時に、変異型ｐ５３の転写活性化を阻止すること（例えば、Ｅｇｒ１のダウンレギュレーション）が可能であること（図１３ａ〜図１３ｈ、図１４、および、下記の実施例の節の実施例６）が示された。従って、ポリペプチドとして投与されるか、または、ファージにおいて呈示されるか、または、細胞内発現抗体として発現されるそのような抗体は、ｐ５３関連のガンの効果的な治療ために使用することができる。
従って、本発明の１つの態様によれば、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供され、この場合、その特異的結合の親和性は２５ｎＭ未満である。
本明細書中で使用される表現「ｐ５３タンパク質」は、細胞周期の調節において、具体的には、Ｇ０からＧ１への移行において、不可欠な役割を果たす核タンパク質であるＴＰ５３腫瘍タンパク質ｐ５３を示す。ｐ５３は、ＤＮＡ結合ドメイン、オリゴマー化ドメインおよび転写活性化ドメインを含有するＤＮＡ結合タンパク質である。ｐ５３は様々な供給源からクローン化されており、限定はされないが、これらには、ヒト［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００５３７（タンパク質）および同ＮＭ＿０００５４６（ｍＲＮＡ）］、マウス［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３５７７０（タンパク質）および同ＮＭ＿０１１６４０（ｍＲＮＡ）］、ラット［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿１１２２５１（タンパク質）および同ＮＭ＿０３０９８９（ｍＲＮＡ）］およびゼブラフィッシュ［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿５７１４０２（タンパク質）および同ＮＭ＿１３１３２７（ｍＲＮＡ）］などが含まれ、ｐ５３タンパク質のコード配列が、例えば、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能である。
表現「露出したエピトープ」は、野生型ｐ５３タンパク質では疎水性コアの中に隠されるが、中間的または大きい立体配座変化を受けるｐ５３変異体ではタンパク質の外側表面に露出する任意の抗原性決定基を示す。例えば、そのような露出したエピトープは、Ｒ２４８ＷおよびＲ１７５Ｈ（中間的な変異および大きい変異）を有するｐ５３タンパク質において露出するが、野生型ｐ５３タンパク質では隠されるＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）であり得る。
表現「特異的結合の親和性」は、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープに対する本発明の単離されたポリペプチドの結合親和性を示す。そのような親和性は、解離定数（Ｋｄ）または結合定数（Ｋａ）を計算することができる、当該技術分野で既知の様々な方法［例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｂｉｏａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、スキャッチャードプロット解析］を使用して測定することができる。本発明のこの態様によれば、本発明のポリペプチドの親和性は、２５ｎＭ未満の解離定数、好ましくは１２ｎＭ未満の解離定数、好ましくは１ｎＭ未満の解離定数、好ましくは０．１ｎＭ未満の解離定数、および、一層より好ましくは０．０１ｎＭ未満の解離定数により特徴づけられる。
本発明のこの態様の抗体は変異型ｐ５３の活性を中和することができ、例えば、その転写活性化活性を阻止することができる（これは、図１３〜図１４、および、下記の実施例の節の実施例６において明らかにされる）。
本発明の単離されたポリペプチドは、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと結合することができる任意の合成ポリペプチド、天然の存在するポリペプチドまたは組換え発現ポリペプチドが可能である。
本発明において使用される用語「抗体」には、無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単一ドメイン分子（例えば、組換えＤＮＡ技術によって少なくとも一部が作製された、抗原のエピトープに対するＶＨおよびＶＬなど）が含まれる。これらの機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：（１）Ｆａｂ、これは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、全長抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、１つの重鎖の一部分とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’、これは、全長抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部分とを生じさせることによって得ることができる、抗体分子のフラグメントである；１分子の抗体分子につき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、これは、全長抗体を、その後の還元を伴うことなく、酵素ペプシンで処理することによって得ることができる、抗体のフラグメントである；（Ｆａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によってつながれる２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；（４）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、これは、遺伝子融合された単鎖分子（ｓｃＦｖ）として好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；および（６）単一ドメイン抗体は、抗原に対する十分な親和性を示す１種だけのＶＨドメインまたはＶＬドメインから構成される。
本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫化および組換えファージ呈示技術によって作製された抗体を含むだけでなく、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異型ｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むように作製される任意のポリペプチドもまた包含する。従って、本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲのコード配列を含むポリヌクレオチド配列から（本明細書中下記においてさらに記載されるように）発現させることができる。
野生型ｐ５３ではなく、変異型ｐ５３によって共有される露出したエピトープに対する抗体の親和性を増大させるために、本発明の抗体は好ましくは少なくとも二価である。そのような抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して、ＩｇＧサブタイプ（これは二価である）、ＩｇＭサブタイプ（これは五価である）にクローン化することができ、または、そのようなサブタイプから選択することができる。あるいは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の親和性を、本質的にはＣｌｏｕｔｉｅｒ ＳＭ他、２０００、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７（１７）：１０６７〜７７に記載されるように、酵素ＢｉｒＡによる部位特異的なビオチン化の後でのストレプトアビジン上での四量体化によって増大させることができる。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを製造する様々な方法が当該分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供するためにペプシンによる抗体の酵素的切断によって製造することができる。このフラグメントはさらに、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断して、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせることができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により、２つの一価のＦａｂ’フラグメントと、１つのＦｃフラグメントとが直接に生じる。これらの方法が、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、それらに含まれる参考文献に記載される（これらの特許は本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６（１９５９）］もまた参照のこと。フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは、他の酵素的技術、化学的技術または遺伝学的技術などもまた使用することができる。
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２（１９７２）］に記載されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、化学試薬（例えば、グルタルアルデヒドなど）によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。このような単鎖の抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによってつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。そのような構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターが宿主細胞（例えば、大腸菌など）に導入される。組換え宿主細胞により、リンカーペプチドが２つのＶドメインを架橋する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓｃＦｖを製造する方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７（１９９３）；および米国特許第４９４６７７８号によって記載される（これらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。様々なＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）を、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、可変領域を抗体産生細胞のＲＮＡから合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ［Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０（１９９１）］を参照のこと。
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する例えば、マウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体において、または、移入されたＣＤＲ配列もしくはフレームワーク配列においてそれらのいずれにも見出されない残基を含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、かつ、フレームワーク領域（ＦＲ）のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の一部分を少なくとも含み、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそのような一部分を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、そのようなインポート残基は、典型的には、インポート可変ドメインから選ばれる。ヒト化は本質的には、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインの実質的に一部が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基と、可能であれば、一部のＦＲ残基とが、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
ヒト抗体はまた、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して製造することができ、そのような技術には、ファージ呈示ライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］が含まれる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用することができる（Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１））。インビボ形成されたＣＤＲが生殖細胞系由来のヒト可変領域フレームワークに組合せ論的に移し替えられる大きいヒト合成単鎖Ｆｖ抗体ライブラリーの構築もまた利用することができる［Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｒ他、２００４、インビボ形成されたＣＤＲを共通のフレームワーク領域に移し替えることに基づく配置可能な単鎖抗体のヒト合成コンビナトリアルライブラリー、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３５（１）：１７７〜９２］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製することができる。抗原による攻撃を受けたとき、ヒト抗体の産生が認められ、これは、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて見られ得る抗体産生と非常に類似する。この方法が、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号において、また、下記の科学的刊行物において記載される：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０；７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３、６５〜９３（１９９５）。
細胞内の特定の区画の標的化が、細胞内抗体（これはまた「細胞内発現抗体細胞内発現抗体」として知られている）を使用して達成され得ることが理解される。細胞内抗体は本質的には、細胞内局在化シグナルが付加されているＳＣＡである（例えば、ＥＲ、ミトコンドリア、核、細胞質）。この技術は当該分野では問題なく適用されている（総説については、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ（１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻）を参照のこと）。細胞内発現抗体は、そうでない場合には多量に存在する細胞表面受容体の発現を事実上なくすこと、および、タンパク質機能を細胞内で阻害することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ他、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３１３７〜３１４１；Ｄｅｓｈａｎｅ他、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：３３２〜３３７；Ｍａｒａｓｃｏ他、１９９８、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、９：１６２７〜４２；Ｓｈａｈｅｅｎ他、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：３３９２〜４００；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．他、１９９０、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２７４：１９３〜１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７４２７〜７４２８；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．他、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：３９６〜３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．他、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：５９５〜６０１；Ｄｕａｎ，Ｌ他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５０７５〜５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５９３２〜５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．他、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２３９３１〜２３９３６；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．他、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４：１５４２〜１５５１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０（Ｍａｒａｓｃｏ他）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２（Ｄｕａｎ他）を参照のこと）。
細胞内抗体発現ベクターを調製するために、目的とする標的タンパク質について特異的な抗体軽鎖および抗体重鎖をコードするｃＤＮＡが、典型的には、マーカーについて特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離される。抗マーカーモノクローナル抗体または組換えモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。マーカータンパク質について特異的なモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体またはコンビナトリアルライブラリー由来の組換え抗体のどちらでもあっても）が特定されると、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準的な分子生物学的技術によって単離される。ハイブリドーマ由来の抗体については、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリースクリーニングによって得ることができる。組換え抗体（例えば、ファージ呈示ライブラリーなど）については、軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、ライブラリースクリーニングプロセス時に単離された呈示パッケージ（例えば、ファージ）から回収することができ、抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列が決定される。例えば、多くのそのような配列が、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、米国厚生省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）において、また、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースにおいて開示される。抗体の軽鎖配列および重鎖配列が得られると、抗体の軽鎖配列および重鎖配列は、標準的な方法を使用して組換え発現ベクターにクローン化される。
軽鎖および重鎖の細胞質発現のために、軽鎖および重鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列が除かれる。抗体の発現を細胞核に対して行わせるために、核局在化シグナルをコードする配列（例えば、ＤＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１３４）が好ましくは、抗体をコードする核酸構築物に、好ましくは抗体のコード配列の下流側において連結される。そのような形態の限定されない例が下記の実施例の節の材料および実験方法において示される。細胞内抗体発現ベクターは細胞内抗体をいくつかの異なる形態の１つでコードすることができる。例えば、１つの実施形態において、ベクターは、全長の抗体が細胞内で発現されるように全長の抗体軽鎖および抗体重鎖をコードする。別の実施形態において、ベクターは、Ｆａｂフラグメントが細胞内で発現されるように、重鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみを除いて全長の軽鎖をコードする。別の実施形態において、ベクターは、軽鎖および重鎖の可変領域が柔軟なペプチドリンカー［例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３］によって連結され、単鎖分子として発現される単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする。細胞におけるマーカー活性を阻害するために、細胞内抗体をコードする発現ベクターは、本明細書中下記で議論されるように、標準的なトランスフェクション方法によって細胞に導入される。
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号８〜配列番号１１２によって示されるような少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む組換えポリペプチドである。例には、Ｆ２ｓｃＦｖ（配列番号１１３）、Ｅ６ｓｃＦｖ（配列番号１１４）およびＡ６ｓｃＦｖ（配列番号１１５）、および／またはおよび／または、少なくとも１つのＣＤＲ配列またはｓｃＦｖ配列を含む任意のＩｇＧクローンが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号３９〜配列番号４１、配列番号４５〜配列番号４７および配列番号６０〜配列番号６２によって示されるような少なくとも１つのＣＤＲを含む。
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体が可能である。本発明と一緒に使用することができる単鎖抗体の限定されない例には、Ｆ２ｓｃＦｖ（配列番号１１３）、Ｅ６ｓｃＦｖ（配列番号１１４）およびＡ６ｓｃＦｖ（配列番号１１５）が含まれ、これらのすべてが、野生型ｐ５３によってではなく、ｐ５３変異体によって共有される露出したエピトープに対する大きい親和性を示す（解離定数が２５ｎＭ未満である）。
下記の実施例の節の表３〜表５に示されるように、本発明者らは、変異型ｐ５３の共通エピトープ（配列番号１）と特異的に結合する２０個の異なるｓｃＦｖを単離している。これらのｓｃＦｖは同一の重鎖可変領域をともに有し（表３）、それらの軽鎖可変領域において異なる（表４）。表５には、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３タンパク質の様々な変異体によって共有されるｐ５３エピトープと特異的に結合することができる可変軽鎖の特有のＣＤＲが示される。
従って、本発明の別の態様によれば、ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む単離されたポリペプチドが提供される。
下記の実施例の節において、また、本明細書中下記の記載においてさらに記載されるように、本発明の単離されたポリペプチドは、インビトロ、エクスビボおよびインビボでの様々な適用において使用することができる。安定性、生物学的利用能、標的エピトープ（すなわち、野生型ではなく、変異型のｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープ）に対する親和性および親和性を増大させるために、本発明はまた、本発明のＣＤＲ（例えば、配列番号８〜配列番号１１２）に由来するペプチド、そのペプチドアナログまたは模倣体を用いることができる。
そのようなペプチド、そのペプチドアナログまたは模倣体は、好ましくは、配列番号８〜配列番号１１２によって示されるＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲに由来する少なくとも４個〜５個の短いアミノ酸配列であり、好ましくは、少なくとも６個の短いアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも７個の短いアミノ酸配列、より好ましくは、８個〜２０個の範囲での短いアミノ酸配列、より好ましくは、８個〜１５個の範囲での短いアミノ酸配列、一層より好ましくは、１１個〜１５個の範囲での短いアミノ酸配列である。
本明細書中および請求項の節で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、および上で記載したようなペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
本明細書中で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
下記の表１および表２には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
本発明のペプチドは、好ましくは、線状形態で利用される。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
本発明の単離されたポリペプチド（例えば、配列番号８〜配列番号１１２によって示されるＣＤＲのうちの少なくとも１つを含むペプチド）は、標準的な固相技術を使用して生化学的に合成することができる。このような方法には、完全固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合および古典的な溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短いとき（すなわち、１０ｋＤａ）、および／または、ペプチドが組換え技術によって作製できないとき（すなわち、ペプチドが核酸配列によってコードされ得ないとき）に使用され、従って、異なる化学反応を伴う。
様々な固相ペプチド合成手法が当該分野では広く知られており、さらには、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）によって記載される。
合成ペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
多量の本発明のペプチドが所望される場合、本発明のペプチドは、様々な組換え技術を使用して作製することができ、そのような組換え技術が、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４；Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ、４２１頁〜４６３頁などによって記載される。
本明細書中で使用される用語「模倣体」は、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異体によって共有されるｐ５３の露出したエピトープと特異的に結合することにおいて本発明のペプチドの代わりになる代用物として役立つ分子構造体を示す（ペプチド模倣体の総説については、Ｍｏｒｇａｎ他（１９８９）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２４：２４３〜２５２）。
ペプチド模倣体には、本明細書中で使用される場合、アミノ酸および／またはペプチド結合を含有してもよく、あるいは、アミノ酸および／またはペプチド結合を含有しなくてもよく、しかし、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異体によって共有されるｐ５３の露出したエピトープと特異的に結合するという構造的および機能的な特徴を保持する合成された構造体（知られているもの、および、未だ知られていないもの）が含まれる。模倣体を作製するために利用することができるアミノ酸のタイプが本明細書中下記でさらに記載される。用語「ペプチド模倣体」にはまた、Ｎ−置換アミノ酸のペプチドまたはオリゴマーであるペプトイドおよびオリゴペプトイドが含まれる［Ｓｉｍｏｎ他（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７〜９３７１］。ペプチド模倣体としてさらに含まれるものが、所与のアミノ酸長であるように設計され、その対応するすべての想定され得るアミノ酸配列を表すペプチドの収集物であるペプチドライブラリーである。
ペプチド模倣体の作製は、本明細書中上記で記載されたように、様々な方法を使用して行われ、それらには、例えば、本明細書中上記で記載されたような短いペプチド配列をそれぞれが呈示する多数の呈示ビヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたは細菌など）を使用する呈示技術が含まれる。ペプチド呈示ライブラリーを構築およびスクリーニングする様々な方法が当該分野で周知である。そのような方法が、例えば、Ｙｏｕｎｇ ＡＣ他、「Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対する多糖結合抗体およびファージ呈示ライブラリー由来ペプチドとのその複合体の三次元構造：ペプチドミモトープを特定するための密接な関係」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９７（Ｄｅｃ １２）、２７４（４）：６２２〜３４；Ｇｉｅｂｅｌ ＬＢ他、「環状ペプチドファージライブラリーのスクリーニングによるストレプトアビジンと大きい親和性で結合するリガンドの特定」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５（Ｎｏｖ ２８）、３４（４７）：１５４３０〜５；Ｄａｖｉｅｓ ＥＬ他、「ニワトリの免疫グロブリン遺伝子に由来するライブラリーを使用する特異的なファージ呈示抗体の選択」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５（Ｏｃｔ １２）、１８６（ｌ）：１２５〜３５；Ｊｏｎｅｓ Ｃ ＲＴ他、「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、１９９５（Ｊｕｌ １４）、７０７（１）：３〜２２；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「合成遺伝子ライブラリーに由来する改善された炭水化物結合性単鎖抗体を選択するための基礎」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９５（Ｍａｙ ２３）、９２（１１）：４９９２〜６；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「ファージ呈示による改善された炭水化物結合性の抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４（Ａｐｒ １）、２６９（１３）：９５３３〜８に記載される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
ペプチド模倣体はまた、コンピュータ使用による生物学を使用して発見することができる。例えば、様々な化合物を、様々な三次元コンピュータ処理ツールを使用して、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異体によって共有されるｐ５３の露出したエピトープと特異的に結合する能力についてコンピュータ分析することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ．他、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４、９４６において総説される）などを、ｐ５３の露出したエピトープ（例えば、配列番号１）と、予想されるペプチド模倣体との間での相互作用をモデル化し、それにより、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異体によって共有される露出したエピトープと特異的に結合する最大の確率を示すペプチドを特定するために利用することができる。タンパク質−ペプチド相互作用のコンピュータ使用によるモデル化が合理的薬物設計では使用され、成功している。さらに詳しくは、Ｌａｍ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、１９９３、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２、５４３；Ａｐｐｅｌｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９；Ｍａｕｒｏ ＭＪ．他、２００２、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０、３２５〜３４を参照のこと。
用いられた方法にかかわらず、上記の教示を使用して作製されたペプチド模倣体は、下記の実施例の節で記載されるアッセイ（例えば、結合親和性アッセイ）を使用して、適格かどうかを調べることができる。
前記で言及されているように、本発明の単離されたペプチドはまた、例えば、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、完全なＩｇＧ抗体、または、本発明の単離されたポリペプチドのＣＤＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸構築物の一部として、細胞（例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞）において組換え発現することができる。
本発明の単離されたペプチドの組換え体を哺乳動物細胞において発現させるために、配列番号８〜配列番号１１２によって示されるような少なくとも１つのＣＤＲ配列をコードするポリヌクレオチド配列が、好ましくは、哺乳動物細胞での発現のために好適な核酸構築物に連結される。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１１３（Ｆ２ｓｃＦｖの場合）、配列番号１１４（Ｅ６ｓｃＦｖの場合）、配列番号１１５（Ａ６ｓｃＦｖの場合）によって示されるポリヌクレオチドであり得る。核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
本発明における使用のために好適な構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性があるプロモーター配列である（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）など）。本発明との使用のために好適な誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｚａｂａｌａ Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。
本発明の核酸構築物（これはまた、本明細書中では「発現ベクター」として示される）には、このベクターを、原核生物、真核生物、または、好ましくは両方（例えば、シャトルベクター）における複製および組み込みのために好適にするさらなる配列が含まれる。加えて、典型的なクローニングベクターはまた、転写開始配列および翻訳開始配列、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、ならびに、ポリアデニル化シグナルを含有する場合がある。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列（ＴＡＴＡボックスおよび上流側のプロモーター要素）を含有する。ＴＡＴＡボックス（これは転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流側に位置する）は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＲＮＡ合成を開始させることに関与していると考えられる。それ以外の上流側のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定する。
好ましくは、本発明の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性がある。細胞タイプ特異的および／または組織特異的なプロモーターの例には、肝臓特異的であるプロモーター（例えば、アルブミンなど）［Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ他（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３：２３５〜２７５］、具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ他（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．、８：７２９〜７３３］および免疫グロブリンのプロモーター［Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３７２９〜７４０］、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ニューロフィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５４７３〜５４７７］など、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ他（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２〜９１６］、または、乳腺特異的プロモーター、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号）が含まれる。
エンハンサー要素は、転写を、連結された相同的プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍まで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたとき、活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性がある。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）からの長末端反復に由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離で異種の転写開始部位から配置される。しかしながら、当該分野で既知のように、この距離におけるある程度の変動が、プロモーター機能の喪失を伴うことなく受け入れられ得る。
ポリアデニル化配列もまた、組換えられた単離抗体のｍＲＮＡの翻訳の効率を増大させるために発現ベクターに加えることができる。２つの異なった配列要素が正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される（ポリアデニル化部位の下流側に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流側に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列（ＡＡＵＡＡＡ））。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
既に述べられた要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図された他の特殊化された要素を含有することができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外の複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。このようなウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドにおいて運ばれる遺伝子によるか、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子によるかのいずれかで提供される限り、エピソームとして複製する。
ベクターは真核生物のレプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないならば、エピソーム増幅ができない。その代わり、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、その細胞において、プロモーターが所望の核酸の発現を行わせる。
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）、および、プロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を含むことができる。
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、ならびに、それらの誘導体が含まれる。
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節要素を含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞での発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
上記で記載されたように、ウイルスは、多くの場合において宿主の防御機構を回避するように進化してきた非常に特殊化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプに感染し、特定の細胞タイプにおいて増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存する。好適なベクターを形質転換された細胞タイプに従って選択することができることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのため、選択検討の一般的な記載は本明細書中には提供されない。例えば、骨髄細胞を、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）を使用して標的化することができ、また、腎臓細胞が、Ｌｉａｎｇ ＣＹ他（２００４）（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．、１４９：５１〜６０）に記載されるように、バキュロウイルスのＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化される場合がある。
組換えウイルスベクターは、様々な利点（例えば、側方感染および標的化特異性など）を提供するので、本発明の単離されたポリペプチドのインビボ発現のために有用である。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有のものであり、出芽し、周りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを１個の感染細胞が産生するプロセスである。その結果は、最初のウイルス粒子によってそのほとんどが最初に感染していなかった広い面積が急速に感染することである。これは、感染性因子が娘核種を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望する目的が、指定された遺伝子を局在化した多数の標的化された細胞のみに導入することであるならば、有用であり得る。
様々な方法を、本発明の発現ベクターを細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要な要素を含有することの他に、本発明の発現構築物はまた、発現ペプチドの安定性、産生、精製、分泌、収量または毒性を高めるために操作された配列を含むことができる。
本発明の単離されたポリペプチドの分泌のために、本発明の核酸構築物は典型的には、本発明の核酸構築物が置かれている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。加えて、本発明のＭｅｔ変化体と、異種タンパク質とを含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作することができる。そのような融合タンパク質は、融合タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、異種タンパク質について特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位がＭｅｔ成分と異種タンパク質との間で操作される場合、Ｍｅｔ成分を、切断部位を分断する適切な酵素または薬剤による処理によって、クロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他（１９８８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０；Ｇａｒｄｅｌｌａ他（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９を参照のこと］。
様々な原核生物細胞または真核生物細胞が、本発明の単離されたポリペプチドを発現させるための宿主発現システムとして使用され得ることが理解される。これらには、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌など；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞システム、または、コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムもまた、本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる。
細菌構築物の例には、大腸菌発現ベクターのｐＥＴシリーズ［Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９］が含まれる。
酵母では、米国特許出願第５９３２４４７号に開示されるように、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含有する数多くのベクターを使用することができる。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進させるベクターを使用することができる。
様々な他の発現システム（例えば、昆虫、植物および哺乳動物の宿主細胞システムなど）が当該分野では周知であり、これらもまた本発明によって使用することができる。
本発明の組換えポリペプチドの回収が培養での適切な時間の後で行われる。表現「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する成長培地（例えば、発酵培地）全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。上記にかかわらず、本発明のポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび特異的可溶化（これらに限定されない）などを使用して精製することができる。
本発明の単離されたポリペプチド（これは抗ｐ５３抗体として作用する）はまた、変異型ｐ５３タンパク質を発現する標的細胞（例えば、大きいｐ５３変異（例えば、Ｒ１７５Ｈなど）を有するガン細胞など）において発現させることができ、それにより、本明細書中上記で記載されたような細胞内抗体を形成することが理解される。これは、核タンパク質であり、従って、従来の抗体治療に対して比較的「抵抗性」であるｐ５３の場合には特に、特に重要である。図４ａ〜図４ｊ、図１５ａ〜図１５ｈおよび図１６ａ〜図１６ｄに示され、また、下記の実施例の節の実施例３において記載されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体（ＴＡＲ１）は、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３タンパク質（これは、配列番号１によって示される露出したエピトープを有する）を特異的に発現するヒト肺ガン細胞またはヒト結腸ガン細胞においてアポトーシスを誘導することができた。加えて、様々な内因性のｐ５３変異型タンパク質を発現するガン性細胞株の、ＴＡＲ１による処理は、アポトーシスの著しい増大をもたらした（図１７ａ〜図１７ｒ、実施例３）。そのうえ、本発明のＦ２ｓｃＦｖ（ＴＡＲ１）抗体を発現するように安定的にトランスフェクションされた、変異型ｐ５３タンパク質（Ｒ１７５Ｈ）を有する細胞は、形成されたコロニーの低下した数、ならびに、形成されたコロニーの低下したサイズにおいて明らかにされる低下したコロニー形成能を示した（図５、図６ａ〜図６ｄ、下記の実施例の節の実施例４および実施例４）。
従って、本発明のさらなる態様によれば、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導する方法が提供される。この方法は、本発明の単離されたポリペプチド（これは本明細書中上記において包括的に記載される）をガン細胞と接触させるか、または、ガン細胞において発現させ、それにより、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導することによって達成される。
本明細書中で使用される用語「アポトーシス」は、細胞が「細胞自殺」プログラムを実行するプログラム化された細胞死を示す。アポトーシスは、胚発生、免疫系の調節、および、恒常性をはじめとする数多くの生理学的事象において重要な役割を果たしている。従って、アポトーシスは、多様なシグナル（例えば、四肢および神経の発達、神経変性疾患、放射線療法および化学療法など）に対する応答においてであり得る。アポトーシスのプロセスは通常、ミトコンドリアでの酸化の非共役、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］のレベルにおける低下、チトクロームｃの放出、カスパーゼの活性化、ＤＮＡ断片化、および、原形質膜の外側リーフレットへのホスファチジルセリン（脂質二重層の内側リーフレットに通常の場合には限定される膜リン脂質）の外在化によって特徴づけられる。
本明細書中で使用される表現「成長停止」は、インビトロ、エクスビボ（すなわち、細胞が個体に由来し、組織培養で培養されるとき）および／またはインビボ（個体の腫瘍において）での細胞成長の阻害を示す。インビトロ条件またはエクスビボ条件が使用される場合、成長停止は、コロニー形成（コロニー数を計数することによる）、細胞面積、および、コロニーにおける細胞数などを、当該技術分野で既知の様々な方法を使用して追跡することによって検出することができる。インビボ条件が用いられる場合、成長停止はまた、腫瘍のサイズおよび／または形状および／または腫瘍転移物の存在を、病理学における当業者に知られている様々な組織学的および免疫学的な染色方法を使用して追跡することによって監視することができる。
本発明のこの態様の方法によれば、アポトーシスが本発明のこの態様の方法に従って誘導されるガン細胞は、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異体によって共有される露出したエピトープ（例えば、配列番号１）を特異的に発現する。そのようなガン細胞は、本明細書中上記で記載されたように、大きいｐ５３変異または中間的なｐ５３変異を有することができる。そのようなガン細胞は、固形腫瘍（例えば、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、肝細胞ガン、骨原性肉腫、結腸直腸ガン、神経膠芽細胞腫、食道ガン、膀胱ガン、扁平上皮ガンなど）および非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫）を含めて、任意の種類の腫瘍に由来し得る。加えて、そのような細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、発ガン遺伝子による正常細胞の変異誘発またはトランスフェクションによって派生させることができる。
本発明のこの態様の方法によれば、本発明の単離されたポリペプチドは本発明のガン細胞と接触されるか、または、本発明のガン細胞において発現される。ｐ５３は細胞の核で発現されるので、本発明の単離されたポリペプチドは、好ましくは、大きい分子（例えば、ＩｇＧ分子など）ではなく、小さいポリペプチド［例えば、ＣＤＲ含有ポリペプチドまたはｓｃＦｖ（例えば、Ｆ２ｓｃＦｖ（配列番号１１３）など）］であり、従って、細胞膜および核膜をより容易に突き抜けることが理解される。
細胞の核への単離されたポリペプチドの侵入を容易にするために、単離されたポリペプチドは疎水性成分に共有結合により結合することができ、または、（例えば、下記の実施例の節の「一般的な材料および実験方法」において記載されるＴＡＴ−ｓｃＦｖ Ｆ２／Ｈｉｓ発現ベクターの場合などでは）疎水性成分との融合遺伝子として発現させることができる。そのような疎水性成分は、非極性であり、かつ、一般には水と混和しない任意の物質が可能である（例えば、疎水性物質の疎水性残基（部分）など）。疎水性物質の限定されない例には、置換または非置換の飽和炭化水素および不飽和炭化水素（この場合、炭化水素は、脂肪族、脂環族または芳香族が可能である）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、炭化水素は、アミノ酸残基へのその結合を可能にする官能基を有する。そのような官能基の代表的な例には、限定されないが、遊離カルボン酸（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、遊離アミノ基（ＮＨ２）、エステル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、アシルハライド基（Ｃ（＝Ｏ）Ａ、式中、Ａは、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドである）、ハライド（フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、チオール基（ＳＨ）、ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、遊離Ｃ−カルバミン酸基（ＮＲ”−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、遊離Ｎ−カルバミン酸基（ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−、式中、Ｒ’は上記で定義される通りである）、チオニル基（Ｓ（＝Ｏ）２Ａ、式中、Ａは上記で定義される通りである）などが含まれる。例えば、そのような疎水性成分は脂肪酸が可能であり、例えば、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸（Ｃ１８）、オレイン酸、リノレン酸およびアラキドン酸などである。
本発明の単離されたポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、細胞環境（例えば、血液、血漿、緩衝液および組織培養培地など）への単離されたポリペプチドの添加などを使用して細胞に投与することができる。
あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、本明細書中上記で記載されたような細胞内発現抗体を形成させるために、細胞において、核酸構築物を使用して発現させることができる。
加えて、または、代替として、本発明の抗ｐ５３抗体（例えば、ＴＡＲ１抗体）はウイルス呈示ビヒクル（例えば、繊維状ファージなど）において提示することができ、あるいは、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導するために治療効果的な量で使用することができる。本発明者らは、そのようなウイルス呈示ビヒクル（すなわち、ファージ）が不活性なビヒクルであり、かつ、活性な抗体フラグメントをＣＮＳに運ぶために好適であることを以前に明らかにしている（米国特許出願第２００４００１３６４７号、Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｂｅｋａ他）。
本発明のウイルス呈示ビヒクルは、細胞内での本発明のｐ５３抗体（例えば、ＴＡＲ１）の提示を可能にするために設計され得ることが理解される。図１８〜図２１に示されるように、また、下記の実施例の節の実施例７において記載されるように、ＰＴＤ（タンパク質形質導入ドメイン）［例えば、哺乳動物細胞内への内在化を可能にするＰＥＰペプチド（配列番号１３６）；図１８ａ〜図１８ｂに示される］を含有するウイルス呈示ビヒクルは、哺乳動物ＣＨＯ細胞に侵入することができた。核内への侵入のために、ウイルスベクターはさらに、呈示されている抗体に共役化されるＮＬＳペプチド（配列番号１３４）を含むことができる。構築されたファージはＰＴＤをそのコートタンパク質ＶＩＩＩの表面に提示し、ＮＬＳペプチドに融合された抗体をそのタンパク質ＩＩＩの表面に提示する（図１８ａ〜図１８ｂを参照のこと）。
従って、本発明の抗ｐ５３抗体を提示するウイルス呈示ビヒクルは、その必要性のある個体に投与することができ、目的とする細胞の核に対して標的化することができる。例えば、脳腫瘍については、ウイルス呈示ビヒクルを鼻腔内適用によって個体に投与し、それにより、様々な脳領域（例えば、皮質および海馬など）に到達させることができる。
本発明の単離されたポリペプチド、核酸構築物および／またはウイルス呈示ビヒクルによって誘導されるアポトーシスは、当該技術分野で既知の様々な方法を使用して検出することができる。
エチジウムホモダイマー−１染色。アポトーシスを、膜が損なわれた細胞（すなわち、死細胞）に特異的に結合する色素によって検出することができる。簡単に記載すると、固定処理されていない細胞（例えば、懸濁状態の細胞、組織培養物および組織切片など）が蛍光性色素のエチジウムホモダイマー−１（励起、４９５ｎｍ；放射、６３５ｎｍ）により染色される。このアッセイでは、生細胞は緑色蛍光の細胞質を有するが、ＥｔｈＤ−１のシグナルを全く有さず、これに対して、死細胞は緑色の蛍光を有さず、ＥｔｈＤ−１により染色される。
Ｔｕｎｎｅｌアッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）では、アポトーシスを受けている細胞に特徴的であるＤＮＡ断点がフルオレセイン（励起、４５０ｎｍ〜５００ｎｍ；放射、５１５ｎｍ〜５６５ｎｍ）により標識される。
生／死による生存性／細胞毒性の二色蛍光アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌ−３２２４、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）。このアッセイでは、細胞内エステラーゼ活性が細胞透過性基質（カルセイン−ＡＭ）を用いて測定され、この場合、細胞透過性基質（カルセイン−ＡＭ）が生細胞によって蛍光性誘導体（ポリアニオンのカルセイン、励起、４９５ｎｍ；放射、５１５ｎｍ）に変換され、この蛍光性誘導体が、その後、生細胞の無傷の原形質膜によって保持される。
ＦＡＣＳ分析−アポトーシスを受けている細胞と特異的に結合することができる分子（例えば、ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶなど）が使用される。アネキシンＶは、初期アポトーシスの期間中に原形質膜の外側への外在化を受けるホスファチジルセリンに対するカルシウム媒介の大きい親和性結合によって特徴づけられるヒトタンパク質である。
ゲル電気泳動によるＤＮＡ断片化―簡単に記載すると、ＤＮＡが、固定処理されていない細胞から抽出され、ゲル電気泳動（例えば、１．５％〜２％のアガロースゲル）に供され、ＤＮＡ断片化の程度が、何らかのＤＮＡ染色（例えば、臭化エチジウムおよびＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｎｎなど）を使用して評価される。
図８ａ〜図８ｆにおいてさらに示されるように、また、下記の実施例の節の実施例４において記載されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ（ＴＡＲ１）抗体は腫瘍成長をインビボで阻害することができた。これらの結果は、ｐ５３関連のガンを治療することにおける、本発明の単離されたポリペプチド、本発明の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターの使用を強く示唆している。
従って、本発明のさらなる態様によれば、ｐ５３関連のガンに罹患しているか、または、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する対象を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の単離されたポリペプチドの治療効果的な量を対象に投与するか、または、対象の細胞において発現させ、それにより、対象におけるｐ５３関連のガンを治療することによって行われる。
用語「治療（処置）する」は、疾患、障害または状態（例えば、ｐ５３関連のガン）の発達を阻害または停止すること、および／あるいは、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を生じさせることを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害または状態の発達を評価するために使用でき、同様にまた、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を評価するために使用され得ることを理解する。
本明細書中で使用される用語「対象」（または、本明細書中において交換可能に使用される「個体」）は哺乳動物を示し、好ましくは、ｐ５３関連のガンに罹患している任意の年齢のヒトを示す。好ましくは、この用語は、ｐ５３関連のガンを発症する危険性のある個体、すなわち、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する個体を包含する。そのような個体は、リー・フロイメニ症候群の場合などでは、ｐ５３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００５４６）における生殖細胞系変異の保因者であり得る。
本明細書中で使用される「ｐ５３関連のガン」は、ｐ５３がその発症または進行に関係づけられる任意のガンを示す。そのようなガンは、ｐ５３タンパク質の異常な構造および／または機能を生じさせる、ｐ５３遺伝子［Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００００１７：７５１２４６４〜７５３１６４２（ゲノム領域）；同ＮＭ＿０００５４６（ｍＲＮＡ）；同ＮＰ＿０００５３７（タンパク質）］における変異によって引き起こされ得る。そのような変異は、ミスセンス、ナンセンス、スプライス変異、プロモーター変異、欠失、挿入および重複化などであり得る。本明細書中上記で述べられるように、ｐ５３タンパク質における様々な変異により、ｐ５３タンパク質の異常な機能を生じさせる中間的または大きい立体配座変化がもたらされる。ｐ５３関連のガンの限定されない例には、ｐ５３遺伝子における生殖細胞系の変異によって引き起こされるガン（例えば、リー・フロイメニ症候群１の場合におけるガン、ＯＭＩＭ＃１５１６２３）、ならびに、ｐ５３遺伝子における体細胞変異によって引き起こされるガン、例えば、肝細胞ガン、骨原性肉腫、結腸直腸ガン、肺ガン、神経膠芽細胞腫、食道ガン、膀胱ガン、扁平上皮ガン、白血病およびリンパ腫などが含まれる。
本明細書中で使用される表現「対象の細胞」には、対象に由来し、対象から取り出される任意の細胞（すなわち、エクスビボ遺伝子治療）、または、対象の一部である細胞（すなわち、本明細書中上記で記載されるようなインビボ遺伝子治療）が含まれる。
本明細書中で使用される表現「治療効果的な量」は、生物学的活性（すなわち、（本明細書中上記で記載されるように）ｐ５３の露出したエピトープと結合すること、アポトーシスを誘導すること、および、ｐ５３関連のガンを治療または防止すること）を発揮するために十分である、本発明の単離されたポリペプチド、本発明の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは発現ベクター、および／または、本発明の抗ｐ５３抗体を呈示するウイルス呈示ビヒクルの量を示す。
図５に示されるように、また、下記の実施例の節の実施例３において記載されるように、Ａ４ｓｃＦｖは化学療法薬物に対するガン細胞の感受性を増大させることができた。これらの結果は、例えば、化学療法薬物を利用する従来のガン治療プロトコルと一緒での、単離されたポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチドをコードする発現ベクター、および／または、それらを含む医薬組成物（これは本明細書中下記でさらに記載される）の使用（すなわち、混合治療）を示唆する。
そのような薬物（例えば、化学療法剤、例えば、メクロレタミン、フルオロウラシル、ダカルバジン、ドセタキセル、カルムスチン、ビンデシンなど）はまた、本発明の単離されたポリペプチドに共役化することができ、または、本発明の単離されたポリペプチドをコードする発現ベクターの一部を形成することができることが理解される。
加えて、本発明の単離されたポリペプチドによって発揮される特異的な生物学的活性を増大させるために、そのようなポリペプチドはさらに、細胞毒性作用因（すなわち、薬物）、例えば、シュードモナスのエキソトキシンＰＥ３５、同ＰＥ３８、同ＰＥ４０、緑膿菌のエキソトキシンＡ（ＥＴＡ’）、および、ジフテリアトキシン（ＤＴ３０）などを含むことができ、それにより、特異的な抗毒素を形成することができる。そのような細胞毒性作用因は、単離されたポリペプチドに結合することができ、または、本発明の発現ベクターによって発現されるポリヌクレオチドの一部とすることができる。
従って、本発明の１つの好ましい実施形態によれば、本発明の単離されたポリペプチドは薬物に融合または共役化される。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターはさらに、薬物をコードするさらなる核酸配列を含む。
そのような抗毒素および／または化学療法剤は、組換えＤＮＡ技術を使用して（例えば、作用因分子のコード配列を通常の場合には本発明の単離されたポリペプチドのコード配列の下流側において本発明の単離されたポリペプチドのコード配列に連結することによって）、あるいは、トキシンまたは化学療法剤を、当該技術分野で既知の方法によって、単離されたポリペプチドの配列（例えば、配列番号１１３、配列番号１１４または配列番号１１５によって示されるポリペプチド）に共有結合により共役化することによって作製され得ることが理解される。例えば、様々な二官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアナートなど）、および、ビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを使用することによる。
本発明の単離されたポリペプチド、本発明の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または核酸構築物は、生物に、それ自体で、あるいは、それらが好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物で投与することができる。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果（すなわち、アポトーシスおよび／またはｐ−５３関連のガンの治療を含む、野生型ｐ５３タンパク質ではなく、変異型ｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープへの特異的結合）を担う本発明の組み換え単離ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはウイルス呈示ビヒクルを示す。
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、心臓内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
あるいは、例えば、患者の組織部位に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与しうる。
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の病状（ｐ−５３関連のガン）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（本発明の単離されたポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドもしくは発現ベクター）の量を意味する。
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な説明に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
投薬量および投薬間隔は、変異型ｐ５３タンパク質［これは、本明細書中上記で記載される共通エピトープ（例えば、配列番号１）の露出をもたらす］を発現するガン細胞に、生物学的活性（例えば、本明細書中上記で記載される変異型ｐ５３の露出したエピトープと結合すること、アポトーシスを誘導すること、および／または、ｐ５３関連のガンを治療すること）を発揮するために十分であるレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）の有効成分を与えるために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、適応される状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
対象への本発明の核酸の導入が、当該分野で使用される任意の遺伝子治療方法論を使用して達成され得ることが理解される。本発明の核酸の導入は、例えば、ウイルス感染などによって達成され、ウイルス感染は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションなど）を上回るいくつかの利点を提供する。
現在好ましいインビボ核酸移入技術（インビボ遺伝子治療）には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）など）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムが含まれる。遺伝子の脂質媒介による移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌなどである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー、または、遺伝子座を規定する要素、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾など）によって制御する他の要素を含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されたウイルスに対して適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が置かれている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列、または、本発明のポリペプチド変化体のシグナル配列である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナル、ならびに、１つ以上の制限部位、および、翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。非ウイルスである他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなど）。
本発明の単離されたポリペプチドは、野生型ではなく、変異型のｐ５３タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるので、そのようなポリペプチドは、そのようなエピトープが露出されるｐ５３関連のガンの診断において使用され得ることが理解される。
従って、本発明のなおさらなる態様によれば、対象におけるｐ５３関連のガンを診断する方法が提供される。この方法は、（ａ）対象の生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリペプチドと、野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープとの間での免疫複合体の形成のために好適な条件のもとで本発明の単離されたポリペプチドと接触させること；および（ｂ）免疫複合体の形成を検出し、それにより、対象におけるガンを診断することによって行われる。
本明細書中で使用される表現「診断する」は、疾患（ｐ５３関連のガン）または症状を分類すること、疾患の重篤度を決定すること、疾患の進行を監視すること、疾患の結果および／または回復の見込みを予測することを示す。
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、対象から単離された組織または体液のサンプルを示し、これには、例えば、血液細胞、骨髄細胞、具体的にはマクロファージ、リンパ液、様々な腫瘍、神経細胞、樹状細胞、器官、および、同様に、インビボ細胞培養構成物のサンプルが含まれるが、これらに限定されない。「対象の生物学的サンプル」はまた、場合により、対象から物理的に取り出されていないサンプルを含み得ることに留意しなければならない。好ましくは、本発明のこの態様の方法によって使用される生物学的サンプルは、血液、リンパ節生検物、骨髄吸引物および組織サンプルである。
本発明のこの態様の方法を使用して診断されるガンは、本明細書中上記で記載されたｐ５３関連のガンのいずれかであり得る。好ましくは、対象から得られる生物学的サンプルは、血液サンプル、骨髄吸引物または組織サンプルである。
本発明によるガンの診断は、対象の生物学的サンプルを免疫複合体の形成のために好適な条件のもとで本発明の単離されたポリペプチドと接触させることによって行われる。
本明細書中で使用される用語「免疫複合体」は、抗体（例えば、本発明の単離されたポリペプチド）と、その特異的な抗原（野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープが露出するｐ５３変異型タンパク質）との間で形成される複合体を示す。
本発明の免疫原複合体は、使用された単離されたポリペプチド、および、ガン細胞に依存して変化し得る様々な温度、塩濃度およびｐＨ値において形成させることができる。当業者は、それぞれの免疫複合体の形成のために好適な条件を調節することができる。
本発明のこの態様の方法によれば、免疫複合体形成の検出により、ｐ５３関連のガンの診断が示される。様々な方法を、本発明の免疫複合体を検出するために使用することができ、当業者は、どの方法が、それぞれの免疫複合体について、かつ／または、診断のために使用された細胞のタイプについて好適であるかを決定することができる。
例えば、免疫複合体を、従来の免疫組織学分析または免疫蛍光分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ分析、ウェスタンブロット分析およびＲＩＡ分析によって、あるいは、分子量に基づく方法によって検出することができる。
免疫組織学分析または免疫蛍光分析−この方法は、抗原（例えば、野生型ｐ５３ではなく、変異型ｐ５３によって共有される共通エピトープが露出する大きい変異または中間的な変異を有するｐ５３変異型タンパク質）を抗原特異的な抗体（すなわち、本発明の単離されたポリペプチド）によって固定処理後の細胞においてその存在場所で検出することを伴う。抗原特異的な抗体は酵素に連結されていてもよく、または、蛍光団に連結されてもよい。検出は顕微鏡観察および主観的評価または自動的評価によって行われる。酵素に連結された抗体が用いられるならば、比色反応が必要される場合がある。免疫組織化学では、多くの場合、続いて、細胞の核が、例えば、ヘマトキシリン染色またはギムザ染色を使用して対比染色されることが理解される。
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）−この方法は、抗原を抗原特異的な抗体によって細胞においてその存在場所で検出することを伴う。抗原特異的な抗体は蛍光団に連結される。検出は、それぞれの細胞が光ビームの中を通過する際にそれぞれの細胞から放出される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）−この方法は、抗原（本明細書中上記で記載されるようなｐ５３変異型タンパク質）を含有するサンプル（例えば、固定処理された細胞またはタンパク質性溶液）を表面（例えば、マイクロタイタープレートのウェルなど）に固定することを伴う。酵素にカップリングされた抗原特異的な抗体（すなわち、本発明の単離されたポリペプチド）が加えられ、抗原に結合される。その後、抗体の存在が、抗体にカップリングされた酵素を用いて比色反応によって検出および定量される。この方法において一般に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲に含まれるならば、サンプルに存在する基質の量は、生じた色の量に比例する。基質標準物が一般には、量的精度を改善するために用いられる。
ウェスタンブロット−この方法は、基質（例えば、本明細書中上記で記載されるようなｐ５３変異型タンパク質）を他のタンパク質からアクリルアミドゲルによって分離し、その後、基質を膜（例えば、ナイロンまたはＰＤＶＦ）に転写することを伴う。その後、基質の存在が、基質に対して特異的な抗体（すなわち、本発明の単離されたポリペプチド）によって検出され、次いで、その抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体（例えば、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）における抗体など）であり得る。抗体結合試薬は放射能標識され得るか、または、本明細書中上記で記載されるように酵素連結され得る。検出を、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行うことができる。この方法では、基質の量の定量と、電気泳動時におけるアクリルアミドゲルでの移動距離を示す膜上での相対的位置によるその正体の決定との両方が可能である。ＭＨＣ−ペプチド複合体の場合、非変性ゲル電気泳動が好ましくは用いられることが理解される。
放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）−１つの型において、この方法は、所望の抗原（例えば、本明細書中上記で記載されるようなｐ５３変異型タンパク質）を、特異的な抗体（すなわち、本発明の単離されたポリペプチド）と、沈殿性キャリア（例えば、アガロースビーズなど）に固定化された放射能標識されている抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）とを用いて沈殿させることを伴う。沈殿ペレットにおけるカウント数が抗原の量に比例する。
ＲＩＡの代替型において、標識された抗原と、非標識の抗体結合タンパク質とが用いられる。未知量の抗原を含有するサンプルが様々な量で加えられる。標識された抗原からの沈殿したカウント数の減少が、添加されたサンプルにおける抗原の量に比例する。
分子量に基づく方法−本明細書中上記で記載されるようなｐ５３変異型タンパク質と、本発明の単離されたポリペプチドとの間で形成される免疫複合体は、その成分（すなわち、本発明の単離されたポリペプチドまたはｐ５３変異型タンパク質）よりも大きい分子量を示すことが理解される。従って、分子量におけるそのような変化を検出することができる方法もまた用いることができる。例えば、免疫複合体をゲル遅延アッセイによって検出することができる。簡単に記載すると、非変性アクリルアミドゲルに、免疫複合体形成の前および後での、本発明の単離されたポリペプチドと、ｐ５３変異型タンパク質とを含有するサンプルが負荷される。その成分と比較して、タンパク質生成物のサイズ（分子量）における変化により、免疫複合体の存在が示される。高分子量側へのそのような変化を、非特異的なタンパク質染色（例えば、銀染色またはクーマシーブルー染色など）を使用して見ることができる。あるいは、ｐ５３変異型タンパク質または本発明の単離されたポリペプチドはゲル電気泳動の前に（例えば、放射性標識で）標識することができる。加えて、または、代替として、ｐ５３変異型タンパク質を発現する細胞をタンパク質抽出の前に放射能標識することができる。
免疫複合体形成の検出を容易にするために、本発明の単離されたポリペプチドのポリペプチド配列はさらに、検出可能な標識（すなわち、エピトープタグ）のアミノ酸配列を含む。そのようなアミノ酸配列は、本発明の発現ベクターに含まれる核酸配列によってコードされ得る。
本発明のこの態様のさらなる好ましい実施形態によれば、本発明の単離されたポリペプチドは検出可能な標識（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニンなど）に結合することができる。そのような検出可能な標識は、当該分野で周知の方法を使用して、本発明の単離されたポリペプチドに共有結合により結合させることができる。
免疫複合体形成の検出のための本明細書中上記に記載される薬剤は、好ましくは、使用のための適切な説明書、ならびに、ｐ５３関連のガンの重篤度を診断および／または評価することにおける使用についてのＦＤＡ承認を示すラベルと一緒に、診断キット／製造物に含めることができる。
そのようなキットは、例えば、上記の診断剤（例えば、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体、Ｅ６ｓｃＦｖ抗体またはＡ４ｓｃＦｖ抗体）のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの容器と、別の容器に詰められた画像化試薬（例えば、酵素、二次抗体、緩衝液、発色性基質、蛍光性物質）とを含むことができる。キットはまた、キットの貯蔵寿命を改善するための適切な緩衝液および保存剤を含む場合がある。
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｍｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９４年、第３版；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
一般的な材料および実験方法
細胞、プラスミドおよび試薬。Ｈ１２９９細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得て、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で維持した。ホットスポット変異Ｒ１７５Ｈを安定的に発現するＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞をＶ．Ｒｏｔｔｅｒ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から得た。ｐＣＭＶ／ｍｙｃおよびｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｎｕｃのプラスミドがＩ．Ｂｅｎｈａｒ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ大学）によって提供された。ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖ Ｆ２およびｐＣＭＶ／ｎｕｃ−ｓｃＦｖ Ｆ２を、ｓｃＦｖ Ｆ２の配列を、ヒト合成ライブラリー（Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００４、ＪＭＢ、３３５、１７７）から単離された対応するｐＣＣ１６クローンから取り出し、ｐＣＭＶおよびｐＣＭＶ／ｎｕｃにおいてＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位にサブクローン化することによって構築した。ＴＡＴ−ｓｃＦｖ Ｆ２／Ｈｉｓ発現プラスミドを、ＴＡＴペプチド（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ；配列番号１３３）をベクターｐＣＡＮＴＡＢ６−Ｆｖ（これは無関係のｓｃＦＶを発現する）においてｓｃＦｖの上流側のＮｃｏＩ部位にクローン化するか、または、ベクターｐＭａｌＣ−ＴＮＮ−ＥＧＦＰにおいてＭＢＰの上流側のＮｄｅＩ部位にクローン化することによって構築した。両方のベクターがＩ．Ｂｅｎｈａｒ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ大学）によって提供された。ＦｖおよびＥＧＦＰを、両方のプラスミドのＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローン化されたｓｃＦｖ Ｆ２によって置き換えた。ＴＡＴ−ｓｃＦｖ Ｆ２−ＮＬＳ／Ｈｉｓ発現プラスミドを、ＮＬＳペプチド（ＤＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１３４）をｓｃＦｖの下流側のＮｏｔＩ部位にクローン化することによって構築した。
ライブラリーのスクリーニング−変異型ｐ５３の共通エピトープと特異的に結合するｓｃＦｖを特定するために、配置可能な単鎖抗体のヒト合成コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングした。ライブラリーの構築および性質が、Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００４、ＪＭＢ、３３５、１７７〜１９２に記載される。ライブラリーのバイオパンニングを、ビオチン化ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０−ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）を使用して行った。
ライブラリーのレスキュー−細菌ライブラリーのグリセロールストック（約１ｘ１０１０クローン）のアリコートを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを含有するＹＴ（ＹＴＡＧ）で２回接種し、ＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで３７℃で成長させた。細胞にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを１：２０の比率で感染させ、細胞を、振とうせずに、３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、３７℃の振とうインキュベーターにさらに３０分間移した。感染細胞を３３００ｇで１０分間ペレット化し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＹＴ（ＹＴＡＫ）で２回再懸濁し、３０℃でオーバーナイトでインキュベーションした。細胞を４℃において８０００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを上清に（ＰＥＧ／ＮａＣｌ対上清の１：５の比率で）加え、氷上で１時間インキュベーションした。ファージを４℃における１０８００ｇでの３０分間の遠心分離によって集め、ＰＢＳに再懸濁した。
バイオパンニング−ストレプトアビジン−ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を、１時間、室温で回転器においてＭＰＢＳ（２％スキムミルク粉末を含有するＰＢＳ）と平衡化させた。ビーズを磁石で集め、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＭＰＢＳに再懸濁した。ファージをストレプトアビジン−ダイナビーズ単体と室温で１時間プレインキュベーションした。これら２つの工程により、抗ストレプトアビジン結合物が除去および回避される。ファージを新しいチューブに移し、５ｎｍｏｌのビオチン化ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）ペプチドを加え、回転器において室温で１時間インキュベーションした。平衡化ダイナビーズをファージ−抗原混合物に加え、回転器において室温で１５分間インキュベーションした。チューブを磁石ラックに１分間置き、その後、注意深く吸引した。ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１ｍｌのＭＰＢＳにより６回洗浄した。その後、ファージを、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）を使用してビーズから溶出した。ファージ溶液を、０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ７）を含有するチューブに移すことによって直ちに中和した。パンニングの収量を、ＴＧ−１感染細胞の連続希釈物を平板培養することによって決定した。
モノクローナルファージの調製−最終プレートからの個々のコロニーを選択し、無菌の９６ウェルプレートにおいて１００μｌのＹＴＡＧに接種した。ファージを、１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でオーバーナイトで成長させた。１０μｌの接種物を、ウェルあたり２００μｌのＹＴＡＧを含有する第２の９６ウェルプレートに移し、３７℃で１時間振とうしながら成長させた。それぞれのウェルに、１０９プラーク形成単位（ＰＦＵ）のヘルパーファージを含有する２５μｌのＹＴＡＧを加え、振とうせずに、３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、３７℃で振とう（１５０ｒｐｍ）しながらさらに１時間インキュベーションした。プレートを１８００ｇで１０分間遠心分離し、培地を吸引し、細胞を２００μｌのＹＴＡＫに再懸濁し、振とうしながら（１５０ｒｐｍ）、３０℃でオーバーナイトで成長させた。その後、プレートを１８００ｇで１０分間遠心分離し、１００ｍｌの上清をファージＥＬＩＳＡで使用した。
ＥＬＩＳＡ−プレートを１μｇ／ウェルのＢＳＡ−ビオチンで被覆し、４℃でオーバーナイトでインキュベーションした。それぞれの抗体インキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）により３回洗浄し、その後、ＰＢＳにより１回洗浄した。１μｇ／ウェルのストレプトアビジンを加え、３７℃で１時間インキュベーションし、上記で記載されたように洗浄した。プレートを２つに分け、一方の半分にはＦＲＨＳＶＶ−ビオチン（１μｇ／ウェル）を加え、もう一方の半分にはＢＳＡ−ビオチン（１μｇ／ウェル）を（コントロールとして）加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄し、３％脱脂粉乳により４℃でオーバーナイトでブロッキング処理し、ｓｃＦｖを加え（ｓｃＦｖの量は１００ｎｇ〜５００ｎｇの間で変化させた）、３７℃で１時間インキュベーションした。ｓｃＦｖとのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、モノクローナル抗Ｍ１３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、モノクローナル抗Ｈｉｓタグ（Ｓｉｇｍａ）またはモノクローナル抗ＭＢＰ（Ｓｉｇｍａ）を、ｓｃＦｖの供給源に依存して加え（それぞれ、製造者の説明書に従って１：１０００の希釈度）、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、洗浄した。ＨＲＰに共役化された抗マウスＩｇＧを加え、３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄し、基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ））を製造者の説明書に従って使用して発色させた。その後、プレートを４５０ｎｍにおいてＥａｓｙＲｅａｄｅｒ ４００ＦＷ ＥＬＩＳＡリーダー（ＳＬＴ、オーストリア）で走査した。
ｍＡｂ１６２０抗体またはＴＡＲ１抗体を使用する変異型コアドメインおよび野生型コアドメインのＥＬＩＳＡ研究−プレートを、組換えの野生型コアドメインまたは変異型コアドメインにより、あるいは、コントロールとしてのＰＢＳにより４℃でオーバーナイトで被覆した。プレートを洗浄し、３％脱脂粉乳により３７℃で２時間ブロッキング処理した。ｍＡｂ１６２０抗体またはＴＡＲ１抗体を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、洗浄した。ＨＲＰに共役化されたモノクローナル抗ＭＢＰ（１：１０００の希釈度）を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄し、基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ））を使用して発色させた。
ｓｃＦｖの発現および精製−ｓｃＦｖ発現ベクターを、ＴＡＴ配列（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ；配列番号１３３）の３つの繰り返しをｓｃＦｖのＮ末端に融合し、かつ、ＮＬＳ配列（ＤＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１３４）をｓｃＦｖのＣ末端に融合することによって調製した。大腸菌細胞を、ｐＭａｌＣ−ＮＮ−ＴＡＴ−ｓｃＦｖ、ｐＭａｌＣ−ＮＮ−ＴＡＴ−ｓｃＦｖ−ＮＬＳ、ｐＣＡＮＴＡＢ６−ＴＡＴ−ｓｃＦｖまたはｐＣＡＮＴＡＢ６−ＴＡＴ−ｓｃＦｖ−ＮＬＳ（これらの構築物のすべてがヒスチジンタグ化されている）で形質転換して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％（ｗ／ｖ）のグルコースが補充されたＬＢ培地で成長させた。培養物が０．６〜０．９のＡ６００に達したとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を３０℃で４時間行った。細胞抽出物を、凍結解凍、その後の短時間の超音波処理によって２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールにおいて調製した。抽出物を２００００ｇでの遠心分離によって清澄化し、ｓｃＦｖを、ＡＫＴＡプライム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造者の説明書に従って使用してＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析−ｓｃＦｖとＦＨＲＳＶＶ−ビオチンと間の相互作用のリアルタイム分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ技術（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を製造者の説明書に従って使用して明らかにした。ペプチド（ＦＨＲＳＶＶ−ビオチン）をストレプトアビジン被覆センサーチップ表面ＳＡに固定化した。固定化されたペプチドの量は２００ｐｇ／ｍｍ２であり、結合はＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、３．４ｍＭのＥＤＴＡ）においてであった。精製ｓｃＦｖのいくつかの濃度（６２ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭおよび２μＭ）を２０μｌ／分の流速で注入した。解離を操作緩衝液（ＨＢＳ）において１８０秒間にわたって観測した。センサーチップの再生を、１０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌを使用して行った。結合反応の速度論パラメーターを、１：１のラングミュアモデルを使用してＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．０ソフトウエア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）によって求めた。解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数Ｋｄおよび会合速度定数（ｏｎ−ｒａｔｅ）Ｋａを製造者の説明書に従って同時に求めた。
ＦＡＣＳ分析−それぞれのウェルに３ｘ１０５個の細胞を播種した。２４時間後、精製ＴＡＴ−ｓｃＦｖ Ｆ２−ＮＬＳ（２５０ｎＭ、０．５μＭ、１μＭまたは２μＭ）を培地に加え、さらに２４時間インキュベーションした。細胞を、上清中の剥離細胞を、トリプシン処理によって除かれた同じウェルからの接着性細胞と一緒にすることによって集めた。細胞をペレット化し、ＰＢＳにより洗浄し、その後、１ｍｌの冷７０％エタノールをゆっくり加えることによって固定処理した。細胞を４℃でオーバーナイトで保ち、もう一度ペレット化し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、５０μｌのヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｍｌ）を加えることによって染色した。染色強度を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して求めた。
ｓｃＦｖ発現細胞の確立−Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞を、製造者の説明書に従って、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を２μｇのＤＮＡ：４μｌのＦｕｇｅｎの比率で使用してｐＣＭＶ／ｍｙｃ−ｓｃＦｖ−Ｆ２プラスミドによりトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、選択薬物Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。細胞をＧ４１８の存在下で３時間成長させて、単一細胞クローンのコロニーを達成させた。それぞれのコロニーを拡大し、ウェスタンブロット分析によってｓｃＦｖ Ｆ２の発現について試験した。
ウェスタンブロット分析。細胞を受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）において溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して求めた。溶解物の一部を１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＭＢＰ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）または抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）によりプローブした。その後、膜を、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して発色させた。
免疫沈殿−変異型コアドメインまたは野生型コアドメインの免疫沈殿研究のために、タンパク質を８０ｎＭのＴＡＲ１とオーバーナイトでインキュベーションした。免疫沈殿を、ｍＡｂ ＤＯ−１２抗体（１：３３の希釈度）を用いて行い、プロテインＧ磁石ビーズを４℃でオーバーナイトでインキュベーションした。ビーズをＰＢＳにより洗浄し、サンプル緩衝液を加え、５分間煮沸した。溶出されたタンパク質を、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（１：３０００の希釈度）を使用してウェスタンブロット分析に供し、ＥＣＬキットを使用して発色させた。
コロニー形成−変異型ｐ５３を安定的に発現するＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ、または、変異型ｐ５３およびｓｃＦｖ Ｆ２の両方を安定的に発現するＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ−ｓｃＦｖ Ｆ２を低い濃度（５００細胞／プレート〜１０００細胞／プレート）で播種した。細胞を２週間成長させ、培地を吸引し、コロニーをギムザにより染色した。コロニーの数およびサイズを、スキオン（ｓｃｉｏｎ）分析粒子ツール（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ４．０）分析システムを使用して求めた。
動物研究−ｓｃＦｖ Ｆ２の抗腫瘍活性の評価のために、９匹のＣＤ１ヌードマウス（６週齢）に５ｘ１０６個のＨ１２９９−Ｒ１７５Ｈ細胞を右脇腹の皮下および片側に接種した。３日後、マウスを２つの群に分けた。５匹のマウスからなる一方の群には、ｓｃＦｖ Ｆ２の腫瘍内注射が２００μｇ／マウスの用量で与えられ、４匹のマウスからなる第２の群には、ＰＢＳが注射され、これはコントロールとして役立った。注射が２週間にわたって１日おきに与えられた。腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を、（ａ２ｘｂ）／２の式（式中、（ａ）は短軸であり、（ｂ）は長軸である）を使用して計算した。それぞれの群についての相対的な体積を、それぞれのデータ点についての平均腫瘍体積を平均開始時腫瘍体積によって除することによって求めた。
円二色性の測定−タンデムキュベット（Ｈｅｌｌｍａ）を使用した。これは、別々または複合体でのｐ５３コアドメインおよびＴＡＲ１の両方の同時測定を可能にした。すべてのタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて１μＭの濃度に希釈した。円二色性の吸光度測定をＡＶＩＶ装置で行った。実験パラメーターは下記の通りであった：１９０ｎｍ〜２５０ｎｍのスペクトル走査；１ｎｍステップ；それぞれのステップでの平均して５秒の測定；３回の走査をそれぞれのサンプルについて行った。測定を４℃で行った。
ＴＵＮＥＬアッセイ−ｐ５３についてヌルであるＨ１２９９細胞、または、Ｒ１７５Ｈの変異型ｐ５３を発現するＨ１２９９細胞をスライドガラス上で成長させた。細胞を１μＭのＴＡＲ１の非存在下または存在下でオーバーナイトでインキュベーションした。スライドガラスをＰＢＳにより洗浄し、室温で１０分間、３．７％ホルムアルデヒドにより固定処理し、その後、ＰＢＳにより洗浄した。サンプルを、室温で１５分間、Ｃｙｔｏｎｉｎで透過処理し、その後、水により洗浄した。内因性ペルオキシダーゼの失活化を、３％のＨ２Ｏ２を含むメタノールを用いて室温で５分間行った。スライドガラスをＰＢＳにより洗浄し、ＴｄＴをビオチン化ヌクレオチドにより３７℃で１時間標識し、その後、ＰＢＳにより洗浄した。スライドガラスをストレプトアビジン−ＨＲＰと１０分間インキュベーションし、ＰＢＳにより２回洗浄し、基質（ジアミノベンジジン）を用いて発色させた。
（実施例１）
ｓｃＦｖは大きい親和性で変異型ｐ５３の共通エピトープと結合する
変異型ｐ５３の共通エピトープと特異的に結合するｓｃＦｖを特定するために、配置可能な単鎖抗体のヒト合成コンビナトリアルライブラリー（Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００４、ＪＭＢ、３３５、１７７〜１９２）を、ビオチン化ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）ペプチドおよびストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ）を使用してスクリーニングした。
２０個のｓｃＦｖが、変異型ｐ５３の共通エピトープを使用してバイオパンニングによって選択された−図１ａ〜図１ｂは、変異型ｐ６３の共通エピトープのＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）ペプチドを用いたバイオパンニングによって選択される単離されたｓｃＦｖの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＨＬ）のアミノ酸配列を示す。表３（下記）は、単離され、また、図１ａ〜図１ｂならびに表４および表５に記載されるすべてのｓｃＦｖクローンの可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
表４および表５（下記）は、ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）ペプチドに対して選択される単離されたｓｃＦｖの可変軽鎖のＣＤＲ（表４）および単離されたｓｃＦｖの可変軽鎖の特有のＣＤＲ（表５）を示す。
ｓｃＦｖのＦ２、Ａ４およびＢ６は、変異型ｐ５３の共通エピトープに対して特異的である−Ｆ２ｓｃＦｖ、Ａ４ｓｃＦｖおよびＢ６ｓｃＦｖを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、ＦＲＨＳＶＶペプチド（配列番号１）、β−アミロイドペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ；配列番号２）、ＭＡＰ−ＰｒＰペプチド（ＤＹＥＤＲＹＹＲＥ；配列番号３）およびＰａＰペプチド（ＩＬＬＷＱＰＩＰＶ；配列番号４）に対するそれらの結合能について調べた。図９に示されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ、Ａ４ｓｃＦｖ、および、より小さい程度ではあるが、Ｂ６ｓｃＦｖは、変異型ｐ５３の共通エピトープに由来するペプチドに対する大きい親和性を示した。他方で、これらの抗体は、試験された他のペプチドまたはタンパク質に対しては低い親和性を示した。
ｓｃＦｖ Ｆ２抗体およびＥ６抗体は変異型エピトープの大きい親和性結合を示す−標的ペプチド（配列番号１）に対する単離されたｓｃＦｖの親和性結合を明らかにするために、ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いた。ペプチド（ＦＲＨＳＶＶ；配列番号１）のビオチン共役体をストレプトアビジン被覆センサーチップ表面に固定化し、結合特異性を、精製されたＦ２ｓｃＦｖおよびＥ６ｓｃＦｖの増大する濃度を使用して求めた。図２ａ〜図２ｂに示されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ（図２ａ）およびＥ６ｓｃＦｖ（図２ｂ）はともに、変異型ｐ５３の共通エピトープとそれぞれ１．１ｘ１０−８Ｍおよび４．６ｘ１０−１４Ｍの親和性で結合することができた。これらの結果は、治療的適用のために好適な親和性を有する、ｐ５３の共通エピトープに向けられたヒト抗体の単離を初めて明らかにしている。
Ｆ２抗体およびＡ４抗体は変異型ｐ５３の共通エピトープに対して特異的である−図９に示されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ、Ａ４ｓｃＦｖおよびＢ６ｓｃＦｖを使用して行われたＥＬＩＳＡでは、Ｆ２抗体およびＡ４抗体が、変異型ｐ５３の共通エピトープに由来するペプチド（配列番号１）に対して非常に特異的であることが明らかにされた。
（実施例２）
単離されたｓｃＦｖは、大きい立体配座変化を有する完全な変異型ｐ５３タンパク質と結合する
完全なｐ５３分子に対する単離されたｓｃＦｖの結合能を明らかするために、ＥＬＩＳＡプレートを、ｓｆ９昆虫細胞で産生された組換えの野生型ｐ５３または変異型ｐ５３−Ｒ１７５Ｈ、変異型ｐ５３−Ｒ２４８Ｈおよび変異型ｐ５３−Ｒ２７３Ｗの完全なタンパク質により被覆し、１００ｎｇ〜５００ｎｇのｓｃＦｖ Ｆ２を加えた。
図３に示されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ（これはまた、本明細書中ではＴＡＲ１と称される）精製抗体は様々なｐ５３タンパク質に対して特異的に結合した。野生型ｐ５３タンパク質に対するＦ２ｓｃＦｖの結合は比較的低かった（約０．１のＯＤ４９２ｎｍ）が、大きい立体配座変化を示すｐ５３変異体（例えば、Ｒ１７５Ｈ）、または、中間的な立体配座変化を示すｐ５３変異体（例えば、Ｒ２４８Ｗ）に対する結合は著しく大きかった（０．２５を超えるＯＤ４９２ｎｍ）。従って、共通する変異型エピトープのより大きい露出をもたらすｐ５３タンパク質における大きい立体配座変化は本発明の抗体に対してより感受性がある。
これらの結果から、野生型ｐ５３タンパク質に影響を及ぼすことなく、変異型ｐ５３タンパク質を特異的かつ特異的に標的化するための本発明の抗体（例えば、Ｆ２ｓｃＦｖ）の使用が示唆される。
（実施例３）
Ｆ２ｓｃＦｖ抗体（ＴＡＲ１）は、変異型ｐ５３を発現する細胞においてアポトーシスを誘導し、コロニー形成を阻害する
野生型ｐ５３のアポトーシス活性は、その腫瘍サプレッサー機能に大きく寄与するものである。しかしながら、この活性は、ｐ５３が変異しているときには失われる。Ｆ２ＳＣＦＶ（ＴＡＲ１）が変異型ｐ５３に対するアポトーシス機能を回復させ得るかどうかを明らかにするために、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３タンパク質を安定的に発現するガン細胞株をＴＡＲ１で処理し、アポトーシスに対する影響を、下記のようにＦＡＣＳ分析およびＴＵＮＥＬ分析を使用して明らかにした。
Ｆ２ｓｃＦｖ（ＴＡＲ１）はアポトーシスを誘導することができる−精製された単離Ｆ２ｓｃＦｖ抗体（ＴＡＲ１）を、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３タンパク質を発現するＨ１２９９ヒト肺ガン細胞においてアポトーシスを誘導するその能力について調べた。図４ａ〜図４ｊおよび図１５ａ〜図１５ｄに示されるように、変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３タンパク質を発現する細胞において、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体（ＴＡＲ１）による２４時間の処理はアポトーシスを用量依存的な様式（０．５μＭおよび２μＭのＦ２ｓｃＦｖの存在下で約１３％および約３２％のアポトーシス細胞、それぞれ、図４ａ〜図４ｅおよび図１５ａ〜図１５ｂ）で誘導した一方で、Ｒ１７５Ｈのｐ５３タンパク質を発現しない肺ガン細胞では、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体はアポトーシスを誘導しなかった（図４ｆ〜図４ｊおよび図１５ｃ〜図１５ｄ）。
同様な結果が、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを安定的に発現するＨＣＴ１１６結腸ガン細胞を１μＭのＴＡＲ１により２４時間処理したときに得られた。図１５ｅ〜図１５ｈに示されるように、ＴＡＲ１は、ＤＮＡ断片化および細胞死を示して、亜Ｇ１のＤＮＡ含有量を有する細胞の割合において実質的な増大を引き起こした（図１５ｆ）。アポトーシスの誘導が、野生型ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞では明らかではなく（図１５ｈ）、これは、ＴＡＲ１によるアポトーシスの誘導が変異型ｐ５３に依存していることを示している。
これらの結果は、図１６ａ〜図１６ｄに示されるＴＵＮＥＬアッセイによって裏付けられた。アポトーシス細胞の染色が、非処理の細胞（図１６ａ）ではなく、ＴＡＲ１で処理された、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを発現するＨ１２９９細胞においてのみ明白であった（図１６ａ）。細胞がＴＡＲ１で処理された（図１６ｄ）か、または、処理されなかった（図１６ｃ）かにかかわらず、ｐ５３についてヌルであるＨ１２９９細胞では染色が全く観測されなかった。
ＴＡＲ１は、内因性の変異型ｐ５３タンパク質を発現するガン性細胞株においてアポトーシスによる細胞死を誘導することができる−細胞死に対するＴＡＲ１の影響を、それらのｐ５３コアドメインにおいて異なる点変異を内因的に発現する９個のヒト腫瘍細胞株の一団においてさらに調べた。これらは様々な腫瘍タイプを表し、結腸（ＫＭ１２−Ｃ、ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏｎ３２０）、乳房（Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１）、脳（例えば、神経芽細胞腫ＬＡＮ１）および膵臓（ＰＡＮＣ１）を含む。細胞を１μＭのＴＡＲ１で２４時間処理し（図１７ｂ、図１７ｄ、図１７ｆ、図１７ｈ、図１７ｊ、図１７ｌ、図１７ｎ、図１７ｐ、図１７ｒ）、または、非処理のままにし（図１７ａ、図１７ｃ、図１７ｅ、図１７ｇ、図１７ｉ、図１７ｋ、図１７ｍ、図１７ｏ、図１７ｑ）、アポトーシスに対する影響を、ＦＡＣＳ分析を使用して評価した。図１７ａ〜図１７ｒに示されるように、ＴＡＲ１処理は、亜Ｇ１画分における細胞の蓄積によって明らかにされるように、それらの点変異の性質または腫瘍タイプにかかわらず、すべての試験された細胞株においてアポトーシスの特異的な誘導をもたらした。
Ｆ２ｓｃＦｖを発現する細胞は低下したコロニー形成を示す−アポトーシスおよび細胞成長に対するＦ２ｓｃＦｖ抗体の影響をさらに実証するために、変異型ｐ５３タンパク質（Ｒ１７５Ｈ）を有する細胞を、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体を有する発現ベクターにより安定的にトランスフェクションし、細胞成長に対する影響を、５００細胞／プレート〜１０００細胞／プレートが播種された組織培養物において明らかにした。図６ａ〜図６ｄに示されるように、コロニー数およびコロニー面積の両方が、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体を発現する細胞において著しく低下した。
まとめると、これらの結果から、本発明のＦ２ｓｃＦｖ抗体はアポトーシスを誘導することができ、かつ、コロニー形成を阻害することができることが明らかにされる。これらの結果は、変異型ｐ５３を発現するガン細胞を治療することにおける本発明のｓｃＦｖ抗体の使用を示唆する。
Ｆ２ｓｃＦｖは、化学療法薬物に対する、変異型ｐ５３を発現する細胞の感受性を増大させる−一般的な化学療法薬物との組合せでの本発明のｓｃＦｖ抗体の可能性のある使用を調べるために、エトポシドおよびシスプラチンの薬物の影響を、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体の存在下または非存在下で、変異型ｐ５３を発現する細胞について調べた。図５に示されるように、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体を発現する細胞はシスプラチンの０．５μｇ／ｍｌまたはエトポシドの１μＭもの低い濃度でこれらの化学療法薬物に対して非常に感受性であったが、ｓｃＦｖ抗体を発現しないヒト肺ガン細胞はそのような薬物に対してそれほど感受性ではなかった。
これらの結果から、ガンを他の薬物との組合せで治療することにおける本発明のｓｃＦｖ抗体の使用がさらに示唆される。
（実施例４）
Ｆ２ｓｃＦｖ抗体は腫瘍成長をインビボで抑制する
腫瘍細胞の成長をインビボで阻害する本発明のｓｃＦｖ抗体の能力を調べるために、ヌードマウスにヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ）の皮下注射を行った。３日後、マウスは、２週間にわたって１日おきに繰り返されたｓｃＦｖ Ｆ２（２００μｇ）またはＰＢＳ（５０μｌ）の腫瘍内注射を受けた。図７に示されるように、ＰＢＳにより処理されたマウスでは、腫瘍サイズが接種後２８日〜３６日のうちに劇的に増大した一方で、Ｆ２ｓｃＦｖにより処理されたマウスでは、腫瘍サイズが３６日後でさえ変化しないままであった。図８ａ〜図８ｆは、Ｆ２ｓｃＦｖにより処理されたマウスにおける腫瘍の抑制を示す。まとめると、これらの結果は、腫瘍成長をインビボで抑制することにおける精製Ｆ２ｓｃＦｖ抗体の使用を明らかにしている。
（実施例５）
変異型ｐ５３への野生型ｐ５３立体配座の復帰
本発明者らは、変異型ｐ５３に対するＴＡＲ１（すなわち、Ｆ２ｓｃＦｖ抗体）の結合が野生型タンパク質の折り畳みを回復し得るかどうかを明らかにするために、生化学的方法および生物物理的方法を下記のように用いた。
実験結果
ＴＡＲ１は、ｐ５３のＲ１７５Ｈ変異体へのｍＡｂ１６０（野生型ｐ５３に特異的な抗体）の結合を増大させる−野生型ｐ５３タンパク質およびＲ１７５Ｈの変異型ｐ５３タンパク質のｐ５３コアドメイン（配列番号１３５によって示されるｐ５３タンパク質のアミノ酸９４〜３１２を含む；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００５３７）の組換えポリペプチドを、立体配座特異的なモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイおよび免疫沈殿アッセイに供した。最初の工程は、精製された組換えコアドメインタンパク質が野生型ｐ５３タンパク質および変異型ｐ５３タンパク質の特異的な立体配座を示すことを明らかにすることであった。変異型の立体配座に対して特異的であるＴＡＲ１抗体（これは、ｍＡｂ２４０と同じエピトープを認識する）（図１０ａ）および野生型の立体配座に対して特異的であるｍＡｂ１６２０（Ａｂｃａｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ、英国）（図１０ｂ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより、これが実際に事実であることが確認された。変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈのコアドメインおよび野生型のコアドメインに対するＴＡＲ１の結合は、３７℃で３０分間または６０分間加熱したとき、変異型コアドメインのｍＡｂ１６２０陽性割合における３倍の増大をもたらし、野生型コアドメインのアンフォールディングの防止および野生型ｐ５３の立体配座の安定化をもたらした（図１０ｃおよび図１０ｄ）。変異型ｐ５３の立体配座について特異的であるが、ＴＡＲ１以外のエピトープに結合するという結果を実証するために、ｍＡｂ ＤＯ−１２（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ、英国）を免疫沈殿アッセイにおいて用いた。変異型ｐ５３のコアドメインに対するＴＡＲ１の結合は、ＤＯ−１２陽性画分における劇的な減少を引き起こすが、野生型コアドメインに対する影響は何らなかった。
ＴＡＲ１との結合は変異型ｐ５３のスペクトルでの変化を引き起こす−円二色性は、溶液におけるタンパク質の二次構造を分析するための方法であり、タンパク質−タンパク質の相互作用がタンパク質の立体配座を変化させるどうかを明らかにすることができる。タンパク質における立体配座変化は、個々の成分の和とは異なるスペクトルをもたらす。円二色性の方法を、ＴＡＲ１抗体および野生型ｐ５３コアドメインまたは変異型ｐ５３コアドメインを使用して用いた。ＴＡＲ１の結合は変異型ｐ５３のスペクトルにおける変化を引き起こし、一方、野生型コアドメインのスペクトルでは、ＴＡＲ１および変異型ｐ５３の複合体における立体配座変化を示す差がほとんど観測されなかった。野生型ｐ５３とのＴＡＲ１複合体、および、変異体ｐ５３とのＴＡＲ１複合体の両方のスペクトルは非常に類似しており、これは立体配座の類似性を示している（図１２）。
変異型ｐ５３を発現する細胞のＴＡＲ１処理はそのような細胞の抽出物に対するｍＡｂ１６２０の結合を増大させる−図１１ｂに示されるように、変異型ｐ５３の立体配座における変化を、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを安定的に発現するＨ１２９９細胞において検出することができた。この細胞をＴＡＲ１で処理したとき、野生型に特異的な抗体ｍＡｂ１６２０による免疫沈殿によって判断されたように、野生型の立体配座を取る細胞の割合の増大が観測された。
まとめると、これらの結果から、ＴＡＲ１は野生型の立体配座を変異型ｐ５３のコアドメインに戻すことができることが明らかにされる。
（実施例６）
ＴＡＲ１は変異型ｐ５３に対する転写のトランス活性化を回復する
野生型ｐ５３の標的遺伝子の転写をトランス活性化する能力の喪失は、変異型ｐ５３の特徴的な特徴の１つである。本発明者らは、変異型ｐ５３を発現する細胞においてＰ５３の転写のトランス活性化機能を回復するＴＡＲ１の能力を下記のように調べている。変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈタンパク質を安定的に発現するＨ１２９９細胞をＴＡＲ１で２４時間処理し、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＢａｘの発現レベルをウェスタンブロット分析によって調べた。ＴＡＲ１による細胞の処理は、３つの内因性の野生型ｐ５３標的遺伝子のｐ２１（図１３ａ）、ＭＤＭ２（図１３ｂ）およびＢａｘ（図１３ｄ）の発現レベルにおける濃度依存的な様式での増大をもたらした。チューブリンの発現レベルは、それぞれの実験で使用されたタンパク質レベルについての内部コントロールとして役立った（図１３ｅ〜図１３ｈ）。さらに、いくつかの変異型ｐ５３タンパク質は、野生型ｐ５３によって活性化される遺伝子とは異なる遺伝子の転写をトランス活性化することが示されており、そのような遺伝子の１つがＥＧＲ１である。図１３ｃに示されるように、ＴＡＲ１による細胞の処理は、処理された細胞におけるＥＧＲ１のより低い発現によって明らかにされるように、変異型ｐ５３タンパク質の機能獲得活性を無効にした。
従って、これらの結果から、本発明のＴＡＲ１抗体は、野生型に特異的な標的遺伝子（例えば、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＢａｘ）の転写のトランス活性化機能を回復させることができ、また、変異体ｐ５３の転写活性化を防止できることが明らかにされる。
（実施例７）
ウイルス呈示ビヒクルは有用な治療剤である
本発明者らは、本発明の抗ｐ５３抗体（例えば、ＴＡＲ１）を目的の細胞に送達するために使用することができる、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に侵入することができるウイルス呈示ビヒクルを下記のように設計している。
ＰＴＤ（例えば、図１８ａ〜図１８ｂに示されるようなペプチドＰＥＰ）をコートタンパク質ＶＩＩＩ上に発現する繊維状ファージ（ｆｕｓｅ８８）。ＰＥＰペプチド（配列番号１３６）は細胞内へのファージの侵入を可能にする。繊維状ファージはまた、タンパク質ＩＩＩ上のＮＬＳ（配列番号１３４）に融合された本発明のｓｃＦｖ（例えば、ＴＡＲ１）を含む。ＮＬＳペプチドはファージの核局在化を可能にする。図１８〜図２１に示される結果は、ファージＰＥＰは様々な哺乳動物細胞に侵入することができ、また、これらの細胞に対して毒性作用を何ら有しないことを明らかにしている。そのような繊維状ファージ（すなわち、ウイルス呈示ビヒクル）は、脳腫瘍の治療のための治療剤として鼻腔内投与することができる。
従って、これらの結果は、ｐ５３関連の疾患を治療するための、本発明の抗ｐ５３抗体を含むウイルス呈示ビヒクルの使用を明らかにしている。
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
変異型ｐ５３の共通エピトープ（ＦＲＨＳＶＶ；配列番号１）と結合することについて選択された２０個のヒトｓｃＦｖクローンのアミノ酸配列アラインメントを示す。 ＦＲＨＳＶＶ（配列番号１）エピトープに対するＦ２ｓｃＦｖクローン（これはまた本明細書中では「ＴＡＲ１」として示される）の結合（図２ａ）およびＥ６ｓｃＦｖクローンの結合（図２ｂ）を示す。 ＥＬＩＳＡを使用して明らかにされるような、完全なｐ５３分子に対するｓｃＦｖ Ｆ２の結合を示す棒グラフである。 ホットスポット変異Ｒ１７５Ｈを有するヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ）におけるアポトーシスに対するｓｃＦｖ Ｆ２の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 ホットスポット変異Ｒ１７５Ｈを有するヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈ；図４ｄ〜図４ｅ）、ｐ５３ヌルヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９ｐ５３−／−；図４ｆ）におけるアポトーシスに対するｓｃＦｖ Ｆ２の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 ｐ５３ヌルヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９ｐ５３−／−；図４ｇ〜図４ｉ）におけるアポトーシスに対するｓｃＦｖ Ｆ２の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 ｐ５３ヌルヒト肺ガン細胞（Ｈ１２９９ｐ５３−／−；図４ｊ）におけるアポトーシスに対するｓｃＦｖ Ｆ２の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 ｓｃＦｖ Ｆ２抗体を発現する細胞の、薬物処理に対する増大した感受性を示す棒グラフである。 ｓｃＦｖ Ｆ２抗体を発現する肺ガン細胞におけるコロニー形成の阻害を示す。 マウスにおけるヒト腫瘍細胞異種移植片に対するｓｃＦｖ Ｆ２の抗腫瘍効果を示すグラフである。 インビボでの腫瘍成長に対するｓｃＦｖ Ｆ２抗体の影響を示す。 インビボでの腫瘍成長に対するｓｃＦｖ Ｆ２抗体の影響を示す。 ｓｃＦｖの結合特異性を示す棒グラフである。 ＴＡＲ１抗体（図１０ａ）、または、野生型ｐ５３について特異的なｍＡＢ１６２０（図１０ｂ〜図１０ｄ）を使用して組換えｐ５３の野生型コアドメインまたは変異型コアドメインに対して行われたＥＬＩＳＡアッセイを示す棒グラフである。 野生型ｐ５３またはＲ１７５Ｈ変異型ｐ５３に対するｍＡｂ ＤＯ−１２ｍＡｂ（ｐ５３変異体に特異的な抗体）の結合を示す免疫沈殿アッセイである。 ＴＡＲ１抗体の存在下における野生型またはＲ１７５Ｈ変異体のｐ５３コアドメインのスペクトルを示す円二色性分析である。 抗ｐ２１抗体（図１３ａ）、抗ＭＤＭ２抗体（図１３ｂ）、抗Ｅｇｒ１抗体（図１３ｃ）、抗Ｂａｘ抗体（図１３ｄ）および抗チューブリン抗体（図１３ｅ〜図１３ｈ）によりプローブされた、Ｈ１２９９細胞が発現するＲ１７５Ｈ変異体ｐ５３の抽出物のウェスタンブロット分析である。 図１３ａ〜図１３ｈに示されるウェスタンブロット分析の定量化を示す棒グラフである。 変異型ｐ５３を発現するＨ１２２９−Ｒ１７５Ｈ細胞（図１５ａ〜図１５ｂ）、ｐ５３ヌルＨ１２９９ヒト肺ガン細胞（図１５ｃ〜図１５ｄ）におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示す蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析である。 変異体Ｒ１７５Ｈのｐ５３を発現するＨＣＴ１１６結腸ガン細胞（図１５ｅ〜図１５ｆ）、野生型ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６結腸ガン細胞（図１５ｇ〜図１５ｈ）におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示す蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析である。 １μＭのＴＡＲ１の非存在下（図１６ａおよび図１６ｃ）または存在下（図１６ｂおよび図１６ｄ）における、ｐ５３についてヌルであるＨ１２９９細胞（図１６ｃ〜図１６ｄ）、または、変異型ｐ５３のＲ１７５Ｈを発現する細胞（図１６ａ〜図１６ｂ）のＴｄＴ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）である。 異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 異なるｐ５３変異を内因的に発現する９個の細胞株におけるアポトーシスに対するＴＡＲ１（ｓｃＦｖ−Ｆ２）の影響を示すＦＡＣＳ分析である。 ＰＥＰ内在化ペプチドを含むファージの構築を示す概略的例示である。 ＣＨＯ細胞におけるファージＰＥＰの免疫蛍光分析を示し、ファージの内在化がファージ濃度に依存することを明らかにする共焦点顕微鏡像である。 ＣＨＯ細胞におけるファージＰＥＰの免疫蛍光分析を示し、ファージが哺乳動物細胞ＣＨＯ細胞の中に侵入することを明らかにする共焦点顕微鏡像である。 ファージＰＥＰとのインキュベーションの後でのＣＨＯ細胞のＭＴＴ分析を示す棒グラフである。
配列番号１は、変異体ｐ５３の共通エピトープの合成ペプチドである。
配列番号２は、ベータアミロイドのアミノ酸１〜１６に対応するペプチドである。
配列番号３は、ヒトプリオンタンパク質を呈示する多数の抗原ペプチドのアミノ酸１４４〜１５３に対応するペプチドである。
配列番号４は、前立腺癌抗原に対応するペプチドである。
配列番号５〜７は、可変重鎖の配列である。
配列番号８〜６５、１１１及び１１２は、可変軽鎖の配列である。
配列番号６６〜１１０は、軽鎖特異的ＣＤＲの配列である。
配列番号１１３〜１３２は、単一鎖Ｆｖの配列である。
配列番号１３３は、ＴＡＴペプチドの配列である。
配列番号１３４は、核局在化シグナルの配列である。
配列番号１３６は、細胞内面化ペプチドの配列である。

Claims (34)

  1. 野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である、単離されたポリヌクレオチド。
  2. ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むＣＤＲ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
  3. 請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチドを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
  4. 野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である、単離されたポリペプチド。
  5. ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  6. 請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
  7. 野生型ｐ５３タンパク質によってではなく、ｐ５３変異型タンパク質によって共有される露出したエピトープと特異的に結合することができるポリペプチドを表面に発現するウイルス呈示ビヒクルを含む組成物であって、前記特異的結合の親和性は２５ナノモル濃度未満である、組成物。
  8. ＣＤＲ配列番号８〜配列番号１１２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含むＣＤＲ含有ポリペプチドを表面に発現するウイルス呈示ビヒクルを含む組成物。
  9. 請求項７または８に記載のウイルス呈示ビヒクルを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
  10. 請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチドと、細胞において、前記単離されたポリヌクレオチドの発現を指向させるためのプロモーターとを含む核酸構築物。
  11. ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導する方法であって、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドをガン細胞と接触させるか、または、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドをガン細胞において発現させ、それにより、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導することを含む、方法。
  12. ｐ５３関連のガンに罹患しているか、または、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する対象を治療する方法であって、治療効果的な量の請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドを対象に投与するか、または、治療効果的な量の請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドを対象の細胞において発現させ、それにより、対象におけるｐ５３関連のガンを治療することを含む、方法。
  13. ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導する方法であって、請求項７または８に記載のウイルス呈示ビヒクルをガン細胞と接触させ、それにより、ガン細胞のアポトーシスおよび／または成長停止を誘導することを含む、方法。
  14. ｐ５３関連のガンに罹患しているか、または、ｐ５３関連のガンに対する素因を有する対象を治療する方法であって、治療効果的な量の請求項７または８に記載のウイルス呈示ビヒクルを対象に投与し、それにより、対象におけるｐ５３関連のガンを治療することを含む、方法。
  15. ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドの使用。
  16. ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
  17. ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための請求項１０に記載の核酸構築物の使用。
  18. ｐ５３関連のガンを治療するために特定される医薬品を製造するための請求項７または８に記載のウイルス呈示ビヒクルの使用。
  19. （ａ）対象の生物学的サンプルを、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドと、ｐ５３変異型タンパク質とを含む免疫複合体の形成のために好適な条件のもとで、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチドと接触させること、および
    （ｂ）前記免疫複合体の形成を検出し、それにより、対象におけるガンを診断することを含む、対象におけるｐ５３関連のガンを診断する方法。
  20. 前記エピトープは配列番号１によって示される、請求項１、３、４、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  21. 前記ポリペプチドは、配列番号３９〜配列番号４１、配列番号４５〜配列番号４７および配列番号６０〜配列番号６２からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１、３、４、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  22. 前記ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、単一ドメイン抗体および抗体からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  23. 前記単鎖抗体は、配列番号１１３、配列番号１１４および配列番号１１５からなる群から選択される、請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  24. 前記ポリペプチドに融合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の核酸構築物。
  25. 前記ＮＬＳは配列番号１３４によって示される、請求項２４に記載の核酸構築物。
  26. 前記ポリヌクレオチドは、薬物をコードするさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１、２、３、１０、１６および１７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、医薬組成物、核酸構築物、使用または方法。
  27. 前記ポリペプチドは、薬物のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  28. 前記ポリペプチドは薬物に結合されている、請求項４、５、６、１１、１２および１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、医薬組成物、使用または方法。
  29. 前記薬物はトキシンおよび／または化学療法薬物である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、組成物、使用または方法。
  30. 前記ポリヌクレオチドは、検出可能な標識をコードするさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１、２および１０のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸構築物。
  31. 前記ポリペプチドは、検出可能な標識をさらに含む、請求項１、２、４、５、７、８、１０および１９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、核酸構築物、組成物または方法。
  32. 前記検出可能な標識はビオチンおよびジゴキシゲニンである、請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、核酸構築物、組成物または方法。
  33. 前記生物学的サンプルは、血液、リンパ節生検物、骨髄吸引物および組織サンプルからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  34. 前記Ｆａｂフラグメント、前記Ｆｖフラグメント、前記単鎖抗体、前記単一ドメイン抗体および前記抗体のそれぞれがヒト化されている、請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリペプチド、医薬組成物、核酸構築物、使用または方法。
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