CN114574524A - 一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用,所述方法包括如下步骤:(1)制备CRISPR‑Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;(2)使用CRISPR‑Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR‑Cas9稳定株;(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR‑Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。通过所述方法筛选到的肝癌抑癌基因在肝癌药物筛选和/或药效评价中的具有重要应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用。
背景技术
在全球范围内,肝癌是癌症相关死亡的第四大原因,在新发病例数量方面排名第六。肝癌的5年生存率仅为18%,是胰腺癌之后死亡率排名第二的致死性肿瘤。由于肝脏是一类高度异质性的组织结构,肝癌也成了一类十分复杂的肿瘤。临床上,许多患者被确诊时已处于晚期,而现有的临床治疗方案都难以有效提高患者的生存率。因此,急需新的生物标志物和药物靶点来有效地治疗这种疾病。
目前,基因筛选已被广泛应用于肝癌的驱动基因的筛选中。转座子和慢病毒的随机插入突变可以诱导基因功能的增加或减少,能快速地识别肝癌的驱动基因,然而转座子和慢病毒的随机插入存在偏好性,因此,这类正向遗传筛选存在局限性。短发夹RNA(shRNAs)的RNA干扰筛选也被用于肝癌的研究,然而shRNA文库不能达到基因组规模的覆盖,而且RNA干扰不能完全敲除目的基因。
新一代基因编辑技术CRISPR-Cas9以其操作简单和通用的独特优势,成为了开展正向遗传学筛选实验的强有力的工具。利用CRISPR-Cas9技术建立与某类功能相关的sgRNA文库,通过功能性筛选、富集、PCR扩增及深度测序分析筛选功能相关的基因。目前,利用全基因组范围敲除的筛选系统存在细胞量的限制,其中原代肝脏细胞虽为最理想的肝细胞源,但其保存成本较高,难以体外扩增,其来源短缺同时涉及伦理问题,因此,不适合作为修饰细胞进行筛选。
基于肝癌转化的全基因组筛选研究仍局限于鼠源化肝脏细胞、肝癌细胞系或转分化类肝细胞,虽然动物源性肝细胞的来源较广,且具有正常肝细胞的功能,但是有发生免疫排斥及异种来源的反转录病毒感染的风险。此外,肿瘤肝细胞也存在有致瘤风险和肝功能不足等缺陷。
目前常用的小鼠肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)模型主要有化学诱导、移植和基因修饰等类型。这类小鼠HCC模型可以在原位诱导肝癌的发生,但存在稳定性差、造模周期长和非人源化模型的局限性。
因此,开发一种新的理想的肝细胞源和全基因组筛选肝癌抑制基因的方法,筛选获得新的生物标志物和药物靶点,对肝癌的临床治疗具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用。通过所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法能够筛选获得新的生物标志物和药物靶点,通过所述方法筛选到13种肝癌抑癌基因,对肝癌的临床治疗具有重要意义;本发明还提供了一种适用性广的转化肝细胞为永生化肝细胞的方法,所述方法可以实现人肝细胞的体外大量扩增,同时还可保留其正常肝细胞功能,所述方法制备的永生化肝细胞是新的理想的肝细胞源,能够作为筛选肝癌抑癌基因的工具细胞,具有广阔的应用前景。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤:
(1)制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株;
(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。
本发明中,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法首先将正常人肝细胞诱导为永生化肝细胞,提供一种用于筛选肝癌抑癌基因的工具细胞,再利用人类全基因组sgRNA文库筛选肝癌抑癌基因,最后利用人源化肝脏小鼠模型原位验证筛选所得候选基因的抑癌作用,为靶向肝癌治疗提供新的生物靶标,进一步为靶向肝癌治疗提供新的策略。
本发明利用人源化肝脏细胞在小鼠肝脏上形成的高度嵌合的人源化肝脏小鼠模型,对筛选所得的候选基因进行原位验证,可以一定程度上解决现存肝癌转化诱导模型不足的问题,同时可以还原肝脏的内环境,并更大程度地模拟人肝癌的发生和发展的过程。
优选地,步骤(1)中,所述CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒的制备方法包括如下步骤:
分别将含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表达质粒和含有sgRNA文库的慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染包装细胞,分别得到CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒。
优选地,所述含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表达质粒包括lenti-Cas9-Blast质粒。
优选地,所述sgRNA文库包括GeCKOv2.0。
由于肝脏是一类高度异质化的组织,肝癌细胞的基因组也存在高度异质性,存在许多潜在的驱动突变。在本发明中,所使用的人类全基因组sgRNA文库为GeCKOv2.0文库,所述GeCKOv2.0文库靶向19050个编码蛋白质的基因以及1864条microRNA。与转座子和慢病毒随机插入技术相比较,所述GeCKOv2.0文库可以无偏倚地在全基因组范围内改变基因的表达和功能;与shRNAs干扰技术相比较,所述GeCKOv2.0文库能完全敲除目的基因,以减少目的基因未被完全敲低而对筛选结果产生的干扰。
优选地,所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
优选地,所述包装细胞包括293T细胞。
优选地,步骤(2)中,所述使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株包括如下步骤:
将所述CRISPR-Cas9慢病毒接种于永生化肝细胞培养液中孵育,进行抗生素筛选,得到CRISPR-Cas9稳定株。
优选地,所述永生化肝细胞培养液的细胞密度为(1~2)×106cells/mL,例如可以是1×106cells/mL、1.2×106cells/mL、1.4×106cells/mL、1.6×106cells/mL、1.8×106cells/mL或2×106cells/mL等。
优选地,所述CRISPR-Cas9慢病毒的MOI为0.7以下,例如可以是0.7、0.6或0.5等。
优选地,所述抗生素包括杀稻瘟菌素。
优选地,步骤(3)中,所述使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞包括如下步骤:
将所述sgRNA文库慢病毒接种于所述CRISPR-Cas9稳定株培养液中,孵育,抗生素筛选,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞。
优选地,所述CRISPR-Cas9稳定株培养液的细胞密度为(2~2.5)×106cells/mL,例如可以是2×106cells/mL、2.1×106cells/mL、2.2×106cells/mL、2.3×106cells/mL、2.4×106cells/mL或2.5×106cells/mL等。
优选地,所述sgRNA文库慢病毒的MOI为0.3以下,例如可以是0.1、0.2或0.3等。
优选地,所述抗生素包括嘌呤霉素。
优选地,步骤(4)中,将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因包括如下步骤:
将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,提取收集肿瘤细胞,分别对所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞和肿瘤细胞进行基因组DNA分析,根据sgRNA的差异倍数筛选肝癌抑癌基因。
优选地,所述免疫缺陷的小鼠包括NSI小鼠。
优选地,所述筛选肝癌抑癌基因的标准为sgRNA的差异倍数在8以上,对应的基因为肝癌抑癌基因,sgRNA的差异倍数例如可以是8、8.5或9等。
在本发明中,通过对比所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞和肿瘤细胞的sgRNA的均一度,通过sgRNA的差异倍数筛选得到了13种肝癌抑癌基因,其中抑癌基因被敲除的永生化肝细胞的增殖抑制作用降低。
优选地,所述永生化肝细胞的构建方法包括如下步骤:
(a)制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒;
(b)用所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒转染正常人肝细胞,构建永生化肝细胞。
本发明中,所述永生化肝细胞的构建方法简单便捷,得到的永生化肝细胞在体外可无限扩增,不存在接触抑制,且形态与肝细胞相似,理论上任何人来源肝细胞都能够通过此方法制备成永生化肝细胞。
优选地,步骤(a)中,所述制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒包括如下步骤:
将含有TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒表达质粒、病毒包装质粒共转染包装细胞,得到含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒。
优选地,所述慢病毒表达质粒包括组成型质粒或诱导型质粒。
优选地,所述组成型质粒的载体包括pWPXLD载体。
优选地,所述诱导型质粒的载体包括FUW载体。
本发明中,用所述诱导型质粒制备的含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒进行转染,得到的永生化肝细胞无接触抑制,且细胞排列整齐,细胞形态呈多边形与肝细胞系形态相像。同时可以使用DOX控制永生化肝细胞的增殖速度,防止永生化肝细胞分化成瘤。
优选地,所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
优选地,所述包装细胞包括293T细胞。
优选地,步骤(b)中,用所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒转染正常人肝细胞,构建永生化肝细胞包括如下步骤:
将所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒与正常人肝细胞混合孵育,更换培养基继续传代培养,得到永生化肝细胞。
优选地,所述培养基包括DMEM培养基和/或InVitroGRO CP肝细胞培养基。
优选地,所述慢病毒转染前使用InVitroGRO CP肝细胞培养基培养正常人肝细胞。
优选地,所述慢病毒转染后使用DMEM培养基进行传代培养。
优选地,所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒的MOI为0.6~0.8,例如可以是0.6、0.7或0.8等。
作为本发明的优选技术方案,所述以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤:
(1)制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒:
分别将含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表达质粒和含有sgRNA文库的慢病毒表达质粒与psPAX2质粒和pMD2.G质粒共转染293T细胞,分别得到CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株:
将含有TP53R249S基因和MYC基因的组成型或诱导型慢病毒表达质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒共转染293T细胞,得到含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒;
用InVitroGRO CP肝细胞培养基培养正常人肝细胞,将所述含有TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒与正常人肝细胞混合后孵育,所述含有TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒的MOI为0.6~0.8,使用DMEM培养基继续传代培养,得到永生化肝细胞;
将所述CRISPR-Cas9慢病毒接种于细胞密度为(1~2)×106cells/mL的永生化肝细胞培养液中进行孵育,所述CRISPR-Cas9慢病毒的MOI为0.7以下,加入杀稻瘟菌素进行抗生素筛选,得到CRISPR-Cas9稳定株;
(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞:
将所述sgRNA文库慢病毒接种于所述CRISPR-Cas9稳定株培养液中,所述CRISPR-Cas9稳定株培养液的细胞密度为(2~2.5)×106cells/mL,所述sgRNA文库慢病毒的MOI为0.3以下,孵育,加入嘌呤霉素进行抗生素筛选,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因:
将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到NSI小鼠体内,收集肿瘤细胞,分别对所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞和肿瘤细胞进行基因组DNA分析,根据sgRNA的差异倍数筛选肝癌抑癌基因,所述筛选肝癌抑癌基因的标准为sgRNA的差异倍数在8以上,对应的基因为肝癌抑癌基因。
第二方面,本发明提供一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置包括:
(1)慢病毒制备模块:制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
(2)稳定株制备模块:制备永生化肝细胞,使用所述CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株;
(3)基因敲除模块:使用所述sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
(4)基因筛选模块:将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。
第三方面,本发明提供一种抑癌基因敲除的永生化肝细胞,所述抑癌基因由第一方面所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法筛选得到。
优选地,所述抑癌基因包括CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7或MIR873中任意一种或至少两种的组合。
第四方面,本发明提供第一方面所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法、第二方面所述的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置或第三方面所述的抑癌基因敲除的永生化肝细胞中任意一种或至少两种的组合在肝癌药物筛选和/或药效评价中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值,还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)所述永生化肝细胞的构建方法简单便捷,得到的永生化肝细胞能在体外可无限扩增,不存在接触抑制,且形态与肝细胞相似,理论上任何人来源肝细胞都能够通过此方法制备成永生化肝细胞。同时可以使用DOX控制永生化肝细胞的增殖速度,防止永生化肝细胞分化成瘤。
(2)本发明利用人源化肝脏细胞在小鼠肝脏上高度嵌合的人源化肝脏小鼠模型,对筛选所得的候选基因进行原位验证,可以一定程度上解决现存肝癌转化诱导模型不足的问题,同时可以还原肝脏的内环境,并更大程度地模拟人肝癌的发生和发展的过程。
(3)与转座子和慢病毒随机插入技术相比较,本发明所述的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法可以无偏倚地在全基因组范围内改变基因的表达和功能,与shRNAs干扰技术相比较,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法能完全敲除目的基因,以减少目的基因未被完全敲低而对筛选结果产生的干扰。
附图说明
图1为实施例1中组成型永生化肝细胞和原代肝细胞在光学显微镜下的检测结果图(比例尺=100μm)。
图2为实施例2中原代肝细胞和诱导型永生化肝细胞在光学显微镜下的检测结果图(比例尺=100μm)。
图3为实施例2中诱导型永生化肝细胞在在普通光学显微镜下的检测结果图(比例尺=100μm)。
图4为实施例2中诱导型永生化肝细胞在荧光显微镜下的检测结果图(比例尺=100μm)。
图5为实施例3中小鼠体内的肿瘤体积检测结果统计图。
图6为实施例3中对照组小鼠肿瘤的免疫组化分析结果图(比例尺=50μm)。
图7为实施例3中实验组小鼠肿瘤的免疫组化分析结果图(比例尺=50μm)。
图8为实施例3中实验组的肿瘤组织和全基因组敲除永生化肝细胞(对照组)的测序结果统计图。
图9为测试例1中CSK基因、NF2基因和PIK3CB基因敲除的验证结果统计图。
图10为测试例1中CNOT4基因、SRRD基因、PLEKHA1基因和PTEN基因敲除的验证结果统计图。
图11为测试例1中AAGAB基因、BTBD2基因、RELA基因、LRFN5基因、USP7基因和MIR873基因敲除的验证结果统计图。
图12为测试例1中PLEKHA1蛋白的western blotting检测结果和PLEKHA1基因的相对表达量的对比图。
图13为测试例1中CSK蛋白的western blotting检测结果和CSK基因的相对表达量的对比图。
图14为测试例1中PIK3CB蛋白的western blotting检测结果和PIK3CB基因的相对表达量的对比图。
图15为测试例1中RELA蛋白的western blotting检测结果图。
图16为测试例1中对照组的免疫组化分析结果图(比例尺=50μm)。
图17为测试例1中实验组的免疫组化分析结果图(比例尺=50μm)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种组成型永生化肝细胞,所述组成型永生化肝细胞的制备方法包括如下步骤:
(a)制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒:
分别合成MYC基因(所述MYC基因的序列来自于NCBI,参考序列:NM_002467.6)和TP53R249S基因(所述TP53R249S基因的序列来自于NCBI,WT-TP53参考序列:NM_000546.6),并将其克隆至pWPXLD载体上,测序正确后转化,挑单克隆,质粒中提,得到pWPXLD-TP53R249S/MYC-GFP质粒(组成型质粒)。
将状态良好的293T细胞接种于10cm培养皿中,待293T细胞生长到80%汇合度时,用含有1%FBS和1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基饥饿培养6h。
将PEI(72μg)加入0.5mL的opti-MEM培养基中,混匀,室温静置5min,得到预混好的opti-MEM PEI培养基。
将pWPXLD-TP53R249S/MYC-GFP质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒分别按照3:4:1的比例混合,加入opti-MEM培养基中并混匀;按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的opti-MEM培养基中,边滴加边摇晃混匀,室温静置25min。
将室温静置后的混合液逐滴加入饥饿培养的293T细胞培养皿中,轻轻摇晃混匀,37℃培养箱中培养,8h后换液继续培养,24h及48h分别收集上清并加入预热的含1%FBS和1%双抗的DMEM培养基。72h后收集上清,弃掉293T细胞,将3个时间点收集的慢病毒细胞培养液混合后过滤,得到pWPXLD-TP53R249S/MYC-GFP慢病毒溶液,置于4℃冰箱冷藏。
(b)用所述慢病毒转染正常人肝细胞构建永生化肝细胞:
将冻存肝细胞从液氮中取出,于37℃水浴锅摇晃解冻;调整肝细胞浓度后接种于10cm培养皿中,添加InVitroGRO CP肝细胞培养基,置于5%CO2的37℃的培养箱中培养4h后,更换新鲜培养基并去除未贴壁细胞,每两天更换新鲜培养基,感染病毒前控制细胞培养时间为2天。
以每皿1×106个细胞将原代肝细胞接种于直径10cm培养皿中,按照8mL/皿加含有10%FBS和1%双抗的DMEM培养基,置于37℃、5%CO2的条件下培养24h;
撤掉肝细胞培养上清,加入pWPXLD-TP53R249S/MYC-GFP慢病毒溶液10mL,12h后换新鲜培养基,得到组成型永生化肝细胞。
(c)对所得组成型永生化肝细胞进行生物学特征检测:
将培养14天的组成型永生化肝细胞和原代肝细胞在体外培养2天,分别将其置于光学显微镜下,观察其细胞形态。将所述组成型永生化肝细胞与原代肝细胞作对比。组成型永生化肝细胞和原代肝细胞在光学显微镜下的检测结果图如图1所示,其中,组成型永生化肝细胞的形态更为偏小,且细胞偏扁平状,但是细胞无接触抑制,在体外可无限扩增,不存在接触抑制,且形态与肝细胞相似。
利用免疫荧光染色法对组成型永生化肝细胞的肝细胞标记物及肝癌标记物进行检测,结果发现组成型永生化肝细胞同时表达正常肝细胞标记物(HLA、ALB、HNF4A)和肝癌细胞标记物(KRT19、GPC3、AFP),所述方法得到的永生化肝细胞可用于筛选肝癌抑制基因。
实施例2
本实施例提供一种诱导型永生化肝细胞,所述诱导型永生化肝细胞的制备方法包括如下步骤:
(a)制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒:
分别合成MYC基因和TP53R249S基因,并将其克隆至FUW载体上,测序正确后转化,挑单克隆,质粒中提,得到FUW-GFP-TP53R249S-MYC质粒(诱导型质粒)。
将状态良好的293T细胞接种于10cm培养皿中,待293T细胞生长到80%汇合度时,用含有1%FBS和1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基饥饿培养6h。
将PEI(72μg)加入0.5mL的opti-MEM培养基中,混匀,室温静置5min,得到预混好的opti-MEM PEI培养基。
将FUW-GFP-TP53R249S-MYC质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒分别按照3:4:1的比例混合,加入opti-MEM培养基中并混匀;按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的opti-MEM培养基中,边滴加边摇晃混匀,室温静置25min。
将室温静置后的混合液逐滴加入饥饿培养的293T细胞培养皿中,轻轻摇晃混匀,37℃培养箱中培养,8h后换液继续培养,24h及48h分别收集上清并加入预热的含1%FBS和1%双抗的DMEM培养基。72h后收集上清,弃掉293T细胞,将3个时间点收集的慢病毒细胞培养液混合后过滤,得到FUW-GFP-TP53R249S-MYC慢病毒溶液,置于4℃冰箱冷藏。
(b)用所述慢病毒转染正常人肝细胞构建永生化肝细胞:
将冻存肝细胞从液氮中取出,于37℃水浴锅摇晃解冻;调整肝细胞浓度后接种于10cm培养皿中,添加InVitroGRO CP肝细胞培养基,置于5%CO2的37℃的培养箱中培养4h后,更换新鲜培养基并去除未贴壁细胞,每两天更换新鲜培养基,感染病毒前控制细胞培养时间为2天。
以每皿1×106个细胞将原代肝细胞接种于直径10cm培养皿中,按照8mL/皿加含有10%FBS和1%双抗的DMEM,置于37℃、5%CO2的条件下培养24h。
撤掉肝细胞培养上清,加入FUW-GFP-TP53R249S-MYC慢病毒溶液10mL,12h后换新鲜培养基,得到诱导型永生化肝细胞。
(c)对所得诱导型永生化肝细胞进行生物学特征检测:
在诱导型永生化肝细胞的培养基中加入DOX诱导剂,细胞迅速增殖,将诱导型永生化肝细胞置于光学显微镜下观察其细胞形态,并与培养2天的原代肝细胞对比。原代肝细胞和诱导型永生化肝细胞在光学显微镜下的检测结果图如图2所示,其中,诱导型永生化肝细胞无接触抑制,且细胞排列整齐,细胞形态呈多边形与肝细胞系形态相像。
当在培养条件下停止使用DOX诱导剂时(-DOX),培养7天后经绿色荧光标记的诱导型永生化肝细胞在普通光学显微镜下的检测结果图如图3所示,在荧光显微镜下的检测结果图如图4所示,其中,绿色荧光强度可判断细胞中TP53R249S/MYC基因的表达水平。与未停药组(+DOX)的诱导型永生化肝细胞作对比,发现停止DOX用药后,诱导型永生化肝细胞增殖逐渐缓慢,显微镜下的细胞荧光强度逐渐减弱,7天后诱导基因逐渐关闭表达,最后荧光全部消失。结果表明,DOX药物可以用于控制诱导型永生化肝细胞的增殖速度,防止永生化肝细胞分化成瘤。
实施例3
本实施例提供一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤:
(1)制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒:
CRISPR-Cas9慢病毒的包装及纯化:
将状态良好的293T细胞接种于10cm培养皿中,待293T细胞生长到70%汇合度时,用含有1%FBS和1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基饥饿培养6h。
将PEI(72μg)加入0.5mL的opti-MEM培养基中,混匀,室温静置5min,得到预混好的opti-MEM PEI培养基。
将lenti-Cas9-Blast质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒分别按照3:4:1的比例混合,加入opti-MEM培养基中并混匀;按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的opti-MEM培养基中,边滴加边摇晃混匀,室温静置25min。
将室温静置后的混合液逐滴加入饥饿培养的293T细胞培养皿中,轻轻摇晃混匀,37℃培养箱中培养,8h后换液继续培养,24h及48h分别收集上清并加入预热的含1%FBS和1%双抗的DMEM培养基。72h后收集上清,弃掉293T细胞,将3个时间点收集的慢病毒细胞培养液混合后过滤,得到病毒上清液。
用75%酒精和紫外照射消毒超滤管后,将预先获得的病毒上清液置于超滤管中,6000g离心20min,收集滤膜上方的纯化病毒溶液,分装并保存于-80℃。
sgRNA文库慢病毒的包装及纯化:
在12个T225培养瓶中接种状态良好的293T细胞,待293T细胞生长到80%汇合度时,用含有1%FBS和1%双抗的DMEM培养基饥饿培养6h。
将PEI(72μg)加入0.5mL的opti-MEM培养基中,混匀,室温静置5min,得到预混好的opti-MEM PEI培养基。
将lentiguide-sgRNA-puro质粒(sgRNA文库质粒)、psPAX2质粒和pMD2.G质粒分别按照3:4:1的比例混合,加入opti-MEM培养基中并混匀;按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的opti-MEM培养基中,边滴加边摇晃混匀,室温静置25min。
将室温静置后的混合液逐滴加入饥饿培养的293T细胞培养皿中,轻轻摇晃混匀,37℃培养箱中培养,8h后换液继续培养,24h及48h分别收集上清并加入预热的含1%FBS和1%双抗的DMEM培养基。72h后收集上清,弃掉293T细胞,将3个时间点收集的慢病毒细胞培养液混合后离心并过滤,得到病毒上清液。
用75%酒精和紫外照射消毒超滤管后,将预先获得的病毒上清液置于超滤管中,6000g离心20min,收集滤膜上方的纯化病毒液,分装并保存于-80℃。
(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株:
CRISPR-Cas9慢病毒的转染:
提前测定好病毒的滴度以及永生化肝细胞对抗生素的最适筛选浓度。
以1×106cells/mL的细胞密度将永生化肝细胞接种于6孔板中,加入MOI等于0.7的CRISPR-Cas9慢病毒及8μg/mL的聚凝胺,并设置无病毒感染孔,作为抗生素筛选的对照孔。
感染12h后更换新鲜的含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基,置于5%CO2的37℃的培养箱中培养。
抗生素的筛选:
感染后48h,向感染孔和对照孔中加入杀稻瘟菌素,维持细胞汇合度不超过70%,并孵育3天至无病毒对照孔的细胞死尽,则抗生素筛选完成,存活细胞均为带杀稻瘟菌素抗性的CRISPR-Cas9稳定株。
(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞:
sgRNA文库病毒的转染:
将3×108个CRISPR-Cas9稳定株细胞以2×106cells/mL的密度接种于6孔板中,加入MOI小于0.3的sgRNA文库慢病毒及8μg/mL的聚凝胺,并设置无病毒感染孔,作为抗生素筛选的对照孔;感染12h后更换新鲜的含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基,置于5%CO2的37℃的培养箱中培养。
抗生素筛选:感染48h后,向感染孔和对照孔加入嘌呤霉素,维持细胞汇合度不超过70%,并孵育3天至无病毒对照孔的细胞死尽,则抗生素筛选完成,存活细胞均感染上sgRNA文库慢病毒,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞。
(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因:
将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞在体外培养7天,至Cas9蛋白将sgRNA靶点基因完全敲除后,在第7天,用胰酶消化并收集细胞,即抑癌基因敲除的永生化肝细胞。
将3×107个细胞冷冻以进行基因组DNA分析。剩余细胞以5×106cells/只移植到NSI小鼠的皮下腹股沟,移植sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞的小鼠作为肝癌抑癌基因筛选的实验组。
将未转染sgRNA病毒的CRISPR-Cas9稳定株以5×106cells/只移植到NSI小鼠的皮下腹股沟,作为肝癌肿瘤形成的对照组。
待实验组形成较大的肿瘤后,用颈椎脱臼法处死小鼠,收集肿瘤块以进行基因组DNA分析。对小鼠体内的肿瘤体积进行检测,小鼠体内的肿瘤体积检测结果如图5所示,结果发现与对照组相比,实验组(全基因组敲除组)小鼠体内肿瘤生长速率显著提升。同时对小鼠体内肿瘤进行免疫荧光染色分析,结果显示,实验组小鼠体内的肿瘤表达肝癌标记物,但是肝细胞标记物丢失。且进一步对实验组小鼠体内的肿瘤进行免疫组化分析,对照组小鼠肿瘤的免疫组化分析结果图如图6所示,实验组小鼠肿瘤的免疫组化分析结果图如图7所示,发现实验组小鼠体内的肿瘤中的P53下游的P21的表达量较对照组比更低,证明肿瘤细胞增殖抑制作用降低,肿瘤细胞的抑癌基因已被敲除。
对实验组小鼠体内的肿瘤组织和冷冻的sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞提取基因组DNA,分两步进行PCR测序,每个样本有至少以130μg的DNA为模板(假设106个细胞有6.6μg的gDNA),以达到sgRNA文库的300倍覆盖率。其中以10μg/100μL的体系进行PCR,然后将得到的扩增产物进行合并。第一次PCR扩增的引物包括F1和R1,F1的序列如SEQ IDNo.1所示,R1的序列如SEQ ID No.2所示:
SEQ ID No.1:
AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG;
SEQ ID No.2:
CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCC。
第二次PCR的引物包括一个可变长度的序列,以增加文库的复杂性,以及一个8bp的barcode序列。每个样本以不同长度的前端引物,分别从第一次PCR的扩增产物中取5μL进行第二次PCR。不同组别及不同生物学重复的样本用含不同barcode序列的末端引物以进行区分。两次PCR后,获得连接Illumina适配器和barcode的样本PCR产物。
第二次PCR扩增物用凝胶分离,收集提取260~280bp长度的产物,定量,混合并进行测序。用MAGECK软件进行测序结果分析,获得筛选后的高富集sgRNA序列。实验组小鼠体内的肿瘤组织和sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞(对照组)的测序结果统计图如图8所示,与对照组相比,实验组小鼠体内的肿瘤组织样本中的sgRNA均一度下降,sgRNA有所富集,说明筛选得到的全基因组敲除文库构建成功。
经过上述筛选方式进行筛选,sgRNA的差异倍数在8以上的基因为肝癌抑癌基因,得到了13种高富集的靶向基因分别包括CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7和MIR873。
测试例1
本测试例对实施例3中筛选得到的肝癌抑癌基因(CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7和MIR873)进行单基因敲除验证。
(1)sgRNA载体的构建:
根据筛选结果选择高富集的靶向基因作为验证的目的基因,合成靶向目的基因的sgRNA序列,并将其克隆到lentiguide-puro载体上,得到lentiguide-sgRNA-puro质粒,测序正确后转化,挑单克隆,质粒中提,获得无内毒素质粒以备包装病毒。
(2)慢病毒包装:
接种状态良好的293T细胞于10cm皿中,待293T细胞生长到75%汇合度时,用含有1%FBS和1%双抗的DMEM培养基饥饿培养5h。
将PEI(72μg)加入0.5mL的opti-MEM培养基中,混匀,室温静置5min,得到预混好的opti-MEM PEI培养基。
将lentiguide-sgRNA-puro质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒分别按照3:4:1的比例混合,加入opti-MEM培养基中并混匀;按1:1的比例将提前预混好的opti-MEM PEI培养基加入含有质粒的opti-MEM培养基中,边滴加边摇晃混匀,室温静置25min。
将室温静置后的混合液逐滴加入饥饿后的293T细胞培养皿中,轻轻摇晃混匀,37℃培养箱中培养,8h后换液继续培养,24h及48h分别收集上清并加入预热的含1%FBS和1%双抗的DMEM培养基。72h后收集上清,弃掉293T细胞,将3个时间点收集的慢病毒细胞培养液混合后过滤,将病毒溶液分装并保存于-80℃。
(3)慢病毒感染永生化肝细胞:
以细胞密度为2×106cells/mL将CRISPR-Cas9稳定株细胞接种于六孔板中,培养至汇合度达到80%。撤掉培养上清加入2mL lentiguide-sgRNA-puro慢病毒溶液,并设置无病毒感染孔,作为抗生素筛选的对照孔,12h后更换含10%FBS、1%双抗的DMEM新鲜培养基,继续置于5%CO2的37℃的培养箱中培养。
感染后48h,向感染孔和对照孔加入嘌呤霉素,维持细胞汇合度不超过70%,并孵育3天至无病毒对照孔的细胞死尽,则抗生素筛选完成,存活细胞均感染上lentiguide-sgRNA-puro慢病毒。
(4)单基因敲除的体内验证:
CRISPR-Cas9稳定株和目的基因(包括CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7或MIR873)被完全敲除的永生化肝细胞分别以2×106cells/只移植到NSI小鼠皮下腹股沟,作为抑癌基因单基因敲除验证的实验组,记录小鼠皮下肿瘤生长曲线。
将未转染sgRNA病毒的CRISPR-Cas9稳定株以2×106cells/只移植到NSI小鼠的皮下腹股沟,作为肝癌肿瘤形成的对照组。
待肿瘤生长至1.5×1.5cm,安乐死小鼠并收集体内肿瘤组织块。候选基因的单基因敲除验证结果如图9、图10和图11所示,其中,图9为CSK基因、NF2基因和PIK3CB基因敲除的验证结果统计图,图10为CNOT4基因、SRRD基因、PLEKHA1基因和PTEN基因敲除的验证结果统计图,图11为AAGAB基因、BTBD2基因、RELA基因、LRFN5基因、USP7基因和MIR873基因敲除的验证结果统计图。肿瘤体积检测结果发现,敲除CSK、PIK3CB、CNOT4、PTEN、PLEKHA1或RELA等抑癌基因后,随着培养天数增加,肿瘤块体积不断增大。说明单独敲除上述抑癌基因可有效促进永生化肝细胞分化为肝癌细胞。
敲除效率验证:
将肿瘤组织剪碎,提取蛋白,通过western blotting检测目的基因的蛋白水平,若实验组的肿瘤组织的蛋白水平与对照组的肿瘤组织蛋白水平相比显著性降低,则此次敲除未脱靶,目的基因的敲除在小鼠体内促进了肝癌的发展。western blotting检测结果如图12、图13、图14和图15所示,其中,图12为PLEKHA1蛋白的western blotting检测结果和PLEKHA1基因的相对表达量的对比图,图13为CSK蛋白的western blotting检测结果和CSK基因的相对表达量的对比图,图14为PIK3CB蛋白的western blotting检测结果和PIK3CB基因的相对表达量的对比图,图15为RELA蛋白的western blotting检测结果图,从图中可以看出目的基因的敲除效率均在50%以上。
单基因RELA敲除的体内EMT(上皮细胞向间质细胞的转变)相关标志物鉴定:
收集上述单敲RELA基因的小鼠,发现敲除RELA基因后,小鼠皮下发生了肿瘤转移,且通过免疫组化分析发现,RELA基因敲除的小鼠体内肿瘤中Vimentin、N-Cadherin以及E-Cadherin等EMT相关标志物上调,免疫组化分析结果如图16和图17所示,其中,图16为对照组的免疫组化分析结果图,图17为实验组的免疫组化分析结果图,说明RELA的敲除有效促进了永生化肝细胞向肝癌的转化。
综上,通过所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法筛选到13种肝癌抑癌基因,分别包括CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7或MIR873,所述肝癌抑癌基因对肝癌的临床治疗具有重要意义。本发明还提供了一种适用性广的转化肝细胞为永生化肝细胞的方法,所述方法可以实现人肝细胞的体外大量扩增,同时还可保留其正常肝细胞功能,所述方法制备的永生化肝细胞是新的理想的肝细胞源,能够作为筛选肝癌抑癌基因的工具细胞。本发明中筛选得到的候选基因能为靶向肝癌治疗提供新的生物靶标,进一步为靶向肝癌治疗提供新的策略,具有广阔的应用前景。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司
<120> 一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用
<130> 2022
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc g 41
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctttagtttg tatgtctgtt gctattatgt ctactattct ttcc 44
Claims (10)
1.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤:
(1)制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株;
(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。
2.根据权利要求1所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒的制备方法包括如下步骤:
分别将含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表达质粒和含有sgRNA文库的慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染包装细胞,分别得到CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
优选地,所述含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表达质粒包括lenti-Cas9-Blast质粒;
优选地,所述sgRNA文库包括GeCKOv2.0;
优选地,所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒;
优选地,所述包装细胞包括293T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述使用CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株包括如下步骤:
将所述CRISPR-Cas9慢病毒接种于永生化肝细胞培养液中孵育,进行抗生素筛选,得到CRISPR-Cas9稳定株;
优选地,所述永生化肝细胞培养液的细胞密度为(1~2)×106cells/mL;
优选地,所述CRISPR-Cas9慢病毒的MOI为0.7以下;
优选地,所述抗生素包括杀稻瘟菌素。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞包括如下步骤:
将所述sgRNA文库慢病毒接种于所述CRISPR-Cas9稳定株培养液中,孵育,抗生素筛选,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
优选地,所述CRISPR-Cas9稳定株培养液的细胞密度为(2~2.5)×106cells/mL;
优选地,所述sgRNA文库慢病毒的MOI为0.3以下;
优选地,所述抗生素包括嘌呤霉素。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,步骤(4)中,将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因包括如下步骤:
将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,收集肿瘤细胞,分别对所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞和肿瘤细胞进行基因组DNA分析,根据sgRNA的差异倍数筛选肝癌抑癌基因;
优选地,所述免疫缺陷的小鼠包括NSI小鼠;
优选地,所述筛选肝癌抑癌基因的标准为sgRNA的差异倍数在8以上,对应的基因为肝癌抑癌基因。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,所述永生化肝细胞的构建方法包括如下步骤:
(a)制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒;
(b)用所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒转染正常人肝细胞,构建永生化肝细胞。
7.根据权利要求6所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法,其特征在于,步骤(a)中,所述制备含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒包括如下步骤:
将含有TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒表达质粒、病毒包装质粒共转染包装细胞,得到含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒;
优选地,所述慢病毒表达质粒包括组成型质粒或诱导型质粒;
优选地,所述组成型质粒的载体包括pWPXLD载体;
优选地,所述诱导型质粒的载体包括FUW载体;
优选地,所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒;
优选地,所述包装细胞包括293T细胞;
优选地,步骤(b)中,用所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒转染正常人肝细胞,构建永生化肝细胞包括如下步骤:
将所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒与正常人肝细胞混合后孵育,更换培养基继续传代培养,得到永生化肝细胞;
优选地,所述培养基包括DMEM培养基和/或InVitroGRO CP肝细胞培养基;
优选地,所述慢病毒转染前使用InVitroGRO CP肝细胞培养基培养正常人肝细胞;
优选地,所述慢病毒转染后使用DMEM培养基进行传代培养;
优选地,所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒的MOI为0.6~0.8。
8.一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置,其特征在于,所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置包括:
(1)慢病毒制备模块:制备CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒;
(2)稳定株制备模块:制备永生化肝细胞,使用所述CRISPR-Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR-Cas9稳定株;
(3)基因敲除模块:使用所述sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR-Cas9稳定株,得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞;
(4)基因筛选模块:将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内,通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。
9.一种抑癌基因敲除的永生化肝细胞,其特征在于,所述抑癌基因由权利要求1~7中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法筛选得到;
优选地,所述抑癌基因包括CSK、NF2、PIK3CB、CNOT4、SRRD、PTEN、PLEKHA1、RELA、AAGAB、BTBD2、LRFN5、USP7或MIR873中任意一种或至少两种的组合。
10.权利要求1~7中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法、权利要求8所述的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的装置或权利要求9所述的抑癌基因敲除的永生化肝细胞中任意一种或至少两种的组合在肝癌药物筛选和/或药效评价中的应用。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105400773A (zh) * | 2015-12-14 | 2016-03-16 | 同济大学 | 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法 |
CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
WO2020000437A1 (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-02 | 深圳市博奥康生物科技有限公司 | 一种敲除人aprf基因的方法 |
CN110770252A (zh) * | 2016-10-17 | 2020-02-07 | 新加坡科技研究局 | 抗p53抗体 |
CN111254164A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株 |
CN111304249A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-06-19 | 东南大学 | 一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用 |
CN111635912A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-08 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用 |
-
2022
- 2022-03-14 CN CN202210244798.9A patent/CN114574524A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105400773A (zh) * | 2015-12-14 | 2016-03-16 | 同济大学 | 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法 |
CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
CN110770252A (zh) * | 2016-10-17 | 2020-02-07 | 新加坡科技研究局 | 抗p53抗体 |
WO2020000437A1 (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-02 | 深圳市博奥康生物科技有限公司 | 一种敲除人aprf基因的方法 |
CN111254164A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种快速建立crispr基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株 |
CN111304249A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-06-19 | 东南大学 | 一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用 |
CN111635912A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-08 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用 |
Non-Patent Citations (16)
Title |
---|
JIANG Z等: "Transforming primary human hepatocytes into hepatocellular carcinoma with genetically defined factors", 《EMBO REPORTS》, vol. 23, no. 6, 7 June 2022 (2022-06-07), pages 54275 * |
JIANG Z等: "Transforming primary human hepatocytes into hepatocellular carcinoma with genetically defined factors", 《EMBO REPORTS》, vol. 23, no. 6, pages 54275 * |
LIAO P等: "Mutant p53 gains Its function via c-Myc activation upon CDK4 phosphorylation at serine 249 and consequent PIN1 binding", 《MOLECULAR CELL》, vol. 68, no. 6, 21 December 2017 (2017-12-21), pages 1134 - 1146 * |
SHEN T等: "TP53 R249S mutation detected in circulating tumour DNA is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma patients with or without hepatectomy", 《LIVER INT》, vol. 40, no. 11, 30 November 2020 (2020-11-30), pages 2835 * |
SONG CQ等: "Genome-wide CRISPR Screen Identifies Regulators of MAPK as Suppressors of Liver Tumors in Mice", 《GASTROENTEROLOGY》, vol. 152, no. 5, 30 April 2017 (2017-04-30), pages 5 - 3 * |
SONG CQ等: "Genome-wide CRISPR Screen Identifies Regulators of MAPK as Suppressors of Liver Tumors in Mice", 《GASTROENTEROLOGY》, vol. 152, no. 5, pages 2 - 4 * |
WANG H等: "It takes a team: a gain-of-function story of p53-R249S", 《JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY》, vol. 11, no. 4, 1 April 2019 (2019-04-01), pages 277 - 283 * |
ZENDER L等: "An Oncogenomics-Based In Vivo RNAi Screen Identifies Tumor Suppressors in Liver Cancer", 《CELL》, vol. 135, pages 852 - 864, XP055251471, DOI: 10.1016/j.cell.2008.09.061 * |
尹煜鹏: "全基因组范围的CRISPR/Cas9筛选所鉴定的Ermap抑制肿瘤肝转移的作用和机制研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库(电子期刊)医药卫生科技辑》, no. 2019, pages 072 - 1 * |
曹颖等: "CRISPR-Cas9功能基因筛选技术在肝癌研究中的应用", 《中国细胞生物学学报》, vol. 44, no. 4, pages 663 - 671 * |
李祖俐: "高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 医药卫生科技辑》, no. 2021, 15 February 2021 (2021-02-15), pages 072 - 1273 * |
杨振兴: "TBK1与NF-κB relA在HCC中的表达及意义", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 医药卫生科技辑》, no. 2016, 15 December 2016 (2016-12-15), pages 076 - 5 * |
耿云峰等: "NF-κB家族成员RelA的翻译后修饰及其生理病理作用的研究进展", 《生命科学》, vol. 32, no. 5, 31 May 2020 (2020-05-31), pages 431 - 438 * |
褚嘉佑主编: "《中华民族永生细胞库的建立 理论与实践》", vol. 2009, 28 February 2009, 上海科学技术出版社, pages: 10 * |
郑杰: "《肿瘤的细胞和分子生物学》", vol. 2011, 28 February 2011, 上海科学技术出版社, pages: 142 - 143 * |
霍云飞等: "靶向RelA(p65)基因shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定", 《中国临床新医学》, vol. 16, no. 9, 30 September 2023 (2023-09-30), pages 907 - 912 * |
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