ES2288318T3

ES2288318T3 - Uso de dna-pk.

Info

Publication number: ES2288318T3
Application number: ES99937188T
Authority: ES
Inventors: Gloria C. Li; Paul J. J. Burgman
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2008-01-01
Anticipated expiration: 2019-06-30
Also published as: HK1036483A1; WO2000000644A1; AU5206899A; EP1090146A1; JP2002519010A; CA2332179C; DE69936141D1; EP1090146A4; DE69936141T2; ATE362994T1; CA2332179A1; EP1090146B1

Abstract

Un procedimiento in vivo para aumentar la susceptibilidad de una célula a agentes que dañan el DNA, que comprende introducir en la célula un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula al daño al DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación, y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

Description

Uso de DNA-PK.

En esta solicitud se hace referencia a publicaciones entre paréntesis. Se pueden encontrar citas completas para estas referencias al final de cada serie de experimentos. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad describen con más detalle el estado de la técnica a la que pertenece la invención.

Antecedentes de la invención

Se han identificado en células de mamíferos dos procesos característicos que están implicados en las roturas de la doble hebra (DSB) de DNA: la reparación del daño al DNA inducida por radiación ionizante y la recombinación V(D)J durante el desarrollo de linfocitos B y C. Hasta ahora, todos los mutantes de células de mamíferos que carecen de reparación de DSB de DNA comparten el fenotipo común de hipersensibilidad a la radiación y capacidad limitada para sufrir recombinación V(D)J (1-6). Estudios de fusión celular que usan mutantes para reparación de DSB de híbridos somáticos de humanos-roedores han definido cuatro grupos complementarios: IR4, IR5, IR6 e IR7. Análisis genéticos y bioquímicos han revelado que células de IR5 (por ejemplo, xrs-6) e IR7 (por ejemplo, scid) son deficientes en componentes de la proteína quinasa dependiente del DNA (DNA-PK) (2, 7-9). La DNA-PK es una serina/treonina quinasa compuesta por una gran subunidad catalítica (DNA-PK_{cs}) y un componente determinante de diana de DNA denominado Ku, que a su vez es un heterodímero de un polipéptido de 70-kDa (Ku70) y 86-kDa (Ku80) (10-12). Recientemente, se ha demostrado que la DNA-PK es la responsable génica de la deficiencia scid murina (inmunodeficiencia combinada grave) (13-15); y se ha identificado que Ku80 es XRCC5 (16-18), el gen complementario para la reparación por rayos X para IR5. Se encontró que ratones con eliminación génica de Ku80 presentaban una grave inmunodefi-
ciencia combinada, procesado deficiente de intermedios de recombinación V(D)J y retraso en el crecimiento (19, 20).

Aunque se ha designado Ku70 como XRCC6 (7, 8) y es un componente importante del complejo DNA-PK, la función de Ku70 in vivo es desconocida hasta ahora. Para definir la función de Ku70 en la reparación de DNA y la recombinación V(D)J, los autores han dirigido a diana el gen Ku70 en ratones. Homocigotos de Ku70 presentaron enanismo proporcional, un fenotipo de ratones Ku80-/-, pero no scid. La ausencia de Ku70 confiere hipersensibilidad a la radiación ionizante y deficiencia en la reparación de DSB de DNA, que son características de ratones Ku80-/- y scid. De forma sorprendente, al contrario que los ratones Ku80-/- y scid, en los que el desarrollo de linfocitos T y B se detiene en una etapa temprana, la falta de Ku70 es compatible con la recombinación génica del receptor de linfocitos T y el desarrollo de linfocitos T CD4^{+}CD8^{-} y CD4^{-}CD8^{+} maduros. Nuestros datos, por primera vez, proporcionan una evidencia directa que apoya que Ku70 juega una función esencial en la reparación de DSB de DNA, pero no es necesaria para la recombinación génica de TRC. Estos resultados sugieren que vías solapadas pero diferenciadas de reparación pueden mediar en la reparación de DSB y en la recombinación V(D)J: además, sugiere la presencia de una vía de reserva independiente de Ku70 en la recombinación V(D)J de TCR. El fenotipo característico de ratones Ku70-/-
haría de estos valiosas herramientas para desenmarañar los mecanismos de reparación y recombinación de DNA.

Ku es un complejo de dos proteínas, Ku70 y Ku80, que funcionan como un heterodímero para unir roturas en la doble hebra de DNA (DSB) y activar la proteína quinasa dependiente del DNA (DNA-PK). La función de la subunidad Ku70 en la reparación de DSB de DNA, hipersensibilidad a la radiación ionizante y recombinación V(D)J se examinó en ratones que carecían de Ku70 (Ku70-/-). Al igual que los ratones Ku80-/-, los ratones Ku70-/- mostraron una profunda deficiencia en la reparación de DSB de DNA y fueron enanos proporcionales. De forma sorprendente, al contrario que en ratones Ku80-/-, en los que de detuvo tanto el desarrollo de linfocitos T como B en una etapa temprana, la ausencia de Ku70 fue compatible con recombinación génica con el receptor de linfocitos T y el desarrollo de linfocitos T CD4^{+}CD8^{-} y CD4^{-}CD8^{+} maduros. Nuestros datos muestran, por primera vez, que Ku70 desempeña una función esencial en la reparación de DSB de DNA, pero que no es necesario para la recombinación V(D)J de TCR. Estos resultados sugieren que vías de reparación distintas pero solapadas pueden mediar en la reparación de DSB de DNA y en la recombinación V(D)J.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un procedimiento in vitro para aumentar la susceptibilidad de una célula a agentes que dañan el DNA, que comprende introducir en la célula un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA previniendo la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula a roturas de DNA inducidas por calor, agentes químicos o radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80.

Esta invención también proporciona el uso de un oligonucleótido antisentido para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor en un sujeto, en el que el oligonucleótido se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad del tumor a rotura del DNA inducida por calor, agentes químicos o radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80.

Además, esta invención proporciona el uso de un vector de expresión para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un sujeto, en el que el vector comprende (a) un promotor de choque térmico y (b) una porción que codifica un oligonucleótido antisentido que se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; e inducir la expresión del oligonucleótido antisentido, en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad del tumor a rotura del DNA inducida por calor, agentes químicos o radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80.

También se describe en la presente un oligonucleótido antisentido que se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80, para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA.

Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende los oligonucleótidos antisentido descritos antes y un vehículo.

Breve descripción de las figuras Figura 1

Inactivación de Ku70 por recombinación homóloga. (A) Representación esquemática del locus Ku70 (superior), la construcción de localización (centro), el alelo dirigido a diana y sonda de hibridación (inferior). Se indican los sitios de restricción EcoRI usados para detectar el gen dirigido a diana y se indican (21): Transferencia Southern de DNA de la cola digerida por EcoRI de ratones dirigidos a Ku70 control tipo salvaje (WT), heterocigóticos (+/-) y homocigóticos (-/-). Los fragmentos de tipo salvaje y mutantes son de 13 y 5,7 kb respectivamente. (C) Análisis de transferencia Western que muestra que la proteína Ku70 no se expresa en células Ku70-/-. Los lisados de células completas preparados a partir de fibroblastos de oído de ratón (50 \mug) y fibroblastos embrionarios de ratón (100 \mug) se separaron por SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de celulosa y se insertó una sonda con anticuerpos policlonales frente a Ku80 (superior) y Ku70 (inferior) de roedores de longitud completa, respectivamente. (D) Ensayo de cambio de movilidad en gel (22) que muestra la falta de actividad de unión al extremo de DNA en células Ku70-/-. El complejo de unión Ku-DNA está indicado por una flecha a la derecha.

Figura 2

El desarrollo de linfocitos B, pero no de linfocitos T, está bloqueado en un estadio temprano en ratones Ku70-/-. (A) Histología del timo (Thy), nódulos linfáticos (LN) y bazos (Spl) de ratones control tipo salvaje, ratones Ku70-/- y ratones Ku80-/- (23). Se indican la corteza (C) y las médulas (M). W, pulpa blanca; R, pulpa roja; GC, centro germinal. Grupos a a i, las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE); grupos j a l, las secciones tisulares se tiñeron con anti-CD3 (CD3); y grupos m a o, los tejidos se tiñeron con anti-CD19 (CD19). Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19 se ensayaron en secciones congeladas y en parafina de órganos linfoides de tipo salvaje y mostraron los patrones específicos esperados de tinción. (B) Análisis de citometría de flujo de timocitos (Thy), células de médula ósea (BM) y bazo (Spl) de ratones Ku70-/-, hermanos de camada de Ku70+/+ y ratones Ku80-/-. CD4, anticuerpo monoclonal anti-CD4; CD8, anticuerpo monoclonal anti-CD8; B220, anticuerpo monoclonal anti-B220; CD43, anticuerpo monoclonal anti-CD43; IgM, anticuerpo monoclonal anti-lg\mu-cadena pesada. Los datos se analizaron y se separaron las células linfoides vivas en base a propiedades de dispersión frontal y ortogonal; se analizaron 10.000-20.000 células por muestra. (C) Análisis de expresión de cadena TCR\beta en ratones Ku70-/-. Los timocitos y células de bazo se obtuvieron de hermanos de camada de Ku70-/-, Ku80-/- y de tipo salvaje y se analizaron para determinar la expresión de CD4, CD8 y TCR\beta por citometría de flujo de 3 colores. Se mostró la expresión de TCR\beta de linfocitos T positivas únicas CD4^{+} y CD8^{+}.

Figura 3

Se reagruparon el receptor del antígeno de linfocitos T y el gen de inmunoglobulina en ratones Ku70-/-. (A) Recombinación de V558L, V7183 a DJ_{H}, y segmentos génicos D_{H} a J_{H} (26). Se usaron 100 ng de DNA para ratones Ku70-/- (carriles 7 y 8), Ku80-/ (carriles 1, 2 y 3) y SCID (carriles 4, 5 y 6) y 1, 10 y 100 ng para ratones WT (carriles 9-11). Para los controles IVS, se diluyó el DNA 100 veces antes de la PCR. (B) Análisis PCR de reagrupaciones del gen TCR. Se ensayó DNA de timo para la recombinación de las reagrupaciones V\beta8-J\beta2 y D\delta2 a J\delta1 (20, 27, 28). Se usaron 100 ng de DNA para los ratones Ku70-/- (carriles 2 y 7), Ku80-/- (carril 1) y Ku70+/ (carril 7) y 1, 10 y 100 ng para ratones WT (carriles 4-6). Los controles incluyen un intervalo de línea germinal de 1-kb amplificado en la región implicada D\delta2 a J\delta1 (línea germinal), y un segmento no recombinante del locus Ig entre J_{H} y C_{H}1. Se examinaron las mismas muestras de DNA del timo para la recombinación V\beta8-J\beta2 y D\delta2 a J\delta1. Abreviaturas: DJ_{H}, reagrupaciones D_{H} a J_{H}; V7183J_{H} y V558LJ_{H}, reagrupaciones V7183 y V558L a DJ_{H} (26); V\beta8J\beta2.1 a V\beta8-J\beta2.6, reagrupaciones V\beta8 a DJ\beta2 (28); línea germinal, DNA no recombinado del intervalo D\delta2 a J\delta1; D\delta2J\delta1, reagrupaciones D\delta2 a J\delta1 (20, 27); IVS, segmento no recombinante del locus Ig entre J_{H} y C_{H}1 (26). Varios carriles por debajo de cada marca genotípica (Ku70-/-, Ku80-/- y SCID) representan diferentes animales individuales.

Figura 4

La ruptura de Ku70 confiere hipersensibilidad a la radiación y una deficiencia en la reparación de DSB del DNA. (A) Curvas de supervivencia a la radiación para las unidades formadoras de colonia de granulocitos/macrófagos (CFU-GM) en la médula ósea de ratones tipo salvaje (WT), Ku70-/- y Ku80-/- (30, 32). (B) Deficiencia en la reparación de DSB inducidas por radiación en células Ku70-/- y Ku80-l (31). El grupo superior muestra la nueva unión de DSB de DNA producidas por rayos X de 40 Gy; (C) Inducción de DSB de DNA en función de la dosis de radiación en células WT, Ku70-/- y Ku80-/. Los símbolos son \bullet para células WT (tipo salvaje), \blacktriangle para Ku70-/- y \blacksquare para Ku80-/-, respectivamente.

Figura 5

Ruptura del locus Ku70 en células de ratón ES y generación de ratones Ku70-/-. (A) Representación esquemática del locus Ku70 (superior), la construcción de localización (centro), el alelo dirigido a diana (inferior) y los cebadores de PCR. Los sitios de restricción EcoRI (E) usados para detectar los genes dirigidos a diana están indicados. (B) Análisis de PCR de DNA de la cola de ratones Ku70+/+, Ku70+/- y Ku70-/-. La secuencia de tipo salvaje que se amplificó usando cebadores HO-4/HO-3 no estaba presente en la cola del ratón Ku70-/- aunque la secuencia alterada cebada por HO-4/HO-2 no se expresó en el ratón Ku70+/+. (C) Crecimiento postnatal de hermanos de camada de Ku70+/+ y Ku70-/-. Se representan frente al tiempo los pesos promedio de siete animales de cada genotipo. No hubo diferencia significativa en el peso corporal entre ratones Ku70+/+ y Ku70+/-. (D) Fotografía de hermanos de camada Ku70+/+ Ku70-/- de cinco semanas.

Figura 6

Curvas de supervivencia de ratones Ku70+/+, Ku70+/- y Ku70-/-. Los tamaños de muestra usados para el análisis estadístico son (Kaplan and Meier, 1958): n (+/+) = 102, n (+/-) - 326 y n (-/-) = 185.

Figura 7

Análisis histológico de los tumores espontáneos que se desarrollan en ratones Ku70-/-. (A & D) Fotomicrografías de secciones de un linfoma de timo procesado como sigue: (A), tinción con hematoxilina y eosina; (D), tinción de superficie inmunohistoquímica positiva frente al marcador de superficie de linfocitos T CD3. (B, C, E y F) Fotomicrografías de secciones de tejidos pulmonares que muestran implicación del tumor. (B) y (C), hematoxilina y eosina; (E) y (F), superficie inmunohistoquímica positiva frente al marcador CD3 de superficie de linfocitos T. B, luz de los bronquios; V, vaso sanguíneo. (G) Análisis de citometría de flujo de células tumorales. Las células se marcaron con anticuerpos anti-CD4 conjugados con PE y anti-CD8 conjugados con FITC. Aumentos originales: A, C, D y F, 400 x; B y E, 100 x.

Figura 8

Transformación neoplásica de fibroblastos de oído de ratón (MEF) de pase temprano Ku70-/-. (B) Morfología de focos transformados (tipo III). (C) Ensayo de formación de colonias en agar blando. Izquierda, MEF sin transformar tipo salvaje (Ku70^{+/+}); centro izquierda, MEF sin transformar Ku70-/-; centro derecha (foco T1), células de un foco producidas por transformación espontánea de Ku70-/-MEFs (pase 7); y derecha (foco C2), células de un foco producidas por transformación de MEF Ku70^{-/-} cotransfectados con E6/E7. Las células de otros focos elegidos al azar también fueron capaces de producir colonias en agar blando.

Figura 9

Sensibilidad a la radiación de fibroblastos Ku70-/- y ratones Ku70^{-/-}. (A) Fibroblastos de oído primarios Ku70-/-
y Ku70+/+ tipo salvaje (pase 7) se expusieron a dosis medidas de irradiación \gamma. Las células con deficiencia en Ku70 muestran una capacidad significativamente reducida para formar colonias después de radiación ionizante al compararlas con células tipo salvaje. (B) Supervivencia de ratones Ku70-/- y tipo salvaje irradiados con 400 cGy. Se irradiaron cinco ratones adultos (4 meses) de cada genotipo simultáneamente y se controlaron durante 2 semanas. Mientras que todos los de tipo salvaje sobrevivieron, el 100% de los ratones Ku70-/- murieron en este período.

Figura 10

Apariencia histológica de anomalías gastrointestinales segmentales de ratones Ku70-/-. Los tejidos gastrointestinales de un ratón de tres meses Ku70-/- se tiñeron con hematoxilina y eosina y se fotografiaron. (A) Apariencia normal del intestino en presencia de neuronas ganglionares (400x). (B) Sección del intestino del mismo animal que muestra ausencia de neuronas ganglionares (400x). (C) A un menor aumento (100x) se muestra la aganglionosis segmental que se desarrolló en un ratón Ku70-/-. La porción izquierda de la muestra presenta ausencia completa de neuronas ganglionares. Este fenotipo está asociado con la no aparición de la morfología típica de las vellosidades intestinales, dilatación de la luz intestinal y despojada de la mucosa, así como distensión segmental del intestino. Como contraste, la porción derecha de la muestra presenta una apariencia normal que se observa en los hermanos de camada de tipo salvaje.

Figura 11

Alteración Ku70 en tumores humanos. Análisis inmunohistoquímico de la expresión de Ku70 en linfomas de linfocitos T humanos. (A-C), linfomas de linfocitos B (D-F) y en bazo normal humano (G). La fotomicrografía del bazo (parafina) ilustra la tinción nuclear frente a Ku70 (G). (A) Fotomicrografía que ilustra un linfoma de linfocitos T (muestra nº 2 - parafina) con tinción nuclear positiva frente a Ku70, (B y C) Fotomicrografías de linfomas de linfocitos T (muestras nº T13 y T9 - parafina y congelada, respectivamente) que muestran tinción inmunohistoquímica negativa frente a Ku70. En el grupo (C), la flecha apunta a células endoteliales con tinción nuclear positiva por Ku70, que sirve como control positivo interno. (D) Fotomicrografía que ilustra un linfoma de linfocitos B (muestra nº 4 - parafina) con tinción nuclear positiva frente a Ku70. (E) Fotomicrografía de un linfoma de linfocitos B (muestra nº B8 - parafina) que muestra tinción inmunohistoquímica negativa frente a Ku70. (F) Fotomicrografía de un linfoma de linfocitos B (muestra nº 9 - congelada) que muestra tinción citoplásmica de Ku70. Aumento original: A a G, 400x. (H) Análisis representativo de PCR-SSCP. El carril 3 ilustra el cambio de banda Ku70 identificado por PCR-SSCP que corresponde a la muestra nº T3. Carril 1, control interno (normal); carril 2, tumor que corresponde a la muestra nº T8, que no muestra cambio de banda. Más abajo se muestran resultados de secuenciación directa del producto PCR obtenido de la muestra tumoral nº T3. Se encontró que la sustitución de un único par de bases (ACA\rightarrowATA) era específica del tumor (ausente en tejido normal) afectando al codon 292, cambiando una treonina a isoleucina. (I) Secuenciación directa RT-PCR representativa de un linfoma de linfocitos T (muestra nº T3) y su tejido normal correspondiente. Sustituciones de bases sencillas están indicadas en los codones 452 (ATC\rightarrowGTC) y 453 (ATG\rightarrowACG), cambiando isoleucina a valina y metionina a treonina. Estas alteraciones se encontró que eran específicas del tumor y estaban ausentes en tejidos normales. (J) Secuenciación directa RT-PCR representativa de un neuroblastoma (muestra nº N10) y su tejido normal correspondiente. Las sustituciones de bases sencillas están indicadas en el codon 530 (TAC\rightarrowCAC) y el codon 529 (GTT\rightarrowGTC), cambiando tirosina a histidina en el codon 530, y produciendo una mutación silenciosa en el codon 529 (valina a valina), respectivamente. También se encontró que estas mutaciones eran específicas del tumor y estaban ausentes en tejido normal correspondiente.

Figura 12

Efecto de (A) radiación, (B) bleomicina, (C) adriamicina y (D) Etopósido sobre células de ratón con deficiencia en Ku70 y Ku80.

Figura 13

Efecto de (A) radiación y (B) adriamicina sobre diferentes tipos de células. \medcirc = células control HeLa; \blacksquare = células HeLa que expresan Ku70 antisentido; \blacktriangle = células HeLa que expresan Ku80 antisentido.

Figura 14

Secuencias de nucleótidos de uniones V\beta8D\beta2.1J\beta2.6 de timo de un ratón de 4 semanas Ku70-/-. Los productos correspondientes a una reagrupación V\beta8.1, V\beta8.2 o V\beta8.3 con J\beta2.6 se clonaron y secuenciaron. Las uniones TCR V\beta8-J\beta2 se amplificaron por PCR (20, 27, 28) como se describe (véase la Fig. 3B). Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 94ºC durante 45'', 68ºC durante 30'' y 72ºC durante 30'' (30 ciclos). La banda que corresponde a V\beta8-J\beta2.6 se amplificó, se volvió a amplificar durante 20 ciclos y luego se subclonó en el vector pCRII (Invitrogen). Se extrajo DNA de colonias individuales y se secuenció usando los cebadores inversos universales T7 y M13. Las secuencias de línea germinal se escriben en negrita, "N" y "P" denotan nucleótidos no presentes en las secuencias germinales.

Figura 15

Inactivación de DNA-PKcs por recombinación homóloga. (A) Diagrama esquemático del locus DNA-PKcs murino del exon 1 a 10 y sonda de hibridación (superior), la construcción de localización (centro) y el alelo dirigido a diana (inferior). Se indican los sitios de restricción BamHI (B), EcoRI(E) y HindIII(H). (B) Transferencia Southern del DNA de la cola digerido con BamHI-de ratones con DNA-PKcs dirigido a diana tipo salvaje (WT), heterocigóticos (+/-) y homocigóticos (-/-). Los fragmentos tipo salvaje y mutantes son de 10 y 2,2 kb respectivamente. (C) RT-PCR de regiones 5'- (exon 1 - 4) y 3'-(dominio PI-3 quinasa) de RNA de DNA-PKcs de tipo salvaje, DNA-PKcs dirigido a diana y células de ratón SCID. El RNA total se aisló de fibroblastos pulmonares transformados con SV40. Las reacciones de PCR se realizaron con (+) o sin (-) transcriptasa inversa (RT). La RT-PCR para GAPDH se llevó a cabo para garantizar la integridad del RNA. (C) Análisis de transferencia Western de las diversas células. Los extractos de células completas se prepararon a partir de fibroblastos de pulmón primarios y transformados con SV40. Para la detección se usaron anticuerpos monoclonales anti-DNA-PCcs y anticuerpo policlonal anti-Ku70. Obsérvese que hay otro gen, MCM4, que está localizado aproximadamente 700 pb cadena arriba de DNA-PKcs. La transcripción de DNA-PKcs y MCM4 se controlan independientemente por dos promotores diferentes localizados en esta región de 700 pb. Los autores han diseñado cuidadosamente el vector de la eliminación génica de DNA-PKcs en el exon 3, que está aproximadamente 10 kb alejado de la región promotora, evitando así la posibilidad de interferencia con la expresión del gen MCM4. Además, también se ha demostrado que el RNAm de DNA-PKcs truncado es expresado en ratones DNA-PKcs-/-, confirmando que la región promotora del gen DNA-PKcs no se ve afectada por nuestra construcción con eliminación génica.

Figura 16

El desarrollo de linfocitos está bloqueado en estadios tempranos en ratones DNA-PKcs-/-. (A) Análisis histológico del timo (Thy), bazo (Spl) y nódulos linfáticos (LN) de ratones tipo salvaje y DNA-PKcs-/- (aumento x 200). Las secciones tisulares se tiñeron con hematoxilina y eosina. En muestras de tejido de ratones con deficiencia en DNA-PKcs, los autores observaron ausencia de la histología normal y reemplazo por células inmaduras. Las abreviaturas son como sigue: C, corteza; M, médula; W, pulpa blanca; R, pulpa roja; GC, centro germinal. (B) Análisis de citometría de flujo de células del timo (Thy), médula ósea (BM) y bazo (Spl) para la presencia de linfocitos T y B maduros y precursores. Los timocitos y esplenocitos se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo frente a CD4 y CD8; los esplenocitos y células de la médula ósea se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo frente a B220 e IgM o CD43. Los perfiles mostrados son resultados representativos de un ratón DNA-PKcs-/- de 4 a 5 semanas, su hermano de camada heterocigótico y un ratón de igual edad CB-17 SCID. (C) Reagrupación del gen de TCR e inmunoglobulina en ratones DNA-PKcs-/. (a) Reagrupación de TCR\beta por análisis PCR. El DNA del timo y el bazo se ensayó para determinar la recombinación de V_{\beta}8-J_{\beta} 2.6. Tanto la cantidad como la diversidad de reagrupación de TCR_{\beta} se redujeron en ratones DNA-PKcs-/- y SCID. (b) Unión codificante de la reagrupación de TCR_{\beta}. El DNA del timo y el bazo se ensayaron para determinar la recombinación de D_{\delta}2-J_{\delta}1. (c) Unión señal de la reagrupación de TCR_{\delta}. El DNA del timo se ensayó para determinar productos de unión señal circulares D_{\delta}2-J_{\delta}1. Existe una señal más amplificada para ratones DNA-PKcs-/- y SCID que para ratones control heterocigóticos. (e) Reagrupación de la cadena pesada de inmunoglobulina por análisis PCR. Para la recombinación de V_{H}7183-J_{H}4 se usaron DNA de médula ósea (BM) y bazo. La reagrupación en DNA-PKcs-/- y SCID se reduce drásticamente tanto en la médula ósea como en el bazo. (d) y (f) amplificación GAPDH control de DNA del timo, bazo y médula ósea (BM) DNA. DNA (100, 10 ó 1 ng) del timo, bazo y médula ósea (BM) o un ratón DNA-PKcs+/- de 5 semanas (carril 1-3), de un ratón DNA-PKcs+/- de 9 semanas (carril 4-6) y 100 ng de DNA de tres ratones individuales DNA-PKcs-/- (carril 7-9) y tres ratones SCID individuales (carril 10-12). Los ratones DNA-PKcs-/- y SCID analizados también tenían de 4-9 semanas de edad.

Figura 17

Respuesta a dosis de radiación de células DNA-PKcs-/-. La supervivencia clonogénica se midió en fibroblastos de pulmón de ratones transformados con SV40 irradiados con dosis medidas de radiación ionizante. Células DNA-PKcs-/- muestran una sensibilidad similar a la radiación ionizante que SCID y son mucho menos sensibles que las células de tipo salvaje (+/+) y heterocigóticas (+/-).

Figura 18

Lesiones preneoplásicas en ratones DNA-PKcs-/-. Muestras intestinales de ratones DNA-PKcs-/ se seis semanas a seis meses se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se fotografiaron. (A) Sección de tejido intestinal que muestra inflamación e hiperplasia epitelial leve (aumentos x 100). (B) Fotomicrografía de mucosa del colon que muestra hiperplasia de las criptas con displasia leve a moderada (aumentos x200). (C) Pólipo adenomatoso del colon que muestra áreas de displasia severa (aumentos x400). (D) Focos de las criptas aberrantes a lo largo de la mucosa intestinal que muestran displasia severa (aumentos x400). (E) Sección de tejido intestinal de un ratón tipo salvaje que muestra morfología normal (aumentos x 250)).

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona un procedimiento in vitro para aumentar la susceptibilidad de una célula a agentes que dañan el DNA, que comprende introducir en la célula un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad proteína quinasa dependiente del DNA de modo que se previene la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula al daño en el DNA inducido por calor, agentes químicos o por radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del ADN es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80.

Se han presentado en la técnica procedimientos para introducir un ácido nucleico en células. Se puede introducir ácido nucleico intacto en la célula por transformación directa. De forma alternativa, la molécula de ácido nucleico puede estar embebido en liposomas. Por consiguiente, esta invención proporciona los procedimientos anteriores en los que el ácido nucleico se introduce en las células por tecnología de DNA no transformado, vector adenovirus, vector virus adenoasociado, vector virus de Epstein-Barr, vector Herpes virus, vector VIH atenuado, vectores retrovirales, vector virus vaccinia, liposomas, liposomas revestidos de anticuerpos, coprecipitación con fosfato de calcio, medios eléctricos o mecánicos (es decir, electropermeabilización). Sirviendo los procedimientos indicados antes únicamente como ejemplos de medios posibles de introducción de ácido nucleico en células. También se pueden usar en esta invención otros procedimientos conocidos.

Esta invención también proporciona el procedimiento anteriormente descrito, en el que el oligonucleótido antisentido se introduce en un liposoma antes de la introducción en la célula.

Esta invención también proporciona el uso de un oligonucleótido antisentido para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor en un sujeto, en el que el oligonucleótido se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad del tumor a daño en el DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

Tal como se usa en la presente memoria, la administración de dicha composición farmacéutica se puede efectuar o llevar a cabo usando cualquiera de los diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La administración puede comprender administración intravenosa. La administración también puede comprender administración intramuscular. La administración puede comprender además administración subcutánea. La administración puede comprender también administración oral.

También se describe el uso anteriormente descrito, en el que el oligonucleótido antisentido se introduce en un liposoma antes de ser administrado al sujeto.

También se describen los usos anteriormente descritos, en los que la administración al sujeto de un oligonucleótido antisentido comprende: administrar a un sujeto un vector de expresión para el oligonucleótido antisentido; e introducir la expresión del oligonucleótido antisentido.

Se pueden emplear numerosos vectores para la expresión de proteínas de la invención. Tales vectores, incluyendo los vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores bacteriófagos y otros virus, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de DNA que se obtienen de virus animales tales como el virus del papiloma humano, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MoMLV), virus de Semliki Forest o virus SV40. Además, se pueden seleccionar células que han integrado de forma estable el DNA en sus cromosomas introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células hospedadoras transfectadas. Los marcadores pueden proporcionar, por ejemplo, prototrofia a un hospedador auxotrófico, resistencia biocida o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a secuencias de DNA a expresar o introducirse en la misma célula por cotransformación. Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias de promotor para unir RNA polimerasa y secuencias de inicio de transcripción para la unión ribosómica. Otros elementos pueden ser necesarios para la síntesis óptima de mRNA. Estos elementos adicionales pueden incluir señales de corte y empalme, así como potenciadores y señales de terminación. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia Shine-DalgRNAo y el codon de inicio AUG: De igual forma, una vector de expresión eucariótico incluye un promotor heterólogo u homólogo para RNA polimerasa II, una señal de poliadenilación cadena abajo, el codon de inicio AUG, y un codon de terminación para la separación del ribosoma. Tales vectores se pueden obtener comercialmente o ensamblarse a partir de las secuencias descritas por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los procedimientos descritos antes para la construcción de vectores en general.

Estos vectores se pueden introducir en una célula hospedadora adecuada para formar un sistema vector hospedador para producir las proteínas de la invención. Los procedimientos para preparar sistemas vectores hospedadores son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Células hospedadoras adecuadas incluyen, aunque sin quedar limitadas a las mismas, células bacterianas (incluyendo células gram positivas), células de levadura, células fúngicas, células de insectos y células animales.

Células animales adecuadas incluyen, aunque sin quedar limitadas a las mismas, células HeLa, células Cos, células CV1 y diversas células de mamíferos primarios. Se pueden usar como hospedadoras numerosas células de mamíferos, incluyendo, aunque sin quedar limitadas a las mismas, los fibroblastos de ratón NIH-3T3, células HeLa, células Ltk y células COS. Las células de mamífero se pueden transfectar por procedimientos bien conocidos en la técnica tales como precipitación en fosfato de calcio, electropermeabilización y microinyección.

En una realización, promotores inducibles se pueden fusionar con la región codificante del DNA para proporcionar un medio experimental de regular la expresión. De forma alternativa o adicional, se pueden fusionar elementos reguladores específicos de tejidos con la región codificante para permitir la expresión específica del tejido.

Se describen además los usos anteriormente descritos, que comprenden administrar al sujeto uno o más agentes que dañan el DNA.

Se describen además los usos anteriormente descritos, en los que los agentes que dañan el DNA son adriamicina, bleomicina o etopósido.

Se describen además los usos anteriormente descritos, en los que los agentes que dañan el DNA inducen roturas de la doble hebra.

Esta invención también proporciona el uso de un vector de expresión para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un sujeto, en el que el vector comprende (a) un promotor de choque térmico y (b) una porción que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA; e inducir la expresión del oligonucleótido antisentido, estando el oligonucleótido antisentido en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula a daño en el DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación; y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad de la proteína quinasa catalítica dependiente del DNA, una Ku70, o una Ku80.

En una realización, el promotor del choque térmico puede tener cierta actividad a 37ºC pero se hará más activo a temperatura algo mayor (es decir, 45ºC). En otra realización, el promotor del choque térmico puede no tener actividad a 37ºC, pero se hará más activo a temperatura algo mayor (es decir, 43ºC).

Esta invención proporciona también los usos anteriormente descritos en los que el oligonucleótido antisentido se introduce selectivamente en sitios de cáncer.

Sitios de cáncer incluyen sitios en o cerca de células que presentan un fenotipo de transformación maligno.

Esta invención proporciona los usos anteriormente descritos, que comprenden además dirigir calor, radiación o quimioterapia a sitios de cáncer.

Esta invención proporciona los usos anteriormente descritos, que comprenden además aplicar energía de campo eléctrico a sitios de cáncer.

Esta invención proporciona los usos anteriormente descritos, en los que la energía de campo eléctrico comprende radiación de radiofrecuencia.

Esta invención proporciona los usos anteriormente descritos, que comprenden además implantar un depósito de agentes quimioterápicos cerca de sitios de cáncer, liberándose los agentes quimioterápicos durante un período de tiempo de al menos ocho horas.

En una realización, los agentes quimioterápicos se encapsulan antes de la implantación.

También se describe en la presente memoria un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad de la proteína quinasa catalítica dependiente del DNA, Ku70 o Ku80, para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA.

También se describe en la presente memoria el oligonucleótido antisentido unido a una sustancia que inactiva el mRNA.

Además, se describen en la presente memoria los oligonucleótidos antisentido anteriormente descritos, en los que la sustancia que inactiva mRNA es una ribozima.

También se describen en la presente memoria los oligonucleótidos antisentido unidos a un elemento regulador.

Elementos reguladores incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, secuencias promotor para unir RNA polimerasa y secuencias de inicio de transcripción para unión a ribosomas. Otros elementos también pueden ser necesarios para la síntesis óptima de mRNA. Estos elementos adicionales pueden incluir, aunque sin quedar limitados a los mismos, señales de corte y empalme, así como potenciadores y señales de terminación.

También se describen en la presente memoria los oligonucleótidos antisentido anteriormente descritos, en los que el elemento regulador es un promotor inducible.

También se describen en la presente memoria los oligonucleótidos antisentido anteriormente descritos, en los que el elemento regulador es un promotor del choque térmico.

También se describe en la presente memoria un vector de expresión adaptado para la expresión de los oligonucleótidos antisentido anteriormente descritos.

También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los oligonucleótidos antisentido anteriormente descritos y un vehículo.

Vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, tampón fosfato 0,01-0,1M y preferiblemente 0,05M o una solución salina al 0,8%. Además, tales vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de sistemas no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohol/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer con lactado o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, quelatantes, gases inertes y similares.

También se describe en la presente memoria la composición farmacéutica anteriormente descrita, en la que el vehículo se adapta para pasar a través de una membrana plasmática de una célula.

Esta invención se comprenderá mejor a partir de los ejemplos siguientes. No obstante, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los procedimientos específicos y resultados discutidos son únicamente ilustrativos de la invención que se describe con más detalle en las reivindicaciones que siguen más adelante.

Detalles experimentales Primera serie de experimentos Materiales y procedimientos Ruptura objetivo de Ku70 y Generación de ratones Ku70^{-/-}

Se aisló gen Ku70 genómico de ratones de una genoteca de cósmidos sCos-I construida a partir de una línea de células madre embrionarias de la cepa 129 de ratón (21). El vector de sustitución se construyó usando un fragmento de 1,5 kb 5' que contenía el locus promotor con cuatro GC-box y el exon 1 y un fragmento de 8 kb EcoRV-EcoRI que se extiende desde el intrón 2 al intrón 5 como se indica en la Figura 1a. La sustitución homóloga dio como resultado una eliminación del exon 2 de 336 pb que incluye el codon de inicio de la traducción.

El vector de localización se linealizó con NotI y se transfectó en células madre embrionarias (ES) CJ7 por electropermeabilización usando un Bio-Rad Gene Pulser. Se rastrearon trescientos clones de células ES y se identificaron 5 clones que portaban la mutación en Ku70 por transferencia Southern. Los clones con ES positivos se inyectaron en blastocitos C57BL/6 para generar el ratón quimérico. Se transmitió con éxito un clon a través de la línea germinal después de cruzar con hembras C57 BL/6. Los ratones Ku70-/- homocigóticos se generaron por cruce con heterocigóticos Ku70+/-.

El genotipo del ratón se determinó primero por análisis PCR de la cola que distingue el alelo endógeno del alelo Ku70 dirigido a diana y, seguidamente se confirmó por análisis de transferencia Southern. La reacción PCR contenía 1 \mug de DNA genómico; 0,6 \muM (cada uno) de cebadores HO-2: GGGCCAGCTCATTCCTCCACTCATG, HO-3: CCTACAGTGTACCCGGACCTATGCC y HO-4: CGGAACAGGACTGGTGGTTGAGCC; 0,2 mM (cada uno) de dNTP; 1,5 mM MgCl_{2} y 2,5 U de Taq polimerasa. Las condiciones de los ciclos fueron 94ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto (30 ciclos), seguidos por una extensión a 72ºC durante 10 minutos. Los cebadores HO-2 y HO-4 dieron un producto del alelo dirigido a diana que tiene -380 pb; los cebadores HO-3 y HO-4 proporcionaron un producto tipo salvaje de 407 pb.

Análisis de transferencia Western y ensayo de cambio de movilidad en gel

Para confirmar que la ruptura de Ku70 produce una mutación nula, se midió la expresión de proteína Ku70 por transferencia Western usado antisuero policlonal contra Ku70 de ratón intacto. La falta de Ku70 también se verificó por un ensayo de unión al extremo de DNA de Ku (análisis de cambio de movilidad en gel). Los extractos celulares se prepararon y se llevaron a cabo ensayos de de cambio de movilidad en gel como se describe (22). Se incubaron cantidades iguales de proteína celular (50 \mug) a partir de fibroblastos embrionarios de ratones Ku70+/+ (WT), Ku70+/- y Ku70^{-/-} con un oligonucleótido de doble hebra marcado con ^{32}P, 5'-GGGCCAAGAATCTTCCAGCAGTTTCGGG-3'. Los oligonucleótidos ligados a proteína y libres se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida nativo al 4,5%. Se secaron bloques de gel y se autorradiografiaron con película Kodak X-Omat.

Immunohistoquímica

Para determinar los cambios patológicos, se prepararon y examinaron como se ha descrito previamente (23) secciones histológicas de diversos órganos de ratones hermanos de camada Ku70-/-, Ku80-/- y de tipo salvaje. Se fijaron nódulos linfáticos, bazos y timos de ratones de 4 a 5 semanas en formalina tamponada al 10% y se embebieron en parafina, o se embebieron en compuesto OCT (Miles Laboratories) y se congelaron en nitrógeno líquido a -70ºC. Se tiñeron secciones (5 \mum) con hematoxilina y eosina y se seleccionaron muestras representativas para análisis inmunohistoquímico. Se llevó a cabo un inmunofenotipado usando una técnica de avidina-biotina inmunoperoxidasa (24). Anticuerpos primarios incluyeron anti-CD3 (suero de conejo purificado, 1:1000, Dako), anti-B220 (monoclonal de rata, 1:1000, Pharmingen), anti-CD19 (monoclonal de rata, 1:1000, Pharmingen) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se incubaron seguidamente muestras con anticuerpos secundarios biotinilados (Vector Laboratories) durante 30 minutos (anticonejo de cabra, 1:100; antirata de cabra, 1:100) y luego con avidina-biotina peroxidasa (dilución 1:25, Vector Laboratories) durante 30 minutos. Se usó diaminobenzadina como cromógeno y hematoxilina como tinte en el contador. Para la valoración de los anticuerpos y controles positivos se usaron órganos linfoides de tipo salvaje incluyendo timo, bazo y nódulos linfáticos de diferentes ratones. Se analizaron anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19 en secciones congeladas y en parafina de órganos linfoides tipo salvaje y mostraron los patrones esperados de tinción. Para los controles negativos se sustituyeron los anticuerpos primarios por anticuerpos de la misma clase pero no relacionados en las mismas diluciones de trabajo finales.

Preparación de las células y análisis de citometría de flujo

Para la citometría de flujo, se prepararon para tinción como se ha descrito anteriormente (19) suspensiones de células aisladas de órganos linfáticos de ratones mutantes de 4 a 6 semanas y de la misma camada control y se analizaron en un aparato Becton Dickinson FACs Scan con un programa de Cell Quest. Las células se tiñeron con combinaciones de anti-CD4 marcado con ficoeritrina-(PE) y anti-CD8 marcado con fluoresceína (FITC) o anti-B220 marcado con PE y anti-CD43 marcado con FITC, anti-\mu FITC o anti-B220 PE (Pharmingen), según fuera necesario. Se recolectaron células de médula ósea de fémures por lavado con jeringa y se prepararon las células del timo y bazo por homogeneización. Las células se recogieron y lavaron en PBS más FCS al 5% y se realizó el recuento usando un hemacitómetro. Se analizaron muestras de ratones individuales por separado. Las células muertas se estudiaron y separaron en ventanas de análisis para sus propiedades de dispersión frontal y ortogonal. Los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces y proporcionaron resultados consistentes.

Preparación de DNA y análisis de productos de recombinación V(D)J

Para determinar si una mutación nula en Ku70 afecta a la recombinación de genes antígeno-receptor en linfocitos T y B in vivo, se midieron por PCR las reagrupaciones de inmunoglobulina y receptor del antígeno de linfocitos T (TCR). Se amplificó DNA de médula ósea con cebadores específicos para reagrupaciones inmunoglobulina D-J_{H} y V-DJ_{H}, y se amplificó DNA del timo con cebadores que detectan la reagrupación V-DJ_{\beta} y D_{\delta}-J_{\delta} (20, 25-28). Oligonucleótidos para sondas y cebadores PCR específicos para reagrupaciones TCR V\beta-J\beta y reagrupaciones inmunoglobulina D-J_{H} y V-DJ_{H} son los siguientes. Para la reagrupación TCR\beta V\beta8-J\beta2 (28): V\beta8.1: 5'-GAGGAAAGGT-GACATTGAGC-3', J\beta2.6: 5'-GCCTGGTGCCGGGACCGAAGTA-3', sonda V\beta8: 5'-GGGCTG AGGCTG ATCCATTA-3'. Para la reagrupación D_{\delta 2}-J_{\delta 1} (20, 27): DR6: 5'-TGGCTTGACATGCAGAAAACACCTG-3', DR53: 5'-TGAATTCCACAG
TCACTTGGCTTC-3', y sonda DR2: 5'-GACACGTGATACAAAGCCCAGGGAA-3'. Para las reagrupaciones inmunoglobulina D-J_{H} y V-DJ_{H} (26): 5'D: 5'-GTCAAGGGATCTACTACTGTG-3', V7183: 5'-GAGAGAATTCAGA
GACAATC-CCAAGAACACCCTG-3', VJ558L: 5'-GAGAGAATTCTCCTCCAGCACAG-CCTACATG-3', J2: 5'-GAGAGAATTCGGCTCCCAATGACCCTTTCTG-3', 5'IVS: 5'-GTAAGAATGGCCTCTCCAGGT-3', 3'-IVS: 5'-GACTCAATCACTAAGACA-GCT-3', y sonda: un fragmento EcoR I de 6 kb que cubre la región J de IgM de ratón.

Determinación de la supervivencia celular

Para nuestros estudios se usaron ratones de 8 a 10 semanas Ku70-/- y Ku80-/- y hermanos de camada de tipo salvaje. Se prepararon suspensiones celulares de médula ósea lavando el fémur con MEM suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 15%. La suspensión celular se contó entonces usando un hemacitómetro y centrifugando a 1000 rpm durante 12 minutos. El sedimento resultante se resuspendió y diluyó aproximadamente a 1 x 10^{6} células/ml en MEM más FCS al 15% para posteriores experimentos.

Para medir la supervivencia de progenitores de granulocitos-macrófagos se usó el procedimiento de Van Zant et al. (29) con ligeras modificaciones (30). De forma resumida, se usó FCS inactivado térmicamente al 30% que contenía \alpha-MEM y albúmina sérica bovina al 1%; además, se usó como fuente de factor estimulador de colonias 0,5 ng/ml de GM-CSF (R & D Systems). Un día antes de cada experimento, se añadieron 2,0 ml del medio anterior que contiene agar noble al 0,5% (DIFCO Laboratories) a discos Petri de 60 mm individuales. Inmediatamente después de la exposición a la radiación, se diluyeron las células en 2 ml del medio anterior con agar noble al 0,3% y se vertieron sobre las placas preparadas con una subcapa de agar noble al 0,5%. Las células se incubaron entonces a 37ºC con CO_{2} al 5% y 95-98% de humedad. Se realizó el recuento de las colonias el día 8 con un microscopio de disección. Las colonias de macrófagos y granulocitos se contaron por separado y luego se sumaron para los cálculos de supervivencia de progenitores de granulocitos-macrófagos (CFU-GM). Solo se almacenaron las colonias que contenían 50 o más células. La eficacia formadora de colonias de CFU-GMs fue 60 a 100/10^{5} células nucleadas para los controles no tratados. La fracción superviviente se definió como la eficacia de clonación de células de médula ósea irradiadas con respecto a las de los controles sin tratar. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos dos veces y proporcionaron resultados consistentes.

Electroforesis en gel con inversión de campo asimétrico

Para determinar la relación y extensión de la reparación de DSB de DNA en células con deficiencia en Ku después de exposición a radiación ionizante, se usaron fibroblastos embrionarios primarios derivados de ratones hermanos de camada Ku70-/-, Ku80-/ y de tipo salvaje. Se expusieron a 40 Gy de rayos X fibroblastos embrionarios de ratón de embriones de 13,5 días que crecieron en cultivos replicados durante 3 días en presencia de 0,01 \muCi/ml de ^{14}C-timidina (NEN) y 2,5 \muM de timidina fría y se volvió a 37ºC. En varios tiempos posteriores, se retiró una placa y se tripsinizó en hielo; se prepararon suspensiones de células aisladas y se embebieron en un tapón de agarosa a una concentración final de 3 X 10^{6} células/ml. Se llevó a cabo una AFIGE (Electroforesis en Gel con Inversión de Campo Asimétrico ("Asymmetric Field Inversion Gel Electrophoresis")) en agarosa Seakem al 0,5% (FMC, moldeada en presencia de bromuro de etidio 0,5 \mug/ml) en 0,5 X TBE (Tris 45 mM, pH 8,2, ácido bórico 45 mM, EDTA 1 mM) a 10ºC durante 40 h, aplicando ciclos de 1,24 V/cm durante 900 segundos en la dirección de migración del DNA y 5,0 V/cm durante 75 segundos en la dirección inversa como se describe (31). La cuantificación y el análisis para DSB de DNA se llevaron a cabo en un PhosphorImager (Molecular Dynamics). Los niveles de roturas de la doble hebra de DNA (DSB) se cuantificaron calculando la FAR (fracción de actividad liberada desde el pocillo en el carril) en muestras irradiadas y no irradiadas, que iguala la relación de la señal de radiactividad frente a la de la muestra completa (pocillo más carril).

Resultados experimentales Ruptura dirigida del gen Ku70

Para estudiar la función de Ku70 in vivo, los autores generaron ratones que contenían la ruptura de la línea germinal del gen Ku70. Se aisló gen Ku70 genómico murino y se construyó un vector determinante de diana (Fig. Ia). La sustitución homóloga da como resultado una eliminación del exon 2 de 336 pb que incluye el codon de inicio de traducción. Se inyectaron en blastocitos C57BL/6 para generar el ratón quimérico dos clones ES dirigidos a diana que llevan la mutación en Ku70. Un clon se transmitió con éxito a través de la línea germinal después de que las quimeras se cruzaran con hembras C57BL/6. No se observaron defectos obvios en heterocigotos Ku70+/-, y estos ratones Ku70+/- se usaron seguidamente para generar ratones Ku70-/- (Fig. 1b). 25% de la estirpe que nació de los cruces Ku70+/- x Ku70+/ fue Ku70-/-. Los ratones adultos Ku70-/- son fértiles pero tuvieron camadas reducidas (2 a 4 cachorros) al compararlos con ratones Ku70^{+/-} o Ku70^{+/+} (aproximadamente 8 cachorros).

Para confirmar que la ruptura produjo una mutación nula, se analizó la expresión de la proteína Ku70 por transferencia Western (Fig. 1C) y un ensayo de unión al extremo del DNA (Fig. 1D). La inmunoreactividad de Ku70 no fue detectable (Fig. 1C) y no hubo actividad de unión al extremo de DNA de Ku en fibroblastos Ku70-/ (Fig. 1D). La subunidad Ku80 del heterodímero Ku se encontró pero a niveles mucho más reducidos (Fig. 1C), sugiriendo que la estabilidad de Ku80 se ve comprometida por la ausencia de Ku70. Estas observaciones son consistentes con el hallazgo de que el nivel de Ku70 fue significativamente reducido en fibroblastos Ku80-/- y células Ku80-/-ES (19). En conjunto, estos datos sugieren que la estabilidad de cualquiera de los componentes de Ku se ve comprometida por la ausencia del otro.

Los ratones Ku70-/- recién nacidos fueron un 40-60% más pequeños que sus hermanos de camada Ku70+/- y Ku70+/+. Durante un período de observación de 5 meses, los ratones Ku70-/- crecieron y mantuvieron el peso corporal al 40-60% de los controles. Así, ratones Ku70-/-, al igual que los ratones Ku80-/- son enanos proporcionales (19).

El Desarrollo de linfocitos B pero no de linfocitos T, está bloqueado en un estadio temprano en ratones Ku70^{-/-}

El examen de diversos órganos de ratones Ku70^{-/-} mostró anomalías solo en el sistema linfático (Fig. 2A). El bazo y los nódulos linfáticos fueron desproporcionalmente más pequeños en 5 a 10 veces con respecto a los controles. En particular, los nódulos de la pulpa blanca esplénicos fueron significativamente reducidos. La inmunohistoquímica en secciones de tejidos desparafinados reveló que la pulpa blanca esplénica contenía células que se teñían con anti-CD3 (es decir, linfocitos T positivos a CD3), pero que no eran linfocitos B positivos a CD19 (Figura 2A, paneles k y n). El timo de Ku70-/- fue también desproporcionalmente más pequeño y contenía 100 veces menos linfocitos que los hermanos de camada Ku70+/+ (2 x 10^{6} en el primero frente a 2 x 10^{8} en el segundo; medido en 3 ratones de cada genotipo). Al contrario que los ratones Ku80-/-, el timo de Ku70-/- presentó una apariencia normal en uniones cortico-medulares (Fig. 2A, paneles g y j). En general, los tejidos linfáticos y órganos de ratones Ku70-/- son algo desorganizados y mucho más pequeños que los de ratones Ku70+/+ (Tabla I); además están relativamente más desarrollados y son ligeramente más grandes que los de ratones Ku80^{-/-}.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Recuento de células linfoides de ratones Ku70^{-/-}

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Para examinar adicionalmente el defecto inmunológico en ratones Ku70-/, se analizaron células de timo, de la médula ósea y del bazo usando anticuerpos monoclonales específicos para marcadores de superficie linfocíticos y citometría de flujo (19). Consistente con los datos inmunohistológicos fue un bloque completo en desarrollo de linfocitos B en el estadio B220^{+}CD43^{+} en la médula ósea y no hubo linfocitos B maduros en el bazo (Fig. 2B). Como contraste, los timocitos se desarrollaron a través del estadio CD4^{+}CD8^{+} doble-positivo (DP) y maduraron en CD4^{+}CD8^{-} y CD4^{-}CD8^{+} simple-positivo (SP), células positivas a TCR\beta (Figs. 2B, C). En seis ratones de cuatro semanas Ku70^{-/-} analizados, el porcentaje de timocitos CD4-CD8^{-} doble-negativo variaba de 11-62%, y el de células CD4^{+}CD8^{+} DP variaba de 35-73%. CD4^{-}CD8^{+} (1-11%) y también se detectaron en el timo células SP CD4^{+}CD8^{-} (1-3%). Además, se encontraron en el bazo en el 67% de los ratones estudiados linfocitos T simple-positivo CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{+}, (Fig. 2B), que expresan TCR\beta de superficie (Fig. 2C) y CD3. Así, al contrario que en la interrupción temprana del desarrollo de linfocitos T y B, en ratones Ku80-/- (Fig. 2B), la falta de Ku70 es compatible con la maduración de linfocitos T.

Reagrupación del gen del receptor de linfocitos T y de inmunoglobulina

Para determinar si una mutación nula en Ku70 afecta a la recombinación génica antígeno-receptor, se amplificó DNA de médula ósea con cebadores específicos a las reagrupaciones de inmunoglobulina D-J_{H} y V-DJ_{H} y se amplificó DNA del timo con cebadores que detectaban reagrupaciones V-DJ_{\beta} y D_{\delta}-J_{\delta} (20, 25-28). La Figura 3A muestra que linfocitos B Ku70-/- sufren recombinación D-J_{H}, a un nivel que es similar al de los linfocitos B Ku80-/-, pero que es de 2 a 3 veces menor que el nivel encontrado en ratones scid y 10-50 veces menor que los hermanos de camada tipo salvaje. Es posible que parte, pero no toda, la disminución en la reagrupación D-J_{H} sea debida a una menor fracción de linfocitos de linaje B en la muestra mutante, puesto que los ratones hermanos de camada tipo salvaje tienen solo ~ 5-veces más linfocitos B220^{+} que los ratones Ku70-/- (véase la Tabla I). No se detectaron reagrupaciones V-DJ_{H} en muestras de médula ósea de Ku70-/-, Ku80-/- o scid, posiblemente compensando la ausencia de linfocitos B maduros en estos ratones mutantes (Fig. 3A).

Al contrario que la recombinación del gen de cadena pesada de inmunoglobulina, el análisis PCR semicuantitativo de DNA de timocitos para uniones V-DJ_{\beta} mostró niveles normales de reagrupaciones TCR_{\beta} en una base celular (Fig. 3B). De igual modo, se encontraron uniones que codifican D_{\delta}2 y J_{\delta}1 en timocitos Ku70-/- en niveles que se asemejaban a los de tipo salvaje. Para determinar la naturaleza molecular de las uniones codificantes amplificadas, se secuenciaron uniones clonadas V_{\beta}8-DJ_{\beta}2.6. Los autores encontraron números normales de nucleótidos N y P así como niveles normales de eliminaciones de extremo codificante (Fig. 14). Así, uniones codificantes en timocitos Ku70-/- difieren de uniones codificantes producidas en células con deficiencia en Ku80 xrs6 porque no había grandes eliminaciones aberrantes (4, 18). Los autores llegaron a la conclusión de que la recombinación V(D)J de TCR in vivo no requiere Ku70.

La ausencia de Ku70 confiere hipersensibilidad a la radiación y deficiencia en la reparación de DSB del DNA

Para valorar la sensibilidad a la radiación en ausencia de Ku70, se expusieron células de la médula ósea a radiación ionizante y se ensayaron para determinar la formación de colonias (30, 32). La Fig. 4A muestra las curvas de supervivencia de las unidades formadoras de colonias de granulocitos/macrófagos (CFU-GM) de ratones Ku70-/-, Ku80-/- y tipo salvaje. Las CFU-GM de ratones deficientes en Ku70 fueron más sensibles a la radiación ionizante que los ratones control con suficiente Ku (Fig. 4A). Se observó una hipersensibilidad similar a la radiación para CFU-GM de Ku80^{-/-} (Fig. 4A).

La velocidad y grado de reorganización de las DSB de DNA inducidas por rayos X en células Ku70-/-, Ku80-/- y Ku70+/+ se midieron usando electroforesis en gel con inversión de campo asimétrica (AFIGE) (31). Se expusieron fibroblastos obtenidos de embriones de 13,5 días a 40 Gy de rayos X y de volvió a 37ºC para la reparación. En diversos tiempos después, se prepararon las células para la AFIGE para cuantificar las DSB de DNA (Fig. 4B, panel superior). Las DSB de DNA se reorganizaron casi totalmente en células de tipo salvaje en aproximadamente 2 horas después de la exposición a la radiación. Sin embargo, los fibroblastos obtenidos de ratones Ku70-/- mostraron una capacidad drásticamente reducida para reorganizar las DSB de DNA. Se observó también una deficiencia similar en la reorganización de DSB de DNA en fibroblastos obtenidos de embriones Ku80-/-. A pesar de las grandes diferencias observadas en la reorganización de DSB de DNA entre los fibroblastos de tipo salvaje y fibroblastos obtenidos de embriones de ratones Ku70-/- o Ku80-/-, los experimentos de dosis-respuesta mostraron que los fibroblastos de Ku70-/-,
Ku80-/- y tipo salvaje eran igualmente susceptibles a daños inducidos por rayos X (Fig. 4B, panel inferior). Así, la deficiencia en Ku afecta principalmente a la capacidad de las células para reorganizar DSB de DNA inducidas por radiación sin afectar de forma significativa a la inducción de daños en el DNA.

Discusión experimental

La ausencia de Ku70 tiene como resultado una hipersensibilidad a la radiación, enanismo proporcional, así como deficiencias en la reparación de DSB de DNA y en la recombinación V(D)J. Así, ratones Ku70-/- se asemejan a ratones Ku80-/- en varios aspectos pero las dos mutaciones se diferencian en sus efectos sobre el desarrollo de linfocitos T y B. La falta de Ku70 fue compatible con la reagrupación del gen TCR y el desarrollo de linfocitos T CD4^{+}CD8^{-} y CD4^{-}CD8^{+} maduros, mientras que los linfocitos T maduros estaban ausentes en ratones Ku80-/-. Al contrario, los linfocitos B no pudieron completar la reagrupación del gen receptor de antígenos y no maduraron en ratones Ku70-/- o Ku80-/-.

¿Qué puede explicar las diferencias que se encontraron en las reagrupaciones del gen TCR e inmunoglobulina en ratones Ku70-/-?. Una implicación de nuestros hallazgos es que son vías de rescate de Ku70 alternativas que son compatibles con la finalización de la recombinación V(D)J en linfocitos T. Es probable en la fase crítica de maduración de linfocitos T, puede estimularse otra actividad reparadora de DNA (33, 34) y puede complementar funcionalmente al gen Ku70 en la recombinación V(D)J específica de linfocitos T. Puesto que los ratones Ku80-/- son deficientes tanto en el desarrollo de linfocitos T y B, es posible que estas vías alternativas de reparación de DNA todavía por identificar incluyan Ku80. El nivel muy reducido de proteína Ku80 en células Ku70-/- puede en parte compensar la hipocelularidad de los timos de Ku70^{-/-}.

Aunque la función de Ku en la recombinación V(D)J no está molecularmente definida, Ku se ha propuesto para proteger extremos de DNA de la degradación (18, 35), activar DNA-PK (10, 11) y disociar el complejo RAG/DNA para facilitar la reacción de unión (20). Estas funciones no son mutuamente excluyentes y dependen todas de la interacción de Ku con el DNA. Así, el hallazgo de que Ku70 no es necesaria para la reagrupación del gen TCR es particularmente inesperada, debido a que la subunidad Ku70 se cree que es la subunidad de unión a DNA del complejo Ku (36) y no se detectó actividad de unión al extremo del DNA en células con deficiencia en Ku70 (Fig. 1D).

En resumen, nuestros estudios proporcionan una evidencia directa que apoye la implicación de Ku70 en la reparación de DSB de DNA y en la recombinación V(D)J, y la presencia de una vía(s) de rescate independientes de Ku70 en la recombinación V(D)J de TCR. El fenotipo característico de ratones Ku70-/- debería hacer del mismo herramientas valiosas para descubrir el mecanismo o mecanismos de reparación y recombinación de DNA.

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Segunda serie de experimentos

Los datos presentados en la presente muestran la evidencia de que la inactivación del gen Ku70 conduce a una propensión a transformación maligna, tanto in vitro como in vivo. Fibroblastos de ratón Ku70-/- presentaron una mayor tasa de intercambio de cromátidas hermanas y una alta frecuencia de transformación neoplásica espontánea. Ratones Ku70-/-, conocidos por su deficiencia en la maduración de linfocitos B pero no T, desarrollaron linfomas de linfocitos T en el timo y diseminados en una edad media de 6 meses, con células tumorales CD4^{+}CD8^{+}. Una relación plausible entre anomalías en Ku70 y linfomas humanos fue apoyada por la falta de expresión de Ku70 en muestras de tumores de trece de veintiséis pacientes analizados. En rastreos preliminares, se detectaron mutaciones específicas de tumor de Ku70 en 35% (6/17) de linfomas humanos y en 30% (11/38) de neuroblastomas. Estos hallazgos demuestran directamente que la deficiencia de Ku70 facilita el crecimiento neoplásico y sugieren que el locus Ku70 es un gen supresor de tumores candidato.

Recientes investigaciones han asociado los mecanismos moleculares de dos procesos, la reparación de roturas de la doble hebra de DNA (DSB) inducidas por la radiación y la recombinación V(D)J durante el desarrollo de linfocitos T y B. La proteína quinasa dependiente del DNA, DNA-PK de mamíferos ha aparecido como una molécula clave en estas vías. DNA-PK es una serina/treonina quinasa que comprende una subunidad catalítica de 465-kDa (DNA-PKcs) y un heterodímero determinante de diana de DNA consistente en un polipéptido de 70-kDa y uno de 86-kDa (denominados Ku70 y Ku80, respectivamente). Cuando se ensamblan en DNA de doble hebra in vitro, la holoenzima DNA-PK fosforila factores de transcripción y otras proteínas, incluyendo Sp1, Oct1, c-fos, c-jun, p53 y la subunidad 34-kDa de la proteína A de replicación (Anderson, 1993, Pan, et al., 1994). Estudios genéticos y bioquímicos sugieren contundentemente una función crítica de DNA-PK en la reparación de DSB y en la recombinación V(D)J (Jackson and Jeggo, 1995, Jeggo, et al., 1995, Lees-Miller, 1996). Líneas celulares que carecen de cualquiera de Ku80 o DNA-PKcs presentan deficiencia en la reparación de DSB y en la recombinación V(D)J, y son hipersensibles a la radiación ionizante (Blunt, et al., 1995, Jackson and Jeggo, 1995, Jeggo, et al., 1995, Kirchgessner, et al., 1995, Peterson, et al., 1995, Rathmell and Chu, 1994, Smider, et al., 1994, Taccioli, et al., 1994). Se han mapeado genes que codifican cada una de las subunidades de DNA-PK en loci que complementan el defecto en células mutantes sensibles a rayos X (Jeggo, et al., 1995, Thompson and Jeggo, 1995). El gen que codifica DNA-PKcs se localiza en el cromosoma humano 8q11, que también se ha identificado como el locus del gen SCID (deficiencia inmune combinada severa) (Blunt, et al., 1995, Kirchgessner, et al., 1995, Sipley, et al., 1995). Células derivadas de ratones SCID son hipersensibles a los rayos X, presentan deficiencia en la reparación de DSB y en la recombinación V(D)J (Biedermann, et al., 1991) y carecen de expresión de DNA-PKcs (Blunt, et al., 1995, Kirchgessner, et al., 1995, Peterson, et al., 1995). Consistente con estos hallazgos, se encontró que una línea celular de glioma humano radiosensible presentaba deficiencia en la reparación de DSB y carecía de mRNA y proteínas de DNA-PKcs (Lees-Miller, et al., 1995).

El heterodímero Ku se descubrió inicialmente como un autoantígeno en pacientes con trastornos autoinmunes (Mimori, et al., 1981). Se han clonado genes que codifican Ku70 y Ku80 y se han localizado citogenéticamente en los cromosomas humanos 22q13 y 2q33-35 (Cai, et al., 1994). Los grupos de Dynan y Jackson han proporcionado evidencias de que Ku es la subunidad determinante de diana de DNA de DNA-PK (Dvir, et al., 1992, Gottlieb and Jackson, 1993). Solas, ni DNA-PKcs ni Ku tienen actividad quinasa, y la actividad DNA-PK requiere el ensamblaje de cantidades aproximadamente equimolares de Ku70, Ku80 y DNA-PKcs en DNA de doble hebra (Chan and Lees-Miller, 1996, Suwa, et al., 1994). Sin embargo, datos recientes sugieren que DNA-PKcs puede unirse por si misma a fragmentos lineales de DNA y activarse para la actividad quinasa (Hammarstein and Chu, 1998, Yaneva, et al.,
1997).

A pesar de los rápidos avances en nuestro conocimiento de la genética de las subunidades DNA-PK, la función precisa de cada una estas proteínas in vivo, y sus funciones en la reparación de DSB y recombinación V(D)J siguen sin esclarecerse. Se han propuesto varios modelos (Jackson and Jeggo, 1995, Lees-Miller, 1996). Después de la localización con una DSB, DNA-PK puede señalizar a través de fosforilación para activar enzimas u otros factores implicados en la reorganización de extremos de DNA. Como alternativa, quizás además de su función en la señalización, DNA-PK puede ligar estructuralmente extremos adyacentes de DNA en una conformación adecuada para la reorganización de extremos (Jeggo, et al., 1995, Roth, et al., 1995). Aunque sigue sin demostrar, es muy probable que la actividad proteína quinasa de DNA-PK desempeñe una función crítica en la reparación y recombinación del DNA (Jackson and Jeggo, 1995, Lees-Miller, 1996). La función in vivo de Ku tampoco está bien definida a nivel molecular. Se ha propuesto que Ku protege los extremos de DNA de la degradación (Liang and Jasin, 1996, Taccioli, et al., 1994), activa DNA-PK (Dvir, et al., 1992, Gottlieb and Jackson, 1993) y disocia el complejo RAG/DNA facilitando la reacción de unión del DNA (Zhu, et al., 1996). Estas funciones no son mutuamente excluyentes y todas parecen depender de la interacción de Ku con moléculas de DNA.

Para facilitar estudios sobre la función de las subunidades Ku de DNA-PK in vivo, los autores han llevado a cabo recientemente la ruptura dirigida a diana de genes de Ku70 y Ku80 en ratones (Nussenzweig, et al., 1996, Ouyang, et al., 1997). En ratones Ku80^{-/-}, se detuvo el desarrollo de linfocitos T y B en estadios de progenitor tempranos y existe una profunda deficiencia en la recombinación V(D)J (Nussenzweig, et al., 1996, Zhu, et al., 1996). Similar al fenotipo Ku80^{-/-}, la inactivación de Ku70 conduce a un desarrollo de linfocitos B limitado y a deficiencia en la reparación de DSB (Ouyang, et al., 1997). No obstante, al contrario que en el fenotipo Ku80^{-/-}, la ausencia de Ku70 no abroga la recombinación del gen de linfocitos T (TCR) y el desarrollo de linfocitos T maduros (Gu, et al., 1997, Ouyang, et al., 1997). Estos estudios indican que Ku70 desempeña una función esencial en la reparación de DSB pero no es esencial en la recombinación V(D)J de TCR, sugiriendo que vías diferentes y solapadas pueden mediar en la reparación de DSB y en la recombinación V(D)J. Una implicación relacionada de estos hallazgos es que puede existir actividad residual o vías independientes de Ku70 alternativas para la recombinación V(D)J durante el desarrollo de linfocitos T.

Por ello, el procesado de la recombinación V(D)J de TCR en el ratón Ku70^{-/-}, que es deficiente en la reparación de DSB, puede facilitar la generación de sucesos recombinantes ilegítimos (Cleary, 1991), que potencialmente conducen a desarrollo tumoral.

En el presente estudio, los autores han examinado el efecto del defecto Ku70^{-/-} respecto a la transformación maligna y desarrollo tumoral en ratones mutantes y líneas celulares derivadas. Fibroblastos derivados de ratones Ku70^{-/-} presentaron frecuencias significativamente más altas de intercambios de cromátidas hermanas y transformación neoplásica espontánea, con respecto a los controles de tipo salvaje. Consistente con este fenotipo celular, la mayoría de los ratones Ku70^{-/-} desarrollaron linfomas de linfocitos T en el timo y diseminados a los 8 meses. La falta de expresión de la proteína Ku70 también se encontró en 13 de 26 linfomas humanos analizados. El análisis de polimorfismo de conformación de una hebra por reacción en cadena con polimerasa (PCR-SSCP) de DNA genómico de muestras de linfoma humano y secuenciamiento de DNA confirmó la presencia de la mutación Ku70. Además, en los rastreos preliminares, se detectaron mutaciones específicas de tumores de la región que codifica Ku70 en 35% (6/17) de linfomas humanos y en 30% (11/38) de neuroblastomas. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el locus Ku70 es un gen supresor de tumor candidato.

Resultados experimentales Caracterización detallada del ratón Ku70^{-/-}

Los autores han descrito recientemente la generación de ratones Ku70^{-/-} (Ouyang, et al., 1997). El gen Ku70 se inactivó eliminando 336 pb del exon 2, incluyendo el codon de inicio de la traducción del locus K70 del ratón. Heterocigóticos Ku70^{+/-} no presentaron anomalías y se usaron para generar una colonia de ratones Ku70^{-/-} usados para los presentes experimentos.

El análisis PCR usando cebadores específicos confirmó que parte del exon 2 se eliminó del genoma de la descendencia de Ku70^{-/-}, y el análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-Ku70 demostró la ausencia de la proteína Ku70 en células de Ku70^{-/-}. La descendencia de cruces de Ku70^{+/-} fueron los tres genotipos, siendo aproximadamente el 25% homocigóticos Ku70^{-/-}, como se espera por la distribución de Mendel. Los ratones Ku70^{-/-} fueron fértiles, pero un 40-60% más pequeños que sus hermanos de camada Ku70^{+/-} y Ku70^{+/+} (Figs. 1A y B), un fenotipo similar a ratones Ku80^{-/-} (Nussenzweig, et al., 1996), pero diferentes claramente a partir de lo que se describió para ratones SCID (Bosma, et al., 1983, Bosma and Carroll, 1991). Las diferencias de peso del fenotipo tipo salvaje estuvieron presentes en el nacimiento y se mantuvieron en la madurez (Fig 5A).

El examen de los tejidos de ratones Ku70^{-/-} reveló anomalías en órganos linfáticos y en el tracto gastrointestinal. Otros órganos, incluyendo cerebro, pulmón, hígado, corazón, riñón, testículos y ovarios fueron proporcionalmente menores pero sin anomalías estructurales o histológicas aparentes. El examen histológico del tracto gastrointestinal mostró una aganglionosis segmentada de leve a moderada que afectaba al intestino delgado y al colon (descrito en la sección posterior). El timo de Ku70^{-/-} fue desproporcionalmente más pequeño y contenía de 50 a 100 veces menos timocitos que los hermanos de camada Ku70^{+/+}, pero presentó uniones cortical-medular de apariencia relativamente normal, como se ha descrito antes (Ouyang, et al., 1997). El bazo de Ku70^{-/-} también fue de 5 a 10 veces más pequeño con la pulpa blanca esplénica significativamente reducida. Estudios inmunohistoquímicos y análisis de citometría de flujo multiparámetro revelaron que había un bloqueo total en el desarrollo de linfocitos B en estadios progenitores tempranos. Como contraste, la ausencia de Ku70 no bloqueaba la recombinación del gen TCR y el desarrollo de linfocitos T.

Ratones Ku70^{-/-} desarrollan linfomas de linfocitos T

Como se ha indicado anteriormente, el procesado de la recombinación V(D)J y la proliferación de precursores de linfocitos T en ratones Ku70^{-/-}, que tienen una deficiencia intrínseca en la reparación de DSB de DNA, puede potenciar la recombinación ilegítima y conduce a desarrollo tumoral. Para ensayar esta hipótesis, se valoró la susceptibilidad de ratones Ku70^{-/-} al tumor. Los autores asignaron camadas derivadas de cruces heterocigóticos (por ejemplo, Ku70^{+/+}, Ku70^{+/-}, Ku70^{-/-}) para sus experimentos y controlaron los ratones diariamente para determinar el desarrollo del tumor y la supervivencia. Como se muestra en la Fig. 6, 100% de Ku70^{+/+} (n=102) y Ku70^{+/-} (n=326) hermanos de camada quedaron libres de tumor y sobrevivieron a lo largo de las primeras 45 semanas de vida. Sin embargo, la supervivencia actuarial de ratones Ku70^{-/-} en riesgo fue solo de 22,4% a las 42 semanas, con una supervivencia mediana de 28 semanas.

Las autopsias mostraron que, en las primeras 5-8 semanas de vida, 14,2% de ratones Ku70^{-/-} murieron de formas severas de síndrome tipo Hirschprung (véase más adelante). Por consiguiente, los animales murieron de linfomas de linfocitos T de timo y diseminados (Fig. 7). El animal más joven con un tumor detectable tenia 14 semanas y a las 36 semanas, la gran mayoría de los ratones Ku70^{-/-} restantes murieron del linfoma de linfocitos T. No se detectaron tumores B de origen linfoide o no linfoide entre los 45 animales que tenían tumor examinados. Como contraste, durante el mismo período de observación, no se detectaron tumores en colonias de ratones Ku80^{-/-} y SCID. Histológicamente, los tumores primarios consistían en células mononucleares atípicas con núcleos divididos, nucleolos prominentes y muchas figuras mitóticas. Análisis inmunohistoquímicos revelaron que las células tumorales fueron CD3+, confirmando el diagnóstico de linfoma de linfocitos T (Fig. 7, D, E, y F). En la mayoría de los casos, estos tumores afectaron a otros órganos, tales como pulmón, corazón, riñón, bazo e hígado; en todos estos tumores se identificó un fenotipo CD3+.

Se establecieron fácilmente líneas celulares de tumores de timo, designados T-96, T-49, T-248, T-311 y T-441. Estas líneas de células tumorales tienen un tiempo de duplicación de 16-18 horas. El análisis de citometría de flujo de estas tres líneas tumorales en pases tempranos reveló un fenotipo CD4+ CD8+ DP (Fig. 7G), consistente con linfocitos T inmaduros de origen tímico. Además, el análisis Southern de células de estos linfomas de timo Ku70^{-/-}, usando una sonda cDNA de TCR C\beta (Danska, et al., 1994), presentó solo una o dos recombinaciones TCR\beta por tumor, sugiriendo que los tumores son de naturaleza clonalmente derivada. Análisis cariotípico en células cultivadas derivadas de tres linfomas de linfocitos T primarios desarrollados en ratones con deficiencia Ku70 revelaron varias anomalías cromosómicas. Las tres células tumorales cultivadas mostraron monosomía del cromosoma 8. Dos de las tres células tumorales cultivadas mostraron trisomía de los cromosomas 1 y 13, así como monosomía del cromosoma 12. Otras alteraciones identificadas incluyeron monosomía que afectaba a los cromosomas 9, 10 y 16; trisomía de los cromosomas 4, 5, 6 y 15; y duplicación del cromosoma 6, 14 y 15. Así, es razonable que algunas células DP Ku70^{-/-} adquirieran mutaciones que potenciaban su supervivencia o la capacidad para proliferar con respecto a la de timocitos DP tipo salvaje de vida corta.

Fibroblastos Ku70^{-/-} también sufren transformación maligna

Se produjo transformación neoplásica espontánea raras veces en fibroblastos de ratones primarios. Consistente con esta observación, fibroblastos de oído de ratón primario (MEF) derivados de Ku70^{+/+} o Ku70^{+/-} y cultivados hasta el pase 10, no sufrieron transformación maligna espontánea. Como contraste, la formación de focos transformados tipo III se observó en MEF de Ku70^{-/-} en una frecuencia de transformación de 4,3 x 10^{-2}/células viables (Fig. 8, A y B). La cotransfección con HPV16 E6 y E7 en MEF de Ku70^{-/-} aumentó además la frecuencia de formación de focos, mientras que la transformación no se observó en fibroblastos de Ku70^{+/+} o Ku70^{+/-} transfectados con E6/E7.

El análisis de aberraciones cromosómicas en los diversos cultivos celulares desarrollados a 37ºC reveló que las células de Ku70^{-/-} contenían 0,326 intercambios de cromátidas hermanas (SCE) por cromosoma (n=30 células), representando un aumento de 2,2 veces con respecto al de células de Ku70^{+/-} (0,147 SCE por cromosoma, n=34 células) (p<0,05). De igual forma, células de Ku70^{-/-} cotransfectadas con E6/E7 contenían una frecuencia casi 3 veces superior de SCE (0,262 SCE por cromosoma, n = 36 células) que las células de Ku70^{+/+} o Ku70^{+/+} tipo salvaje cotransfectadas con E6/E7 (0,092 SCE por cromosoma, n = 23 células) (p<0,05).

Los focos derivados de cultivos de Ku70^{-/-} primarios y cotransfectados con E6/E7 se analizaron adicionalmente para determinar su capacidad para crecer en condiciones independientes del anclaje y producir tumores en ratones atímicos. La Fig. 8C muestra que células de Ku70^{-/-} derivadas de focos transformados producen fácilmente colonias en agar blando, mientras que no fue evidente para células de Ku70^{+/+} crecimiento independiente del anclaje. Para la formación de tumores en ratones atímicos (Jackson Laboratory), 5 x 10^{6} células de Ku70^{-/-} derivadas de focos transformados o fibroblastos Ku70^{+/+} se inyectaron en cada uno de los dos costados de ratones atímicos y se valoró la formación de tumor después de 3 semanas. Se encontró que células de Ku70^{-/-} derivadas de focos transformados produjeron tumores en ratones atímicos (100% sufrieron tumor) mientras que no fue evidente el tumor para células de Ku70^{+/+}. En conjunto, estos resultados indican que la deficiencia en Ku70 conduce a una mayor propensión para la transformación maligna de fibroblastos de ratones primarios.

Sensibilidad extrema a la radiación de ratones Ku70^{-/-} y fibroblastos de Ku70^{-/-}

Estudios previos han demostrado que fibroblastos primarios de Ku70^{-/-} estuvieron limitados en la reparación de DSB inducidas por radiación (Ouyang, et al., 1997). Para demostrar que esta deficiencia en la reparación de DSB conduce a la hipersensibilidad de células Ku70^{-/-} a la radiación, se expusieron monocapas de fibroblastos primarios de oído de Ku70^{-/-} y Ku70^{+/+} (pase 7) a dosis medidas de irradiación g (0-6 Gy), y se determinó la supervivencia por un ensayo de formación de colonias. La Fig. 9A muestra claramente que células de Ku70^{-/-} fueron mucho más sensibles a la radiación que los controles de tipo salvaje, con una diferencia mayor que 100 veces en la supervivencia después de 400 cGy de irradiación \gamma.

Para valorar el fenotipo sensible a la radiación in vivo se administraron 400 cGy de irradiación \gamma a ratones Ku70^{-/-} adultos de 4 meses, así como a controles de tipo salvaje (Fig. 9B). Todos los ratones de tipo salvaje sobrevivieron. No obstante, todos los ratones Ku70^{-/-} irradiados murieron en 2 un período de semanas.

Anomalías gastrointestinales en ratones Ku70^{-/-}

En nuestro grupo experimental de ratones Ku70^{-/-}, se observó que el 14,2% murió sin evidencias de linfoma. El examen histológico mostró que todos estos ratones, así como el 60% de los ratones Ku70^{-/-} que tenían linfoma, mostraron anomalías gastrointestinales características. Se observó aganglionosis segmental de leve a moderada, afectando al intestino delgado y al colon (Fig. 10). Estas anomalías se confirmaron además por ensayos inmunohistoquímicos: el número de células ganglionales identificadas por inmunotinción con cromogranina fue mucho más reducido o ausente en segmentos del tracto intestinal de los ratones Ku70^{-/-}. Este fenotipo se asoció con no aparición de la morfología típica de las vellosidades intestinales, dilatación de las luces del intestino y despojada de la mucosa intestinal, causando obstrucción funcional y distensión progresiva del intestino. En algunos casos, se observó esta alteración incluso en el esófago y el estómago. Estos cambios fueron similares a los observados en la enfermedad de Hirschsprung (BDNAer, et al., 1990). La muerte causada por la forma más severa de este fenotipo comenzó aproximadamente a las 5 semanas de edad y alcanzó su máximo a las 12 semanas, mucho más temprano que el inicio de la muerte por linfoma a las 14 semanas. Estas anomalías no se observaron en ratones heterocigóticos y de tipo salvaje hasta los 8 meses de edad.

Alteraciones de Ku70 en tumores humanos

Debido a la alta incidencia de linfomas de linfocitos T en ratones Ku70^{-/-}, se evaluó la posibilidad de que la expresión de Ku70 anómala también se produjera en linfomas humanos. Se analizaron muestras de tumores de catorce pacientes con linfomas de linfocitos T y doce pacientes con linfomas de linfocitos B, clasificados por un panel de anticuerpos frente a marcadores de superficie específicos y sondas moleculares. El análisis inmunohistoquímico, usando un antisuero de conejo purificado específico para Ku70 (Ouyang, et al., 1997), mostró un patrón de tinción nuclear intenso de la proteína Ku70 en linfocitos humanos normales del bazo (Fig. 11G) y de los nódulos linfáticos. Los patrones de tinción de Ku70 no se vieron afectados por el procedimiento de preparación del tejido y fueron similares en secciones congeladas y muestras embebidas en parafina, con una tinción nuclear intensa en linfocitos y células endoteliales en ambos tipos de muestras (Fig. 11C y 11G).

Sin embargo, siete de catorce linfomas de linfocitos T analizados mostraron niveles no detectables de Ku70 en los núcleos (Fig. 11B y 11C), mientras que los siete casos restantes mostraron inmunorreactividad nuclear heterogénea de débil a moderada (Fig. 11A). Además, cuatro de estos casos mostraron una expresión de Ku70 citoplásmica anómala. En los casos negativos de Ku70, se encontró que los infiltrados celulares inflamatorios, así como las células endoteliales, tenían una fuerte tinción nuclear, que sirve como controles positivos internos (véase la Fig. 11C). De igual modo, seis de los doce linfomas de linfocitos B mostraron tinción de Ku70 indetectable en los núcleos de células tumorales (Figs. 11E y 11F). Se observó también una expresión citoplásmica anómala de Ku70 en nueve de estos doce linfomas de linfocitos B (Fig. 11F). Así, la mayoría de los linfomas humanos estudiados mostraron alteraciones en Ku70, bien por carecer totalmente de expresión de Ku70, o presentar localización citoplásmica de Ku70 anómala.

Para complementar los datos inmunohistoquímicos y explorar con más detalle la significación de estos hallazgos, se llevó a cabo un análisis PCR-SSCP con 17 de 26 linfomas humanos primarios de los cuales estaban disponibles tejidos congelados (7 linfomas de linfocitos T y 10 de B). La búsqueda de mutaciones se llevó a cabo primero a nivel genómico, es decir, usando DNA genómico como sustrato. Debido a que las uniones entre los intrones y los 13 éxones del gen Ku70 humano no están bien establecidas, los autores estuvieron limitados por el uso de nueve parejas de cebadores (para nueve de los 13 éxones) para amplificar aproximadamente el 50% de la región codificante del gen Ku70 humano. El análisis SSCP de los productos de PCR (74 a 194 pb de tamaño) presento cambios en bandas en 3 de 17 muestras de linfoma. El análisis de la secuencia de un caso reveló una mutación puntual de ACA a ATA en el codon 292, convirtiendo una treonina a isoleucina (Fig. 11H). Sin embargo, la mutación no pudo confirmarse para los otros dos casos posiblemente debido a las condiciones subóptimas de los cebadores usados.

Para corroborar más, se caracterizaron las secuencias codificantes de Ku70 en los 17 linfomas anteriormente citados. También se amplió el estudio para incluir un panel de 38 neuroblastomas bien caracterizados. Se llevó a cabo secuenciamiento por PCR directo a partir de los productos cDNA de estas muestras. Usando esta estrategia, se examinó toda la región codificante de Ku70. Los autores encontraron que las secuencias de Ku70 mutaron frecuentemente en las muestras de tumores, pero no en sus tejidos normales correspondientes (para ejemplos véanse las Figs. 11I y 11J). Más específicamente, 2 de 7 linfomas de linfocitos T y 4 de 10 linfomas de linfocitos B mostraron mutaciones puntuales múltiples en los codones 292, 344, 452, 453, 460 y 466, con un efecto predicho de sustitución de aminoácidos de treonina a isoleucina, glicina a alanina, isoleucina a valina, metionina a treonina, glucina a ácido aspártico y valina a isoleucina, respectivamente (Fig. 11I y Tabla II). Además, se identificaron mutaciones puntuales específicas de tumor en 11 de 38 neuroblastomas en los codones 529 (silenciosa), 530 (Tyr\rightarrowHis), 549 (Gly\rightarrowAsp) y 593 (silenciosa) (Fig. 11J y Tabla II). Mutaciones representativas de Ku70 identificadas en tumores primarios humanos se resumen en la Tabla II y se ilustran en la Figura 11.

TABLA II Mutaciones representativas de Ku70 identificadas en tumores primarios humanos

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Discusión experimental

El presente estudio revela una nueva característica del fenotipo Ku70^{-/-}, la propensión a transformación maligna, tanto in vitro como in vivo. In vitro, esto se expresa en términos de mayor tasa de intercambio de cromátidas hermanas, transformación neoplásica espontánea frecuente de fibroblastos primarios, crecimiento independiente del anclaje de los focos transformados en agar blando y sus capacidad para producir tumores en ratones atímicos. In vivo, ratones Ku70^{-/-} desarrollaron espontáneamente linfomas de linfocitos T de timo y diseminados. De acuerdo con estos datos, muestras de tumores de linfomas de linfocitos T humanos también mostraron una ausencia patológica de expresión de proteína Ku70 y la presencia de mutaciones específicas del tumor. Estos hallazgos demuestran directamente que la inactivación del gen Ku70 facilita el crecimiento neoplásico y sugiere contundentemente el locus Ku70 como un gen supresor de tumor candidato para linfoma de linfocitos T murino y humano.

La especificidad del fenotipo Ku70^{-/-} murino para el desarrollo de linfoma de linfocitos T y B es consistente con la reciente observación de los autores de que el desarrollo de linfocitos B estaba ausente en ratones Ku70^{-/-} (Ouyang, et al., 1997). Al contrario que en ratones SCID y Ku80^{-/-}, en los que el desarrollo de linfocitos T y B estuvo detenido en estadios progenitores tempranos (Bosma and Carroll, 1991, Carroll and Bosma, 1991, Carroll, et al., 1989, Lieber, et al., 1988, Nussenzweig, et al., 1996, Zhu, et al., 1996), la ausencia de Ku70 no bloquea ni la recombinación del gen TCR ni el desarrollo de células T maduras (Gu, et al., 1997, Ouyang, et al., 1997). No obstante, la diferenciación específica de linfocitos T fue subóptima en ratones Ku70^{-/-}, con cantidades de timocitos de 50 a 100 veces menores que los hermanos de camada de tipo salvaje. Estos resultados sugieren que existe una actividad residual, o una vía independiente de Ku70 alternativa para la recombinación V(D)J de TCR y la maduración de linfocitos T. No obstante, esta vía es menos eficiente o no proporciona todas las señales necesarias para llevar a cabo completamente la transición del desarrollo. Otra posible explicación para la falta de expansión de timocitos DP en Ku70^{-/-} puede estar asociada con la propensión intrínseca de las células DP a sufrir apóptosis (Smith, et al., 1989), que puede verse además potenciada por la ausencia de Ku70. Consistente con este paradigma, los autores han encontrado que células de Ku70^{-/-} transfectadas con SV40 fueron extremadamente susceptibles a la apóptosis inducida por radiación con respecto a los controles de tipo salvaje. Es improbable que las diferencias en la base genética contribuyan a los diferentes fenotipos de ratones Ku70^{-/-} y Ku80^{-/-} en el desarrollo de tumores. Se generaron ambos ratones Ku70^{-/-} y Ku80^{-/-} en nuestras instalaciones centrales de ratones transgénicos en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center usando protocolos idénticos, incluyendo la misma cepa de células ES y los mismos ratones C57BL/6 (Nussenzweig, et al., 1996, Ouyang, et al., 1997). Así, la cepa Ku70^{-/-} usada estaba en una base mixta 129/SV x C57BL/6 similar a la de nuestra cepa Ku80^{-/-}. Por otro lado, una línea obtenida independientemente de ratones Ku70^{-/-} tenia un fenotipo esencialmente idéntico al del que se está describiendo (Gu, et al., 1997).

El mecanismo para la inducción de linfoma de timo en ratones Ku70^{-/-} no es claro en la actualidad. Es razonable plantear la hipótesis de que un defecto en la maduración de timocitos y procesos malignos en el timo están mecanísticamente relacionados y asociados con anomalías en la reparación de DSB de ADN, una característica de las células Ku70^{-/-}. Aunque la recombinación de DSB residual puede ser responsable de la aparente recombinación V(D)J de TCR, pueden existir vías de reparación de DNA alternativas en ausencia de Ku70. Tales vías pueden complementar funcionalmente el gen Ku70 y participar en la recombinación del gen TCR. Por otro lado, el rescate de la recombinación del gen TCR y la proliferación de linfocitos T en un entorno general con deficiencia en reparación de DNA puede potenciar la generación de una recombinación ilegítima (Cleary, 1991), conduciendo al desarrollo de procesos malignos de los linfocitos T. Es consistente con este modelo la observación de los autores sobre la frecuencia mayor de transformación neoplásica en fibroblastos de Ku70^{-/-}, sugiriendo que la falta de Ku70 puede constituir un suceso crítico en los procesos de transformación multietapas.

La relación supuesta entre una deficiente reparación de DSB, diferenciación defectuosa en linfocitos T y desarrollo de tumores en ratones Ku70^{-/-} es consistente con los resultados experimentales obtenidos en ratones SCID irradiados (Danska, et al., 1994). Aunque las células de SCID demostraron ser eficaces en la reparación de DSB inducidas por radiación y recombinación V(D)J (Bosma and Carroll, 1991, Carroll and Bosma, 1991, Carroll, et al., 1989, Lieber, et al., 1988), el tratamiento de ratones SCID recién nacidos con una dosis de radiación subletal de 100 cGy devolvió a la recombinación de TCRb del receptor de linfocitos T, maduración de linfocitos T y proliferación de timocitos a valores normales, pero no la recombinación de IgM o el desarrollo de linfocitos B (Danska, et al., 1994). Se considera relevante la observación de que todos los ratones SCID irradiados desarrollaron finalmente tumores de linfocitos T, pero no tumores de origen linfoide B o no linfoide. Estos datos apoyan la noción de que la inducción de vías alternativas para la recombinación de DSB, aparentemente activada por radiación, puede restaurar la recombinación V(D)J de TCR; pero debido a su deficiencia en la reparación de DSB, estas actividades promueven la transformación maligna de linfocitos T. Por tanto, la especificidad de linaje T de la transformación neoplásica bien inducida por irradiación de baja dosis (como en el caso de ratones SCID) o que se produce espontáneamente (como en los ratones Ku70^{-/-}), puede reflejar una interacción entre reparación defectuosa de DSB de DNA y recombinación del gen TCR.

Aunque las células Ku70^{-/-} de linaje no linfoide, tales como fibroblastos primarios, pueden sufrir transformación espontánea in vitro, los autores han observado que no hay tumores espontáneos distintos de linfomas de linfocitos T en los ratones Ku70^{-/-}. Esto puede deberse al hecho de que casi todos los animales observados hasta la edad de 8 meses murieron bien por linfoma de linfocitos T o por síndrome gastrointestinal del tipo Hirschsprung. Aganglionosis segmentada de leve a severa en el tracto gastrointestinal fue, de hecho, detectada en la mayoría de ratones Ku70^{-/-} examinados por autopsia. Este fenotipo inesperado se asoció con la falta de morfología típica de las vellosidades intestinales, dilatación de las luces del intestino y despojada de la mucosa intestinal, trastornos similares a los descritos en la enfermedad de Hirschsprung (HSCR). La HSCR humana es un trastorno congénito del sistema nervioso entérico caracterizado por la ausencia de ganglios entéricos (BDNAer, et al., 1990, Pingault, et al., 1997). Se han identificado tres genes para HSCR, incluyendo proto-oncogén RET (Angrist, et al., 1995, Attie, et al., 1995), el gen que codifica el receptor de endotelina B (EDNRB) (Amiel, et al., 1996) y el gen de endotelina 3 (EDN3) (Edery, et al., 1996, Hofstra, et al., 1996). En ratones, mutaciones espontáneas e inducidas in vitro que afectan a los genes RET, EDNRB y EDN3 generan fenotipos similares a HSCR humana. Otro modelo murino de enfermedad de HSCR es el megacolon dominante (Dom), una mutación en el ratón espontánea en la que el gen diana no se ha caracterizado totalmente (Pavan, et al., 1995, Pingault, et al., 1997, Southard-Smith, et al., 1998). La mutación Dom se ha localizado en la región medio-terminal del cromosoma 15 del ratón. Usando polimorfismos conocidos para genes humanos/ratón conservados, se ha establecido homología entre el locus Dom y el cromosoma humano 22q12-q13 (Pingault, et al., 1997). Aunque el locus Ku70 de también se ha localizado en el cromosoma 15 (Takiguchi, et al., 1996), resulta improbable que el gen Dom se rompa en los ratones Ku70^{-/-}, debido al hecho de que la mutación Dom homocigótica da como resultado un fenotipo letal. Sin embargo, sería de gran interés examinar si la expresión del gen Dom, o la de otros genes de HSCR, se ve afectada por la ausencia de proteína Ku70.

El desarrollo espontáneo de tumores de linfocitos T en el ratón Ku70^{-/-} es muy diferente al de los fenotipos Ku80^{-/-} y SCID. No obstante, es comparable con el desarrollo de linfomas linfoblásticos de timo en ratones deficientes en Atm (Barlow, et al., 1996) y ratones sin DNA-PKcs (Jhappan, et al., 1997), el desarrollo de tumores de timo en ratones con deficiencia en p53 (Donehower, et al., 1992, Jacks, et al., 1994, Purdie, et al., 1994, Tsukada, et al., 1993) y la predisposición a procesos malignos linforreticulares en pacientes con ataxia telangiectasia (Boder, 1975, Sedgewick and Boder, 1991). Sin embargo, las mutaciones AT y p53 se asocian también con otros tipos de tumores (Donehower, et al., 1992, Jacks, et al., 1994). Así, la dominancia de tumores de linfocitos T en ratones Ku70^{-/-} es única. El análisis de los autores de muestra de tumores humanos, sugiere no obstante una posible asociación de Ku70 con linfomas de linfocitos T y B (Fig. 11).

La expresión y análisis genético molecular de Ku70 llevados a cabo en linfomas y neuroblastomas humanos apoyó la hipótesis de una función de Ku70 en la supresión tumoral. Se buscaron e identificaron primero mutaciones especificas de tumores en linfomas de linfocitos T. No obstante, se amplió el rastreo mutacional a linfomas de linfocitos B y neuroblastomas, puesto que estos tumores son dos de los procesos malignos más frecuentes que afectan a la población pediátrica. Linfocitos B normales y neuronas expresan altos niveles nucleares de proteína Ku70, similares a los observados en linfocitos T normales. El patrón alterado de expresión de Ku70, fundamentalmente la falta de tinción nuclear de Ku70 y la localización citoplásmica ectópica de proteína Ku70 en una gran fracción de tumores estudiados, sugiere posibles aberraciones genéticas. La identificación de varias mutaciones específicas del tumor en un subgrupo de los linfomas y neuroblastomas rastreados es consistente con la hipótesis de trabajo. Queda todavía por analizar si las mutaciones representan la base de la falta de expresión o la expresión aberrante de Ku70 en todas las muestras de tumores humanos examinadas. No obstante, hay otros mecanismos para inactivar supresores tumorales. La metilación de la región promotora de ciertos genes, tales como p16/INK4A, produce el silenciamiento de la transcripción y ausencia del gen producto final (Gonzalez-Zulueta, et al., 1995, Merlo, et al., 1995). La inhibición de la función supresora del tumor también se puede conseguir por proteínas celulares y virales que muestran interaccionar con productos supresores específicos, tales como p53 y RB (Dyson, et al., 1989, Linzer and Levine, 1979, SRNAow, et al., 1982, Werness, et al., 1990, Whyte, et al., 1988). Más recientemente, se ha demostrado que p27 se degrada a través de mecanismos mediados por proteosoma en lugar de mutaciones específicas del tumor (Ponce-Castaneda, et al., 1995), y que la deficiencia en p27 está asociada con tumorigénesis y progresión tumoral en ciertos neoplasmas humanos (Loda, et al., 1997, Porter, et al., 1997). Las mutaciones identificadas en el gen Ku70, junto con los patrones anómalos de expresión observados en la mayoría de muestras de linfomas humanos, están de acuerdo con la hipótesis de que Ku70 tiene una función importante en la supresión de tumores.

En resumen, nuestros estudios muestran que la inactivación de Ku70 tiene como resultado un fenotipo característico, con respecto a ratones Ku80^{-/-} y SCID, que son deficientes en otros componentes del complejo DNA-PK. Consistente con la observación de que el ratón Ku70^{-/-} es muy susceptible al desarrollo de linfoma de linfocitos T espontáneos en el timo y diseminados, los linfomas de linfocitos T examinados también mostraron expresión alterada de Ku70 y mutaciones específicas de tumor de Ku70. Estos datos demuestran que la ruptura de Ku70 facilita el crecimiento neoplásico y sugiere contundentemente que el locus Ku70 es un gen supresor de tumor candidato. Aunque el modelo de roedor Ku70^{-/-} no presente otros tipos de tumor, la alta frecuencia de intercambios de cromátidas hermanas en fibroblastos de Ku70^{-/-} y su alta susceptibilidad a transformación neoplásica espontánea eleva la posibilidad de que otros tumores humanos también puedan verse afectados por la función del locus Ku70. Esto se apoya además por el modelo de expresión anómala de Ku70 en linfocitos B, así como las mutaciones múltiples de Ku70 específicas del tumor detectadas en linfomas de linfocitos B y neuroblastomas.

Procedimientos experimentales Ruptura dirigida de Ku70 y generación de ratones Ku70^{-/-}

Se aisló el gen Ku70 genómico de ratón de una genoteca de cósmidos sCOS-I construida a partir de una línea de células madre embrionarias 129 de ratón (Takiguchi, et al., 1996). Se construyó el vector de reemplazo usando un fragmento 5' de 1,5 kb que contenía el locus promotor con cuatro GC-bos y el exon 1, y un fragmento de 8 kb EcoRV-EcoRI que se extiende desde el intrón 2 al intrón 5 (Ouyang, et al., 1997). El reemplazo homólogo dio como resultado una eliminación de 336 pb del exon 2 incluyendo el codon de inicio de la traducción.

Se linealizó el vector determinante de diana con Not 1 y se transfectó en células madre (ES) embrionarias CJ7 por electropermeabilización usando un Bio-Rad Gene Pulser. Se rastrearon trescientos clones de células ES y se identificaron 5 clones que llevaban la mutación en Ku70 por transferencia Southern. Los clones ES positivos se inyectaron por separado en blastocitos C57BL/6 para generar el ratón quimérico. Se transmitió con éxito un clon a través de la línea germinal después de que se cruzaran las quimeras con hembras C57 BL/6. Se generaron ratones Ku70^{-/-} homocigóticos con cruces de Ku70^{+/-} heterocigóticos.

Los genotipos de los ratones se determinaron primero por análisis PCR de la cola que distinguía el alelo endógeno del alelo Ku70 dirigido a diana y luego se confirmó por análisis de transferencia Southern. La reacción PCR contenía 1 mg de DNA genómico; 0,6 mM (de cada uno) de cebadores HO-2: GGGCCAGCTCATTCCTCCACTCATG, HO-3: CCTACAGTGTACCCGGACCTATGCC y HO-4: CGGAACAGGACTGGTGGTTGAGCC; 0,2 mM (de cada uno) dNTP; 1,5 mM MgCl_{2} y 2,5 U de Taq polimerasa. Las condiciones de los ciclos fueron 94ºC durante 1 minuto, 64ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto (30 ciclos), seguido por una extensión a 72ºC durante 10 minutos. Los cebadores HO-2 y HO-4 dieron un producto del alelo dirigido a diana que tiene \sim380 pb; los cebadores HO-3 y HO-4 proporcionaron un producto tipo salvaje de 407 pb.

Cultivos celulares y determinación de la radiosensibilidad

Se sembraron en discos Petri de 60 mm monocapas de células (1-2 x 10^{5} células) y se cultivaron a 37ºC durante 3 días, momento en el que llegaron casi a confluencia (1-2 x 10^{6} células por placa). El medio de cultivo se cambio diariamente y las células estaban en una fase de meseta inhibida por la densidad el día 6. El índice pulso-marcado, determinado por incubación durante 30 minutos con 10 mCi/ml de ^{3}H-timidina y análisis autorradiográfico fue < 1% indicando una insuficiencia de células para el ciclo. Los experimentos se llevaron a cabo el día 6 ó 7.

Se obtuvieron curvas de supervivencia midiendo la capacidad formadora de colonias de células irradiadas como se ha descrito antes (Nagasawa, et al., 1991). Una colonia que contiene más de 50 células se valoró como superviviente. La supervivencia de las células se normalizó siempre con la eficiencia de los controles sin tratar. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces y proporcionaron resultados consistentes.

Transformación espontánea de células con deficiencia en Ku70

Para estudiar la transformación espontánea de fibroblastos con deficiencia en Ku70, se usaron los protocolos de Little bien establecidos (Little, 1979). Se sembraron células en 6 réplicas de discos Petri Falcon de plástico de 100 mm a densidades que se diseñaron para proporcionar aproximadamente 4000 a 7000 células viables (formadoras de colonia) por disco. Después de una incubación de 3 a 4 semanas a 37ºC, con doce renovaciones semanales del medio nutriente, se fijaron los cultivos con etanol al 95% y se tiñeron con violeta cristal al 0,1%. Los focos transformados (Tipo III) aparecieron como colonias apiladas densas de células que solapaban la monocapa de células. Las células de estos Focos se aislaron, se expandieron y luego se ensayaron para determinar su capacidad para crecer en agar blando de una forma independiente del anclaje.

En paralelo con el anterior, se sembraron tres placas de 100 mm desde una dilución 1:50 de la misma suspensión celular (80 a 140 células viables) en cada grupo con el fin de determinar la eficacia formadora de colonias real. Después de una incubación de 10 a 12 días a 37ºC, se fijaron las muestras y se tiñeron, se recontó el número de colonias viables y se determinó la eficacia de clonación que se usó para calcular el número de células viables sembradas en las placas de transformación. La frecuencia de transformación se determinó dividiendo el número total de focos transformados almacenados en un grupo de tratamiento por el número total de células viables sembradas, y se expresó por tanto como transformantes por célula viable.

Para la formación de colonias en agar blando, se usó un procedimiento modificado de MacPherson (MacPherson, 1973) (Nagasawa, et al., 1987). Se revistieron discos Petri de plástico (60 mm) con una capa de 5 ml de agarosa al 0,5% en medio suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 20%. Se mezclaron dos mililitros de la suspensión celular con 4 ml de la solución de agarosa al 0,5%; se cultivaron 1,5 ml de la suspensión celular resultante en los discos revestidos de agarosa. Seguidamente se alimentaron los cultivos una vez a la semana añadiendo 1 ml de medio completo (sin agarosa). El tamaño de las colonias se controló a los 2 días, 1, 2 y 3 semanas después de sembrar tomando microfotografías de los cultivos en un microscopio invertido. Para la formación de tumor en ratones atímicos (Jackson Laboratory), se inyectaron 5 x 10^{6} células en cada uno de los dos costados de dos ratones atímicos y se valoró la formación de tumor después de 3 semanas.

Análisis de intercambio de cromátidas hermanas

Para el análisis de intercambio de cromátidas hermanas (SCE) se siguieron los protocolos de Nagasawa et al (Nagasawa, et al., 1991). De forma resumida, se subcultivaron células en cultivos inhibidos en densidad en tres matraces de cultivo de tejidos T-25 replicados en medio completo nuevo que contenía bromodesoxiuridina 10^{-5} M (BrdUrd) durante dos rondas de replicación celular. Durante tres intervalos de 4 horas sucesivos que comenzaron 15 minutos después del subcultivo, se añadió colcemida (0,2 g/ml) a uno de los matraces durante un intervalo de 4 horas antes de fijar. Por tanto, la recolección se llevó a cabo durante un período total de 12 horas. Los cromosomas se prepararon para el análisis de SCE por el procedimiento de secado al aire, como se describe previamente (Nagasawa and Little, 1979, Nagasawa, et al., 1991). La tinción diferencial de cromátidas hermanas se llevó a cabo por la técnica de fluorescencia más Giemsa (Nagasawa, et al., 1991, Perry and Wolff, 1974). El SCE se analizó en los índices mitóticos máximos después de completarse la primera o segunda mitosis.

Preparación de tejidos

Se fijaron muestras de tejidos normales y tumorales de ratones de tipo salvaje y/o Ku70^{-/-} en formalina tamponada al 10% y embebidas en parafina, o embebidas en una solución crioconservadora (compuesto OCT, Miles Laboratories, Elkhard, IN), congeladas rápidamente en isopentano en nitrógeno líquido y almacenadas a -70ºC.

De igual modo, se obtuvieron de muestras quirúrgicamente extirpadas en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center veintiséis casos de linfomas de linfocitos T (n=14) o B (n=12) así como 38 neuroblastomas y se usaron para este estudio. Las muestras se embebieron en solución crioconservadora (compuesto OCT, Miles Laboratories, Elkhard, IN), se congelaron rápidamente en isopentano en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC o fijaron en formalina y embebieron en parafina. Se examinaron secciones teñidas con hematoxilina-eosina (5 \mum de espesor) para evaluar las características histopatológicas de las lesiones a analizar, incluyendo la relación de contenido normal a tumoral para la posible microdisección.

Aislamiento de DNA, ensayos de PCR-SSCP y secuenciamiento de DNA

El DNA se extrajo de secciones de 30 \mum consecutivas de bloques de tejido congelados, usando un procedimiento no orgánico (Oncor, Gaithersburg, MD) (Dalbagni, et al., 1993). Se diseñaron nueve grupos de cebadores (una pareja para cada uno de 9 de los 13 exones del gen Ku70) y se usaron para amplificar el 50% de la región codificante de Ku70.

El análisis PCR-SSCP se llevó a cabo según una ligera modificación del procedimiento de Orita et al. (Orita, et al., 1989). En resumen, se llevaron a cabo amplificaciones con 50-100 ng de DNA genómico en volúmenes de 10 \mul. Se usaron treinta y cinco ciclos para la amplificación consistentes en 20 s a 94ºC para la desnaturalización, 20 s a 55-64ºC para los diferentes cebadores usados y 30 segundos a 72ºC para la extensión. Se mezclaron muestras amplificadas de 3 \mul con 7 \mul de solución de parada de la secuenciación y luego se desnaturalizaron 5-10 min a 95-100ºC y se enfriaron en hielo seco. Se cargaron muestras (4 \mul) sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizante al 5-8% que contenían glicerol al 5-10% y gel MDE (FMC, Philadelphia, PA) y corrieron a temperatura ambiente durante 18 h a 5 vatios. Los geles se secaron a 80ºC a vacío y se expusieron a película de rayos X durante 4-24 h.

Se usaron los mismos cebadores usados en la SSCP para el secuenciamiento de DNA. Los fragmentos de DNA que presentaban cambios de banda en el análisis SSCP se secuenciaron por el procedimiento de didesoxi (Sanger, et al., 1977) usando el kit de secuenciamiento del producto de PCR Sequenase (Amersham Life Science, Cleveland, OH). Se secuenciaron ambas hebras para cada DNA analizado. Los casos que presentaron mutaciones puntuales se volvieron a analizar por al menos dos estudios de secuenciamiento adicionales.

Preparación de RNA, análisis RT-PCR y mutacional

Se prepararon RNA totales usando el kit RNeasy Mini de Qiagen. Se rompieron muestras de secciones consecutivas de 30 \muM de tejido congelado en 600 \mul de tampón de lisis y se homogeneizaron. Se añadieron entonces 600 \mul de etanol al lisado y se aplicaron a una columna Minis Spin RNeasy. Después de varias etapas de lavado, se separaron los contaminantes por lavado y se eluyó el RNA en 40 \mul de agua exenta de RNase. Se usó RNA total preparado de muestras de linfoma y neuroblastoma para la transcripción in vitro. Se usó aproximadamente 1 \mug de RNA total como molde en una reacción a TA de 25 \mul que contenían 40 ng de cebadores al azar hexámeros. Se usó entonces un \mul de producto a TA como molde en una reacción PCR de 25 \mul. Se llevaron a cabo treinta ciclos de amplificación (30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC, 2 min a 72ºC) y se analizaron los productos en geles de agarosa. Se diseñaron cuatro cebadores PCR y 6 cebadores de secuenciamiento para analizar la ORF de Ku70. Una reacción de 25 \mul contenían 100 ng de DNA genómico o 1 \mul de producto a TA, 10 pmol de cada cebador, tampón PCR 1X Expand^{TM} High Fidelity (Boehringer Mannheim) y 1,3 U de mezcla enzimática del sistema PCR Expand^{TM} High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim). Después de una desnaturalización inicial durante 2 min a 94ºC, se llevaron a cabo 30 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC y 2 min a 72ºC, y una extensión final durante 7 min a 72ºC en un aparato de microtubos de PCR térmico Cycler (Perkin Elmer). Se llevó a cabo el secuenciamiento directo de productos PCR después de un tratamiento previo por el kit de secuenciamiento Pre-PCR (Amersham) usando cebadores de secuenciamiento diseñados al efecto. Todas las mutaciones se confirmaron por secuenciamiento de un producto recién amplificado.

Immunohistoquímica

Se fijaron muestras de tejido normal y tumoral de ratones tipo salvaje y/o Ku70^{-/-} en formalina al 10% y se embebieron en parafina o se embebieron en compuesto OCT (Miles Laboratories) y se congelaron en nitrógeno líquido a -70ºC. Además, se analizaron también veintiséis linfomas de linfocitos T y B humanos, en combinación con muestras de tejido normal humano de nódulos linfáticos y bazo. Para los análisis de inmunofenotipado se usaron secciones de 5 mm representativas de muestras de tejido normal y tumoral de ratones tipo salvaje y Ku70^{-/-}, así como los 26 linfomas humanos usando técnica de inmunoperoxidasa avidina-biotina (Cordon-Cardo and Richon, 1994, Serrano, et al., 1996). Los anticuerpos primarios incluían CD45 anti-ratón (anticuerpo monoclonal de rata purificado, 1:500, PharMingen), CD3 anti-ratón (anticuerpo monoclonal de rata purificado, 1:1000, Dako), B220 anti-ratón (anticuerpo monoclonal de rata purificado, 1:1000, PharMingen), CD19 anti-ratón (anticuerpo monoclonal de rata purificado, 1:1000, PharMingen) y anti-cromogranina de conejo A (suero de conejo purificado, 1:1000, Dako) y se incubaron durante una noche a 4ºC. También se usó un antisuero de conejo purificado para la proteína nuclear de Ku70 (dilución 1:500). Las muestras se incubaron seguidamente con anticuerpos secundarios biotinilados (Vector Laboratories) durante 30 min (anti-conejo de cabra, 1:500; anti-rata de conejo, 1:100) y luego con complejos de peroxidasa avidina-biotina (dilución 1:25, Vector Laboratories) durante 30 min. Se usó diaminobenzadina como cromógeno y hematoxilina como tinción de recuento. Para valorar los anticuerpos y controles positivos se usaron órganos linfoides de tipo salvaje incluyendo timo, bazo y nódulos linfáticos de diferentes ratones. Para los controles negativos se sustituyeron anticuerpos primarios con anticuerpos de la misma clase pero no relacionados en las mismas diluciones de trabajo finales (Ouyang, et al., 1997). La identificación de Ku70 humana se consiguió usando el mismo antisuero anti-Ku70 de conejo purificado. Para la expresión de Ku70, se examinaron inmunorreactividades nucleares y citoplásmicas; la intensidad de la tinción se valoró como positiva fuerte, positiva moderada, positiva débil y sin tinción. Las inmunorreactividades nucleares y citoplásmicas se clasificaron como datos continuos, es decir, de nivel no detectable o tinción 0% a homogénea o 100%.

Análisis de citometría de flujo de tumores espontáneos

Las líneas celulares se establecieron para cada tumor primario como sigue. Se dispersaron muestras de tumores en suspensión celular y se cultivaron a diversas densidades en RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y antibióticos. Los cultivos celulares se dividieron 1:2 y 1:4 hasta que estuvieron establecidos. Para el análisis de citometría de flujo, se tiñeron las células tumorales de cada pase con combinaciones de anticuerpos específicos para diversos marcadores de superficie de linfocitos T y B, tales como CD4 anti-ratón marcado con PE y CD8 anti-ratón marcado con FITC y se analizaron en un aparato Becton Dickinson FAC scan con programa Cell Quest (Ouyang, et al., 1997).

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Tercera serie de experimentos Las células con deficiencia de Ku son sensibles a rayos \gamma y agentes quimioterapícos

Experimentos de supervivencia que usan células derivadas de ratones con eliminación génica de Ku70 o Ku80 han demostrado que estas células son muy sensibles a la radiación \gamma y varios agentes quimioterápicos en especial aquellos agentes que inducen roturas de la doble hebra de DNA, tales como: bleomicina, etopósido y adriamicina (Figura 12).

Análisis del promotor HSP70

Se llevaron a cabo experimentos para ensayar la actividad de transcripción del promotor hsp70 en el ratón. Para estos experimentos, primero se usó para los estudios el plásmido N3Luc, una construcción de gen informador que contiene el promotor hsp70 de ratón cadena arriba del gen de luciferasa de la luciernaga. Las células se transfectaron de forma transitoria con esta construcción del gen informador de luciferasa activada por el promotor hsp70 de ratón. La comparación de la actividad luciferasa antes y 8 horas después de choque térmico de las células demostró que a) este promotor muestra pocas "inactivaciones parciales" (es decir, baja transcripción en condiciones normales) y b) una alta actividad inducible por calor. La actividad de transcripción después de un choque térmico de 15 minutos a 45ºC fue al menos 30 veces mayor respecto a los niveles de control. Otros investigadores han descrito niveles de inducción incluso mayores (más de 100 veces) para este promotor (Nguyen et al., J. Biol. Chem. 264: 10487 (1989)).

Se generó entonces el mutante del promotor hsp70, que incluye una eliminación 5', mutaciones de búsqueda del engarce y mutaciones puntuales, fusionadas al gen informador de luciferasa de luciernaga (la construcción N3Luc mutante se designa \DeltaN3Luc) y se examinó la expresión del gen informador inducida por calor. Los resultados mostraron que la eliminación específica (por ejemplo bien en 5' o en la región central del promotor hsp70) aumentó la inducción térmica de actividad de transcripción (como se midió para la actividad del gen informador de luciferasa de luciernaga) en unas cuantas veces más cuando se compara con la capacidad de inducción térmica del promotor intacto no mutado. Otros datos indican que en células con deficiencia en Ku70 o Ku80, la inducción térmica de la actividad del promotor hsp70 también se ve potenciada.

Se establecieron células HeLa estables, que contenían cDNA de Ku70 humano o cDNA de Ku80 humano en la orientación antisentido bajo la regulación del sistema de expresión Tet-Off^{TM} (Clonetech). Una vez inducido el sistema de expresión estas células producirán RNA de Ku70 o Ku80 antisentido, respectivamente. Los experimentos que se llevaron a cabo mostraron (Figura 13) que la expresión de RNA antisentido de Ku70 o Ku80 aumentó el efecto citotóxico de adriamicina 3-5 veces a 1 \mug/ml y que la expresión de RNA antisentido de Ku70 aumentó el efecto citotóxico de radiación \gamma aproximadamente (a 6 Gy).

Cuarta serie de experimentos Subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente del DNA: Impacto sobre el desarrollo linfocítico y tumorigénesis Introducción

La proteína quinasa dependiente del DNA (DNA-PK) consiste en un complejo que se une al DNA heterodímero, Ku70 y Ku80, y una gran subunidad catalítica, DNA-PKcs. Para examinar la función de DNA-PKcs en el desarrollo linfocítico, sensibilidad a la radiación y tumorigénesis, se rompió DNA-PKcs de ratón por recombinación homóloga. Ratones con DNA-PKcs inactivada no presentaron retardo en el crecimiento ni una alta frecuencia de desarrollo de linfocitos T, pero mostraron una inmunodeficiencia severa e hipersensibilidad a la radiación. Al contrario que con el fenotipo Ku70-/- y Ku80-/-, los ratones con DNA-PKcs inactivada estuvieron presentaron bloqueo en la codificación V(D)J pero no en la formación de la unión señal-extremo. Además, la inactivación de DNA-PKcs condujo a hiperplasia y displasia de la mucosa intestinal y a producción de focos de las criptas aberrantes, sugiriendo una nueva función de DNA-PKcs en la supresión de tumor.

Los ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) son hipersensibles a la radiación, tienen deficiencia en la reparación de roturas de la doble hebra de DNA y una recombinación V(D)J debilitada. Recientes estudios sugieren que el defecto SCID está en el gel que codifica la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA DNA-PK(1-3). DNA-PK es una serina/treonina quinasa consistente en una subunidad catalítica de 465-kDa (DNA-PKcs) y un complejo regulador heterodimérico denominado Ku, que está formado por un polipéptido de 70-kDa (Ku70) y uno de 86-kDa (Ku80). Aunque por lo general se cree que Ku ayuda a reclutar DNA-PKcs a DNA in vitro y es posible que sea requerido para la activación fisiológica de DNA-PK en el sitio del daño al DNA (4,5), existen evidencias al menos in vitro de que DNA-PKcs puede por si sola unirse a fragmentos de DNA lineales y activarse para la actividad quinasa en ausencia de Ku (6,7). Se ha demostrado que el fenotipo SCID se relaciona con una mutación sin sentido en Tyr-4046 en la región carboxilo terminal del gen DNA-PKcs (8-10). Esta transversión de T a A tiene como resultado la sustitución del codon de terminación ocre y una pérdida de 83 aminoácidos del extremo C-terminal (9, 10). Por tanto, una razón posible para el fenotipo "rezumante" de SCID es que la proteína DNA-PKcs truncada tenga una débil actividad, pero una funcionalidad suficiente para cierto desarrollo de linfocitos T. Recientemente, Jhappan et al. (11) generaron ratones homocigóticos a partir del ratón transgénico que tiene el gen de fosfodiesterasa cAMP de levadura (designado ratón Sra5-1 o slip). Los homocigotos Sra-1 se encontró que eran inmunodeficientes, carecían de linfocitos maduros, sugiriendo que el transgen se había integrado en un gen requerido para el desarrollo normal de linfocitos T y B. Posteriormente se demostró que la integración del transgen se producía directamente en el locus DNA-PKcs, como se sugería por la localización cromosomal del transgen, los experimentos complementarios con ratones SCID y los niveles agotados de actividad DNA-PK. La diferencia más significativa del fenotipo SCID, no obstante, es la fuerte predisposición a linfomas linfocíticos en el timo que se origina en ratones slip con penetración completa. Por el contrario, el desarrollo de linfomas es de solo aproximadamente 15% de ratones CB-17 SCID, y no se ha descrito para ratones con inactivación de Ku80. La integración de estos datos para generar un modelo global para la función del complejo DNA-PK en tumorigénesis/o supresión de tumor es sencillamente difícil. Primero, suponiendo que la actividad DNA-PK requiera el ensamblado de Ku y DNA-PKcs en las roturas de DNA, entonces la comparación entre el fenotipo Ku80-/- (sin desarrollo de tumor) y slip (100% de penetración de desarrollo de tumor) sugiere que la actividad quinasa de DNA-PK no es necesaria para la supresión tumoral. Quizás están implicadas en la supresión tumoral otras funciones características para esta molécula quinasa, independiente de Ku y cuya inactivación conduce a la predisposición de linfoma de timo como se aprecia en ratones slip. También es posible que en la generación de ratones slip, las múltiples copias de transgenes incorporadas en el locus DNA-PKcs pueda afectar a la expresión de
gen(es) adyacente(s), por ejemplo, a través de la metilación o efecto de posicionamiento. Uno de estos genes activados-cis/inactivados puede funcionar como un gen oncogen/supresor tumoral.

Para determinar la función de los componentes individuales de DNA-PK in vivo, los autores han generado previamente ratones Ku70-/ y Ku80-/- (13, 16). En el presente estudio, los autores han roto el gen DNA-PKcs mediante recombinación homóloga. En el ratón DNA-PKcs-/- resultante, se detuvo el desarrollo de linfocitos T y B, la recombinación de extremo codificante V(D)J fue deficiente, pero permaneció intacta la capacidad de unión señal-extremo V(D)J. Los ratones con inactivación DNA-PKcs no presentaron retardo en el crecimiento ni una alta frecuencia de desarrollo de linfoma de linfocitos T. Además, la inactivación de DNA-PKcs conduce a hiperplasia y displasia de la mucosa intestinal y a producción de focos de las criptas aberrantes, sugiriendo una nueva función de DNA-PKcs en la supresión tumoral.

Materiales y procedimientos Ruptura dirigida de DNA-PKcs y generación de ratones DNA-PKcs-/-

Se aisló el gen DNA-PKcs genómico de ratones de una genoteca de cósmidos sCos-I construida a partir de una línea de células madre embrionarias (ESA) de la cepa 129 de ratón. El vector determinante de diana se construyó sustituyendo la mitad del exon 3 y parte del intrón 3 con el gen PGK-neo. La construcción determinante de diana se linealizó con Notl y se transfectó en células ES de CJ7 por electropermeabilización. Se rastrearon cuatrocientos clones y se identificaron inicialmente como positivos ocho grupos por PCR. Se identificó un clon ES positivo que llevaba la mutación dirigida a diana de DNA-PKcs por una segunda PCR y se confirmó por análisis de transferencia Southern. Este clon ES positivo se inyectó en blastocitos C57BL/6 y se implantó quirúrgicamente en hembras pseudopreñadas para generar el ratón quimérico. Las quimeras se cruzaron con hembras C57BL/6, dando lugar a cinco ratones con transmisión de línea germinal de los siete machos rastreados. Los ratones DNA-PKcs-/- se obtuvieron cruzando ratones DNA-PKcs+/-. Los ratones SCID CB-17 se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY).

El genotipo de los ratones se determinó por PCR que distinguía el alelo endógeno del DNA-PKcs dirigido a diana. La reacción PCR contenía 1 \mug de DNA genómico; 0,6 \muM (de cada uno) de cebadores MD-20: TATCCG
GAAGTCGCTTAGCA-TTG; MD-21: AAGACGGTTGAAGTCAGAAGTCC; y POL-8: TTCACATACACCTTGT
CTCCGACG; 0,2 mM (de cada uno) dNTP; MgCl_{2} 1,5 mM y 2,5 U de Taq polimerasa. Los cebadores MD-20 y MD-21 dieron un producto de alelo de tipo salvaje que tiene 264 pb; los cebadores MD-20 y Pol-8 proporcionaron un producto del alelo dirigido a diana que tiene 360 pb.

Establecimiento de líneas de células primarias y SV40 transformadas

Se aislaron fibroblastos de pulmón primarios de ratones tipo salvaje DNA-PKcs (+/+) de cuatro semanas, ratones heterocigóticos (+/-), homocigóticos (-/-) y CB-17 SCID. Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5% en aire usando medio alpha-MEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 Unidades/ml penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Se obtuvieron fibroblastos de pulmón transformados SV40 transfectando el plásmido de expresión del antígeno T de SV40 usando un sistema de transfección en fosfato de calcio (nº Cat 18306-019, Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

RT-PCR, Análisis de transferencia Western y ensayo quinasa in vitro

Para el ensayo de RT-PCR, se preparó RNA total a partir de fibroblastos de pulmón transformados SV40 usando el kit Qiagen RNeasy (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA). Después de la digestión de DNA genómico contaminado por DNase I (Ambion, Austin TX), se llevó a cabo la síntesis de cDNA con el sistema de preamplificación Superscript (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo al protocolo incluido. Los cebadores PCR usados para la RT-PCR fueron MD-3: ATCAGAAGGTCTAAGGCTGGAAT, MD-5: CGTACGGTGTTGGCTACTGC para la amplificación entre exon 1 y 4 de DNA-PKcs, MD-28: CACTGAGGGCTT-TCCGCTCTTGT, MD-29: GCTCTTGTGCACGAATGTTG
TAG para el dominio quinasa PI-3 y GA-5: AGAAGACTGTGGATGGCCCC, GA-3: AGGTCCACCACCC-TGTTGC para el control de la amplificación GAPDH.

Se prepararon extractos de células completas como se ha descrito antes (15). La concentración de proteína de los extractos se determinó por análisis de Bradford usando BSA como patrón. El análisis de transferencia Western de DNA-PKcs y Ku70 se llevó a cabo como se describe (16) usando el anticuerpo monoclonal DNA-PKcs [42-26] y anticuerpo policlonal Ku70 de cabra anti-ratón M-19 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA).

Histología y preparación celular y análisis de citometría de flujo

Para determinar los cambios patológicos, se prepararon y examinaron como se ha descrito antes (16, 18) secciones histológicas de diversos órganos de ratones hermanos de camada DNA-PKcs-/- y de tipo salvaje. Para la citometría de flujo, se prepararon suspensiones celulares aisladas de órganos linfáticos de mutantes de 4 a 9 semanas, sus controles hermanos de camada y ratones CB-17 SCID para la tinción como se ha descrito antes (16) y se analizaron en FACScan con el programa Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células se tiñeron con combinaciones de anti-CD4 marcado con PE y anti-CD8 marcado con FITC o anti-B220 marcado con PE y anti-CD43 marcado con FITC (PharMingen), según se necesiten. Se recolectaron células de médula ósea de fémures por lavado con jeringa y se prepararon células del timo y del bazo por homogeneización. Las células se recolectaran y lavaron en PBS más FCS al 5% y se recontaron usando un hemacitómetro. Las muestras de ratones individuales se analizaron por separado. Las células muertas se separaron por sus propiedades de dispersión frontal y ortogonal. Los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces y proporcionaron resultados consistentes.

Preparación de DNA y análisis de los productos de recombinación V(D)J

Se midieron el receptor de antígeno de linfocitos T (TCR) y los linfocitos T y B recombinados en inmunoglobulina amplificando fragmentos de DNA recombinados usando PCR. Los DNA genómicos se aislaron del timo, bazo y médula ósea (BM) de ratones heterocigóticos DNA-PKcs (+/-), homocigóticos (-/-) de 4 a 9 semanas y ratones SCID. Los oligonucleótidos para los cebadores de PCR y sondas son como sigue. Para la recombinación V_{\beta}8-J_{\beta}2 TCR_{\beta} (16), V_{\beta}8.1: GAGGAAAGGTGACATTGAGC, J_{\beta}2.6: GCCTGGTGCCGGGACCGAAGTA, y sonda V_{\beta}8: GGGCTGAGGCTGATCCATTA. Para la recombinación D_{\delta}2-J_{\delta}1 TCR_{\delta}, DR6: TGGCTTGACATGCAGAAAA
CACCTG, DR53: TGAATTCCACAGTCACTTGGGTTC y sonda DR2: GACACGTGATACAAAGCCCAGGGAA. Para la unión señal D_{\delta}2-J_{\delta}1 TCR_{\delta} (19), DR21: GTCATATCTTGTCCAGTCAACTTCC, DR162:GATGAGCCAGCT
GGATGAGTAACAC, y sonda DR161: GCCCTCTAGCCATGACA TCAGAGC. Para la recombinación V_{H}7183-J_{H}4 inmunoglobulina (19), DR214: CGCGAAGCTTCGT GGAGTCTGGGGGA, DR217: GGGGAATTCCTGAG
GAGACGGTGACT y sonda DR218: ACCCCAGTAGTCCATAGCATAGTAAT. Para controlar la amplificación de GAPDH, se usaron los mismos cebadores que para el experimento de RT-PCR. La sonda de DNA para GAPDH de ratón se adquirió de Ambion Inc. (nº de Cat. 7330, Austin TX). Los productos de PCR amplificados se resolvieron en 2% de gel de agarosa en TBE 0,5x y se transfirieron a una membrana Hybond N+ de nailon. Usando oligonucleótidos radiomarcados o sondas de DNA, los productos de PCR se hibridaron y visualizaron por autorradiografía.

Análisis de supervivencia a la radiación

Se obtuvieron curvas de supervivencia para cada línea de células midiendo la capacidad formadora de colonias de poblaciones celulares irradiadas. Las células se cultivaron en discos Petri de plástico de 60 mm y se irradiaron con ^{137}Cs (rayos \gamma a una dosis de 2,2 Gy/min para conseguir una dosis acumulada de 1, 2, 3 ó 5 Gy 2 horas después de la siembra. Después de 7 días, las células se fijaron y tiñeron con violeta cristal al 1% en una solución etanólica al 70% y se valoraron las colonias que contenían más de 20 células y se determinó el valor medio para las placas de cultivo triplicadas. La supervivencia celular se normalizó sembrando eficazmente controles sin tratar para cada tipo de célula.

Resultados Ruptura dirigida del gen DNA-PKcs

Para determinar las funciones de DNA-PKcs in vivo, los autores dirigieron a diana DNA-PKcs en ratones por recombinación homóloga. Se inactivó el gen DNA-PKcs sustituyendo la mitad 3' del exon 3 y parte del intrón 3 con el gen PGK-neo (Figs. 15A y 15B). Ratones heterocigóticos para el alelo dirigido a diana DNA-PKcs no mostraron ningún defecto detectable comparado con los hermanos de camada de tipo salvaje. Estos heterocigóticos PKcs+/ se cruzaron seguidamente con cada uno de otros homocigóticos PKcs-/- en 25% de la camada. Por tanto, la ruptura del gen DNA-PKcs no da lugar a letalidad embrionaria. Los ratones adultos PKcs-/- son fértiles y tienen descendencia comparable (aproximadamente 6 embriones) con respecto a los ratones PKcs+/- o PKcs+/+ (aproximadamente 8 embriones). Como contraste con el tamaño corporal es 50% menor en ratones Ku70-/- y Ku80-/ (13, 16), los ratones PKcs-/- tuvieron aproximadamente el mismo tamaño que sus hermanos de camada PKcs+/- y PKcs+/+.

Para confirmar que la ruptura produjo una mutación nula, se analizó mRNA de DNA-PKcs y la expresión de proteínas por RT-PCR, transferencia Western y ensayo quinasa de DNA-PK in vitro. En la Fig. 1C se muestra claramente que los productos de RT-PCR entre el exon 1 y el exon 4 no estuvieron presentes en las células DNA-PKcs-/-. La inmunorreactividad DNA-PKcs fue indetectable (Fig. 15D) y no había actividad quinasa en fibroblastos DNA-PKcs-/- (datos no mostrados). Los niveles del componente de unión a DNA, las proteínas Ku70 y Ku80, fueron similares a los de los controles de tipo salvaje (Fig. 15D y datos no mostrados).

El desarrollo de linfocitos T y B está bloqueada en un estadio temprano en ratones DNA-PKcs-/-

Para determinar si existen cambios patológicos específicos en los ratones dirigidos a diana, se examinó la histología de diversos órganos (Fig. 16A). Con la excepción de sus órganos linfoides y tracto gastrointestinal, los ratones DNA-PKcs-/- tuvieron apariencia normal. El bazo y nódulos linfáticos fueron desproporcionalmente menores 5 a 10 veces con respecto a los controles y estaban exentos de linfocitos. El timo de DNA-PKcs-/- fue desproporcionalmente menor también, no tenía unión cortical-medular y contenían de 50 a 100 veces menos linfocitos que los hermanos de camada de tipo salvaje (2-6 x 10^{6} y 2 x 10^{8}, respectivamente). Además, el tejido linfoide asociado al intestino, estructuras especializadas denominadas placas de Peyer en el intestino delgado, estuvieron notablemente reducidas o ausentes.

Para examinar el defecto inmunológico en ratones DNA-PKcs-/, se marcaron células del timo, médula ósea y bazo con anticuerpos monoclonales específicos para marcadores de superficies de linfocitos y se analizaron usando citometría de flujo multiparámetro. Consistente con los datos histológicos, hubo una ausencia completa de linfocitos B maduros en el bazo (Fig. 16B). El examen de la médula ósea mostró que el desarrollo de los linfocitos B estuvo bloqueado en el estadio temprano B220+ CD43+ progenitor.

El timo de DNA-PKcs-/- presentó contenidos variables de células que expresan timocitos CD4+CD8+ (1-7%), aunque las células CD4-CD8- normalmente constituyen la mayor parte de la población (\sim95%). Las células del bazo de ratones DNA-PKcs-/- contenían linfocitos T positivos aislados CD4+ detectables (1-5%), que fueron ligeramente superiores a los descritos para los ratones SCID. En conjunto, el fenotipo inmunológico en ratones DNA-PKcs-/- se parece mucho al de SCID, pero difiere del de ratones Ku80-/- y Ku70-/- (13, 16). En términos de desarrollo de linfocitos T adecuados, el orden de rango es de tipo salvaje, Ku70-/-, DNA-PKcs-/-, SCID, Ku80-/-, siendo el más deficiente Ku80-/-.

Recombinación génica del receptor de linfocitos T e inmunoglobulina

Para determinar si una mutación nula en DNA-PKcs afecta las recombinaciones de segmentos génicos antígeno-receptor en linfocitos T y B in vivo, se amplificó DNA de médula ósea con cebadores específicos para las recombinaciones V-DJ_{H} de inmunoglobulina, y se amplificó DNA del timo con cebadores que detectan recombinaciones V-DJ_{\beta} y D_{\delta}-J_{\delta} (Fig. 16C). Similar a lo encontrado en ratones SCID, no se detectaron recombinaciones V-DJ_{H} en linfocitos B DNA-PKcs-/-, posiblemente compensando la ausencia de linfocitos B maduros en estos ratones mutantes.

Los linfocitos T de DNA-PKcs -/- en el timo y bazo sufren recombinación D_{\delta}2-J_{\delta}1 a un nivel que es similar al encontrado en ratones SCID y en los hermanos de camada heterocigóticos. No obstante, las recombinaciones V-DJ_{\beta} se redujeron significativamente tanto en calidad como en diversidad (Fig. 16C). La formación en la unión señal de recombinaciones D_{\delta}-J_{\delta} en ratones DNA-PKcs-/ y SCID muestra, no obstante, señales mucho mayores que los hermanos de camada heterocigóticos control. En conclusión, los resultados demostraron que se requiere DNA-PKcs para la codificación pero no para la formación de la unión señal en ratones, un fenotipo que se asemeja mucho al encontrado en ratones SCID, pero característicamente distintos de los de ratones Ku70-/- o Ku80-/-.

La ausencia de DNA-PKcs confiere hipersensibilidad a la radiación

Para demostrar que la inactivación de DNA-PKcs conduce a hipersensibilidad a la radiación ionizante, se expusieron monocapas de fibroblastos pulmonares de DNA-PKcs-/-, DNA-PKcs+/- y DNA-PKcs+/+ a dosis medidas de radiación \gamma (0-5 Gy), y se determinó la supervivencia por el ensayo de formación de colonias. La Figura 17 muestra claramente que las células DNA-PKcs-/- eran mucho más radiosensibles que los heterocigóticos y controles de tipo salvaje, con una diferencia mayor de 100 veces en la supervivencia después de 5 Gy de radiación \gamma. La curva dosis de radiación-respuesta de células DNA-PKcs-/- fue, no obstante, casi idéntica a la de los fibroblastos pulmonares de SCID.

Lesiones preneoplásicas en ratones DNA-PKcs^{-/-}

Recientemente, Jhappan et al (11) describieron que la integración de un transgen en el locus DNA-PKcs da lugar a una fuerte predisposición a linfomas linfoblásticos de timo, que da lugar a ratones slip con una penetración completa. Para examinar si nuestros ratones DNA-PKcs-/ eran también susceptibles a desarrollo tumoral, los autores asignaron al azar camadas que derivan de cruces heterocigóticos y controlaron diariamente el desarrollo tumoral y la supervivencia en los ratones. Ninguno de los hermanos de camada DNA-PKcs+/+ (n = 59) y DNA-PKcs+/- (n = 102) desarrolló tumores en un período de observación de doce meses. Entre los ratones 120 DNA-PKcs-/-, solo 3 desarrollaron linfomas de timo entre los 3 y 12 meses, en profundo contraste con la observación de los ratones slip.

El examen de la autopsia en el tracto gastrointestinal inferior reveló la falta de placas de Peyer maduras en ratones DNA-PKcs-/-. Además, se observó un aumento en las glándulas del colon, que se confirmó por el índice proliferativo de Ki67 (datos no mostrados). En cada uno de 21 ratones DNA-PKcs-/- sanos seleccionados al azar (edades de 1 a 6 meses), se encontraron segmentos intestinales con infiltrados inflamatorios compuestos por células polimorfonucleares, dando lugar a cambios histopatológicos con pólipos inflamatorios (Fig. 18A). Además, en 15 de estos 21 ratones inactivados, se detectó la presencia de lesiones polipoides hiperplásicas, compuestas de células epiteliales colónicas diferenciadas con focos de displasia leve a moderada (Fig. 18B). En ocho casos se encontraron áreas de displasia de moderada a severa. En los casos con displasia severa, se encontraron además áreas identificadas de estroma de tejido conectivo suelto y células displásicas que entran en el núcleo del tallo, que sugiere invasión en la lámina propia (Fig. 18C). Además, tres de estos casos revelaron segmentos de mucosa colónica reemplazara por lesiones lisas compuestas de células displásicas, reminiscentes de los denominados focos de las criptas aberrantes (Fig. 18D). En dos de estos casos, estos cambios se observaron a lo largo del intestino, incluyendo el intestino delgado.

Discusión

En resumen, los autores llevaron a cabo la ruptura dirigida a diana del gen DNA-PKcs-/- en ratones mediante recombinación homóloga. En el ratón DNA-PKcs-/- resultante, se detuvo el desarrollo de linfocitos T y B en estadios progenitores tempranos, la recombinación de extremo codificante V(D)J fue deficiente pero la capacidad de la unión señal-extremo V(D)J permaneció intacta. Los fibroblastos de DNA-PKcs-/- son hipersensibles a la radiación y deficientes en la reparación de roturas de la doble hebra de DNA (datos no mostrados). En conjunto, nuestros datos demuestran de forma concluyente que DNA-PKcs-/- es esencial para el desarrollo de linfocitos T y B. Los autores también han proporcionado evidencia genética directa y definitiva de que el fenotipo SCID está causado por la alteración de la proteína DNA-PKcs. La fuerte similitud entre ratones DNA-PKcs-/- y SCID en términos de desarrollo de linfocitos y recombinación V(D)J sugiere que el fenotipo "rezumante" observado frecuentemente en el desarrollo linfocitario de ratones SCID puede no ser debido a "inactivación parcial" de la expresión de DNA-PKcs. Así, pueden existir quizás vías menos eficientes alternativas en la recombinación V(D)J y el desarrollo de linfocitos.

Son de interés significativo otros tres nuevos hallazgos. Primero, durante un período de observación de 12 meses, solo 3 de 120 ratones DNA-PKcs-/- desarrollaron linfoma de timo. Esta baja frecuencia de linfoma de timo es similar a la observada en ratones Ku80-/- y SCID, pero diferente de ratones Ku70-/- y slip en los que el locus DNA-PKcs se rompió por la integración de un transgen (11). La notable diferencia entre ratones DNA-PKcs-/- (con menos de 3% de incidencia de desarrollo de tumor espontáneo) y slip (que muestran una fuerte predisposición a linfomas linfoblásticos de timo) desarrolla la cuestión de la función de DNA-PKcs en la génesis del linfoma. Aunque DNA-PKcs desempeña una función crucial en la reparación de DSB de DNA y en la recombinación V(D)J, los datos de los autores sugieren que la subunidad catalítica DNA-PK no es esencial para la supresión de tumores de linfocitos T. Las diferencias en la base genética es improbable que contribuyan a los diferentes fenotipos de Ku70-/- y Ku80-/- y DNA-PKcs-/- en el desarrollo de tumores. Todas las cepas Ku70-/- y Ku80-/- y DNA-PKcs-/- estuvieron en una base mixta 129/SV x C57BL/6 y se generaron en las instalaciones centrales de ratones transgénicos en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center usando protocolos idénticos. Además, una línea obtenida de forma independiente de ratones DNA-PKcs-/- tuvo un fenotipo esencialmente idéntico al que describen los autores (20). Y, hasta la fecha, la propensión al desarrollo de linfoma no se ha descrito en ratones con deficiencia de DNA-PKcs generados por ruptura dirigida a diana (20, 21).

En segundo lugar, dichos ratones DNA-PKcs-/- pueden portar la unión señal-extremo y no presentar retardo en el crecimiento, al contrario que los animales Ku70-/- y Ku80-/- (13, 16, 22), sugiriendo fuertemente que las proteínas Ku pueden tener funciones en la recombinación V(D)J y en la reparación de daño al DNA que son independientes de DNA-PKcs.

En tercer lugar, y quizás la más interesante, es la propensión de ratones DNA-PKcs-/- a desarrollar pólipos hiperplásicos y focos de las criptas aberrantes (ACF) en el intestino. Estos cambios se consideran lesiones neoplásicas y lesiones tipo carcinoma in situ en roedores tratados con carcinógenos y en seres humanos con alto riesgo de desarrollar hiperplasia colorectal (23-27). Los resultados de los autores muestran claramente que la inactivación de DNA-PKcs conduce a hiperplasia, displasia de la mucosa intestinal y producción de focos de las criptas aberrantes, sugiriendo una función de DNA-PKcs en la supresión del tumor.

La carcinogénesis es un proceso complejo de varias etapas, que conlleva la aparición de varios sucesos a niveles molecular, celular y morfológico. Debido a que los tumores de colon se desarrollan a través de estadios morfológicos bien definidos, se ha establecido un modelo elegante para la tumorigénesis colorectal (26). El desarrollo de tumores colorectales parece iniciarse por mutaciones en el gen supresor del tumor APC, que conducen a la formación de adenomas benignos. Mutaciones secuenciales en los genes supresores de tumor RAS, DCC y p53 parecen completar el proceso, que finalmente da lugar a la progresión del estado benigno al maligno. Estudios recientes de dos síndromes hereditarios distintos, la Poliposis Adenomatosa Familiar (FAP) y el Cáncer Colorectal No Poliposo Hereditario (HNPCC) (27) sugieren que el defecto genético en FAP afecta a la velocidad de inicio del tumor alterando la función "vigilante" del gen APC. Como contraste, el defecto en HNPCC afecta en gran medida a la progresión del tumor determinando como diana la función guardiana del genoma de genes reparadores de emparejamientos erróneos del DNA (MMR). Es posible que la mutación en DNA-PKcs, además de alteraciones en el gel APC, pueda afectar el inicio de tumor colorectal o de lugar a predisposición a tales tumores. De forma alternativa, el defecto en DNA-PKcs puede afectar a la progresión del tumor, una función "vigilante" similar a la propuesta para los genes MMR. Se ha demostrado que DNA-PKcs fosforila muchos factores de transcripción in vitro (28-31), sugiriendo la relación de DNA-PKcs en la regulación de la transcripción. Aunque permanece sin demostrar, es posible que la posible función supresora del tumor de DNA-PKcs pueda estar relacionada con la actividad de control de la transcripción de esta molécula quinasa. Otras investigaciones revelarán cómo ejerce este efecto DNA-PKcs y porqué mutaciones en diferentes componentes del complejo DNA-PK dan lugar a fenotipos discretos.

Referencias para la cuarta serie de experimentos

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<110> SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH

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<120> USOS DE DNA-PK

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<130> 1747/55672-A-PCT-EPO

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<140> 99937188.3

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<141> 1999-06-30

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<160> 40

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<170> PatentIn version 3.0

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagaattc tcctccagca cagcctacat g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagaattc ggctcccaat gaccctttct g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagaatgg cctctccagg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactcaatca ctaagacagc t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggccagctc attcctccac tcatg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctacagtgt acccggacct atgcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaacagga ctggtggttg agcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatccggaag tcgcttagca ttg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagacggttg aagtcagaag tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcacataca ccttgtctcc gacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcagaaggt ctaaggctgg aat

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtacggtgt tggctactgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactgagggc tttccgctct tgt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcttgtgc acgaatgttg tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagactgt ggatggcccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtccacca ccctgttgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaaaggt gacattgagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctggtgcc gggaccgaag ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggctgaggc tgatccatta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcttgaca tgcagaaaac acctg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaattccac agtcacttgg gttc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacacgtgat acaaagccca gggaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatatctt gtccagtcaa cttcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagccag ctggatgagt aacac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccctctagc catgacatca gagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Otras características de interés

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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cgcgaagctt cgtggagtct ggggga

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26

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<210> 39

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<221> Otras características de interés

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<222> (1)..(26)

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador

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<400> 39

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ggggaattcc tgaggagacg gtgact

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26

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<210> 40

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<221> Otras características de interés

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<222> (1)..(26)

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<223> Descripción de secuencia artificial: sonda

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<400> 40

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accccagtag tccatagcat agtaat

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26

Claims

1. Un procedimiento in vivo para aumentar la susceptibilidad de una célula a agentes que dañan el DNA, que comprende introducir en la célula un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula al daño al DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación, y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido antisentido está encerrado en un liposoma antes de la introducción en la célula.

3. Uso de un oligonucleótido antisentido para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor en un sujeto, en el que el oligonucleótido se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que el oligonucleótido antisentido está en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de un tumor al daño al DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación, y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

4. Una composición farmacéutica para prevenir la expresión de una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA que comprende un oligonucleótido antisentido purificado que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en la que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

5. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el oligonucleótido antisentido está encerrado en un liposoma.

6. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende además uno o más agentes que dañan el DNA.

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que los agentes que dañan el DNA son adriamicina, bleomicina y etopósido.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que los agentes que dañan el DNA inducen roturas de la doble hebra.

9. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el vehículo está adaptado para pasar a través de una membrana plasmática de una célula.

10. Uso de un vector de expresión para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer en un sujeto, en el que el vector comprende (a) un promotor de choque térmico y (b) una porción que codifica un oligonucleótido antisentido que se hibrida de forma específica con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, para prevenir la expresión de la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA, en el que el oligonucleótido antisentido se expresa en una cantidad suficiente para aumentar la sensibilidad de una célula al daño al DNA inducido por calor, agentes químicos o radiación y en el que la subunidad de la proteína quinasa dependiente del DNA es una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del DNA, una Ku70 o una Ku80.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que el oligonucleótido antisentido se introduce de forma selectiva en sitios de cáncer.

12. El uso según la reivindicación 10, que comprende además el uso de calor, radiación o quimioterapia.

13. El uso según la reivindicación 10, que comprende además aplicar energía de campo eléctrico.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que la energía de campo eléctrico comprende radiación de radiofrecuencia.