CN101474413A

CN101474413A - Drr1基因在制备抗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN101474413A
Application number: CNA2009103003782A
Authority: CN
Inventors: 魏于全; 赵新宇; 刘劝; 梁淑芳
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2009-02-10
Filing date: 2009-02-10
Publication date: 2009-07-08

Abstract

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及DRR1基因在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明提供了新的肿瘤基因治疗的技术方案。该技术方案提供了DRR1基因及其编码蛋白在制备抗肿瘤药物与抗肿瘤辅助药物中的用途。动物实验结果表明DRR1的表达通过诱导肿瘤细胞的凋亡而显著抑制异种移植肿瘤的生长。本发明将以脂质体包裹的表达的重组表达载体经静脉注射给药，能够延长DNA药物在体内降解时间，抑瘤作用明显。DRR1重组制剂具有生产简单且使用方便的特点，将对肿瘤特别是上皮来源肿瘤的治疗有重要意义。

Description

DRR1基因在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及DRR1基因及其编码产物在制备抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物方面的用途。

背景技术

肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因而获得特定的功能，继而执行或者介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。随着人类基因组计划的完成和分子生物学技术的不断提高，将会有大批的肿瘤相关基因和致癌基因被克隆并鉴定，肿瘤发病机制的分子基础将被逐步阐明。这不仅为肿瘤的基因治疗提供更多的治疗基因和有效的治疗策略，而且也将大大拓宽肿瘤基因治疗的临床应用前景。

细胞凋亡(apoptosis)是一切生物正常胚胎发生过程和发育过程中细胞清除的正常途径。这一过程的紊乱可导致发育异常，并给人类造成许多严重的疾病。许多证据表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的失调有密切关系。肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。细胞凋亡参与了癌症的起始过程，并对癌症的发生起负调控作用。凋亡调控失常的发生机制几乎涉及细胞凋亡信号途径的所有方面，凋亡异常对癌细胞的转移也十分重要。由于肿瘤细胞凋亡的抑制是肿瘤发生的一个重要原因，故通过细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号转递系统，即抑制肿瘤细胞的生存基因的表达，而激活其死亡基因的表达，以选择性诱导细胞凋亡为目标的基因治疗已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。

人肾癌下调基因(down-regulated in renal cell carcinoma，DRR1，GenBankNM_007177))亦称为TU3A(Tohoku University cDNA clone A on chromosome3)，该基因由日本学者Horii等和美国学者Smith等分别独立克隆和鉴定，该基因定位于染色体的3p21.1。Northern分析和基因芯片分析显示，DRR1基因广泛表达于正常的组织或细胞，而在许多癌细胞系和原发肿瘤中表达受到抑制。DRR1基因的原初转录产物可在个体发育或细胞分化时通过变位剪接产生出组织或发育阶段特异性的mRNA，这些mRNA剪接异构体(splicing isoforms)编码的各同源蛋白质之间具有大致相同结构或功能域，同时也具有特定的性质差异。对DRR1基因的功能、失活机制以及其与细胞转化之间的关系等尚不清楚，有待进一步的深入研究。目前，尚未有将DRR1基因应用于肿瘤基因治疗的技术方案报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供人肾癌下调基因(down-regulated in renalcell carcinoma，DRR1)或DRR1基因表达产物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物方面的新用途。GenBank中的人DRR1基因的序列为NM_007177。

其中，上述DRR1基因表达产物的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8所示。

其中，上述DRR1基因表达产物的cNDA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物。该抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物是由DRR1基因表达载体或DRR1基因表达产物作为主要活性成分并添加药学上可以接受的辅料制备而成的。

其中，上述表达载体为真核表达质粒或病毒载体。

其中，上述真核表达质粒为pVAX1-DRR1。

进一步的，上述抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物的活性成分被脂质体所包被。

更进一步的，上述抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物还含有肿瘤化疗药物作为活性成分。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种制备权利要求上述抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物的方法。该方法包括以下步骤：

a、将DRR1基因或编码DRR1基因表达产物的cDNA构建入表达载体得到能够表达DRR1的重组载体；

b、将a步骤所得的重组载体转入宿主细胞，扩增制备重组载体；

c、纯化重组载体；

d、将重组载体与脂质体或其他辅料混合形成复合体；

e、将步骤d产物制成注射剂或冻干制剂。

当使用质粒载体pVAX1时，可以采用下述优选的方法：

a、将DRR1基因或DRR1基因表达产物的cDNA构建入质粒载体pVAX1，得到能够表达DRR1的重组载体pVAX1-DRR1；

b、将a步骤所得的重组载体转入宿主细胞，扩增制备该重组载体；

c、纯化重组载体pVAX1-DRR1；

d、将重组载体pVAX1-DRR1与阳离子脂质体(DOTAP:Chol)以1μg:1nmol的比例混合形成复合体，其中阳离子脂质体(DOTAP:Chol)则是DOTAP和胆固醇(Chol)按照相同摩尔比制备而成；

e、将步骤d产物制成注射剂或冻干制剂。

其中，上述肿瘤可为鼻咽癌、肝癌、肺癌、白血病、宫颈癌或肾癌中的至少一种。

优选的，上述肿瘤可为上皮来源的其他肿瘤。

具体而言，本发明提供了人肾癌下调基因(down-regulated in renal cell carcinoma，DRR1)及其表达产物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物方面的新用途。人肾癌下调基因表达产物是指其原初转录产物，及其原初转录产物在个体发育或细胞分化时通过变位剪接产生出组织或发育阶段特异性的mRNA，以及这些mRNA编码的各同源蛋白质。

DRR1基因的原初转录产物可在个体发育或细胞分化时通过变位剪接产生出组织或发育阶段特异性的mRNA，这些mRNA剪接异构体编码的各同源蛋白质之间具有大致相同结构或功能域，具有相似的功能。

比如SEQ ID NO.5所示的蛋白，其编码cDNA序列为SEQ ID NO.1所示，是由DDR1 mRNA的剪接异构体1编码；SEQ ID NO.6所示的蛋白，其编码cDNA序列为SEQ ID NO.2所示，是由DDR1 mRNA的剪接异构体2编码；SEQ ID NO.7所示的蛋白，其编码cDNA序列可SEQ ID NO.3所示是，由DDR1 mRNA的剪接异构体3编码；SEQ ID NO.8所示的蛋白，其编码cDNA序列可为SEQID NO.4所示，是由DDR1 mRNA的剪接异构体4编码。

根据本发明的一个方面，可以将DRR1基因构建于表达载体中，将该重组表达载体与阳离子脂质体形成的复合体作为药物应用于非小细胞肺癌的治疗。其中，上述的载体为真核表达载体，外源cDNA可以为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DRR1基因剪接异构体。

本发明的有益效果在于：创造性地提供了人肾癌下调基因(down-regulated in renalcell carcinoma，DRR1)基因及其编码的产物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物方面的新用途。本发明使用脂质体包裹真核表达DRR1的重组质粒制剂通过尾静脉注射后能在荷瘤裸小鼠的肿瘤组织中表达DRR1多肽并诱导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制了肿瘤的生长。HE染色表明治疗心、肝、脾、肺、肾等重要器官无明显损害。因此，DRR1基因重组制剂有望成为一种安全有效的抗肿瘤药物或者肿瘤放化疗的辅助用药，具有良好的应用前景。

附图说明

图1、质粒载体pVAX1载体及其多克隆位点序列的图谱。

图2、PCR扩增的DRR1 cDNA。M：DL2000DNA Marker(TaKaRa)；1：DRR1 cDNA。

图3、为DRR1基因在不同肿瘤细胞中的表达情况。M：GeneRular DNA ladder Mix(Fermentas)；RT-PCR分析结果表明DRR1mRNA仅在所检测的肾细胞癌O S-RC-2细胞中有表达，而在肺癌A549和SPC-A1、鼻咽癌HNE-1、宫颈癌HeLa、肝癌HepG2及白血病K562等细胞中无表达。GAPDH为细胞内管家基因，作为细胞内总mRNA完整性的参照。

图4、是临床肺癌标本的免疫组化染色。共检测了20例非小细胞肺癌临床标本和2例癌旁肺组织，其中有15例肺癌的DRR1表达缺失，在其余5例肺癌和2例癌旁组织中有表达。A代表典型的DRR1表达缺失的肺癌；B表明DRR1蛋白在核内有表达。C和D分别为A和B的局部(以虚线方框表示)放大图片。显色底物为3，3-二氨基联苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)。

图5、表明体外转染DRR1表达质粒后能够抑制肿瘤细胞的生长。用脂质体(Lipofectamine2000)转染空质粒载体(pVAX1)或重组质粒(pVAX1-DRR1)至培养的A549细胞，转染48h后用MTS法测定细胞的增殖活性。结果显示重组质粒(pVAX1-DRR1)转染组与空质粒载体(pVAX1)转染组的细胞相比，细胞的增值活性受到明显抑制(P<0.05；左图)。

图6、流式细胞仪分析结果，表明体外转染DRR1表达质粒后能够抑制肿瘤细胞的生长；流式细胞仪分析结果亦表明重组质粒(pVAX1-DRR1)转染组的细胞凋亡率(D)较空质粒载体(pVAX1)转染组的凋亡率(C)提高了65.1％；A和B分别代表为处理组和脂质体(Lipofectamine 2000)处理组的凋亡率。

图7、为DRR1基因表达抑制异种移植肺癌在裸小鼠体内的生长。小鼠经尾静脉注射脂质体包裹的空质粒载体(pVAX1)或重组质粒(pVAX1-DRR1)，每周3次。治疗约3周后，治疗组(pVAX1-DRR1)与对照组(pVAX1)相比，肿瘤的生长受到明显的抑制(P<0.05)。

图8、为动物实验各处理组肿瘤免疫组化分析的典型结果。A、B、C和D分别代表来自PBS处理组、脂质体处理组、空载体处理组(pVAX1)以及基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤组织。基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤组织细胞中有DRR1蛋白的表达。

图9、为动物实验各处理组肿瘤TUNEL分析的典型结果。结果表明，基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤与空载体处理组(pVAX1)的相比，细胞凋亡显著增加(P<0.05)。A、B、C和D分别代表来自PBS处理组、脂质体处理组、空载体处理组(pVAX1)以及基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤组织。

图10、为动物实验各处理组肿瘤TUNEL分析的结果图。结果表明，基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤与空载体处理组(pVAX1)的相比，细胞凋亡显著增加。A、B、C和D分别代表来自PBS处理组、脂质体处理组、空载体处理组(pVAX1)以及基因治疗组(pVAX1-DRR1)的肿瘤组织。

以下结合附图通过对具体实施方式的简要描述来进一步说明本发明，但这并非对本发明的限制，本领域的专业技术人员依据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进，只要基于本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

具体实施方式

实施例一人DRR1 cDNA的克隆及重组载体的构建

根据GenBank中的人DRR1基因的序列(NM_007177)，设计引物扩增人DRR1 cDNA序列。为了进一步将DRR1 cDNA构建于真核表达载体pVAX1(Invitrogen，图1)，在引物的上、下游引物中分别引入BamH I与Xho I酶切位点。

上游引物(SEQ ID NO.9)：

5’-TATGGATCCATGTACTCGGAGATCCAGA-3’；

下游引物(SEQ ID NO.10)：

5’-TATCTCGAGTACAGCTCTCTCTCTTC-3’；

下划线示酶切位点。

以重组质粒pQE30-DRR1(由四川大学生物治疗国家重点实验室构建和保存；原核表达载体购自Qiagen公司，重组质粒的结构及其构建过程已公开于Biotechnol Appl Biochem2008；49(Pt 1)：17-23)为模板，用上述基因特异引物行PCR以扩增DRR1 cDNA。反应条件为：94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，循环25次。PCR反应扩增出长约450bp的DNA片段，与理论预期大小一致(图2)。

将上述PCR产物和真核表达质粒pVAX1分别用BamH I/Xho I进行双酶切。1％琼脂糖凝胶回收后以T4连接酶在4℃反应过夜，连接子转化大肠杆菌DH5α，再经卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒行PCR和BamH I/Xho I双酶切鉴定，最后进行测序鉴定，得到真核表达pVAX1-DRR1。其中DRR1 cDNA的序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质序列如如SEQ IDNO.5所示。

实施例二 DRR1基因在肿瘤细胞以及临床肿瘤标本中的表达

通过RT-PCR的方法对DRR1基因在人鼻咽癌HNE-1、肾癌OS-RC-2、肝癌HepG2、肺小细胞肺癌A549、白血病K562以及宫颈癌HeLa等6种肿瘤细胞中的表达情况进行了分析。提取各细胞的总RNA，用基因特异性引物进行一步法扩增。其中DRR1cDNA的上游引物为5’-GCTCATCAAGCCCAAGAAGC-3’；下游引物为5’-GCTCTCTCTCTTCGCTGGTC-3’。细胞内管家基因GAPDH作为内参，扩增引物为5’-TCATCTCTGCCCCCTCTG-3’(上游)和5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’(下游)。其表达的缺失情况见图3。

应用兔抗人DRR1多克隆抗体(由四川大学生物治疗国家重点实验室制备和保存，制备方法公开于Biotechnol Appl Biochem 2008；49(Pt 1)：17-23)，对20例临床肺小细胞肺癌标本和2例癌旁肺组织中DRR1的表达进行了免疫染色。结果表明，与2例DRR1表达正常的癌旁肺组织相比，DRR1蛋白在15例肺癌中表达缺失(图4)。

实施例三 DRR1基因的再表达对肿瘤细胞的影响

在96孔板中接种1×10⁴个A549细胞，于5％ CO₂，37℃孵箱培养。待细胞汇合至60-70％时，参照脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染对照质粒pVAX1或重组质粒pVAX1-DRR1，转染48h后吸出培养液，每孔加入新鲜培养液100μl以及20μl四氮唑蓝内盐(MTS，3-(4，5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium，inner salt，购于Promega)溶液，于5％ CO₂，37℃孵箱培养1h后在酶标仪上检测各处理组在490nm波长处的吸光值(A490)。每个处理重复5次。实验结果表明，DRR1在其表达阴性的A549细胞中重表达后能抑制肿瘤细胞增殖(图5)。

用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)将对照质粒pVAX1或重组质粒pVAX1-DRR1转染A549细胞48h后胰酶消化各组细胞，1000rpm离心5min沉淀细胞，再用PBS清洗细胞2次；随即加入0.5ml的碘化丙锭(PI)染液(5μg/ml)重悬细胞，于4℃避光静置30min后进行流式细胞仪检测。未转染细胞以及单纯脂质体转染的细胞做相同的处理。流式细胞分析结果表明未处理组、脂质体处理组、对照质粒pVAX1以及重组质粒pVAX1-DRR1处理组的细胞凋亡率分别为4.0％、5.6％、32.4％和54.5％(图6)。

实施例四 DRR1基因的表达对体内肿瘤的生长的抑制

为证明DRR1基因的表达在体内是否也具有抗肿瘤作用，本发明按常规方法建立了人肺小细胞肺癌的异种移植瘤动物模型。具体是将2×10⁶个对数生长期的A549细胞接种于4～6周龄雌性裸小鼠的肋腹侧。待肿瘤体积达70～100mm³时，将小鼠随机分为以下4组(5～7只/组)进行治疗。

(1)PBS组：每只小鼠尾静脉注射PBS缓冲液300μl/次，每周的1、3、5给药，共4周。

(2)Lipo组：每只小鼠尾静脉注射含有125μg阳离子脂质体DOTAP/Chol(由四川大学生物治疗国家重点实验室制备)的PBS溶液300μl；给药方式和时间同上。

(3)NP组：将空质粒pVAX1与阳离子脂质体DOTAP:Chol按照质量比1:2.5制备成脂质体-质粒复合物溶液(300μl)；每只小鼠尾静脉注射pVAX1质粒2.5mg/kg/次(50μg/只/次)；给药方式和时间同上。

(4)DRR1治疗组：将重组质粒pVAX1-DRR1与阳离子脂质体DOTAP/Chol按照质量比1:2.5制备成脂质体质粒复合物溶液(300μl)；每只小鼠尾静脉注射pVAX1-DRR1质粒2.5mg/kg/次(50μg/只/次)；给药方式和时间同上。

小鼠接种肿瘤细胞后，观察肿瘤体积，从开始治疗起用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(D)，用下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积V(mm³)＝0.52×L×D²。治疗结束后的第3天从每组中以颈椎脱臼法处死进行肿瘤组织的分析。实验结果表明，到治疗后第3周时，DRR1治疗组与对照组(NP组)的肿瘤相比生长速度明显降低，结果具有统计学差异(P<0.05；图7)。

为了验证抗肿瘤效应与DRR1基因的再表达之间是否具有相关性，取各组的肿瘤组织的进行免疫组化分析。免疫染色结果表明在治疗组肿瘤细胞核中有明显的阳性染色，而各对照组的肿瘤组织均为阴性(图8)，证明DRR1基因的表达是导致体内抗肿瘤效应的直接因素。

将各处理组的肿瘤组织进一步用DeadEnd Fluorometric TUNEL System(Promega)进行检测，结果见图9和图10。原位末端标记法(TUNEL)分析结果显示DRR1治疗组凋亡细胞明显增加(图10D)，而各对照组(图10A，B，C)的肿瘤组织未见明显的凋亡细胞。

综上所述，本发明使用脂质体包裹真核表达DRR1的重组质粒制剂通过尾静脉注射后能在荷瘤裸小鼠的肿瘤组织中表达DRR1多肽并诱导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制了肿瘤的生长。HE染色表明治疗心、肝、脾、肺、肾等重要器官无明显损害。因此，DRR1基因重组制剂有望成为一种新的抗肿瘤药物。虽然本发明具体实施方式只提供了肺小细胞肺癌模型中的抗肿瘤结果，但结合实施例二的表达情况分析，本领域技术人员容易得知其在其他肿瘤的治疗中也会有效果，特别是在治疗上皮来源的肿瘤中会有较好的疗效。

以上实例仅是对本发明的举例说明。本领域技术人员可依据本发明做出各种变型或改进，比如将权利要求书中各蛋白的编码基因之间或它们与其他基因进行组合；进一步地，将上述组合应用于抗肿瘤的基因治疗或肿瘤放疗、化疗的增敏治疗以及术后的辅助治疗。总之，只要不脱离将DRR1基因/蛋白及其变异体作为药物而应用于抗肿瘤的基本思想，都属于本发明的权利要求所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>DRR1基因在制备抗肿瘤药物中的用途

<130>A090028k

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>435

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

<210>2

<211>408

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>2

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<212>DNA

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<220>

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<212>DNA

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<220>

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<212>PRT

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<220>

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<212>PRT

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<213>artificial

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<212>DNA

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<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>10

Claims

【权利要求1】DRR1基因或DRR1基因表达产物在制备抗肿瘤药物与抗肿瘤辅助药物中的用途。
【权利要求2】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述DRR1基因表达产物的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

【权利要求3】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述DRR1基因表达产物的cNDA序列如SEQ ID NO.1SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
【权利要求4】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肿瘤上皮来源的肿瘤。
【权利要求5】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为鼻咽癌、肝癌、肺癌、白血病、宫颈癌或肾癌中中的至少一种。
【权利要求6】一种抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，是由DRR1基因编码的蛋白或DRR1基因表达载体作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成。
【权利要求7】根据权利要求6所述的抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，其特征在于：所述表达载体为真核表达质粒或病毒载体。
【权利要求8】根据权利要求6所述的抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分被脂质体所包被。
【权利要求9】根据权利要求6～8任一项所述的抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，其特征在于还含有肿瘤化疗药物作为活性成分。
【权利要求10】一种制备权利要求7所述抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、将DRR1基因或编码DRR1蛋白的cDNA构建入表达载体，得到能够表达DRR1的重组载体；

b、将a步骤所得的重组载体转入宿主细胞，扩增制备该重组载体；

c、纯化重组载体；

d、将重组载体与脂质体或其他辅辅助性成分混合形成复合体；

e、将步骤d产物制成注射剂或冻干制剂。