CN111304249A - 一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体及其应用。CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体由NF‑κB特异性启动子DMP和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达形成；Cas13a‑gRNA表达载体的gRNA 5′端为可靶向特定基因mRNA的28nt序列，其产生的gRNA可引导Cas13a蛋白结合并切割特定基因的mRNA，造成特定基因表达抑制。本发明构建了的新型CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体可特异性敲低促癌基因在癌细胞中的表达，进而导致癌细胞生长抑制和凋亡，但不影响正常细胞的靶基因表达及生长；本发明的表达载体可应用在制备新型癌症基因治疗试剂中。

Description

一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用
技术领域
本发明涉及癌症基因治疗生物技术领域，具体涉及新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其在癌细胞生长抑制中的应用。
背景技术
癌症是困扰人类健康和威胁人类生命的重要疾病。在于癌症的长期斗争中，人类已经发展了手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种癌症治疗手段，也取得了显著的进步，癌症生存率显著提高。但目前癌症治疗的水平，仍然于广大患者对健康和生命的期望存在很大的距离。因此，积极发展新型癌症治疗技术仍是医学领域的持续努力的目标。基因治疗是未来医学的前沿领域和技术高地，基因治疗在遗传病治疗领域取得的进展已经受到医学界的瞩目，但该技术用于癌症治疗尚没有显著突破。因此，探索癌症单基因治疗技术也发展新型癌症治疗技术的主要突破口。
癌症基因治疗，顾名思义，就是通过向癌细胞内导入遗传物质，通过遗传物质发挥治疗作用，干扰癌细胞生长或杀灭癌细胞。特别是向细胞中导入某种基因，通过表达基因产物如干扰RNA或蛋白，引发癌细胞生长抑制或凋亡、坏死。基因治疗中两个问题至关重要，一是基因的选择，直接决定治疗效率；二是控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。相对而言，基因的选择问题不大，基于目前基因组科学对大量基因功能的研究，不少基因特别是编码干扰RNA及其抑癌蛋白的基因，导入细胞后其表达产物都会或多或少产生对癌细胞的抑制作用。最关键的是如何控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。目前基于合成生物学原理，已经发展了一些基因开关，用于控制基因在癌细胞中的特异性表达，但这些基因控制元件构成复杂、效率较低，与应用还有较大的距离。
在申请人过去的研究中，申请人基于对重要炎症及癌症相关转录因子NF-κB的大量研究，构建了一种NF-κB特异性启动子，该启动子由NF-κB诱骗(Decoy)序列与最小启动子(Minimal Promoter)连接而成，被称为DMP启动子(专利申请号CN201710812983.2)(Int JBiochem Cell Biol.2018,95:43–52；Control the intracellular NF-κB activity by asensor consisting of miRNA and decoy)。因此，该启动子的转录激活活性主要取决于细胞中的NF-κB活性。由于NF-κB在各种癌症中都被过度激活，因此证明了该启动子可以在多种癌细胞中特异性地驱动效应基因的表达，而在正常细胞中不表达(专利申请号CN201711335257.2、CN201810163823.4)(Hum Gene Ther.2019,30:471-484；A Cell-Specific Nuclear Factor-Kappa B-Activating Gene Expression Strategy forDelivering Cancer Immunotherapy)。因此，DMP启动子是一种癌细胞特性启动子，其能控制其下游基因只在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。该启动子在未来癌症基因治疗领域具有广泛而重要的应用价值。
由于微生物群落中的生存竞争，已经产生了多种抗病毒防御策略。在这些防御机制中，几乎所有古细菌都拥有成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)相关基因(Cas)适应性免疫途径，并且大约有一半的细菌使用CRISPR RNA(crRNA)引导的核酸酶保护微生物免受病毒和其他外来核酸的侵害。CRISPR/Cas系统分为两大类：I类，通过多效应物复合物介导干扰；II类，使用单、多域效应子介导干扰。根据CRISPR阵列和特征干扰效应物的基因组结构，这两个类别进一步细分为6种类型和33种亚型。I类包括I，III和IV类型，II类包括II，V和VI类型。
与其他Cas核酸酶不同，VI-A CRISPR/Cas系统的特征蛋白Cas13a(之前称为C2c2)具有其他已知Cas蛋白所不具有的独特功能，其中包含高级真核生物和原核生物两个核苷酸结合域(HEPN)，具有催化crRNA成熟和ssRNA降解两个单独的核糖核酸酶活性，使Cas13a可以作为单组分可编程的RNA引导的RNA靶向CRISPR效应子。CRISPR/Cas13a系统已经被用作具有渺摩尔(attomolar)灵敏度和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测技术，被称为“特异性高灵敏酶报告物解锁”(Specific High Sensitivity Enzymatic ReporterUnLOCKing，SHERLOCK)。这种体外应用依赖于Cas13a的侧向效应(collateral effect)和等温扩增相结合。Cas13a的侧向效应是指激活的Cas13a在识别其靶RNA后，参与附近非靶标荧光报告分子RNA的“侧向”切割。
然而，Cas13a在细胞中没有类似的侧向作用，但仍保持其对靶RNA的高特异性切割活性。有研究表明，LwaCas13a可以在哺乳动物和植物细胞中异源表达，并可被引导RNA(guide RNA，gRNA)引导，有效敲低(knock down)报告基因或内源基因转录本(transcripts)。目前仍然无法做到人工控制Cas13a-gRNA仅在癌细胞中表达，该系统还没有报道被用于特异性敲低癌细胞中的促癌基因表达。
发明内容
发明目的：针对现有CRISPR Cas13a-gRNA表达载体存在的问题，本发明提出一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，运用该载体可制备靶向特定基因的Cas13a-gRNA表达载体，用于特异性敲低特定基因在癌细胞中的表达，以此抑制癌细胞的生长。
本发明还提供了一种基于新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体的应用。本发明提出的新型CRISPR Cas13a-gRNA有潜力用于制备新型癌症基因治疗试剂。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，由DMP启动子和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达，构建新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体。
其中，所述DMP启动子是一种NF-κB特异性启动子，由NF-κB诱骗子和最小启动子连接形成(专利申请号CN201710812983.2)，该启动子可激活其下游基因在各种癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达(专利申请号CN201711335257.2、CN201810163823.4)；所述DMP启动子可激活Cas13a基因在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。
其中，所述U6启动子为一种真核细胞RNA聚合酶III识别启动子，可激活gRNA在真核细胞中的表达；所述gRNA的5′端为靶向特定基因mRNA的28nt序列，gRNA为可与Cas13a结合的一种RNA。
作为优选，所述CRISPR Cas13a-gRNA表达载体的功能元件为DMP-Cas13a-U6-gRNA；所述这些功能元件及其DNA序列如说明书图1所示。
作为优选，所述CRISPR Cas13a-gRNA表达载体的功能元件DMP-Cas13a-U6-gRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体可进一步制备靶向特定基因的Cas13a-gRNA表达载体，其表达产物为Cas13a蛋白与gRNA；其中Cas13a蛋白与gRNA可形成Cas13a-gRNA复合物，该复合物中的Cas13a蛋白在其中gRNA的引导下可靶向结合并切割特定基因的mRNA，造成其表达抑制。具体的，是指Cas13a-gRNA表达载体的gRNA编码区的5′端插入可靶向特定基因mRNA的28nt序列，产生的gRNA可引导Cas13a蛋白结合并切割特定基因的mRNA，造成特定基因表达的抑制。本发明中Cas13a-gRNA载体进入癌细胞后表达的gRNA，可引导Cas13a蛋白靶向切割特定基因的mRNA。
其中，所述特定基因可以是任何编码RNA、多肽或蛋白的基因，其编码产物可促进癌细胞生长、转移或耐药；所述特定基因其表达经Cas13a-gRNA复合物抑制后，可引发癌细胞生长、转移或耐药的抑制。
进一步地，所述特定基因为促癌相关基因。
作为优选，所述特定基因为TERT、EZH2和RelA基因中的一种或者多种。
作为优选，新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体靶向TERT、EZH2和RelA基因mRNA的28nt序列分别为5′-CCCTC TTTTC TCTGC GGAAC GTTCT GGC-3′、5′-CGGCT TTCTT TATCATCTCG GTGAT CCT-3′及5′-CCTCT TTCTG CACCT TGTCA CACAG TAG-3′(SEQ ID NO.2-4)；即制备得到靶向特定基因TERT、EZH2、RELA的Cas13a-sgRNA表达载体。
其中，本发明用28nt的5′-TAGATT GCTGT TCTAC CAAGT AATCC AT-3′为Cas13a-gRNA表达载体gRNA的5′端序列，该表达载体作为阴性对照使用，不靶向哺乳动物基因组中任何基因，因此不会造成癌细胞中特定基因的表达抑制。
其中，所述新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体产生的gRNA为可同时编码靶向多个基因的gRNA；此时gRNA 5′端序列的固定结构为28nt-间隔序列-28nt-间隔序列-28nt-间隔序列，依次循环类推，最后以一个28nt序列结尾。此时，Cas13a-gRNA表达载体可同时靶向抑制癌细胞中多个基因的表达，达到协同作用。
作为优选，所述间隔序列为GAAAC ACCGA TTTAG ACTAC CCCAA AAACG AAGGGGACTA AAAC(SEQ ID NO.5)。
作为优选，当所述gRNA同时靶向多个基因TERT、EZH2和RelA的mRNA时，其gRNA的5′端序列为5′-CCCTC TTTTC TCTGC GGAAC GTTCT GGCGA AACAC CGATT TAGAC TACCC CAAAAACGAA GGGGA CTAAA ACCGG CTTTC TTTAT CATCT CGGTG ATCCT GAAAC ACCGA TTTAG ACTACCCCAA AAACG AAGGG GACTA AAACC CTCTT TCTGC ACCTT GTCAC ACAGT AG-3′(SEQ IDNO.6)。
本发明所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体在制备新型癌症基因治疗试剂中的应用。
其中，所述Cas13a-gRNA表达载体可被包装进腺相关病毒或者溶瘤病毒等病毒颗粒，用于通过皮下、瘤内或者静脉等方式注射进体内，进行体内癌细胞的生长抑制。
进一步地，所述Cas13a-gRNA表达载体用于特异性敲低特定基因在癌细胞中的表达，具体为DMP控制的只在癌细胞中表达的Cas13a蛋白，可被靶向特定基因的gRNA引导，结合并切割癌细胞中特定基因的mRNA，造成特定基因只在癌细胞表达的抑制。
本发明中构建了一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，在该载体中用DMP控制Cas13a的表达、用U6启动子控制gRNA的表达。运用该载体可制备靶向特定基因的Cas13a-gRNA表达载体，通过在不同癌细胞及正常细胞中靶向敲低外源报告基因及內源癌症相关基因的表达，证明新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体在靶向特定基因时如TERT、EZH2和RelA时，可有效地抑制癌细胞中这些靶基因的表达，并产生癌细胞的生长抑制效应。同时本发明还证明了将靶向特定基因的新型CRISPR Cas13a-gRNA包装到腺相关病毒(AAV)中，可通过静脉注射来抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长。
本发明通过构建靶向外源报告基因EGFP和mCherry及三个内源性癌基因TERT、EZH2和RelA的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，证明靶向外源报告基因EGFP和mCherry的Cas13a-gRNA表达载体可靶向抑制293T和HepG2细胞中EGFP和mCherry的表达；靶向内源性癌基因TERT、EZH2和RelA的Cas13a-gRNA表达载体可靶向抑制人肝癌细胞HepG2中TERT、EZH2和RelA的表达，进而导致癌细胞生长抑制和凋亡，但对人正常肝细胞HL7702中TERT、EZH2和RelA基因的表达没有影响，也不影响正常细胞的生长。此外，还证明将靶向TERT、EZH2和RelA基因的Cas13a-gRNA表达载体包装进腺相关病毒，所获得的重组病毒不仅能显著抑制人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepa1-6的生长，还能显著抑制小鼠体内癌细胞Hepa1-6皮下移植瘤的生长。因此，本发明提出的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体在制备新型癌症基因治疗试剂中具有潜在应用价值。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明构建了新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其优选功能元件为DMP-Cas13a-U6-gRNA(在质粒中为pDMP-Cas13a-U6-gRNA，简称为pDCUg)。本发明通过这种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，依赖于其在哺乳动物细胞中的mRNA切割活性，来敲低靶基因的表达。通过用申请人先前开发的癌细胞特异性启动子DMP控制Cas13a在癌细胞中的特异性表达，开发出一种可控制Cas13a在癌细胞中的特异性表达的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，并可以开发出基于该表达载体的抑制癌细胞增殖的新试剂。实验结果表明，本发明发展的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体可以在mRNA和蛋白质水平上特异性地、有效地敲低内源性和外源性靶基因的表达。而且，在癌细胞特异性启动子DMP的控制下，仅在癌细胞中有效地敲低内源靶基因的表达，包括mRNA和蛋白质水平上的表达。pDCUg特异性敲低癌细胞中的癌基因的表达，可在体内外诱导癌细胞凋亡。这些结果表明，pDCUg可以提供一种抑制癌细胞增殖的新方法。
本发明中的pDCUg载体(即作为优选功能元件的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体)一个显著的优点是可包装进AAV颗粒。AAV常用于体内基因传递。对于AAV的低包装容量(4.7kb)，现有的LwaCas13a-msfGFP(4335bp)和U6-gRNA(326bp)太大，限制了LwaCas13a的体内应用(RNA targeting with CRISPR-Cas13a；Nature.2017；550:280–284)，尤其是用多个gRNA靶向多个基因时，问题更严重。已报道的基于Cas13a的癌症治疗方法将纯化的LwaCas13a蛋白和crRNA用于KRAS-G12D mRNA的有效地特异性敲低，发现LwaCas13a蛋白与crRNA共转染可显著敲低突变KRAS mRNA的表达，而且，在crRNA中引入第二个错配后可以特异性从WT KRAS mRNA中区分KRAS-G12D mRNA。更重要的是，LwaCas13a介导的KRAS G12DmRNA敲低在体外有效诱导细胞凋亡，并引起小鼠肿瘤明显地缩小，这为在癌症治疗中进一步开发CRISPR/Cas13a提供了有前景的平台(A CRISPR-Cas13a system for efficientand specific therapeutic targeting of mutant KRAS for pancreatic cancertreatment.Cancer Lett 2018；431:171-81)。但该研究无法控制Cas13a仅在癌细胞中的表达，此外，LwaCas13a蛋白的体内输送及顺利进入癌细胞非常困难。
在本发明中，选择了三个众所周知的癌基因作为靶标，发现采用pDCUg表达载体构建靶向这些靶标的Cas13a-gRNA表达载体(即靶向特定基因Cas13a-gRNA表达载体)，可有效地、特异性地抑制癌细胞的增殖。这些效应基因选择的依据是，端粒酶由端粒酶逆转录酶(TERT)基因编码，该活性在大多数正常体细胞中受到限制，而在90％的肿瘤细胞中具有活性。组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(EZH2)，由EZH2基因编码的组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶的过表达，在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌和肾癌等多种癌症中被大量发现。EZH2的突变或过表达与多种形式的癌症有关。EZH2抑制基因负责抑制肿瘤发展，而阻断EZH2活性可以减慢肿瘤的生长。EZH2抑制剂目前已被开发为有前途的癌症治疗药物。RelA是最重要的NF-κB家族成员，RelA具有转录激活结构域，可与NF-κB家族另一成员p50结合形成异二聚体，广泛激活NF-κB靶基因的表达。NF-κB的异常激活及其信号传导途径导致许多人类疾病，特别是炎症性疾病和癌症。
在本发明中，选择了三个基因作为优化过的CRISPR Cas13a-sgRNA表达载体的靶标，以探索其在HepG2和HL7702细胞中的凋亡作用。本发明的数据表明，通过CRISPRCas13a-sgRNA靶向这三个基因，仅癌细胞(HepG2和Hepa1-6)可以被显著诱导凋亡。而且，通过构建同时靶向三个转录本的CRISPR Cas13a-sgRNA表达载体pDCUg-TER(其中TER为TERT-EZH2-RELA的首字母缩写)，产生了最强的癌细胞凋亡作用，表明当同时干扰多个基因时，对癌细胞凋亡具有协同作用。同时靶向多个基因为CRISPR Cas13a-sgRNA提供了制备癌症治疗试剂方面的新优势，即优于其他CRISPR/Cas系统(如Cas9)，因为Cas9自身无法使其gRNA成熟。另外，用相同载体处理的正常肝HL7702细胞的生长或凋亡率没有明显变化，表明用pDCUg治疗肿瘤的策略在体外具有肿瘤特异性。为了进一步研究该系统在体内的抗肿瘤作用，本发明将靶向这些靶标的Cas13a-gRNA表达载体包装到AAV中，并通过静脉内给药在体内治疗肿瘤。重组AAV可以有效地将Cas13a-gRNA表达载体递送到癌细胞中并导致肿瘤抑制，这对于体内肿瘤基因治疗是有益的。重要的是，本发明检测了各种组织中Cas13a的表达，发现只有在肿瘤组织中可检测到Cas13a的表达，证明了Cas13a仅在肿瘤中的表达，这为CRISPR Cas13a-sgRNA表达载体的体内癌细胞特异性提供了有力的支持。
总之，本发明开发了一种新型CRISPR Cas13a-sgRNA表达载体，用该载体制备的靶向特定基因如TERT、EZH2、RELA的Cas13a-sgRNA表达载体，可有效抑制抑制特定基因在体内外癌细胞中的表达，并抑制体内外癌细胞的生长。因此，新型CRISPR Cas13a-sgRNA表达载体提供了一个有用的平台，可特异性敲低体内和体外癌细胞中的各种靶基因的表达，在癌症基因治疗试剂的制备中具有广泛的潜在应用价值。
附图说明
图1为pDMP-Cas13a-U6-gRNA(简称为pDCUg)(p为质粒的含义)载体元件布局及其序列示意图。
图2为pDCUg对HEK293T细胞中异位基因表达(ectopic gene expression)的干扰示意图。用不同的质粒转染细胞，并在转染后24小时检测细胞。(A)有代表性的细胞荧光图。pDCUg-NT/EGFP/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。(B)流式细胞仪分析荧光强度。(C)QPCR分析mRNA的表达。RQ，相对定量。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p＜0.01。
图3为HEK293T细胞中pDCUg-EGFP对EGFP/mCherry异位表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用荧光显微镜成像。pEGFP/mCherry，CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/EGFP，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的细胞的代表性图像。
图4为HEK293T细胞中pDCUg-EGFP对异位EGFP/mCherry表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用流式细胞仪(FC)定量细胞的荧光强度。通道FL1显示绿色荧光，通道FL4显示红色荧光。pEGFP/mCherry，CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/EGFP，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的代表性FC结果。
图5为HEK293T细胞中pDCUg-mCherry对EGFP/mCherry异位表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用荧光显微镜成像。pEGFP/mCherry，CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的细胞的代表性图像。
图6为HEK293T细胞中pDCUg-mCherry对异位EGFP/mCherry表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用流式细胞仪(FC)定量细胞的荧光强度。通道FL1显示绿色荧光，通道FL4显示红色荧光。pEGFP/mCherry，在CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的代表性FC结果。
图7为pDCUg干扰HepG2细胞中异位基因表达示意图。用不同的质粒转染细胞，并在转染后24小时检测细胞。(A)有代表性的细胞荧光图。pDCUg-NT/EGFP/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。(B)荧光强度的流式细胞仪分析。(C)QPCR分析mRNA的表达。RQ，相对定量。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p＜0.01。
图8为HepG2细胞中pDCUg-EGFP对EGFP/mCherry异位表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用荧光显微镜成像。pEGFP/mCherry，在CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/EGFP，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的细胞的代表性图像。
图9为HepG2细胞中pDCUg-EGFP对异位EGFP/mCherry表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时用流式细胞仪(FC)定量细胞的荧光强度。通道FL1显示绿色荧光，通道FL4显示红色荧光。pEGFP/mCherry，在CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/EGFP，分别是表达非靶向性gRNA/靶向EGFP转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的代表性FC结果。
图10为HepG2细胞中pDCUg-mCherry对EGFP/mCherry异位表达的干扰示意图。用不同质粒载体转染细胞，并在转染后24小时用荧光显微镜成像。pEGFP/mCherry，在CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的细胞的代表性图像。
图11为HepG2细胞中pDCUg对EGFP/mCherry异位表达的干扰示意图。用不同质粒载体转染细胞，并在转染后24小时用流式细胞仪(FC)定量细胞的荧光强度。通道FL1显示绿色荧光，通道FL4显示红色荧光。pEGFP/mCherry，在CMV启动子控制下表达EGFP/mCherry的质粒；pDCUg-NT/mCherry，分别是表达非靶向性gRNA/靶向mCherry转录本的pDCUg质粒。该图显示了三个独立转染的代表性FC结果。
图12为pDCUg干扰内源基因表达示意图。用不同载体转染HepG2及HL7702细胞，并在转染后24小时检测细胞对细胞进行显微拍摄。
图13为pDCUg对内源基因表达的干扰示意图。用不同质粒转染细胞，并在转染后24小时检测细胞。(A)流式细胞仪分析细胞凋亡。(B)HepG2和HL7702细胞中Cas13a mRNA的表达水平。RQ，相对定量。除非另有说明，所有数值均为平均值±标准误差，n＝3。*，p<0.05；**，p＜0.01。(C)mRNA表达的QPCR分析。RQ，相对定量。所有数值均为平均值±标准误差。*，p<0.05；**，p＜0.01。(D)蛋白质印迹分析。显示了代表性图像和定量的光密度。Lip，Lipofectamine；NT/TERT/EZH2/RelA/TER，pDCUg-NT/TERT/EZH2/RelA/TER。(E)CCK-8测定细胞生长。空白，细胞未经任何处理。Lipofectamine，仅用Lipofectamine处理的细胞。pDCUg-NT/TERT/EZH2/RelA/TER，分别是表达非靶向性gRNA/靶向TERT转录本/靶向EZH2转录本/靶向RelA转录本/同时靶向TER的pDCUg质粒。
图14为pDCUg干扰内源基因表达示意图。用不同质粒载体转染细胞，并在转染后24小时检测细胞。用流式细胞仪器对细胞定量分析。
图15为rAAV病毒在体外的抗肿瘤作用示意图。将细胞接种在24孔板中(1×105细胞/孔)，并培养12小时。然后分别用rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER的病毒(5×1010vg/孔)处理细胞。将细胞培养24小时后成像。
图16rAAV病毒在体外的抗肿瘤作用示意图。将细胞接种在24孔板中(1×105细胞/孔)，并培养12小时。然后分别用rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER的病毒(5×1010vg/孔)处理细胞。将细胞48小时后成像。
图17为rAAV病毒在体外的抗肿瘤作用示意图。将细胞接种在24孔板中(1×105细胞/孔)，并培养12小时。然后分别用rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER病毒(5×1010vg/孔)处理细胞。将细胞继续培养72小时后成像。同时，在转染后72小时，使用CCK-8测定法评估细胞活力。(A)转染后72小时的代表性细胞图。(B)转染后72小时的细胞活力。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p＜0.01。
图18.rAAV病毒在体内的抗肿瘤作用。(A)用病毒rAAV-NT和rAAV-TER转染的癌细胞Hepa1-6荷瘤的小鼠图像。(B)病毒治疗前后的肿瘤大小。(C)组织中病毒DNA的丰度。(D)Cas13a mRNA在静脉注射rAAV-NT和rAAV-TER的荷瘤小鼠的心脏，肝，脾，肺，肾和肿瘤组织中的表达。将所有其他值与经rAAV-NT处理的小鼠的心脏值进行比较。(E)组织中靶mRNA的丰度。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05，**，p<0.01。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
pDCUg敲低体内外癌细胞中靶基因表达及抑制体内肿瘤生长
1、材料和方法
1.1、载体构造
将化学合成的NF-κB特异性启动子(DMP)克隆到pMD19-T simple(TAKARA)中，得到pMD19-T-DMP。通过PCR从pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a(Addgene)扩增人密码子优化的Cas13a编码序列，并将其克隆到pMD19-T-DMP中以获得pMD19-T-DMP-Cas13a。将化学合成的U6启动子序列和由BbsI限制性酶切位点分隔的向导RNA(gRNA)的直接重复序列克隆到pMD19-T-DMP-Cas13a中，以生成pDMP-Cas13a-U6-gRNA载体(简称为pDCUg)。表1中列出了gRNA靶向的基因及其靶点序列。
表1.Cas13a-gRNA干扰试验中引导RNA的靶序列
Figure BDA0002385436830000101
Figure BDA0002385436830000111
注：PFS为protospacer flanking site(原间隔子旁侧位点)。PFS为Cas13a-gRNA识别其靶点需要的一个碱基，该碱基为mRNA上gRNA靶点序列之后第一个碱基，原则上为一种非G碱基(即A、U或C)。PFS类似以Cas9-sgRNA别别位点后的PAM序列。
使用CHOPCHOP(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)选择了非靶向转录本(NT)、EGFP、mCherry、TERT、EZH2和RelA的gRNA。化学合成包含28bp gRNA和两个侧翼BbsI位点的互补寡核苷酸(表2)，并使其退火成双链寡核苷酸，然后将其连接到pDCUg中。连接反应(10μL)由10单位BbsI(NEB)、600单位T4 DNA连接酶(NEB)、1×T4 DNA连接酶缓冲液、0.1mg/mL牛血清蛋白、1nM双链寡核苷酸和50ng pDCUg质粒组成。连接反应在PCR循环仪上同时进行：37℃5分钟和16℃10分钟进行10个循环，37℃30分钟和80℃5分钟。产生的质粒分别命名为pDCUg-NT、pDCUg-EGFP、pDCUg-mCherry、pDCUg-TERT(注意：由于使用人及小鼠的细胞进行实验，人与小鼠基因编码序列的有差异，因此实验中分别构建了针对人和小鼠基因的这些载体)、pDCUg-EZH2(人及小鼠)和pDCUg-RelA(人及小鼠)。还构建了可同时表达靶向TERT、EZH2和RelA的gRNA的质粒，被命名为pDCUg-TER(人及小鼠)。
通过使用MluI(上游)和XbaI(下游)限制酶切位点将DCUg-NT、DCUg-TERT、DCUg-EZH2、DCUg-RelA及DCUg-TER编码序列克隆到pAAV-MCS(VPK-410，Stratagene)中来构建pAAV-DCUg-NT、pAAV-DCUg-TERT、pAAV-DCUg-EZH2、pAAV-DCUg-RelA、pAAV-DCUg-TER载体。DCUg-NT、DCUg-TERT、DCUg-EZH2、DCUg-RelA及DCUg-TER编码序列通过PCR分别从pDCUg-NT、pDCUg-TERT、pDCUg-EZH2、pDCUg-RelA及pDCUg-TER扩增。其中，NT、TERT、EZH2、RelA、TER的编码序列分别如表1所示。
报告载体pEGFP和pmCherry为常规载体，其中EGFP和mCherry的表达受CMV启动子的控制。
表2.用于构建靶向特定基因pDCUg载体的寡核苷酸。
Figure BDA0002385436830000112
Figure BDA0002385436830000121
1.2、细胞培养和转染
HEK293T、HepG2、HL7702和Hepa1-6从中国科学院上海生物科学研究所细胞资源中心获得。HEK293T、HepG2和Hepa1-6细胞用含高葡萄糖的Dulbecco改良Eagle Eagle(DMEM)培养基培养或HL7702细胞用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基培养。所有培养基都添加10％胎牛血清(VWR Seradigm)，100单位/mL青霉素(Thermo FisherScientific)和100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific)。将细胞置于含5％CO2的培养箱中于37℃孵育。根据制造商的说明用Lipofectamine 2000(Thermo FisherScientific)在24孔板中转染细胞。转染前18～24h将细胞接种在24孔板中，过夜培养以确保80％融合。在干扰异位基因表达的实验中，每孔细胞用500ng pDCUg和150ng报告载体(pEGFP/mCherry)转染。在干扰内源基因表达的实验中，用500ng pDCUg转染细胞。通过荧光显微镜(IX51，Olympus)对细胞拍照。
1.3、流式细胞仪
为了量化细胞中异位的EGFP和mCherry的表达，在转染后24h通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用流式细胞仪进行定量(Calibur，BD，USA)。为了量化细胞凋亡，转染后24小时通过胰蛋白酶消化收集细胞，并根据制造商的说明使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国，USA)进行检测。用流式细胞仪(Calibur，BD，USA)定量细胞的荧光强度。使用BD软件进行流式细胞术数据分析和图形准备。
1.4、CCK-8测定
将细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。每种处理用六组细胞进行，每组有四个重复。将细胞培养18小时(过夜)，并用不同质粒(100ng质粒/孔)转染。转染后的不同时间点(0天、1天、2天、3天、4天和5天)，每个孔分别添加1 0μL Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液(BS350B，Biosharp)。1小时后，使用酶标仪(BioTek)测量450nm处的光密度。
1.5、免疫印迹
将细胞接种到6孔板中，并过夜培养至80％汇合。每个孔中的细胞均转染1000ngpDCUg质粒。转染后24小时，根据制造商的说明，使用磷蛋白提取试剂盒(SA6034-100T，Signalway Antibody，美国)制备全细胞和核提取物。通过SDS-PAGE分离蛋白裂解物(20μg/样品)，并用Western blot(WB)检测目标蛋白，所用抗体如下：GAPDH小鼠单克隆抗体(97166S，CST，USA)，TBP兔单克隆抗体(12578S，CST，USA)，TERT兔单克隆抗体(ab191523，Abcam，UK)，EZH2小鼠单克隆抗体(3147S，CST，USA)和RelA小鼠单克隆抗体(6956S，CST，USA)。二抗是
Figure BDA0002385436830000131
800CW山羊抗小鼠抗体或山羊抗兔抗体(Licor)。检测印迹，并使用Odyssey红外荧光成像系统(Licor)定量荧光强度。
1.6、病毒准备
将HEK293T细胞以每瓶5×106个细胞的密度接种到75cm2的细胞瓶中，并培养12～20小时。然后，根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000将细胞用两种辅助质粒(pHelper和pAAV-RC；Stratagene)和一种pAAV质粒(pAAV-MCS、pAAV-DCUg-TER、pAAV-DCUg-EZH2、pAAV-DCUg-RelA和pAAV-DCUg-NT)共转染。转染后，将细胞用新鲜培养基培养72小时。然后收集病毒并纯化。使用引物AAV-F/R(表3)通过qPCR确定AAV的滴度。20μL qPCR反应包含1×SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Roche)、0.25μM引物(AAV-F/R)和2μL病毒或标准DNA(AAV-F/R扩增的159-bp AAV gDNA片段)的两倍稀释液。qPCR程序的执行过程如下：95℃持续10s，95℃持续15s，60℃持续1分钟，进行45个循环。然后构建熔解曲线以监测PCR扩增特异性。使用Applied Biosystems StepOne v2.3进行数据分析。根据标准曲线计算病毒基因组的浓度(vg)。将定量的病毒分装并保存在-80℃以备后用。将获得的病毒简称为rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER。
表3.用于qPCR检测的引物。
名称 引物序列(5′→3′)
EGFP-F GACGGCAACTACAAGACCCG
EGFP-R CTGCCGTCCTCGATGTTGT
mCherry-F CGCGTGATGAACTTCGAGGA
mCherry-R TCTGCTTGATCTCGCCCTTC
hGAPDH-F ATTTGGTCGTATTGGGCG
hGAPDH-R CTCGCTCCTGGAAGATGG
hTERT-F GGCACGGCTTTTGTTCAGATG
hTERT-R GCTGTTCACCTGCAAATCCA
hEZH2-F ACATGCGACTGAGACAGCTC
hEZH2-R GTCACTGGTCACCGAACACT
hRelA-F CCTGGAGCAGGCTATCAGTC
hRelA-R ATGGGATGAGAAAGGACAGG
mGAPDH-F TCACCACCATGGAGAAGGC
mGAPDH-R GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA
mTERT-F TCTACCGCACTTTGGTTGCC
mTERT-R CAGCACGTTTCTCTCGTTGC
mEZH2-F CGAATAACAGTAGCAGACCCAG
mEZH2-R TGTTTGACACCGAGAATTTGCTT
mRelA-F TGCGATTCCGCTATAAATGCG
mRelA-R ACAAGTTCATGTGGATGAGGC
AAV-F TGCATGACCAGGCTCAGCTA
AAV-R GACAGGGAAGGGAGCAGTG
注：引物名称前的h表示human，m表示mouse。
1.7、病毒评估
将细胞接种到24孔板(1×105细胞/孔)中，培养24小时。然后细胞分别感染rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER，病毒用量为(5×1010vg/孔)。注意人细胞用靶向人基因的rAAV病毒感染，如人HepG2及HL7702细胞；而小鼠细胞用靶向小鼠基因的rAAV病毒感染，如小鼠Hepa1-6细胞。将细胞再继续培养72小时，并分别在转染后24小时、48小时和72小时通过光学显微镜(Olympus)成像。转染后72小时，使用CCK-8测定法(BS350B，Biosharp)评估细胞活力。
1.8、动物实验
所有小鼠均购自常州卡文斯实验动物有限公司(中国)。本发明是依据东南大学动物护理和使用指南(中国南京)，东南大学实验动物伦理委员会的建议进行的。该方案得到东南大学实验动物伦理委员会的批准。肝癌异种移植是在平均体重20g的4周龄雌性BALB/c-Foxn1nu小鼠上进行的，通过在小鼠皮下两个点注射Hepa1-6细胞进行成瘤，接种剂量为2×106个细胞/位置(5只小鼠/组)。饲养7～10天后，将小鼠随机分为rAAV-NT和rAAV-TER两个实验组，用精密测径仪测量肿瘤大小，然后以1×109vg/小鼠的剂量静脉注射AAV病毒。使用公式V＝(ab2)/2计算肿瘤体积，其中a是肿瘤的长轴，b是短轴。在注射病毒后的第七天，对小鼠实施安乐死并拍照，然后如上所述测量和计算肿瘤大小。
1.9、定量PCR
转染后24小时，使用TRIzolTM(Invitrogen)从细胞或小鼠组织中提取总RNA。cDNA是根据制造商的说明使用FastKing RT试剂盒(TIANGEN)生成的。根据制造商的说明，使用TIANamp基因组DNA试剂盒(TIANGEN)从小鼠组织中提取基因组DNA(gDNA)。根据制造商的说明，使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen)通过qPCR检测cDNA和gDNA。qPCR引物见表3所示。GADPH作为内参。QPCR程序在ABI Step One Plus(Applied Biosystems)上运行。每个样品进行三次重复分析。mRNA相对转录水平和病毒DNA丰度根据以下方程式计算：RQ＝2–ΔΔCt。根据熔解曲线分析，证明所有qPCR引物均具有特异性，这些PCR引物序列见表2和表3。
1.10、统计分析
数据显示为平均值±标准差(SD)，并伴有独立进行的实验次数，并用T检验进行了分析。p<0.05的差异被认为具有统计学意义。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。
2、结果
2.1、pDCUg的基因敲低效应
为了评估pDCUg的体外敲低效率和特异性，首先设计了靶向EGFP转录本的gRNA，并将其克隆到pDCUg中。然后，将pDCUg-EGFP、pEGFP和pmCherry共转染HEK293T细胞，使EGFP转录本成为靶标，而pmCherry转录本成为阴性对照。细胞的显微成像表明，pDCUg-EGFP转染显著降低了EGFP荧光，但未降低mCherry荧光(图2A；图3)。通过流式细胞仪对细胞荧光进行定量分析，也验证了这个结果(图2B；图4)。为了进一步验证pDCUg的敲低效率和特异性，设计了靶向mCherry转录本的gRNA，并将其克隆到pDCUg中。然后用pDCUg-mCherry、pEGFP和pmCherry共转染HEK293T细胞，使mCherry转录本成为靶标，EGFP转录本作为阴性对照。结果，降低了mCherry荧光，但未降低EGFP荧光(图2A和2B；图5和图6)。pDCUg-mCherry转染显著降低了mCherry荧光，但未降低EGFP荧光。在这些检测中，表达不靶向人细胞中任何转录本(NT)的gRNA的pDCUg-NT被用作对照，其转染既不影响EGFP荧光的表达，也不影响mCherry荧光的表达。这些数据证明了pDCUg具有高敲低效率和特异性。
作为报告基因，pDCUg-EGFP和pDCUg-mCherry的转染清楚地表明，pDCUg显著且特异性地抑制了EGFP和mCherry蛋白的表达。为了进一步证实pDCUg的敲低效应，用qPCR检测了靶基因在mRNA水平上的表达。正如所料，发现EGFP和mCherry的mRNA水平均被其相应的pDCUg载体转染显著下调(图2C)，这与本发明预期的Cas13a/gRNA敲低其靶RNA相符。
同时还用HepG2细胞进行了相同的转染。在该细胞系中获得了相似的结果。pDCUg显著且特异性地敲低了EGFP和mCherry蛋白表达(图7A和7B；图8、图9、图10、图11)。qPCR检测显示该细胞系中EGFP和mCherry的mRNA水平也均降低(图7C)。两种细胞的数据说明，pDCUg可显著而特异地抑制不同细胞(HEK293T与HepG2)中不同基因(EGFP和mCherry)的表达。
2.2、pDCUg的体外抗肿瘤作用
为了测试pDCUg是否能有效敲低内源基因的表达，接下来设计了针对三种促癌癌相关基因的gRNA，包括TERT、EZH2和RelA。通过转染人肝癌细胞HepG2和正常细胞HL7702评估这些gRNA的效果。同时用pDCUg-NT作为对照转染细胞。用显微镜对细胞成像(图12)，并通过流式细胞仪检测其凋亡(图13A；图14)。结果表明，所有靶向gRNA均可显著诱导HepG2细胞凋亡，而非靶向gRNA则不会。此外，pDCUg-TER可最显著地诱导HepG2细胞凋亡，pDCUg-TER可以共表达靶向TERT、EZH2和RelA的gRNA。但是，pDCUg-NT不能明显诱导HepG2细胞凋亡。相比之下，HL7702细胞并未被所有gRNA诱导凋亡。这些数据初步说明，pDCUg作用效果的癌细胞特异性。
为了进一步探索pDCUg系统的效应基因Cas13a的癌细胞特异性表达，首先在两种处理下检测了这两种细胞中的Cas13a mRNA(图13B)。结果表明，在HepG2细胞系中，Cas13a在除脂质体转染对照组外的所有检测组中表达；然而，在所有处理过的HL7702细胞系中未检测到Cas13a mRNA。这些结果表明pDCUg系统可以在癌细胞而不是正常细胞中被激活，这导致了效应基因Cas13a只在癌细胞中的特异性表达。
接下来，通过qPCR检测了靶基因的表达(图13C)。结果表明，HepG2细胞中的靶向gRNA也可显著下调靶mRNA的水平，而HL7702细胞中靶mRNA的水平没有变化。然后，通过蛋白质印迹检测了TERT、EZH2和RelA的蛋白质水平(图13D)。结果显示，pDCUg系统在靶向gRNA处理的HepG2细胞中显著抑制了TERT、EZH2和RelA蛋白的表达。
鉴于这三个基因(TERT、EZH2和RelA)在癌症进展中的重要作用，接下来在HepG2和HL7702细胞中测试了pDCUg介导的TERT、EZH2和RelA mRNA干扰的抗肿瘤作用。因此，进行了CCK-8分析，以检测pDCUg处理过的细胞的生长速率(图13E)。结果表明，转染三个靶向gRNA在120小时(连续5天)的时间中显著抑制了HepG2细胞的生长。此外，共表达三种靶向gRNA(pDCUg-TER)的抑制作用最强。但是，所有转染均未在HL7702细胞中诱导明显的生长变化。
2.3、pDCUg在体内的抗肿瘤作用
为了研究pDCUg靶向上述三种致癌mRNA是否具有抗肿瘤作用，将pDCUg包装到AAV载体中。首先用HepG2、Hepa1-6和HL7702这三种细胞系评估病毒的抗肿瘤作用。将细胞接种到24孔板(1×105细胞/孔)中，并培养12小时。然后分别在培养基中添加rAAV-MCS、rAAV-NT、rAAV-TERT、rAAV-EZH2、rAAV-RelA和rAAV-TER病毒以感染细胞，病毒剂量为5×1010vg/孔。注意人细胞(HepG2和HL7702)和小鼠细胞(Hepa1-6)分别用靶向人及小鼠基因的rAAV感染；人鼠细胞均可用rAAV-MCS、rAAV-NT感染。将细胞再培养72小时，并分别在24小时(图15)、48小时(图16)和72小时(图17A)的时间成像。最后在转染后72小时使用CCK-8测定细胞的活力。结果表明，HepG2和Hepa1-6细胞均被四种靶向AAV显著诱导凋亡，而rAAV-MCS和rAAV-NT均未诱导细胞凋亡(图17B)。此外，rAAV-TER在这两个细胞中诱导了最显著的凋亡。因此，将rAAV-TER应用于进一步的动物实验。相反，所有病毒感染均未在HL7702细胞中诱导明显的细胞凋亡。
为了评估pDCUg是否可用于体内治疗癌症，随后进行了动物实验。将十只小鼠移植体外培养的小鼠肝癌Hepa1-6细胞。7天后，将荷瘤小鼠随机分成两组，并分别静脉注射2种病毒(rAAV-TER和rAAV-NT)。测量肿瘤体积大小表明，与rAAV-NT组相比，rAAV-TER治疗的小鼠上肿瘤的生长被显著抑制(图18A和18B)。
为了进一步证明rAAV载体的体内肿瘤特异性表达，检测了AAV病毒DNA的存在以及Cas13a和靶基因在各种组织中的表达。从两个实验组的小鼠中收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤组织。qPCR检测显示在所有检测的组织中，AAV病毒基因组DNA都有分布(图18C)；而Cas13a仅在静脉注射rAAV-NT和rAAV-TER的小鼠肿瘤中表达(图18D)。此外，包括TERT、EZH2和RelA在内的三种致癌转录本仅在肿瘤中被下调(图18E)，表明pDCUg在体内具有肿瘤特异性表达。此外，qPCR检测显示三种癌基因在所有正常组织中均没有高表达，但在肿瘤中出现高表达(图18E)，这与其他大量研究结果吻合，即三种促癌基因在癌症组织中表达上调。此外，rAAV-TER显著抑制了肿瘤中这些癌基因的上调，而rAAV-NT却没有显著地下调它们的表达(图18E)，表明了pDCUg的体内靶向性。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg atttagacta ccccaaaaac gaaggggact aaaacgggtc ttcgagaaga 300
cctggatccg gcctaactgg ccggtaccgg gaatttccgg ggactttccg ggaatttccg 360
gggactttcc gggaatttcc tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc aggtcgacgc 420
gtaagcttgc caccatgcca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag 480
ccatgaaagt gaccaaggtc gacggcatca gccacaagaa gtacatcgaa gagggcaagc 540
tcgtgaagtc caccagcgag gaaaaccgga ccagcgagag actgagcgag ctgctgagca 600
tccggctgga catctacatc aagaaccccg acaacgcctc cgaggaagag aaccggatca 660
gaagagagaa cctgaagaag ttctttagca acaaggtgct gcacctgaag gacagcgtgc 720
tgtatctgaa gaaccggaaa gaaaagaacg ccgtgcagga caagaactat agcgaagagg 780
acatcagcga gtacgacctg aaaaacaaga acagcttctc cgtgctgaag aagatcctgc 840
tgaacgagga cgtgaactct gaggaactgg aaatctttcg gaaggacgtg gaagccaagc 900
tgaacaagat caacagcctg aagtacagct tcgaagagaa caaggccaac taccagaaga 960
tcaacgagaa caacgtggaa aaagtgggcg gcaagagcaa gcggaacatc atctacgact 1020
actacagaga gagcgccaag cgcaacgact acatcaacaa cgtgcaggaa gccttcgaca 1080
agctgtataa gaaagaggat atcgagaaac tgtttttcct gatcgagaac agcaagaagc 1140
acgagaagta caagatccgc gagtactatc acaagatcat cggccggaag aacgacaaag 1200
agaacttcgc caagattatc tacgaagaga tccagaacgt gaacaacatc aaagagctga 1260
ttgagaagat ccccgacatg tctgagctga agaaaagcca ggtgttctac aagtactacc 1320
tggacaaaga ggaactgaac gacaagaata ttaagtacgc cttctgccac ttcgtggaaa 1380
tcgagatgtc ccagctgctg aaaaactacg tgtacaagcg gctgagcaac atcagcaacg 1440
ataagatcaa gcggatcttc gagtaccaga atctgaaaaa gctgatcgaa aacaaactgc 1500
tgaacaagct ggacacctac gtgcggaact gcggcaagta caactactat ctgcaagtgg 1560
gcgagatcgc cacctccgac tttatcgccc ggaaccggca gaacgaggcc ttcctgagaa 1620
acatcatcgg cgtgtccagc gtggcctact tcagcctgag gaacatcctg gaaaccgaga 1680
acgagaacgg tatcaccggc cggatgcggg gcaagaccgt gaagaacaac aagggcgaag 1740
agaaatacgt gtccggcgag gtggacaaga tctacaatga gaacaagcag aacgaagtga 1800
aagaaaatct gaagatgttc tacagctacg acttcaacat ggacaacaag aacgagatcg 1860
aggacttctt cgccaacatc gacgaggcca tcagcagcat cagacacggc atcgtgcact 1920
tcaacctgga actggaaggc aaggacatct tcgccttcaa gaatatcgcc cccagcgaga 1980
tctccaagaa gatgtttcag aacgaaatca acgaaaagaa gctgaagctg aaaatcttca 2040
agcagctgaa cagcgccaac gtgttcaact actacgagaa ggatgtgatc atcaagtacc 2100
tgaagaatac caagttcaac ttcgtgaaca aaaacatccc cttcgtgccc agcttcacca 2160
agctgtacaa caagattgag gacctgcgga ataccctgaa gtttttttgg agcgtgccca 2220
aggacaaaga agagaaggac gcccagatct acctgctgaa gaatatctac tacggcgagt 2280
tcctgaacaa gttcgtgaaa aactccaagg tgttctttaa gatcaccaat gaagtgatca 2340
agattaacaa gcagcggaac cagaaaaccg gccactacaa gtatcagaag ttcgagaaca 2400
tcgagaaaac cgtgcccgtg gaatacctgg ccatcatcca gagcagagag atgatcaaca 2460
accaggacaa agaggaaaag aatacctaca tcgactttat tcagcagatt ttcctgaagg 2520
gcttcatcga ctacctgaac aagaacaatc tgaagtatat cgagagcaac aacaacaatg 2580
acaacaacga catcttctcc aagatcaaga tcaaaaagga taacaaagag aagtacgaca 2640
agatcctgaa gaactatgag aagcacaatc ggaacaaaga aatccctcac gagatcaatg 2700
agttcgtgcg cgagatcaag ctggggaaga ttctgaagta caccgagaat ctgaacatgt 2760
tttacctgat cctgaagctg ctgaaccaca aagagctgac caacctgaag ggcagcctgg 2820
aaaagtacca gtccgccaac aaagaagaaa ccttcagcga cgagttggaa ctgatcaacc 2880
tgctgaacct ggacaacaac agagtgaccg aggacttcga gctggaagcc aacgagatcg 2940
gcaagttcct ggacttcaac gaaaacaaaa tcaaggaccg gaaagagctg aaaaagttcg 3000
acaccaacaa gatctatttc gacggcgaga acatcatcaa gcaccgggcc ttctacaata 3060
tcaagaaata cggcatgctg aatctgctgg aaaagatcgc cgataaggcc aagtataaga 3120
tcagcctgaa agaactgaaa gagtacagca acaagaagaa tgagattgaa aagaactaca 3180
ccatgcagca gaacctgcac cggaagtacg ccagacccaa gaaggacgaa aagttcaacg 3240
acgaggacta caaagagtat gagaaggcca tcggcaacat ccagaagtac acccacctga 3300
agaacaaggt ggaattcaat gagctgaacc tgctgcaggg cctgctgctg aagatcctgc 3360
accggctcgt gggctacacc agcatctggg agcgggacct gagattccgg ctgaagggcg 3420
agtttcccga gaaccactac atcgaggaaa ttttcaattt cgacaactcc aagaatgtga 3480
agtacaaaag cggccagatc gtggaaaagt atatcaactt ctacaaagaa ctgtacaagg 3540
acaatgtgga aaagcggagc atctactccg acaagaaagt gaagaaactg aagcaggaaa 3600
aaaaggacct gtacatccgg aactacattg cccacttcaa ctacatcccc cacgccgaga 3660
ttagcctgct ggaagtgctg gaaaacctgc ggaagctgct gtcctacgac cggaagctga 3720
agaacgccat catgaagtcc atcgtggaca ttctgaaaga atacggcttc gtggccacct 3780
tcaagatcgg cgctgacaag aagatcgaaa tccagaccct ggaatcagag aagatcgtgc 3840
acctgaagaa tctgaagaaa aagaaactga tgaccgaccg gaacagcgag gaactgtgcg 3900
aactcgtgaa agtcatgttc gagtacaagg ccctggaaaa aaggccggcg gccacgaaaa 3960
aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagtgac tcgagcacgt gctacgagat ttcgattcca 4020
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 4080
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 4140
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 4200
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atctta 4246
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctcttttc tctgcggaac gttctggc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggctttctt tatcatctcg gtgatcct 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctctttctg caccttgtca cacagtag 28
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaacaccga tttagactac cccaaaaacg aaggggacta aaac 44
<210> 6
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctcttttc tctgcggaac gttctggcga aacaccgatt tagactaccc caaaaacgaa 60
ggggactaaa accggctttc tttatcatct cggtgatcct gaaacaccga tttagactac 120
cccaaaaacg aaggggacta aaaccctctt tctgcacctt gtcacacagt ag 172

Claims (13)

1.一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，由DMP启动子和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达，构建新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体。
2.根据权利要求1所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述DMP启动子是一种NF-κB特异性启动子，由NF-κB诱骗子和最小启动子连接形成，该启动子可激活其下游基因在各种癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达；所述DMP启动子可激活Cas13a基因在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。
3.根据权利要求1所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述U6启动子为一种真核细胞RNA聚合酶III识别启动子，可激活gRNA在真核细胞中的表达。
4.根据权利要求1-3任一所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体的功能元件为DMP-Cas13a-U6-gRNA；所述功能元件DMP-Cas13a-U6-gRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1-3任一所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述CRISPR Cas13a-gRNA表达载体其表达产物为Cas13a蛋白和gRNA；所述gRNA的5′端为靶向特定基因mRNA的28nt序列；所述Cas13a蛋白和gRNA可形成Cas13a-gRNA复合物，该复合物中的Cas13a蛋白在gRNA的引导下可靶向结合并切割特定基因的mRNA，造成其表达抑制。
6.根据权利要求5所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述特定基因可以是任何编码RNA、多肽或蛋白的基因，其编码产物可促进癌细胞生长、转移或耐药；所述特定基因其表达经Cas13a-gRNA复合物抑制后，可引发癌细胞生长、转移或耐药的抑制。
7.根据权利要求5所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述特定基因为促癌相关基因。
8.根据权利要求5所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述促癌相关的特定基因优选为TERT、EZH2和RelA基因中的一种或者多种。
9.根据权利要求8所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，可靶向特定基因TERT、EZH2和RelA的mRNA的28nt序列分别为5′-CCCTC TTTTC TCTGC GGAAC GTTCTGGC-3′、5′-CGGCT TTCTT TATCA TCTCG GTGAT CCT-3′及5′-CCTCT TTCTG CACCT TGTCACACAG TAG-3′。
10.根据权利要求5所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述CRISPR Cas13a-gRNA表达载体产生的gRNA为可同时编码靶向多个基因的gRNA；此时gRNA5′端序列的固定结构为28nt-间隔序列-28nt-间隔序列-28nt-间隔序列，依次循环类推，最后以一个28nt序列结束；所述间隔序列为GAAAC ACCGA TTTAG ACTAC CCCAA AAACG AAGGGGACTA AAAC。
11.根据权利要求10所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述gRNA同时靶向多个基因TERT、EZH2和RelA的mRNA时，其gRNA的5′端序列为5′-CCCTC TTTTCTCTGC GGAAC GTTCT GGCGA AACAC CGATT TAGAC TACCC CAAAA ACGAA GGGGA CTAAA ACCGGCTTTC TTTAT CATCT CGGTG ATCCT GAAAC ACCGA TTTAG ACTAC CCCAA AAACG AAGGG GACTAAAACC CTCTT TCTGC ACCTT GTCAC ACAGT AG-3′。
12.一种权利要求1所述的新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体在制备新型癌症基因治疗试剂中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述Cas13a-gRNA表达载体可被包装进腺相关病毒或者溶瘤病毒等病毒颗粒，用于通过皮下、瘤内或者静脉等方式注射进体内，进行体内癌细胞的生长抑制。
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