KR20190137294A - 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 인간 서열 유래의 특정 VH 또는 VL 골격(scaffold)을 가지고 있어 높은 열역학적 안정성(thermodynamic stability)을 가지고 있으며, 높은 수용성 발현(high soluble expression)이 가능하다는 장점뿐 아니라, 가역적인 폴딩(reversible folding)이 가능하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 모든 항원에 대해 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)를 가지도록 합리적으로 조절된(rationally controlled)된 다양한 CDR 들을 포함하고 있어, 목적하는 항원에 대한 적절한 후보 항체를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 모든 항원에 대해 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)를 가지도록 합리적으로 조절된(rationally controlled)된 다양한 CDR 들을 포함하고 있어, 목적하는 항원에 대한 적절한 후보 항체를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 인간 서열 유래의 특정 VH 또는 VL 골격(scaffold)을 가지고 있어 높은 열역학적 안정성(thermodynamic stability)을 가지고 있으며, 높은 수용성 발현(high soluble expression)이 가능하다는 장점뿐 아니라, 가역적인 폴딩(reversible folding)이 가능하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 모든 항원에 대해 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)를 가지도록 합리적으로 조절된(rationally controlled)된 다양한 CDR 들을 포함하고 있어, 목적하는 항원에 대한 적절한 후보 항체를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
항체는 면역계 내의 백혈구의 B 세포(B 림프구)에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질로서, 항원을 만나게 되면 세포에 있는 수용체를 통하여 항원을 인식하고 수용체를 통해 결합한다. 이와 같은 항체는 질병을 치료하기 위한 단백질 신약의 후보 물질로 여겨지고 있으며, 목적하고자 하는 기능적인 항체를 찾기 위해 다양한 항체 라이브러리를 제조하여 이로부터 스크리닝한다.
이와 같은 항체 라이브러리는 유전자 재조합 기술을 이용하는 것으로, 인간 체내에 존재하는 B 세포에서 항체 단백질을 코딩하는 유전자를 추출하여 항체 유전자 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리로부터 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 항체를 선별한다. 항체 라이브러리 기술은 인간 항체 등 항체의 제작에 일대 혁신을 가져왔다. 항체 면역 반응의 가장 두드러진 특징은 외부로부터 어떤 종류, 혹은 모양의 항원이 체내에 침입하더라도 그 항원이 체내의 성분과 동일하지 않은 외래물질이라면 그 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 일주일 내에 만들어진다는 것이다.
항체는 B 림파구에 의해 만들어지고 하나의 B 림파구는 단 한 종류의 항체만을 생산한다. 실제로 우리 인체에는 수많은 B 림파구가 있고 각각의 B 림파구는 자신만의 독특한 항원 결합 특이성을 지닌 항체를 세포막에 발현하고 있는데, 일반적으로 약 108가지 정도의 항원 결합 다양성이 인체 내에 존재한다고 알려져 있다. 항원이 침입할 경우에는 이 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 발현하고 있는 B 림파구만이 빠르게 증식을 하면서 항체를 다량 생산하게 되며, 결과적으로 혈청 내에 이 특정 항체의 농도가 급격히 상승해 침입한 항원의 신속한 제거 기능을 수행하게 된다. 따라서 인체 내에는 수 억 종의 항체 다양성 (diversity)이 존재하고, 이러한 항체의 다양성을 항체 레퍼토리 (repertoire)라고 표현한다.
그러므로 인체로부터 충분한 숫자의 B 림파구를 채혈로 획득한 후, 이 세포에서 mRNA를 분리한 다음 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법으로 항체 중사슬 및 경사슬의 가변영역을 코딩하는 cDNA를 얻으면, 비교적 간단한 방법으로 인체 내의 항체 레퍼토리를 유전자 형태로 시험관 내 (in vitro)에 확보할 수 있게 된다. 항체 라이브러리 기술의 핵심은 이러한 인간 항체 유전자 레퍼토리를 단백질로 발현함(혹은 디스플레이라고 표현)과 동시에 그 항체 단백질을 코딩하는 유전자가 어떠한 매체를 통해 연결되는, 이른바 유전형-표현형 연결(genotype-phenotype linkage)이며, 이를 통해 항체 라이브러리로부터 특정 항원과 결합하는 항체를 선별하고 동시에 그 특정 항체를 코딩하는 유전자를 획득하는 것이다.
이 때 완벽한 형태의 면역은 필요치 않으며, 항원 결합 기능을 지닌 항체의 Fab 형태로 발현하거나 혹은 중사슬 및 경사슬 가변 도메인(VH와 VL)이 약 15 아미노산의 짧은 펩타이드 연결자(linker)로 연결된 scFv(single-chain variable fragment)라고 명명된 항체 단편으로 발현한다. 이 때 이러한 항체의 유전형-표현형 연결(genotype-phenotype linkage)에 사용되는 매체를 어떤 매체의 표면에 발현시키는가에 따라 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 효모 디스플레이 등으로 구별되며, 항원을 투여하는 등의 면역 반응의 유도 없이 원하는 항원 결합성의 항체를 얻을 수 있다.
그러나, 항체라이브러리 제작 및 항체 선별에 많은 노하우가 필요하며, 고 친화도의 항체를 얻기 쉽지 않아서, 항체 선별 후 친화도 성숙 등 항체 최적화 과정을 수행하는 경우가 많고, 특히 1차 선별 시, 독성 등의 문제로 곧바로 포유동물 세포 (mammalian cell)에서 기능 분석을 할 수 없는 단점 등이 있다. 치료 항체의 경우에는 단순히 항원과의 결합이 아닌 실제 치료 기능이 있는 항체를 선별하여야 하므로 이와 같은 단점은 치료용 항체 개발에 장벽이 되어 왔다.
항체 라이브러리에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 것은 파지 디스플레이 항체 라이브러리이며, 실제로 현재 상업화되어 있는 류마티스 관절염 치료제인 휴미라 (Humira, anti-TNF-alpha 인간 단클론 항체)가 파지 디스플레이 기술에 의해 제조된 치료용 항체이다. 이상적인 항체 라이브러리는 거대한 항체 다양성을 포함하고 있어 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 고친화도의 항체 클론을 언제든지 획득할 수 있는 라이브러리이다. 이를 위해서는 약 1010 내지 1011정도의 항체 다양성을 지닌 라이브러리를 제작해야 하는데, 항체 유전자 클로닝 작업을 통해 이러한 크기의 라이브러리를 제작하는 것은 매우 어려운 일이며, 바로 이 점이 파지 디스플레이 항체 라이브러리 제작의 가장 어려운 난제라고 할 수 있다. 또한, 파지 자체가 독성으로 작용하여 곧바로 기능 분석을 할 수 없다는 단점이 있다.
리보솜 디스플레이의 가장 큰 장점은 cell-free 시스템이므로 이론적으로 1013 크기의 라이브러리 제작이 가능할 정도로 거대한 크기의 라이브러리를 손쉽게 만들 수 있어 고친화도 항체(high affinity antibody)의 획득에 유리하며(일반적으로 항체 라이브러리의 크기가 클수록 라이브러리 내에 고친화도의 항체가 포함되어 있을 가능성이 높다), PCR 증폭과정이 있기 때문에 error-prone polymerase 등을 이용할 수 있어 분자 진화(molecular evolution)를 인위적으로 유도하기 위한 돌연변이의 도입이 매우 용이하나, 이 또한 독성 문제 및 여러 실험상의 문제점들로 인하여 실제의 경우 naive 기원의 항체 라이브러리의 제작에는 파지 디스플레이 기술을 주로 사용하고 있다.
효모 디스플레이 기술의 경우 재조합 벡터를 S. cerevisiae 균주에 삽입하는 과정과 효모 세포의 큰 크기로 인하여 109 이상의 다양성을 지닌 항체 라이브러리를 만드는데 많은 기술적 제한이 따르며, 따라서 선별 과정에서의 장점을 활용하여 이미 확보되어 있는 항원-특이적 항체의 돌연변이 라이브러리를 제작하고 이로부터 고친화도의 항체를 선별하는데 주로 사용한다.
이 중, 파지 디스플레이는 박테리오파지의 표면에 항체단편을 발현시켜 항체를 스크리닝하는 기술이며, 기존의 항체개발 기술(하이브리도마를 이용한 키메릭/인간화 항체 개발, 유전자 이식 트랜스제닉 마우스를 이용한 항체 개발)에 비해 단시간에 항원 특이적 항체를 동정할 수 있다는 장점이 있다. 높은 다양성의 라이브러리가 확보되어야 효과적인 항체를 동정할 수 있다는 단점이 있지만, 최근의 유전자 증폭 기술 및 클로닝 기술의 발달로 인해 라이브러리 확보는 상당 부분 해결되고 있다.
인간 유전자 기반의 자연적 라이브러리에 비해, 항체의 상보성결정부위(CDR)에 무작위 합성 서열을 넣어 다양성을 창조한 것을 합성 항체 라이브러리(Synthetic antibody library)라고 한다. 그러나, 합성 항체 라이브러리는 돌연변이나 프레임시프트(frameshift) 등의 영향으로 정상적으로 기능 가능한 항체 단편의 비율이 자연적 인간 라이브러리에 비해 낮다. 최근에는 신규 표적항원을 동정하기 위한 항체 라이브러리 이용 전략이 다양해지고 있으며, 대표적으로 종양 유래 1차세포(Tumor-derived primary cells)를 이용한 셀 패닝(Cell panning)을 통해 신규 항원 특이적 항체를 동정하였다 (Zhu X. et al., Mol. Cancer Res. 2010).
이와 같이, 다양한 접근 전략이 가능하기 때문에 지속적인 항체 후보물질이 확보될 수 있고, 클로닝을 통해 항체를 생산할 수 있기 때문에 파지 디스플레이는 효율적인 접근 전략이라 할 수 있다. 이러한 파지 디스플레이 기술을 응용하여 동정된 다양한 종류의 암을 표적으로 하는 후보 항체의약품들이 임상에 진입하고 있다. 파지디스플레이 기술의 활용을 위해, 목적하는 항체 동정을 위해서는 항체 가변영역 유전자들의 라이브러리화가 필요하며, 다양한 라이브러리 구축이 필수적이라 할 것이다.
현재 다양한 항체 라이브러리가 개발되어 있지만, 여전히 높은 열역학적 안정성(thermodynamic stability) 및 높은 수용성 발현(high soluble expression)이 가능하며, 큰 다양성(diversity)를 가지고 있어 다양한 항원에 대한 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)을 가지는 항체를 선별해낼 수 있는 항체 라이브러리에 대한 요구는 지속되고 있는 실정이다.
이러한 기술적 배경하에 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 아시안 및 코카시안 인종의 cDNA로부터 공통된 서열을 추출하고, 이를 바탕으로 특정 VH 및/또는 VL 골격(scaffold)의 조합을 기반으로 하는 항체 라이브러리를 이용할 경우, 선별된 항체가 높은 열역학적 안정성을 가지고 있으며, 높은 수용성 발현이 가능할 뿐 아니라, 가역적인 폴딩(reversible folding)이 가능하다는 점을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
더욱이, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 모든 항원에 대해 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)를 가지도록 합리적으로 조절되고 설계된(rationally controlled and designed)된 다양한 CDR 들을 포함하고 있어, 자연상의 항체 라이브러리보다 월등한 다양성 및 낮은 반복서열 비율을 나타낼 뿐 아니라, 목적하는 항원에 대한 적절한 후보 항체를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 질병의 치료 또는 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 인간 항체를 스크리닝하기 위한 항체 라이브러리 및 이를 이용하여 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)을 포함하며, 상기 중쇄 가변영역은 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역(framework region)과, 각 중쇄 가변영역별로 상이한 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)의 조합을 포함하며, 상기 경쇄 가변영역은 VκID NO: 16), Vκκ및 VλID NO: 31)로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역과, 각 경쇄 가변영역별로 상이한 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합을 제공한다.
상기 항체 또는 이의 단편의 집합에 포함되는 개별적인 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 개별적으로 별개의 파지(phage) 또는 숙주세포(host cell)에 포함되며, 상기 항체 또는 이의 단편들은 각각 파지 또는 숙주세포의 표면에 발현되는 형태를 가지는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산들은 개별적으로 별개의 파지(phage) 또는 숙주세포(host cell)에 포함되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, (a) 항원을 상기 항체의 집합과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항체 라이브러리는 높은 열역학적 안정성(thermodynamic stability)을 가지고 있으며, 높은 수용성 발현(high soluble expression)이 가능하다는 장점뿐 아니라, 가역적인 폴딩(reversible folding)이 가능하다는 장점이 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 모든 항원에 대해 높은 특이성(specificity)과 높은 친화도(affinity)를 가지도록 합리적으로 조절된(rationally controlled)된 다양한 CDR 들을 포함하고 있어, 높은 수준의 다양성을 가지고 있어 목적하는 항원에 대한 적절한 후보 항체를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 항체 라이브러리는 인간 항체서열에 기반한 라이브러리라는 특성으로 인해, 인체 내에 투여 시 면역원성이 최소화된 항체를 스크리닝할 수 있으며, 질환의 치료 또는 진단에 효과적으로 사용할 수 있는 항체의 개발을 가능하도록 한다.
도 1은 본 발명에 따른 라이브러리 벡터를 구축하는 과정을 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리의 중쇄 상보성 결정영역(CDRH3)의 위치 별 아미노산 분포를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리 서열의 반복되는 서열의 비율을 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리의 중쇄 상보성 결정영역(CDRH3)의 길이 분포를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리의 중쇄 상보성 결정영역(CDRH3)의 위치 별 아미노산 분포를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리 서열의 반복되는 서열의 비율을 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 구축한 라이브러리의 중쇄 상보성 결정영역(CDRH3)의 길이 분포를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 프레임워크 영역의 안정성이 높은 VH, VL 클론을 확보하고, 번역후 변형(Posttranslational modification, PTM)을 최소화 하며, 면역원성을 최소화하는 아미노산만 정확히 합성하기 위하여 트라이머 코돈(trimer codon)을 이용하여 항체 라이브러리를 구축할 경우, 높은 다양성 및 안정성을 가지는 항체 라이브러리를 구축할 수 있다는 것을 확인하였다
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 아시안(Asian) 및 코카시안(Caucasian)의 cDNA로부터 인간 가변영역 중 중쇄 가변 영역은 VH1, VH3, 경쇄 가변영역은 Vκ1, Vκ3, Vλ1 유전자를 확보한 다음, 인간항체 가변영역에 포함된 상보성 결정영역(CDR)의 아미노산 조합을 분석하였고, 특별히 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)은 9개에서 14개의 길이 별로 각각을 분석하였다. 분석 후 확보한 아시안과 코카시안 간의 가변영역의 아미노산의 조합은 유의미한 차이 없이 유사성을 나타내었으며 확보된 아시안과 코카시안 조합의 평균값을 구하여 라이브러리 프라이머 디자인에 반영하였다. 그리고 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2)의 경우 분석된 조합에서 N-X-S/T 아미노산으로 인하여 5%의 N-Glycosylation site 발생가능성을 발견하였고, 본 PTM에 의하여 향후 항체 결합력 및 안정성에 저해를 줄 가능성을 배제하기 위하여 N-Glycosylation site의 발생가능성을 1% 이하로 조절하였다. 상기 방법을 통하여 높은 다양성을 가지는 라이브러리 구축용 프라이머를 설계하였다. 상기 프라이머를 바탕으로 Fab 라이브러리를 구축한 결과, 1.54X1011의 다양성을 가지는 라이브러리를 구축하였다(도 1).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 항체 또는 이의 단편의 집합으로, 상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)을 포함하며, 상기 중쇄 가변영역은 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역(framework region)과, 각 중쇄 가변영역별로 상이한 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)의 조합을 포함하며, 상기 경쇄 가변영역은 VκID NO: 16), Vκκ및 VλID NO: 31)로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역과, 각 경쇄 가변영역별로 상이한 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합에 관한 것이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 집합은
VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκID NO: 16), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκκλκID NO: 16), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/VκID NO: 21), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vκλκκ/VκID NO: 26) 및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)/VλID NO: 31)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역 쌍에 포함된 프레임워크 영역과,
각 중쇄 가변영역별로 상이한 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 조합 및 각 경쇄 가변영역별로 상이한 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 집합은
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.2), FR2(SEQ ID NO.3), FR3(SEQ ID NO.4) 및 FR4(SEQ ID NO.5)를 포함하며,
VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.7), FR2(SEQ ID NO.8), FR3(SEQ ID NO.9) 및 FR4(SEQ ID NO.10)를 포함하며,
VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.12), FR2(SEQ ID NO.13), FR3(SEQ ID NO.14) 및 FR4(SEQ ID NO.15)를 포함하며,
VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.17), FR2(SEQ ID NO.18), FR3(SEQ ID NO.19) 및 FR4(SEQ ID NO.20)를 포함하며,
VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.22), FR2(SEQ ID NO.23), FR3(SEQ ID NO.24) 및 FR4(SEQ ID NO.25)를 포함하며,
VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.27), FR2(SEQ ID NO.28), FR3(SEQ ID NO.29) 및 FR4(SEQ ID NO.30)를 포함하며,
및 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.32), FR2(SEQ ID NO.33), FR3(SEQ ID NO.34) 및 FR4(SEQ ID NO.35)를 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)의 각 가변영역 내에 포함된 상보성 결정영역(CDR)은 잠재적인 번역 후 수식(PTM: post-translational modification)이 일어날 수 있는 아미노산이 변형되어 번역 후 수식이 발생하지 않도록 설계된 것을 특징으로 할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 집합에 포함되는 CDR 서열들은
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 5의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 6의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 9개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 7의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 10개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 8의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 11개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 9의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 12개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 10의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 13개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 11의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 14개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 12의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 13의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 14의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 15의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 16의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 19의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 20의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 21의 범위를 포함하며,
및 상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 22의 범위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 항체 또는 또는 이의 단편의 집합은
아래 i) 내지 iv)에서 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
i) 10% 이하의 redundancy(반복 서열의 비율)
ii) CDR composition의 p-value > 0.05
iii) 70℃이상의 열 안정성
iv) 107 이상의 다양성(library size).
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 IgA, IgE, IgM, IgD, IgY 및 IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로, 목표 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain) 각각 2개씩 모여 이루어지며, 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변영역(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 고정영역(constant domain)으로 이루어져 있다. 가변영역의 3차원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며, 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성결정부위(complementarity determining region)들이 모여서 형성된다. 상보성결정부위는 가변영역 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며, 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다. 본 발명의 범위에는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ뮤(μ), 알파(α), 델타(δ및 엡실론(ε타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ감마2(γ감마3(γ감마4(γ알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ및 람다(λ타입을 가진다.
본 발명에 따른 “항원 결합 단편”은 특정 항원과 결합할 수 있는 기능을 보유하고 있는 항체의 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv (scFv)2, scFv-Fc, 및 Fv 등을 포함하는 개념으로, 본 명세서에서는 “항체 단편”과 동일한 의미로 혼용되어 사용된다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ScFv (single-chain Fv, 단일사슬단편항체 또는 항체 단편)"는 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 연결한 항체이다. 경우에 따라서, 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 링커(linker, 연결부위)를 포함할 수 있으며, 이 때, ScFv는 경쇄 가변영역-연결부위-중쇄 가변영역, 또는 중쇄 가변영역- 연결부위-경쇄 가변영역의 구조를 가질 수 있으며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체 라이브러리"는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체들의 조합을 의미하며, 본 발명에서의 특정 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍의 조합으로 이루어진 집합을 의미한다.
상기 항체 라이브러리에 포함되는 개벌적인 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 개별적으로 별개의 파지(phage) 또는 숙주세포(host cell)에 포함되며, 상기 항체 또는 이의 단편들은 각각 파지 또는 숙주세포의 표면에 발현되는 형태(surface display)를 가지는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편들이 표면에 발현되는 형태에 이용되는 숙주세포로는 대장균, 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등의 효모 등과 인간과 쥐의 B세포가 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
파지 또는 숙주세포 표면에 발현되는 항체 또는 이의 단편의 형태에 따라 본 발명에 따른 라이브러리는 Fab 라이브러리 또는 scFv 라이브러리와 같은 형태로 명명될 수 있다.
또한 본 발명에서의 “항체 라이브러리”는 단백질 수준에서의 특정 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍의 조합뿐 아니라, 각 특정 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍을 암호화하는 유전자 수준에서의 조합들을 포함하는 의미로 사용된다.
유전자들의 집합이다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체 라이브러리를 이루는 항체 유전자는 예를 들어, 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝되어 형질전환체(대장균 등의 숙주세포)에 형질전환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 상기 "핵산"은 유전자 또는 뉴클레오티드와 혼용될 수 있으며, 예를 들어 천연/합성 DNA, 게놈 DNA, 천연/합성 RNA, cDNA 및 cRNA로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파지미드" 벡터는 파지 디스플레이에 사용되고, 파지복제시작점(phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이며, 통상적으로 항생제 내성 유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지 디스플레이에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 또는 그 일부가 포함되어 있으며, ScFv 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 형질전환체를 통해 발현된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "헬퍼 파지(helper phage)"는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 헬퍼 파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파지에 감염된 형질전환체를 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "신호서열"은 유전자의 5' 말단부분에 위치하여, 유전자로부터 코딩된 단백질이 외부로 분비될 때 필요한 신호로 기능하는 염기서열 혹은 그에 상응하는 아미노산 서열이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 숙주세포의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 인간 생식세포계 조직 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertoire)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체 가변 영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 프레임워크 영역 (framework region, FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"프레임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편의 집합은 VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκID NO: 16), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκκλκκD NO: 21), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/VκID NO: 26), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/Vλκκκ및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)/VλID NO: 31)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역 쌍에 포함된 프레임워크 영역과, 각 중쇄 가변영역별로 상이한 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 조합 및 각 경쇄 가변영역별로 상이한 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.2), FR2(SEQ ID NO.3), FR3(SEQ ID NO.4) 및 FR4(SEQ ID NO.5)를 포함하며,
VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.7), FR2(SEQ ID NO.8), FR3(SEQ ID NO.9) 및 FR4(SEQ ID NO.10)를 포함하며,
VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.12), FR2(SEQ ID NO.13), FR3(SEQ ID NO.14) 및 FR4(SEQ ID NO.15)를 포함하며,
VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.17), FR2(SEQ ID NO.18), FR3(SEQ ID NO.19) 및 FR4(SEQ ID NO.20)를 포함하며,
VκEQ ID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.22), FR2(SEQ ID NO.23), FR3(SEQ ID NO.24) 및 FR4(SEQ ID NO.25)를 포함하며,
VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.27), FR2(SEQ ID NO.28), FR3(SEQ ID NO.29) 및 FR4(SEQ ID NO.30)를 포함하며,
및 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.32), FR2(SEQ ID NO.33), FR3(SEQ ID NO.34) 및 FR4(SEQ ID NO.35)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 각 가변영역 내의 프레임워크 영역의 서열을 정리하면 하기와 같다:
| 서열정보 | 서열번호 | |
| VH3-15 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-X-WVRQAPGKGLEWV-X- YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS | 1 |
| FR1 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG | 2 |
| FR2 | WVRQAPGKGLEWV | 3 |
| FR3 | YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR | 4 |
| FR4 | WGQGTLVTVSS | 5 |
| VH3-23 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-X-WVRQAPGKGLEWV-X- YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-X- WGQGTLVTVSS | 6 |
| FR1 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG | 7 |
| FR2 | WVRQAPGKGLEWV | 8 |
| FR3 | YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR | 9 |
| FR4 | WGQGTLVTVSS | 10 |
| VH1-69 | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG-X-WVRQAPGQGLEWM-X- YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS | 11 |
| FR1 | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG | 12 |
| FR2 | WVRQAPGQGLEWM | 13 |
| FR3 | YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR | 14 |
| FR4 | WGQGTLVTVSS | 15 |
| Vκ1-39 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ-X-WYQQKPGKAPKLLIY-X- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK | 16 |
| FR1 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ | 17 |
| FR2 | WYQQKPGKAPKLLIY | 18 |
| FR3 | GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ | 19 |
| FR4 | TFGQGTKVEIK | 20 |
| Vκ3-20 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ-X-WYQQKPGQAPRLLI-X- IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK | 21 |
| FR1 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | 22 |
| FR2 | WYQQKPGQAPRLLI | 23 |
| FR3 | IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ | 24 |
| FR4 | TFGQGTKVEIK | 25 |
| Vκ3-20-2 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ-X-WYQQKPGQAPRLLI-X- IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ-X-TFGQGTKVEIK | 26 |
| FR1 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | 27 |
| FR2 | WYQQKPGQAPRLLI | 28 |
| FR3 | IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ | 29 |
| FR4 | TFGQGTKVEIK | 30 |
| Vλ1-51 | QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG-X-WYQQLPGTAPKLLI-X- RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC-X-FGGGTKLTVL | 31 |
| FR1 | QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG | 32 |
| FR2 | WYQQLPGTAPKLLI | 33 |
| FR3 | RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC | 34 |
| FR4 | FGGGTKLTVL | 35 |
| 서열정보 | 서열번호 | |
| VH3-15 | Gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgaaaccaggcggcagccttcgtttaagctgtgcagcatctggt-N-tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg-N- tacgcagcaccggtcaaaggtcgttttacgattagtcgcgatgattcgaaaaacactctttacctgcagatgaattctctgaaaacagaagataccgcagtgtattactgtgcacgt-N- tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 36 |
| FR1 | gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgaaaccaggcggcagccttcgtttaagctgtgcagcatctggt | 37 |
| FR2 | tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg | 38 |
| FR3 | tacgcagcaccggtcaaaggtcgttttacgattagtcgcgatgattcgaaaaacactctttacctgcagatgaattctctgaaaacagaagataccgcagtgtattactgtgcacgt | 39 |
| FR4 | tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 40 |
| VH3-23 | Gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgcagccaggcggcagccttcgtttaagctgtgcagcatctggt-N-tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg-N- tatgcggatagcgttaagggtcgttttaccatcagtcgcgacaactccaaaaataccctgtacttacaaatgaatagcttacgtgcggaagataccgcagtgtattactgtgcacgt-N- tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 41 |
| FR1 | gaagtgcaacttgtcgaatctggcggcggcttagtgcagccaggcggcagccttcgtttaagctgtgcagcatctggt | 42 |
| FR2 | tgggttcgtcaggcaccaggtaaaggtcttgaatgggtg | 43 |
| FR3 | tatgcggatagcgttaagggtcgttttaccatcagtcgcgacaactccaaaaataccctgtacttacaaatgaatagcttacgtgcggaagataccgcagtgtattactgtgcacgt | 44 |
| FR4 | tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 45 |
| VH1-69 | Caggtccaactggttcagtctggtgcggaagttaaaaagccaggaagttcagttaaagtcagttgtaaagcgtctggt-N-tgggttcgtcaagcaccaggacagggcttagaatggatg-N- tatgcacagaaattccaaggtcgtgttacgattacggccgatgagtccactagtaccgcctatatggaactctccagccttcgctctgaagataccgcagtgtattactgtgcacgt-N-tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 46 |
| FR1 | caggtccaactggttcagtctggtgcggaagttaaaaagccaggaagttcagttaaagtcagttgtaaagcgtctggt | 47 |
| FR2 | tgggttcgtcaagcaccaggacagggcttagaatggatg | 48 |
| FR3 | tatgcacagaaattccaaggtcgtgttacgattacggccgatgagtccactagtaccgcctatatggaactctccagccttcgctctgaagataccgcagtgtattactgtgcacgt | 49 |
| FR4 | tggggtcaaggtacactggttaccgttagctcg | 50 |
| Vκ1-39 | Gacatccaaatgacacagagcccttcttccttatccgcgtcggtaggagatcgcgttacaatcacctgccgtgcgagtcag-N-tggtatcagcagaaaccagggaaagcaccgaagctcctgatttat-N- ggcgttccgagccgttttagtggctcggggtccggcaccgacttcaccctgactatctcttcgctgcagcctgaggattttgctacctattactgtcaacag-N-acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 51 |
| FR1 | gacatccaaatgacacagagcccttcttccttatccgcgtcggtaggagatcgcgttacaatcacctgccgtgcgagtcag | 52 |
| FR2 | tggtatcagcagaaaccagggaaagcaccgaagctcctgatttat | 53 |
| FR3 | ggcgttccgagccgttttagtggctcggggtccggcaccgacttcaccctgactatctcttcgctgcagcctgaggattttgctacctattactgtcaacag | 54 |
| FR4 | acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 55 |
| Vκ3-20 | Gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgtgctacccttagctgccgtgcgagtcaa-N-tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc-N- attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatctctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag-N-acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 56 |
| FR1 | gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgtgctacccttagctgccgtgcgagtcaa | 57 |
| FR2 | tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc | 58 |
| FR3 | attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatctctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag | 59 |
| FR4 | acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 60 |
| Vκ3-20-2 | Gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgtgctacccttagctgccgtgcgagtcaa-N-tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc-N-attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatctctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag-N-acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 61 |
| FR1 | gaaattgtactgacccaaagtcctgggacactgagtctgagtccaggtgaacgtgctacccttagctgccgtgcgagtcaa | 62 |
| FR2 | tggtaccaacaaaagcctggtcaggcaccacgtctgctgatc | 63 |
| FR3 | attccggaccgtttctctggctccggctcgggtactgattttaccctgactatctctcgtttagaacctgaggattttgctgtttattactgtcaacag | 64 |
| FR4 | acattcgggcagggtaccaaagtggaaattaaa | 65 |
| Vλ1-51 | Caatcagttctgacccaacccccctctgtatccgcggcacccggtcaaaaggtgaccatctcgtgctctggc-N-tggtatcaacagcttccaggtacagcaccgaagttattgatt-N-cgtccttccggtattccggatcgtttttcggggagtaaaagtggcacctcagcaacacttggtattaccggactgcagaccggcgacgaagccgattactactgc-N-ttcggtggtggcaccaaacttacggtcctg | 66 |
| FR1 | caatcagttctgacccaacccccctctgtatccgcggcacccggtcaaaaggtgaccatctcgtgctctggc | 67 |
| FR2 | tggtatcaacagcttccaggtacagcaccgaagttattgatt | 68 |
| FR3 | cgtccttccggtattccggatcgtttttcggggagtaaaagtggcacctcagcaacacttggtattaccggactgcagaccggcgacgaagccgattactactgc | 69 |
| FR4 | ttcggtggtggcaccaaacttacggtcctg | 70 |
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)의 각 가변영역 내에 포함된 상보성 결정영역(CDR)은 잠재적인 번역 후 수식(PTM: post-translational modification)이 일어날 수 있는 아미노산이 변형되어 번역 후 수식이 발생하지 않도록 설계된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 5의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 6의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 9개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 7의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 10개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 8의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 11개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 9의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 12개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 10의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 13개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 11의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 14개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 12의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 13의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 14의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 15의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 16의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 19의 범위를 포함하며,
상기 Vκ3-20-2(SEQ ID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 20의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 21의 범위를 포함하며, 및
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 22의 범위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 23의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 24의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 23의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 24의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 25의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 26의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 9개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 27의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 10개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 28의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 11개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 29의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 12개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 30의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 13개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 31의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 14개의 아미노산 일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 32의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 33의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 34의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 35의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 36의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 37의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 38의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 39의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 37의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 38의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 40의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 41의 범위를 포함하며, 및
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 42의 범위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체의 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fv 및 scFv으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형태인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 i) 10% 이하의 redundancy(반복 서열의 비율); ii) CDR composition의 p-value > 0.05; iii) 70℃이상의 열 안정성; 및 iv) 107 이상의 다양성(library size)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 항원을 상기 항체의 집합과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항체의 집합은 상기 항체의 집합을 암호화하는 핵산이 도입된 형질전환체에 포함된 파지 표면에서 발현되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 동정 방법은 라이브러리의 형질전환체와 파지를 배양하여 파지 표면에 발현된 항체를 항원과 결합시켜 원하는 항체를 발현하는 형질전환체를 스크리닝하고, 선별하는 과정을 포함할 수 있다. 이러한 스크리닝 및 선별 단계는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 라이브러리로부터 패닝(panning) 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 항체를 분리하여 제작할 수 있다. 상기 패닝은 특정 항원(target antigen)에 파지를 결합시키고 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 결합된 파지를 회수하여 숙주세포에 감염시킴으로써 파지 수를 증폭하고, 이 과정을 2-4회 반복하는 과정을 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1) Asian과 Caucasian의 인간가변영역 cDNA 확보.
Asian과 Caucasian의 인간항체 가변영역 CDR의 아미노산 조합을 분석하기 위하여, 우선 Asian 인간 메신저 RNA는 연구소 내 연구원의 혈액 공여(IRB 실시 이전)를 통한 PBMC로부터 B-cell을 분화하여 획득하였고, Caucasian 인간 메신저 RNA는 Clontech사의 human spleen total RNA(CAT No. 636525, Lot No. 1107171A)를 구매하였다. 확보된 Asian, Caucasian 메신저 RNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, CAT No. A3802)을 이용하여 cDNA로 각각 변환하였다. 확보한 cDNA로부터 인간 가변영역 유전자를 확보하기 위하여 Asian, Caucasian cDNA 각각을 주형으로 VH1 type은 순방향 primer(표 43: 서열번호71), 역방향 primer(표 43: 서열번호72)를 첨가하고, VH3 type은 순방향 primer(표 43: 서열번호73), 역방향 primer(표43: 서열번호72)를 첨가하고, Vk1 type은 순방향 primer(표 43: 서열번호74), 역방향 primer(표 43: 서열번호75)를 첨가하고, Vk3 type은 순방향 primer(표 43: 서열번호), 역방향 primer(표 43: 서열번호75)를 첨가하고, Vλ1 type은 순방향 primer(표 43: 서열번호77), 역방향 primer(표 43: 서열번호78)를 첨가 후 각각의 cDNA, primer 혼합물을 platinum mix polymerase(Invitrogen, CAT No. 11306)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94℃에서 3분간 노출 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간 노출을 25회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT. No. 28706).
| 이름 | 염기서열 | 서열번호 |
| VH1 Fo | CARGTGCAGCTKGTGCAGTCTGG | 71 |
| JH Re | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 72 |
| VH3 Fo | GARGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 73 |
| Vk1 Fo | GACATCCAGATGACCCAGTCTCC | 74 |
| Jk Re | ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC | 75 |
| Vk3 Fo | GAAATWGTGWTGACRCAGTCTCC | 76 |
| Vλ Fo | CAGTCTGTGYTGACKCAGCCGCC | 77 |
| Jλ Re | ACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC | 78 |
실시예 2) High-throughput sequencing 용 Asian과 Caucasian의 인간항체 가변영역 라이브러리 제작.
실시예 1에서 확보한 Asian과 Caucasian의 cDNA를 high-throughput sequencing을 수행하기 위하여 각 type을 분별하기 위한 barcode를 연결하는 PCR을 수행하였다. 우선 Asian은 Asian VH1 cDNA을 주형으로 순방향 primer(표 44: 서열번호79), 역방향 primer(표 44: 서열번호89)를 첨가하고, VH3 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호80), 역방향 primer(표 44: 서열번호89)를 첨가하고, Vk1 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호81), 역방향 primer(표 44: 서열번호90)를 첨가하고, Vk3 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호82), 역방향 primer(표 44: 서열번호90)를 첨가하고, Vλ1 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호83), 역방향 primer(표 44: 서열번호91)를 첨가 후 각각의 주형, primer 혼합물을 Prime star mix(Takara, CAT No. R040B)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94℃에서 2분간 노출 후 94℃에서 15분, 55℃에서 15분, 72℃에서 30분간 노출을 10회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT. No. 28706). Caucasian은 Caucasian VH1 cDNA을 주형으로 순방향 primer(표 44: 서열번호84), 역방향 primer(표 44: 서열번호89)를 첨가하고, VH3 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호85), 역방향 primer(표 44: 서열번호89)를 첨가하고, Vk1 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호86), 역방향 primer(표 44: 서열번호90)를 첨가하고, Vk3 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호87), 역방향 primer(표 44: 서열번호90)를 첨가하고, Vλ1 type은 순방향 primer(표 44: 서열번호88), 역방향 primer(표 44: 서열번호91)를 첨가 후 각각의 주형, primer 혼합물을 Prime star mix(Takara, CAT No. R040B)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94℃에서 2분간 노출 후 94℃에서 15분, 55℃에서 15분, 72℃에서 30분간 노출을 10회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, CAT. No. 28706).
확보한 Asian, Caucasian 별 유전자를 마크로젠(서울 구로구, 한국)에 의뢰하여 454 sequencing (GS FLX Titanium, Roche) 기법으로 표 45에 나타낸 갯수만큼 시퀀싱을 수행하였다. 표 46에 표기한 아미노산을 기준으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나뉘어 시퀀싱 된 서열의 CDR 아미노산 구성비율을 분석하였다.
| 이름 | 염기서열 | 서열번호 |
| VH1 Fo Asian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGAGTGCGTCARGTGCAGCTKGTGCAGTCTGG | 79 |
| VH3 Fo Asian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGAGTGCGTCARGTGCAGCTKGTGCAGTCTGG | 80 |
| Vk1 Fo Asian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACGCTCGACAGARGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 81 |
| Vk3 Fo Asian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGACGCACTCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC | 82 |
| Vλ1 Fo Asian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGCACTGTAGGAAATWGTGWTGACRCAGTCTCC | 83 |
| VH1 Fo Caucasian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCAGACACGCAGTCTGTGYTGACKCAGCCGCC | 84 |
| VH3 Fo Caucasian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATATCGCGAGCARGTGCAGCTKGTGCAGTCTGG | 85 |
| Vk1 Fo Caucasian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGTGTCTCTAGARGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 86 |
| Vk3 Fo Caucasian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCGCGTGTCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC | 87 |
| Vλ1 Fo Caucasian | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGTATCAGCGAAATWGTGWTGACRCAGTCTCC | 88 |
| JH Re | CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 89 |
| Jk Re | CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC | 90 |
| Jλ Re | CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC | 91 |
실시예 3) High-throughput sequencing 데이터를 분석 및 이를 기반으로 한 primer 디자인
High-throughput sequencing을 통하여 각 인종 및 type별로 10000개 이상의 인간가변영역 서열을 확보하였다(표 45). 확보한 인간가변영역 서열 중 CDR영역의 아미노산 조합을 확인하기 위하여 VH1 type의 CDR1은 Serine-Cysteine(Kabat 넘버 22,23번)과 Tryptophan-Valine (Kabat 넘버 36,37번) 사이, CDR2는 Glutamic acid-Tryptophan (Kabat 넘버 47,48번)과 Arginine-random-Threonine (kabat 넘버 67,68,69) 사이, CDR3는 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine (kabat 넘버 90,91,92)과 Glycine-Threonine-Leucine (kabat 넘버 103,104,105) 사이를 분석하였다. VH3 type의 CDR1은 Serine-Cysteine (Kabat 넘버 22,23번)과 Tryptophan-Valine (Kabat 넘버 36,37번) 사이, CDR2는 Glutamic acid-Tryptophan (Kabat 넘버 47,48번)과 Lysine-Glycine-Arginine (kabat 넘버 67,68,69) 사이, CDR3는 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine (kabat 넘버 90,91,92)과 Glycine-Threonine-Leucine (kabat 넘버 103,104,105) 사이를 분석하였다. Vk1의 CDR1은 Isoleucine-random-Cysteine (Kabat 넘버 21,22,23번)과 Tryptophan-Tyrosine (Kabat 넘버 35,36번) 사이, CDR2는 Isoleucine-Tyrosine (Kabat 넘버 48,49번)과 Glycine-Valine (kabat 넘버 57,58) 사이, CDR3는 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine (kabat 넘버 86,87,88)과 Glycine-Threonine-Lysine (kabat 넘버) 사이를 분석하였다. Vk3의 CDR1은 Serine-Cysteine (Kabat 넘버 22,23번)과 Tryptophan-Tyrosine (Kabat 넘버 35,36번) 사이, CDR2는 Leucine-Isoleucine (Kabat 넘버 47,48번)과 Isoleucine-Proline (kabat 넘버 58,59) 사이, CDR3는 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine (kabat 넘버 86,87,88)과 Glycine-Threonine-Lysine (kabat 넘버) 사이를 분석하였다. Vλ1의 CDR1은 Serine-Cysteine (Kabat 넘버 22,23번)과 Tryptophan-Tyrosine (Kabat 넘버 35,36번) 사이, CDR2는 Leucine-Isoleucine (Kabat 넘버 47,48번)과 Serine-Glycine (kabat 넘버 56,57) 사이, CDR3는 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine (kabat 넘버 86,87,88)과 Glycine-Threonine-Lysine (kabat 넘버) 사이를 분석하였다(표 46). VH1과 VH3 type의 경우 CDR3의 길이가 다양하기 때문에 기존 문헌을 통하여 합성라이브러리 제작 시 가장 효율적으로 항체를 선별해 낼 수 있는 길이인 아미노산 9~14개 별로 나누어 각각 분석한 후 아미노산 조합을 확인하였다.
분석 결과, 아시안과 코카시안의 CDR 아미노산 조합간의 유의미한 차이점을 발견하지 못하고 상당히 유사함을 확인하였다. VH의 CDR1, 2의 경우 다양한 아미노산의 조합을 가지고 있으나 CDR3에 비해 높은 비율로 보존되어 있는 아미노산이 존재하였다. 이는 V-gene 영역이므로 V-D-J joining이 일어나지 않아 CDR3에 비해 돌연변이 도입가능성이 낮고 구조적 안정성에 영향을 주는 residue number가 있음에 따라 보존되어야 할 아미노산이 존재하기 때문이다. VH1과 VH3의 CDR3간에도 유의미한 차이점을 발견하지 못했고, 유사한 아미노산 조합을 갖는 것을 확인하였다. 이는 VH1, VH3의 V-gene 말단이 Tyrosine-Tyrosine-Cysteine-Alanine-Arginine/Lysine으로 공통적으로 보존되어 있으며, V-D-J joining 시 D, J gene은 공통적으로 동일한 gene이 적용되기 때문이다.
분석 결과에 따라 아시안과 코카시안의 CDR 아미노산의 조합의 평균값을 구해 프라이머 코돈 디자인에 반영하였다. 또한 VH1과 VH3의 CDR3가 유사함에 따라 CDR3를 구성하는 프라이머를 공유하였다. 추가적으로 VH1의 CDR2의 kabat 넘버 52-52a-53, VH3의 CDR2에서 kabat 넘버 52a-53-54의 아미노산 N-X-S/T의 비율이 5% 가량 됨에 따라 N-glycosylation에 따른 항체 역가 감소의 우려성으로 인하여 VH1의 52, VH3의 52a의 Asparagine의 비율을 0%로 낮추어 N-glycosylation 형성 가능성을 제거하였다.
| 이름 | 서열분석 개수 |
| VH1 Asian | 33,572 |
| VH3 Asian | 27,587 |
| Vk1 Asian | 44,113 |
| Vk3 Asian | 23,762 |
| Vλ1 Asian | 16,980 |
| VH1 Caucasian | 22,455 |
| VH3 Caucasian | 22,508 |
| Vk1 Caucasian | 28,467 |
| Vk3 Caucasian | 15,260 |
| Vλ1 Caucasian | 19,381 |
| 1 | 2 | 3 | |
| VH1 Asian | SC-WV | EW-RXT | YYC-GTL |
| VH3 Asian | SC-WV | EW-KGR | YYC-GTL |
| Vk1 Asian | IXC-WY | IY-GV | YYC-GTK |
| Vk3 Asian | SC-WY | LI-IP | YYC-GTK |
| Vλ1 Asian | SC-WY | LI-SG | YYC-GTK |
| VH1 Caucasian | SC-WV | EW-RXT | YYC-GTL |
| VH3 Caucasian | SC-WV | EW-KGR | YYC-GTL |
| Vk1 Caucasian | IXC-WY | IY-GV | YYC-GTK |
| Vk3 Caucasian | SC-WY | LI-IP | YYC-GTK |
| Vλ1 Caucasian | SC-WY | LI-SG | YYC-GTK |
실시예 4) Fab 라이브러리 구축
4-1) 경쇄가변영역 라이브러리 구축
1) VL Frame sequence synthesis: Human VLκ1-39, VLκ3-20, VLλ1-51 의 frame 1 ~ 3의 서열(표 47)을 바이오니아 사(http://www.bioneer.co.kr) 에 합성을 의뢰하여 확보하였다.
| Fragment 1 | Fragment 2 | Fragment 3 | |
| VLκ1-39 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ (서열번호 17) | WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호 18) | GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ (서열번호 19) |
| VLκ3-20 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ (서열번호 22) | WYQQKPGQAPRLLI (서열번호 23) | IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ (서열번호 24) |
| VLλ1-51 | QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSG (서열번호 32) | WYQQLPGTAPKLLI (서열번호 33) | RPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC (서열번호 34) |
| CLκ | TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 133) | ||
| CLλ | QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC (서열번호 134) | ||
2) Primary PCR amplification (Fragment PCR): 각 frame 서열을 template(5 ng / reaction)로 VL CDR1 ~ CDR3 단편(Fragment 1 ~ 3)을 PCR로 증폭하였다. PCR에사용되는 Primer 서열은 표 48과 같다. 상기 서열에서 X숫자는 염기 3개를 의미하며, 서열목록 파일에서는 NNN으로 표기하였다. AccuPower Pfu PCR PreMix (Bioneer, K-2025)를 사용하여 30 cycles (95℃ for 30 sec, 50~58℃ for 30sec, 72℃ 1min)로 반응시킨다. 각각의 PCR products는 전기영동 한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28706)을 사용하여 purification 하였다.
| 이름 | 방향 | 염기서열 | 서열번호 |
| VLκ1-39_F1 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | GGCTTTCCCTGGTTTCTGCTGATACCAX5TAN5X4X3X2TAN4X1N3N2GACTCGCACN1GCAGGTGATTGTAACGCGATCTCCTAC | 93 | |
| VLκ1-39_F2 | Forward | TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC | 94 |
| Reverse | GCCACTAAAACGGCTCGGAACGCCX21X20AN10GX19AN9TX18X17ATAAATCAGGAGCTTCGGTGCTTTCCC | 95 | |
| VLκ1-39_F3 | Forward | GGCGTTCCGAGCCGTTTTAGTGGC | 96 |
| Reverse | TTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCCGAATGTX31CGGX30X29X28X27N14TN15N14N13GACAGTAATAGGTAGCAAAATCCTCAGGCTGCAG | 97 | |
| VLκ3-20_F1 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | TGCCTGACCAGGCTTTTGTTGGTACCATGCAN8CX11X10X9X8X7X6N7TN6ACTCGCACN1GCAGCTAAGGGTAGCACGTTCACCTGG | 98 | |
| VLκ3-20_F2 | Forward | GCATGGTACCAACAAAAGCCTGGTCAGGCA | 99 |
| Reverse | GGAGCCAGAGAAACGGTCCGGAATAN1CAGN12AN11CACGX26X25X24X23 X22GATCAGCAGACGTGGTGCCTGACC | 100 | |
| VLκ3-20_F3 | Forward | ATTCCGGACCGTTTCTCTGGCTCC | 101 |
| Reverse | TTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCCGAATGTX31CGGX35X34X33X32N16TGN7N16GACAGTAATAAACAGCAAAATCCTCAGGTTCTAAACG | 102 | |
| VLκ3-20-2_F1 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | TGCCTGACCAGGCTTTTGTTGGTACCATGCAN8CX16X15X14X13X12N3N2GACTCGCACN1GCAGCTAAGGGTAGCACGTTCACCTGG | 103 | |
| VLλ1-51_F1 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | TGCTGTACCTGGAAGCTGTTGATACCAX41CACX40X39X38TN18CAAN17ATTAGAX37X36GCCAGAGCACGAGATGGTCACCTTTTG | 104 | |
| VLλ1-51_F2 | Forward | TGGTATCAACAGCTTCCAGGTACAGCA | 105 |
| Reverse | ACGATCCGGAATACCGGAAGGACGX46X45X44X43X42AATCAATAACTTCGGTGCTGTACCTGG | 106 | |
| VLλ1-51_F3 | Forward | CGTCCTTCCGGTATTCCGGATCGT | 107 |
| Reverse | CGTAAGTTTGGTGCCACCACCGAAX56X55X54X53X52X51X50ATCX49X48X47GCAGTAGTAATCGGCTTCGTCGCC | 108 | |
| CLκ | Forward | GGGCAGGGTACCAAAGTGGAAATTAAACGCACGGTGGCTGCCCCTTCTGTGTTC | 109 |
| Reverse | AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA | 110 | |
| CLλ | Forward | GGTGGTGGCACCAAACTTACGGTCCTAGGCCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTC | 111 |
| Reverse | TTATCTAGAACTAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC | 112 |
서열번호 93(Vk1-39-F1), 서열번호 98(Vk 3-20-F1) 및 서열번호 103(Vk3-20-2-F1)의 N1 내지 N8은 하기 표 49와 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 93(Vk1-39-F1), 서열번호 98(Vk 3-20-F1) 및 서열번호 103(Vk3-20-2-F1)의 X1 내지 X16은 하기 표 50과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 95(Vk1-39-F2)의 N은 하기 표 51과 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 95(Vk1-39-F2)의 X는 하기 표 52와 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 100(Vk3-20-F2)의 N은 하기 표 53과 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 100(Vk3-20-F2)의 X는 하기 표 54와 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 97(VLκ) 및 서열번호 102(VLκ)의 N은 하기 표 55와 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 97(VLκ) 및 서열번호 102(VLκ)의 X는 하기 표 56과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 104(VLλ)의 N은 하기 표 57과 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 104(VLλ)의 X는 하기 표 58과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 106(VLλ2)의 X는 하기 표 59와 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 108(VLλ3)의 X는 하기 표 60과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
3) Second PCR amplification (1st Overlapping PCR): Primary PCR product(Fragment 1 ~ 3)를 template(각fragment 당 20 ng/ reaction)로 첨가하여 16 cycles (95℃ for 30sec, 55℃ for 30sec, 72℃ 1min)로 반응시켰다. PCR에사용되는 Primer 서열은 표 61과 같다. 각각의 PCR products (Variable Light chains) 는 전기영동 한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28706)을 사용하여 purification 하였다.
| 이름 | 방향 | 염기서열 | 서열번호 |
| VLκ1-39 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC | 113 | |
| VLκ3-20 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC | 113 | |
| VLκ3-20-2 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | ACTAGTGCGTTTAATTTCCACTTTGGTACCCTGCCC | 113 | |
| VLλ1-51 | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | ACTAGTACCCAGGACCGTAAGTTTGGTGCC | 114 |
4) Third PCR amplification (2nd Overlapping PCR): Purification한 1st Overlapping PCR products를 정량하여 VLκ1-39, VLκ3-20, VLκ3-20-2의 경우는 CLκ(Fragment PCR product) 와 VLλ1-51의 경우는 CLλ(Fragment PCR product)를 함께 template(각 product 당 10 ng/ reaction)로 사용하여 15 cycles (95℃ for 1min, 55 ℃ for 1min, 72℃ 1min)로 반응시켰다. PCR에 사용되는 Primer 서열은 표 62와 같다. 각각의 PCR products는 전기영동 한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28706)을 사용하여 purification 하였다.
| 이름 | 방향 | 염기서열 | 서열번호 |
| VLκ1-39_CLκ | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA | 109 | |
| VLκ3-20_CLκ | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA | 109 | |
| VLκ3-20-2_CLκ | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | AATTATCTAGAACTAGCACTCACCCCTGTTGAA | 109 | |
| VLλ1-51_CLλ | Forward | GAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAAAAAGACAGCTATCG | 92 |
| Reverse | TTATCTAGAACTAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC | 111 |
5) VL library transformation
5-a) Ligation: Variable light chain(VL)과 light chain constant (CL) region 의 overlapping PCR products에 EcoRⅠ (NEB, CAT. NO. R0101L)을 첨가하여 37℃에서 overnight(O/N) 반응시킨 후, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 purification 하였다. 여기에 XbaⅠ(NEB. CAT. NO. R0145L)를 첨가하여37℃에서 overnight(O/N) 반응시킨 후, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 purification 하였다. EcoRⅠ과 XbaⅠ으로 자른 insert DNA fragments 20 μg과linearized pComb3XTT vector(EcoRⅠ, XbaⅠ cutted) 40 μg에 T4 DNA Ligase (NEB, CAT. NO. M0203S)를 첨가하여 25℃에서 overnight(O/N) 반응시켰다.
5-b) Transformation: Ligation한 반응물을 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 정제하였다. Light chain의 각 sub-type 당 1 mL의 MC1061F'(SS320) Competent Cells (Lucigen, CAT. NO. 60512-1)에 10개의 cuvettes(100 μl/cuvette)로 나누어electroporation하였다. SB liquid media를 첨가하여total volume을 500 mL로 맞춘 후, 1시간 동안 37℃ 200 rpm 에서 shaking incubation 한 다음, Culture sup. 100 μL를 serial dilution을 통해 LB agar lop plate + carbenicillin (NaraeBiotech, CAT. NO. LN004CA)에 spreading 한 후, 37℃ overnight incubation하여 pComb3XTT-Synthetic VL library size를 확인하였다. 500 mL culture 부피 당 carbencillin (100 mg/mL) 500 μL를 넣고 37℃ 에서 overnight incubation (200 rpm) 하였다.
4-2) 중쇄가변영역 라이브러리 구축
1) VH Frame sequence synthesis: Human VH1-69, VH3-15, VH3-23 의 frame 1 ~ 3의 서열(표 63)을 바이오니아 사(http://www.bioneer.co.kr) 에 합성을 의뢰하여 확보하였다.
| Fragment 1 | Fragment 2 | Fragment 3 | |
| VH1-69 | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS(서열번호 12) | WVRQAPGQGLEWM (서열번호 13) | YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (서열번호 14) |
| VH3-15 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG (서열번호 2) | WVRQAPGKGLEWV (서열번호 3) | YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR (서열번호 4) |
| VH3-23 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (서열번호 7) | WVRQAPGKGLEWV (서열번호 8) | YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열번호 9) |
2) Primary PCR amplification (Fragment PCR): 각 frame 서열을 template(5 ng / reaction)로 VL CDR1 ~ CDR3 단편(Fragment 1 ~ 3)을 PCR로 증폭하였다. PCR에 사용되는 Primer 서열은 표 64와 같다. AccuPower Pfu PCR PreMix (Bioneer, K-2025)를 사용하여 30 cycles (95℃ for 30 sec, 50~55℃ for 30sec, 72℃ 1min)로 반응시켰다. 각각의 PCR products는 전기영동 한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28706)을 사용하여 purification 하였다.
| 이름 | 방향 | 염기서열 | 서열번호 |
| VH1-69_F1 | Forward | TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 115 |
| Reverse | CTGTCCTGGTGCTTGACGAACCCAX62N22AN20X61X60X59X58GAAX57X63ACCAGACGCTTTACAACTGACTTTAACTGAACT | 116 | |
| VH1-69_F2 | Forward | TGGGTTCGTCAAGCACCAGGACAG | 117 |
| Reverse | CGTAACACGACCTTGGAATTTCTGTGCATAX73X72X71X70X69X68X67X66GATX65X64CATCCATTCTAAGCCTTGTCCAGG | 118 | |
| VH1-69_F3_CDR9 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 120 | |
| VH1-69_F3_CDR10 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 121 | |
| VH1-69_F3_CDR11 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 122 | |
| VH1-69_F3_CDR12 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 123 | |
| VH1-69_F3_CDR13 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X123X122X112X111X110X103X102X101X100X121ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 124 | |
| VH1-69_F3_CDR14 | Forward | TATGCACAGAAATTCCAAGGTCGTGTTACGATT | 119 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 125 | |
| VH3-15_F1 | Forward | TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 115 |
| Reverse | TTTACCTGGTGCCTGACGAACCCAX62N21AN20X61X60X59X58GAAX57AN19AACCAGATGCTGCACAGCTTAAACGAAG | 126 | |
| VH3-15_F2 | Forward | TGGGTTCGTCAGGCACCAGGTAAA | 127 |
| Reverse | ACGACCTTTGACCGGTGCTGCGTAX81AN28N17AGN27X80ACN26X79X78X77X76TN25TX75X75AN24N23CACCCATTCAAGACCTTTACCTGG | 128 | |
| VH3-15_F3_CDR9 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 120 | |
| VH3-15_F3_CDR10 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 121 | |
| VH3-15_F3_CDR11 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 122 | |
| VH3-15_F3_CDR12 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 123 | |
| VH3-15_F3_CDR13 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X123X122X112X111X110X103X102X101X100X121ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 124 | |
| VH3-15_F3_CDR14 | Forward | TACGCAGCACCGGTCAAAGGTCGT | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 125 | |
| VH3-23_F1 | Forward | TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 115 |
| Reverse | TTTACCTGGTGCCTGACGAACCCAX62N21AN20X61X60X59X58GAAX57AN19AACCAGATGCTGCACAGCTTAAACGAAG | 126 | |
| VH3-23_F2 | Forward | TGGGTTCGTCAGGCACCAGGTAAA | 127 |
| Reverse | GGTAAAACGACCCTTAACGCTATCCGCATAX89X88X87X86ACN30X85X84X83GATX82TCN29CACCCATTCAAGACCTTTACCTGG | 130 | |
| VH3-23_F3_CDR9 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | CACCAGGGTCCCCTGGCCCCAX98X97X96X95X94X93X92X91X90GCGGGCGCAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 120 | |
| VH3-23_F3_CDR10 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX108X107X106X105X104X103X102X101X100X99ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 121 | |
| VH3-23_F3_CDR11 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX115X114X113X112X111X110X103X102X101X100X109ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 122 | |
| VH3-23_F3_CDR12 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX120X119X118X116X112X111X110X103X102X101X100X116ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 123 | |
| VH3-23_F3_CDR13 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX126X125X124X123X122X112X111X110X103X102X101X100X121ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 124 | |
| VH3-23_F3_CDR14 | Forward | TATGCGGATAGCGTTAAGGGTCGTTTTACC | 129 |
| Reverse | AACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCAX132X131X130X129X128X122X112X111X110X103X102X101X100X127ACGTGCACAGTAATACACTGCGGTATCTTC | 125 |
서열번호 116(VH1-69_F1) 및 서열번호 126(VH3-15_F)의 N은 하기 표 65와 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 116(VH1-69_F1) 및 서열번호 126(VH3-15_F)의 X는 하기 표 66과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 118(VH1-69_F2) 의 X는 하기 표 67과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 128(VH3-15_F2)의 N은 하기 표 68과 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 128(VH3-15_F2)의 X는 하기 표 69와 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 130(VH3-23_F2)의 N은 하기 표 70과 같은 염기의 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 130(VH3-23_F2)의 X는 하기 표 71과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 120(VH1-69_F3_CDR9, VH3-15_F3_CDR9, VH3-23_F3_CDR9)의 X는 하기 표 72와 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 121(VH1-69_F3_CDR10, VH3-15_F3_CDR10, VH3-23_F3_CDR10), 서열번호 122(VH1-69_F3_CDR11, VH3-15_F3_CDR11, VH3-23_F3_CDR11), 서열번호 123(VH1-69_F3_CDR12, VH3-15_F3_CDR12, VH3-23_F3_CDR12), 서열번호 124(VH1-69_F3_CDR13, VH3-15_F3_CDR13, VH3-23_F3_CDR13) 및 서열번호 125(VH1-69_F3_CDR14, VH3-15_F3_CDR14, VH3-23_F3_CDR14)의 X는 하기 표 73과 같은 코돈 비율을 가지도록 설계하여 PCR을 수행하였다.
3) Second PCR amplification (1st Overlapping PCR): Primary PCR product(Fragment 1 ~ 3)를 template(각fragment 당 40 ng/ reaction)로 첨가하여 16 cycles (95℃ for 30 sec, 50~55℃ for 30sec, 72℃ 1min)로 반응시켰다. PCR에사용되는 Primer 서열은 표 74와 같다. 각각의 PCR products (Variable heavy chains) 는 전기영동 한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28706)을 사용하여 purification 한다.
| 이름 | 방향 | 염기서열 | 서열번호 |
| VH1-69 | Forward | GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 131 |
| Reverse | GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCA | 132 | |
| VH3-15 | Forward | GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 131 |
| Reverse | GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCA | 132 | |
| VH3-23 | Forward | GCTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCT | 131 |
| Reverse | GGGCCCTTGGTGGAGGCCGAGCTAACGGTAACCAGTGTACCTTGACCCCA | 132 |
4) Fab library transformation
4-a) Ligation: Variable heavy chain(VH) 의 PCR products에 XbaⅠ(NEB. CAT. NO. R0145L)을 첨가하여 37℃에서 6시간 반응시킨 후, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 purification 하였다. 여기에 ApaⅠ(NEB. CAT. NO. R0114L)를 첨가하여25℃에서 6시간 반응시킨 후, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 purification 하였다. XbaⅠ과 apaⅠ으로 자른 insert DNA fragments 10 μg과linearized pComb3XTT vector(EcoRⅠ, XbaⅠ cutted) 40 μg에 T4 DNA Ligase (NEB, CAT. NO. M0203S)를 첨가하여 25℃에서 overnight(O/N) 반응시켰다. 이때 CDR3의 길이에 따라 전체 DNA양의 비율에서CDR3_9AA(amino acid) lengths는 12%, CDR3_10AA lengths는 14%, CDR3_11AA lengths는 17%, CDR3_12AA lengths는 22%, CDR3_13AA lengths는 19%, CDR3_14AA lengths는 16%가 되도록 조정하였다.
4-b) Transformation: Ligation한 반응물을 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAT. NO. 28106)를 사용하여 purification 하였다. Heavy chain의 각 sub-type 당 1 mL의 XL1-Blue Electroporation-Competent Cells (Stratagene, CAT. NO. 200228)에 10개의 cuvettes(100 μl/cuvette)로 나누어 electroporation 하였다. SB liquid media를 첨가하여total volume을 500 mL로 맞춘 후, 1시간 동안 37℃ 200 rpm 에서 shaking incubation 하였다. Culture sup. 100 μL를 serial dilution을 통해 LB agar lop plate + carbenicillin (NaraeBiotech, CAT. NO. LN004CA)에 spreading 한 후 37℃ overnight incubation하여 pComb3XTT-Synthetic VL library size를 확인하였다. 500 mL culture 부피 당 carbencillin (100 mg/mL) 500 μL를 넣고 37℃ 에서 overnight incubation (200 rpm) 하였다.
실시예 5) Fab 라이브러리 성능 확인
5-1) 라이브러리 사이즈 확인
Fab library는 3개의 VH type, 4개의 VL type을 이용하여 총 12개의 라이브러리를 각각 1010사이즈 이상으로 구축하여 총 1.52x1011 size의 Fab 라이브러리를 구축한 것을 확인하였으며, scFv library는 2개의 VH type, 4개의 VL type을 이용하여 총 8개의 라이브러리를 각각 1011사이즈 이상으로 구축하여 총 1.27x1012 size의 scFv 라이브러리를 구축한 것을 확인하였다.
5-2) 라이브러리 CDR 아미노산 분포 확인
HT-Sequencing을 이용하여 얻은 human germline CDR서열과 실제 구축된 라이브러리의 CDR서열을 비교하여 재현수준을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 설계한 만큼의 아미노산 다양성을 확보한 것을 확인할 수 있었다.
이를 정량적으로 분석하기 위하여 paired-T test를 이용하여 분석하였다.
그 결과 모든 라이브러리 도입 site의 유의수준이 5%이하임을 확인하여, Human germline CDR을 기반한 디자인과 실제 라이브러리의 mutation서열이 동등한 것을 확인할 수 있었다.
5-3) 반복 서열(redundancy, repetitive sequence) 분포 확인
HT-sequencing을 이용하여 각 라이브러리 서열을 약 10000개씩 분석하여 반복되는 서열의 비율을 도출하였다.
그 결과, VH3-15, VH3-23 type은 10%이하, VH1-69는 13~21%의 반복서열을 보유. 전체 평균으로 10.5%의 반복서열 비율을 보유하는 것을 확인하였으며(표 77), 도 3에 개시된 바와 같이 반복서열 중 대부분이 2번 반복이므로 라이브러리 품질을 낮추는 영향이 미미한 것을 확인하였다.
5-4) CDR 길이 분석
Human germline VH CDR3서열을 HT-sequencing을 통하여 길이 별 분포를 확인하였고, 이를 라이브러리에 재현 후 HT-sequencing을 통해 비교분석하였다.
그 결과 도 4에 개시된 바와 같이, human germline서열의 길이 별 분포와 라이브러리의 CDR 길이가 유사하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Mogam Institute for Biomedical Research
<120> Antibody library and Screening Method of Antibody by Using the
Same
<130> P17-B211
<160> 134
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> VH3-15
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly
35 40 45
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
50 55 60
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75 80
Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
85 90
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> VH3-15_FR1
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<211> 13
<212> PRT
<213> VH3-15_FR2
<400> 3
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> VH3-15_FR3
<400> 4
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> VH3-15_FR4
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 6
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<212> PRT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
35 40 45
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75 80
Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
85 90
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> VH3-23_FR1
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<212> PRT
<213> VH3-23_FR2
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212> PRT
<213> VH3-23_FR3
<400> 9
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> VH3-23_FR4
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 92
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<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75 80
Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
85 90
<210> 12
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<212> PRT
<213> VH1-69_FR1
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
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<211> 13
<212> PRT
<213> VH1-69_FR2
<400> 13
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10
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<212> PRT
<213> VH1-69_FR3
<400> 14
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Gly Val Pro Ser
35 40 45
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
50 55 60
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Thr
65 70 75 80
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
85 90
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<212> PRT
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<212> PRT
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
Gln Gln
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
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<212> PRT
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<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Xaa Ile Pro Asp Arg Phe
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Thr Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10
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<212> PRT
<213> Vκ3-20_FR3
<400> 24
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
Gln
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Vκ3-20_FR4
<400> 25
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 88
<212> PRT
<213> Vκ3-20-2
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<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Xaa Ile Pro Asp Arg Phe
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Thr Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
20 25
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<212> PRT
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<400> 28
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<211> 33
<212> PRT
<213> Vκ3-20-2_FR3
<400> 29
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
Gln
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<212> PRT
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 31
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
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Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Xaa Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Xaa Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
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50 55 60
Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Xaa Phe Gly Gly Gly
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<211> 24
<212> PRT
<213> Vλ1-51_FR1
<400> 32
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
20
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> Vλ1-51_FR2
<400> 33
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10
<210> 34
<211> 35
<212> PRT
<213> Vλ1-51_FR3
<400> 34
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp
20 25 30
Tyr Tyr Cys
35
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Vλ1-51_FR4
<400> 35
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 270
<212> DNA
<213> VH3-15_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (237)..(237)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
gaagtgcaac ttgtcgaatc tggcggcggc ttagtgaaac caggcggcag ccttcgttta 60
agctgtgcag catctggtnt gggttcgtca ggcaccaggt aaaggtcttg aatgggtgnt 120
acgcagcacc ggtcaaaggt cgttttacga ttagtcgcga tgattcgaaa aacactcttt 180
acctgcagat gaattctctg aaaacagaag ataccgcagt gtattactgt gcacgtntgg 240
ggtcaaggta cactggttac cgttagctcg 270
<210> 37
<211> 78
<212> DNA
<213> VH3-15_FR1_D
<400> 37
gaagtgcaac ttgtcgaatc tggcggcggc ttagtgaaac caggcggcag ccttcgttta 60
agctgtgcag catctggt 78
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> VH3-15_FR2_D
<400> 38
tgggttcgtc aggcaccagg taaaggtctt gaatgggtg 39
<210> 39
<211> 117
<212> DNA
<213> VH3-15_FR3_D
<400> 39
tacgcagcac cggtcaaagg tcgttttacg attagtcgcg atgattcgaa aaacactctt 60
tacctgcaga tgaattctct gaaaacagaa gataccgcag tgtattactg tgcacgt 117
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> VH3-15_FR4_D
<400> 40
tggggtcaag gtacactggt taccgttagc tcg 33
<210> 41
<211> 270
<212> DNA
<213> VH3-23_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (237)..(237)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
gaagtgcaac ttgtcgaatc tggcggcggc ttagtgcagc caggcggcag ccttcgttta 60
agctgtgcag catctggtnt gggttcgtca ggcaccaggt aaaggtcttg aatgggtgnt 120
atgcggatag cgttaagggt cgttttacca tcagtcgcga caactccaaa aataccctgt 180
acttacaaat gaatagctta cgtgcggaag ataccgcagt gtattactgt gcacgtntgg 240
ggtcaaggta cactggttac cgttagctcg 270
<210> 42
<211> 78
<212> DNA
<213> VH3-23_FR1_D
<400> 42
gaagtgcaac ttgtcgaatc tggcggcggc ttagtgcagc caggcggcag ccttcgttta 60
agctgtgcag catctggt 78
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> VH3-23_FR2_D
<400> 43
tgggttcgtc aggcaccagg taaaggtctt gaatgggtg 39
<210> 44
<211> 117
<212> DNA
<213> VH3-23_FR3_D
<400> 44
tatgcggata gcgttaaggg tcgttttacc atcagtcgcg acaactccaa aaataccctg 60
tacttacaaa tgaatagctt acgtgcggaa gataccgcag tgtattactg tgcacgt 117
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> VH3-23_FR4_D
<400> 45
tggggtcaag gtacactggt taccgttagc tcg 33
<210> 46
<211> 270
<212> DNA
<213> VH1-69_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (237)..(237)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
caggtccaac tggttcagtc tggtgcggaa gttaaaaagc caggaagttc agttaaagtc 60
agttgtaaag cgtctggtnt gggttcgtca agcaccagga cagggcttag aatggatgnt 120
atgcacagaa attccaaggt cgtgttacga ttacggccga tgagtccact agtaccgcct 180
atatggaact ctccagcctt cgctctgaag ataccgcagt gtattactgt gcacgtntgg 240
ggtcaaggta cactggttac cgttagctcg 270
<210> 47
<211> 78
<212> DNA
<213> VH1-69_FR1_D
<400> 47
caggtccaac tggttcagtc tggtgcggaa gttaaaaagc caggaagttc agttaaagtc 60
agttgtaaag cgtctggt 78
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> VH1-69_FR2_D
<400> 48
tgggttcgtc aagcaccagg acagggctta gaatggatg 39
<210> 49
<211> 117
<212> DNA
<213> VH1-69_FR3_D
<400> 49
tatgcacaga aattccaagg tcgtgttacg attacggccg atgagtccac tagtaccgcc 60
tatatggaac tctccagcct tcgctctgaa gataccgcag tgtattactg tgcacgt 117
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> VH1-69_FR4_D
<400> 50
tggggtcaag gtacactggt taccgttagc tcg 33
<210> 51
<211> 264
<212> DNA
<213> Vκ1-39_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (128)..(128)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (231)..(231)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
gacatccaaa tgacacagag cccttcttcc ttatccgcgt cggtaggaga tcgcgttaca 60
atcacctgcc gtgcgagtca gntggtatca gcagaaacca gggaaagcac cgaagctcct 120
gatttatngg cgttccgagc cgttttagtg gctcggggtc cggcaccgac ttcaccctga 180
ctatctcttc gctgcagcct gaggattttg ctacctatta ctgtcaacag nacattcggg 240
cagggtacca aagtggaaat taaa 264
<210> 52
<211> 81
<212> DNA
<213> Vκ1-39_FR1_D
<400> 52
gacatccaaa tgacacagag cccttcttcc ttatccgcgt cggtaggaga tcgcgttaca 60
atcacctgcc gtgcgagtca g 81
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> Vκ1-39_FR2_D
<400> 53
tggtatcagc agaaaccagg gaaagcaccg aagctcctga tttat 45
<210> 54
<211> 102
<212> DNA
<213> Vκ1-39_FR3_D
<400> 54
ggcgttccga gccgttttag tggctcgggg tccggcaccg acttcaccct gactatctct 60
tcgctgcagc ctgaggattt tgctacctat tactgtcaac ag 102
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> Vκ1-39_FR4_D
<400> 55
acattcgggc agggtaccaa agtggaaatt aaa 33
<210> 56
<211> 258
<212> DNA
<213> Vκ3-20_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (125)..(125)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(225)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
gaaattgtac tgacccaaag tcctgggaca ctgagtctga gtccaggtga acgtgctacc 60
cttagctgcc gtgcgagtca antggtacca acaaaagcct ggtcaggcac cacgtctgct 120
gatcnattcc ggaccgtttc tctggctccg gctcgggtac tgattttacc ctgactatct 180
ctcgtttaga acctgaggat tttgctgttt attactgtca acagnacatt cgggcagggt 240
accaaagtgg aaattaaa 258
<210> 57
<211> 81
<212> DNA
<213> Vκ3-20_FR1_D
<400> 57
gaaattgtac tgacccaaag tcctgggaca ctgagtctga gtccaggtga acgtgctacc 60
cttagctgcc gtgcgagtca a 81
<210> 58
<211> 42
<212> DNA
<213> Vκ3-20_FR2_D
<400> 58
tggtaccaac aaaagcctgg tcaggcacca cgtctgctga tc 42
<210> 59
<211> 99
<212> DNA
<213> Vκ3-20_FR3_D
<400> 59
attccggacc gtttctctgg ctccggctcg ggtactgatt ttaccctgac tatctctcgt 60
ttagaacctg aggattttgc tgtttattac tgtcaacag 99
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> Vκ3-20_FR4_D
<400> 60
acattcgggc agggtaccaa agtggaaatt aaa 33
<210> 61
<211> 258
<212> DNA
<213> Vκ3-20-2_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (125)..(125)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(225)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 61
gaaattgtac tgacccaaag tcctgggaca ctgagtctga gtccaggtga acgtgctacc 60
cttagctgcc gtgcgagtca antggtacca acaaaagcct ggtcaggcac cacgtctgct 120
gatcnattcc ggaccgtttc tctggctccg gctcgggtac tgattttacc ctgactatct 180
ctcgtttaga acctgaggat tttgctgttt attactgtca acagnacatt cgggcagggt 240
accaaagtgg aaattaaa 258
<210> 62
<211> 81
<212> DNA
<213> Vκ3-20-2_FR1_D
<400> 62
gaaattgtac tgacccaaag tcctgggaca ctgagtctga gtccaggtga acgtgctacc 60
cttagctgcc gtgcgagtca a 81
<210> 63
<211> 42
<212> DNA
<213> Vκ3-20-2_FR2_D
<400> 63
tggtaccaac aaaagcctgg tcaggcacca cgtctgctga tc 42
<210> 64
<211> 99
<212> DNA
<213> Vκ3-20-2_FR3_D
<400> 64
attccggacc gtttctctgg ctccggctcg ggtactgatt ttaccctgac tatctctcgt 60
ttagaacctg aggattttgc tgtttattac tgtcaacag 99
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> Vκ3-20-2_FR4_D
<400> 65
acattcgggc agggtaccaa agtggaaatt aaa 33
<210> 66
<211> 252
<212> DNA
<213> Vλ1-51_D
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (222)..(222)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 66
caatcagttc tgacccaacc cccctctgta tccgcggcac ccggtcaaaa ggtgaccatc 60
tcgtgctctg gcntggtatc aacagcttcc aggtacagca ccgaagttat tgattncgtc 120
cttccggtat tccggatcgt ttttcgggga gtaaaagtgg cacctcagca acacttggta 180
ttaccggact gcagaccggc gacgaagccg attactactg cnttcggtgg tggcaccaaa 240
cttacggtcc tg 252
<210> 67
<211> 72
<212> DNA
<213> Vλ1-51_FR1_D
<400> 67
caatcagttc tgacccaacc cccctctgta tccgcggcac ccggtcaaaa ggtgaccatc 60
tcgtgctctg gc 72
<210> 68
<211> 42
<212> DNA
<213> Vλ1-51_FR2_D
<400> 68
tggtatcaac agcttccagg tacagcaccg aagttattga tt 42
<210> 69
<211> 105
<212> DNA
<213> Vλ1-51_FR3_D
<400> 69
cgtccttccg gtattccgga tcgtttttcg gggagtaaaa gtggcacctc agcaacactt 60
ggtattaccg gactgcagac cggcgacgaa gccgattact actgc 105
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> Vλ1-51_FR4_D
<400> 70
ttcggtggtg gcaccaaact tacggtcctg 30
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> VH1 Fo
<400> 71
cargtgcagc tkgtgcagtc tgg 23
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> JH Re
<400> 72
tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 24
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> VH3 Fo
<400> 73
gargtgcagc tggtggagtc tgg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Vk1 Fo
<400> 74
gacatccaga tgacccagtc tcc 23
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> Jk Re
<400> 75
acgtttgatt tccaccttgg tccc 24
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Vk3 Fo
<400> 76
gaaatwgtgw tgacrcagtc tcc 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Vλ Fo
<400> 77
cagtctgtgy tgackcagcc gcc 23
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Jλ Re
<400> 78
acctaggacg gtcagcttgg tccc 24
<210> 79
<211> 63
<212> DNA
<213> VH1 Fo asian
<400> 79
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgagtgcgt cargtgcagc tkgtgcagtc 60
tgg 63
<210> 80
<211> 63
<212> DNA
<213> VH3 Fo asian
<400> 80
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgagtgcgt cargtgcagc tkgtgcagtc 60
tgg 63
<210> 81
<211> 63
<212> DNA
<213> Vk1 Fo asian
<400> 81
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgctcgaca gargtgcagc tggtggagtc 60
tgg 63
<210> 82
<211> 63
<212> DNA
<213> Vk3 Fo asian
<400> 82
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag agacgcactc gacatccaga tgacccagtc 60
tcc 63
<210> 83
<211> 63
<212> DNA
<213> Vλ1 Fo asian
<400> 83
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag agcactgtag gaaatwgtgw tgacrcagtc 60
tcc 63
<210> 84
<211> 63
<212> DNA
<213> VH1 Fo caucasian
<400> 84
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atcagacacg cagtctgtgy tgackcagcc 60
gcc 63
<210> 85
<211> 63
<212> DNA
<213> VH3 Fo caucasian
<400> 85
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atatcgcgag cargtgcagc tkgtgcagtc 60
tgg 63
<210> 86
<211> 63
<212> DNA
<213> Vk1 Fo caucasian
<400> 86
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cgtgtctcta gargtgcagc tggtggagtc 60
tgg 63
<210> 87
<211> 63
<212> DNA
<213> Vk3 Fo caucasian
<400> 87
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctcgcgtgtc gacatccaga tgacccagtc 60
tcc 63
<210> 88
<211> 63
<212> DNA
<213> Vλ1 Fo caucasian
<400> 88
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tagtatcagc gaaatwgtgw tgacrcagtc 60
tcc 63
<210> 89
<211> 54
<212> DNA
<213> JH Re_2
<400> 89
cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 54
<210> 90
<211> 54
<212> DNA
<213> Jk Re_2
<400> 90
cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag acgtttgatt tccaccttgg tccc 54
<210> 91
<211> 54
<212> DNA
<213> Jλ Re_2
<400> 91
cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag acctaggacg gtgaccttgg tccc 54
<210> 92
<211> 39
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F1_F
<400> 92
gaattcagga ggaatttaaa atgaaaaaga cagctatcg 39
<210> 93
<211> 87
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(50)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 93
ggctttccct ggtttctgct gataccannn tannnnnnnn nntannnnnn gactcgcacn 60
gcaggtgatt gtaacgcgat ctcctac 87
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F2_F
<400> 94
tggtatcagc agaaaccagg gaaagcc 27
<210> 95
<211> 72
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 95
gccactaaaa cggctcggaa cgccnnnnnn angnnnantn nnnnnataaa tcaggagctt 60
cggtgctttc cc 72
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F3_F
<400> 96
ggcgttccga gccgttttag tggc 24
<210> 97
<211> 90
<212> DNA
<213> VLκ1-39_F3_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(52)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(56)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 97
tttaatttcc actttggtac cctgcccgaa tgtnnncggn nnnnnnnnnn nntnnngaca 60
gtaataggta gcaaaatcct caggctgcag 90
<210> 98
<211> 93
<212> DNA
<213> VLκ3-20_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(55)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 98
tgcctgacca ggcttttgtt ggtaccatgc ancnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntnact 60
cgcacngcag ctaagggtag cacgttcacc tgg 93
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> VLκ3-20_F2_F
<400> 99
gcatggtacc aacaaaagcc tggtcaggca 30
<210> 100
<211> 75
<212> DNA
<213> VLκ3-20_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 100
ggagccagag aaacggtccg gaatancagn ancacgnnnn nnnnnnnnnn ngatcagcag 60
acgtggtgcc tgacc 75
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> VLκ3-20_F3_F
<400> 101
attccggacc gtttctctgg ctcc 24
<210> 102
<211> 93
<212> DNA
<213> VLκ3-20_F3_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(52)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(56)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 102
tttaatttcc actttggtac cctgcccgaa tgtnnncggn nnnnnnnnnn nntgnngaca 60
gtaataaaca gcaaaatcct caggttctaa acg 93
<210> 103
<211> 87
<212> DNA
<213> VLκ3-20-2_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(50)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 103
tgcctgacca ggcttttgtt ggtaccatgc ancnnnnnnn nnnnnnnnnn gactcgcacn 60
gcagctaagg gtagcacgtt cacctgg 87
<210> 104
<211> 87
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 104
tgctgtacct ggaagctgtt gataccannn cacnnnnnnn nntncaanat tagannnnnn 60
gccagagcac gagatggtca ccttttg 87
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F2_F
<400> 105
tggtatcaac agcttccagg tacagca 27
<210> 106
<211> 66
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 106
acgatccgga ataccggaag gacgnnnnnn nnnnnnnnna atcaataact tcggtgctgt 60
acctgg 66
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F3_F
<400> 107
cgtccttccg gtattccgga tcgt 24
<210> 108
<211> 81
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F3_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 108
cgtaagtttg gtgccaccac cgaannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnatcnn nnnnnnngca 60
gtagtaatcg gcttcgtcgc c 81
<210> 109
<211> 54
<212> DNA
<213> CLκ_F
<400> 109
gggcagggta ccaaagtgga aattaaacgc acggtggctg ccccttctgt gttc 54
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> CLκ_R
<400> 110
aattatctag aactagcact cacccctgtt gaa 33
<210> 111
<211> 54
<212> DNA
<213> CLλ_F
<400> 111
ggtggtggca ccaaacttac ggtcctaggc cagcccaagg ccaaccccac tgtc 54
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> CLλ_R
<400> 112
ttatctagaa ctaacattct gtaggggcca ctgtcttctc 40
<210> 113
<211> 36
<212> DNA
<213> VLκ1-39_R
<400> 113
actagtgcgt ttaatttcca ctttggtacc ctgccc 36
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> VLλ1-51_F
<400> 114
actagtaccc aggaccgtaa gtttggtgcc 30
<210> 115
<211> 48
<212> DNA
<213> VH1-69_F1_F
<400> 115
ttctagataa ttaattagga ggaatttaaa atgaaatacc tattgcct 48
<210> 116
<211> 84
<212> DNA
<213> VH1-69_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 116
ctgtcctggt gcttgacgaa cccannnnan nnnnnnnnnn nngaannnnn naccagacgc 60
tttacaactg actttaactg aact 84
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> VH1-69_F2_F
<400> 117
tgggttcgtc aagcaccagg acag 24
<210> 118
<211> 87
<212> DNA
<213> VH1-69_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 118
cgtaacacga ccttggaatt tctgtgcata nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngatnnn 60
nnncatccat tctaagcctt gtccagg 87
<210> 119
<211> 33
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR9_F
<400> 119
tatgcacaga aattccaagg tcgtgttacg att 33
<210> 120
<211> 78
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR9_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 120
caccagggtc ccctggcccc annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngc gggcgcagta 60
atacactgcg gtatcttc 78
<210> 121
<211> 87
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR10_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 121
aacggtaacc agtgtacctt gaccccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnacg 60
tgcacagtaa tacactgcgg tatcttc 87
<210> 122
<211> 90
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR11_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 122
aacggtaacc agtgtacctt gaccccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
acgtgcacag taatacactg cggtatcttc 90
<210> 123
<211> 93
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR12_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 123
aacggtaacc agtgtacctt gaccccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnacgtgca cagtaataca ctgcggtatc ttc 93
<210> 124
<211> 96
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR13_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 124
aacggtaacc agtgtacctt gaccccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnacgt gcacagtaat acactgcggt atcttc 96
<210> 125
<211> 99
<212> DNA
<213> VH1-69_F3_CDR14_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(69)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 125
aacggtaacc agtgtacctt gaccccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnna cgtgcacagt aatacactgc ggtatcttc 99
<210> 126
<211> 78
<212> DNA
<213> VH3-15_F1_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 126
tttacctggt gcctgacgaa cccannnnan nnnnnnnnnn nngaannnan aaccagatgc 60
tgcacagctt aaacgaag 78
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> VH3-15_F2_F
<400> 127
tgggttcgtc aggcaccagg taaa 24
<210> 128
<211> 78
<212> DNA
<213> VH3-15_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 128
caccagggtc ccctggcccc annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngc gggcgcagta 60
atacactgcg gtatcttc 78
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> VH3-15_F3_CDR9_F
<400> 129
tacgcagcac cggtcaaagg tcgt 24
<210> 130
<211> 87
<212> DNA
<213> VH3-23_F2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 130
ggtaaaacga cccttaacgc tatccgcata nnnnnnnnnn nnacnnnnnn nnnngatnnn 60
tcncacccat tcaagacctt tacctgg 87
<210> 131
<211> 49
<212> DNA
<213> VH1-69_F
<400> 131
gctctagata attaattagg aggaatttaa aatgaaatac ctattgcct 49
<210> 132
<211> 50
<212> DNA
<213> VH1-69_R
<400> 132
gggcccttgg tggaggccga gctaacggta accagtgtac cttgacccca 50
<210> 133
<211> 106
<212> PRT
<213> CLκ
<400> 133
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 134
<211> 104
<212> PRT
<213> CLλ
<400> 134
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
100
Claims (12)
- 항체 또는 이의 단편의 집합으로,
상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)을 포함하며,
상기 중쇄 가변영역은 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역(framework region)과,
각 중쇄 가변영역별로 상이한 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1), 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 및 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)의 조합을 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 VκID NO: 16), Vκκ및 VλID NO: 31)로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역에 포함된 프레임워크 영역과,
각 경쇄 가변영역별로 상이한 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1), 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2) 및 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항에 있어서,
VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκID NO: 16), VH3-15(SEQ ID NO: 1)/VκκλH3-23(SEQ ID NO: 6)/VκID NO: 16), VH3-23(SEQ ID NO: 6)/VκκλκκID NO: 21), VH1-69(SEQ ID NO: 11)/VκID NO: 26) 및 VH1-69(SEQ ID NO: 11)/VλID NO: 31)으로 구성된 군에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역 쌍에 포함된 프레임워크 영역과,
각 중쇄 가변영역별로 상이한 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 조합 및 각 경쇄 가변영역별로 상이한 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.2), FR2(SEQ ID NO.3), FR3(SEQ ID NO.4) 및 FR4(SEQ ID NO.5)를 포함하며,
VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.7), FR2(SEQ ID NO.8), FR3(SEQ ID NO.9) 및 FR4(SEQ ID NO.10)를 포함하며,
VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.12), FR2(SEQ ID NO.13), FR3(SEQ ID NO.14) 및 FR4(SEQ ID NO.15)를 포함하며,
VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.17), FR2(SEQ ID NO.18), FR3(SEQ ID NO.19) 및 FR4(SEQ ID NO.20)를 포함하며,
VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.22), FR2(SEQ ID NO.23), FR3(SEQ ID NO.24) 및 FR4(SEQ ID NO.25)를 포함하며,
VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.27), FR2(SEQ ID NO.28), FR3(SEQ ID NO.29) 및 FR4(SEQ ID NO.30)를 포함하며,
및 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 프레임워크 영역은 FR1(SEQ ID NO.32), FR2(SEQ ID NO.33), FR3(SEQ ID NO.34) 및 FR4(SEQ ID NO.35)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서.
상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 쌍(pair)의 각 가변영역 내에 포함된 상보성 결정영역(CDR)은 잠재적인 번역 후 수식(PTM: post-translational modification)이 일어날 수 있는 아미노산이 변형되어 번역 후 수식이 발생하지 않도록 설계된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 3의 범위를 포함하며,
상기 VH3-23(SEQ ID NO: 6)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 4의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 1(CDRH1) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 5의 범위를 포함하며,
상기 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 2(CDRH2) 내 위치 별 아미노산 비율은 표 6의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 9개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 7의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 10개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 8의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 11개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 9의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 12개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 10의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 13개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 11의 범위를 포함하며,
상기 VH3-15(SEQ ID NO: 1), VH3-23(SEQ ID NO: 6) 또는 VH1-69(SEQ ID NO: 11)의 서열을 갖는 중쇄 가변영역 내의 중쇄 상보성 결정영역 3(CDRH3)가 14개의 아미노산일 경우, 상기 CDRH3 내 위치 별 아미노산 비율은 표 12의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 13의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 14의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 16)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 15의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 16의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 21)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 19의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 17의 범위를 포함하며,
상기 VκID NO: 26)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 18의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 1(CDRL1)내 위치 별 아미노산 비율은 표 20의 범위를 포함하며,
상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 2(CDRL2)내 위치 별 아미노산 비율은 표 21의 범위를 포함하며,
및 상기 VλID NO: 31)의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 내의 경쇄 상보성 결정영역 3(CDRL3)내 위치 별 아미노산 비율은 표 22의 범위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서.
상기 항체의 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv (scFv)2, scFv-Fc, 및 Fv으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형태인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서.
아래 i) 내지 iv)에서 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 집합:
i) 10% 이하의 redundancy(반복 서열의 비율)
ii) CDR composition의 p-value > 0.05
iii) 70℃이상의 열 안정성
iv) 107 이상의 다양성(library size).
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 상기 항체 또는 이의 단편의 집합은 상기 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산이 도입된 포함된 파지 또는 숙주세포의 표면에서 발현되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 조합.
- 제8항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균 또는 효모인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편의 조합.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산.
- (a) 항원을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편의 집합과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편을 동정하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편의 집합은 상기 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산이 도입된 파지 또는 숙주세포 표면에서 발현되는 것을 특징으로 하는 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편을 동정하는 방법.
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