CN116162158A - 结合bp特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本公开属于生物医药领域，涉及一种结合BP特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途。具体来说，本公开涉及一种单克隆抗体，所述抗体特异性结合BP180抗原蛋白的NC16A结构域，单克隆抗体的制备方法及其前述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗大疱性类天疱疮的药物中的用途。本公开筛选出的抗BP180的抗体或抗原结合片段特异性结合BP180抗原，能作为定性检测BP180阳性的参考标准，实现对BP患者中抗BP180NC16A自身抗体水平的定量检测，对于BP患者的临床诊断、病情监测、治疗具有重要意义。

Description

结合BP特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，涉及一种结合BP特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途。具体来说，本公开涉及一种单克隆抗体，所述抗体特异性结合BP180抗原蛋白的NC16A结构域，单克隆抗体的制备方法及其前述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗大疱性类天疱疮的药物中的用途。
背景技术
大疱性类天疱疮(Bullous Pemphigoid，BP)是一种在免疫系统攻击皮肤并引起水疱时产生的自身免疫性疾病，最常发病在60-80岁的老年人。此病特征性的临床表现为紧张性水疱和剧烈泛发的瘙痒症状。组织病理上，苏木精和曙红(HE)染色可见表皮下裂隙伴随嗜酸性粒细胞浸润，直接免疫荧光(DIF)可见沿基底膜带分布的线状沉积的自身抗体和/或补体，盐裂间接免疫荧光(ssIIF)可见自身抗体和/或补体沉积在表皮侧。
BP患者血清中自身抗体的靶抗原是BP180和BP230，也称作BPAG1和BPAG2，这两种抗原的分子量分别是180KD和230KD。BP180被认为是自身抗体的直接靶点。BP180是具有胞质NH2末端和细胞外COOH结构域的II型跨膜蛋白。N末端结构域、跨膜拉伸和细胞外C末端分别具有466、23和1008个氨基酸。胞外域包含15个胶原蛋白子域(COL1–COL15)，其间散布着16个非胶原序列(NC1–NC16)。NC16A结构域是膜旁连接区，是形成胶原样三螺旋的核心。胞外区包含螺旋状结构，通过去整合素金属蛋白酶(ADAM)从细胞表面生理脱落。NC16A结构域有七个抗原位点，包括NC16A1(aa 490-506)、NC16A1-3(aa 490-534)、NC16A1-5(aa 490-562)、NC16A2(aa 507-520)、NC16A2.5(aa 514-532)、NC16A3(aa 521-534)和NC16A3-4(aa522-545)。在这些位点中，NC16A2和NC16A2.5是主要的抗原位点，可被所有的IgG和IgE抗体捕获。据报道，BP180-NC16A抗体滴度与BP患者的疾病严重程度相关。用同源的人BP180-NC16A簇区域取代小鼠BP180-NC14A，并在小鼠体内注射完整IgG或针对BP患者的BP180-NC16A亲和纯化的IgG抗体，皮肤出现脆性增加。BP180的结构和定位表明它是连接细胞内外半桥体蛋白的核心锚定蛋白，在BP的发病机制中起着关键作用，BP180的NC16A结构域被认为是BP的主要致病性表位。因此，识别BP180的靶区对于了解BP180的发病机制和临床特征具有重要意义。
BP是一个谱系疾病，尽管大多数病人在治疗后可得到临床缓解，但在老年患者中还是有相当的死亡率，尤其是80岁以上患者死亡率可达25％。此外，在癌症患者人群开展免疫治疗也会引发BP疾病的发生。PD-1/PD-L1检查点抑制剂多用于治疗各种实体和血液系统恶性肿瘤，是一类近年来报道较多的诱发BP的药物。大部分病例在PD-1/PD-L1抑制剂开始治疗后6-8个月内出现水疱或大疱，少数病例出现黏膜受累。随着PD-1免疫治疗的普及，未来针对BP检测的需求会越来越多。目前如何快速准确诊断此类疾病缺乏有效检测手段。
IgG是BP致病性自身抗体的一种，其靶抗原主要是BP180。BP-IgG与BP180结合后激活补体，诱导抗原肽段的细胞内化，导致角质形成细胞与基底膜的粘附力减弱。热休克蛋白90(HSP90)在BP患者体内的血清水平与BP180-NC16A IgG抗体呈反比，即抗BP180-NC16AIgG抗体通过可溶性炎症趋化介质产生的炎症反应间接增强细胞内HSP90的表达，并同时抑制细胞向外周血释放HSP90。细胞内HSP90异常高表达，释放相关趋化因子趋化嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润，并释放一些蛋白水解酶和多种炎症介质，参与BP的病理改变和水疱的形成。
BP的诊断标准包括临床表现、组织病理、直接免疫荧光、间接免疫荧光、特异性抗体检查，根据病情严重程度采用不同的治疗方案，主要依靠糖皮质激素、抗生素和免疫抑制剂等。目前糖皮质激素是公认的治疗BP的一线药物，临床疗效显著，但长期使用可引发大量并发症，有些严重的并发症甚至阻碍了临床上某些患者对该药物的使用。因此，需要提供一种用于大疱性类天疱疮的诊断或者治疗的试剂。
与此同时，经典的杂交瘤技术需要耗费大量的时间和精力去获得高亲和力的抗体，而且需要进行后续的人源化改造，导致难以获得人源单克隆抗体，无法对抗体水平做到绝对定量。因此这些治疗方式缺乏特异性，疗效差且疗程长。噬菌体展示技术在1985年由Smith首次建立，经过三十多年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体抗体库技术是通过制备人源抗体文库(library)，把蛋白或多肽表达在噬菌体的表面，从而筛选并富集特异性抗体。已经提出了可以从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体可能性，因此，当使用噬菌体抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段(Fab或ScFv)。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术中存在的问题，本公开筛选出一种针对抗大疱性类天疱疮抗原BP180的人源性单克隆抗体。
用于解决问题的方案
第一方面，本公开提供了分离的抗BP180的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中，编码所述重链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(a1)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(a2)与SEQ ID NO：4所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(a3)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(a4)与SEQ ID NO：8所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(a5)如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(a6)与SEQ ID NO：12所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
所述重链可变区为根据IMGT的分析方法编码。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中，编码所述轻链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(b1)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(b2)与SEQ ID NO：3所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(b3)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
(b4)与SEQ ID NO：7所示的序列相比，存在1个或2个保守突变的氨基酸序列；
(b5)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
(b6)与SEQ ID NO：11所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
所述轻链可变区为根据IMGT的分析方法编码。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(CDR)1、VL互补决定区(CDR)2和VL互补决定区(CDR)3，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(CDR)1、VH互补决定区(CDR)2和VH互补决定区(CDR)3；并且，
所述VL由如下氨基酸编码：VLCDR1包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，VLCDR3包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
所述VH由如下氨基酸编码：VHCDR1包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，VHCDR2包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，VHCDR3包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体或其抗原结合片段，其中，编码所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
(i)VH包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所示序列相比，存在保守突变的序列。
第二方面，本公开提供了一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(a)-(d)中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17任一序列或其组合所示的核苷酸序列；
(b)包含如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17任一序列或其组合所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(c)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)-(b)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)-(c)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
第三方面，本公开提供了一种载体，其中，所述载体包含根据第二方面所述的多核苷酸。
第四方面，本公开提供了一种分离的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含如第三方面所述的载体。
第五方面，本公开提供了一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法，其中，所述方法包含利用第三方面所述的载体，转化初始宿主细胞的步骤。
第六方面，本公开提供了一种制备目标蛋白的方法，所述方法包含利用第四方面所述的宿主细胞或通过第五方面所述的方法，制备所述目标蛋白。
第七方面，本公开提供了根据第五方面所述的方法制备的抗体或其结合片段。
第八方面，本公开提供了一种检测抗BP180抗体的方法，其中，所述方法包括使用第一方面或第七方面所述的抗体或其抗原结合片段对待测样品进行检测的步骤；
可选地，所述方法包括对待测样品中的抗BP180抗体进行定量的步骤。
第九方面，本公开提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据第一方面或第七方面所述的抗体或其抗原结合片段。
第十方面，本公开提供了一种组合物，其中，所述组合物中含有根据第一方面或第七方面所述的抗体或其抗原结合片段。
第十一方面，本公开提供了根据第一方面或第七方面所述的抗体或其抗原结合片段，或第十方面所述的组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
(1)检测抗BP180抗体，或制备用于检测抗BP180抗体的试剂或试剂盒；
(2)制备用于诊断大疱性类天疱疮的试剂或试剂盒；
(3)制备用于监测大疱性类天疱疮的病情进展的试剂或试剂盒；
(4)制备用于研究大疱性类天疱疮的致病机理的试剂或试剂盒。
第十二方面，本公开提供了一种预防或治疗大疱性类天疱疮的方法，其中，使用根据第一方面或第七方面所述的抗体或其抗原结合片段，或根据第十方面所述的组合物给予受试者。
发明的效果
本公开筛选出一种针对抗大疱性类天疱疮抗原BP180的人源性单克隆抗体。该抗体通过与BP180结合，活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测BP180阳性的参考标准，能够定量检测BP患者中抗BP180 NC16A自身抗体水平，从而监测病情活动度，可以用于BP患者的临床诊断和治疗。
附图说明
图1示出了VL噬菌体文库的单克隆菌PCR琼脂糖凝胶电泳图，其对应于本公开构建的VL噬菌体文库。其中，泳道M为DL2000，泳道1-16分别为pATA-VK，泳道17-32分别为pATA-Vλ。
图2示出了KH噬菌体文库的单克隆菌PCR琼脂糖凝胶电泳图，其对应于本公开构建的KH噬菌体文库。其中，泳道M为DL2000，泳道1-48分别为pATA-scFv-KH。
图3示出了λH噬菌体文库的单克隆菌PCR琼脂糖凝胶电泳图，其对应于本公开构建的λH噬菌体文库。其中，泳道M为DL2000，泳道1-48分别为pATA-scFv-λH。
图4示出了对噬菌体展示文库进行单克隆测序分析的结果。其中，左图为文库序列轻链分析结果，右图为文库序列重链分析结果。
图5示出了目标蛋白BP180 SDS-PAGE电泳图。从前述电泳图的结果来看，蛋白大小34KDa，纯度大于90％。
图6示出了76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体不同浓度稀释下的ELISA结果。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，术语“大疱性类天疱疮”(Bullous Pemphigoid，BP)，一般认为是自身免疫性疾病，大部分患者血清中有抗基底膜带自身抗体，抗原抗体结合导致基底膜带损伤形成水疱。
本发明上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
如本公开所使用的，术语“BP180抗原”(简称为BP180)也被称作BPAG1抗原，其分子量分别是180KD。BP180被认为是自身抗体的直接靶点。BP180是具有胞质NH2末端和细胞外COOH结构域的II型跨膜蛋白。N末端结构域、跨膜拉伸和细胞外C末端分别具有466、23和1008个氨基酸。胞外域包含15个胶原蛋白子域(COL1–COL15)，其间散布着16个非胶原序列(NC1–NC16)。
如本公开所使用的，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变(例如，氨基酸的置换、插入和/或缺失)。示例性的，保守突变为保守置换。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
本公开中的术语“噬菌体展示技术”，是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
本公开中的术语“抗体”，指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括，但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。
本公开中的术语“单链抗体”(scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过有限个氨基酸的短肽(也被称为连接子，linker)连接而成的抗体。
本公开中的术语“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。
本公开中的术语“IMGT编号方案”，是Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入了新的标准化编号系统，包括来自抗体轻链和重链的可变结构域以及来自不同物种的T细胞受体链。所述IMGT编号方法基于种系V序列(germ-line V)比对连续计数残基。
在本公开所描述的技术方案中，除非特别说明，否则本公开中针对抗体所采用的抗体编号方案均为IMGT编号方案。
在一些技术方案中，本公开涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。可选的，前述多核苷酸可以选自DNA。本公开使用的“严格性”指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。“严格条件”指仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语“在高严格性或非常高的严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in MolecμLarBiology，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。本公开提及的具体杂交条件如下：1)高严格性杂交条件：在约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后于65℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或更多次；2)非常高严格性杂交条件：65℃的0.5M磷酸钠，7％SDS，然后于65℃下用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或更多次。
技术方案
在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
SEQ ID NO：1所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL FR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH FR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO：4所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL FR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO：6所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH FR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO：8所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL FR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO：10所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH FR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO：11所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO：12所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO：13所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL FR4的氨基酸序列；
SEQ ID NO：14所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH FR4的氨基酸序列；
SEQ ID NO：15所示序列为编码76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH的核苷酸序列；
SEQ ID NO：16所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VH的氨基酸序列；
SEQ ID NO：17所示序列为编码76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL的核苷酸序列；
SEQ ID NO：18所示序列为76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体VL的氨基酸序列；
SEQ ID NO：19～34所示序列为引物序列；
SEQ ID NO：35所示序列为BP180蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：36所示序列为编码BP180蛋白的核苷酸序列。
抗BP180抗体或其抗原结合片段
大疱性类天疱疮是由致病性自身抗体介导的自身免疫性水疱病，BP患者的疾病严重程度与抗BP180抗体滴度相关，因此，检测抗BP180的抗体水平对于BP的发病机制研究、疾病诊断及监测病情具有重要意义。
在一些实施方式中，本公开制备了BP180蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，编码BP180蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示。
在一些具体的实施方式中，BP180蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)人工合成了BP180基因序列，将BP180基因重组到表达载体质粒pGEX-6P-1中，得到BP180-pGEX表达载体；克隆位点BamHI/XhoI。
(2)将BP180-pGEX表达载体转染到BL21(DE3)感受态中培养，收集沉淀进行GST标签亲和层析得到BP180蛋白。
在一些实施方式中，利用噬菌体展示技术筛选与BP180蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段。示例性的，与BP180蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段包括多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体，或者如Fab、F(ab’)2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。
在一些实施方式中，本公开分离了BP180抗体阳性患者的PBMCs，通过扩增其中的抗体VH、VL基因片段构建成包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的噬菌体展示文库，通过与BP180蛋白进行生物淘选，进而筛选到了能够特异性结合BP180抗原的人源抗体。
在一些具体的实施方式中，本公开筛选抗BP180抗体的方法包括如下步骤：
S1，分离BP180抗体阳性患者的PBMCs，提取RNA并对RNA进行质检。采用RT-PCR技术将质检合格的RNA反转录成cDNA，扩增其中全部的抗体VH、VL基因片段。将体外扩增的VH、VL基因片段克隆入pATA-scFv-2载体，构建成抗体组合文库。
S2，将抗体基因组合文库插入噬菌体编码的膜蛋白的基因III(g3)的先导系列的紧邻下游，通过辅助噬菌体的超感染，使外源抗体基因表达的多肽或蛋白可以以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白pIII的N端。每个噬菌体颗粒编码并呈递不同的抗体，其含有数十亿个单个克隆。在这些抗体文库中，编码可与抗原结合的那些抗体的基因通过在体外对抗原进行亲和力富集-温和洗脱-噬菌体扩增，再继续重复以上富集筛选过程，直至数个循环后获得特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库，从抗体噬菌体库中筛选阳性克隆。通过ELISA方法对阳性克隆进行鉴定，最后从中筛选特异性好、亲和力强的全人源抗体。
在一些更为具体的实施方式中，步骤S1包括：使用
Figure BDA0003371529580000071
III 1st StrandcDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)反转录试剂盒将BP180抗体阳性患者的RNA反转录成cDNA，对DNA的VH和VL片段进行扩增。体外扩增得到的VK、Vλ基因片段通过克隆技术克隆入pATA-scFv-2载体，组成VK文库和Vλ文库。使用质粒提取试剂盒提取VK文库和Vλ文库的质粒载体，将体外扩增的VH基因片段插入VK文库和Vλ文库的质粒载体，构成KH文库和λH文库。
本公开经过三轮抗体噬菌体库的筛选，将抗原组大于3倍对照组的克隆定为阳性克隆，对这些单克隆进行测序分析。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，并结合ELISA实验所反映的抗原抗体特异性结合能力，最终得到了1条高亲和力的抗体，命名为76F-GST-NC16A-R2P1-H2。该抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测BP180阳性的参考标准，也能定量检测BP患者中抗BP180自身抗体水平，为大疱性类天疱疮患者的诊断、病情发展监测、临床用药治疗以及致病机理的研究等方面提供有效信息。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例一：人源ScFv噬菌体展示文库的构建方法
本实施例中所主要使用的试剂如表1所示。
表1实施例1中使用的主要试剂
Figure BDA0003371529580000081
1.文库构建
1.1组装重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)
表2 PCR反应条件和步骤
Figure BDA0003371529580000082
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。
本实施例中使用的引物序列如下：
Forward(F):
5′L-VH 1：ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG(SEQ ID NO：19)
5′L-VH 3：AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG(SEQ ID NO：20)
5′L-VH 4/6：CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG(SEQ ID NO：21)
5′L-VH 5/7：CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG(SEQ ID NO：22)
5′L VK 1/2：ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG(SEQ ID NO：23)
5′L VK 3：CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG(SEQ ID NO：24)
5′L VK 4/5：ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG(SEQ ID NO：25)
5′L Vλ1：GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG(SEQ ID NO：26)
5′L Vλ2：GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG(SEQ ID NO：27)
5′L Vλ3：GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG(SEQ ID NO：28)
5′L Vλ4/5：GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG(SEQ ID NO：29)
5′L Vλ6：GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG(SEQ ID NO：30)
5′L Vλ7：GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG(SEQ ID NO：31)
5′L Vλ8/9/10：GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG(SEQ ID NO：32)
Reverse(R):
3′CK：TGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT(SEQ ID NO：33)
3′Cλ：CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG(SEQ ID NO：34)
1.2构建轻链可变区噬菌体展示文库
1.2.1准备pATA-scFv-2载体为文库克隆
1.2.2消化载体和PCR产物
表3消化载体和PCR产物的反应体系
Figure BDA0003371529580000091
通过表3记载的技术方案，获得PCR产物。
1.2.3连接
表4连接反应体系
pATA-VK pATA-Vλ
T4 DNA连接酶(Thermo) 3μL 3μL
10×T4 DNA连接酶缓冲液 8μL 8μL
载体(NheI/NotI) 1μg 1μg
VK or Vλfragment(NheI/NotI) 0.3μg 0.3μg
H2O 添加至反应体系共80μL 添加至反应体系共80μL
通过表4记载的技术方案进行连接。16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min，以获得连接产物。
1.2.4电转
1.2.4.1 TG1感受态细胞的制备。
1.2.4.2 37℃预温1mL SOC培养基(Sigma，S1797)。将电穿孔比色皿(0.1厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
1.2.4.3从-80℃的冰箱中取出Electrocompetent细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15分钟)。细胞解冻后，轻轻混匀。将50μL细胞放入在冰上的冷冻微离心管中。
1.2.4.4小心地将3μL的DNA混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡。用你的手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
1.2.4.5在600Ω，10μF和1.8kV下电穿孔。在脉冲的10秒内，立即在每个试管中加入1mL预热的SOC培养基。37℃，250rpm摇晃1小时。
1.2.4.6收集所有的电转化培养基。连续稀释10μL培养物到90μL SOC培养基中，涂布于LB/Amp/Glucose上。37℃孵育过夜。通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
1.3构建VL-VH噬菌体展示文库
1.3.1消化载体和PCR产物
表5消化反应体系
Figure BDA0003371529580000101
通过表5中的消化反应体系和反应步骤，获得消化后的PCR产物。
1.3.2连接
表6连接反应体系
Figure BDA0003371529580000102
通过表6记载的技术方案进行连接。16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min，以获得连接产物。
1.3.3电转
1.3.3.1 TG1感受态细胞的制备。
1.3.3.2 37℃预温4mL SOC培养基(Sigma，S1797)。将电穿孔比色皿(0.2厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
1.3.3.3从-80℃的冰箱中取出Electrocompetent细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15分钟)。细胞解冻后，轻轻混匀。
1.3.3.4小心地将6μL的DNA混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡。用你的手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
1.3.3.5在600Ω，100Ω和2.5kV下电穿孔。在脉冲的10秒内，立即在每个试管中加入2mL预热的SOC培养基。37℃，250rpm摇晃1小时。
1.3.3.6收集所有的电转化培养基。连续稀释10μL培养物到90μL SOC培养基中，涂布于LB/Amp/Glucose上。37℃孵育过夜。通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
1.4文库评估
1.4.1菌落PCR：以构建好的文库为模板，进行PCR。
表7 PCR反应条件
Figure BDA0003371529580000111
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。
表7中的引物序列如下：
pATA-scFv-2载体鉴定上游引物(F):AGCGGATAACAATTTCACACAGGA(SEQ ID NO：35)
pATA-scFv-2载体鉴定下游引物(R)：GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC(SEQ ID NO：36)
PCR后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-图3所示。
1.4.2测序
挑选阳性克隆送到武汉擎科生物科技有限公司测序，测序质控结果如图4所示。
1.5表达BP180蛋白
人工合成BP180基因序列，将BP180基因重组到表达载体质粒pGEX-6P-1中，得到BP180-pGEX表达载体；克隆位点BamHI/XhoI。
BP180的氨基酸序列为(SEQ ID NO：35)：
GSEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLR；
基因序列为(SEQ ID NO：36)：
ggatccGAGGAGGTGAGGAAGCTGAAGGCGCGTGTGGATGAGCTGGAGAGGATCAGGAGGAGCATACTGCCCTATGGGGACAGCATGGATAGAATAGAAAAGGACCGCCTCCAGGGCATGGCACCCGCGGCGGGAGCAGACCTGGACAAAATTGGGCTGCACAGTGACAGCCAGGAGGAGCTCTGGATGTTCGTGAGGAAGAAGCTAATGATGGAACAGGAAAATGGAAATCTCCGAtgactcgag。
将BP180-pGEX表达载体转染到BL21(DE3)感受态中培养，收集沉淀进行GST标签亲和层析得到BP180蛋白；纯化后的BP180还需要进行SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)以验证其纯度，纯化后的BP180 SDS-PAGE电泳图如图5所示，纯度大于90％。
实施例二：与BP180特异性结合的单克隆抗体的制备
本实施例1使用的主要试剂如表8所示。
表8实施例2中使用的主要试剂
试剂 编号 制造商
96-well plate 42592 Costar
Tween 20 P2287 Sigma
Tris RES3098T-B7 Sigma
Glycine G8200 Solarbio
PEG 181986 Sigma
PBS C10010500BT Life
BSA A104912-100g aladdin
Skim milk 6342932 BD
1.第一轮
1.1生物淘选
1.1.1包被：包被免疫管，4℃孵育过夜。抗原组：1mL GST-NC16A转染液(50μg/mL)，对照组：500μL转染液(0μg/mL)。GST-NC16A由实施例1中BP180-pGEX表达载体重组表达得到。
1.1.2洗涤：弃掉免疫管中液体，用5mL 0.05％PBST洗涤三遍。
1.1.3封闭：在管中加入5mL 5％脱脂牛奶(PBST溶解)，37℃孵育2小时。
1.1.4洗涤：弃掉免疫管中液体，用5mL 0.05％PBST洗涤一遍。
1.1.5孵育：用1％脱脂牛奶(PBST溶解)稀释噬菌体文库，取1mL加入免疫管中，32℃孵育2小时。
1.1.6洗涤：弃掉免疫管中液体，用5mL 0.05％PBST洗涤三遍，用PBS洗涤两遍。
1.1.7洗脱：用1mL的甘氨酸-盐酸(pH 2.2)洗脱与BP180结合的噬菌体，再用Tris-HCl中和至pH 7.0。
1.2测定稀释噬菌体的滴度
1.2.1培养大肠杆菌TG1直到OD600＝0.4-0.6。
1.2.2混合10μL稀释的洗脱后噬菌体和190μL大肠杆菌TG1。
1.2.3 37℃培养混合物15分钟，然后倒到2×YT-A(Amp 100μg/mL)培养基中。将培养基倒扣培养在37℃处过夜。
1.3噬菌体文库扩增
1.3.1将10μL E.coli TG1加到800μL of 2YT培养液中,在37℃混合培养至OD600＝0.4-0.6。
1.3.2将培养至对数期的TG1转入10mL 2YT-G培养液(终浓度2％葡萄糖)，在摇床上37℃培养至OD600＝0.4-0.6。
1.3.3加入洗脱后的产物，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。
1.3.4加入30mL 2YT-AG培养液(终浓度0.1％Amp，2％葡萄糖)，37℃摇床培养1小时。
1.3.5加入M13KO7(M13KO7:TG1＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。
1.3.6菌液在5000rpm离心5分钟。用40mL 2YT-AK(终浓度Amp 100μg/mL,Kan 100μg/mL)重悬，30℃摇床孵育过夜。
1.3.7 8000rpm离心10分钟，取出上清，用1mL PBS重悬，12000rpm离心5分钟，将上清转移至新的1.5mL离心管。
1.4扩增后的噬菌体文库滴度测定
步骤同1.2。
2.第二轮到第三轮
2.1生物淘选
循环重复步骤1两次，每次投入的噬菌体文库均用前一轮扩增后的洗脱噬菌体。
表9生物淘选结果
Figure BDA0003371529580000131
3.多克隆噬菌体ELISA
3.1包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μL/每孔GST-NC16A蛋白(4μg/mL)，对照组：100μL/每孔蛋白稀释液(0μg/mL)。
3.2洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μL的0.05％PBST洗涤三遍。
3.3封闭：每孔加入300μL的5％脱脂牛奶(PBS溶解)，37℃封闭2小时。
3.4噬菌体孵育：每孔中加入100μL稀释后扩增噬菌体，如表10所示，32℃孵育2小时。
3.5洗涤：同步骤3.2。
3.6二抗孵育：每孔加入100μL用封闭液稀释的anti-M13-HRP antibody(1:9000)，32℃孵育1小时。
3.7洗涤：同步骤3.2。
3.8显色：每孔加100μL TMB，室温孵育，然后每孔加50μL 2M HCl终止反应。
3.9读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值。读板结果如表10所示。
表10多克隆噬菌体ELISA的结果
Figure BDA0003371529580000132
4.单克隆噬菌体ELISA(根据多克隆结果选用第二轮洗脱产物进行单克隆)
4.1从培养皿中选择96个克隆，这些克隆在37℃250rpm培养，直到OD600nm＝0.4-0.6。
4.2 M13KO7感染培养物(MOI＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。将菌液离心，并用等体积2×YT-AK(终浓度Amp 100μg/mL,Kan 100μg/mL)重悬沉淀，30℃培养过夜。
4.3将培养物离心，上清液可用于ELISA。
4.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μL/每孔GST-NC16A蛋白(4μg/mL)的，对照组：100μL/每孔蛋白稀释液(0μg/mL)。
4.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μL的0.05％PBST洗涤三遍。
4.6封闭：每孔加入300μL的5％脱脂牛奶(PBS溶解)，37℃封闭2小时。
4.7噬菌体孵育：每孔中加入100μL噬菌体上清，32℃孵育2小时。
4.8洗涤：同步骤4.5。
4.9二抗孵育：每孔加入100μL用封闭液稀释的anti-M13-HRP antibody(1:9000)，32℃孵育1小时。
4.10洗涤：同步骤4.5。
4.11显色：每孔加100μL TMB，室温孵育，然后每孔加50μL 2M HCl终止反应。
4.12读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。读板结果如表11和表12所示。
表11抗原组单克隆噬菌体ELISA的结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.16 0.04 0.03 0.05 0.02 0.03 0.05 0.28 0.33 0.41 0.33 0.21
B 0.03 0.02 0.02 0.05 0.03 0.03 0.04 0.05 0.04 0.04 0.06 0.06
C 0.03 0.02 0.02 0.04 0.03 0.20 0.19 0.12 0.17 0.03 3.94 0.05
D 0.03 0.09 0.03 0.03 0.17 0.60 0.03 0.04 0.03 0.03 0.03 0.46
E 0.03 0.03 0.03 0.04 0.03 0.03 0.18 0.04 0.58 0.03 0.03 0.22
F 0.06 0.11 0.05 0.14 0.03 0.03 0.03 0.19 0.03 0.05 0.04 0.03
G 0.03 0.04 0.19 0.11 0.12 0.03 0.03 0.10 0.05 0.16 0.17 0.04
H 0.05 3.38 0.04 0.16 0.04 0.04 0.18 0.04 0.03 0.17 0.04 1.62
表12对照组单克隆噬菌体ELISA的结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.06 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.03 0.05 0.05 0.10 0.07 0.25
B 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04
C 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.03 0.05 0.02 3.16 0.02
D 0.02 0.03 0.02 0.02 0.07 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.20 0.05
E 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.06 0.02 0.05 0.03 0.09 0.06
F 0.03 0.04 0.03 0.04 0.02 0.02 0.02 0.07 0.05 0.03 0.02 0.02
G 0.03 0.04 0.05 0.02 0.03 0.16 0.02 0.03 0.03 0.08 0.06 0.04
H 0.06 0.03 0.02 0.04 0.02 0.03 0.05 0.03 0.03 0.04 0.05 0.28
5.阳性克隆验证ELISA
5.1将50μL阳性克隆加入2mL 2YT-AG培养基(终浓度0.1％Amp，2％葡萄糖)中培养至OD600＝0.4-0.6。
5.2 M13KO7感染培养物(MOI＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。将菌液离心，并用等体积2×YT-AK(终浓度Amp 100μg/mL，Kan 100μg/mL)重悬沉淀，30℃培养过夜。
5.3将培养物离心，上清液可用于ELISA。
5.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μL/每孔GST-NC16A蛋白(4μg/mL)，对照组：100μL/每孔蛋白稀释液(0μg/mL)。
5.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μL的0.05％PBST洗涤三遍。
5.6封闭：每孔加入300μL的5％脱脂牛奶(PBS溶解)，37℃封闭2小时。
5.7噬菌体孵育：每孔中加入100μL噬菌体上清，32℃孵育2小时。
5.8洗涤：同步骤4.5。
5.9二抗孵育：每孔加入100μL用封闭液稀释的anti-M13-HRP antibody(1:9000)，32℃孵育1小时。
5.10洗涤：同步骤4.5。
5.11显色：每孔加100μL TMB，室温孵育，然后每孔加50μL 2M HCl终止反应。
5.12读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。读板结果如表13所示。
表13阳性单克隆噬菌体ELISA的结果
Figure BDA0003371529580000151
6.抗体序列的测序
筛选得到的噬菌体阳性克隆，进行全序列测序，得到相应的抗体重链轻链，以及全序列如表14所示。
表14 76F-GST-NC16A-R2P1-H2单克隆抗体序列
Figure BDA0003371529580000152
76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体的重链碱基序列如下(SEQ ID NO：15)：
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACACCTTTACCAACTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACTAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGGTTACAATGGTAACACACACTATGCACAGAAGCTCCAGGACAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGATGAGGAGCCTGGGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTACCTGCCCGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCCCTCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGA；
76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体的重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO：16)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGISWVRQAPGLGLEWMGWISGYNGNTHYAQKLQDRVTMTTDTSTSTAYMEMRSLGSDDTAVYYCARDYLPGYCSSTSCPHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体的轻链碱基序列如下(SEQ ID NO：17)：
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGCGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTACGTACGGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGA；
76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体的轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO：18)：
QPVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例三：ELISA检测抗体不同稀释浓度条件下的OD值
酶联免疫吸附反应ELISA实验步骤：
1.包被：100μL/每孔GST-NC16A蛋白(4μg/mL)包被酶标板，4℃孵育过夜。
2.洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μL的0.05％PBST洗涤三遍。
3.封闭：每孔加入300μL的5％脱脂牛奶(PBS溶解)，37℃封闭2小时。
4.阳性抗体孵育：将76F-GST-NC16A-R2P1-H2抗体进行梯度稀释，每孔中加入100μL稀释后的抗体溶液，37℃孵育1小时。
5.洗涤：同步骤4.5。
6.二抗孵育：用封闭液10000倍稀释Goat Anti-Human IgG(H+L)antibody(Jackson，code：109-035-088)，每孔加入100μL稀释的二抗，37℃孵育30分钟。
7.洗涤：同步骤4.5。
8.显色：每孔加100μL TMB，37℃孵育10分钟，然后每孔加50μL 2M HCl终止反应。
9.读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，如图6所示。
从图6的结果来看，证明了76F-GST-NC16A-R2P1-H2与BP180具有较强的特异性结合的能力。
本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入本公开的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州方科生物科技有限公司
苏州系统医学研究所
中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所)
<120> 结合BP特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
<130> 6A59-2103407I
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL FR1
<400> 1
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH FR1
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL CDR1
<400> 3
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH CDR1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL FR2
<400> 5
Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH FR2
<400> 6
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL CDR2
<400> 7
Arg Asn Asn
1 3
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH CDR2
<400> 8
Ile Ser Gly Tyr Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL FR3
<400> 9
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH FR3
<400> 10
His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Met Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL CDR3
<400> 11
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH CDR3
<400> 12
Ala Arg Asp Tyr Leu Pro Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Pro His
1 5 10 15
Phe Asp Tyr
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL FR4
<400> 13
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH FR4
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 1371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH
<400> 15
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggtta cacctttacc aactatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggactag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcggtt acaatggtaa cacacactat 180
gcacagaagc tccaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagatga ggagcctggg atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagattac 300
ctgcccggat attgtagtag taccagctgc cctcactttg actactgggg ccagggcacc 360
ctggtcaccg tctcgagtgc tagcaccaag ggaccttctg tgttccctct ggctccttct 420
tctaagtcca cttccggtgg tacagcagct ctgggttgtc tggtgaagga ttacttccca 480
gaaccagtga ctgtgtcctg gaactccgga gctctgactt ctggagtgca tactttccca 540
gcagtgctgc aatctagcgg actgtactct ctgtcttccg tggtgactgt gccttcttct 600
tccctgggga ctcaaactta catctgcaac gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg 660
gacaagaagg tggagccaaa gagctgcgat aagacccaca cctgtccacc ttgtccagct 720
ccagaactgc tgggtgggcc ttctgtgttt ctgttcccac ctaagccaaa ggataccctg 780
atgatctcta ggaccccaga agtgacctgt gtggtcgtcg atgtgtctca tgaagaccct 840
gaagtgaagt tcaactggta cgtggacggg gtggaagtgc ataacgcaaa gaccaagccc 900
agggaagagc aatacaactc cacctacagg gtggtctccg tcctgacagt cctgcatcag 960
gattggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca ataaagccct gcctgcccct 1020
atcgagaaaa ccattagcaa agccaaaggc cagcccaggg agccccaggt ctatacactg 1080
ccccccagca gggaggagat gacaaaaaat caggtcagcc tgacatgcct ggtcaaaggc 1140
ttttatccca gcgacattgc cgtcgagtgg gagtccaatg gccagcccga gaataattat 1200
aaaacaacac cccccgtcct ggacagcgac ggcagctttt ttctgtatag caaactgaca 1260
gtcgataaaa gcaggtggca gcagggcaat gtcttttcct gcagcgtcat gcacgaggcc 1320
ctgcacaatc actatactca gaaaagcctg agcctgtccc ccgggaaatg a 1371
<210> 16
<211> 456
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VH
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Gly Tyr Asn Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Leu Pro Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Pro His
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 17
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL
<400> 17
cagcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagcg ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta cgtacggtgg ctgcaccttc tgtgttcatc 360
ttccctccat ctgatgagca gctgaagtct ggaaccgcat ctgtcgtctg tctgctgaac 420
aacttttacc ccagggaggc taaggtccaa tggaaggtgg acaacgccct gcagtctggt 480
aatagccagg aaagcgtgac cgaacaggat tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc 540
acactgacac tgagcaaagc cgactatgaa aagcacaaag tgtatgcctg cgaggtcact 600
catcagggcc tgtccagccc cgtgactaaa agctttaata ggggggagtg ctga 654
<210> 18
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of VL
<400> 18
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 19
acaggtgccc actcccaggt gcag 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 20
aaggtgtcca gtgtgargtg cag 23
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 21
cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 22
caaggagtct gttccgaggt gcag 24
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 23
atgaggstcc cygctcagct gctgg 25
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 24
ctcttcctcc tgctactctg gctcccag 28
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 25
atttctctgt tgctctggat ctctg 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 26
ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 27
ggtcctgggc ccagtctgcc ctg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 28
gctctgtgac ctcctatgag ctg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 29
ggtctctctc scagcytgtg ctg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 30
gttcttgggc caattttatg ctg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 31
ggtccaattc ycaggctgtg gtg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 32
gagtggattc tcagactgtg gtg 23
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 33
tgctgtcctt gctgtcctgc t 21
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 34
caccagtgtg gccttgttgg cttg 24
<210> 35
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of BP180
<400> 35
Gly Ser Glu Glu Val Arg Lys Leu Lys Ala Arg Val Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Arg Ile Arg Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Gly Asp Ser Met Asp Arg Ile
20 25 30
Glu Lys Asp Arg Leu Gln Gly Met Ala Pro Ala Ala Gly Ala Asp Leu
35 40 45
Asp Lys Ile Gly Leu His Ser Asp Ser Gln Glu Glu Leu Trp Met Phe
50 55 60
Val Arg Lys Lys Leu Met Met Glu Gln Glu Asn Gly Asn Leu Arg
65 70 75
<210> 36
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of BP180
<400> 36
ggatccgagg aggtgaggaa gctgaaggcg cgtgtggatg agctggagag gatcaggagg 60
agcatactgc cctatgggga cagcatggat agaatagaaa aggaccgcct ccagggcatg 120
gcacccgcgg cgggagcaga cctggacaaa attgggctgc acagtgacag ccaggaggag 180
ctctggatgt tcgtgaggaa gaagctaatg atggaacagg aaaatggaaa tctccgatga 240
ctcgag 246

Claims (15)

1.分离的抗BP180的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中，编码所述重链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(a1)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(a2)与SEQ ID NO：4所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(a3)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(a4)与SEQ ID NO：8所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(a5)如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(a6)与SEQ ID NO：12所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
所述重链可变区为根据IMGT的分析方法编码。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中，编码所述轻链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(b1)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
(b2)与SEQ ID NO：3所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
(b3)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
(b4)与SEQ ID NO：7所示的序列相比，存在1个或2个保守突变的氨基酸序列；
(b5)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
(b6)与SEQ ID NO：11所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
所述轻链可变区为根据IMGT的分析方法编码。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(CDR)1、VL互补决定区(CDR)2和VL互补决定区(CDR)3，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(CDR)1、VH互补决定区(CDR)2和VH互补决定区(CDR)3；并且，
所述VL由如下氨基酸编码：VLCDR1包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，VLCDR3包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
所述VH由如下氨基酸编码：VHCDR1包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，VHCDR2包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，VHCDR3包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，编码所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
(i)VH包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所示序列相比，存在保守突变的序列。
5.一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(a)-(d)中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17任一序列或其组合所示的核苷酸序列；
(b)包含如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17任一序列或其组合所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(c)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)-(b)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)-(c)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
6.一种载体，其中，所述载体包含根据权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种分离的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的载体。
8.一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法，其中，所述方法包含利用权利要求6所述的载体，转化初始宿主细胞的步骤。
9.一种制备目标蛋白的方法，所述方法包含利用权利要求7所述的宿主细胞或通过权利要求8所述的方法，制备所述目标蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法制备的抗体或其结合片段。
11.一种检测抗BP180抗体的方法，其中，所述方法包括使用权利要求1-4任一项或权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段对待测样品进行检测的步骤；
可选地，所述方法包括对待测样品中的抗BP180抗体进行定量的步骤。
12.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据权利要求1-4任一项或权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种组合物，其中，所述组合物中含有根据权利要求1-4任一项或权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求1-4任一项或权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求14所述的组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
(1)检测抗BP180抗体，或制备用于检测抗BP180抗体的试剂或试剂盒；
(2)制备用于诊断大疱性类天疱疮的试剂或试剂盒；
(3)制备用于监测大疱性类天疱疮的病情进展的试剂或试剂盒；
(4)制备用于研究大疱性类天疱疮的致病机理的试剂或试剂盒。
15.一种预防或治疗大疱性类天疱疮的方法，其中，使用根据权利要求1-4任一项或权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求13所述的组合物给予受试者。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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