BR112020024489A2 - conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ácido nucleico e método de identificação de anticorpo ou fragmento do mesmo - Google Patents
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Abstract
CONJUNTO DE ANTICORPOS OU FRAGMENTOS DOS MESMOS, ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO.
A presente invenção se refere a uma nova biblioteca de anticorpos e a um método de pesquisa de anticorpos usando a mesma. Tendo uma estrutura de VH ou VL específica derivada de sequência humana, a biblioteca de anticorpos de acordo com a presente invenção exibe alta estabilidade termodinâmica e desfruta das vantagens de permitir alta expressão solúvel, bem como dobramento reversível. Além disso, o anticorpo de acordo com a presente invenção inclui uma variedade de CDRs racionalmente controladas de modo a exibir alta especificidade e alta afinidade para todos os antígenos e, portanto, pode ser vantajosamente usado para selecionar um anticorpo candidato adequado contra um antígeno alvo.
Description
DO MESMO Campo de Aplicação
[001] A presente invenção se refere a uma nova biblioteca de anticorpos e um método de triagem de anticorpos usando a mesma, em que a biblioteca de anticorpos de acordo com a presente invenção tem certas estruturas VH ou VL derivadas de sequências humanas e, portanto, tem vantagens de exibir alta estabilidade termodinâmica e realizar alta expressão solúvel e dobramento reversível.
[002] Além disso, a biblioteca de anticorpos de acordo com a presente invenção contém várias CDRs que são racionalmente controladas para terem alta especificidade e alta afinidade para todos os antígenos e, portanto, são úteis para a seleção de anticorpos candidatos.
Estado da Técnica
[003] Os anticorpos são proteínas produzidas pela estimulação de um antígeno nas células B (linfócitos B) de leucócitos no sistema imunológico. Quando um anticorpo encontra um antígeno, ele reconhece o antígeno por meio de um receptor presente na célula e se liga ao antígeno usando o receptor. Esse anticorpo é considerado um candidato para novos fármacos de proteína para o tratamento de doenças, e várias bibliotecas de anticorpos são produzidas e os anticorpos são triados a partir das mesmas, a fim de encontrar anticorpos funcionais de interesse.
[004] Essa biblioteca de anticorpos usa tecnologia de recombinação de genes. Os genes que codificam proteínas de anticorpos são extraídos de células B presentes no corpo humano para produzir bibliotecas de genes de anticorpos, e um anticorpo possuindo especificidade de ligação ao antígeno desejada é selecionado a partir dessas bibliotecas. A tecnologia da biblioteca de anticorpos revolucionou a produção de anticorpos, como os anticorpos humanos. A característica mais marcante da resposta imunológica do anticorpo é que não importa que tipo ou forma de antígeno externo invade o corpo, se o antígeno for uma substância estranha que não é idêntica a um componente do corpo, um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno é produzido dentro de uma semana.
[005] Os anticorpos são produzidos por linfócitos B, e um linfócito B produz apenas um tipo de anticorpo. Na verdade, há uma série de tipos de linfócitos B no corpo humano, cada tipo de linfócito B expressando um anticorpo tendo sua própria especificidade de ligação ao antígeno única na membrana celular, e é conhecido que aproximadamente 108 tipos de ligação ao antígeno diversidade existe no corpo humano. Quando um antígeno invade, apenas o linfócito B que expressa um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno se prolifera rapidamente e produz uma grande quantidade de anticorpos. Como resultado, a concentração desse anticorpo específico no soro aumenta rapidamente e desempenha a função de remover rapidamente o antígeno invasor. Portanto, existem centenas de milhões de diversidade de anticorpos no corpo humano, e essa diversidade de anticorpos é referida como um “repertório de anticorpos”.
[006] Portanto, um número suficiente de linfócitos B do corpo humano é obtido através da coleta de sangue, o mRNA é isolado dessas células e, em seguida, o cDNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo é obtido através de RT-PCR (reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa). Como resultado, um repertório de anticorpos no corpo humano pode ser adquirido in vitro na forma de um gene de uma maneira relativamente simples. O núcleo da tecnologia de biblioteca de anticorpos é que este repertório de genes de anticorpos humanos é expresso (ou exibido) como uma proteína, o gene que codifica a proteína do anticorpo é ligado por qualquer meio, que é chamado de ligação genótipo-fenótipo, e com base nisso, um anticorpo que se liga a um antígeno específico é selecionado da biblioteca de anticorpos e, ao mesmo tempo, um gene que codifica o anticorpo específico é obtido.
[007] Aqui, a imunidade completa não é necessária e a forma de Fab de um anticorpo com função de ligação ao antígeno é expressa, ou um fragmento de anticorpo denominado "scFv (fragmento variável de cadeia única)", em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL) estão ligados por ligantes peptídicos curtos de cerca de 15 aminoácidos. Neste caso, a tecnologia de biblioteca de anticorpos é classificada em exibição de fago, exibição de ribossomo, exibição de levedura ou semelhantes, dependendo do meio tendo uma superfície, na qual o meio usado para a ligação genótipo- fenótipo de tal anticorpo é expresso, e anticorpos com propriedades de ligação ao antígeno desejadas podem ser obtidos sem indução de resposta imunológica, como administração de antígeno.
[008] No entanto, há desvantagens em que muito conhecimento técnico é necessário para a produção de biblioteca de anticorpos e triagem de anticorpos, e processos de otimização de anticorpos, como maturação de afinidade após a triagem de anticorpos, são frequentemente realizados devido à dificuldade em obter anticorpos de alta afinidade e análise funcional direta em células de mamíferos é desvantajosamente impossível devido a problemas como toxicidade durante a triagem primária. No caso de anticorpos terapêuticos, os anticorpos que não se ligam simplesmente a um antígeno, mas têm uma função terapêutica real, devem ser selecionados e, portanto, tal desvantagem tem sido uma barreira para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos.
[009] A biblioteca de anticorpos de exibição de fago é a biblioteca de anticorpos mais amplamente usada. Na verdade, o Humira (anticorpo monoclonal humano anti-TNF-alfa), que está atualmente disponível comercialmente, é um anticorpo terapêutico produzido usando a tecnologia de exibição de fago. A biblioteca de anticorpos ideal exibe ampla diversidade de anticorpos e permite que clones de anticorpos de alta afinidade possuindo a especificidade de ligação ao antígeno desejada sejam obtidos a qualquer momento. Para este fim, deve ser produzida uma biblioteca possuindo uma diversidade de 10 11 anticorpo de cerca de 10 a cerca de 10 . No entanto, é muito difícil produzir uma biblioteca desse tamanho por meio da clonagem de genes de anticorpos, e este é o desafio mais difícil na produção de uma biblioteca de anticorpos de exibição em fagos. Além disso, há uma desvantagem em que o próprio fago atua como uma toxina, de modo que a análise funcional não pode ser realizada imediatamente.
[010] A maior vantagem da exibição de ribossomo é que é um sistema livre de células e, portanto, é capaz de produzir facilmente uma biblioteca que é grande o suficiente para produzir teoricamente uma biblioteca com um tamanho de 1013, o que é vantajoso para a obtenção de anticorpos de alta afinidade (geralmente, conforme o tamanho das bibliotecas de anticorpos aumenta, a possibilidade de que anticorpos de alta afinidade estejam contidos na biblioteca aumenta) e a polimerase propensa a erros pode ser usada porque há um processo de amplificação por PCR, portanto, a introdução de mutações para induzir artificialmente a evolução molecular é muito fácil. No entanto, devido a problemas de toxicidade e vários problemas experimentais, na prática, a tecnologia de exibição de fago é usada principalmente para a produção de bibliotecas de anticorpos naive.
[011] A tecnologia de apresentação de levedura tem muitas limitações técnicas na construção de uma biblioteca de anticorpos com uma diversidade de 109 ou mais, devido ao processo de inserção do vetor recombinante na cepa de S. cerevisiae e o grande tamanho das células de levedura. Portanto, é usado principalmente para construir uma biblioteca mutante de um anticorpo específico do antígeno que já foi assegurado usando as vantagens no processo de seleção e para selecionar anticorpos de alta afinidade da biblioteca.
[012] Entre eles, a exibição de fago é uma tecnologia para rastrear anticorpos pela expressão de fragmentos de anticorpos na superfície de um bacteriófago e tem a vantagem de identificar anticorpos específicos do antígeno em um curto espaço de tempo em comparação com a tecnologia de anticorpos convencionalmente desenvolvida (desenvolvimento de anticorpos quiméricos/humanizados usando hibridomas ou desenvolvimento de anticorpos usando camundongos transgênicos). A exibição de fagos tem uma desvantagem em que anticorpos eficazes podem ser identificados apenas quando uma biblioteca altamente diversa é assegurada. No entanto, o recente desenvolvimento de técnicas de amplificação e clonagem de genes resolveu a questão de garantir uma grande biblioteca.
[013] Uma biblioteca de anticorpos sintéticos refere-se a uma biblioteca de anticorpos que é transmitida com diversidade pela introdução de sequências sintéticas aleatórias na região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo, em comparação com uma biblioteca natural baseada em genes humanos. No entanto, a biblioteca de anticorpos sintéticos tem uma proporção menor de fragmentos de anticorpos que podem funcionar normalmente devido à influência de mutações ou mudanças de estrutura em comparação com uma biblioteca humana natural. Nos últimos anos, as estratégias para o uso de bibliotecas de anticorpos para identificar novos antígenos alvo foram diversificadas e, entre elas, novos anticorpos específicos para o antígeno foram identificados por meio de seleção de células usando células primárias derivadas de tumor (Zhu X. et al., Mol. Cancer Res. 2010).
[014] Conforme descrito acima, os candidatos a anticorpos contínuos podem ser garantidos devido à possibilidade de várias estratégias de abordagem e os anticorpos podem ser produzidos por meio de clonagem, de modo que a exibição de fago é uma estratégia de abordagem eficiente. Os candidatos a medicamentos com anticorpos direcionados a vários tipos de câncer identificados usando essa tecnologia de exibição de fago estão em testes clínicos. A fim de identificar os anticorpos desejados para utilizar a tecnologia de exibição de fago, é necessário produzir uma biblioteca de genes de região variável de anticorpo e é indispensável construir uma variedade de bibliotecas.
[015] Embora várias bibliotecas de anticorpos estejam sendo desenvolvidas atualmente, ainda há uma demanda crescente por uma biblioteca de anticorpos que seja capaz de selecionar um anticorpo com alta especificidade e afinidade para vários antígenos porque tem alta estabilidade termodinâmica, permite alta expressão solúvel e tem alta diversidade.
[016] Contra este estado da técnica, como resultado de esforços intensivos, os presentes inventores descobriram que, ao extrair sequências comuns de cDNAs de raças asiáticas e caucasianas e usando uma biblioteca de anticorpos com base em uma combinação de estruturas específicas de VH e/ou VL com base na sequências, os anticorpos selecionados têm alta estabilidade termodinâmica e permitem alta expressão solúvel e dobramento reversível. Com base nesta constatação, a presente invenção foi concluída.
[017] Além disso, a biblioteca de anticorpos, de acordo com a presente invenção, contém várias CDRs que são racionalmente controladas e projetadas para ter alta especificidade e alta afinidade para todos os antígenos, exibindo assim excelente diversidade e uma proporção de sequência repetitiva inferior em comparação com uma biblioteca natural de anticorpos, e pode ser usada com utilidade para selecionar anticorpos candidatos apropriados para um antígeno alvo.
[018] As informações divulgadas nesta seção de Fundamentos são fornecidas apenas para uma melhor compreensão dos fundamentos da presente invenção e, portanto, podem não conter informações que formam a técnica anterior que já é óbvia dos especialistas na técnica.
Descrição Geral da Invenção
[019] Portanto, a presente invenção foi feita tendo em vista os problemas acima, e é um objetivo da presente invenção fornecer uma biblioteca de anticorpos para a triagem de anticorpos humanos que podem ser efetivamente usados para o tratamento ou diagnóstico de doenças, e um método para triar anticorpos usando a mesma.
[020] De acordo com um aspecto da presente invenção, os objetivos acima e outros podem ser alcançados pelo fornecimento de um conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, em que cada anticorpo ou fragmento do mesmo inclui um par de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável da cadeia, em que a região variável da cadeia pesada inclui uma região estrutural incluída em uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) e VH1-69 (SEQ ID NO: 11), e uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRH1), uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDRH2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDRH3), que são diferentes para cada região variável de cadeia pesada, e a região variável de cadeia leve inclui uma região estrutural incluída em uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16), Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21), Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) e Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31), e uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRL1), uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDRL2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDRL3), que são diferentes para cada região variável de cadeia leve.
[021] Os ácidos nucleicos que codificam anticorpos individuais ou fragmentos dos mesmos incluídos no conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos são incluídos individualmente em fagos ou células hospedeiras separadas, e os anticorpos ou fragmentos dos mesmos são preferencialmente expressos cada um na superfície dos fagos ou células hospedeiras, mas a presente invenção não se limita a estes.
[022] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, são fornecidos ácidos nucleicos que codificam o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Os ácidos nucleicos que codificam o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos estão preferencialmente contidos individualmente em fagos ou células hospedeiras separadas, mas a presente invenção não está limitada a estes.
[023] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de identificação de um anticorpo ou fragmento do mesmo específico para um antígeno, incluindo (a) o contato de um antígeno com o conjunto de anticorpos e (b) a seleção de um ou mais anticorpos ou anticorpos fragmentos que se ligam ao antígeno.
Descrição das Figuras
[024] A FIG. A Fig. 1 é um diagrama de esquemático que mostra um processo de construção de uma biblioteca de vetor, de acordo com a presente invenção.
[025] A FIG. 2 é um gráfico que mostra a distribuição de aminoácidos em diferentes posições da região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDRH3) da biblioteca construída em uma modalidade da presente invenção.
[026] A FIG. 3 é um gráfico que mostra o resultado da análise da razão da sequência repetitiva da sequência da biblioteca construída em uma modalidade da presente invenção.
[027] A FIG. 4 mostra o resultado da análise da distribuição do comprimento da região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDRH3) da biblioteca construída em uma modalidade da presente invenção.
Melhor Modo de Realizar a Invenção
[028] Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que os apreciados pelos especialistas na técnica aos quais a presente divulgação se refere. Em geral, a nomenclatura aqui utilizada é bem conhecida na técnica e é normalmente usada.
[029] Na presente invenção, verificou-se que uma biblioteca de anticorpos com alta diversidade e estabilidade pode ser construída ao construir uma biblioteca de anticorpos usando um códon trímero a fim de garantir clones VH e VL com alta estabilidade da região estrutural, minimizar a modificação pós-tradução (PTM) e sintetizam precisamente apenas aminoácidos que minimizam a imunogenicidade.
[030] Ou seja, em uma modalidade da presente invenção, da região variável humana de cDNA asiático e caucasiano, genes VH1 e VH3 para a região variável de cadeia pesada e genes Vκ1, Vκ3 e Vλ1 para a região variável de cadeia leve foram obtidos, e as combinações de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) incluídas na região variável do anticorpo humano foram analisadas e, em particular, a região determinante da complementaridade da cadeia pesada 3 (CDRH3) foi analisada para cada um de 9 a 14 comprimentos. As combinações de aminoácidos da região variável asiática e caucasiana obtidas após a análise mostraram similaridade sem diferença significativa, e a média das combinações asiáticas e caucasianas seguras foi calculada e então refletida no projeto do iniciador da biblioteca. No caso da região determinante de complementaridade 2 da cadeia pesada (CDRH2), a possibilidade de ocorrência de sítios de N-glicosilação foi de 5% devido aos aminoácidos NXS/T na combinação analisada e a probabilidade de ocorrência de N-sítios de glicosilação foram ajustados para 1% ou menos, a fim de evitar que o PTM iniba a capacidade de ligação do anticorpo e estabilidade no futuro. Através do método acima, os iniciadores para a construção de uma biblioteca com alta diversidade foram projetados. Como resultado da construção de uma biblioteca de Fab com base nos iniciadores, foi obtida uma biblioteca com uma diversidade de 1,54 x 1011 (FIG. 1).
[031] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, em que cada anticorpo ou fragmento do mesmo inclui um par de uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada inclui uma região estrutural incluída em uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) e VH1-69 (SEQ ID NO: 11), e uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRH1), uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDRH2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDRH3), que são diferentes para cada região variável de cadeia pesada, e a região variável de cadeia leve inclui uma região estrutural incluída em uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16), Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21), Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) e Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31), e uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRL1), uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDRL2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDRL3), que são diferentes para cada região variável de cadeia leve.
[032] Preferencialmente, o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção inclui:
[033] uma região estrutural incluída em um par de regiões variáveis de cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3- 15(SEQ ID NO: 1)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-15(SEQ ID NO:
1)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3- 23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH1- 69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26) e VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), e
[034] uma combinação de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 diferente para cada região variável de cadeia pesada e uma combinação de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 diferente para cada região variável de cadeia leve.
[035] Além disso, no conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção,
[036] a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui FR1 (SEQ ID NO: 2), FR2 (SEQ ID NO: 3), FR3 (SEQ ID NO: 4) e FR4 (SEQ ID NO: 5),
[037] a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui FR1 (SEQ ID NO: 7), FR2 (SEQ ID NO: 8), FR3 (SEQ ID NO: 9) e FR4 (SEQ ID NO: 10),
[038] a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui FR1 (SEQ ID NO: 12), FR2 (SEQ ID NO: 13), FR3 (SEQ ID NO: 14) e FR4 (SEQ ID NO: 15),
[039] as regiões estruturais na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui FR1 (SEQ ID NO: 17), FR2 (SEQ ID NO: 18), FR3 (SEQ ID NO: 19) e FR4 (SEQ ID NO: 20),
[040] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui FR1 (SEQ ID NO: 22), FR2 (SEQ ID NO: 23), FR3 (SEQ ID NO: 24) e FR4 (SEQ ID NO: 25),
[041] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) inclui FR1 (SEQ ID NO: 27), FR2 (SEQ ID NO: 28), FR3 (SEQ ID NO: 29), e FR4 (SEQ ID NO: 30), e
[042] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui FR1 (SEQ ID NO: 32), FR2 (SEQ ID NO: 33), FR3 (SEQ ID NO: 34) e FR4 (SEQ ID NO: 35).
[043] O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser caracterizado pelo fato de que a região determinante de complementaridade (CDR) incluída em cada região variável do par da região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve é projetada para prevenir a ocorrência de modificação pós- tradicional por meio da alteração de um aminoácido que tem o potencial de sofrer modificação pós-tradução (PTM).
[044] Em particular, em relação às sequências CDR incluídas no conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção,
[045] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 3,
[046] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 4,
[047] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 3,
[048] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 4,
[049] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 5,
[050] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 6,
[051] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2)
na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 9 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 inclui a faixa da Tabela 7,
[052] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 10 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 8,
[053] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 11 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 inclui a faixa da Tabela 9,
[054] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 12 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 10,
[055] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 13 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 11,
[056] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 14 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 12,
[057] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 13,
[058] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 14,
[059] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 15,
[060] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 16,
[061] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 17,
[062] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 18,
[063] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 19,
[064] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 17,
[065] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 18,
[066] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 20,
[067] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 21, e
[068] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 22.
[069] Em particular, o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção, tem uma ou mais características selecionadas de i) a iv) abaixo:
[070] i) redundância (porcentagem de sequências repetitivas) de 10% ou menos;
[071] ii) valor p da composição de CDR> 0,05;
[072] iii) estabilidade térmica de 70ºC ou superior; e
[073] iv) diversidade (tamanho da biblioteca) de 107 ou mais.
[074] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" significa uma imunoglobulina que é selecionada do grupo que consiste em IgA, IgE, IgM, IgD, IgY e IgG e é capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo. Consiste em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, e cada cadeia inclui um domínio variável com uma sequência de aminoácidos variável e um domínio constante com uma sequência de aminoácidos constante. Um sítio de ligação ao antígeno está localizado no final da estrutura tridimensional do domínio variável, e este sítio é formado pela combinação de três regiões determinantes de complementaridade presentes em cada uma das cadeias leve e pesada. A região determinante de complementaridade é uma parte com variabilidade particularmente elevada em uma sequência de aminoácidos entre os domínios variáveis, e anticorpos específicos para vários antígenos podem ser encontrados devido a esta alta variabilidade. O escopo da presente invenção inclui não apenas uma forma de anticorpo completa, mas também um fragmento de ligação ao antígeno da molécula de anticorpo.
[075] O termo “anticorpo completo” se refere a uma estrutura tendo duas cadeias leves completas e duas cadeias pesadas completas, em que cada cadeia leve está ligada à cadeia pesada correspondente por uma ligação dissulfeto. O domínio constante de cadeia pesada tem tipos gama (γ), mu (µ), alfa (α), delta (δ) e epsilon (ε), e é classificado em gama 1 (γ1), gama 2 (γ2), gama 3 (γ3), gama 4 (γ4), alfa 1 (α1) e alfa 2 (α2). O domínio constante da cadeia leve possui os tipos capa (κ) e lambda (λ).
[076] O termo “fragmento de ligação ao antígeno”, de acordo com a presente invenção se refere a um fragmento de um anticorpo que tem a capacidade de ligação ao antígeno e inclui Fab, Fab', F(ab')2, scFv (scFv)2, scFv-Fc, Fv e semelhantes. No presente relatório descritivo, o termo "fragmento de ligação ao antígeno" é usado indistintamente com "fragmento de anticorpo" e tem o mesmo significado.
[077] Entre os fragmentos de anticorpo, Fab se refere a uma estrutura incluindo um domínio variável de cada uma das cadeias pesada e leve, o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada, cada um tendo, cada um, um sítio de ligação ao antígeno. Fab’ é diferente de Fab na medida em que inclui ainda uma região dobradiça incluindo pelo menos um resíduo de cisteína em um C- terminal do domínio CH1 da cadeia pesada. F(ab’)2 é criado por uma ligação dissulfeto entre resíduos de cisteína na região dobradiça de Fab'. Fv é o fragmento de anticorpo mínimo tendo apenas um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve e tecnologia recombinante para a produção de Fv é divulgado nas Publicações Internacionais de PCT tais como WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 e WO 88/09344. Um Fv de duas cadeias é um fragmento em que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve são ligados por uma ligação não covalente, e um Fv de cadeia simples (scFv) é um fragmento em que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio da cadeia leve são geralmente ligados por uma ligação covalente através de um peptídeo ligante entre eles, ou são diretamente ligados ao C-terminal, formando uma estrutura em forma de dímero, como ao Fv de duas cadeias. Tais fragmentos de anticorpos podem ser obtidos utilizando proteinases (por exemplo, Fab pode ser obtido por clivagem por restrição do anticorpo completo com papaína, e o fragmento F(ab)2 pode ser obtido por clivagem por restrição do anticorpo completo com pepsina), e pode ser preparado por técnicas de recombinação genética.
[078] Tal como aqui utilizado, o termo "ScFv" (Fv de cadeia única, anticorpo de fragmento de cadeia única ou fragmento de anticorpo) se refere a um anticorpo no qual os domínios variáveis das cadeias leve e pesada estão ligados. Em alguns casos, um ScFv pode incluir um ligante (sítio de ligação) que consiste em uma cadeia de peptídeo com cerca de 15 aminoácidos ligados e, neste caso, ScFv pode ter uma estrutura incluindo um domínio variável de cadeia leve, um sítio de ligação e um domínio variável de cadeia pesada, ou incluindo um domínio variável de cadeia pesada, um sítio de ligação e um domínio variável de cadeia leve, e tem especificidade de antígeno igual ou semelhante à do anticorpo original.
[079] Tal como aqui utilizado, o termo "biblioteca de anticorpos" se refere a uma combinação de vários anticorpos com sequências diferentes e significa um conjunto de uma combinação de região variável de cadeia pesada específica e pares de região variável de cadeia leve na presente invenção.
[080] Os ácidos nucleicos que codificam anticorpos individuais ou fragmentos dos mesmos incluídos na biblioteca de anticorpos estão individualmente contidos em fagos ou células hospedeiras separadas, e os anticorpos ou fragmentos dos mesmos são preferencialmente expressos (exibidos) nas superfícies dos fagos ou células hospedeiras, mas a presente invenção não se limita a estes.
[081] Exemplos de células hospedeiras utilizadas para a expressão de superfície (exibição) dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção, incluem leveduras, tais como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e células B de humanos e camundongos, mas não estão limitados a estas.
[082] A biblioteca, de acordo com a presente invenção, pode ser referida como uma "biblioteca Fab" ou "biblioteca scFv" dependendo do tipo de anticorpo ou fragmento do mesmo que é expresso na superfície do fago ou célula hospedeira.
[083] Além disso, como aqui utilizado, o termo "biblioteca de anticorpos" significa não apenas uma combinação de pares de região variável de cadeia pesada específica e região variável de cadeia leve no nível da proteína, mas também combinações no nível do gene que codificam cada região variável de cadeia pesada específica e par de região variável de cadeia leve.
[084] A fim de separar anticorpos específicos para um antígeno da biblioteca de anticorpos, é necessária uma diversidade muito alta e uma biblioteca que consiste em diferentes clones de anticorpos é construída e usada. Os genes de anticorpos que constituem essa biblioteca de anticorpos podem ser clonados em, por exemplo, um vetor fagemídeo e transformados em um transformante (célula hospedeira como E. coli).
[085] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" pode ser usado indistintamente com "gene" ou "nucleotídeo" e pode ser, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em DNA natural/sintético, DNA genômico, RNA natural/sintético, cDNA e cRNA, mas não está limitado aos mesmos.
[086] Tal como aqui utilizado, o termo vetor "fagemídeo" se refere a um DNA de plasmídeo que é usado para exibição em fago e tem uma origem de replicação de fago e geralmente tem um gene de resistência a antibióticos como um marcador de seleção. O vetor fagemídeo usado para a exibição de fago inclui o gene gIII do fago M13 ou uma porção do mesmo, e o gene ScFv é ligado à extremidade 5'do gene gIII e é expresso através de um transformante.
[087] Conforme usado neste documento, o termo "fago helper" se refere a um fago que fornece a informação genética necessária para que o fagemídeo seja empacotado em partículas de fago. Uma vez que apenas gIII dos genes do fago ou uma porção dos mesmos está presente no fagemídeo, as células hospedeiras (transformantes) transformadas com o fagemídeo são infectadas com um fago helper para assim fornecer os genes do fago restantes. Existem tipos, como M13K07 ou VCSM13, e muitos dos mesmos incluem genes de resistência a antibióticos, como canamicina, de modo que os transformantes infectados com o fago auxiliar podem ser selecionados. Além disso, como o sinal de empacotamento é defeituoso, os genes dos fagemídeos, ao invés dos genes do fago helper, são seletivamente empacotados em partículas de fago.
[088] Tal como aqui utilizado, o termo "sequência de sinal" se refere a uma sequência de base ou uma sequência de aminoácidos correspondente a ela, que está localizada na extremidade 5’ de um gene e funciona como um sinal necessário quando a proteína codificada do gene é secretada para fora.
[089] Como aqui usado, o termo “exibição de fagos” é uma técnica para exibir um polipeptídeo mutante como uma proteína de fusão com pelo menos uma parte de uma proteína de revestimento, por exemplo, na superfície da partícula de um fago, por exemplo, um fago fibroso. A utilidade da apresentação em fagos é classificar rapidamente e eficientemente sequências que se ligam a antígenos alvo com alta afinidade em grandes bibliotecas de mutantes de proteínas aleatórias. A apresentação de peptídeos e bibliotecas de proteínas em fagos foi utilizada para triar milhões de polipeptídeos de modo a identificar polipeptídeos com propriedades de ligação específicas.
[090] A tecnologia de exibição de fagos oferece uma ferramenta poderosa para gerar e triar novas proteínas que se ligam a ligantes específicos (por exemplo, antígenos). Utilizando tecnologia de apresentação em fagos, podem ser produzidas grandes bibliotecas de mutantes de proteína e as sequências que se ligam com elevada afinidade aos antígenos alvo podem ser rapidamente classificadas. Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo mutante é fundido com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de revestimento viral, por exemplo, uma proteína de gene III ou gene VIII. Foi desenvolvido um sistema de apresentação fago monofásico, em que uma sequência de ácido nucleico codificando proteína ou polipeptídeo com uma sequência de ácido nucleico codificando uma parte da proteína do gene III. No sistema de apresentação monofásico, um gene fundido é expresso a um nível baixo, uma proteína do gene III de tipo selvagem também é expressa, e assim a infecciosidade de partículas é mantida.
[091] É importante demonstrar a expressão de peptídeos na superfície do fago fibroso e a expressão de fragmentos de anticorpos funcionais no citoplasma periférico de E. coli para o desenvolvimento de bibliotecas de apresentação em fagos de anticorpos. As bibliotecas de polipeptídeos de ligação ao anticorpo ou antígenos preparadas através de um número de métodos, por exemplo, métodos de modificação de um único gene por inserção de uma sequência de DNA aleatória ou clonagem de uma sequência genética relacionada. As bibliotecas podem ser triadas quanto à expressão de proteínas de ligação a antígeno ou anticorpo com características desejadas.
[092] A tecnologia de exibição de fagos apresenta várias vantagens sobre os hibridomas convencionais e métodos recombinantes para a produção de anticorpos com características desejadas. Esta técnica fornece a produção de grandes bibliotecas de anticorpos com uma variedade de sequências dentro de um curto período de tempo sem o uso de animais. A produção de hibridomas e a produção de anticorpos humanizados podem requerer um tempo de produção de vários meses. Adicionalmente, uma vez que não é necessária imunidade,
as bibliotecas de anticorpos em fagos são capazes de produzir anticorpos contra antígenos que são tóxicos ou têm baixa antigenicidade. As bibliotecas de anticorpos de fagos podem também ser utilizadas para produzir e identificar novos anticorpos terapêuticos.
[093] Podem ser utilizadas técnicas para gerar anticorpos humanos a partir de humanos imunizados, não imunizados, sequências da linhagem germinativa ou repertórios de Ig de células B não sensibilizadas utilizando bibliotecas de apresentação em fagos. Podem ser utilizados vários tecidos linfáticos para produzir bibliotecas de ligação ao antígeno não sensibilizadas ou não imunogênicas.
[094] Técnicas para identificar e separar anticorpos de alta afinidade de bibliotecas de exibição de fagos são importantes para a separação de novos anticorpos terapêuticos. A separação de anticorpos de alta afinidade a partir das bibliotecas depende do tamanho das bibliotecas, da eficiência de produção em células bacterianas, e da variedade de bibliotecas. O tamanho das bibliotecas é reduzido pelo dobramento inapropriado da proteína de ligação ao anticorpo ou antígeno e produção ineficiente devido à presença do códon de parada. A expressão em células bacterianas pode ser inibida quando o domínio de ligação ao anticorpo ou antígeno não está apropriadamente dobrado. A expressão pode ser melhorada alterando alternadamente resíduos na superfície das interfaces variável/constante ou dos resíduos CDR selecionados. A sequência da região estrutural é um elemento para fornecer dobragem apropriada quando se produzem bibliotecas de fagos de anticorpos em células bacterianas.
[095] É importante gerar várias bibliotecas de proteínas de ligação a antígenos ou anticorpos na separação de anticorpos de alta afinidade. As regiões CDR3 geralmente demonstram participarem na ligação ao antígeno. Uma vez que a região CDR3 em uma cadeia pesada varia consideravelmente em termos de tamanho, sequência e morfologia estrutural/dimensional, várias bibliotecas podem ser preparadas usando a mesma.
[096] Além disso, a diversidade pode ser criada pela aleatorização das regiões CDR de cadeias pesadas e leves variáveis usando todos os 20 aminoácidos em cada posição. O uso de todos os 20 aminoácidos resulta em sequências de anticorpos com grande diversidade e um aumento na chance de identificar novos anticorpos.
[097] Como usado aqui, o termo “domínio variável de anticorpo” se refere às regiões de cadeia leve e pesada de uma molécula de anticorpo incluindo as sequências de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade (CDR; ou seja, CDR1, CDR2 e CDR3) e uma região estrutural (FR). VH se refere a um domínio variável da cadeia pesada. VL se refere a um domínio variável da cadeia leve.
[098] O termo “região determinante de complementaridade” (CDR; ou seja, CDR1, CDR2 e CDR3) se refere a um resíduo de aminoácido do domínio variável do anticorpo, que é necessário para a ligação ao antígeno. Cada domínio variável possui tipicamente três regiões CDR , identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3.
[099] O termo “região estrutural” (FR) se refere a um resíduo de domínio variável diferente de um resíduo de CDR. Cada domínio variável geralmente tem quatro FRs, identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4.
[0100] Preferencialmente, o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção inclui:
[0101] uma região estrutural incluída em um par de regiões variáveis de cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3- 15(SEQ ID NO: 1)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3- 23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH1- 69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26) e VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31), e uma combinação de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 diferente para cada região variável de cadeia pesada e uma combinação de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 diferente para cada região variável de cadeia leve.
[0102] Na presente invenção, a região estrutural na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui FR1 (SEQ ID NO: 2), FR2 (SEQ ID NO: 3), FR3 (SEQ ID NO: 4) e FR4 (SEQ ID NO: 5),
[0103] a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui FR1 (SEQ ID NO: 7), FR2 (SEQ ID NO: 8), FR3 (SEQ ID NO: 9) e FR4 (SEQ ID NO: 10),
[0104] a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui FR1 (SEQ ID NO: 12), FR2 (SEQ ID NO: 13), FR3 (SEQ ID NO: 14) e FR4 (SEQ ID NO: 15),
[0105] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui FR1 (SEQ ID NO: 17), FR2 (SEQ ID NO: 18), FR3 (SEQ ID NO: 19) e FR4 (SEQ ID NO: 20),
[0106] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui FR1 (SEQ ID NO: 22), FR2 (SEQ ID NO: 23), FR3 (SEQ ID NO: 24) e FR4 (SEQ ID NO: 25),
[0107] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) inclui FR1 (SEQ ID NO: 27), FR2 (SEQ ID NO: 28), FR3 (SEQ ID NO: 29), e FR4 (SEQ ID NO: 30), e
[0108] a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui FR1 (SEQ ID NO: 32), FR2 (SEQ ID NO: 33), FR3 (SEQ ID NO: 34) e FR4 (SEQ ID NO: 35).
[0109] As sequências da região variável da cadeia pesada, a região variável da cadeia leve e as regiões estruturais dentro de cada região variável da presente invenção são resumidas como segue: Tabela 1
[0110] Sequências de aminoácidos de regiões variáveis e regiões estruturais
Informação de sequência SEQ ID NO.
VH3-15 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-X-WVRQAPGKGLEWV-X- 1 YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR-X-
WGQGTLVTVSS FR1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG 2 FR2 WVRQAPGKGLEWV 3 FR3 YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR 4 FR4 WGQGTLVTVSS 5 VH3-23 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-X-WVRQAPGKGLEWV-X- 6 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-X-
WGQGTLVTVSS FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG 7 FR2 WVRQAPGKGLEWV 8 FR3 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 9 FR4 WGQGTLVTVSS 10 VH1-69 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG-X-WVRQAPGQGLEWM-X- 11 YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR-X-
WGQGTLVTVSS FR1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG 12
FR2 WVRQAPGQGLEWM 13
FR3 YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR 14
FR4 WGQGTLVTVSS 15
Vκ1-39 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ-X-WYQQKPGKAPKLLIY-X- 16 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK
FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 17
FR2 WYQQKPGKAPKLLIY 18
FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ 19
FR4 TFGQGTKVEIK 20
Vκ3-20 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ-X-WYQQKPGQAPRLLI-X- 21 IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK
FR1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ 22
FR2 WYQQKPGQAPRLLI 23
FR3 IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ 24
FR4 TFGQGTKVEIK 25
Vκ3-20-2 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ-X-WYQQKPGQAPRLLI-X- 26 IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK
FR1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ 27 FR2 WYQQKPGQAPRLLI 28 FR3 IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ 29 FR4 TFGQGTKVEIK 30 Vλ1-51 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG-X-WYQQLPGTAPKLLI-X- 31 RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC-X-FGGGTKLTVL FR1 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG 32 FR2 WYQQLPGTAPKLLI 33 FR3 RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC 34 FR4 FGGGTKLTVL 35 Tabela 2
[0111] Sequências de ácido nucleico que codificam regiões variáveis e regiões estruturais Informação de sequência SEQ ID NO.
VH3-15 Gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgaaaccaggcggcagcctt 36 cgtttaagctgtgcagcatctggt-N- tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg-N- tacgcagcaccggtcaaaggtcgttttacgattagtcgcgatgattcgaaaaac actctttacctgcagatgaattctctgaaaacagaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt-N- tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg
FR1 gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgaaaccaggcggcagcctt 37 cgtttaagctgtgcagcatctggt
FR2 tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg 38
FR3 tacgcagcaccggtcaaaggtcgttttacgattagtcgcgatgattcgaaaaac 39 actctttacctgcagatgaattctctgaaaacagaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt
FR4 tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg 40
VH3-23 Gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgcagccaggcggcagcctt 41 cgtttaagctgtgcagcatctggt-N- tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg-N- tatgcggatagcgttaagggtcgttttaccatcagtcgcgacaactccaaaaat accctgtacttacaaatgaatagcttacgtgcggaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt-N- tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg
FR1 gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgcagccaggcggcagcctt 42 cgtttaagctgtgcagcatctggt
FR2 tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg 43
FR3 tatgcggatagcgttaagggtcgttttaccatcagtcgcgacaactccaaaaat 44 accctgtacttacaaatgaatagcttacgtgcggaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt
FR4 tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg 45
VH1-69 Caggtccaactggttcagtctggtgcggaagttaaaaagccaggaagttcagtt 46 aaagtcagttgtaaagcgtctggt-N- tgggttcgtcaagcaccaggacagggcttagaatggatg-N- tatgcacagaaattccaaggtcgtgttacgattacggccgatgagtccactagt accgcctatatggaactctccagccttcgctctgaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt-N-tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg
FR1 caggtccaactggttcagtctggtgcggaagttaaaaagccaggaagttcagtt 47 aaagtcagttgtaaagcgtctggt
FR2 tgggttcgtcaagcaccaggacagggcttagaatggatg 48
FR3 tatgcacagaaattccaaggtcgtgttacgattacggccgatgagtccactagt 49 accgcctatatggaactctccagccttcgctctgaagataccgcagtgtattac tgtgcacgt
FR4 tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg 50
Vκ1-39 Gacatccaaatgacacagagcccttcttccttatccgcgtcggtaggagatcgc 51 gttacaatcacctgccgtgcgagtcag-N- tggtatcagcagaaaccagggaaagcaccgaagctcctgatttat-N- ggcgttccgagccgttttagtggctcggggtccggcaccgacttcaccctgact atctcttcgctgcagcctgaggattttgctacctattactgtcaacag-N- acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa
FR1 gacatccaaatgacacagagcccttcttccttatccgcgtcggtaggagatcgc 52 gttacaatcacctgccgtgcgagtcag
FR2 tggtatcagcagaaaccagggaaagcaccgaagctcctgatttat 53
FR3 ggcgttccgagccgttttagtggctcggggtccggcaccgacttcaccctgact 54 atctcttcgctgcagcctgaggattttgctacctattactgtcaacag
FR4 acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa 55
Vκ3-20 Gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgt 56 gctacccttagctgccgtgcgagtcaa-N- tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc-N- attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatc tctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag-N- acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa
FR1 gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgt 57 gctacccttagctgccgtgcgagtcaa
FR2 tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc 58
FR3 attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatc 59 tctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag
FR4 acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa 60
Vκ3-20- Gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgt 61 2 gctacccttagctgccgtgcgagtcaa-N- tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc-N- attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatc tctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag-N- acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa
FR1 gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgt 62 gctacccttagctgccgtgcgagtcaa
FR2 tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc 63
FR3 attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatc 64 tctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag
FR4 acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa 65
Vλ1-51 Caatcagttctgacccaacccccctctgtatccgcggcacccggtcaaaaggtg 66 accatctcgtgctctggc-N- tggtatcaacagcttccaggtacagcaccgaagttattgatt-N- cgtccttccggtattccggatcgtttttcggggagtaaaagtggcacctcagca acacttggtattaccggactgcagaccggcgacgaagccgattactactgc-N- ttcggtggtggcaccaaacttacggtcctg
FR1 67 caatcagttctgacccaacccccctctgtatccgcggcacccggtcaaaaggtg accatctcgtgctctggc FR2 tggtatcaacagcttccaggtacagcaccgaagttattgatt 68 FR3 cgtccttccggtattccggatcgtttttcggggagtaaaagtggcacctcagca 69 acacttggtattaccggactgcagaccggcgacgaagccgattactactgc FR4 ttcggtggtggcaccaaacttacggtcctg 70
[0112] Na presente invenção, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser caracterizado em que a região determinante de complementaridade (CDR) incluída em cada região variável do par da região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve é projetada para prevenir a ocorrência de modificação pós-tradicional por meio da alteração de um aminoácido que tem o potencial de sofrer modificação pós- tradução (PTM).
[0113] Na presente invenção, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 3,
[0114] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 4,
[0115] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 3,
[0116] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 4,
[0117] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 5,
[0118] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 6,
[0119] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 9 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 inclui a faixa da Tabela 7,
[0120] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 10 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 8,
[0121] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69
(SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 11 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 inclui a faixa da Tabela 9,
[0122] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 12 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 10,
[0123] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 13 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 11,
[0124] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 14 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 12,
[0125] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 13,
[0126] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 14,
[0127] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 15,
[0128] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 16,
[0129] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 17,
[0130] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 18,
[0131] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 19,
[0132] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 17,
[0133] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 18,
[0134] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 20,
[0135] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 21, e
[0136] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 22, mas não está limitado a esta.
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Tabela 9
Tabela 10
Tabela 11
Tabela 12
Tabela 13
Tabela 14
Tabela 15
Tabela 16
Tabela 17
Tabela 18
Tabela 19
Tabela 20
Tabela 21
Tabela 22
[0137] Na presente invenção, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 23,
[0138] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) inclui o intervalo da Tabela 24,
[0139] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1)
na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 23,
[0140] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) inclui o intervalo da Tabela 24,
[0141] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 25,
[0142] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) inclui o intervalo da Tabela 26,
[0143] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 9 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 27,
[0144] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 10 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 inclui a faixa da Tabela 28,
[0145] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 11 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 29,
[0146] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 12 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 30,
[0147] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 13 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 31,
[0148] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 14 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 inclui a faixa da Tabela 32,
[0149] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 33,
[0150] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 34,
[0151] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) inclui o intervalo da Tabela 35,
[0152] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 36,
[0153] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 37,
[0154] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) inclui o intervalo da Tabela 38,
[0155] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 39,
[0156] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 37,
[0157] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) inclui o intervalo da Tabela 38,
[0158] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 40,
[0159] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 41, e
[0160] a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) inclui o intervalo da Tabela 42, mas não está limitado a esta.
Tabela 23
Tabela 24
Tabela 25
Tabela 26
Tabela 27
Tabela 28
Tabela 29
Tabela 30
Tabela 31
Tabela 32
Tabela 33
Tabela 34
Tabela 35
Tabela 36
Tabela 37
Tabela 38
Tabela 39
Tabela 40
Tabela 41
Tabela 42
[0161] Na presente invenção, o fragmento de anticorpo pode ter uma ou mais formas selecionadas do grupo que consiste em Fab, F (ab’)2, Fab', Fv e scFv, mas não está limitado a eles.
[0162] O anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com a presente invenção, pode ter uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em: i) redundância (porcentagem de sequências repetitivas) de 10% ou menos; ii) valor p da composição de CDR> 0,05; iii) estabilidade térmica de 70ºC ou superior; e iv) diversidade (tamanho da biblioteca) de 107 ou mais.
[0163] Em outro aspecto, a presente divulgação é direcionada para ácidos nucleicos que codificam o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos.
[0164] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de identificação de um anticorpo ou fragmento do mesmo específico para um antígeno incluindo (a) o contato de um antígeno com o conjunto de anticorpos e (b) a seleção de um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam ao antígeno.
[0165] Na presente invenção, o conjunto de anticorpos pode ser expresso na superfície do fago incluído em um transformante introduzido com o ácido nucleico que codifica o conjunto de anticorpos, mas não está limitado aos mesmos.
[0166] Na presente invenção, o método de identificação pode incluir a cultura do transformante e do fago da biblioteca, ligação do anticorpo expresso na superfície do fago a um antígeno e triagem e seleção de um transformante que expressa um anticorpo desejado. A triagem e seleção podem ser realizadas usando várias técnicas conhecidas na técnica.
[0167] Por exemplo, um anticorpo que se liga a um antígeno específico pode ser produzido por isolamento da biblioteca usando um método de panning. A seleção inclui fagos de ligação a um antígeno alvo, remoção de fagos não ligados, recuperação de fagos ligados, infecção de células hospedeiras com os fagos para amplificar o número de fagos e repetição deste processo 2 a 4 vezes.
Exemplo
[0168] A seguir, a presente divulgação será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. No entanto, é óbvio para os especialistas na técnica que estes exemplos são fornecidos apenas para ilustração da presente divulgação e não devem ser interpretados como limitativos do escopo da presente divulgação.
[0169] Exemplo 1) Aquisição de cDNAs de região variável humana asiática e caucasiana.
[0170] A fim de analisar a combinação de aminoácidos de CDRs de região variável de anticorpos humanos asiáticos e caucasianos, o RNA mensageiro humano asiático foi obtido pela diferenciação de células B de PBMCs por meio da doação de sangue (antes da implementação do IRB) por um pesquisador no laboratório. O RNA mensageiro caucasiano aqui utilizado foi o RNA total do baço humano (CAT No. 636525, Lote No. 1107171A) produzido por Clontech Laboratories Inc. Os RNAs mensageiros asiáticos e caucasianos obtidos foram convertidos em cDNAs usando um
Sistema de Transcrição Reversa ImProm-II (Promega, CAT No. A3802). A fim de proteger os genes da região variável humana a partir do cDNA obtido, cDNAs asiáticos e caucasianos foram usados como modelos, um iniciador direto (Tabela 43: SEQ ID NO: 71) e um iniciador reverso (Tabela 43: SEQ ID NO: 72) foram adicionados a um tipo VH1, um iniciador direto (Tabela 43: SEQ ID NO: 73) e um iniciador reverso (Tabela 43: SEQ ID NO: 72) foram adicionados a um tipo VH3, um iniciador direto (Tabela 43: SEQ ID NO: 74) e um iniciador reverso (Tabela 43: SEQ ID NO: 75) foram adicionados a um tipo Vk1, um iniciador direto (Tabela 43: SEQ ID NO: 76) e um iniciador reverso (Tabela 43: SEQ ID NO: 75) foram adicionados a um tipo Vk1, um iniciador direto (Tabela 43: SEQ ID NO: 77) e um iniciador reverso (Tabela 43: SEQ ID NO: 78 foram adicionados a um tipo Vλ1 e, em seguida, a PCR foi realizada para cada mistura de cDNA e iniciadores usando polimerase de mistura de platina (Invitrogen, CAT No. 11306). As condições de PCR foram as seguintes: exposição a 94ºC por 3 minutos, seguida por 25 repetições de um ciclo, incluindo exposição a 94ºC por 1 minuto, exposição a 55ºC por 1 minuto e exposição a 72ºC por 2 minutos e, em seguida, reação a 72ºC durante 10 minutos. Os genes amplificados foram identificados como bandas de DNA com os tamanhos esperados em gel de agarose a 1% e foram isolados usando um kit de extração de gel (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT. No. 28,706).
Tabela 43 Nome Sequência SEQ ID NO.
VH1 Fo CARGTGCAGCTKGTGCAGTCTGG 71 JH TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 72 Re_cDNA
VH3 Fo GARGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 73 Vk1 Fo GACATCCAGATGACCCAGTCTCC 74 Jk ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC 75 Re_cDNA Vk3 Fo GAAATWGTGWTGACRCAGTCTCC 76 Vλ Fo CAGTCTGTGYTGACKCAGCCGCC 77 Jλ 78
ACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC Re_cDNA
[0171] Exemplo 2) Construção de bibliotecas de regiões variáveis de anticorpos humanos asiáticos e caucasianos para sequenciamento de alto rendimento.
[0172] Para realizar o sequenciamento de alto rendimento de cDNAs asiáticos e caucasianos obtidos no Exemplo 1, a PCR foi realizada para conectar códigos de barras para identificar os respectivos tipos. Em primeiro lugar, em relação ao cDNA asiático, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 79) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 89) foram adicionados ao cDNA de VH1 asiático como um modelo, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 80) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 89) foram adicionados a um tipo VH3, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 81) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 90) foram adicionados a um tipo Vk1, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 81) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 90) foram adicionados a um tipo Vk3, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 83) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 91) foram adicionados a um tipo Vλ1 e, em seguida, a PCR foi realizada para cada mistura de cDNA e iniciadores usando uma mistura estrela primária (Takara, CAT No. R040B). As condições de PCR foram as seguintes: exposição a 94ºC por 2 minutos, seguida por 10 repetições de um ciclo, incluindo exposição a 94ºC por 15 minutos, exposição a 55ºC por 15 minutos e exposição a 72ºC por 30 minutos e reação a 72ºC durante 5 minutos.
Os genes amplificados foram identificados como bandas de DNA de tamanhos esperados em gel de agarose a 1%, e foram isolados individualmente usando um kit de extração de gel (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT.
No. 28,706). Em relação ao cDNA caucasiano, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 84) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 89) foram adicionados ao cDNA de VH1 caucasiano como um modelo, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 85) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 89) foram adicionados a um tipo VH3, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 86) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 90) foram adicionados a um tipo Vk1, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 87) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 90) foram adicionados a um tipo Vk1, um iniciador direto (Tabela 44: SEQ ID NO: 88) e um iniciador reverso (Tabela 44: SEQ ID NO: 91) foram adicionados a um tipo Vλ1 e, em seguida, a PCR foi realizada para cada mistura de cDNA e iniciadores usando uma mistura estrela primária (Takara, CAT No.
R040B). As condições de PCR foram as seguintes: exposição a 94ºC por 2 minutos, seguida por 10 repetições de um ciclo, incluindo exposição a 94ºC por 15 minutos, exposição a 55ºC por 15 minutos e exposição a 72ºC por 30 minutos, e depois reação a 72ºC durante 5 minutos.
Os genes amplificados foram identificados como bandas de DNA dos tamanhos esperados em gel de agarose a 1% e foram isolados usando um kit de extração de gel (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT.
No. 28,706).
[0173] Os genes asiáticos e caucasianos obtidos foram sequenciados nos números mostrados na Tabela 45 usando um método de sequenciamento 454 (GS FLX Titanium, Roche) por Macrogen (Guro-gu, Seul, Coreia). A proporção da composição dos aminoácidos CDR das sequências para CDR1, CDR2 e CDR3 com base nos aminoácidos mostrados na Tabela 46 foi analisada.
Tabela 44 Nome Sequência SEQ ID NO.
VH1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGAGTGCGTCARGTGCAGCT 79 Asiático KGTGCAGTCTGG VH3 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGAGTGCGTCARGTGCAGCT 80 Asiático KGTGCAGTCTGG Vk1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGCTCGACAGARGTGCAGCT 81 Asiático GGTGGAGTCTGG Vk3 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGACGCACTCGACATCCAGAT 82 Asiático GACCCAGTCTCC Vλ1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGCACTGTAGGAAATWGTGWT 83 Asiático GACRCAGTCTCC VH1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCAGACACGCAGTCTGTGYT 84 Caucasiano GACKCAGCCGCC VH3 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATATCGCGAGCARGTGCAGCT 85 Caucasiano KGTGCAGTCTGG Vk1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGTGTCTCTAGARGTGCAGCT 86 Caucasiano GGTGGAGTCTGG Vk3 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCGCGTGTCGACATCCAGAT 87 Caucasiano GACCCAGTCTCC Vλ1 Fo CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGTATCAGCGAAATWGTGWT 88 Caucasiano GACRCAGTCTCC JH Re CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGT 89
GCC Jk Re CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGACGTTTGATTTCCACCTTGGT 90
CCC Jλ Re CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGACCTAGGACGGTGACCTTGGT 91
[0174] Exemplo 3) Análise de dados de sequenciamento de alto rendimento e desenho de iniciador com base neste
[0175] Mais de 10.000 sequências de região variável humana foram obtidas para cada raça e tipo através de sequenciamento de alto rendimento (Tabela 45). A fim de detectar as combinações de aminoácidos das regiões CDR, entre as sequências da região variável humanas obtidas, para a CDR1 de tipo VH1, a região entre a serina-cisteína (números de Kabat 22, 23) e triptofano-valina (números de Kabat 36, 37) foi analisada, para o CDR2 do tipo VH1, a região entre o ácido glutâmico-triptofano (números de Kabat 47, 48) e arginina- random-treonina (números de Kabat 67, 68, 69) foi analisada e para a CDR3 de tipo de VH1, a região entre a tirosina- tirosina-cisteína (números de Kabat 90, 91, 92) e glicina- treonina-leucina (Kabat números 103, 104, 105) foi analisada. Para o tipo de CDR1 de VH3, a região entre a serina-cisteína (números de Kabat 22, 23) e triptofano-valina (números de Kabat 36, 37) foi analisada, para o tipo de CDR2 de VH3, a região entre ácido glutâmico-triptofano (números de Kabat 47, 48) e lisina-glicina-arginina (números de Kabat 67, 68, 69) foi analisada, e para o tipo de CDR3 de VH3, a região entre a tirosina-tirosina-cisteína (números de Kabat 90, 91, 92) e glicina-treonina-leucina (números de Kabat 103, 104, 105). Para o tipo de CDR1 de Vk1, a região entre isoleucina- aleatória-cisteína (números de Kabat 21, 22, 23) e triptofano- tirosina (números de Kabat 35, 36) foi analisada, para o tipo de CDR2 de Vk1, a região entre isoleucina-tirosina (números de Kabat 48, 49) e glicina-valina (números de Kabat 57, 58) foi analisada, e para o tipo de CDR3 de Vk1, a região entre a tirosina-tirosina-cisteína (números de Kabat 86, 87, 88) e glicina-treonina-lisina (número Kabat 101, 102, 103). Para a CDR1 de VK3, a região entre a serina-cisteína (22,23 números de Kabat) e triptofano-tirosina (35,36 números de Kabat) foi analisada, para a CDR2 da VK3, a região entre a leucina- isoleucina (números de Kabat 47,48) e isoleucina-prolina (58,59 números de Kabat) foi analisada, e para a CDR3 de VK3, a região entre a tirosina-tirosina-cisteína (números de Kabat 86,87,88) e glicina-treonina-lisina (Kabat números 101, 102, 103) foi analisada. Para a CDR1 de Vλ1, a região entre a serina-cisteína (números de Kabat 22, 23) e triptofano- tirosina (números de Kabat 35, 36) foi analisada, para a CDR2 da Vλ1, a região leucina-isoleucina (números de Kabat 47, 48) e serina-glicina (número de Kabat 56, 57) foi analisada, e para a CDR3 da Vλ1, a região entre a tirosina-tirosina- cisteína (números de Kabat 86, 87, 88) e glicina-treonina- lisina (números de Kabat 101, 102, 103) foi analisada (Tabela 46). Os tipos VH1 e VH3 têm vários comprimentos de CDR3, então as combinações de aminoácidos foram identificadas após a análise de cada um dos 9 a 14 aminoácidos, que são os comprimentos que permitem a seleção mais eficiente de anticorpos ao produzir bibliotecas sintéticas com base na literatura convencional.
[0176] O resultado da análise mostrou que não foi encontrada diferença significativa entre as combinações de aminoácidos de CDR asiáticos e caucasianos, ou seja, são bastante semelhantes. CDR1 e CDR2 de VH têm várias combinações de aminoácidos, mas contêm aminoácidos conservados em uma taxa mais alta do que CDR3. A razão para isso é que se trata de regiões do gene V que não possuem junção VDJ, então a possibilidade de introdução de mutações é menor do que no caso de CDR3, e há aminoácidos que devem ser conservados devido à presença de números de resíduos que afetam a estabilidade estrutural. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre a CDR3 de VH1 e a CDR3 de VH3, e verificou-se que eles tinham combinações de aminoácidos semelhantes. Isso ocorre porque as extremidades do gene V de VH1 e VH3 são comumente conservadas como tirosina-tirosina-cisteína-alanina- arginina/lisina, e genes idênticos são aplicados aos genes D e J durante a união V-D-J.
[0177] De acordo com o resultado da análise, a média das combinações de aminoácidos CDR asiáticos e caucasianos foi calculada e refletida no desenho do códon do iniciador. Além disso, como os CDR3s de VH1 e VH3 são semelhantes, os iniciadores que constituem CDR3 foram compartilhados. Além disso, há um risco de redução no título de anticorpo devido à N-glicosilação, porque a razão de aminoácidos NXS/T de Kabat No. 52-52a-53 de CDR2 de VH1 e CDR2 de VH3 de Kabat No. 52a- 53-54 é cerca de 5%. Por esta razão, a possibilidade de N- glicosilação foi eliminada pela redução da proporção de asparagina em 52 de VH1 e 52a de VH3 para 0%.
Tabela 45 Nome Número da Análise de sequência VH1 Asiático 33.572 VH3 Asiático 27.587 Vk1 Asiático 44.113 Vk3 Asiático 23.762 Vλ1 Asiático 16.980 VH1 Caucasiano 22.455
VH3 Caucasiano 22.508 Vk1 Caucasiano 28.467 Vk3 Caucasiano 15.260 Vλ1 Caucasiano 19.381 Tabela 46
[0178] Exemplo 4) Construção da biblioteca Fab
[0179] 4-1) Construção de biblioteca de região variável de cadeia leve
[0180] 1) Síntese da sequência estrutural de VL: as sequências estruturais de 1 a 3 de VLκ1-39, VLκ3-20 e VLλ1-51 humanas (Tabela 47) foram sintetizadas por Bioneer (http://www.bioneer.co.kr) mediante solicitação, e assim adquirido.
Tabela 47 Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 VLκ1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT WYQQKPGKAPKLL GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT -39 ITCRASQ (SEQ ID NO: IY (SEQ ID YYCQQ (SEQ ID NO: 19) 17) NO: 18)
VLκ3 EIVLTQSPGTLSLSPGERAT WYQQKPGQAPRLL IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVY -20 LSCRASQ (SEQ ID NO: I (SEQ ID NO: YCQQ (SEQ ID NO: 24) 22) 23) VLλ1 WYQQLPGTAPKLL RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGD
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTI -51 I (SEQ ID NO: EADYYC (SEQ ID NO: 34) SCSG (SEQ ID NO: 32) 33) CLκ TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 133) CLλ QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAA SSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC (SEQ ID NO: 134)
[0181] 2) Amplificação por PCR primária (PCR de Fragmento): Fragmentos de CDR1 a CDR3 de VL (fragmentos 1 a 3) foram amplificados por PCR usando cada sequência estrutural como um modelo (5 ng/reação). As sequências de iniciadores usados na PCR estão mostradas na Tabela 48. Na sequência acima, o número X significa 3 bases, e no arquivo de listagem de sequência, isso é indicado como “NNN”. A reação foi conduzida usando um AccuPower Pfu PCR PreMix (Bioneer, K-2025) por 30 ciclos (a 95ºC por 30 segundos, a 50 a 58ºC por 30 segundos, a 72ºC por 1 minuto). Cada produto de PCR foi submetido a eletroforese e depois purificado usando um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28706).
Tabela 48 Nome Direção Sequência SEQ
VLκ1- Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 39_F1 Reverso GGCTTTCCCTGGTTTCTGCTGATACCAX5TAN5X4X3X2TAN4X1N3 93 N2GACTCGCACN1GCAGGTGATTGTAACGCGATCTCCTAC VLκ1- Direto TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC 94 39_F2 Reverso GCCACTAAAACGGCTCGGAACGCCX21X20AN10GX19AN9TX18X1 95 7ATAAATCAGGAGCTTCGGTGCTTTCCC VLκ1- Direto GGCGTTCCGAGCCGTTTTAGTGGC 96
39_F3 Reverso TTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCCGAATGTX31CGGX30X29X2 97 8X27N14TN15N14N13GACAGTAATAGGTAGCAAAATCCTCAGGCT
GCAG VLκ3- Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 20_F1 Reverso TGCCTGACCAGGCTTTTGTTGGTACCATGCAN8CX11X10X9X8X7X 98 6N7TN6ACTCGCACN1GCAGCTAAGGGTAGCACGTTCACCTGG VLκ3- Direto GCATGGTACCAACAAAAGCCTGGTCAGGCA 99 20_F2 Reverso GGAGCCAGAGAAACGGTCCGGAATAN1CAGN12AN11CACGX26X25 100 X24X23X22GATCAGCAGACGTGGTGCCTGACC VLκ3- Direto ATTCCGGACCGTTTCTCTGGCTCC 101 20_F3 Reverso TTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCCGAATGTX31CGGX35X34X3 102 3X32N16TGN7N16GACAGTAATAAACAGCAAAATCCTCAGGTTCTA
AACG VLκ3- Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 20- 2_F1 Reverso TGCCTGACCAGGCTTTTGTTGGTACCATGCAN8CX16X15X14X13X 103 12N3N2GACTCGCACN1GCAGCTAAGGGTAGCACGTTCACCTGG VLλ1- Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 51_F1 Reverso TGCTGTACCTGGAAGCTGTTGATACCAX41CACX40X39X38TN18C 104 AAN17ATTAGAX37X36GCCAGAGCACGAGATGGTCACCTTTTG VLλ1- Direto TGGTATCAACAGCTTCCAGGTACAGCA 105 51_F2 Reverso ACGATCCGGAATACCGGAAGGACGX46X45X44X43X42AATCAATA 106
ACTTCGGTGCTGTACCTGG VLλ1- Direto CGTCCTTCCGGTATTCCGGATCGT 107 51_F3 Reverso CGTAAGTTTGGTGCCACCACCGAAX56X55X54X53X52X51X50AT 108 CX49X48X47GCAGTAGTAATCGGCTTCGTCGCC CLκ Direto GGGCAGGGTACCAAAGTGGAAATTAAACGCACGGTGGCTGCCCCTTC 109
TGTGTTC Reverso AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA 110 CLλ Direto GGTGGTGGCACCAAACTTACGGTCCTAGGCCAGCCCAAGGCCAACCC 111
CACTGTC Reverso TTATCTAGAACTAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC 112
[0182] N1 a N8 da SEQ ID NO: 93 (Vk1-39-F1), SEQ ID NO: 98 (Vk3-20-F1) e SEQ ID NO: 103 (Vk3-20-2-F1) foram projetados para ter a razão de bases mostrada na Tabela 49 abaixo e a PCR foi realizada.
Tabela 49
[0183] X1 a X16 da SEQ ID NO: 93 (Vk1-39-F1), SEQ ID NO: 98 (Vk3-20-F1) e SEQ ID NO: 103 (Vk3-20-2-F1) foram projetados para ter a razão de códons mostrada na Tabela 50 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 50
[0184] N da SEQ ID NO: 95 (Vk1-39-F2) foi projetado para ter a razão de bases mostrada na Tabela 51 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 51
[0185] X da SEQ ID NO: 95 (Vk1-39-F2) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 52 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 52
[0186] N da SEQ ID NO: 100 (Vk3-20-F2) foi projetado para ter a razão de bases mostrada na Tabela 53 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 53
[0187] X da SEQ ID NO: 100 (Vk3-20-F2) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 54 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 54
[0188] N da SEQ ID NO: 97 (VLκ1-39_F3) e EQ ID NO: 102 (VLκ3- 20_F3) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 55 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 55
[0189] X da SEQ ID NO: 97 (VLκ1-39_F3) e SEQ ID NO: 102 (VLκ3- 20_F3) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 55 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 56
[0190] N da SEQ ID NO: 104 (VLλ1-51_F1) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 57 abaixo, e PCR foi realizado.
Tabela 57
[0191] X da SEQ ID NO: 104 (VLλ1-51_F1) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 58 abaixo, e PCR foi realizado.
Tabela 58
[0192] X da SEQ ID NO: 106 (VLλ1- 51_F2) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 59 abaixo, e PCR foi realizada.
Tabela 59
[0193] X da SEQ ID NO: 108 (VLλ1-51_F3) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 60 abaixo, e PCR foi realizada.
Tabela 60
[0194] 3) Na segunda amplificação por PCR (1ª PCR de sobreposição): os produtos de PCR primária (fragmentos de 1 a 3) foram adicionados como moldes (20 ng de cada fragmento/reação) e a reação foi conduzida durante 16 ciclos (95ºC durante 30 seg, 55ºC durante 30 seg, a 72ºC durante 1 min). As sequências de iniciadores usadas para PCR estão mostradas na Tabela 61. Os respectivos produtos de PCR (cadeias leves variáveis) foram submetidos à eletroforese e, em seguida, purificados usando um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28706).
Tabela 61 Nome Direção Sequência SEQ ID NO.
VLκ1-39 Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 Reverso ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC 113 VLκ3-20 Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 Reverso ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC 113 VLκ3- Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 20-2 Reverso ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC 113 VLλ1-51 Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 Reverso ACTAGTACCCAGGACCGTAAGTTTGGTGCC 114
[0195] 4) Terceira amplificação por PCR (2ª PCR de sobreposição): os produtos da 1ª PCR de sobreposição purificados foram pesados e utilizados como moldes (10 ng por cada produto/reação) juntamente com CLκ (produto de PCR de fragmento) para VLκ1-39, VLκ3-20 e VLκ3-20-2, e junto com CLλ (produto de PCR de fragmento) para VLλ1-51, e a reação foi conduzida por 15 ciclos (a 95ºC por 1 min, a 55ºC por 1 min, a 72ºC por 1 min). As sequências de iniciadores usados na PCR estão mostradas na Tabela 62. Os respectivos produtos de PCR foram submetidos a eletroforese e, em seguida, purificados usando um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28706).
Tabela 62 Nome Direção Sequência SEQ ID NO.
VLκ1-39_ Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 CLκ Reverso AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA 109 VLκ3-20_ Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 CLκ Reverso AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA 109 VLκ3-20-2_ Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 CLκ Reverso AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA 109 VLλ1-51_ Direto GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG 92 CLλ Reverso TTATCTAGAACTAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC 111
[0196] 5) Transformação da biblioteca VL
[0197] 5-a) Ligação: EcoRI (NEB, CAT. NO. R0101L) foi adicionado aos produtos de PCR de sobreposição das regiões de cadeia leve variável (VL) e cadeia leve constante (CL), a reação foi conduzida a 37ºC durante a noite (O/N) e, em seguida, o resultado foi purificado usando um Kit de purificação QIAquick PCR (QIAGEN, CAT. NO. 28106). XbaI (NEB. CAT. NO. R0145L) foi adicionada ao mesmo, seguido por reação a 37ºC durante a noite (O/N) e purificação usando um kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28106). T4 DNA Ligase (NEB, CAT. NO. M0203S) foi adicionado a 20 µg de fragmentos de DNA de inserção cortados com EcoRI e XbaI e 40 µg de vetor pComb3XTT linearizado (EcoRI, corte XbaI), seguido por reação a 25ºC durante a noite (O/N).
[0198] 5-b) Transformação: o produto de reação ligado foi purificado usando um kit de purificação de PCR QIAquick
(QIAGEN, CAT. NO. 28106). Para cada subtipo de cadeia leve, 1 mL de MC1061F' (SS320) Células Competentes (Lucigen, CAT. NO. 60512-1) foi dividido em 10 cubetas (100 µl/cubeta) e eletroporado. O meio líquido SB foi adicionado para ajustar o volume total para 500 mL, o resultado foi incubado com agitação a 37ºC e 200 rpm por 1 hora, e 100 µL de cultura sup. foi espalhado em uma placa de agar LB + carbenicilina (NaraeBiotech, CAT. NO. LN004CA) por meio de diluição em série e, em seguida, incubados a 37ºC durante a noite para determinar o tamanho da biblioteca de pComb3XTT-Synthetic VL. 500 µL de carbenicilina (100 mg/mL) foram adicionados a 500 mL da cultura, que foi então incubada a 37ºC (200 rpm) durante a noite.
[0199] 4-2) Construção de biblioteca de região variável de cadeia pesada
[0200] 1) Síntese da sequência estrutural VH: as sequências (Tabela 63) estruturais 1 a 3 de VH1-69, VH3-15 e VH3-23 humanos foram sintetizadas por Bioneer (http://www.bioneer.co.kr) mediante solicitação, e assim adquirida.
Tabela 63 Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 VH1-69 QVQLVQSGAEVKKPGSSV WVRQAPGQGLEWM YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRS KVSCKAS(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 13) EDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 14) 12) VH3-15 EVQLVESGGGLVKPGGSL YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKT
WVRQAPGKGLEWV RLSCAASG (SEQ ID EDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 3) NO: 2) VH3-23 EVQLVESGGGLVQPGGSL YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA
WVRQAPGKGLEWV RLSCAASG (SEQ ID EDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 8) NO: 7)
[0201] 2) Amplificação por PCR primária (PCR de Fragmento): Fragmentos de CDR1 a CDR3 de VL (fragmentos 1 a 3) foram amplificados por PCR usando cada sequência estrutural como um modelo (5 ng/reação). As sequências de iniciadores usadas para PCR estão mostradas na Tabela 64. A reação foi conduzida usando um AccuPower Pfu PCR PreMix (Bioneer, K-2025) por 30 ciclos (a 95ºC por 30 seg, a 50 a 55ºC por 30 seg, a 72ºC por 1 min). Cada produto de PCR foi submetido a eletroforese e depois purificado usando um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28706).
Tabela 64 Nome Direção Sequência SEQ
VH1-69_F1 Direto TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACC 115
TATTGCCT Reverso CTGTCCTGGTGCTTGACGAACCCAX62N22AN20X61X60 116 X59X58GAAX57X63ACCAGACGCTTTACAACTGACTTTA
ACTGAACT VH1-69_F2 Direto TGGGTTCGTCAAGCACCAGGACAG 117 Reverso CGTAACACGACCTTGGAATTTCTGTGCATAX73X72X71X 118 70X69X68X67X66GATX65X64CATCCATTCTAAGCCTT
GTCCAGG VH1-69_F3_CDR9 Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 Reverso CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X 120 92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH1- Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 69_F3_CDR10 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X 121 105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAAT
ACACTGCGGTATCTTC VH1- Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 69_F3_CDR11 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X 122 112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACA
GTAATACACTGCGGTATCTTC VH1- Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 69_F3_CDR12 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X 123 116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTG
CACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH1- Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 69_F3_CDR13 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X 124 123X122X112X111X110X103X102X101X100X121A
CGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH1- Direto TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT 119 69_F3_CDR14 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X 125 129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X 127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3-15_F1 Direto TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACC 115
TATTGCCT Reverso TTTACCTGGTGCCTGACGAACCCAX62N21AN20X61X60 126 X59X58GAAX57AN19AACCAGATGCTGCACAGCTTAAAC
GAAG VH3-15_F2 Direto TGGGTTCGTCAGGCACCAGGTAAA 127 Reverso ACGACCTTTGACCGGTGCTGCGTAX81AN28N17AGN27X 128 80ACN26X79X78X77X76TN25TX75X75AN24N23CAC
CCATTCAAGACCTTTACCTGG VH3-15_F3_CDR9 Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 Reverso CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X 120 92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 15_F3_CDR10 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X 121 105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAAT
ACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 15_F3_CDR11 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X 122 112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACA
GTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 15_F3_CDR12 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X 123 116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTG
CACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 15_F3_CDR13 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X 124 123X122X112X111X110X103X102X101X100X121A
CGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT 129 15_F3_CDR14 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X 125 129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X 127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3-23_F1 Direto TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACC 115
TATTGCCT Reverso TTTACCTGGTGCCTGACGAACCCAX62N21AN20X61X60 126 X59X58GAAX57AN19AACCAGATGCTGCACAGCTTAAAC
GAAG VH3-23_F2 Direto TGGGTTCGTCAGGCACCAGGTAAA 127 Reverso GGTAAAACGACCCTTAACGCTATCCGCATAX89X88X87X 130 86ACN30X85X84X83GATX82TCN29CACCCATTCAAGA
CCTTTACCTGG VH3-23_F3_CDR9 Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 Reverso CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X 120 92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 23_F3_CDR10 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X 121 105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAAT
ACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 23_F3_CDR11 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X 122 112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACA
GTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 23_F3_CDR12 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X 123 116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTG
CACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 23_F3_CDR13 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X 124 123X122X112X111X110X103X102X101X100X121A
CGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC VH3- Direto TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC 129 23_F3_CDR14 Reverso AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X 125 129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X 127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC
[0202] N da SEQ ID NO: 116 (VH1-69_F1) e SEQ ID NO: 126 (VH3- 15_F) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 65 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 65
[0203] X da SEQ ID NO: 116 (VH1-69_F1) e SEQ ID NO: 126 (VH3-15_F) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 66 abaixo e a PCR foi realizada.
Tabela 66
[0204] X da SEQ ID NO: 118 (VH1-69_F2) foi projetado para ter a proporção de códons mostrada na Tabela 67 abaixo e a PCR foi realizada.
Tabela 67
[0205] N da SEQ ID NO: 128 (VH3-15_F2) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 68 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 68
[0206] X da SEQ ID NO: 128 (VH3-15_F2) foi projetado para ter a proporção de códons mostrada na Tabela 69 abaixo e a PCR foi realizada.
Tabela 69
[0207] N da SEQ ID NO: 130 (VH3-23_F2) foi projetado para ter a razão de base mostrada na Tabela 70 abaixo, e a PCR foi realizada.
Tabela 70
[0208] X da SEQ ID NO: 130 (VH3-23_F2) foi projetado para ter a proporção de códons mostrada na Tabela 71 abaixo e a PCR foi realizada.
Tabela 71
[0209] X da SEQ ID NO: 120 (VH1-69_F3_CDR9, VH3-15_F3_CDR9, VH3-23_F3_CDR9) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 72 abaixo, e PCR foi realizada.
Tabela 72
[0210] X da SEQ ID NO: 121 (VH1-69_F3_CDR10, VH3-15_F3_CDR10, VH3-23_F3_CDR10), SEQ ID NO: 122 (VH1-69_F3_CDR11, VH3- 15_F3_CDR11, VH3-23_F3_CDR11), SEQ ID NO: 123 (VH1- 69_F3_CDR12, VH3-15_F3_CDR12, VH3-23_F3_CDR12), SEQ ID NO: 124 (VH1-69_F3_CDR13, VH3-15_F3_CDR13, VH3-23_F3_CDR13) e SEQ ID
NO: 125 (VH1-69_F3_CDR14, VH3-15_F3_CDR14, VH3-23_F3_CDR14) foi projetado para ter a razão de códons mostrada na Tabela 73 abaixo, e PCR foi realizada.
Tabela 73
[0211] 3) A segunda amplificação por PCR (1ª PCR de sobreposição): os produtos de PCR primária (fragmentos de 1 a 3) foram adicionados como moldes (40 ng de cada fragmento/reação) e a reação foi conduzida durante 16 ciclos (a 95ºC durante 30 seg, 50 a 55ºC durante 30 seg, a 72ºC durante 1 min). As sequências de iniciadores usados na PCR estão mostradas na Tabela 74. Os respectivos produtos de PCR (cadeias pesadas variáveis) foram submetidos a eletroforese e, em seguida, purificados usando um kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28706).
Tabela 74 Nome Direção Sequência SEQ
VH1-69 Direto GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAA 131
ATACCTATTGCCT Reverso GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGT 132
GTACCTTGACCCCA VH3-15 Direto GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAA 131
ATACCTATTGCCT Reverso GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGT 132
GTACCTTGACCCCA VH3-23 Direto GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAA 131
ATACCTATTGCCT Reverso GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGT 132
[0212] 4) Transformação da biblioteca Fab
[0213] 4-a) Ligação: XbaI (NEB. CAT. NO. R0145L) foi adicionado a produtos de PCR de uma cadeia pesada variável (VH), a reação foi conduzida a 37ºC por 6 horas e, em seguida, o resultado foi purificado usando um kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28106). ApaI (NEB. CAT. NO. R0114L) foi adicionado ao mesmo, seguido por reação a 25ºC durante 6 horas e purificação usando um kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28106). T4 DNA ligase (NEB, CAT. NO. M0203S) foi adicionado a 10 µg de fragmentos de DNA de inserção cortados com XbaI e apaI e 40 µg de vetor pComb3XTT linearizado (EcoRI, corte XbaI) e a reação foi conduzida a 25ºC durante a noite (O/N). Neste momento, como uma proporção do comprimento de CDR3 em relação à quantidade total de DNA, a porcentagem de comprimentos de CDR3_9AA (aminoácido) foi ajustada para 12%, a porcentagem de comprimentos de CDR3_10AA foi ajustada para 14%, a porcentagem dos comprimentos de CDR3_11AA foi ajustada para 17%, a porcentagem de comprimentos de CDR3_12AA foi ajustada para 22%, a porcentagem de comprimentos de CDR3_13AA foi ajustada para 19% e a porcentagem de comprimentos de CDR3_14AA foi ajustada para 16%.
[0214] 4-b) Transformação: o produto de reação ligado foi purificado usando um kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN, CAT. NO. 28106). Para cada subtipo de cadeia pesada, 1 mL de células componentes por eletroporação XL1-Blue (Stratagene, CAT. NO. 200228) foi dividido em 10 cubetas (100 µl/cubeta) e eletroporado. Meio líquido SB foi adicionado para ajustar o volume total para 500 mL, e o resultado foi incubado com agitação a 37ºC e 200 rpm por 1 hora. 100 µL de cultura sup. foi espalhado em uma placa de agar LB + carbenicilina (NaraeBiotech, CAT. NO. LN004CA) por meio de diluição em série e, em seguida, incubado a 37ºC durante a noite para determinar o tamanho da biblioteca pComb3XTT-Synthetic VL. 500 µL de carbenicilina (100 mg/mL) foram adicionados a 500 mL da cultura, que foi então incubada a 37ºC (200 rpm) durante a noite.
Exemplo 5) Detecção de desempenho da biblioteca Fab 5-1) Determinação do tamanho da biblioteca
[0215] Para uma biblioteca Fab, um total de 12 bibliotecas, cada uma com um tamanho de 1010 ou mais, foi construído usando 3 tipos de VH e 4 tipos de VL para obter uma biblioteca de Fab com um tamanho total de 1,52 × 1011. Para obter uma biblioteca de scFv, um total de 8 bibliotecas, cada uma tendo um tamanho de 1011 ou mais, foi construída usando 2 tipos de VH e 4 tipos de VL, para obter uma biblioteca de scFv com um tamanho total de 1,27 x 1012.
Tabela 75
[0216] 5-2) Detecção da distribuição de aminoácidos da CDR da biblioteca
[0217] A reprodutibilidade foi analisada comparando as sequências CDR da linhagem germinativa humana obtidas usando Sequenciamento HT com as sequências CDR da biblioteca realmente construída.
[0218] O resultado mostrou que a diversidade de aminoácidos projetada, como mostrado na FIG. 2 foi obtida.
[0219] A fim de analisar quantitativamente o mesmo, uma análise foi realizada usando um teste T pareado.
[0220] O resultado mostrou que os níveis de significância de todos os sítios de introdução da biblioteca eram de 5% ou menos, o que indica que a sequência de mutação da biblioteca real é a mesma que a sequência projetada com base no CDR da linhagem germinativa humana.
Tabela 76
[0221] 5-3) Detecção de distribuição de sequência de redundância (repetitiva)
[0222] A proporção de sequências repetitivas foi obtida analisando cerca de 10000 de cada sequência de biblioteca usando sequenciamento HT.
[0223] O resultado mostrou que os tipos VH3-15 e VH3-23 têm uma razão de sequência repetitiva de 10% ou menos, VH1-69 tem uma razão de sequência repetitiva de 13 a 21% e a razão de sequência repetitiva média geral é de 10,5% (Tabela 77) Como pode ser visto a partir da fig. 3, uma vez que a maioria das sequências repetitivas foi repetida duas vezes, o efeito de diminuir a qualidade da biblioteca foi insignificante.
Tabela 77
[0224] 5-4) Análise de comprimento de CDR
[0225] A distribuição das sequências de VH CDR3 da linhagem germinativa humana para cada comprimento foi detectada por meio de sequenciamento HT, foi reproduzida na biblioteca e comparada e analisada por meio de sequenciamento HT.
[0226] Como pode ser visto a partir da fig. 4, a distribuição da sequência da linhagem germinativa humana para cada comprimento e o comprimento de CDR da biblioteca eram semelhantes.
[0227] Embora as configurações específicas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes, os especialistas na técnica apreciarão que esta descrição é proporcionada como modalidades preferenciais para fins ilustrativos e não deve ser interpretada como limitando o escopo da presente invenção. Por conseguinte, o escopo substancial da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.
Aplicabilidade Industrial
[0228] Vantajosamente, a biblioteca de anticorpos, de acordo com a presente invenção, tem alta estabilidade termodinâmica e permite alta expressão solúvel, bem como dobramento reversível.
[0229] Além disso, a biblioteca de anticorpos, de acordo com a presente invenção, contém várias CDRs que são racionalmente controlados para terem alta especificidade e alta afinidade para todos os antígenos e, portanto, têm um alto nível de diversidade e, portanto, podem ser usados de forma útil para selecionar anticorpos candidatos apropriados para um antígeno desejado.
[0230] Além disso, a biblioteca de anticorpos, de acordo com a presente invenção, é baseada em sequências de anticorpos humanos e, portanto, pode ser usada para triar anticorpos com imunogenicidade mínima quando administrados ao corpo humano, e para desenvolver anticorpos que podem ser efetivamente usados para o tratamento ou diagnóstico de doenças.
【Lista de sequências Texto Livre】
[0231] Um arquivo eletrônico é anexado.
Claims (12)
1. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, caracterizado por - cada anticorpo ou fragmento do mesmo compreender um par de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, - em que a região variável de cadeia pesada compreende: - uma região estrutural incluída em uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) e VH1-69 (SEQ ID NO: 11); e - uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDRH1), uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDRH2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDRH3), que são diferentes para cada região variável da cadeia, e a região variável de cadeia leve compreende: - uma região estrutural incluída em uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16), Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21), Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) e Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31); e - uma combinação de uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDRL1), uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDRL2) e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDRL3), que são diferentes para cada região variável de cadeia leve.
2. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: - uma região estrutural incluída em um par de regiões variáveis de cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em VH3-15 (SEQ ID NO: 1)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/Vλ1- 51(SEQ ID NO: 31), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vλ1- 51(SEQ ID NO: 31), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ1-39(SEQ ID NO: 16), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20(SEQ ID NO: 21), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26) e VH1-69(SEQ ID NO: 11)/Vλ1-51(SEQ ID NO: 31); e - uma combinação de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 diferente para cada região variável de cadeia pesada e uma combinação de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 diferente para cada região variável de cadeia leve.
3. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela região estrutural na região variável da cadeia pesada ter a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) compreende FR1 (SEQ ID NO: 2), FR2 (SEQ ID NO: 3), FR3 (SEQ ID NO: 4) e FR4 (SEQ ID NO: 5), a região estrutural na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) compreende FR1 (SEQ ID NO: 7), FR2 (SEQ ID NO: 8), FR3 (SEQ ID NO: 9) e FR4 (SEQ ID NO: 10), a região estrutural na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) compreende FR1 (SEQ
ID NO: 12), FR2 (SEQ ID NO: 13), FR3 (SEQ ID NO: 14) e FR4 (SEQ ID NO: 15), a região estrutural na região variável de cadeia pesada tendo a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 16) compreende FR1 (SEQ ID NO: 17), FR2 (SEQ ID NO: 18), FR3 (SEQ ID NO: 19) e FR4 (SEQ ID NO: 20), a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 21) compreende FR1 (SEQ ID NO: 22), FR2 (SEQ ID NO: 23), FR3 (SEQ ID NO: 24) e FR4 (SEQ ID NO: 25), a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) compreende FR1 (SEQ ID NO: 27), FR2 (SEQ ID NO: 28), FR3 (SEQ ID NO: 29), e FR4 (SEQ ID NO: 30), e a região estrutural na região variável de cadeia leve tendo a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) compreende FR1 (SEQ ID NO: 32), FR2 (SEQ ID NO: 33), FR3 (SEQ ID NO: 34) e FR4 (SEQ ID NO: 35).
4. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, no anticorpo ou fragmento do mesmo, a região determinante de complementaridade (CDR) incluída em cada região variável do par de A região variável da cadeia e a região variável da cadeia serem projetadas para prevenir a ocorrência de modificação após a tradução através da alteração de um aminoácido que tem o potencial de sofrer modificação pós-tradução (PTM).
5. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada ter a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) compreende o intervalo da Tabela 3, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1) compreende o intervalo da Tabela 4, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) compreende o intervalo da Tabela 3, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH3-23 (SEQ ID NO: 6) compreende o intervalo da Tabela 4, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDRH1) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) compreende o intervalo da Tabela 5, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDRH2) na região variável da cadeia pesada com a sequência de VH1-69 (SEQ ID NO: 11) compreende o intervalo da Tabela 6, quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 9 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 compreende a faixa da Tabela 7,
quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 10 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 compreende a faixa da Tabela 8, quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 11 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição no CDRH3 compreende a faixa da Tabela 9, quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 12 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 compreende a faixa da Tabela 10, quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 13 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 compreende a faixa da Tabela 11, quando a região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada (CDRH3) na região variável da cadeia pesada tendo a sequência de VH3-15 (SEQ ID NO: 1), VH3-23 (SEQ ID NO: 6) ou VH1-69 (SEQ ID NO: 11) tem 14 aminoácidos, a razão de aminoácidos para cada posição em CDRH3 compreende a faixa da Tabela 12,
a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) compreende o intervalo da Tabela 13, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) compreende o intervalo da Tabela 14, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ1-39 (SEQ ID NO: 16) compreende o intervalo da Tabela 15, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) compreende o intervalo da Tabela 16, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) compreende o intervalo da Tabela 17, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20 (SEQ ID NO: 21) compreende o intervalo da Tabela 18, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) compreende o intervalo da Tabela 19, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) compreende o intervalo da Tabela 17, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vκ3-20-2 (SEQ ID NO: 26) compreende o intervalo da Tabela 18, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDRL1) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) compreende o intervalo da Tabela 20, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDRL2) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) compreende o intervalo da Tabela 21, a razão de aminoácidos para cada posição na região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDRL3) na região variável da cadeia leve com a sequência de Vλ1-51 (SEQ ID NO: 31) compreende o intervalo da Tabela 22.
6. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ter uma ou mais formas selecionadas do grupo que consiste em Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv (scFv)2, scFv-Fc e Fv.
7. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ter uma ou mais características selecionadas a partir de i) a iv) a seguir: i) redundância (porcentagem de sequências repetitivas) de 10% ou menos;
ii) valor p da composição de CDR> 0,05; iii) estabilidade térmica de 70ºC ou superior; e iv) diversidade (tamanho da biblioteca) de 107 ou mais.
8. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser expresso na superfície de um fago ou célula hospedeira introduzida com um ácido nucleico que codifica o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos.
9. Conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela célula hospedeira ser E. coli ou levedura.
10. Ácido nucleico caracterizado por codificar o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
11. Método de identificação de um anticorpo ou fragmento do mesmo específico para um antígeno, caracterizado por compreender: (a) contatar um antígeno com o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) selecionar um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam ao antígeno.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos ser expresso na superfície de um fago ou célula hospedeira introduzido com o ácido nucleico que codifica o conjunto de anticorpos ou fragmentos dos mesmos.
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