KR20070102587A

KR20070102587A - 항체를 개선하기 위한 방법

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Publication number: KR20070102587A
Application number: KR1020077019945A
Authority: KR
Inventors: 마사하루 토리카이; 토시히로 나카시마
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2005-02-08
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-10-18
Also published as: EP2395026A3; CN101155832B; JP5142707B2; JP5947022B2; KR101262058B1; EP1860120A1; JP2012031211A; US9873730B2; AU2006213321A1; CA2596925C; AU2006213321B2; EP2395026A2; EP1860120A4; WO2006085518A1; AU2006213321A2; CA2596925A1; EP1860120B1; EP2395026B1; JPWO2006085518A1; US20180118813A1

Abstract

본 발명은 발현 레벨 및 안정성과 같은 항체의 특성을 개선시키는 방법을 제공한다. 인간 항체 또는 인간화 항체를 변형시킴으로써, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 얻는 방법은 인간 항체 또는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"으로 언급함) 내의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기들 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환되는 것과 상기 방법에 의하여 얻어진 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편에 의하여 특징화된다.

Description

항체를 개선하기 위한 방법{Method for improving antibody}

본 발명은 아미노산 치환에 의한 항체 분자의 분자 변형을 통하여, 발현 레벨 및 안정성과 같은 인간 항체의 특성을 개선하기 위한 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 기술은 항체의 연구 및 발전에 큰 걸림돌이 되는 낮은 생산 레벨, 또는 응집, 조작 시 변성 또는 비활성화와 같은 방해하는 문제들을 위한 수단으로 기대된다.

인간에서 생물학적 보호의 기작에 기초한 항체 약제는 그것이 특정 기능 분자를 표적화하는 분자 표적화 치료법이기 때문에 매우 기대된다. 특히, 암 및 류마티즘의 분야에서 나타나는 그 높은 효능은 최근 세계적인 개발 쇄도가 증가하고, 그것의 세계 판매 규모는 당분간 증가가 유지될 것이라 생각된다.

그러한 사회적 배경하에서, 본 기술에서 두드러진 진전이 항체 약제 및 항체 엔지니어링의 분야에서 발전되었다. 그러나 항체 분자의 수득된 클론 몇몇은 낮은 발현 레벨 및/또는 안정성 때문에, 그들의 조작에서 많은 어려움을 지니며, 그의 용액은 용이한 물질이 아니다. 상기에서 언급된 문제들은 항체의 연구 및 발전에 큰 걸림돌이다.

항체 약제의 경우에 직면한 또다른 문제점은 그의 비용이다. 비교적 많은 양 의 항체가 치료법에 필요하며, 또한 식물 및 장치에서 과다한 투자가 발생하고, 약제 치료를 위한 환자의 부담 뿐 아니라, 국가 비용이 증가된다. 이에 따라, 항체 약제의 개발을 위한 중요한 계획은 생산성을 개선시키고, 그의 비용을 낮추는 것이다.

생체에서, 항체 서열은 B 세포가 성숙하는 동안 발생하는 임의의 유전자 재조합 또는 돌연변이 생성에 의하여 생산되며, 그 중 최적화 항체 서열을 갖는 것이 선택되고 증식된다. 최적화는 주로 항원-결합 능력에 의존한다. 그러나 도메인의 안정성, H 사슬과 L 사슬 사이의 상호작용, 가변 영역과 불변 영역 사이의 상호작용, 단백질분해효소 민감성 및 분비 효율성을 포함한 많은 요소들이 복잡하게 최적화에 공헌하는 것으로 생각된다. 이에 따라, 자연의 항체 서열은 안정성의 측면으로 필수적으로 최적화되지 않는다.

분리된 항체 클론이 분석을 위한 재조합 단백질로써 발현한다면, 그것은 때때로 상당히 불안정한 것으로 발견된다. 결과적으로, 예를 들어, (1) 발현 레벨이 매우 낮거나; (2)그것이 가용성 형태로 발현되지 않고, 리폴딩을 필요로 하는 봉입체(inclusion body)로써 발현되거나; (3) 정제하는 동안 산에의 노출이 변성을 유발하거나; 또는 (4) 실온에서, 심지어 4℃에 놔두어 침전 및 변성이 발생하며, 이에 따라 반응성이 사라지는 다양한 문제들이 발생한다.

이러한 문제점들을 해결하기 위한, 첫번째 접근은 각각의 항체 클론을 위한 조작 또는 완충액의 최적 조건의 연구일 수 있다. 그러나 그러한 연구는 많은 노동력과 비용이 필요할 뿐 아니라, 몇몇 경우에, 문제점 해결의 실패에 의하여 연구원 이 장래성 있는 반응성을 가질지도 모르는 항체 클론의 다음 개발 또는 분석을 포기하도록 할 수 있다.

두번째 접근은 항체의 특성의 개선을 목표로 한 아미노산 치환 또는 분자 형태의 전환과 같은 분자 변형일 수 있다. 일반적으로, 개선된 단백질 안정성을 위한 변형은 다른 동종의 서열로부터의 더욱 보존된 아미노산의 이식과 분자 표면에 친수성을 증가시키거나 소수성 코어의 내부에 소수성을 증가시켜 패킹의 강도를 증가시키기 위한 컴퓨터 모델링을 통한 합리적인 설계를 포함한다(비-특허 참조 1).

아미노산 치환을 통한 항체 분자의 발현 레벨 또는 안정성의 개선에 관하여, 많은 기존 기록들이 각각의 항체 클론의 서열을 위한 독특한 아미노산 변형과 관련되어 있으나, 일반화될 수 있는 변형을 위한 오직 소수의 기술들만이 알려져 있다. 일반화될 수 있는 변형을 위한 그러한 기술들은 Worn et al.(비-특허 참조 2)에 의하여 기록된 바와 같이, 단일 사슬 항체(scFv)의 안정성을 개선시키기 위한 VH 내의 하나 또는 두 부위에서 아미노산 치환; Knappik et al.(비-특허 참조 3)에 의하여 기록된 바와 같이, Fv 단편의 발현 레벨을 증가시키고, 응집 반응을 억제시키기 위한 VH 내의 하나 또는 복수 부위에서 아미노산 치환; Steipe et al.(비-특허 참조 4)에 의하여 기록된 바와 같이, VL 도메인의 안정성을 개선시키기 위하여 VL 내의 하나 또는 두 부위에서의 아미노산 치환; 및 Hugo et al.(비-특허 참조 5)에 의하여 기록된 바와 같이, scFv의 발현 레벨 및 안정성을 개선시키기 위한 VL 내의 위치 34(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 치환을 포함한다. 그러나 모든 이러한 기록들에 의한 변형에 당면한 목적 항체는 마우스 항체이다.

항체 약제로써의 이용을 위하여, 마우스 항체는 인간에 투여될 때 그의 높은 항원성에 기인하여 차단되며, 외부 물질로써 인지된다. 이에 따라, 질환의 치료법을 위한 약제로써 마우스 항체를 이용하는 데 어려움이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 마우스 단일클론 항체는 단백질 엔지니어링 기술을 이용하여 키메라 항체로 전환될 수 있다. 그러나 마우스 키메라 항체는 여전히 30% 이상의 양으로 마우스로부터 유래된 서열을 함유하며, 이에 따라 그의 반복적 또는 지속적 투여는 투여된 키메라 항체의 활성을 저해하는 항체의 생산을 이끌어, 이에 따라 약제의 효능을 상당히 낮출 뿐 아니라, 심한 부작용을 유발할 것이다.

이에 따라, 이러한 문제들을 해결하기 위한 주요 접근은 마우스 가변 영역으로부터의 상보성 결정 영역(CDRs)이 인간 가변 영역 또는 인간으로부터 완전하게 유래된 서열을 갖는 인간 항체로 이식되는 인간화 항체를 작제하는 것이다.

반면, 아미노산 치환이 VH 내의 하나 또는 복수 부위에서 인간 항체를 위하여 수행되어, scFv의 발현 레벨 및 안정성을 개선시키도록 허용하는 Ewert et al.(비-특허 참조 6)에 의한 기록이 있다. 그러나, Ewert et al.에 의하여 변형된 인간 항체는 VH6 패밀리의 것이며, 상기 패밀리에 속하는 유전자의 이용 빈도는 1.4% 내지 2.4%(비-특허 참조 7)만큼 낮으며, 이는 그들의 기술을 광범위하게 실행할 수 있는 것이 아니게 한다.

상기에서 기술한 바와 같이, 질환-관련 항원을 표적화하는 특정 항체가 인간 진단 및 치료와 같은 임상 분야에서 매우 유용하기 때문에, 높은 항원 특이성, 낮은 면역원성 및 높은 생산성의 모든 특징을 갖는 항체를 제조하기 위한 기술의 확 립이 진정으로 요구된다.

비-특허 참조 1: Vriend et al., J. Comput . Aided Mol . Des ., 7(4), p.367-396 (1993)

비-특허 참조 2: Worn et al., Biochemistry, 37, p.13120-13127 (1998)

비-특허 참조 3: Knappik et al., Protein Eng ., 8(1), p.81-89 (1995)

비-특허 참조 4: Steipe et al., J. Mol . Biol ., 240, p.188-192 (1994)

비-특허 참조 5: Hugo et al., Protein Eng ., 16(5), p.381-386 (2003)

비-특허 참조 6: Ewert et al., Biochemistry, 42, p.1517-1528 (2003)

비-특허 참조 7: Brezinschek et al., J. Clin . Invest ., 99(10), p.2488-2501 (1997)

(본 발명에 의하여 해결될 기술적 문제)

본 발명에 의하여 해결될 기술적 문제는 인간에 낮은 면역원성을 갖고 있다고 알려진 인간 항체 또는 인간화 항체로부터 시작한 항체를 개선하기 위한 일반적 방법을 확립하여, 낮은 면역원성 및 특이 결합 능력이 유지되면서, 높은 생산성 및 뛰어난 안정성을 갖는 항체를 수득하는 것이다.

(문제 해결 수단)

그러한 환경 하에서, 본 발명자들은 진지하게 연구 활동을 계속하였으며, 결과적으로 다른 아미노산 서열을 갖는 인간 항체의 경쇄 가변 영역(VL 사슬)에서 아미노산(들)을 치환시킴으로써 항체의 발현 및 안정성을 유의적으로 개선시키는 데 성공하고 본 발명을 완성하였다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 항체의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"로써 언급함)의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기들 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환되는 것에 의하여 특징화된다.

이에 따라, 본 발명은 이하 서술된 바와 같은 발명 (1) 내지 (18)을 포함한다.

(1) 인간 항체 또는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"로써 언급함)의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기들 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로하는, 인간 항체 또는 인간화 항체를 변형시켜, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 수득하는 방법.

(2) VL 사슬 내 8, 12, 15 또는 18 위치에 있는 적어도 임의의 하나의 프롤린 또는 15 위치에 있는 아미노산 잔기가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 (1)에 따른 방법.

(3) 각 위치에서 아미노산 잔기가 치환 후 다음 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 (1) 또는 (2)에 따른 방법:

위치 8: Gly, Thr, Arg 또는 Ser

위치 12: Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Met 또는 Glu

위치 15: Arg, Ser, Gly 또는 Phe

위치 18: Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leu 또는 Gln.

(4) VL 사슬이 인간 Vκ1 패밀리, 인간 Vκ2 패밀리 또는 인간 Vκ3 패밀리 중 임의의 하나에 속하는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 방법.

(5) 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 각 위치의 아미노산 잔기가 치환 후 다음에 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 방법:

위치 8: Gly, Thr, Arg 또는 Ser

위치 15: Arg 또는 Ser.

(6) 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 전 DPK9 (GeneBank 수탁 번호 X59315)로부터의 서열을 갖는 (5)에 따른 방법.

(7) 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 후 서열 번호 2 내지 7에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 (5) 또는 (6)에 따른 방법.

(8) 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 각 위치의 아미노산 잔기가 치환 후 아래 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 방법:

위치 12: Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Met 또는 Glu

위치 15: Arg

위치 18: Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leu 또는 Gln.

(9) 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 전 DPK18 (GeneBank 수탁 번호 X63403)로부터의 서열을 갖는 (8)에 따른 방법.

(10) 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 후 서열 번호 9 내지 25에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 (8) 또는 (9)에 따른 방법.

(11) 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 각 위치의 아미노산 잔기가 치환 후 다음에 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 방법:

위치 15: Arg, Ser, Gly 또는 Phe.

(12) 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 전 DPK22 (GeneBank 수탁 번호 X59315)로부터의 서열을 갖는 (11)에 따른 방법.

(13) 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 후 서열 번호 27 내지 30에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 (11) 또는 (12)에 따른 방법.

(14) 항체가 완전 항체, 또는 Fab, Fab', F(ab')₂, scAb, scFv, 디아바디(diabody)[짧은 링커 펩티드에 의하여 연결된 동종 또는 이종 중쇄 가변 영역(VH 사슬) 및 VL 사슬로 구성된 재조합 다이머 항체] 또는 scFv-Fc; 또는 다른 단백질들과의 융합 항체 또는 융합 항체 단편; 또는 저분자량 화합물로 표지된 항체 또는 항체 단편; 또는 고분자량 화합물로 변형된 항체 또는 항체 단편과 같은 항체 단편인 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 따른 방법.

(15) 아미노산 치환이 유전자 재조합 기술에 의하여 수행되는 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 방법.

(16) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 방법에 의하여 수득된, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편.

(17) 각각 치환 후 VL 사슬의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 제조하고;

진핵 또는 원핵 생물의 숙주를 상기 유전자로 형질전환시키고;

상기 숙주로부터 상기 인간 항체 또는 상기 인간화 항체 또는 상기 인간 항체 단편 또는 상기 인간화 항체 단편을 발현시키고;

상기 인간 항체 또는 상기 인간화 항체 또는 상기 인간 항체 단편 또는 상기 인간화 항체 단편을 회수하는 것을 포함하여, 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"로써 언급)내의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 제조하는 방법.

(18) (17)에 나타낸 바와 같은 방법에 의하여 제조된, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편.

(종래 기술 보다 더욱 효과적인 영향)

본 발명에 따라, 아미노산 치환을 통한 인간 항체 분자의 분자 변형의 결과로써, 그것의 발현 레벨 및 안정성과 같은 항체의 특성을 매우 개선시킬 수 있게 된다. 본 발명에 따른 기술은 항체의 연구 및 개발에 큰 장애물이 되는 낮은 생산 레벨, 또는 응집, 조작시 변성 또는 비활성과 같은 방해하는 문제들을 위한 수단으로써 이용가능하다.

더욱이, 본 발명에 따라 항체를 개선시키는 방법은 그것이 인간 항체 또는 인간화 항체로부터 시작된 프레임워크 영역 내 아미노산 잔기의 변형에 목적을 두기 때문에, 진단 또는 치료 약제로써 항체 약제의 개발을 위하여 광범위하게 이용될 수 있다. 또한, 오직 단일 아미노산 잔기가 변형되기 때문에, 인간에 투여될 때 항원 유도에 관한 걱정을 최소화할 수 있다.

분자 변형을 통한 열 안정성의 개선의 관점이 생체 내에서 종양의 표적화를 증가시키기 위하여 기록되었으며(Willuda et al., Cancer Res ., 59, p.5758-5767 (1999)), 안정성의 개선이 효능에서의 증가를 이끈다고 기대된다. 그와 같이, 본 발명에 따른 항체 개선 방법은 항체 치료법의 개발에 많은 공헌을 할 것으로 기대된다. 더욱이, 항체가 의학 분야 뿐 아니라 다양한 다른 분야에서 적용될 수 있기 때문에, 본 발명은 산업 과정 또는 관련된 연구와 같은 다양한 분야에 광범위하게 적용가능할 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명의 방법에 의하여 수득되는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편은 발현 레벨 및/또는 안정성에서 탁월하며, 정제 단계 동안 응집의 형성 또는 활성의 손실에 기인한 손상을 감소시킬 수 있고, 항체 생성 또는 정제 단계에서 유용성을 제공할 수 있다. 이외에, 물론 본 발명의 방법이 뛰어난 안정성을 갖는 인간 항체 분자 또는 인간화 항체 분자를 제공하기 때문에, 약제학적 제제의 설계에서 많은 선택과 이에 따른 그들의 생산성을 위한 큰 장점을 제공하는 것이 가능할 것이다.

도 1은 Fab의 발현을 위하여 이용되는 플라스미드의 구조를 나타낸다.

도 2는 ELISA에서 세포질 분획의 기능 Fab 단백질의 발현 레벨을 위하여, 야생형 SEB3-2-7과 L 사슬 내의 위치 8에서 그것의 변형된 항체의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 3은 ELISA에서 42℃로 처리될 때 그들의 열 안정성을 위하여, 야생형 SEB3-2-7과 L 사슬 내의 위치 8에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 4는 ELISA에서 pH 4.5로 처리될 때 산에 대한 그들의 내성을 위하여, 야생형 SEB3-2-7과 L 사슬 내의 위치 8에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 5는 ELISA에서 배양 상층액 내의 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 위하여, 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 12에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 6은 ELISA에서 40℃로 처리될 때 그들의 열 안정성을 위하여, 야생형 RNOK203와 L 사슬 내의 위치 12에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 7은 ELISA에서 pH 4.0으로 처리될 때 산에 대한 그들의 내성을 위하여, 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 12에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 8은 ELISA에서 냉동-해동에 대한 그들의 내성을 위하여, 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 12에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 9는 ELISA에서 세포질 분획의 기능 Fab 단백질의 발현 레벨을 위하여, 야생형 CTLA4-3-1과 L 사슬 내의 위치 15에서 그것의 변형된 항체의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 10은 E 태그를 암호화하는 합성 올리고 DNA가 Fd 사슬의 C-말단에 삽입되는 야생형 CTLA4-3-1 Fab와 그것의 P15R 변형된 항체를 위한 발현 플라스미드의 구조를 나타낸다. 구역 (a) 및 (b)는 야생형 CTLA4-3-1 Fab 및 그것의 P15R 변형된 항체를 각각 나타낸다.

도 11은 웨스턴 블롯에서 배양 상층액 분획 및 세포질 분획 내 Fd 사슬 및 L 사슬 그들의 발현 레벨을 위하여, 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E와 그것의 P15R 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다. 구역 (a)는 HRP-표지된 항-E 태그 Ab로 검출되는 Fd 사슬을 위한 결과를 나타낸다. 구역 (b)는 HRP-표지된 항-c-myc 태그 Ab로 검출되는 L 사슬을 위한 결과를 나타낸다. 레인(Lane) 1: 마커; 레인 2: 배양 상층액 분획에서 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E; 레인 3: 배양 상층액 분획에서 P15R 변형된 CTLA4-3-1 Fab-E; 레인 4: 세포질 분획에서 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E; 및 레인 5: 세포질 분획에서 P15R 변형된 CTLA4-3-1 Fab-E.

도 12는 샌드위치 ELISA에서 배양 상층액 분획 및 세포질 분획에서 Fd 사슬/L 사슬 복합체의 그들의 발현 레벨을 위하여, 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E와 그것의 P15R 변형된 항체 사이의 비교를 나타낸 그래프이다. 구역 (a) 및 (b)는 배양 상층액 분획 및 세포질 분획, 각각을 위한 결과를 나타낸다.

도 13은 ELISA에서 28℃로 처리될 때 그들의 열 안정성을 위하여 야생형 CTLA4-3-1와 L 사슬 내의 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 14는 ELISA에서 산에 대한 그들의 내성을 위하여 야생형 CTLA4-3-1와 L 사슬 내의 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다. 구역 (a) 및 (b)는 각각 pH 4.0 및 pH 3.5에서 처리될 때 각각의 결과를 나타낸다.

도 15는 ELISA에서 배양 상층액 분획의 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 위하여 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 16은 ELISA에서 pH 5.0으로 처리될 때 산에 대한 그들의 내성을 위하여 야생형 RNOK203과 L 사슬 내 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 17은 ELISA에서 42℃로 처리될 때 그들의 열 안정성을 위하여 야생형 SEB3-2-7과 L 사슬 내 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 18은 ELISA에서 산에 대한 그들의 내성을 위하여 야생형 SEB3-2-7과 L 사슬 내 위치 15에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다. 구역 (a) 및 (b)는 pH 4.5 및 pH 4.0에서 각각 처리될 때의 결과를 나타낸다.

도 19는 ELISA에서 45℃로 처리될 때 그들의 열 안정성을 위하여 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 18에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 20은 ELISA에서 pH 4.0으로 처리될 때 산에 대한 그들의 내성을 위하여 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 18에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

도 21은 ELISA에서 냉동-해동에 대한 그들의 내성을 위하여 야생형 RNOK203과 L 사슬 내의 위치 18에서 그것의 변형된 항체 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.

본 발명을 수행하기 위한 최선의 형태

변형될 인간 항체의 VL 사슬은 λ사슬 및 κ사슬을 포함하며, 이 중에서, κ사슬은 바람직하게 마우스 L 사슬의 97%가 κ사슬(" Menekigaku Jiten " ( Dictionary of Immunology ), 2nd Ed., 2001, TOKYO KAGAKU DOJIN CO., LTD.)인 근거에 의하여 이용될 수 있으며, 이에 따라, 인간화 기술의 대부분의 경우들에서 인간 Vκ는 주형 서열로써 이용되며, κ사슬은 또한 인간 L 사슬에서 대다수, 예를 들어, 67%이 다(Knappik et al., J. Mol . Biol ., 296, p.57-86 (2000)).

덧붙여, 인간 Vκ가 Vκ1 내지 Vκ6 패밀리를 포함하는 것이 알려져있다. 전체 양으로 92%까지의 Vκ1, Vκ2 및 Vκ3의 이용 빈도는 인간 Vκ의 대부분을 포함한다(Foster et al., J. Clin . Invest ., 99(7), p.1614-1627 (1997)). 이에 따라, 이러한 세 패밀리, Vκ1, Vκ2 및 Vκ3 중 임의의 것이 바람직하게 이용될 수 있다.

항체 변형을 위한 전략으로써, 인간화 항체 VL 사슬의 입체 구조의 유지를 위하여 중요한 프레임워크(FR) 1 영역 내의 아미노산, 프롤린(Pro; P)를 표적화하는 아미노산 치환이 연구되었으며, 이는 폴딩을 위한 비율-결정이 될 것이며, α나선 및 β시트 구조를 파괴하기 위한 것으로 알려져 있다.

세부적으로, 인간 항체 또는 인간화 항체의 VL 사슬 내 위치 8, 12, 15 또는 18에서 아미노산 잔기 중 임의의 하나가 변형을 위하여 표적화된다. 본원에서 이용돤 바와 같이, Kabat et al. (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publication No. 91-3242, 1991)에 의한 숫자 구성에 따라, 항체의 VL 사슬 내의 아미노산 잔기 위치의 확인이 수행된다.

변형을 위하여, 대부분의 종래 기록들은 상기에 기재된 바와 같은 합리적 설계에 의한 접근에 관계된다. 고도로 보존된 아미노산 잔기의 이식에 의한 기술을 위한 것과 같이, 자연에서 선택된 바와 같은 항체 서열은 도메인의 안정성, H 사슬과 L 사슬 사이의 상호작용, 가변 영역과 불변 영역 사이의 상호작용, 단백질분해효소 민감성 및 세포 외로의 분비 효율과 같은 많은 요소들에 복잡하게 기인한 선 택의 결과이다. 이에 따라, 자연에서 항체 서열은 안정성에 관하여 필수적으로 최적화되지 않으며, 따라서 이러한 기술은 제한을 갖는다. 또한, 컴퓨터 모델링을 이용한 접근은 많은 노동력에도 불구하고, 실제 안정성을 보장하지 않을 것이며, 이에 따라, 현재 효율적 접근이 아니다.

이에 따라, 본 발명자들은 진전적인 엔지니어링 기술, 예를 들어, 변형을 위하여 표적화된 아미노산 잔기를 임의의 아미노산으로 임의로 치환하고, 얻어진 그룹으로부터 원하는 특성을 갖는 변형된 항체를 선택하는 것에 의하여 연구하였다.

결과적으로, 하기 실시예에서 개시된 바와 같이, 다음 아미노산 치환들 중 임의의 하나가 VL 사슬의 FR1(첫번째 내지 23번째)에서 유도되었을 때, 발현 레벨 및 안정성의 개선이 관찰될 수 있는 것이 입증되었다:

위치 8: Gly, Thr, Arg 또는 Ser

위치 12: Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Met 또는 Glu

위치 15: Arg, Ser, Gly 또는 Phe

위치 18: Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leu 또는 Gln.

VL 사슬 FR1의 본래 서열(야생형)은 치환 전 전형적으로 다음 아미노산 서열을 포함한다:

더욱 세부적으로, 본 발명에 따라 아래에 기재된 바와 같이 변형이 수행되며, 수득된 항체는 그들의 발현 레벨 및 안정성(예를 들어, 열에 대한 내성, 산에 대한 내성, 냉동-해동에 대한 내성, 등)이 평가되어, 모든 수득된 항체 내에서 놀라운 개선을 입증한다. 이하에서 이용된 바와 같이, 부호 "-"는 야생형 항체의 것과 동일한 아미노산 잔기를 의미한다.

상기에 기재된 바와 같은 변형의 임의의 것은 인간으로부터의 항체를 위하여 는 물론이고, 동물로부터 유래된 항체를 위하여 이전 특허에서 기록되거나 실행되지 않았으며, 이에 따라 본 출원에서 처음 연구된 것이다.

특히, L 사슬 내 위치 15에서 Arg(R)로 치환된 변형된 항체(P15R)는 엄청난 효과, 말하자면, 기능 분자의 발현 레벨에서 약 100-배 증가를 보유한다. Fab에서 단일 아미노산 치환을 갖는 그러한 많은 효과는 지금까지 기록되지 않았다. 더욱이, L 사슬 내의 15번째 아미노산 잔기를 Arg 또는 Ser로 치환함으로써, 발현 레벨 또는 안정성을 개선하기 위한 변형을 위한 기술이 적어도 Vκ1, Vκ2 및 Vκ3에 적용가능하며, 이에 따라, 광범위한 용도의 것이라고 입증되었다.

본 발명에 따른 아미노산 치환을 위하여, 임의의 아미노산이 VL 사슬 내의 위치 8, 12, 15 또는 18에 임의로 도입된 변형된 항체 라이브러리가 모델 항체를 이용하여 작제되었다. 모델 항체를 위하여, 인간 항-SEB 항체("SEB3-2-7"로 불리는 클론), 인간 항-CTLA-4 항체("CTLA4-3-1"로 불리는 클론) 및 인간 항-인간 FasL 항체 RNOK가 각각 Vκ1, Vκ2 및 Vκ3 패밀리를 위하여 각각 이용된다. 각각 항체의 VL 사슬 유전자 내 표적화된 아미노산의 코돈이 N이 A 또는 C 또는 G 또는 T 이며, K가 G 또는 T인 랜덤 코돈 NNK로 치환된 올리고 DNA 프라이머를 이용하여, 돌연변이된 VL 사슬의 유전자는 주형으로써 야생형 VL 사슬의 유전자를 이용한 PCR에 의하여 증폭된다. 이에 따라 돌연변이된 VL 사슬의 증폭된 유전자는 변형된 Fab 발현 플라스미드를 작제하기 위하여 야생형 Fab 발현 플라스미드 내의 VL 영역으로 교체된다. JM83은 수득된 플라스미드로 형질전환되고, 많은 클론은 수득되며, 분리되고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 발현이 유도되었다. 세포질 분획에서 Fab 의 발현은 돗트 블롯에 의하여 평가되며, 발현이 입증된 클론이 그들의 특성이 분석되었다. Fab는 E. coli에서 가용성으로 발현될 수 있으며, 가변 영역의 특성 분석에 편리한 항체 분자이다.

변형된 Fabs의 발현 레벨과 비교에 의하여, 야생형 Fab의 것보다 더 높은 발현 레벨을 갖는 클론들을 그들의 DNA 뉴클레오티드 서열을 위하여 분석하고, 그들이 각각 단일 아미노산 치환을 함유하고 있음을 입증하였다. 클론은 그들의 발현 레벨, 열 안정성, 산에 대한 내성 및 냉동-해동에 대한 내성에 대해 더 평가되었다.

발현 레벨은 예를 들어, 쉐이커-플라스크 배양에서 발현을 유도하고, ELISA를 이용하여 기능 Fab 단백질의 양으로써 회수된 배양 상층액 또는 세포질 분획의 흡광도를 평가하는 것에 의하여 클론들을 비교하고 평가할 수 있다.

열 안정성은 예를 들어, Fab가 발현되는 배양 상층액 분획 또는 세포질 분획을 희석시키고, 두시간 동안 특정 온도의 수조로 처리하고, 실온에서 샘플을 복원시키며, ELISA를 수행하고, 잔여 활성으로써 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비율을 클론들을 비교하고 평가함으로써 평가될 수 있다.

산에 대한 내성은 예를 들어, Fab가 발현되는 배양 상층액 분획 또는 세포질 분획을 희석하고, 두시간 동안 특정 pH로 적정하며, 샘플을 중화시키고, ELISA를 수행하고, 잔여 활성으로써 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비율을 클론들을 비교하고 분석함으로써 평가될 수 있다.

냉동-해동에 대한 내성은 예를 들어, Fab가 발현되는 배양 상층액 분획 또는 세포질 분획에 대해 특정 시간 동안 냉동-해동을 반복하고, ELISA를 수행하고, 잔여 활성으로써 한번의 냉동-해동 과정 대상이 된 샘플의 그것에 대하여 복수의 냉동-해동 과정 대상이 된 샘플의 흡광도의 비율을 클론들을 비교하고 평가할 수 있다.

변형의 평가의 결과로써, 본 발명자들은 상기에 기재된 바와 같은 변형이 항체의 특성을 개선시킬 수 있음을 발견하였다.

본 발명에 따라, 작제된 변형된 항체는 본래의 항체로서 뿐 아니라, Fab, Fab', F(ab')₂, scAb, scFv, 디아바디 또는 scFv-Fc와 같은 항체 단편의 형태로 이용될 수 있다. 그러한 항체 또는 항체 단편은 또한 다른 단백질 또는 펩티드들과 융합 항체일 수 있다. 발현된 항체는 또한 다양한 화학물질 또는 방사성 요소로 표지되거나, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 합성 고분자량 화합물로 변형될 수 있다.

본 발명에 따라 변형되는 항체 또는 항체 단편은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조되고, 적합한 숙주, 예를 들어, 박테리아, Bacillus subtilis , 이스트, 동물 세포에 유전자를 도입하고, 상기 항체 또는 항체 단편을 발현시킴으로써, 상기 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 유전자의 서열 정보에 기초하여 준비될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, "인간화 항체"는 가변 영역 내 그것의 상보성 결정 영역(CDRs)만이 비-인간 동물 항체의 것으로부터 유래되나, CDR을 제외한 다른 가변 영역, 예를 들어, 프레임워크 영역(FR) 뿐 아니라, 불변 영역은 인간 항체 로부터 유래된 인간 항체를 언급한다.

본 발명은 다음 실시예의 수단으로써 더욱 상세히 설명하나, 거기에 제한되는 것으로 파악하지 아니하여야 한다.

실시예 1: E. coli 균주 및 DNA

(1) E. coli 균주

JM83 균주 (Gene, 33, p.103-119 (1985))를 이용하였다.

(2) 플라스미드

플라스미드 pTrc99A-Fab-myc는 trc 프로모터의 조절하에 Fab 클론의 각각을 암호화한다. E. coli에서 더욱 효과적인 발현 및 폴딩을 허용하기 위하여, CH1 및 Cκ 영역의 C-말단에서 Cys 잔기를 Ser으로 치환하여, 분자가 사슬들 사이의 이황화 결합이 결여되도록 하였다. 더욱 용이한 검출을 위하여, c-myc 태그는 L 사슬의 C-말단에 부가된다. 세포질 및 배양 상층액으로 분비를 위하여, pelB 서열 신호(Lei et al., J. Bacteriol . 169, p.4379-4383(1987))가 두 사슬의 코딩 영역 둘다의 업스트림에 삽입된다(도 1).

(3) 올리고 DNA

본원에서 이용된 바와 같은 올리고 DNA는 SIGMA GENOSYS로부터의 것이다.

실시예 2: 항체 클론

(1) 항-SEB 항체 SEB3-2-7

본 항체는 20명의 건강한 지원자로부터 말초 혈액 림프구를 시작 물질로써 이용하여 작제된 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터 재조합 SEB 단백질을 가려냄으로써 분리된 SEB를 특이적으로 인지할 수 있는 인간 항체이다. 그것의 VH는 VH1 패밀리에 속하는 DP-75 부분으로부터 유래된 서열을 가지며, 그것의 VL은 Vκ1 패밀리에 속하는 DPK9 (GenBank 수탁 번호 X59315) 부분으로부터 유래된 서열을 갖는다. VL 도메인의 FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나타내었다.

(2) 항-FasL 항체 RNOK203

본 항체는 Fas 리간드를 특이적으로 인지하는 인간화 항체이며, Nakashima et al., J. Immunol ., 167, p.3266-3275 (2001)에 의해 기록된 바와 같은 중화 활성을 갖는다. 그것의 VL은 Vκ2 패밀리에 속하는 DPK18 (GenBank 수탁 번호 X63403) 부분으로부터 유래된 서열을 갖는다. VL 도메인의 FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 8에 나타내었다.

(3) 항-CTLA-4 항체 CTLA4-3-1

본 항체는 20명의 건강한 지원자로부터 말초 혈액 림프구를 시작 물질로써 이용하여 작제된 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터 재조합 CTLA-4 단백질을 가려냄으로써 분리된 CTLA-4를 특이적으로 인지할 수 있는 인간 항체이다. 그것의 VH는 VH1 패밀리에 속하는 DP-25 부분으로부터 유래된 서열을 가지며, 그것의 VL은 Vκ3 패밀리에 속하는 DPK22 (GenBank 수탁 번호 X59315) 부분으로부터 유래된 서열을 갖는다. VL 도메인의 FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 나타내었다.

실시예 3: 야생형 Fab 발현 플라스미드의 작제

상기에 기재된 바와 같은 종래 기술 또는 종래 기록과 반대로, 이의 대부분은 VL 도메인 단독으로 또는 sdFV를 이용하고, 항체의 변형이 본 발명에 따라 Fab를 이용하여 연구된다. 분석을 위하여 많은 시간 및 노동력이 필요한 동물 세포 내에서 발현이 필요할 IgG와 비교하여, 그것은 빠른 연구를 허용하는 박테리아 내에서 발현될 수 있다는 데 장점이 있다. 도메인 단독 또는 scFv를 위하여, 어쩌면 구조적 변화에 기인하여, 낮은 항원 친화도와 같은 특성의 변화는 VH 및 VL의 서열이 IgG 분자를 형성하기 위하여 재결합될 때, 때때로 발생하나, Fab가 IgG 분자로 전환될 때 그러한 변화가 발생하지 않는다고 알려진다. 이에 따라, Fab 분자에서 발견되는 변형의 효과는 Fab 분자가 그것의 상응하는 IgG 분자로 전환된 후에도 보유될 수 있는 높은 가능성이 있다. 현재 유효한 항체 약제의 대부분이 IgG 분자의 형태에 있다는 관점에서, 본 발명에 따라 항체를 개선시키기 위한 기술은 항체 약제의 분야에 많은 공헌을 할 것이라 기대된다.

시작 물질로써 RNOK203를 위한 IgG 발현 벡터 (벡터; pCAG: Gene 108, p.193-200, 1991), SEB3-2-7 및 CTLA4-3-1를 위한 scFv 플라스미드 (벡터; pCANTAB5E)를 이용하여, VH 유전자 및 VL 유전자가 증폭되도록 Pyrobest DNA Polymerase (TAKARA)로 PCR을 수행하였다. SfiI로 분해된 VH 유전자 영역과 XhoI 및 NotI로 분해된 VL 유전자 영역을 순서대로 pTrc99A-Fab-myc 벡터에 삽입하였다.

실시예 4: 형질 전환

Gene Pulser (BIO-RAD)를 이용한 전기천공법에 의하여 형질 전환을 수행하였다. JM83 균주를 컴피턴트(competent)로 만들고, 형질 전환시키고, 50㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 LB 아가 배지에 적용하고, 밤새 30℃에서 배양하였다. 수득된 클론을 분리하고 배양하였다. 통상의 방식에 의하여 플라스미드를 준비하고, DNA 서열을 분석하였다.

실시예 5: DNA 시퀀싱

변형된 VL 유전자의 DNA 서열을 CEQ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN COULTER)를 이용하여 결정하였다. 작제된 발현 균주의 경우, DNA 시퀀싱은 그것이 설계된 바와 같은 서열을 함유하는 것으로 입증되었다.

실시예 6: 변형된 Fab 발현 플라스미드의 작제

주형으로써 야생형 Fab 발현 플라스미드를 이용하여, VL 유전자의 증폭을 위하여 돌연변이를 위한 부위에서 코돈이 NNK이고, 여기서 N이 A 또는 C 또는 G 또는 T이며, K가 G 또는 T인 올리고 DNA를 이용하여 상기에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하였다. 증폭된 VL 유전자를 야생형 Fab 발현 플라스미드의 VL 영역으로 교체하였다. JM83을 만들어진 플라스미드로 형질전환시키고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 수득된 클론에 대해 발현을 유도하였다.

실시예 7: 플레이팅 배양에 의한 Fab 발현의 유도

상기에서 얻은 클론과, 대조군으로써 야생형 Fab-발현 균주를 96-웰 플레이트(COSTAR)에서 50㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 2×YT 배지에 접종하고, 5 내지 6시간 동안 30℃에서 배양하였다. 1mM의 최종 농도로 IPTG를 플레이트에 첨가하고, Fab 발현을 유도하기 위하여 배양을 밤새 계속하였다. 배양의 완료 후 세포를 원심분리하고 회수하였으며, 1 mM EDTA를 함유한 PBS에 현탁시키고, 30 분 동안 얼음에 두었다. 그 다음 2,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시키고, 상층액을 회수하여 세포질 분획을 얻었다.

실시예 8: 돗트 블롯

돗트 블롯을 이용하여 발현 레벨을 분석하였다. 상기에서 얻은 세포질 분획을 0.45㎛ 니트로셀룰로오스 필터(Millipore)에 스폿팅(spotting)하고, 다음 2% 스킴 밀크를 함유한 PBS-0.05% Tween20으로 블로킹(blocking)하고, 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 항-Fab Ab (CAPPEL)로 Fab 발현을 검출하였다. 더 높은 발현 레벨을 갖고 있을 거라 생각되는 클론들을 위하여, 상기에서 기재된 바와 같이 DNA 서열을 분석하고, 단일 아미노산 치환되는 것을 증명할 수 있는 클론을 다음에 기재된 바와 같이 분석하였다.

실시예 9: 쉐이킹 배양에 의한 Fab 발현의 유도

E. coli 세포의 현탁액을 50㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 LB 아가에 적용하고, 밤새 30℃에서 배양하였다. 그 다음 수득된 단일 콜로니를 50㎍/㎖ 앰피실린을 함 유한 2×YT 배지에 접종하고, 600nm에서 O.D.가 0.5 내지 1.0이 될 때까지 30℃에서 배양하였다. 1mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하고, Fab 발현을 유도하기 위하여 배양을 밤새 계속하였다. 배양의 완료 후 세포를 원심분리하고 상층액을 회수하여 상층액 분획을 얻었다. 침전된 세포를 1 mM EDTA를 함유한 PBS에 현탁시키고, 얼음에 30분 동안 놔두었다. 그 다음, 8,900xg에서 15분 동안 원심분리시키고, 세포질 분획으로써 상층액을 회수하였다.

실시예 10: ELISA에 의한 SEB와의 반응성 평가

200ng/100㎕/웰로 발현되고 정제된 재조합 SEB를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트(Nunc)에 고정시키고, 세척 후, 4℃에서 밤새 1% BSA-PBS로 블록킹하였다. 야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 세포질 분획 또는 배양 상층액 분획을 1% BSA-PBS로 100㎕/웰로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 비오틴-표지된 항-카파 Ab (Southern Biotechnology) 및 퍼옥시다아제 (HRP)-표지된 스트렙타비딘 (Vector Lab.)의 조합으로 검출을 수행하였다. 650nm/450nm에서의 흡광도를 Microplate Reader Vmax (Molecular Devices)로 측정하였다.

실시예 11: SEB3-2-7을 이용한 L 사슬 내의 위치 8에서 변형된 항체의 발현 레벨의 평가

야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 세포질 분획을 단계별 희석하고, ELISA에서 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 비교하였다. 그 결과, P8G 변형된 항 체가 증가된 발현 레벨을 보유한다는 것을 발견하였다(도 2).

실시예 12: SEB3-2-7를 이용한 L 사슬 내 위치 8에서 변형된 항체의 열 안정성의 평가

야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 1% BSA-PBS로 50㎕/튜브로 희석시키고, 2시간 동안 42℃ 수조에서 처리하였다. 그 다음 샘플을 실온에서 복원하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P8T, P8G, P8R 및 P8S 변형된 SEB3-2-7 항체가 증가된 열 안정성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 3).

실시예 13: SEB3-2-7을 이용한 L 사슬 내의 위치 8에서 변형된 항체의 산에 대한 내성의 평가

야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 1% BSA-PBS로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 4.5로 적정하고, 25℃에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P8T, P8G, P8R 및 P8S 변형된 SEB3-2-7 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 4).

실시예 14: ELISA에 의한 FasL과의 반응성 평가

FasL을 위하여, 50ng/100㎕/웰로 상업적으로 입수가능한 His-tag를 갖는 재조합 Fas 리간드(R&D systems)를 실온에서 2시간 동안 NI 킬레이트 플레이트(Nunc)에 고정시켰다. 야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.)로 100㎕/웰으로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 비오틴-표지된 항-카파 Ab (Southern Biotechnology) 및 퍼옥시다아제 (HRP)-표지된 스트렙타비딘 (Vector Lab.)의 조합으로 검출을 수행하였다. 650nm/450nm에서의 흡광도를 Microplate Reader Vmax (Molecular Devices)로 측정하였다.

실시예 15: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 12에서 변형된 항체의 발현 레벨 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 단계별로 희석하고, ELISA에서 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 비교하였다. 그 결과, P12S 변형된 항체는 증가된 발현 레벨을 보유한다고 관찰되었다(도 5).

실시예 16: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 12에서 변형된 항체의 열 안정성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, 2시간 동안 40℃ 수조에서 처리하였다. 그 다음 샘플을 실온에 서 복원하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 변형된 항체 사이의 비교를 위한 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P12S, P12H, P12V, P12G, P12L, P12R, P12F, P12M 및 P12E 변형된 RNOK203 항체가 증가된 열 안정성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 6). 전형적인 결과를 그래프(도 6)에 나타내고, 야생형 항체의 그것에 대한 각각의 잔여 활성의 비율을 위하여, 남아있는 변형된 항체의 결과를 표 1에 요약하였다.

변형된 항체	야생형과 비교 (%)
P12S	140
P12H	150
P12V	270
P12G	230
P12L	250
P12R	190
P12F	170
P12M	140
P12E	210

실시예 17: RNOK203를 이용한 L 사슬 내 위치 12에서 변형된 항체의 산에 대한 내성의 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 4.0으로 적정하고, 25℃에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대하여 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P12V 변형된 RNOK203 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 7).

실시예 18: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 12에서 변형된 항체의 냉동-해동에 대한 내성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 오직 한번 또는 6번 반복된 냉동-해동에 적용하고, 그 다음, 잔여 활성으로서, 오직 한번 냉동-해동 과정에 적용된 샘플의 그것에 대한 6번 냉동-해동 과정에 적용된 샘플로부터 얻은 흡광도의 비율인 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P12S, P12V, P12G, P12L, P12R 및 P12F 변형된 RNOK203 항체가 냉동-해동에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 8).

실시예 19: ELISA에 의한 CTLA-4와의 반응성 평가

CTLA-4를 위하여, 100ng/100㎕/웰로 상업적으로 입수가능한 재조합 CTLA-4(R&D systems)를 실온에서 1시간 동안 ELISA 플레이트(Nunc)에 고정시켰다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 Block Ace로 블로킹하였다. 야생형 CTLA4-3-1/그의 변형된 항체의 세포질 분획을 Block Ace로 100㎕/웰으로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 비오틴-표지된 항-카파 Ab (Southern Biotechnology) 및 퍼옥시다아제 (HRP)-표지된 스트렙타비딘 (Vector Lab.)의 조합으로 검출을 수행하였다. 650nm/450nm에서의 흡광도를 Microplate Reader Vmax (Molecular Devices)로 측정하였다.

실시예 20: CTLA-4를 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 발현 레벨 평가

야생형 CTLA4-3-1/그의 변형된 항체의 세포질 분획을 단계별로 희석하고, ELISA에서 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 비교하였다. 그 결과, P15R, P15S 및 P15G 변형된 항체가 증가된 발현 레벨을 보유한다는 것이 관찰되었다(도 9). 특히, P15R 변형된 항체는 발현 레벨에서 약 100-배 증가만큼의 엄청난 효과를 보유한다. 단순히 단일 아미노산 치환으로 기능 Fab 단백질의 발현 레벨에서 그러한 많은 증가는 지금까지 결코 기록된 적이 없다.

실시예 21: 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E/그의 P15R 변형된 항체 발현 플라스미드의 작제

실시예 20에서 관찰된 바와 같은 P15R 변형된 항체의 증가된 발현 레벨을 더욱 입증하기 위하여, Fab 발현 플라스미드를 변형시켰다. 야생형 CTLA4-3-1 Fab/그의 P15R 변형된 Fab를 위한 발현 플라스미드를 작제하였으며(도 10), 여기서 E 태그를 암호화하는 합성 올리고 DNA가 Fd 사슬(예를 들어, VH 내지 CH1을 함유하는 H 사슬의 영역)의 C-말단에 삽입된다. 이하, E 태그와 함께 Fd 사슬을 함유하는 Fab를 "Fab-E"로 언급한다. 컴피턴트 세포로써 JM83 균주를 만들어진 플라스미드로 형질 전환시키고, DNA 시퀀싱으로 그들이 설계된 바와 같은 서열을 함유하는 것을 입증하였다. 이에 따라, Fd 사슬을 위한 E 태그, 또는 L 사슬을 위한 c-myc 태그의 이용에 의하여, Fab를 구성하는 Fd 사슬 및 L 사슬을 둘다 검출하는 것이 이제 가능해졌다.

이에 따라 작제된 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E/그의 P15R 변형된 Fab-E를 실시예 9와 같은 쉐이킹 배양에 의한 발현의 유도에 적용하고, 배양 상층액 분획 및 세포질 분획을 회수하였다.

실시예 22: 웨스턴 블롯팅에 의한 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E/그의 P15R 변형된 Fab-E의 발현 레벨 평가

실시예 21에서 얻은 배양 상층액 분획 및 세포질 분획을 웨스턴 블롯팅에 의하여 분석하여, Fd 사슬 및 L 사슬을 검출하였다. HRP-표지된 항-E 태그 Ab (Amersham Biosciences) 및 HRP-표지된 항-c-myc 태그 Ab (Roche) 각각으로 Fd 사슬 및 L 사슬의 검출을 수행하였다. 결과로써, Fd 사슬 또는 L 사슬 둘다 야생형 Fab-E를 위하여 검출되지 않은 반면, 설계된 바와 같은 분자량에 실질적으로 상응하는 Fd 사슬 및 L 사슬 각각을 위한 약 27 kDa 및 약 26 kDa에서 P15R 변형된 Fab-E를 위한 밴드를 검출할 수 있었다(도 11). 이러한 결과는 P15R 변형이 Fd 사슬 및 L 사슬 둘다의 발현 레벨을 증가시키는 것을 확인시킨다.

실시예 23: 샌드위치 ELISA에 의한 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E/그의 P15R 변형된 Fab-E의 발현 레벨 평가

Fd 사슬 및 L 사슬이 함께 어셈블되어 Fab의 정확한 분자 형태를 형성하는지를 조사하기 위하여, 다음 샌드위치 ELISA 시스템을 이용하였다. 200ng/100㎕/웰의 항-c-myc 태그 Ab 9E10를 실온에서 1시간 동안 ELISA 플레이트(Nunc)에 고정시켰다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 1% BSA-PBS로 블로킹하였다. 각 분획을 1% BSA-PBS로 100㎕/웰으로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. HRP-표지된 항-E 태그 Ab로 검출을 수행하였다. 650nm/450nm에서의 흡광도를 Microplate Reader Vmax (Molecular Devices)로 측정하였다.

그 결과, 야생형 CTLA4-3-1 Fab-E를 위한 검출이 관찰되지 않은 반면, 그 세포질 분획을 위하여 수십 배 더 높은 반응을 갖는 P15R 변형된 Fab-E에 대해 농도-의존적 반응이 관찰되었다(도 12). 이러한 결과들은 P15R 변형이 또한 Fd 사슬 및 L 사슬의 복합체의 발현 레벨을 매우 증가시킬 것을 확인시킨다.

실시예 24: CTLA4-3-1을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 열 안정성 평가

야생형 CTLA4-3-1/그의 변형된 항체의 세포질 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, 2시간 동안 28℃ 수조에서 처리하였다. 그 다음 샘플을 실온에서 복원하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P15R, P15S, P15G 및 P15F 변형된 CTLA4-3-1 항체가 증가된 열 안정성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 13).

실시예 25: CTLA4-3-1을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 산에 대한 내성 평가

야생형 CTLA4-3-1/그의 변형된 항체의 세포질 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 4.0 또는 pH 3.5로 적정하고, 얼음에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH 7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 결과적으로, P15R, P15S, P15G 및 P15F 변형된 CTLA4-3-1 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 14).

실시예 26: RNOK203의 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 작제

L 사슬 내 위치 15에서 Arg 또는 Ser으로 변형을 위한 실시예 20 내지 25에서 발견된 동일한 효과가, 15번째 아미노산 잔기가 Leu인 RNOK203에 대해서도 검출될 수 있는지의 여부를 조사하였다.

주형으로써, 야생형 Fab 발현 프라스미드를 이용하여 상기에 개시된 바와 같이 VL 유전자의 증폭을 위하여 L 사슬 내 위치 15에서 코돈이 CGT(Arg) 및 TCT(Ser)인 올리고 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 VL 유전자를 야생형 Fab 발현 플라스미드의 VL 영역으로 교체하였다. 만들어진 플라스미드로 JM83을 형질전환시키고, 얻은 클론의 DNA 서열을 분석하여, 그들이 설계한 대로의 서열을 함유하고 있음을 입증하였다.

실시예 27: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 발현 레벨 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 단계별로 희석시키고, ELISA에서 기능 Fab 단백질의 그들의 발현 레벨을 비교하였다. 결과로써, L15R 변형된 RNOK203 항체가 증가된 발현 레벨을 보유하는 것을 관찰하였다(도 15).

실시예 28: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 산에 대한 내성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 5.0으로 적정하고, 25℃에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH 7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 결과로써, L15R 변형된 RNOK203 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 16).

실시예 29: SEB3-2-7의 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 작제

L 사슬 내 위치 15에서 Arg 또는 Ser으로 변형을 위한 실시예 20 내지 28에서 발견된 동일한 효과가, 15번째 아미노산 잔기가 Val인 SEB3-2-7에 대해서도 검출될 수 있는지의 여부를 조사하였다.

주형으로써, 야생형 Fab 발현 플라스미드를 이용하여 상기에 개시된 바와 같이 VL 유전자의 증폭을 위하여 L 사슬 내 위치 15에서 코돈이 CGT(Arg) 및 TCT(Ser)인 올리고 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 VL 유전자를 야생형 Fab 발현 플라스미드의 VL 영역으로 교체하였다. 만들어진 플라스미드로 JM83을 형질전환시키고, 얻은 클론을 위하여 DNA 서열을 분석하여, 그들이 설계한 대로의 서열을 함유하고 있음을 입증하였다.

실시예 30: SEB3-2-7을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 열 안정성 평가

야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 1% BSA-PBS로 50㎕/튜브로 희석시키고, 2시간 동안 42℃ 수조에서 처리하였다. 그 다음 샘플을 실온에서 복원하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, V15R 및 V15S 변형된 SEB3-2-7 항체가 증가된 열 안정성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 17).

실시예 31: SEB3-2-7을 이용한 L 사슬 내 위치 15에서 변형된 항체의 산에 대한 내성 평가

야생형 SEB3-2-7/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 1% BSA-PBS로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 4.5 또는 pH 4.0으로 적정하고, 25℃에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH 7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대하여 수득된 흡광도의 비가 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, V15R 및 V15S 변형된 SEB3-2-7 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 18).

실시예 32: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 18에서 변형된 항체의 열 안정성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, 2시간 동안 45℃ 수조에서 처리하였다. 그 다음 샘플을 실온에서 복원하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대한 수득된 흡광도의 비가 변형된 항체들 사이의 비교를 위한 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P18R, P18S 및 P18F 변형된 RNOK203 항체가 증가된 열 안정성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 19).

실시예 33: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 18에서 변형된 항체의 산에 대한 내성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 Block Ace로 50㎕/튜브로 희석시키고, pH meter (HORIBA)와 1N HCl를 이용하여 pH 4.0으로 적정하고, 25℃에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음 1M Tris-HCl (pH 9.5)를 이용하여 샘플을 pH 7로 적정하고, 처리되지 않은 샘플의 그것에 대하여 수득된 흡광도의 비가 변형된 항체 사이의 비교를 위한 그래프에서 잔여 활성으로써 나타나는 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P18F, P18A, P18W, P18L, P18R, P18Q 및 P18S 변형된 RNOK203 항체가 산에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다. 전형적 결과는 그래프(도 20)에 나타낸 반면, 야생형 항체의 그것에 대한 각각의 잔여 활성의 비율을 위하여, 남아있는 변형된 항체의 결과를 표 2에 요약하였다.

변형된 항체	야생형과 비교 (%)
P18F	180
P18A	160
P18W	200
P18L	150
P18R	160
P18Q	170
P18S	140

실시예 34: RNOK203을 이용한 L 사슬 내 위치 18에서 변형된 항체의 냉동-해동에 대한 내성 평가

야생형 RNOK203/그의 변형된 항체의 배양 상층액 분획을 오직 한번 또는 6번 반복된 냉동-해동에 적용하고, 그 다음, 잔여 활성으로써, 오직 한번 냉동-해동 과정에 적용된 샘플의 그것에 대한 6번 냉동-해동 과정에 적용된 샘플로부터 얻은 흡광도의 비율인 ELISA에 적용하였다. 그 결과, P18R, P18Q, P18S, P18F 및 P18L 변형된 RNOK203 항체가 냉동-해동에 대한 증가된 내성을 보유한다는 것을 발견하였다(도 21).

본 발명에 따른 인간 항체 또는 인간화 항체의 특성을 개선하기 위한 방법은 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"으로 언급함) 내의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기들 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다. 항체 내 그러한 특정 위치에서 단지 단일 아미노산의 치환으로, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 얻는 것이 가능하다. 이에 따라, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체가 본 발명에 따른 방법에 의하여 수득되며, 높은 항원 특이성, 낮은 면역원성, 높은 생산성 및 개선된 안정성의 모든 특성을 가짐에 따라, 질환-관련 항원을 표적화하는 특정 항체로써 인간 진단 및 치료와 같은 임상 분야에서 매우 유용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute <120> A Process for improving antibody <130> 666485 <150> JP 2005-32377 <151> 2005-02-08 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gly Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Arg Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ser Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu His Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Val Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Gly Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Arg Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Phe Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Glu Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Phe Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Trp Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Arg Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Ser Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Phe Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20

Claims

인간 항체 또는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"으로 언급함) 내의 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라) 위치에서 아미노산 잔기들 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, 인간 항체 또는 인간화 항체를 변형시켜, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 8, 12, 15 또는 18 위치에 있는 적어도 임의의 하나의 프롤린 또는 15 위치에 있는 아미노산 잔기가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각 위치에서 아미노산 잔기가 치환 후 아래 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법:

위치 8: Gly, Thr, Arg 또는 Ser

위치 12: Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Met 또는 Glu

위치 15: Arg, Ser, Gly 또는 Phe

위치 18: Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leu 또는 Gln.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, VL 사슬이 인간 Vκ1 패밀리, 인간 Vκ2 패밀리 또는 인간 Vκ3 패밀리 중 임의의 하나에 속하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 치환 후 각 위치의 아미노산 잔기가 아래 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법.

위치 8: Gly, Thr, Arg 또는 Ser

위치 15: Arg 또는 Ser.
제 5항에 있어서, 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 전 DPK9 (GeneBank 수탁 번호 X59315)로부터의 서열을 갖는 방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 인간 Vκ1 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 후 서열 번호 2 내지 7에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 각 위치의 아미노산 잔기가 치환 후 아래 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법.

위치 12: Ser, His, Val, Gly, Leu, Arg, Phe, Met 또는 Glu

위치 15: Arg

위치 18: Arg, Ser, Phe, Ala, Trp, Leu 또는 Gln.
제 8항에 있어서, 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬 내의 FR1이 치환 전 DPK18 (GeneBank 수탁 번호 X63403)로부터의 서열을 갖는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 인간 Vκ2 패밀리에 속하는 VL 사슬 내의 FR1이 치환 후 서열 번호 9 내지 25에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬 내에서 각 위치의 아미노산 잔기가 치환 후 아래 기재된 바와 같은 아미노산들 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법:

위치 15: Arg, Ser, Gly 또는 Phe.
제 11항에 있어서, 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 전 DPK22 (GeneBank 수탁 번호 X59315)로부터의 서열을 갖는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 인간 Vκ3 패밀리에 속하는 VL 사슬의 FR1이 치환 후 서열 번호 27 내지 30에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 완전 항체, 또는 또는 Fab, Fab', F(ab')₂, scAb, scFv, 디아바디(diabody)[짧은 링커 펩티드에 의하여 연결된 동종 또는 이종 중쇄 가변 영역(VH 사슬) 및 VL 사슬로 구성된 재조합 다이머 항체] 또는 scFv-Fc; 또는 다른 단백질과의 융합 항체 또는 융합 항체 단편; 또는 저분자량 화합물로 표지된 항체 또는 항체 단편; 또는 고분자량 화합물로 변형된 항체 또는 항체 단편과 같은 항체 단편인 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 유전자 재조합 기술에 의하여 수행되는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 방법에 의하여 수득된, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편.
각각 치환 후 VL 사슬의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 제조하고;

진핵 또는 원핵 생물의 숙주를 상기 유전자로 형질전환시키고;

상기 숙주로부터 상기 인간 항체 또는 상기 인간화 항체 또는 상기 인간 항체 단편 또는 상기 인간화 항체 단편을 발현시키고;

상기 인간 항체 또는 상기 인간화 항체 또는 상기 인간 항체 단편 또는 상기 인간화 항체 단편을 회수하는 것을 포함하여, 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편의 경쇄 가변 영역(이하 "VL 사슬"로써 언급)내의 위치 8, 12, 15 또는 18(Kabat 번호에 따라)에서 아미노산 잔기 중 적어도 임의의 하나가 프롤린 또는 시스테인을 제외한 다른 아미노산으로 치환된 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 항체를 제조하는 방법.
제 17항에 나타낸 바와 같은 방법에 의하여 제조된, 개선된 발현 레벨 및/또는 안정성을 갖는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 항체 단편 또는 인간화 항체 단편.