MX2007000104A - Anticuerpos anti-tnf-? de gran afinidad y metodo. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-TNF-? humano aislado, o su porcion de union a antigenos, que contiene por lo menos una cadena de anticuerpos VL o VH de gran afinidad que es eficaz, cuando se sustituye con la correspondiente cadena VL o VH del anticuerpo antri-TNF-? scFv que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1, para unirse al TNF-? con una constante de indice Koff que es por lo menos 1,5 veces menor que aquella del anticuerpo que tiene SEQ ID NO: 1, segun lo determinado bajo condiciones identicas.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TNF-a DE GRAN AFINIDAD Y MÉTODO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos anti-TNF-a humanos con actividad de unión mejorada, y métodos para producir y usar dichos anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de necrosis tumoral a o TNF-a es una citocina reconocida como el principal mediador de la respuesta del organismo a las bacterias gramnegativas. La fuente principal de TNF-a consiste en los fagocitos mononucleares activados por LPS, aunque la citocina también es producida por células T activadas por antígenos, células NK activadas y mastocitos activados (Abbas et al). En bajas concentraciones, el TNF-a tiene una diversidad de acciones biológicas útiles, incluyendo la promoción de acumulación de leucocitos en sitios locales de inflamación, la activación de leucocitos inflamatorios para destruir microbios y la remodelación de tejido, que son críticas para las respuestas inflamatorias locales a los microbios.

Cuando el TNF-a está presente en concentraciones mayores, o bajo ciertas condiciones de ¡nmunorrespuesta, puede contribuir a una diversidad de patologías o trastornos, incluyendo choque septicémico, trastornos autoinmunitahos, enfermedades injerto contra huésped, rechazo de trasplante y trombosis intravascular.

Dado que el TNF-a se asocia con diversas condiciones patológicas en seres humanos, se ha propuesto tratar o aliviar estas condiciones en seres humanos mediante la administración de un anticuerpo TNF-a. Con este fin, distintos grupos han descrito el desarrollo de los anticuerpos TNF-a. Los primeros intentos dentro de estas líneas se dirigieron a producir anticuerpos monoclonales de ratón específicos contra TNF-a humano (hTNF-a). Si bien estos anticuerpos exhibían gran afinidad hacia el hTNF-a y neutralizaban la actividad del hTNF-a, su uso en seres humanos estuvo limitado por una serie de limitaciones conocidas asociadas con la administración de anticuerpos de ratón a sujetos humanos. Una solución a la limitación de anticuerpos de ratón ha sido el desarrollo de anticuerpos parcialmente humanizados, típicamente uniendo regiones variables de un anticuerpo de ratón con las regiones constantes de un anticuerpo humano. Otra solución es derivar un anticuerpo anti-TNF-a totalmente humano usando tecnología celular de hibridoma humano, aunque este último planteamiento tiene aun que producir anticuerpos anti-TNF-a con afinidades de unión adecuadas para uso terapéutico. Más recientemente, se ha descrito un anticuerpo TNF-a totalmente derivado de ser humano elaborado mediante tecnología recombinante, y que tiene propiedades de unión y neutralización adecuadas para la terapia (véanse las patentes estadounidenses Nos. 6.090.382 y 6.509.015). A pesar de estos avances, permanece la necesidad de un anti-TNF-a que tenga mejores propiedades de afinidad de unión, p. ej., un valor KD o K0ff que sea por lo menos 1 ,5 veces, preferiblemente por lo menos 2 veces, inferior a aquel de los anticuerpos TNF-a de la mayor afinidad disponibles hasta el momento. Dicho anticuerpo de unión mejorada sería eficaz en una dosis sustancialmente menor que los anticuerpos actualmente disponibles y/o permitiría un tratamiento más eficaz en una dosis comparable. Estas ventajas tienen el potencial de reducir el costo y/o mejorar el resultado terapéutico cuando se trata una diversidad de condiciones asociadas con el TNF-a.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención incluye, en un aspecto, un anticuerpo anti-TNF-a humano aislado, o su porción de unión a antígenos, que contiene por lo menos una cadena de anticuerpos VL o VH de gran afinidad que es eficaz, cuando se sustituye con la correspondiente cadena VL o VH del anticuerpo anti-TNF-a scFv que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 , para unirse al TNF-a humano con una constante de disociación KD o constante de índice K0ff que es por lo menos 1 ,5 veces menor, preferiblemente por lo menos dos veces menor, que aquella del anticuerpo que tiene SEQ ID NO: 1 , según lo determinado bajo condiciones idénticas. Las secuencias ilustrativas de las cadenas de anticuerpo VL y VH se identifican por SEQ ID NOS 2 y 7. Las secuencias ilustrativas incluyen aquellas en las que por lo menos una de las regiones VL CDR1 , CDR2 y CDR3 puede tener una secuencia que se identifica mediante SEQ ID NOS: 3, 4 y 5, respectivamente, y donde por lo menos una de las regiones VH CDR1 , CDR2 y CDR3 puede tener una secuencia que se identifica mediante SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, respectivamente. En un aspecto relacionado, la invención incluye un anticuerpo anti-TNF-a humano aislado, o su porción de unión a antígenos, que tiene cadenas de anticuerpos V y VH cuyas secuencias se identifican por SEQ ID NOS 2 y 7, respectivamente. Las secuencias y modalidades ilustrativas son tal como se indicó anteriormente. En otro aspecto de la invención, se provee un método para tratar una condición que está agravada por la actividad del TNF-a en un sujeto mamífero. En la práctica del método, el anticuerpo anti-TNF-a humano de afinidad mejorada anteriormente mencionado, o su porción de unión a antígenos, se administra al sujeto, en una cantidad suficiente para mejorar la condición en el sujeto. Las secuencias o modalidades ilustrativas del anticuerpo son tal como se describió anteriormente. También se describe un método para identificar anticuerpos anti- TNF-a humanos con afinidad de unión mejorada. En la práctica del método, las variaciones de las secuencias de aminoácidos contenidas en SEQ ID NOS: 2 y 7 para las CDR de VL y VH, respectivamente, del anticuerpo anti-TNF-a definido por SEQ ID NO: 1 , se usan para construir una biblioteca de secuencias codificantes de anticuerpos que codifican las cadenas VH y VL del anticuerpo. La biblioteca de las secuencias codificantes puede incluir: (a) una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes que codifican combinaciones de las variaciones de la secuencia de aminoácidos de V y VH CDR contenidas en por lo menos una de las secuencias VL o VH especificadas por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7, (b) una biblioteca de mutagénesis Walk Through que codifica, por lo menos una de las CDR, la misma sustitución de aminoácido en múltiples posiciones de aminoácidos dentro de esa CDR, donde el aminoácido sustituido corresponde a una variación de aminoácido hallada en por lo menos una posición de aminoácido de las secuencias V o VH especificadas por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7, para esa CDR, o (c) una biblioteca de secuencias de mutación de saturación localizada que codifica por lo menos una de dichas CDR, los 20 L-aminoácidos naturales en una posición del aminoácido que admite una variación de secuencia en por lo menos una de las secuencias VL o VH especificadas por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7. La biblioteca de secuencias codificantes se expresa en un sistema de expresión en el que los anticuerpos anti-TNF-a codificados se expresan en un sistema de expresión seleccionable, y se seleccionan aquellos anticuerpos que tienen las menores constantes de KD (o EC50) o índices Koff para el TNF-a humano. La biblioteca de secuencias codificantes se puede construir identificando las posiciones de los aminoácidos que son invariantes dentro de una o más CDR seleccionadas, y reteniendo los codones para el aminoácido invariante en las secuencias codificantes de anticuerpos de la biblioteca. La biblioteca de secuencias codificantes puede ser una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes construida (i) produciendo una biblioteca primaria de la secuencia codificante que codifica anticuerpos, una variación de aminoácido sencilla contenida en por lo menos una de las secuencias VL o VH especificadas por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7, y (ii) entremezclando las secuencias codificantes en la biblioteca primaria para producir una biblioteca de secuencias codificantes que tenga múltiples variaciones de aminoácidos contenidas en por lo menos una de las secuencias de V o VH especificadas por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7. En una modalidad relacionada, la biblioteca de las secuencias codificantes es una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes construida generando secuencias codificantes que tienen, en cada posición de variación de aminoácidos, codones para el aminoácido de tipo salvaje y para cada uno de los aminoácidos variantes. En esta modalidad, las regiones codificantes CDR1-CDR3 de la biblioteca de secuencias codificantes para la cadena VL pueden tener las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 11-13, respectivamente. Las regiones codificantes CDR1-CDR3 de la biblioteca de secuencias codificantes para la cadena VH pueden tener las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 14-16, respectivamente. La biblioteca de secuencias codificantes se puede construir para codificar múltiples aminoácidos positivamente cargados en el dominio CDR-L1 o múltiples aminoácidos polares en el dominio CDR-H3. El sistema de expresión empleado en el método puede ser un sistema de expresión de levadura, y la biblioteca de secuencias codificantes puede codificar anticuerpos scFv anti-TNF-a. La biblioteca de secuencias codificantes puede incluir, para las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena VL, las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 11-13, respectivamente, y aquellas para las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena VH pueden incorporar las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 14-16, respectivamente. El anticuerpo se puede expresar en un formato scFv, el sistema de expresión empleado puede ser un sistema de expresión de levadura, y la selección de anticuerpos de gran afinidad se puede basar en una selección cinética para seleccionar anticuerpos en base a las constantes de unión K0ff mejorada. En otro aspecto, la invención incluye secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 11-16, para uso en la construcción de secuencias codificantes para generar anticuerpos anti-TNF-a humanos que tengan una o más de las sustituciones de aminoácidos en las regiones VL y VH CDR de mutaciones identificadas en SEQ ID NOS: 2 y 7, respectivamente. Estos y otros objetos y características de la invención serán más evidentes a partir de la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención, junto con los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Fig. 1A y 1B muestran la disposición de las CDR de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) en un gen de anticuerpo scFv anti-TNF-a sintético (1A) e ilustran la aplicación de mutagénesis Look Through (LTM) para introducir un aminoácido de leucina en cada uno de los catorce residuos 56-69 en la región VH CDR2 del anticuerpo. La Fig. 2 muestra cambios mínimos de base del codón necesarios para producir una sustitución Gly-His en un codón seleccionado en una mutagénesis Walk Through (WTM). Las Fig. 3A-3D ilustran cambios mínimos de base del codón para introducir una sustitución His en cada uno de los siete residuos de aminoácidos en un polipéptido (3A), dada la secuencia codificante natural para estos residuos (3B), cambios en la primera o las primeras dos posiciones de codones de cada uno de los siete codones (3C) y la distribución resultante de los residuos de sustitución en cada posición (3D). Las Fig. 4A-4C muestran la disposición de las CDR de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) en un gen de anticuerpo scFv anti-TNF-a sintético (4A), la aplicación de mutagénesis Walk Through para introducir un aminoácido de aspartato en cada uno de los 14 residuos 56- 69 en la región VH CDR2 del anticuerpo (4B), y las sustituciones de codones mínimas en 18 posiciones de bases diferentes necesarias para introducir aspartato en cada una de las catorce posiciones de residuos diferentes (4C). Las Fig. 5A-5C muestran la disposición de las CDR de cadena ligera y cadena pesada en un gen de anticuerpo scFv anti-TNF-a sintético (5A), y las secuencias de aminoácidos para tres anticuerpos anti-TNF-a para las cadenas VH (5B) y VL (5C). Las Fíg. 6A-6D muestran relaciones de dopaje de bases de nucleótidos para lograr una relación deseada de aminoácidos sustituidos en un procedimiento de mutagénesis Walk-Through para introducir alanina (6A), leucina (6B), tirosina (6C) y prolina (6D) en cada posición de la región CDR2 de la cadena E2D7 VH. Las Fig 7A-7D muestran distribuciones representativas de las sustituciones de aminoácidos en la región CDR2 de las cadenas E2D7 VH usando las secuencias codificantes que se muestran en 6A-6D, respectivamente. La Fig. 8 ilustra las etapas en la detección de anticuerpos anti-TNF-a formados de acuerdo con la presente invención para gran afinidad de unión en base a la unión de equilibrio al TNF-a. La Fig. 9 muestra las curvas de unión de equilibrio para células que expresan anticuerpos antes de la selección (círculos), después de una tanda de selección (triángulos claros), después de dos tandas de selección (triángulos oscuros) y para el anticuerpo de referencia D2E7 anti-TNF-a. Las Fig 10A y 10B muestran mutaciones en las regiones CDR VH (10A) y V (10B) de un anticuerpo scFv anti-TNF-a humano que se asocian con la afinidad de unión de equilibrio mejorada (1 ,5 veces o más para KD de EC50 en relación con el anticuerpo de referencia D2E7). La Fig. 11 ilustra las etapas en la detección de los anticuerpos anti-TNF-a formados de acuerdo con la presente invención para gran afinidad de unión en base a la cinética de unión con respecto a TNF-a, para determinar las constantes K0ff de los anticuerpos.

Las Fig. 12A y 12B muestran mutaciones en las regiones CDR VH (12A) y VL (12B) de un anticuerpo scFv anti-TNF-a humano que se asocian con valores de unión K0ff mejorados (1 ,5 veces o más para K0ff en relación con el anticuerpo de referencia). Las Fig 13A y 13B muestran mutaciones beneficiosas en las regiones CDR VH (13A) y VL (13B) de un anticuerpo scFv anti-TNF-a humano, que representan la combinación de mutaciones en las Fig 10A y 10B, y 12A y 12B, para constantes de unión de equilibrio y cinética, respectivamente. Las Fig 14A-14F muestran el diseño de oligonucleótidos degenerados usados en la formación de bibliotecas que codifican combinaciones de las mutaciones beneficiosas a partir de las Fig. 13A y 13B, en todas las combinaciones de VH CDR1 , CDR2 y CDR3 (Fig. 14A-14C, respectivamente), y todas las combinaciones de VL CDR1 , CDR2 y CDR3 (Fig. 14D-14E, respectivamente). La Fig. 15 ilustra el ensamble de oligonucleótidos para producir la secuencia codificante scFv de tipo salvaje D2E7. Las Fig. 16A-16D ilustran las etapas en la producción de una biblioteca LTM VH CDR2. Las Fig. 17A-17D ilustran las etapas en la producción de una biblioteca LTM VH CDR múltiple. La Fig. 18 muestra una gama de combinaciones de la biblioteca LTM en las CDR VH y VL. La Fig. 19 muestra la construcción de un vector de expresión de levadura para exhibir proteínas de interés en la superficie extracelular de S. cerevisiae. La Fig. 20 es un trazado FACS de unión de TNF-a biotinilado y estreptavidina FITC a D2E7 scFv. La Figura 21 ejemplifica un subconjunto de clones mejorados que tienen valores EC50 inferiores con respecto al anticuerpo D2E7. Las Fig. 22A-22C son trazados FACS que muestran una apertura de selección (el trapezoide R1) para identificar únicamente aquellos clones que expresan la fusión scFv con una afinidad de unión mayor al TNF-a que el anticuerpo D2E7 (22A), la distribución de las afinidades de unión de la biblioteca LTM total (22B), y un análisis FACS post-clasificación (Figura 21 panel derecho) para confirmar que >80% de los clones anti-TNF-a scFv pre-detectados estudiados estaban dentro de los criterios predeterminados. La Fig. 23 demuestra el efecto de dos clones, 3ss-35 y 3ss-30 que tienen un K0ff relativo superior comparado con D2E7. Las Fig. 24A y 24B identifican clones de mutación mixta, que muestran 63 secuencias únicas para clones scFv anti-TNF-a recuperadas de las bibliotecas WTM de mutación mixta detectadas por ensayos de k0ff en las cadenas VH y V , respectivamente. Las Fig 25A-25G muestran una determinación Biacore de cinética de unión de anti-TNF-a de tipo salvaje D2E7 (25A) y seis clones anti-TNF-a scFv con afinidad mejorada (25B-25G). La Fig. 26 es una comparación de índices de disociación normalizados entre los diferentes anti-TNF-a scFv, que también muestra aquel de D2E7. Las Fig. 27A y 27B muestran sustituciones de aminoácidos en los clones K0ff identificados de la cadena ligera (27A) y la cadena pesada (27B) de scCF anti-TNF-a. La Fig. 28 es un análisis gráfico de una curva de dosis y respuesta de L929 TNF-a a partir de los resultados de la Tabla 3. La flecha de dos cabezas indica el intervalo eficaz de concentración de TNF-a. La Fig. 29 muestra un análisis gráfico de la respuesta a la dosis de L929 a 175 pg/mL TNF-a. La Fig. 30 muestra un análisis gráfico de la respuesta a la dosis de L929 a 350 pg/mL TNF-a; y La Fig. 31 es una curva de supervivencia de dosis y respuesta en células L929 en neutralización de TNF-a por clones CBM anti-TNF-a de afinidad mejorada (A1 , 2-44-2, 1-3-3, 2-6-1) en comparación con los controles positivos de anti-TNF-a Humira y D2E7.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones Los términos y expresiones a continuación tienen las siguientes definiciones utilizadas en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario. La expresión "TNF-a humano" o "TNF-a" se refiere a la citocina humana que existe como una forma secretada de 17 kD y una forma asociada de membrana de 26 kD, cuya forma biológicamente activa está compuesta por un trímero de moléculas 17 kD no covalentemente unidas, como lo describen, por ejemplo, Pennica, D., et al (1984) Nature 312:724-729; Davis, J. M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; y Jones, E. Y., eí al. (1989) Nature 338:225-228. El término "anticuerpo", tal como se emplea en la presente memoria, tiene como fin referirse a moléculas de inmunoglobulina comprendidas por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena consiste en una porción variable, VH y VL para las porciones pesada variable y ligera variable, respectivamente, y una región constante, denotada CH y CL para las porciones constante pesada y constante ligera, respectivamente. La porción CH contiene tres dominios CH1 , CH2 y CH3. Cada porción variable está compuesta por tres regiones que determinan complementaridad hipervariable (CDR) y cuatro regiones marco (FR). El término "anticuerpo" también abarca fragmentos de anticuerpo, como (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios V , VH, CL y ,1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y Ch1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementaridad aislada (CDR). A su vez, si bien los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir por métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite elaborarse como una cadena de proteína sencilla en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston eí al (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883). El término anticuerpo también abarca anticuerpos que tienen este formato scFv. La expresión "anticuerpo humano", tal como se emplea en la presente memoria, tiene como fin incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea de gérmenes humanos. La expresión "anticuerpo humanizado" tiene como fin incluir anticuerpos en los que una o más regiones o dominios del anticuerpo derivan de un origen no humano, p. ej., un anticuerpo en el que una de las CDR de cadena pesada o ligera deriva de un anticuerpo anti-TNF-a de ratón, es decir, tiene la misma secuencia codificante o la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia mucho más relacionada con un anticuerpo anti-TNF-a de ratón que con un anticuerpo anti-TNF-a humano. La expresión "anticuerpo recombinante", tal como se emplea en esta memoria, tiene como fin incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedante. La expresión "anticuerpo aislado", tal como se emplea en la presente memoria, tiene como fin referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes. Un "anticuerpo neutralizador", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a un anticuerpo cuya unión a TNF-a produce la inhibición de la actividad biológica del TNF-a, según lo evaluado midiendo uno o más indicadores de TNF-a, como activación celular inducida por TNF-a o unión de TNF-a a receptores de TNF-a. Estos indicadores de actividad biológica se pueden determinar mediante ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la técnica. El término "K0ff". tal como se emplea en la presente memoria, tiene como fin referirse a la constante del índice off para disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno, según lo determinado a partir de una selección cinética. El término "KD", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, y describe la concentración de antígeno requerida para ocupar una mitad de todos los sitios de unión a anticuerpos presentes en una disolución de moléculas de anticuerpos en equilibrio, y es igual a K0ff/K0n, las constantes de los índices on y off para el anticuerpo. La constante de asociación KA del anticuerpo es 1 /KD- La medición de KD presupone que todos los agentes de unión están en disolución. En el caso en que el anticuerpo esté anclado a una pared celular, p. ej., en un sistema de expresión de levadura, la constante del índice de equilibrio correspondiente se expresa como EC50, lo que proporciona una buena aproximación de KD. La expresión "anticuerpo anti-TNF-a de referencia" se refiere al anticuerpo scFv descrito en las patentes estadounidenses Nos. 6.509.015 y 6.090.382. Este anticuerpo tiene una secuencia codificante derivada exclusivamente de la línea de gérmenes humana. También se identifica en esta memoria como anticuerpo E2D7 scFv, y por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Las abreviaturas de los aminoácidos de tres letras y una letra y las abreviaturas de nucleótidos de una sola letra que se emplean en esta memoria, se utilizan de acuerdo con la convención establecida, como se muestra en cualquier libro de texto de bioquímica o biología molecular convencional. II. Generación de anticuerpos anti-TNF-a de afinidad mejorada Esta sección describe métodos para generar anticuerpos anti-TNF-a de gran afinidad, de acuerdo con la invención. El planteamiento general consiste en emplear mutagénesis Look-Through (LTM) para producir un conjunto de secuencias codificantes que contienen una sustitución de aminoácido seleccionada en cada una de las posiciones de residuo de aminoácidos en cada una de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada (CDR). Típicamente, las secuencias codificantes codifican un anticuerpo scFv anti-TNF-a, y están contenida en un vector usado para transformar un sistema de expresión adecuado tal como un sistema de expresión de levadura. Para cada una de las cadenas VL y VH, las mutaciones seleccionadas se pueden disponer en una posición seleccionada en una, dos o tres CDR de la cadena variable. Los anticuerpos anti-TNF-a producidos por el sistema de expresión se estudian luego para gran afinidad de unión, teniendo típicamente un KD (EC50) o Koff que es sustancialmente inferior, típicamente por lo menos 1 ,5 veces y preferiblemente por lo menos 2 veces inferior que el anticuerpo D2E7 scFv identificado por SEQ ID NO: 1 , según lo medido bajo condiciones idénticas. Cuando se mide de acuerdo con los métodos de unión de equilibrio (EC50) o cinética (K0ff) descritos a continuación, los anticuerpos de gran afinidad tienen valores EC50 inferiores a aproximadamente 10"8 M y/o constantes de índice K0ff inferiores a 10"4 seg"1, las afinidades más altas hasta ahora descritas para anticuerpos anti-TNF-a. El método LTM preferiblemente emplea un subconjunto representativo de nueve aminoácidos, como se describe a continuación. Una vez que se identifican las mutaciones de CDR asociadas con afinidad mejorada, por LTM, estas mutaciones se utilizan para guiar la construcción de una biblioteca de secuencias codificantes a partir de las cuales se pueden expresar y seleccionar anticuerpos de afinidad incluso mayor. Entre las bibliotecas que se pueden codificar se encuentran: (a) una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes que codifican combinaciones de las variaciones de secuencias de aminoácidos VL y VH CDR identificadas por el método LTM; (b) una biblioteca de mutagénesis Walk Through que codifica por lo menos una de las CDR, la misma sustitución de aminoácidos en múltiples posiciones de aminoácidos dentro de esa CDR; y (c) una biblioteca de secuencias de mutación de saturación localizada que codifica por lo menos una de dichas CDR, los 20 L-aminoácidos naturales en una posición de aminoácido que admite una variación de secuencia identificada por el método LTM. Estas bibliotecas se usan para codificar anticuerpos en un sistema de expresión adecuado, como un sistema de expresión de levadura que permite la identificación de los anticuerpos de gran afinidad deseados. A. Mutaqénesis Look Through (THM) El propósito de la mutagénesis Look-Through (LTM) es introducir una sustitución seleccionada en cada una de las posiciones de mutación diana en una región de un polipéptido, p. ej., las regiones CDR de la cadena de anticuerpo variable. A diferencia de los métodos combinatorios o la mutagénesis Walk Through (WTM), que permiten las sustituciones de residuos en todas y cada una de las posiciones en un polipéptido sencillo, la LTM limita sustituciones a una posición seleccionada sencilla. Esta característica se ilustra en las Fig, 1A y 1 B. Como se muestra en la Fig. 1A, el anticuerpo, indicado en 20, está compuesto de una cadena pesada (VH) variable 22, una cadena liviana (VL) variable 24 y un enlazador de péptido 26 que une las dos cadenas. La cadena VH 22 está a su vez compuesta por tres regiones CDR hipervariables 28, 30 y 32 (sombreado claro, también denotadas en la presente memoria como CDR1 , CDR2 y CDR3, y D1 , D2, D3, respectivamente), y cuatro regiones de marco (FR), como una región 34 (sombreado oscuro). De modo similar, la cadena ligera (VL) variable está compuesta por tres regiones CDR hipervariables 36, 38 y 40 (sombreado claro, también denotadas en la presente memoria como CDR1 , CDR2 y CDR3, y D4, D5, D6, respectivamente), y cuatro regiones de marco FR), como la región 42 (sombreado oscuro). La Fig 1 B muestra la secuencia de aminoácidos de catorce residuos de la región VH CDR2 del CDR1 de tipo salvaje (línea superior) y debajo, catorce secuencias que tienen una sustitución leu sencilla en cada una de las posiciones a lo largo de la CDR. El propósito del método LTM ilustrado en la Fig. 1B es sustituir un residuo Leu sencillo en cada una de las catorce posiciones 56-69. Esto se logra generando, además de la secuencia codificante de tipo salvaje, catorce secuencias codificantes adicionales que proporcionan individualmente un codón Leu TTG o TTA en cada una de las catorce posiciones de codones diferentes. Se genera un total de catorce péptidos diferentes, y no se producen secuencias "indeseadas" o de sustitución múltiple. B. Mutaqénesis Walk-Throuah (WTM) El objeto de la mutagénesis Walk-Through (WTM) es investigar el efecto en un polipéptido de sustituir un aminoácido seleccionado, p. ej., His, en cada una, o sustancialmente en cada una de las posiciones de los aminoácidos en una porción seleccionada del polipéptido. En el caso usual, las sustituciones de aminoácidos seleccionados se disponen en cada pluralidad de las posiciones de aminoácidos contiguos, donde la región diana para las mutaciones es típicamente entre 3-30 aminoácidos. El método se lleva a cabo de modo que se producen las sustituciones deseadas con el número mínimo de sustituciones de bases en las secuencias codificantes para la porción diana del polipéptido, y se conserva el aminoácido nativo (no mutado) en por lo menos una secuencia codificante. Es decir, en el conjunto de secuencias codificantes necesarias para efectuar una sustitución sencilla de aminoácido en cada posición diana, hay por lo menos una secuencia codificante para el polipéptido nativo y por lo menos una para cada una de las sustituciones deseadas. El método Walk-Through se ilustra en la Fig. 2, que muestra las sustituciones de bases necesarias para producir una sustitución Gly a His deseada en una secuencia codificante que contiene un codón GGT para Gly. Ya que hay tanto codones Gly como His con una base T de tercera posición (GGT y CAT, respectivamente), el número mínimo de sustituciones de bases necesario para codificar ambos aminoácidos es G y C en la primera posición, y G y A en la segunda posición del codón. Como se observa, los codones resultantes incluyen cuatro permutaciones igualmente probables, una que codifica Gly, una que codifica His y dos que codifican los codones "indeseados" para Asp y Arg. Las Fig 3A-3D ilustran la aplicación del mismo método para generar secuencias codificantes en donde un His está sustituido en cada posición de la secuencia de siete aminoácidos mer que se muestra en la Fig. 3A. Como arriba, el objetivo es generar un conjunto mínimo de secuencias codificantes, donde por lo menos una de ellas conserve el aminoácido original en cada posición, y las secuencias en las que His esté sustituido en cada una de las siete posiciones. La secuencia codificante para la secuencia de siete-mer de "tipo salvaje" se muestra en la Fig. 3B. Como se indica en la parte superior de la Fig. 3C, la meta es generar secuencias codificantes que contengan bien un codón His CAC o CAT en cada posición, y conservar la secuencia de aminoácido original en por lo menos una secuencia. Las sustituciones de bases necesarias pueden entonces determinarse a partir de una comparación de la secuencia de tipo salvaje con las bases que son necesarias para las secuencias de sustitución. El marco del medio en la Fig. 3C muestra las bases necesarias para insertar tanto un His como el aminoácido original en cada posición. Por ejemplo, para el primer codón, una mezcla 1 : 1 de G y C en la primera posición de base, y una mezcla a 1 :1 de G y A en la segunda posición produce cuatro codones, uno de los cuales codifica Gly, uno His, y uno de cada uno para los aminoácidos "indeseados" Arg y Asp. En el caso del quinto codón, para Arg, el codón CGT nativo se puede expandir para incluir tanto Arg como His, introduciendo bien una base G o A en la segunda posición, como se observa en la Fig. 3C. El número total de secuencias codificantes diferentes es 213 u 8.192, y el número total de secuencias de péptidos diferentes es 46 x 2 u 8.192. Estos números se han de comparar con el numero posible total de 5 secuencias codificantes producidas con secuencias codificantes generadas en forma aleatoria (421) y el número total de secuencias de aminoácidos diferentes que se podrían producir (207). Por consiguiente, el método Walk- Through también produce un porcentaje mucho mayor de los mutantes deseados (25%-50% en los ejemplos que se muestran en la Fig. 3D) que las 10 mutaciones generadas en forma aleatoria. El método Walk-Through se ilustra en las Fig. 4A-4C, para sustitución de un residuo Asp (D) para cada uno de los catorce residuos de aminoácidos en las posiciones 56-69 en el dominio V CDR1 del anticuerpo anti-TNF-a de referencia, cuyos componentes estructurales se muestran en la 15 Fig. 4A, similar a la Fig. 1A. La secuencia codificante de tipo salvaje y las 18 sustituciones de bases requeridas para formar un codón Asp en cada una de las 14 posiciones de residuos de aminoácidos se exponen en la Fig. 4C. Estas dieciocho sustituciones producen 218 o 262.144 secuencias codificantes diferentes, en la Fig. 4B se muestran los residuos de aminoácidos que serán 20 introducidos en cada una de las dieciocho posiciones VH CDR2 por estas secuencias codificantes, incluyendo las sustituciones "indeseadas" en seis de las posiciones. El objetivo del WTM, como ya se observó, es generar el conjunto I ap { eipSe más pequeño de secuencias codificantes que codifican la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las secuencias en las que cada residuo en una región o regiones seleccionadas de un polipéptido se sustituye con un aminoácido sencillo seleccionado. El aminoácido seleccionado para la sustitución dentro de cada CDR preferiblemente se selecciona entre aquellos que se identifican en el planteamiento LTM anteriormente expuesto, es decir, aminoácidos asociados, en una CDR particular, con actividad de unión mejorada. En una modalidad ilustrativa, el o los aminoácidos seleccionados para sustitución son aquellos que representan mutaciones beneficiosas en más de una posición de una CDR, por ejemplo, la región CDR1 de la cadena VL contiene sustituciones de lisina en cada una de tres de las 11 posiciones CDR1 , lo que sugiere que esta región se puede beneficiar de las sustituciones múltiples de un aminoácido positivo. Una biblioteca WTM adecuada contendría entonces codones para múltiples sustituciones de Lys, His o Arg dentro de esta CDR. La sección a continuación analiza técnicas de dopaje para controlar el número total del aminoácido seleccionado sustituido en una CDR. C. Métodos combinatorios En el planteamiento combinatorio, se generan secuencias codificantes que representan combinaciones de las mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de mutaciones beneficiosas diferentes dentro de una CDR sencilla, mutaciones dentro de dos o más CDR dentro de una cadena de anticuerpo sencilla, o mutaciones dentro de las CDR de diferentes cadenas de anticuerpos. Un planteamiento combinatorio se asemeja al método WTM excepto que las sustituciones del codón seleccionado dentro de las CDR son las diferentes sustituciones de aminoácidos beneficiosas identificadas por el LTM. Por lo tanto, no todas las posiciones de los residuos en una CDR del anticuerpo contienen una mutación, y algunas posiciones tendrán múltiples aminoácidos diferentes sustituidos en esa posición. En general, muchas, si no todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de una CDR o una cadena de anticuerpos estará representada por al menos una de las secuencias codificantes en la biblioteca. Como se observará a continuación, esta biblioteca de la secuencia codificante se puede preparar por una modificación del método WTM, excepto que en lugar de disponer codones para un aminoácido sencillo en cada posición diferente en la región codificante variable, los codones que se introducen son aquellos correspondientes a todas las mutaciones beneficiosas detectadas en el método LTM. Con el fin de mantener manejable el tamaño de esta biblioteca, las mutaciones se pueden limitar a una de las dos cadenas pesada o ligera solamente. Este planteamiento combinatorio se detalla a continuación. En un segundo planteamiento, los fragmentos de genes individuales que contienen una región CDR sencilla, y que tienen una variación de codón que codifica todas las combinaciones de mutaciones beneficiosas dentro de la CDR reconstruida, p. ej., por métodos de mezcla de genes, para producir secuencias que codifican las cadenas VL y V que tienen combinaciones de mutaciones beneficiosas en todas las CDR de una cadena determinada o en todas las CDR en ambas cadenas. Aqenesia En este planteamiento, las mutaciones beneficiosas identificadas por LTM se utilizan para identificar regiones "activas" de las CDR en las que se muestra que diferentes tipos de sustituciones de aminoácidos producen mutaciones beneficiosas. La biblioteca de secuencias codificantes en este planteamiento están diseñadas para codificar hasta e incluyendo cada uno de los 20 aminoácidos en cada uno de los "focos calientes" identificados en una o más de las seis CDR del anticuerpo. A la inversa, el planteamiento se puede llevar a cabo identificando los "focos fríos" y diseñando secuencias codificantes que saturan todas las posiciones de la CDR excepto los sitios de focos fríos. E Bibliotecas codificantes de scFv Las Fig 5A-5C ilustran la disposición y las secuencias representativas de un anticuerpo scFv anti-TNF-a 20. La disposición de las regiones de anticuerpos del anticuerpo scFV anti-TNF-a se muestra en la Fig. 5A, y es similar a la que se muestra en la Fig. 1A y en la Fig. 4A. La Fig. 5B muestra las secuencias de aminoácidos alineadas de la cadena pesada variable en tres anticuerpos anti-TNF-a, designados CDP571 , cA2 y en el anticuerpo de referencia D2E7. Las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena se muestran mediante por sobrerayado fuerte en 28, 30 y 32. Por lo tanto, por ejemplo, la región 5-mer CDR1 de la cadena pesada variable D2E7 tiene la secuencia DYAMH y las regiones 12-mer CDR3 de la misma cadena de anticuerpo tienen la secuencia DYADSVEGRFTI. De modo similar, la Fig. 5C muestra las secuencias de aminoácidos alineadas de la cadena ligera variable en los mismos anticuerpos, donde las tres CDR se identifican por sobrerayado. La síntesis de la secuencia codificante del anticuerpo de referencia D2E7 scFv que tiene la secuencia de aminoácido identificada por SEQ ID NO: 1 se describe en el Ejemplo 1. En síntesis, el gen scFv de tipo salvaje D2E7 (aproximadamente 1 kb) se ensambló in vitro por PCR de 30 oligonucleótidos que se muestra en la Fig. 15, cada uno de los oligonucleótidos tiene una porción de la secuencia scFv de longitud total contigua D2E7. Hubo 15 oligonucleótidos sentido y 15 antisentido que fueron en promedio, 40 pares de bases en longitud (variando en tamaño entre 35 y 70) y regiones complementarias superpuestas de aproximadamente 20 pares de bases en los oligonucleótidos cercanos en dirección 5' y en dirección 3'. Los 30 nucleótidos se identifican en la presente memoria como SEQ ID NOS: 52-81. Como se observará a continuación, los métodos LTM y WTM se aplican a las secuencias codificantes y de aminoácidos de una o más de las regiones CDR de cadena VH o V D2E7, para fines de generar anticuerpos cuya constante de unión sea sustancialmente mejorada con respecto al anticuerpo de referencia scFv E2D7. Más específicamente, las técnicas de LTM y WTM anteriormente descritas se usan para crear grupos de oligonucleótidos con mutaciones en una o más CDR de la cadena ligera o pesada del anticuerpo de referencia. Estos oligonucleótidos se sintetizan para incluir parte del marco circundante. Estos grupos de oligonucleótidos se utilizan para generar todas las cadenas VL y VH posibles en las que hay mutaciones en CDR sencillas, dobles y triples (CDR1 , 2 y 3) que usan PCR de extensión de superposición simple (SOE-PCR). Los métodos para generar grupos de oligonucleótidos LTM CDR y oligonucleótidos WTM se detallan en el Ejemplo 2. Los métodos para generar bibliotecas LTM y WTM a partir de estos grupos se detallan en el Ejemplo 3. Por ejemplo, para crear un grupo de las cadenas VH en las que tanto la V CDR1 como la V CDR2 se mutan y la VH CDR3 es de tipo salvaje, los oligonucleótidos de la CDR1 se usan primero como moldes y se lleva a cabo SOE-PCR para unir los oligonucleótidos de la CDR2 para generar el grupo doblemente mutado. Considerando que cada CDR puede ser de tipo salvaje o mutante, hay ocho combinaciones posibles para cada uno de los grupos de cadenas VL y VH. La combinación de los grupos de ocho VL y ocho V crea 64 combinaciones V -VH (SCFV), una de las cuales es de tipo salvaje, y 63 de las cuales no son del tipo salvaje. Cada una de las 64 combinaciones VL-VH (incluyendo la secuencia de tipo salvaje) se denomina subconjunto de toda la biblioteca LTM™ o WTM™ scFv. Se genera una biblioteca LTM™ o WTM™ scFv para cada aminoácido seleccionado para sustitución. El número de secuencias de aminoácidos representado dentro de cada biblioteca de subconjuntos depende de la longitud de la CDR, la secuencia de aminoácidos dentro de la CDR, y la estrategia de diseño del oligonucleótido LTM™ o WTM™. Las bibliotecas scFv individuales se construyen usando el método SOE-PCR (Horton, eí al., 1989), que proporciona un método rápido y simple para combinar fragmentos de ADN que no requieren sitios de restricción, endonucleasas de restricción o ADN ligasa. En el método SOE-PCR, se amplían primero dos oligonucleótidos por PCR usando cebadores diseñados de modo tal que los productos PCR comparten una secuencia complementaria en un extremo. Bajo condiciones de PCR, las secuencias complementarias se hibridan, formando una superposición. Las secuencias complementarias actúan luego como cebadores, permitiendo la extensión por ADN polimerasa para producir una molécula recombinante. Estos métodos se detallan en el Ejemplo 3. Hay dos restricciones adicionales impuestas a los procedimientos WTM y LTM anteriormente descritos. La primera se relaciona con el número total de aminoácidos donde se examina su sustitución en las regiones CDR del anticuerpo. Más que examinar el efecto de los 20 L-aminoácidos naturales, es más eficaz emplear un subconjunto de éstos que represente la diversidad química de todo el grupo. Un subconjunto representativo de L-aminoácidos que satisface este criterio incluye alanina, aspartato, lisina, leucina, prolina, glutamina, serina, tirosina e histidina. Estos aminoácidos exhiben una diversidad química adecuada en tamaño, carga, hidrofobicidad y capacidad de unión a hidrógeno para proveer información inicial significativa en la funcionalidad química necesaria para mejorar las propiedades de los anticuerpos. La opción de un subconjunto de aminoácidos puede también basarse en la frecuencia de ciertos aminoácidos en las CDR. Por ejemplo, si hay una opción entre tirosina y fenilalanina para representar un aminoácido con una cadena lateral aromática, la tirosina podrá ser una mejor opción de su preponderancia significativamente superior en sitios de unión de anticuerpos. Queda implícito en la selección de un subconjunto representativo de aminoácidos que una mutación beneficiosa, es decir, que mejora la actividad de unión o que neutraliza la actividad del anticuerpo, producida por la sustitución de un aminoácido en el subconjunto representativo, predecirá razonablemente que el o los aminoácidos que se relacionan con la mutación específica en tamaño, carga, hidrofobicidad y/o capacidad de unión a hidrógeno también producirá el mismo efecto positivo en la actividad del anticuerpo. En el presente caso, cada uno de los nueve aminoácidos del subconjunto representativo incluirá los aminoácidos relacionados que se muestran entre paréntesis: Ala (Gly); Asp (Glu); Lys (Arg); Leu (He y Val); Pro; Gin (Asn); Ser (Thr); Tyr (Phe Trp); y His. Por lo tanto, una mutación positiva a partir de Asp a Tyr, predecirá un efecto similar por Gly a Phe o Gly a Trp, y una mutación positiva, o sea, Met a Ser, predecirá una mutación positiva de Met a Thr. Una segunda restricción impuesta a las secuencias codificantes para WTM (pero no para LTM) abarca el uso de dopaje para controlar el porcentaje de secuencias que codifican bien el tipo salvaje o la mutación, teniendo 12% a 50% de las secuencias la mutación. El dopaje de las bases permite afinar el número de sustituciones de aminoácidos en la CDR de un miembro de la biblioteca WTM™. En el ejemplo anterior para las sustituciones de lisina, es improbable que fuese ventajoso para una CDR tener lisina en las siete posiciones, o incluso en la mayoría de las posiciones simultáneamente. Utilizando el dopaje, los oligonucleótidos se sintetizan de modo de mantener un promedio de 2-4 sustituciones de lisina por molécula o por CDR. En el caso de WTM de mutación mixta, el dopaje puede utilizarse adicionalmente para igualar la distribución esperada de mutaciones en cualquier posición determinada. Por ejemplo, si una base produce un nivel esperado de una sustitución determinada de 25%, y otra, un nivel esperado de un aminoácido diferente de solamente 12,5%, las cantidades relativas de las dos bases pueden estar en una relación 1 :2, para igualar las probabilidades de ver ambas mutaciones en cantidades iguales. Las Fig. 6A-6D muestran las sustituciones del codón WTM para introducir bien alanina (Fig. 6A), leucina (Fig. 6B), tirosina (Fig. 6C) o prolina (Fig. 6D) en una o más de las 14 posiciones de residuos en la región D2E7 VH CDR2 del anticuerpo de referencia definido por la secuencia TWNSGHIDYADSVE. En cada figura, las letras de la secuencia indican un nucleótido (A, C, G, o T) o una mezcla de dos nucleótidos, como se indica mediante los dos nucleótidos indicados sobre la letra. Por consiguiente, por ejemplo, en las primeras mezclas de dos nucleótidos que se muestran a la izquierda en la Fig. 6A, R es una mezcla de A y g, K es una mezcla de T y G, S es una mezcla de G y C, y así sucesivamente. Las cantidades molares relativas de cada nucleótido en una mezcla de dos nucleótidos se indican en las figuras, y son típicamente 4:1 (80:20) ó 1 :1 (50:50). Las relaciones 4:1 son relaciones de "dopaje" usadas para lograr un promedio de 3-4 mutaciones del aminoácido seleccionado (para la Fig. 6A, Ala) por anticuerpo expresado. Por tanto, la mezcla 4:1 de Ag en la primera posición codificante sustituida predice una sustitución Thr a Ala en únicamente 1 de cada cinco cadenas de anticuerpos expresadas. Las distribuciones representativas de sustituciones de aminoácidos producidas por las cuatro bibliotecas de secuencias codificantes de las Fig. 6A-6D se exponen en las Fig. 7A-7D, respectivamente. Cada figura muestra la secuencia wt (tipo salvaje) (D2E7), las posiciones WTM en las que puede ocurrir un Ala (Fig. 7A), Leu (Fig. 7B), Tyr (Fig. 7C) y Pro (Fig. 7D), y también aminoácidos adicionales "indeseados" codificados por diversas secuencias codificantes oligo. La porción inferior de cada figura muestra las secuencias representativas reales producidas, incluyendo el número de las sustituciones de aminoácidos deseadas en toda la región. Como se observa, el número de sustituciones varía de 2 a 7 en cada una de las secuencias representativas. El diseño de bibliotecas WTM y LTM de oligonucleótidos preferiblemente se lleva a cabo usando el software acoplado con sintetizadores de ADN automáticos hechos a medida. La implementación de las estrategias LTM™ y WTM™ implica las siguientes etapas. Después de la selección de aminoácidos diana que se incorporarán en las CDR, el software determina la secuencia del codón necesaria para introducir los aminoácidos diana en las posiciones seleccionadas dentro de las CDR. Se selecciona el uso de un codón óptimo para expresión en el hospedante de exhibición y detección seleccionado, p. ej., el sistema de expresión de levadura (véase a continuación). El software también elimina cualquier duplicación de la secuencia de tipo salvaje que se puede generar por este proceso de diseño. Luego analiza potenciales codones finalizadores, horquillas, lazos y otras secuencias problemáticas que luego se reparan. El software determina las relaciones de bases añadidas a cada etapa de la síntesis (para WTM™) para afinar la relación de incorporación de aminoácidos. El plan de diseño LTM™ o WTM™ completado se envía luego al sintetizador de ADN, que realiza una síntesis automática. F. Expresión de células y exhibición de superficie de levadura Existe una diversidad de métodos para seleccionar la expresión e exhibición seleccionable de anticuerpos. Éstos incluyen bacteriófago, Escherichia coli y levadura. Otros métodos de expresión de anticuerpos pueden incluir sistemas libres de células como tecnologías de exhibición de ribosomas y de matriz que permiten la unión del polinucléotido (es decir, un genotipo) a un polipétido (es decir, un fenotipo) p. ej., Profusión™ (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses Nos. 6.348.315; 6.261.804; 6.258.558; y 6.214.553). Se han descrito convenientes sistemas de expresión de E. coli por Pluckthun y Skerra. (Pluckthun, A. and Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra, A. eí al., Biotechnology 9:273-278 (1991)). Al unir una secuencia de señal, como la secuencia de señal ompA, phoA o pelB a bien el extremo 5' o 3' de la secuencia codificante del anticuerpo, los anticuerpos se pueden expresar por secreción en los espacios periplasmáticos de E. coli (Lei, S, P. et al., J. Bacteriol. 169:4379 (1987)). Si bien cada uno de éstos se ha utilizado para mejorar anticuerpos, el sistema de exhibición de levadura proporciona diversas ventajas (Boder y Wittrup 1997). La levadura puede acomodar fácilmente tamaños de bibliotecas de hasta 107, con 103-105 copias de cada anticuerpo que esté siendo exhibido en cada superficie celular. Las células de levadura se detectan fácilmente y se separan usando citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (fluorescence-activated cell sorting o FACS) o microesferas magnéticas. La levadura también produce una rápida selección y re-crecimiento. El sistema de secreción eucariótico y las vías de glucosilación de la levadura permiten que un subconjunto mucho mayor de moléculas scFv se pliegue y exhiba correctamente en la superficie celular que los sistemas de exhibición procarióticos. El sistema de exhibición de levadura utiliza el receptor de adhesión de levadura a-aglutinina para exhibir proteínas en la superficie celular. Las proteínas de interés, en este caso, las bibliotecas WTM™ y LTM™ de scFv, se expresan como aliados de fusión con la proteína Aga2. Estas proteínas de fusión se secretan de la célula y se unen por disulfuro a la proteína Aga1 , que se une a la pared celular de la levadura (véase la bibliografía del producto Invitrogen, pYD1 Yeast Display). Además, hay rótulos carboxil terminales incluidos que se pueden utilizar para controlar los niveles de expresión y/o normalizar las mediciones de afinidad de unión. Los métodos para seleccionar anticuerpos expresados que tienen afinidades sustancialmente mayores para el TNF-a, en relación con el anticuerpo de referencia D2E7, se describirán ahora. Los detalles del sistema de expresión de levadura y su uso en la exhibición de anticuerpos se exponen en el Ejemplo 4. lll. Selección y expresión de anticuerpos con afinidad meiorada Estas sección describe métodos para seleccionar anticuerpos con afinidad mejorada, usando bien un método de análisis de unión de equilibrio para medir KD (o EC50) o un análisis de unión de cinética para determinar una constante de Koff. Se describen diversos anticuerpos de gran afinidad producidos por ambos criterios. Los dos grupos de anticuerpos de unión mejorada pueden tener muchas mutaciones en común y algunas que son únicas de cada método de determinación de afinidad. Los grupos, cuando se combinan, proporcionan un mapa de mutaciones beneficiosas en VH y V CDR del anticuerpo que se asocian con actividad de unión mejorada. A Anticuerpos anti-TNF-a con ECgn mejorado. Los anticuerpos descritos en esta sección tienen valores EC50 que son por lo menos 1 ,5 y hasta 2-5 veces inferiores que los EC50 medidos para el anticuerpo de referencia D2E7, cuando ambos anticuerpos se expresan en la forma de scFv, y se miden bajo condiciones de unión de equilibrio idénticas. La Fig. 8 ilustra el protocolo para determinar EC50 basados en equilibrio de unión. El método emplea un antígeno de TNF-a biotinilado y microesferas magnéticas cubiertas con estreptavidina para seleccionar moléculas de gran afinidad de bibliotecas de levadura, de acuerdo con los procedimientos publicados (Yeung y Wittrup, 2002 y Fetdhaus eí al., 2003). En este caso, el hTNF-a se biotinila de acuerdo con procedimientos estándar (véase Ejemplo 4C), indicándose el TNF-a biotinilado a 50 en la figura. Las células de levadura transformadas con las bibliotecas codificantes de scFv, que se muestran en 44 en la figura, contendrán una mezcla de células que expresan anticuerpos anti-TNF-a, como las células 46, y células sin expresión, como se indica en 48. El objetivo del procedimiento de detección es identificar aquellas células que expresan gran afinidad, como la célula 46a, de células que expresan baja afinidad, indicadas en 46b. Inicialmente, las células de levadura se equilibran con TNF-a biotinilado, produciendo una mezcla de células que tienen unido un TNF-a biotinilado, indicadas en 49, y células de baja afinidad y sin expresión. Después de la unión de equilibrio a TNF-a, se añaden a la mezcla microesferas recubiertas con estreptavidina, como las microesferas 52, formando un complejo de unión 54 que consiste en células de expresión de gran afinidad, TNF-a biotinilado y microesferas magnéticas. Los complejos se aislan de la mezcla usando un imán 56, y el complejo unido se lava varias veces bajo condiciones rigurosas para eliminar los complejos de células de baja afinidad y células no específicamente unidas. Los complejos purificados resultantes se liberan de los complejos, por tratamiento con un medio de disociación adecuado, para producir células enriquecidas para expresión de anticuerpos de gran afinidad. En un método de detección ilustrativo, las células aisladas se disponen en placas a baja densidad, y las colonias clónales se suspenden luego en medio a una densidad celular conocida. Las células se titulan luego con TNF-a biotinilado por adición de cantidades conocidas de TNF-a, según se indica, p. ej., entre 10 pM y 1000 nM. Después de equilibrar, las células se sedimentan por centrifugación y se lavan una o más veces para eliminar el TNF-a no unido, luego finalmente se resuspenden en un medio que contiene estreptavidina fluoresceinada. Las células fluoresceinadas se exploran por FACS para determinar un grado promedio de fluoresceína unida por célula. Este método se describe en los Ejemplos 5 y 6. La Fig. 9 muestra curvas de unión de TNF-a para células antes de la selección (círculos), después de 1 tanda de selección (triángulos claros), después de 2 tandas de selección (triángulos oscuros), y para células que expresan D2E7 (cuadrados). Como se observa, el valor EC50 del anticuerpo expresado disminuyó de aproximadamente 10 nM después de una tanda de detección hasta aproximadamente 0,1 nM después de dos tandas de detección, p. ej., aproximadamente el mismo EC50 que el medido para el anticuerpo de referencia. En el estudio LTM inicial, se construyeron bibliotecas codificantes LTM para las cadenas tanto VH como VL, conteniendo la otra cadena una secuencia de aminoácido de tipo salvaje (D2E7). Cada secuencia codificante en una biblioteca de VH o VL contenía una mutación sencilla para un aminoácido representativo seleccionado en una, dos o tres CDR en esa cadena. Se usaron las secuencias de la biblioteca, como anteriormente, para construir secuencias codificantes de scFv, y la secuencia de scFv se usó para transformar el sistema de expresión de levadura anterior, y los anticuerpos con gran afinidad, medidos como EC50, de menos de ,05 nM (menos de la mitad del EC50 del D2E7) se seleccionaron y secuenciaron en las regiones CDR. Las mutaciones de aminoácidos individuales asociadas con los anticuerpos scFv de afinidad mejorada se muestran en las Fig. 11A y 10B para las regiones VH y V CDR, respectivamente. Las figuras representan un total de 30 secuencias, incluyen mutaciones en cada CDR, mutaciones en CDR sencillas, dobles y triples, e incluyen cada uno de los nueve aminoácidos diferentes ensayados. Cada CDR también incluye una posición en la que no se encontraron mutaciones, p. ej., la posición Ala de VH CDR1 y las posiciones W, G y H, de la región VH CDRR2. Colectivamente, las mutaciones que se muestran en las Fig. 10A y 10B se pueden representar en una secuencia de cadena pesada o ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de D2E7, y en cada posición de CDR que permite una mutación, el residuo de tipo salvaje y cada una de la o las mutaciones seleccionadas. Por consiguiente, por ejemplo, la región V CDR1 correspondiente a los residuos 31-35 se representa como Xaa31 Xaa32 A Xaa34 H, donde Xaa31= D, Y, Q, O H; Xaa32= Y O H, y Xaa34= M o L, donde tres CDR en la cadena VL o VH incluyen por lo menos una de las mutaciones CDR indicadas con respecto a la secuencia D2E7, y pueden incluir múltiples mutaciones, p. ej., 2-5 o más de las mutaciones especificadas. Se ha de entender que una mutación de sustitución en las secuencias de anticuerpos identificadas puede representar el aminoácido que se muestra o su aminoácido de clase equivalente, como se analizó anteriormente. Por lo tanto, en el ejemplo anterior, Xaa34 =M o L también cubrirá, en una modalidad, la secuencia Xaa34= M o L o I o V. Una vez que se han seleccionado las células de gran afinidad, se determinan las afinidades de unión de las moléculas individuales exhibidas en la superficie de las células de levadura clónales, como anteriormente. Esto permite una rápida identificación de moléculas con afinidad mejorada. B Anticuerpos anti-TNF-a con Kng.meiorado Los anticuerpos descritos en esta sección tienen valores K0ff que son por lo menos 1 ,5 y hasta 2-5 veces menores que el K0ff medido para el anticuerpo de referencia D2E7, cuando ambos anticuerpos se expresan en la forma de scFv, y se miden bajo condiciones de unión de cinética idénticas. Los anticuerpos se generaron usando las bibliotecas LTM anteriormente mencionadas para cada una de las cadenas VL y V , donde los anticuerpos se expresaron como anteriormente, en formato scFv. La Fig. 1 1 ilustra el esquema de unión cinética usado para medir el k0ff para anticuerpos anti-TNF-a mutados. El método emplea un antígeno de TNF-a biotinilado y una estrepavidina fluoresceinada a aquellas moléculas de gran afinidad que tienen una constante de bajo k0ff, de acuerdo con los procedimientos publicados (ref). La figura muestra las células de expresión de levadura, como las células 56, que incluye una población de células que tienen anticuerpos exhibidos con diferentes valores k0ff, estando los anticuerpos con valores más bajos (afinidad más alta) asociados con la célula 58 que tiene el sombreado más claro en la figura. Las células se incuban con una cantidad saturante de hTNF-a biotinilado bajo condiciones, p. ej., de 30 minutos a 25°C, con agitación, para saturar de manera eficaz los anticuerpos exhibidos con antígeno unido, indicado en 60 en la figura. Las células se incuban luego con TNF-a no biotinilado o con un anticuerpo soluble competitivo, p. ej., D2E7, ambos en condiciones de saturación, durante un tiempo seleccionado suficiente para reducir el porcentaje de TNF-a biotinilado unido a las células, en ambos casos, como una función del índice off del antígeno. Después de la incubación, las células se centrifugan y se lavan para eliminar el TNF-a biotinilado no unido y/o el anticuerpo competitivo soluble, produciendo células 62, cada una de las cuales contiene una relación de TNF-a biotinilado y nativo proporcional al Koff del anticuerpo. Los detalles del método se exponen en el Ejemplo 7. Los valores k0ff se determinan entonces incubando las células con estreptavidina fluoresceinada (estreptavidina-PE) y un marcador de células fluoresceinadas (anti-his-fluoresceína), lavando las células y clasificando con FACS. El valor k0ft se determina a partir de la relación de los dos marcadores fluorescentes, de acuerdo con métodos conocidos. Las Fig. 12A y 12B muestran 26 secuencias únicas para los anticuerpos scFv anti-TNF-a seleccionados de acuerdo con el método anterior, usando secuencias codificantes LTM que contienen mutaciones sencillas en una, dos o las tres CDR bien en la cadena VH (Fig. 12A) o en la cadena V (Fig. 12B), como se describió anteriormente en la Sección IIIA. Como anteriormente, las mutaciones se pueden representar en una secuencia de cadena pesada o ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de D2E7, y en cada posición CDR para la que se identificó una mutación beneficiosa, el residuo de tipo salvaje y cada una de la o las mutaciones beneficiosas. Por lo tanto, por ejemplo, la región V CDR1 correspondiente a los residuos 31-35 se representa como Xaa3i Xaa32 A Xaa34 H, donde Xaa31 = D, Y, Q, o H; Xaa32= S, y Xaa34 = L, donde las secuencias de cadena ligera y pesada combinadas incluyen por lo menos una de las mutaciones de CDR indicadas con respecto a la secuencia de D2E7, y pueden incluir múltiples mutaciones, p. ej., 2-5 o más de las mutaciones especificadas. Como anteriormente, se ha de entender que una mutación de sustitución en las secuencias de anticuerpos identificadas puede representar el aminoácido mostrado o su aminoácido de clase equivalente. C Producción de anticuerpos solubles Los anticuerpos de clones de gran afinidad anteriormente mencionados se secuencian para identificar mutaciones de gran afinidad. Los anticuerpos de interés se subclonan en un sistema de expresión soluble, como Pichia pastoris o E. coli y se produce el anticuerpo soluble, p. ej., el anticuerpo scFv. Existe una serie de vectores y líneas celulares comerciales para expresión de anticuerpos solubles, incluyendo aquellos de Invitrogen (es decir, pPIC9). Estos sistemas se utilizan rutinariamente para generar anticuerpos de cadena sencilla solubles o de longitud total. La expresión de anticuerpos de gran afinidad de acuerdo con la presente invención ha producido más de 1 mg por litro de scFv soluble en el sistema de expresión de P. pastoris (Invitrogen). La purificación de proteínas se facilita por la presencia de un rótulo His en el extremo C de la molécula, en el caso de cadenas sencillas o por columnas de proteína A o proteína G para anticuerpos de longitud total. Se generarán anticuerpos de longitud total y cadena sencilla solubles para obtener mediciones de afinidad BIAcore y para uso en los ensayos descritos a continuación. IV. Bibliotecas de secuencias codificantes de anticuerpos Como se observó anteriormente, las mutaciones beneficiosas (que producen un KD o k0ff sustancialmente superior) identificadas anteriormente por LTM se pueden usar para generar bibliotecas de secuencias codificantes útiles para seleccionar combinaciones de mutaciones capaces de producir efectos de unión beneficiosos adicionales. Idealmente, los anticuerpos seleccionados contienen múltiples mutaciones en por lo menos una CDR, bien los mismos aminoácidos o aminoácidos diferentes, y/o sustituciones de aminoácidos en dos o más CDR o la cadena de anticuerpos VH O V correspondiente. En un planteamiento combinatorio, las mutaciones beneficiosas identificadas a partir de las selecciones de unión de equilibrio y cinética se combinaron en una o ambas secuencias de cadenas VH y V que se muestran en las Fig 13A y 13B, respectivamente. La secuencia que se muestra en la Fig. 13B se asocia aquí con SEQ ID NO 2 que incluye (i) las cuatro regiones constantes o marco del D2E7 que se muestra en las Fig. 5C, y cada una de las tres regiones CDR que se muestran en la Fig. 13B, donde las regiones VH CDR1 , CDR2 y CDR3 se identifican mediante SEQ ID NOS: 3, 4 y 5, respectivamente. De modo similar, la secuencia que se muestra en la Fig. 13A se asocia aquí como SEQ ID NO 7, que incluye (i) las cuatro regiones constantes o marco del D2E7 que se muestran en las Fig. 5B, y cada una de las tres regiones CDR que se muestran en la Fig. 13A, donde las regiones VH CDR1 , CDR2 y CDR3 se identifican mediante SEQ ID NOS: 8, 9 y 10. Las bibliotecas combinatorias anteriores codifican cada una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena V anteriormente mencionadas que se muestran en las Fig. 14A a 14C, y se identifican aquí como SEQ ID NOS: 14-16 respectivamente. Las secuencias reales identificadas por los números de secuencia incluyen únicamente las secuencias abarcadas por CDR, e incluyen bases alternativas en la posición indicada. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia codificante VH CDR1 identificada por SEQ ID NO 1 representa la secuencia XÍAX^XSTGCTXIOTGCAT, donde X1 = G, C, o T, X3 = T o G, X4 = T o C, X5 = A o C, y X10 = A o C. De modo similar, las regiones codificantes combinatorias para las regiones VL CDR1 , CDR2 y CDR3 se muestran en las Fig. 14D-14F, respectivamente, y se identifican aquí como SEQ ID NOS: 11-13. Las regiones codificantes CDR combinatorias anteriormente mencionadas se incorporan en regiones codificantes de VH o V , empleando regiones codificantes marco para la constante correspondiente de regiones codificantes marco en cualquiera de los lados de cada región codificante CDR, de acuerdo con los métodos ya descritos para la construcción de las bibliotecas LTM. Estas bibliotecas WTM combinatorias de V y V se combinan luego con regiones codificantes de tipo salvaje (D2E&) V o VH, respectivamente, para formar una biblioteca de genes de anticuerpos de VH mutada o VL mutada, p. ej, genes que expresan el formato de anticuerpo scFv. Las bibliotecas se usan para transferir un sistema de exhibición de superficie adecuado, p. ej., células de levadura, y células que se detectan por esquemas de selección de equilibrio o cinética para identificar células que expresan anticuerpos con KD O k0ff de unión mejorada. Como se indicó anteriormente, estos anticuerpos contendrán mutaciones beneficiosas en una o más CDR de cadena V o VH, podrán contener mutaciones múltiples en cualquier CDR, y las mutaciones podrán incluir más de un tipo de aminoácido. Una vez que se identifican las cadenas VL o VH de gran actividad, el método se puede extender para seleccionar mutaciones que ocurren simultáneamente en ambas cadenas V y V , generando bibliotecas WTM de mutaciones mixtas más limitadas que cubren ambas CDR de la cadena. Una biblioteca combinatoria de mutaciones también se puede generar por métodos conocidos de mezcla de genes, como se detalla en la solicitud de patente estadounidense 2003/005439A1 , y en la patente estadounidense No. 6.368.861 , y (Stemmer WP (1994) Proc Nati Acad Sci 91 (22): 10747-51 ), todas incorporadas a la presente memoria por referencia. El método implica la digestión de DNasa I limitada de los clones de mutación mixta recogidos para producir un conjunto de fragmentos génicos aleatorios de diversos tamaños pre-determinados (p. ej., 50-250 pares de bases). Los fragmentos primero se desnaturalizan y se permite entonces que los diversos fragmentos separados se re-asocien en base a regiones complementarias homologas. De este modo, los fragmentos re-naturalizados pueden incorporar CDR de mutaciones mixtas diferentes en los segmentos re-ensamblados que luego se extienden por SOE-PCR como anteriormente, y se puede incorporar luego una quimera re-ensamblada, a un mínimo, por lo menos dos conjuntos de mutaciones mixtas de CDR beneficiosas de cada donante de fuente de ADN parental. También se pueden utilizar otras técnicas de mezcla y emparejamiento para generar secuencias codificantes de fragmentos de oligonucleótidos de CDR. Las bibliotecas de secuencias codificantes de anticuerpos para un WTM se pueden construir como anteriormente, empleando una sustitución sencilla de un aminoácido seleccionado dentro de cada una de las CDR, y preferiblemente también usando dopaje para lograr una aminosustitución promedio de 2-4 mutaciones en cada CDR, tal como se describió anteriormente. El aminoácido que se selecciona para cada CDR es preferiblemente uno correspondiente a una sustitución de aminoácido beneficiosa en por lo menos dos residuos de esa CDR, o que tiene propiedades similares como mutaciones beneficiosas que ocurren en dos o más residuos. Por ejemplo, mirando la Fig. 24, es obvio que muchas de las mutaciones beneficiosas son aminoácidos polares (ionizables), p. ej., glutamina, lisina, asparagina, histidina, serina y tirosina, de modo que cualquiera de estos aminoácidos u otros aminoácidos polares seleccionados se pueden seleccionar para WTM en el dominio CDR-HE. De modo similar, el dominio CDR-L1 contiene múltiples mutaciones beneficiosas positivamente cargadas, como lisina, histidina y arginina, de modo que cualquiera de estos aminoácidos se puede utilizar para WTM en el dominio L1-CDR. Finalmente, la biblioteca de la secuencia codificante construida usando las mutaciones beneficiosas de LTM como mutaciones de guía puede ser una secuencia de saturación en la que una o más posiciones CDR seleccionadas, y preferiblemente los "focos calientes", se sustituyen para cada uno de los aminoácidos estándar e incluyendo hasta 20. Estos "focos calientes" pueden ser posiciones de residuos en las que una o más sustituciones aparecen en un gran número de mutantes de gran afinidad, como el primero y segundo CDR-H1 , o las segunda, tercera, novena, décimo primera y décimo segunda posiciones en donde se encuentran las diversas mutaciones beneficiosas diferentes, como las posiciones 4 y 5 de CDR-L1 , posiciones 3, 5 y 6 de CDR-L2, posición 5 de CDR-L3, posición 1 de CDR-H1 , y posiciones 2, 3, 1 1 y 12 de CDR-H3. Las secuencias codificantes se preparan, como anteriormente, introduciendo codones para cada aminoácido en la posición o posiciones beneficiosas seleccionadas. Ejemplo 1 Síntesis del oligonucleótido D2E7 VH y V^ scFv A. Construcción del gen scFv de tipo salvaje D2E7: El gen scFv de tipo salvaje D2E7 (aproximadamente 1kb) se ensambló in vitro por PCR de 30 oligonucleótidos (Figura 15) representando cada uno una porción de la secuencia D2E7 scFv de longitud total contigua. Los oligonucleótidos sintéticos se sintetizaron en el 3900 Oligosynthesizer de Syngen Inc. (San Carlos, CA) según las instrucciones del fabricante y la calidad del cebador se verificó por electroforesis PAGE antes del uso de PCR. Había 15 oligonucleótidos sentido y 15 antisentido que formaban, en promedio, 40 pares de bases de longitud (en un intervalo de tamaño de 35 a 70) y regiones complementarias superpuestas de aproximadamente 20 pares de bases en los oligonucleótidos próximos en dirección 5' y 3'. Los 30 nucleótidos se mencionan en SEQ ID NO: 17. Los 30 cebadores se incubaron todos juntos como una mezcla (5 µl de mezcla de oligonucleótidos 10 uM) y la PCR se ensambló usando 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl dNTP l OmM, 1 µl MgSO4 50 mM y 37,5 µl dH20 a 94C durante 2 min, seguidos de 24 ciclos de 30 seg a 94C, 30 seg a 50C y 1 min a 68C, y luego se incubó a 68 C durante 5 min. La reacción de ensamble de PCR permitió la renaturalización con superposición del oligonucleótido, el llenado de los orificios de los pares de bases y la ligadura de oligonucleótidos separados en cada cadena del ADN bicatenario para formar un gen D2E7 scFv de longitud total continuo. Se tomó una alícuota (1 µl) de la reacción de ensamble de PCR de arriba para mayor ampliación de longitud total de D2E7 scFv, usando un par añadido de cebadores del oligonucleótido específico de los extremos 5' y 3' D2E7 (SEQ ID NO: 18 y 19), 2 µl cada uno de disolución madre 10 uM, 0,5 µl ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl tampón Pfx, 1 µl dNTP 10mM, 1 µl MgSO4 50 mM y 37,5 µl dH20 a 94C durante 2 min, seguidos de 24 ciclos de 30 seg a 94C, 30 seg a 50C y 1 min a 68C y luego se incubó a 68C durante 5 min. El ADN de D2E7 scFv de la reacción PCR se extrajo y purificó luego (Kit de purificación PCR Qiagen) para la subsiguiente digestión de endonucleasa de restricción Bam Hl y Not I según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Se subclonó luego D2E7 scFv de longitud total en el vector pYD1 y se secuenció para verificar que no se hubiesen introducido mutaciones, deleciones o inserciones (SEQ ID NO; 1 y 6). Una vez verificado, el D2E7 de VH y VL de longitud total sirvió como el molde de tipo salvaje para las estrategias subsiguientes de construcción de bibliotecas LTM y WTM. Ejemplo 2 Síntesis de oliqonucleótidos LTM y WTM En los siguientes ejemplos, los aminoácidos predeterminados del segmento CDR-H2 (posiciones 56 a 69; TWNSGHIDYADSVE) de la sección VH de tipo salvaje D2E7 LDWVSAI-TWNSGHIDYADSVE-GRFTISR, se seleccionó para análisis LTM y WTM. Las secuencias de polipéptidos LDWVSAI y GRFTISR son porciones de los marcos de VH 2 y 3 respectivamente que flanquean la CDR-H2. En el diseño y la síntesis de V y V CDR, los oligonucleótidos de LTM y WTM, que flanqueaban las longitudes de secuencia del marco fueron aproximadamente 21 pares de bases para superposición complementaria SOE-PCR. Un oligonucleótido de referencia que codifica la secuencia de tipo salvaje CDR-H2 anteriormente mencionada (en letra negrita) (SEQ ID NO: 23) que contiene las porciones flanqueadoras VH2 y VH3 (letras minúsculas a continuación) es el siguiente: d'-gta gag tgg gtt tct gcg ata- ACT TGG AAT TCT GGT CAT ATT GAT TAT GCT GAT TCT GTT GAA -ggt aga M act att tcc CQt-3'.

A. Diseño de oliqonucleótidos de MUTAGÉNESIS LOOK THROUGH (LTM) de CDR El análisis de mutagénesis Look Through introduce un aminoácido predeterminado en cada posición (a menos que el aminoácido de tipo salvaje sea el mismo que el aminoácido LTM) dentro de una región definida. En este ejemplo de VH CDR-H2, el LTM de leucina de VH CDR-H2 implica sustituir en serie únicamente una leucina por vez, en cada posición CDR-H2. La Fig. 1 ilustra la aplicación de LTM para introducir un aminoácido de leucina en cada uno de los catorce residuos (posiciones 56-69) en la región VH CDR-H2 de D2E7 scFv. Al realizar el LTM de leucina, se sintetizaron catorce oligonucleótidos separados que codifican todas las variantes posicionales de VH CDR-H2 leucina posibles (SEQ ID NOS: 24-36) teniendo cada una únicamente un codón de reemplazo de leucina (en letra negrita) bordeado por la secuencia de tipo salvaje D2E7. Se diseñaron y sintetizaron en un modo análogo oligonucleótidos CDR-H2 LTM para los otros ocho aminoácidos de "subconjunto": alanina, aspartato, lisina, leucina, prolina, glicina, serina, tirosina e histidina. Por ejemplo, el primer reemplazo de oligonucleótido LTM de aspartato (codón en negrita) (entre los catorce para CDR H2) fue (SEQ ID 38): d'-gtagagtggglttcigcgata- GAC TGG AAT TCT GGT CAT ATT G?T TAT GCT GAT TCT GTT GAA -ggtagantactaUtcccgt-3*.

Un ejemplo de oligonucleótidos para CDR H1 leucina LTM se lista como SEQ ID NOS. 41-45. Como en el diseño de CDR H2 previamente mencionado, 17 pares de bases de las secuencias 1 y 2 del marco D2E7 de tipo salvaje (letra minúscula) flanquean el CDR H1 para permitir un ensamble SOE-PCR en el resto del constructo scFv. B. Diseño de oliqonucleótidos de MUTAGÉNESIS WALK THROUGH (WTM) de CDR Para realizar una mutagénesis Walk Through (WTM), se multiplica un aminoácido seleccionado sustituido en diferentes posiciones y en distintas combinaciones con la secuencia de tipo salvaje de una región predeterminada. Las Figuras 6A, 6B, 6C y 6D describen las secuencias de oligonucleótidos WTM para VH CDR H2 en la introducción de los aminoácidos, alanina, leucina, tirosina y prolina, respectivamente. Las Fig 4A-4C ilustran la sustitución múltiple de aspartato en CDR-H2 usando la siguiente secuencia de oligonucleótidos WTM sintetizada: S'-gtagagtgggtttctgcgata-RMT KRK RAT KMT GRT SAT RWT GAT KAT GMT GAT KMT GWT GAW- ggtagaUtaclatttcccgt-3'.

(SEQ ID NO:39). Nomenclatura de nucleótidos estándar: K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= C o G, W= A o T, Y= C o T, y N= A, C, G, o T. El oligonucleótido degenerado produjo 262.144 secuencias posibles de nucleótidos diferentes, combinaciones que produjeron 27.648 secuencias de aminoácidos posibles en CDR H2. La diversidad adicional introducida en CDR H2 por los codones oligonucleotídicos degenerados se muestra también en la Fig. 4B. Ejemplo 3 Bibliotecas de scFv LTM y WTM Los oligonucleótidos LTM y WTM previamente descritos se utilizaron luego para crear mezclas de mutaciones en una CDR sencilla de la cadena ligera o pesada. Como se muestra, estos oligonucleótidos LTM y WTM se sintetizan para incluir aproximadamente 20 bases de secuencias de marcos flanqueadoras para facilitar la superposición e hibridación durante la PCR. A. Introducción de oliqonucleótidos y construcción de bibliotecas LTM. El planteamiento en la creación de la biblioteca LTM CDR-H2 se resume en las Fig 16A-16D. Se llevaron a cabo reacciones PCR separadas, T1 y T2, usando pares de cebadores FR1 sentido (SEQ ID NO: 21 ) y FR2 antisentido (SEQ ID NO: 22) y los oligonucleótidos mezclados CDR-2 LTM leucina anteriormente mencionados (por ejemplo SEQ ID NO: 24) con el cebador FR4 antisentido, respectivamente. El cebador FR1 sentido contiene secuencias del extremo 5' del gen D2E7 y FR2 antisentido contiene la secuencia antisentido del extremo 3' del marco D2E7 2, de modo que D2E7 CDR-H1 , las regiones de marco 1 y 2, se amplió en la reacción PCR de T1 (Fig 16B y 16C). El cebador FR4 AS contiene la secuencia antisentido del extremo 3' del gen D2E7, los oligonucleótidos CDR-2 LTM contienen secuencias del extremo 5' de la región D2E7 CDR2 con las mutaciones del codón CDR-H2 LTM incorporadas para ampliar la porción restante de D2E7 (fragmento CDR2, FR3, CDR3, FR4 y VL) mientras se incorporan concurrentemente el o los codones mutagénicos. Se usaron las reacciones PCR T1 y T2; 5 µl de mezcla de olignucleótidos 10 µM, 0,5 µl ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl dNTP 10mM, 1 µl MgSO4 50 mM y 37,5 µl dH20 a 94C durante 2 min, seguidos de 24 ciclos de 30 seg a 94C, 30 seg a 50C y 1 min a 68C y luego se incubó a 68C durante 5 min. Las reacciones se realizaron usando un termociclador programable (MJ Research). Las reacciones PCR de T1 y T2 se purificaron luego con gel (según las instrucciones del kit de purificación con gel Qiagen) y se combinaron luego alícuotas equimolares de ambos para SOE-PCR. SOE-PCR es un método rápido y simple para combinar fragmentos de ADN, que no requiere sitios de restricción, endonucleasas de restricción ni ADN ligasa. Los productos PCR de T1 y T2 fueron secuencias complementarias de superposición con extremo compartido diseñadas (Fig. 16D) que se hibridarían y permitirían la extensión PCR para producir un gen LTM D2E7 scFv de longitud total. La reacción de extensión por PCR de scFv utilizó alícuotas de T1 y T2 (aproximadamente 2 µl cada una) con 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl dNTP 10mM, 1 µl MgSO4 50 mM y 37,5 µl dH20 a 94C durante 2 min, seguidos de 20 ciclos de 30 seg a 94C, 30 seg a 50C y 1 min a 68C, y luego se incubó a 68 C durante 5 min. Se añadió un conjunto de cebadores D2E7 5' Bam Hl sentido de extremo específico (SEQ ID NO: 18) y cebadores D2E7 3' Not I antisentido (SEQ ID NO: 19) para facilitar la ampliación de LTM D2E7 e incorporar los sitios de enzimas de restricción en los amplicones de PCR (Figura 16a, etapa E). Se añadieron directamente a la reacción de extensión PCR anteriormente mencionada 4 µl de disolución madre de oligonucleótidos 10 uM, 0,5 µl de ADN polimerasa Pfx (2,5 U/µl), 5 µl tampón Pfx (Invitrogen), 1 µl dNTP 10mM, 1 µl MgSO4 50 mM y 37,5 µl dH20 a 94C durante 2 min, seguidos de 24 ciclos de 30 seg a 94C, 30 seg a 50C, y 1 min a 68C, y luego se incubó a 68 C durante 5 min. B. Clonación de producto PCR en el vector de expresión de células de levadura pYD1 El plásmido pYD1 , preparado a partir de un hospedante de E. coli por purificación del plásmido (Qiagen), se digirió con las enzimas de restricción, Bam Hl y Not I, se desfosforiló terminalmente con fosfatasa alcalina intestinal de ternera. La ligadura del vector pYD1 y los productos SOE-PCR anteriormente mencionados (también digeridos por Bam Hl y Not I), la transformación y selección de E. coli (DH5a) en placas de LB-ampicilina (50 mg/ml) se realizaron usando protocolos de biología molecular estándar. C. Bibliotecas LTM CDR múltiples. Se crean mutaciones de CDR dobles y triples (en diferentes combinaciones de CDR1 , 2 y 3) como anteriormente pero en lugar de usar el gen D2E7 de tipo salvaje como el molde de PCR, se escoge una biblioteca de LTM D2E7 previamente generada. Por ejemplo, para crear cadenas VH en las que se mutan CDR-H1 y CDR-H2, y CDR-H3 y VL son de tipo salvaje, los genes mutantes LTM CDR-H2 se utilizaron como moldes y luego se realizó el SOE-PCR para incorporar los oligonucléotidos CDR-H1 a fin de generar las mutaciones LTM dobles que se resumen en la Figura 16b. En este caso, las dos reacciones PCR separadas, T3 empleó pares de cebadores FR1 sentido (SEQ ID NO: 21) y FR5 antisentido (SEQ ID NO: 20) para ampliar la región marco 1 (FR 1). La reacción PCR de T4 utilizó oligonucleótidos CDR-H1 LTM mezclados (SEQ ID NO: 27) con el cebador FR4 anti-sentido ((SEQ ID NO 24) para ampliar el resto de las porciones FR 2, CDR2 LTM, FR3, CDR3, FR4 y VL de D2E7 (Fig, 17B). Las reacciones PCR de T3 y T4 luego se purificaron y se combinaron alícuotas equimolares de ambas para SOE-PCR (Fig. 17C) a fin de producir las bibliotecas LTM CDR-H1 y CDR-H2 dobles de D2E7 scFv. Se añadió un conjunto de cebadores D2E7 de extremo específico 5' Bam Hl sentido (SEQ ID NO: 18) y D2E7 3' Not I antisentido (SEQ ID NO: 19) para facilitar la ampliación de LTM D2E7 (Fig. 17D) y la clonación en el vector de expresión pYPD1. Las bibliotecas LTM CDR-H1 , CDR-H2 dobles se usaron luego como moldes para incorporar oligonucleótidos LTM CDR-H3 para elaborar las bibliotecas CDR H3 LTM triples. Al utilizar progresivamente las bibliotecas LTM sencillas y dobles, se desarrolló una gama más compleja de combinaciones de bibliotecas LTM tanto en la CDR VH como VL (Fig. 18). Por ejemplo, una vez que se construyó la biblioteca LTM CDR-H1 , CDR-H2, CDR-H3, se designó como el molde de biblioteca 111 en la hilera superior de la Figura 17, la introducción de LTM CDR-L1 en los moldes 111 produjo una biblioteca de 4 LTM CDR (que se indica por la flecha de la Fig 18). Ejemplo 4 Sistema de expresión de células de levadura El pYD1 (Fig. 19) es un vector de expresión diseñado para exhibir proteínas de interés en la superficie extracelular de Saccharomyces cerevisiae. Mediante la sub-clonación del gen scFv en pYD1 , los scFv se convierten en proteínas de fusión permitiendo el receptor de AGA2 aglutinina, la secreción y exhibición de la superficie celular. A. Transformación de células hospedantes de levadura con constructos pYD1 AGA2-scFv: Se prepararon células hospedantes de levadura competentes (500 µl) según las instrucciones del kit de levadura Zymo Research Frozen-EZ (Catálogo #). En síntesis, se mezclaron 500 µl de células competentes con 10- 15 µg de ADN de biblioteca pYPD1 scFv, después de lo cual se añadieron 5 ml de disolución EZ3. La mezcla celular se incubó durante 45 minutos a 30°C mezclando ocasionalmente (tres veces). Las células transformadas se centrifugaron y resuspendieron en medio líquido de selección de Glucosa. B. Inducción de AGA2-scFv: Después de cultivar en el medio de selección de Glucosa (véase manual Invitrogen para composición) a 30°C bajo condiciones de aireación por agitación durante 48 horas hasta OD6oo = 7 (OD6oo = 1 representa 107 células/ml), las células se recogieron luego, se re-sedimentaron y se resuspendieron en el medio de inducción, medio de selección de Galactosa (véase manual Invitrogen para composición), para un ODßoo = 0,9 a 20°C durante 48 horas. La expresión de la proteína de fusión Aga2-scFv de pYD1 se regula firmemente por el promotor GAL1 y depende de la galactosa en el medio para la inducción del promotor. O Preparación de TNF-a biotinilado: La biotinilación del antígeno de TNF se puede lograr mediante una diversidad de métodos, no obstante, la hiper-biotinilación no es conveniente, ya que puede bloquear el epítopo, sitio de interacción de anticuerpos. El protocolo empleado se adaptó del Kit de Marcado de Sondas Moleculares FluoReporter Biotin-XX (cat# F-2610). En síntesis, se añadió TNF-a 300 µl de 1 mg/ml disolución madre (Peprotech), a 30 µl de Tampón de Bicarbonato Sódico 1 M a pH 8,3 y 5,8 µl de disolución Biotin-XX (20 mg/ml disolución Biotin-XX en DMSO). La mezcla se incubó durante 1 hora a 25°C. La disolución se transfirió a un tubo de filtro centrífugo micrométrico, se centrifugó y se lavó repetidamente (cuatro veces) con disolución PBS. La disolución de TNF-a biotinilado se recogió y se determinó la concentración de la proteína por OD 280. D. Monitorización FACS de expresión de AGA2-scFv y unión de TNF-a: Se centrifugó una alícuota de células de levadura (8 x 105 células en 40 µl) de medio de cultivo durante 5 minutos a 2300 rpm. Se aspiró el sobrenadante y el sedimento celular se lavó con 200 µl de tampón PBS/BSA enfriado con hielo (PBS/BSA 0,5% p/v). Las células se re-sedimentaron y el sobrenadante se eliminó antes de resuspender en 100 µl de tampón que contenía el TNF-a biotinilado (200 nM). Se dejó que las células se unieran al TNF-a a 20°C durante 45 minutos después de lo cual se lavaron dos veces con tampón PBS/BSA antes de la adición e incubación con estreptavidina-FITC (2 mg/L) durante 30 minutos en hielo. Se realizó otra tanda de lavado en tampón antes del volumen de resuspensión final de 400 µl en PBS/BSA. Las células se analizaron luego en FACSscan (Becton Dickinson) usando el software CelIQuest según las instrucciones del fabricante. El trazado FACS (Fig 20) ilustra la unión D2E7 scFv de TNF-a biotinilado y estreptavidina FITC (la línea "verde") produciendo una respuesta de señal pico de una magnitud mayor en comparación con la señal del vector vacío pYD1 con TNF-a biotinilado y estreptavidina FITC (área de sombreado oscuro).

Ejemplo 5 Detección de biblioteca de alto rendimiento para afinidad de anticuerpos A. Clasificación magnética de unión de TNF (ECso Fig. 8) La Figura 8 representa un esquema generalizado para enriquecer los clones de unión de gran afinidad específicos del TNF-a de la biblioteca de levadura heterogénea scFv (LTM o WTM). Después de la inducción en el medio de Galactosa, la biblioteca de células de levadura (107) se resuspende en tampón PBS/BSA (volumen total de 500 µl). Se añade TNF-a biotinilado para lograr una concentración final de 50nM y luego se incuba a 25°C durante 2-3 horas con agitación. Las células de levadura se sedimentaron y se lavaron 3 veces (500 µl). Luego, las células de levadura se resuspendieron en 300 µl de tampón PBS/BSA enfriado con hielo y se añadieron 1 x 108 esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina (fabricante). La mezcla de esferas y células se incubó en hielo por 2 minutos con mezclado moderado por inversión para formar un complejo de unión que consistió en las células que expresan scFv de gran afinidad de levadura, TNF-a biotinilado y esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Los tubos que contenían los complejos unidos se aplicaron entonces al soporte de la columna magnética durante 2 minutos. Se eliminó el sobrenadante por aspiración, se separó la columna del soporte magnético, se añadieron 300 µl de PBS/BSA enfriado con hielo para resuspender los complejos unidos y la columna se volvió a disponer en el soporte magnético. Los complejos unidos se lavaron nuevamente para eliminar los clones scFv de baja afinidad y otras células no específicamente unidas. El tubo se separó luego del soporte magnético, tras lo cual se añadió 1 ml de medio de selección de Glucosa y las células de levadura recuperadas se incubaron durante 4 horas a 30°C. El soporte magnético se reaplicó al tubo de cultivo para eliminar las esferas magnéticas restantes. El cultivo de levadura se dejó luego en el medio de selección de Glucosa a 30°C durante 48 horas antes de la inducción de scFv en el medio de selección de Galactosa. En la segunda tanda de selección, la concentración de TNF-a se redujo de 50nM a 0,5nM. La unión de TNF-a, formación de complejo, enriquecimiento de células de levadura y re-crecimiento se realizaron tal como se describió anteriormente. Para la tercera tanda de selección, la concentración de TNF-a se redujo aun más a 0,1 nM. La unión EC50 TNF-a, o "adaptabilidad" de cada tanda de enriquecimiento se evaluó por FACS (protocolo del Ejemplo 3). La Fig. 9 ¡lustra que la biblioteca de levadura VH LTM CDR3 inicialmente transformada sin selección previa (círculos cerrados), la adaptabilidad total en términos de porcentaje de ligantes (eje y), clones que expresan scFv anti-TNF-a funcionales y su afinidad, según lo medido por el EC50 TNF-a (eje x), fue inferior en comparación con D2E7 de tipo salvaje. No obstante, después de solo una tanda de selección (10nM), la curva de "adaptabilidad" (triángulos claros) mejoró en cuanto al porcentaje de ligantes y el EC5o para la unión de TNF-a estuvo en el mismo intervalo nM que el D2E7 de tipo salvaje. Después de la segunda tanda de selección (0,1 nM), la población enriquecida (triángulos oscuros) exhibió una "adaptabilidad" total que prácticamente alcanzó aquella del tipo salvaje de D2E7 (cuadrados pintados). Las células de levadura recuperadas del enriquecimiento de la segunda tanda se dispusieron en placas en medio sólido con el fin de aislar clones sencillos para un análisis de unión individual y determinación de secuencias. B. Clasificación FACS de biblioteca TNF scFv (Fiq 11 y 22) En una metodología alternativa, las bibliotecas de células de levadura LTM también se enriquecieron para clones scFv anti-TNF-a de gran afinidad por FACS. La construcción de la biblioteca, transformación, propagación del medio líquido e inducción se llevaron a cabo tal como se indicó anteriormente para la determinación del EC5o- Después de la inducción del scFv, las células se incubaron con TNF-a biotinilado a concentraciones saturantes (400 nM) durante 3 horas a 25C bajo agitación. Después de lavar las células, se efectuó un medio chase enfriado por 40 horas usando TNF-a no marcado (1 uM) a 25°C. Las células se lavaron luego dos veces con tampón PBS/BSA, se marcaron con Estreptavidina PE (2 mg/ml) anti-HIS-FITC (25 nM) durante 30 minutos en hielo, se lavaron y se resuspendieron tal como se describió en el Ejemplo 3. El D2E7 de tipo salvaje se analizó inicialmente por FACS para proveer un patrón de señal de referencia para clasificación FACS de la biblioteca LTM de levadura (Figura 21 , panel izquierdo). A partir del trazado FACS de D2E7, se dibujó una apertura de selección (el trapezoide R1 ) para obtener únicamente aquellos clones que expresaban la fusión de scFv (según lo detectado por anti-HIS-FITC) y que de manera concomitante exhibirían una afinidad de unión superior al TNF-a (una señal PE más fuerte). La Figura 21 (panel del medio) demuestra que aproximadamente 5% de la biblioteca LTM total se detectó y seleccionó mediante la apertura R1. Después de recoger estos clones anti-TNF-a scFv, se llevó a cabo un análisis FACS post clasificación (Figura 21 panel derecho) para confirmar que >80% de los clones anti-TNF-a pre-detectados estuviesen dentro de los criterios predeterminados. Los clones scFv post FACS se cultivaron luego en medio de Glucosa a 30 C durante 48 horas y luego se dispusieron en placas en medio sólido para aislar clones individuales. Los clones se cultivaron en selección de Glucosa líquida, se volvieron a inducir en selección de Galactosa y se analizaron para sus características de EC50 y/o k0ff como previamente. Ejemplo 6 Caracterización de anticuerpos de gran afinidad Medición FACS de unión TNF-a ECsn: Se incubó una cantidad predeterminada de células de levadura (8 x 105 células en 40 µl) D2E7 scFv (clones LTM, WTM, de tipo salvaje) con 1 :4 diluciones en serie de TNF-a biotinilado (concentraciones finales 200 nM, 50 nM, 12,5 nM, 3,1 nM, 0,78 nM y 0,19 nM en un volumen total de 80 µl) y se incubó a 20°C durante 45 minutos seguidos de 5-10 minutos en hielo. Las células de levadura se lavaron 3 veces y se resuspendieron en 5 ml de tampón PBS/BSA. Se añadió estreptavidina PE (2 mg/ml) y aHIS-FITC (25 nM) para marcar las células durante una incubación de 30 minutos en hielo. El anticuerpo aHIS-FITC permitió el control de la expresión de scFv en la superficie celular de levadura. Se realizó otra tanda de lavado antes de resuspender en 400 µl de tampón PBS/BSA. Las células marcadas se analizaron luego en FACSscan usando el software CelIQuest. La Fig. 21 ejemplifica un subconjunto de clones mejorados en relación con el D2E7, en el sentido que tienen menores valores EC50 (sus curvas de unión al TNF-a se han desplazado a la izquierda con respecto al cuadrado pintado de D2E7 de tipo salvaje). Su EC50 relativo comparado con el D2E7 y el incremento en veces se mencionan en la Tabla 1. Por ejemplo, el clon H3 S96Q exhibió una mejora de 2,5 veces en la unión al TNF-a. La identificación de la nomenclatura de este clon H3 S96Q, indica que era proveniente de una biblioteca sencilla VH CDR-H3 glutamina LTM. En la Figura 10 A, se identificaron tres clones independientes VH CDR-H3 H3 S96Q a partir del estudio EC50 anteriormente mencionado. En un ejemplo de identificación de un mutante LTM doble, L1 L2 R24H S56K (Fig. 20 y Figura 10B) se ilustra que la unión TNF-a mejorada ocurre únicamente cuando hay una interacción sinérgica entre estas dos sustituciones de CDR-L1 R24H y CDR-L2 S56K.

Tabla 1 Ejemplo 7 Detección de bibliotecas de alto rendimiento para Kg» mejorado A. Clones scFv individuales: A partir del clasificador FACS, los clones pre-clasificados se cultivaron luego durante toda la noche en el medio de selección de Glucosa y después se dispusieron en placas en un medio sólido para aislar las colonias sencillas. A partir de una colonia sencilla, se efectuaron cultivos líquidos de clones en medio de selección de Glucosa a 30°C con agitación durante 48 horas. Las células luego se sedimentaron y resuspendieron en medio de selección de Galactosa durante un período de tiempo OD. Ya que la pre-clasificación FACS enriquece (por aproximadamente 80%) pero no elimina todos los clones indeseables, es necesario caracterizar el EC50 de los clones aislados para eliminar aquellos que exhiben valores de unión inferiores al D2E7 (según se detalla en el procedimiento del Ejemplo 3). Estos aislamientos con valores EC50 comparables o superiores se seleccionaron luego para mayor análisis. Pulso: Células de levadura (aproximadamente 5 x 106) después de la inducción en medio de selección de Galactosa, se sedimentaron y resuspendieron en tampón PBS/BSA (1 ml). Se añadió luego TNF-a biotinilado (concentración final 400nM) a las células resuspendidas y se dejó incubar durante 2 horas a 25CC en un nutador para agitación continua y moderada. Chase: la mezcla de TNF-a biotinilado y células de levadura se lavó y resuspendió en tampón PBS/BSA. Se añadió luego TNF-a no marcado (a una concentración final de 1 µM) y la mezcla de células de levadura se incubó adicionalmente durante 24 horas a 25°, tomando alícuotas de muestra cada dos horas durante las siguientes 24 horas. Las mezclas de células se lavaron y resuspendieron en tampón PBS/BSA bien frío y se añadió anticuerpo manchado a-SA PE (2 µg/ml). Después de la incubación durante 30 minutos en hielo con mezclado periódico, la mezcla de células se lavó dos veces y se analizó con FACS como anteriormente. A partir de estos ensayos de Koff, la Fig. 23 demuestra el efecto de dos clones, 3ss-35 y 3ss-30 que tienen un K0ff relativo superior en comparación con el D2E7. En otros términos, cuando se intercambió el TNF-a biotinilado unido con el TNF-a no marcado durante el período de muestreo de 24 horas, 3ss-35 y 3ss-30 liberaron el TNF-a biotinilado previamente unido a una velocidad mucho menor (círculos y triángulos abiertos respectivamente en la Fig. 23). El D2E7 de tipo salvaje, (cuadrados abiertos, Fig. 23), en cambio, exhibió una disminución mucho más marcada en MFI durante las primeras 8 horas. A partir de las diversas bibliotecas LTM sencillas en las VH y V CDR, las Figuras 12A y 12B enumeran los resultados de estos ensayos de LTM koff. Por ejemplo, hubo siete clones sencillos independientes VH CDR-H1 D31Q LTM y once clones VH CDR-H1 Y32S LTM, indicando que estas dos sustituciones respectivas tienen un profundo impacto en el índice k0ff del D2E7 scFv. B. Construcción de una biblioteca beneficiosa (mutación mixta) Las Fig 13A y 13B enumeran todas las mutaciones beneficiosas de D2E7 CDR descubiertas hasta el momento y son un agregado de los clones de secuencias aislados de los ensayos de equilibrio (EC50 Fig 10A y 10B) y cinética (Koff Fig 12A, 12B). Por ejemplo, la secuencia compuesta de la Fig. 13B enumera H?64S/Y/K167 K168L/K16g como las mutaciones beneficiosas de CDR L1 en las que la mutación H164 se identificó principalmente por ensayos de equilibrio, mientras que las mutaciones Ki6ßK/Li69 se identificaron principalmente por ensayos de K0ff. A partir de estas mutaciones CDR compuestas, se designaron oligonucleótidos degenerados para incorporar todas las mutaciones beneficiosas en cada CDR. Las secuencias de los 6 oligonucleótidos de mutación beneficiosa CDR se mencionan en SEQ ID NOS: 46-51. Por ejemplo, el oligonucleótido de mutación beneficiosa CDR L1 codificado para H164 A165 S?66S/Y/K/Qi67 G/K-168L/K/I169 R ó N171 Y172 L173 Ai74- Se construyeron dos bibliotecas separadas, una compuesta de las mutaciones beneficiosas H1 , H2 y H3 (una biblioteca VHCDR triple) y la otra biblioteca compuesta por las mutaciones beneficiosas triples L1, L2 y L3 (biblioteca VL CDR triple). La incorporación de CDR degeneradas múltiples en uno se detalló anteriormente en el Ejemplo 2 (Fig 16A-16D y 17A-17D). En síntesis, por ejemplo, se mutó primero CDR H2 mediante oligonucleótidos de mutación mixta para crear una biblioteca de mutación mixta "sencilla". La biblioteca de mutación mixta CDR H2 serviría entonces como moldes para incorporar los oligonucléotidos de mutación mixta degenerados CDR H1 para crear una biblioteca de mutación mixta "doble" CDR H1 H2. La biblioteca de mutación mixta CDR H1 H2, a su vez, sirve como el molde para los oligonucleótidos de mutación mixta CDR H3 a fin de crear la biblioteca de mutación mixta "triple" CDR H1 H2 H3. Las variantes de cadena ligera de la biblioteca CDR triple se crearon en un modo análogo. Cada biblioteca triple CDR VH y VL tenía una diversidad de aproximadamente un millón de variantes. Las variantes resultantes de estas bibliotecas triples se seleccionaron, no obstante, únicamente por ensayos de off. C. Clones de bibliotecas beneficiosas (Mutación Mixta) Las Fig 24A y 24B identifican clones de mutación mixta, que muestran 63 secuencias únicas para los clones scFv anti-TNF-a recuperados de las bibliotecas de mutación mixta WTM detectadas por los ensayos K0ff. En general, los clones K0ff recuperados tenían sustituciones incorporadas en las seis CDR y grados variables de introducción de mutación mixta dentro de cada CDR. Por ejemplo, el clon de la biblioteca VL triple LB-E2 exhibió un K0ff relativo alto (5,3x) que incorporaba combinaciones de mutaciones mixtas beneficiosas de H164 R167l R?6ß y L16g dentro de CDR L1 , S?93, F194, L195, Q196 en CDR L2 y combinaciones de mutaciones beneficiosas de D207 y P2OT en CDR L3. Los clones de la biblioteca triple VH también demostraron combinaciones beneficiosas de mutaciones mixtas múltiples VH CDR. Por ejemplo, en el clon HB-B1 , hubo una preferencia de combinación de mutación mixta de Q3? Y32 en CDR H1 junto con Q103 Q109 S112 en CDR H3. Ejemplo 8: Análisis BiaCore de clones de gran afinidad Construcción de pBAD Fab Los genes scFv para D2E7 y aquellos clones identificados a partir de los estudios Koff ya descritos con afinidad mejorada, se cortaron a partir de pYD1 , y se sub-clonaron en el vector de expresión de E. coli pBAD (sistema de expresión de pBAD Invitrogen). A Expresión de pBAD de E. coli para la producción de anticuerpos solubles Se prepararon células hospedantes de E. coli competentes según las instrucciones del fabricante (sistema de expresión de pBAD de Invitrogen). En síntesis, se incubaron juntos 40 µl de células competentes LMG 194 y 0,5 µl de constructo pBAD scFv (aproximadamente 1 µg ADN) en hielo durante 15 minutos, tras lo cual, se aplicó un choque de calor de 42°C. Las células se dejaron recuperar durante 10 minutos a 37°C en medio SOC antes de disponerse en placas LB-Amp y a 37°C de cultivo durante toda la noche. Al día siguiente, se recogieron colonias sencillas para cultivos de líquido a pequeña escala a fin de determinar inicialmente las concentraciones óptimas de inducción de L-arabinosa para la producción de scFv. A las réplicas de cada clon, después de alcanzar un OD6oo= 0,5 se les indujo una prueba con titulaciones en serie (1 :10) de L-arabinosa (0,2% a ,00002% concentración final) después de un cultivo de toda la noche a temperatura ambiente. Se recogieron los cultivos de ensayo (1 ml), se sedimentaron y se añadieron 100 µl de tampón 1X BBS (10mM, 160mM NaCI, ácido bórico 200mM, pH=8,0) para resuspender las células antes de la adición de 50 µl de disolución de Lisozima durante 1 hora (37°C). Los sobrenadantes celulares de las digestiones de lisozima se recogieron después de la centrifugación, y se añadió MgSO4 a una concentración final de 40 mM. Esta disolución se aplicó a columnas Ni-NTA pre-equilibradas con PBS. Las muestras de scFv unido marcado con His se lavaron dos veces con tampón PBS tras lo cual se logró la elución con la adición de Imidazol 250 mM. La expresión de scFv soluble se examinó luego por SDS-PAGE. Purificación de scFv de cultivo de E. coli a gran escala: Después de la determinación de las condiciones de cultivo óptimas, se recogieron sedimentos de cultivo celular de E coli a gran escala (volumen) por centrifugación después de cultivar durante toda la noche a 25°C. Los sedimentos se resuspendieron luego en tampón PBS (0,1% tween) y se sometieron a 5 tandas de sonicación repetida (Disruptor celular Virtis Ultrasonic) para lisar la membrana celular bacteriana y liberar los contenidos citoplásmicos. La suspensión se aclaró primero por centrifugación a gran velocidad para recoger el sobrenadante para posterior procesamiento. Este sobrenadante se aplicó a columnas Ni-NTA pre-equilibradas con PBS. Las muestras de scFv unidas marcadas con His se lavaron dos veces con tampón PBS tras lo cual se logró la elución con la adición de Imidazol 250 mM. El pH del sobrenadante se ajustó luego hasta 5,5 con HCl 6M antes de cargar a una columna de intercambio de cationes SP Sepharose HP (Pharmacia). El scFv eluyó un gradiente de sal (NaCI) y las concentraciones de la fracción que contenía el scFv se determinaron por densidad óptica a 280 nm y se verificaron por PAGE. Las fracciones que contenían los scFv se mezclaron y dializaron luego con PBS. Análisis de unión Biacore: Las afinidades de unión al TNF-a (KD=kd/ka = k0ff/kon) de los fragmentos de scFv se calcularon a partir de las constantes de índice de asociación (ka = kon) y disociación (kd = k0ff) resultantes según lo medido usando un sistema de resonancia de superficie de plasmón BIAcore - 2000 (BIAcore, Inc). Para evitar problemas de valencia debidos al estado trimérico del TNF-a, el ligando se inmovilizó en la superficie del chip sensor BIAcore en efecto, permitiendo el control de la unión de scFv monomérica de la disolución fluida. El chip biosensor BIAcore se activó por acoplamiento covalente del TNF-a usando hidrocloruro de N-etil-N'-(3-d¡metilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidrosuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyectó una disolución de etanolamina como agente bloqueante. Para el análisis de flujo, se diluyó anti-TNF-a scFv en disolución salina tamponada con Hepes 20mM, pH 7,0 y se diluyó hasta aproximadamente 50 nM. Se inyectaron alícuotas de anti-TNF-a scFv a un caudal de 2 µl/minuto. Para mediciones de cinética, los scFv se inyectaron a un caudal de 10 µl/min. Se observó la disociación en el tampón de uso sin agentes de disociación. Los parámetros de cinética de las reacciones de unión se determinaron usando el software BIAevaluation 2.1. La Fig. 25 muestra los resultados de BIAcore scFv de la referencia D2E7 anti-TNF-a y seis clones K0ff con afinidad mejorada. Es claro a partir de estos trazos que el D2E7, en comparación con los seis clones, exhibe una pendiente de disminución notablemente más marcada, indicativa de un K0ff más rápido. En comparación con los valores kon, la mayoría de los clones fueron relativamente comparables a D2E7, aunque uno, Fab 26-1 , demostró un índice de unión 1 ,6x inferior. Cuando estos perfiles de disociación se normalizaron, se superpusieron entre sí (Figura 26), es claro que el D2E7 se disocia del TNF-a unido inmovilizado a un índice más veloz. Por ejemplo, acercándose al final del intervalo controlado a 2500 segundos, se unió únicamente 80% del D2E7, mientras que los seis clones aún exhibieron una unión superior a 90%. De hecho, el mejor clon G1 exhibió una unión del 96%. En comparación con el D2E7 de tipo salvaje, este clon G1 exhibió una afinidad de unión de más de 8 veces (KD 247 pM frente a 30 pM respectivamente).

Tabla 2 La tabla siguiente provee las constantes de los índices determinados para cada anti-TNF-a scFv que interactúa con la superficie del TNF-a. La afinidad (KD) se indica en unidades de pM.

En general, como se muestra en la Tabla 2, las constantes de índice de asociación, ka, para todos los clones examinados variaron por 2,1 veces (2,8x105 hasta 5,8x105), mientras que el índice de disociación, kd, mejoró por 7,7 veces (1 ,15x10"4 a 1 ,49x10"5). Por lo tanto, la afinidad mejorada que se muestra en estos clones anti-TNF-a es aportada principalmente por su cinética en el índice de disociación mejorada (kd). Ejemplo 9 Propiedades funcionales in vitro de clones de gran afinidad para neutralizar los efectos citotóxicos del TNF-a en células L929 tratadas con Actinomicina Se midió la actividad biológica de los clones CBM de afinidad mejorada, usando un ensayo de citotoxicidad de células L929 inducida por TNF-a. Las células L929 murinas, después de un co-tratamiento breve con Actinomisina D, son susceptibles a citotoxicidad mediada por el TNF-a. No obstante, si el TNF-a soluble se co-incuba con anticuerpos anti-TNF-a, la citocina unida al anticuerpo es incapaz de unirse al receptor de TNF y la citotoxicidad se neutraliza. Para una concentración determinada de anticuerpo anti-TNF-a, el grado de protección contra citotoxicidad producido por un anticuerpo anti-TNF-a depende, por lo tanto, de su afinidad de unión al TNF-a. Para determinar el IC50, se co-incubaron distintas concentraciones de TNF-a y anticuerpo durante 24 horas, tras lo cual se añadió un tinte metabólico colorimétrico para determinar el grado de muerte celular y protección mediada por el anticuerpo, midiendo la densidad óptica resultante generada por la conversión de sustrato en células vivas. Cultivo celular: Se propagaron células L929 en el siguiente medio de cultivo: Medio Esencial Mínimo (Eagles), enriquecido con L-glutamina 2mM, y se ajustó BSS de Earle para contener 1 ,5g/L bicarbonato sódico, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y piruvato sódico 1 ,0mM, 10% FBS, 50 µg/mL gentamicina y se cultivó en incubadoras a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%. Antes de lograr la confluencia, las poblaciones de células L929 se sub-cultivaron en una relación de 1 :4 tres veces por semana para mantener las células en la fase logarítmica de crecimiento. Ensayo de neutralización: El ensayo de neutralización que se realizó fue una modificación de un procedimiento desarrollado por Doring et al, (Molecular Immunology, 31 :1059-1067 (1994)). En síntesis, se dispusieron 35.000 células L929 por pocilio en una placa de microtitulación de 96 pocilios para cultivo durante toda la noche. Al día siguiente, se diluyeron en serie los siguientes seis fármacos de anticuerpo, de modo que las concentraciones finales en el pocilio fuesen las siguientes: control positivo Humira (lgG1 ) y D2E7 (scFv): 8100pM, 2700pM, 900pM, 300pM, 100pM, 33,3pM, 11 ,1 pM, 3,7pM, 1 ,23pM, 0,411pM; clon CBM de afinidad mejorada A1 (en formato scFv): 1620pM, 540pM, 180pM, 60pM, 20pM, 6,67pM, 2,22pM, 0,741 pM, 0,247pM, 0,082pM; clones CBM de afinidad mejorada 2-44-2,1-3-3, 2-6-1 (todos en formato scFv): 810pM, 270pM, 90pM, 30pM, 10pM, 3,33pM, 1 ,1 1 pM, 0,370pM, 0,123pM, 0,041 1 pM. La secuencia A1 tiene las mutaciones de D2E7 CDRH1 :D31 Q, CDRH3:S99P y CDRL1 :G28E. Los anticuerpos 2-44-2, 1-3-3 y 2-6-1 tienen las mutaciones que se muestran en la Fig. 27B para 2-44, 1-3 y 2-6, respectivamente. Dada la mayor afinidad de los anticuerpos anti-TNF-a, los clones CBM comenzaron con diluciones diez veces inferiores, ya que los experimentos preliminares demostraron que si las concentraciones del clon CBM eran de concentraciones similares con el control positivo Humira y D2E7, la adición de TNF-a en el valor IC5o no induciría citotoxicidad. El diluyente utilizado para las diluciones en serie del anticuerpo fue el medio de cultivo MEM mencionado previamente. Para el ensayo de neutralización en los pocilios de réplica de las diluciones de clon y control de anticuerpo anteriormente mencionadas, el TNF-a se añadió luego para producir dos concentraciones finales diferentes (175pg/mL y 350pg/mL). En consecuencia, un conjunto de las diluciones de anticuerpos (p. ej., 810 a 0,041 1 pM) se incubó a una concentración de TNF-a final de 175pg/mL, mientras que otra dilución de anticuerpo (p. ej., 810 a 0,0411 pM) se incubó a 350pg/mL TNF-a. Para permitir la formación de complejo, estas co-incubaciones de TNF-a y anticuerpo se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su adición a las placas de cultivo celular. Como un control de unión negativo, se hirvió una alícuota de cada uno de los seis anticuerpos de ensayo durante 10 minutos, se dispuso en hielo durante algunos minutos, luego se centrifugó (13.000g) a 4°C durante 5 minutos para eliminar cualquier material precipitado. Una concentración de dilución de los anticuerpos desnaturalizados hervidos se co-incubó luego con TNF-a (175pg/mL y 350pg/mL) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Antes de la co-incubación de TNF-a y uno de los anticuerpos de ensayo, el medio de toda la noche se aspiró de los cultivos de células L929 y se reemplazó con medio que contenía suero inactivado por calor al 10% y 1 µg/mL Actinomicina D. La exposición a Actinomicina D no duró más de 5-15 minutos antes de la adición de las co-incubaciones de TNF-a y anticuerpo. El día de los experimentos de neutralización, se efectuó una curva de dosis y respuesta del TNF-a de control en una placa separada de células L929 para asegurar que los experimentos del fármaco estuviesen dentro del IC50 de citotoxicidad. Las siguientes concentraciones de TNF-a se utilizaron para la curva de dosis y respuesta: 0,08pg/mL, 0,4pg/mL, 2pg/mL, 10pg/mL, 25pg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 250pg/mL, 500pg/mL y 1000pg/mL. Las células L929 tratadas con TNF-a y anticuerpo se incubaron posteriormente durante 20-24 horas a 37°C. Al día siguiente, se añadió una relación de volumen 1/10 de reactivo de proliferación celular WST-1 a cada pocilio, y las células se dejaron incubar otras 4 horas a 37°C. El reactivo WST-1 introducido es absorbido luego por la célula, donde su producto metabolizado causa un incremento en OD de 450nm absorbancia. Después de la incubación WST-1 , se eliminó la placa de cultivo y se dispuso en una lectora de microplacas, donde se leyó la absorbancia a OD 450nm y con una referencia de 630nm en una lectora de placas Wallac Victor2. A partir de los trazados resultantes, se determinaron luego los IC50, usando la versión 3,02 del software Prism. A partir de los experimentos de dosis y respuesta de control del TNF, se puede observar que niveles mayores de citotoxicidad, al aumentar la exposición de concentración de TNF, producirán lecturas de OD 450nm reducidas (Figura 28). Determinación del ICsode células L929 tratadas con TNF-a La Tabla 3 y el trazado de la Figura 28 asociado es un ejemplo de las lecturas de OD 450nm obtenidas para determinar el IC50 de las células L929 tratadas con TNF-a. Se determinó una ventana de curvas estándar de concentraciones de TNF (indicada por la flecha de doble cabeza en la Fig 28) para el ensayo de neutralización a través de una serie de experimentos repetidos de IC50. Se determinó que las co-incubaciones del anticuerpo anti-TNF-a se llevarían a cabo entonces en dos concentraciones finales de TNF-a de 175pg/mL y 350pg/mL. La protección contra citotoxicidad por neutralizaciones de TNF-a mediadas por el anticuerpo anti-TNF-a sería, por lo tanto, la reflejada de manera más eficaz entre los intervalos inferior y superior de la ventana 175 a 350pg/mL.

Tabla 3: Datos brutos de 450nm-A630nm absorbancia: curva de TNF-a.

Neutralización del efecto citotóxico del TNF-a en células L929 Se realizaron experimentos comparativos de neutralización con cuatro de los clones anti-TNF-a de afinidad mejorada CBM y anti-TNF-a Humira de control positivo (lgG1) y D2E7 (scFv) el mismo día para eliminar el la variabilidad típica del día a día. Los resultados de la neutralización del TNF-a para el clon CBM 2-44-2, y representativos de los otros clones experimentales CBM, se muestran en las Tablas 4 y 5 y en los trazados gráficos asociados de las Figuras 29 y 30 para concentraciones de TNF-a de 175pg/mL y 350pg/mL respectivamente. Los resultados también indican que pre-hervir el clon CBM anti-TNF-a antes de la co-incubación de TNF-a anula eficazmente el efecto de neutralización por parte del anticuerpo. Las lecturas de OD 450nm muestran que en las co-incubaciones del anticuerpo hervido y el TNF-a, las células L929 no pudieron metabolizar el sustrato WST-1. Para el clon CBM 2-44-2 (marcado como fármaco de ensayo 2 en las Figuras 29 y 30), la neutralización IC50 fue de 4,21 pM y 8,54pM para las concentraciones de TNF-a 175pg/mL y 350pg/mL respectivamente. La media de la respuesta de neutralización para ambas concentraciones de TNF-a fue entonces 6, 38pM.

Tabla 4: Datos en bruto de 450nm-A630nm absorbancia: dosis v respuesta de 175 pq/mL TNF-a Tabla 5: Datos en bruto de 450nm-A630nm absorbancia: TNF-a.

En total, el IC50 promedio para la curva de dosis y respuesta del TNF-a fue de 248pg/mL, bien dentro de los parámetros de los valores elegidos por Bioren para el ensayo (175pg/mL y 350pg/mL). A partir de sus respectivos ensayos de neutralización de TNF-a, se determinó que el IC50 promedio de los clones CBM anti-TNF-a de afinidad mejorada (A1 , 2-44-2, 1-3-3, 2-6-1 ) era de aproximadamente 5,11pM (Fig. 31 ). Estos resultados muestran los clones CBM anti-TNF-a y son 4,5 veces y 20 veces superiores que los controles positivos anti-TNF-a Humira y D2E7 respectivamente para proteger las células L929 de la citotoxicidad inducida por el TNF-a (Tabla 6).

Tabla 6: Tabla de resumen ICsn comparativo de anticuerpos anti-TNF-a neutralizadores Si bien la invención ha sido descrita con referencia a modalidades y ejemplos particulares, se ha de apreciar que se pueden efectuar diversas modificaciones y otras aplicaciones sin desviarse del espíritu de la invención. Por ejemplo, la selección de aminoácidos representativos empleados en LTM y WTM se puede modificar en una diversidad de formas que conservan la representación de las propiedades fisicoquímicas básicas de los 20 aminoácidos básicos. De modo similar, se pueden usar diferentes formatos de anticuerpos y diferentes secuencias de referencia. En lugar de comenzar con las CDR "derivadas de seres humanos", por ejemplo, una o más de las CDR de cadena HV o HL podría basarse en la secuencia CDR de ratón para la secuencia de anticuerpo anti-TNF-a de ratón correspondiente. Se esperaría que dicha construcción proporcionara información de relación estructura-actividad adicional sobre el efecto de la secuencia de aminoácidos y la actividad de unión.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo anti-TNF-a humano aislado, o su porción de unión a antígenos, que contiene por lo menos una cadena de anticuerpos VL o VH de gran afinidad que es eficaz, cuando se sustituye con la correspondiente cadena V o VH del anticuerpo anti-TNF-a scFv que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 , para unirse al TNF-a humano con una constante de disociación KD o una constante de índice K0ff que es por lo menos 1 ,5 veces inferior que aquella del anticuerpo que tiene SEQ ID NO: 1 , según lo determinado bajo condiciones idénticas.

2.- El anticuerpo según la reivindicación 1 , cuyas cadenas V y VH tienen las secuencias identificadas por SEQ ID NOS 2 y 7, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

3.- El anticuerpo según la reivindicación 2, que tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de V cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 3, 4 y 5, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

4.- El anticuerpo según la reivindicación 2, que tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de HL cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

5.- Un anticuerpo anti-TNF-a humano aislado, o su porción de unión a antígenos, que tiene las cadenas de anticuerpos VL y VH cuyas secuencias se identifican por SEQ ID NOS 2 y 7, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

6.- El anticuerpo según la reivindicación 5, que tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de VL cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 3, 4 y 5, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

7.- El anticuerpo según la reivindicación 5, que tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de HL cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

8.- Un método para tratar una condición que se agrava por la actividad del TNF-a en un sujeto mamífero, que comprende preparar un anticuerpo anti-TNF-a humano, o su porción de unión a antígenos, que contiene por lo menos una cadena de anticuerpos VL o VH de gran afinidad que es eficaz, cuando se sustituye con la correspondiente cadena V o VH del anticuerpo anti-TNF-a scFv que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 , para unirse al TNF-a humano con una constante de disociación KD O una constante de índice K0ff que es por lo menos 1 ,5 veces menor que aquella del anticuerpo que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 , según lo determinado bajo condiciones idénticas, y administrar dicho anticuerpo al sujeto, en un cantidad suficiente como para mejorar la condición en el sujeto.

9.- El método según la reivindicación 11 , en el que el anticuerpo preparado tiene cadenas VL y VH cuyas secuencias se identifican por SEQ ID NOS 2 y 7, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

10.- El método según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo preparado tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de VL cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 3, 4 y 5 respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

11.- El método según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo preparado tiene por lo menos una de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de HL cuya secuencia se identifica por SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, respectivamente, excluyendo SEQ ID NO: 1.

12.- Un método para generar anticuerpos anti-TNF-a humanos con afinidad de unión mejorada, que comprende: (i) usar las variaciones de la secuencia de aminoácidos contenida en SEQ ID NOS: 2 y 7 para las CDR de VH y V , respectivamente, del anticuerpo anti-TNF-a definido por SEQ ID NO: 1 , para construir una biblioteca de secuencias codificantes de anticuerpos que codifica ambas cadenas VH y VL del anticuerpo, y seleccionada del grupo que consiste en: (a) una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes que codifican combinaciones de las variaciones de las secuencias de aminoácidos de CDR VH y VL contenidas en por lo menos una de las secuencias VH O VL especificadas en la etapa (i), (b) una biblioteca de mutagénesis Walk-Through que codifica, por lo menos una de dichas CDR, la sustitución del mismo aminoácido en múltiples posiciones de aminoácidos dentro de esa CDR, donde el aminoácido sustituido corresponde a una variación del aminoácido que se encuentra en por lo menos una posición de aminoácido de las secuencias VH O VL especificadas en la etapa (i), para esa CDR, y (c) una biblioteca de secuencias de mutación de saturación localizada que codifica por lo menos una de dichas CDR, los 20 L-aminoácidos naturales en la posición del aminoácido que admite una variación de secuencia en por lo menos una de las secuencias VH o VL especificadas en la etapa (i), (ii) expresar la biblioteca de secuencias codificantes en un sistema de expresión en el que los anticuerpos anti-TNF-a codificados se expresan en un sistema de expresión seleccionable, y (iii) seleccionar esos anticuerpos expresados en (iii) que tienen las constantes de KD o índice EC50 koff más bajas para el TNF-a humano.

13.- El método según la reivindicación 12, en el que dicha construcción incluye identificar posiciones de aminoácidos que son invariantes dentro de una o más CDR seleccionadas, y retener los codones para el aminoácido invariante en las secuencias codificantes de anticuerpos de la biblioteca.

14.- El método según la reivindicación 12, en el que la biblioteca de secuencias codificantes es una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes construidas (i) produciendo una biblioteca primaria de la secuencia codificante que codifica anticuerpos, una variación de aminoácido sencilla contenida en por lo menos una de las secuencias VL O VH especificadas en la etapa (i), y (ii) entremezclando las secuencias codificantes en la biblioteca primaria para producir una biblioteca de secuencias codificantes que tiene múltiples variaciones de aminoácidos contenidas en por lo menos una de las secuencias de VL o VH especificadas en la etapa (i).

15.- El método según la reivindicación 12, en el que la biblioteca de secuencias codificantes es una biblioteca combinatoria de secuencias codificantes construida generando secuencias codificantes que tienen, en cada posición de variación de aminoácidos, codones para el aminoácido de tipo salvaje y para cada uno de los aminoácidos variantes.

16.- El método según la reivindicación 15, en el que las regiones codificantes CDR de dicha biblioteca de secuencias codificantes para la cadena VL tienen las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 11-13, respectivamente.

17.- El método según la reivindicación 15, en el que las regiones codificantes CDR de dicha biblioteca de secuencias codificantes para la cadena VH tienen las secuencias identificadas por SEQ ID NOS: 14-16, respectivamente.

18.- El método según la reivindicación 12, en el que la biblioteca de secuencias codificantes se construye para codificar múltiples aminoácidos positivamente cargados en el dominio CDR-L1 o múltiples aminoácidos polares en el dominio CDR-H3.

19.- El método según la reivindicación 12, en el que el sistema de expresión empleado para llevar a cabo la etapa (ii) es un sistema de expresión de levadura.

20.- El método según la reivindicación 12, en el que la biblioteca de la secuencia codificante codifica anticuerpos scFv anti-TNF-a.

21.- Una biblioteca de secuencias codificantes de mutagénesis combinatoria cuyas regiones codificantes CDR se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 11-16, para uso en la generación de anticuerpos anti-TNF-a humanos que tienen una o más de las sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR de VL y VH de mutaciones identificadas en SEQ ID NOS: 2 y 7, respectivamente.