WO2010105446A1

WO2010105446A1 - 抗人肿瘤坏死因子受体α单抗及其应用

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Publication number: WO2010105446A1
Application number: PCT/CN2009/070938
Authority: WO
Inventors: 刘庆法
Original assignee: 上海宏源生物技术有限公司
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2010-09-23
Also published as: EP2409992A4; US8354108B2; EP2409992B1; EP2409992A1; CN101896502A; US20110182906A1; CN101896502B

Description

抗人肿瘤坏死因子受体 α单抗及其应用技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗人 TNFa单克隆抗体、运用分子进化技术进行改造，以及改造后结构的临床应用。背景技术关于自身免疫疾病：

以类风湿关节炎为代表的自身免疫疾病是影响人类健康的重要疾病之一。目前，临床上主要用 C0X2 抑制剂为主，国外市场上还有几种单抗类产品，国内市场上有一些中药。但是，这些化学药要么疗效不佳，要么毒副作用大，要么两者兼有。 1997年起，国外市场上出现了疗效突出、毒副作用小的单抗类产品，获得了极大的成功。国际上有许多厂家竞相开发该类产品。目前，已经上市的治疗类风湿关节炎的有 Humira, Remicade和 Enbrel 三种，在 RA 市场上均获得了巨大的成功。治疗银屑病的有 Amivive,、 Raptiva, Enbrel 三种。其中， Enbrel, Remicade, Humira等也在进行其他自身免疫疾病的临床研究。

TNFa的生理作用：

TNFa是一种重要的炎症因子。肿瘤坏死因子 TNFa能够引起肿瘤组织出血坏死并具有多方面功能，其前体为 233个氨基酸组成的多肽， N-端 76个氨基酸组成的多肽不是信号肽，它可以把前体固定在细胞膜上，使成熟的分泌型保留在细胞膜上。前体的成熟 mRNA 长度为 1. 7kb。在体内主要由单核巨噬细胞产生。成熟分子由 157个氨基酸组成，含有两个二硫键，没有糖基化位点。它对不同的细胞有着不同的作用：杀伤细胞、抑制、促进或者不影响细胞生长。它能够抑制造血，引起红细胞减少，可以引起巨噬细胞的活性和杀伤功能，增强巨噬细胞促进免疫应答的能力，对炎症局部的中性粒细胞的活性和聚集也有促进作用。它还可以抑制 B-细胞对 EBV的反应，抑制 B细胞增殖和分泌免疫球蛋白。在肿瘤方面，该因子可以通过对肿瘤区域血管的影响引起抑制肿瘤的出血性坏死，并通过增强免疫机能提高机体的抗肿瘤能力。除此之外，该因子还对肝脏、骨、肌肉、血管等系统有重要的生理作用。

TNFa与类风湿关节炎等疾病相关。在类风湿关节炎病患部位有过量的 TNFa表达，是造成患病部位肿胀和疼痛的主要因素之一，而 TNFa是 TNF家族中与该症关系最为密切的过量蛋白质。

研究证明，该因子的过量表达与人体的多种炎症疾病的发生和发展有关，其中包括类风湿关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、强直性脊椎炎、多发性硬化等多种自身免疫疾病。因此，能下调 TNFa的拮抗剂，包括单抗和可溶性受体，对上述疾病有良好效果。国际上已经有几种调节 TNFa的单抗类产品开成功，包括 Enbrel、 Humira和 Remicade等著名产品，广泛的临床应用表明，其疗效十分突出，且毒副作用轻微或罕见。这些结果表明， TNFa确实是治疗多种自身免疫疾病的理想靶点。

类风湿关节炎，简称类风关，是一种高发性自身免疫病。其主要临床表现为关节肿胀等，约有 20%的严重病人会发生关节骨损伤，甚至完全丧失劳动能力，不但给个人生活带来极大不便，还会给家庭和社会带来巨大的负担。

银屑病是另一种高发性自身免疫疾病。银屑病人的新皮肤细胞生长太快而老的皮肤细胞来不及脱落，导致发炎，肿胀，皮肤上起鳞状物。银屑病严重程度不同，可以是很少很小的斑点，也可以是大面积的皮肤溃烂，主要发生在头皮、膝、肘和躯干。其发病没有年龄、性别、民族等的区别。其可怕的溃烂往往使公众认为是传染病，患者不但每天的治疗和护理十分麻烦，而且还往往由于周围人群的排斥心理而产生严重的心理障碍，给生活和身心造成极大的障碍。如果不及时治疗或治疗不当，银屑病还可导致或伴生类风关，造成行动不便甚至完全失去劳动能力。

具有同样发病机理的自身免疫疾病还有强直型炎椎炎。这种病人的脊椎关节受累，不但个人行动受到极大限制，丧失劳动能力，甚至完全丧失生活自理能力，而且还会带来严重的肉体痛苦。

单抗、治疗性单抗及其发展：

治疗性单克隆抗体在过去十几年里获得了极大的发展，仅仅在抗 TNFa相关的自身免疫疾病方面就有若干产品开发成功，包括以 TNFa为靶点的 Enbrel、 Humira Remicade以及以 CD20为靶点的 Rituxat 这些治疗性单抗因突出的疗效，在临床上获得巨大成功，迅即成为一线治疗药物。治疗性单抗在恶性肿瘤、传染性疾病等领域也获得了空前的成功。由于其突出的疗效，以及由此创造的巨大市场需求，这类药物还在高强度开发中。

目前，获得单克隆抗体的方法主要是杂交瘤技术，主要涉及啮齿类（如小鼠、兔子）、禽类（如鸡等）、灵长类（如猕猴、猿等）和人等物种。另外，近几年对骆驼抗体的研究越来越多。也有人利用抗体人源化的小鼠研究开发单克隆抗体。

作为治疗用药的单克隆抗体有很多要求，其中亲和力、中和能力、特异性和副作用是要考虑的重点，而这三个方面又相互关联。一般来说，亲和力高，所需剂量就小，不但制造成本降低，同时引起副作用的可能性就小；特异性高，对体内其他成分的影响就小，副作用就低。因此，获得高亲和力的单克隆始终是抗体药物研发中的重要方面。但是，并不是每一种方法都可以获得高亲和力或者中和能力都能符合制药要求的单克隆抗体。

虽然获得单克隆抗体的途径很多，但是获得符合临床治疗要求的单克隆抗体并不是一件容易的事。有时，特异性、中和能力、亲和力或者其他方面的限制使得许多单抗不能用于临床治疗。

能否作为候选药物的另一项十分重要的要求是是否容易制造。这就要求抗体的生产能够以大规模、低成本进行生产。这其中最重要的指标是每升培养液能够生产抗体的量，即通常所说的表达量。

在过去二十年，重组单抗药物获得了极大的发展，新的产品层出不穷，已经成为临床治疗用药中发展最快的领域，引起了业界的广泛关注。各国政府和制药公司都积极投入巨资进行单抗药物的研究开发。但是，在单抗药物高速发展的同时，也遇到了自身难以解决的问题。其中，比较突出的是单抗药物必须用重组的哺乳动物细胞生产，且用药量很大，造成生产成本居高不下，患者不堪重负。因此，如何在保证疗效的前提下降低成本，成了单抗药物研发的重点突破方向之一。

已上市抗体药物销量的急剧增长，以及新的抗体药物的持续上市，对抗体医药生产厂家的抗体生产能力提出挑战。

TNFa的拮抗剂及其在临床上的应用：

前已述及， TNFa是引起类风湿关节炎患病部位肿胀和疼痛的主要因素之一，而且有大量研究表明，它还是引起脓毒性休克综合症、强直性脊椎炎、牛皮癣和类风湿关节炎的主要介质。脓毒性休克综合症和类风湿关节炎病人血清中 TNFa水平升高预示着死亡率或致残率升高。被动输入 TNFa的拮抗剂可以防止 LPS和细菌引起的休克和组织损伤，临床上应用 TNFa抗体或者其受体对脓毒性休克综合症、强直性脊椎炎、牛皮癣和类风湿关节炎有明显的疗效。

到目前为止，国际上已有多种拮抗人 TNFa的抗体、受体 -Fc融合蛋白成功用于上述临床指征的临床治疗，在产业化方面获得了极大的成功。

Humira是 Abbott开发的单克隆抗体药物，该产品 2002年获批上市，第一个适应症是风湿性关节炎 (RA)，作用靶标是 TNFa，由于其疗效极为突出， 2006年全球销售额达 20亿美元。该产品的可变区的氨基酸序列和相应的 DNA序列来自于 CAT公司开发的人源抗体库，其 Fc片段的编码区来自人的 IgGl。由此可见，该产品的可变区序列并非直接来自人，而是来自起源于人 B细胞的抗体库。

本发明是以类风湿关节炎病人外周血分离的淋巴细胞为基础材料，以抗体库技术为核心，通过一系列的 panning (淘筛）过程，获得了对人 TNFa有中和能力的全人抗体的 Fab 形式。运用分子进化技术，使其亲和力和特异性得到提高或改变，达到了治疗性单抗对亲和力和特异性等重要技术指标的要求，并在 CH0细胞成功表达了具有生物学活性的全长形式。因此，本发明的抗人 TNFa抗体氨基酸序列和相应的 DNA序列直接来自于人。且与 Humira 相比，本发明的抗人 TNFa抗体的亲和力明显高于 Humira, 其临床有效剂量可明显减少。发明内容

本发明的目的是公开一种抗人 TNFa抗体及其编码基因。

本发明的另一个目的是公开上述抗人 TNFa抗体的制药用途。

本发明一方面公开了一种抗人 TNFa抗体，其轻链氨基酸序列包括 SEQ ID N0: 8，重链氨基酸序列包含 SEQ ID N0: 9或 SEQ ID NO: 10, 较佳的，该抗人 TNFa抗体全长重链氨基酸为 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID NO: 18的多肽片段。上述 SEQ ID NO: 8为轻链可变区氨基酸序列。

本发明另一方面公开了一种多核苷酸，该多核苷酸编码上述抗人 TNFa抗体的轻链，优选的，该多核苷酸的序列包括 SEQ ID N0: 5。

本发明第三方面公开了一种多核苷酸，该多核苷酸编码上述抗人 TNFa抗体的全长重链，优选的，该多核苷酸的序列包括 SEQ ID NO: 15或 SEQ ID NO: 17。

本发明第四方面，公开了上述抗人 TNFa抗体的 Fab形式。

本发明第五方面，公开了将上述抗人 TNFa抗体或其 Fab抗体用于制备治疗与 TNFa相关的炎症的药物，如制备治疗类风湿性关节炎的药物。将本发明的抗人 TNFa抗体或其 Fab 抗体用于治疗类风湿性关节炎等与 TNFa相关的炎症时的用法用量，可参照现有的 TNFa抗体的常规用法用量。本发明有益效果：

虽然现有的 TNF抗体类药物被认为较其它任何药物的效果都好，但它们也存在很大的缺点。第一，它们均用哺乳动物细胞表达和纯化，由于表达水平较低和生产能力有限远远不能满足市场的需求，即便是 Amgen斥资 5亿美金创建了全球最大的 20, 000升细胞培养生物反应器，这一问题依然存在（据 2004年美国 biopharma报告）；第二，这些抗体的高昂成本使很大一部分患者被拒之门外，据估计，常规应用 Enbrel、 Remicade和 Humira治疗 RA—年的费用分别是 11400、 14200和 16776美金，且需长期使用（据 2004年美国 biopharma报告）；第三，这些抗体所携带的 Fc段具有结合补体和 ADCC等活性，体内应用会导致表达 TNF的细胞凋亡，会产生一系列副作用；第四， Remicade是人鼠嵌合性单抗，含有 1/3的鼠源蛋白成分，连续注射可以在 10%以上的病人中激发人抗鼠源蛋白抗体反应或人抗嵌合蛋白抗体反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。即将上市的 CDP870 是 PEG化人源化抗 TNF抗体 Fab段，其鼠源蛋白成分下降到 10 %，但仍然有免疫原性。

本发明采用了人人杂交瘤技术，获得了抗人 TNFa全人抗体，对该抗体的理化及生物活性的初步分析表明，该抗体与 TNF有较好的亲和力，体外能有效中和 TNF对 L929细胞的杀伤。一方面，由于其全部氨基酸序列均与人抗体完全一致，使其对人体的免疫原性降低到最低。其次，应用大肠杆菌表达系统表达 Fab小分子抗体，使生产成本大大降低，并且没有补体结合和 ADCC等效应引发的副作用。第三，采用 PEG化表面改性技术，以减小其被内皮系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗 TNFa活性的同时，使之更适合体内应用。与现有的单抗药物相比，可以大大降低用药频率。这不但进一步降低了病人的经济负担，而且大大减少了病人注射的痛苦，减少了劳动力损失。附图说明

图 1： _PC0Mb3H质粒结构图。

图 2: 表达载体 pGPl质粒结构图。

图 3: 7B4、 2H7、 4D3、 6F5、 3C9、 3H6等 6个 Fab克隆亲和力试验结果。

图 4: 全长分子 7B4、 2H7中和能力试验结果。具体实施方式

本发明采用了下述试验思路：

获得分泌抗人 TNFa抗体的人 B细胞：

从活动性类风湿关节炎病人抽取外周血，用淋巴细胞分离液分离白细胞。对分离的 B 细胞进行培养，根据 ELISA结果鉴定阳性克隆。分离阳性克隆的总 RNA，反转录获取 cDNA。采用 SE. Dohmen等的方法（Journal of Immunological Methods 298 (2005) 9— 20， Production of recombinant Ig molecules from antigen-selected single B cells and restricted usage of Ig-gene segments by anti-D antibodies)进行 PCR扩增，克隆并测序获得抗人 TNFa抗体的重链及轻链可变区的编码序列。由此可以推断相应的氨基酸序列。

1. 构建全长的重链编码区和轻链编码区，分别克隆入表达载体 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司产品），将载体共同转染 CH0细胞，表达抗人 TNFa抗体。通过 MTX筛选，提高抗体表达量。

2. 研究抗人 TNFa抗体、 Fab和 Fab-PEG对 TNFa拮抗能力，并与已有的 TNFa抗体 Humira 比较。下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆：试验手册（New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例 1分泌抗人 TNFa抗体的白细胞的获得取活动性类风湿关节炎病人外周血 5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养，根据 ELISA结果鉴定阳性克隆。

1. 血样及其初步筛査

为了获得分泌抗人 TNFa的人 B细胞，首先用人 TNFa (购自上海欣百诺生物工程有限公司）常规包被 96孔板，每孔用该蛋白 250ng，包被过夜。然后，用 5%脱脂奶粉室温封闭 2小时，奶粉用 pH7. 2 PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清 100微升，室温温育 1小时。然后加入过氧化物酶标记的羊抗人 IgG，室温放置 1小时。洗涤至少 5遍后，加入含 TMD或其他显色剂，室温或 37度处理 20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入 10分钟后，用 50μ1 IN的硫酸终止反应，读取 450nm光密度值。选取阳性且 0D 值高的血清作为获选血样。

2. 人外周血白细胞的分离按照下述配方配制 10倍红细胞裂解液：

称取 NH4C1 80 g， KHC03 10 g， Na₄EDTA 3. 7 g，溶于 800 mL蒸熘水中，用 IN HC1 or IN NaOH调节 pH值用至 7. 2-7. 4，定容至 1000ml。然后按照下述步骤分离外周血白细胞：

( 1 ) 取新鲜抗凝血， 400-500g离心 5分钟，离心弃上清。

(2) 加入 6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解 1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为 lml，则加入 6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或 4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解 1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至 4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

( 3 ) 400-500g离心 5分钟，弃红色上清。 4°C离心效果更佳。

(4) 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤 2和步骤 3—次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。

( 5 ) 洗涤 1-2次：加入适量 PBS、 HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀， 400_500g 离心 2-3分钟，弃上清。可再重复 1次，共洗涤 1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的 5倍, 4°C离心后所得沉淀即为白细胞。按照 lOOmg或 10⁷白细胞沉淀 1ml的比例加入 Trizol , 立即进行总 RNA抽提纯化或 _80°C保存备用。

3. mRNA的分离：

( 1 ) 按照 TriZol (购自 Invitrogen, Cat. No. 12183-555) , ) 分离总 R A，过程按照厂家说明书进行。所得产物 -80°C保存备用。

(2) 用 Dynabeads® mRNA Purification Kit (购自 Invitrogen, Cat. no. 610. 06 ) 分离纯化 mRNA。实施例 2抗人 TNFa抗体基因的获得

以上述所得 mRNA为底物， ol igo-dT25 (委托上海捷瑞生物工程公司合成）为引物，用匪 LV 反转录酶（Invitrogen公司产品， Cat. No. 28025-013) 以获取 cDNA第一链。上述操在均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行 PCR，所用扩增酶为 ClonTech的 Pfu以确保扩增过程中减少可能的突变。

轻链上游引物： GACATCGAGCTGACCCAGTC (SEQ ID N0: 1)

轻链下游引物： CTMCACTCTCCCCTGTTGAAGC (SEQ ID NO : 2)

重链上游引物： GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 3)

重链下游引物： CTAGCATGTGTGAGTTTTGTCACAAG (SEQ ID NO : 4)

PCR条件：

a) 反应体系的组成：成分数量 ( μΐ )

10X PCR反应缓冲液 5

25 mM Mg₂S0₄ 5

Pfu DNA聚合酶（5单位 /微升） 1

上游引物、下游引物（2微克 / 各 1微升，共计 25微微升）升

cDNA 1. 5μ1

灭菌三蒸水至 50微升

b) 反应条件：

预变性： 94度 2分钟

主循环： 94度 1分钟， 55 度 1分钟， 72度 3分钟。

循环数： 20

后延伸： 72度 5分钟

PCR过程在 Thermocycler热循环仪上进行。

c) 电泳鉴定与胶回收

按照上述条件进行 PCR。完毕后将产物在 1%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，两个 PCR的产物分别为 650bp和 670bp左右，与理论大小相符。用 Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行，各得 DNA约 20微克。

抗体库构建和淘筛抗人 TNFa的抗体基因可变区

抗体库构建：

用上述扩增的 PCR产物构建 Fab抗体库，载体为 _PC0Mb3H。该载体为一来自 pC0M3的衍生物，适于表达抗体片段，其全序列参见 GenBank, Accession No. AF268280, 图 1是据此作出的质粒结构图。

来源于人的抗体库的构建过程已在许多文献中有详细描述，以下列举的是其中与本研究密切相关的核心文献。

1. Marks et al By-passing immunization: human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.

J. Mol S o/.，222, 581 -597

2. Hoogenboom and Winter, By-passing immunisation: human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro. J. Mol. Biol.，227, 381 -388

3. Haidaris CG, Malone J, Sherrill LA, Bliss JM, Gaspari AA, Insel RA, Sullivan MA.， Recombinant human antibody single chain variable fragments reactive with Candida albicans surface antigens. J Immunol Methods. 2001 Nov 1 ;257(1 -2): 185-202.

4. Griffiths, A. D.， Williams, S. C.， Hartley, 0.， Tomlinson, I. M.， Waterhouse, P., Crosby, W. L.， Kontermann, R. E.， Jones, P. T.， Low, N. M.， Allison, T. J., Prospero, T. D.， Hoogenboom, H. R.， Nissim, A" Cox, J. P. L.， Harrison, J. L.， Zaccolo, M.， Gherardi, E. & Winter, G. (1994). Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J" 13， 3245-3260.

5. Nissim, A" Hoogenboom, H. R.， Tomlinson, I. M.， Flynn, G.， Midgley, C.， Lane, D. & Winter, G.

(1994). Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. EMBO J.,13, 692-698.

淘筛的操作步骤：

以人 TNFa为抗原，运用 panning方法从上述抗体库中淘筛具有高亲和力的 Fab，具体操作步骤如下：

1. 复苏的抗体库菌株 1毫升加入新鲜 LB培养基 14毫升，于 50毫升三角瓶中 37度培养 16小时。

2. 12000rpm高速离心 10分钟，转移上清至一个无菌的 50毫升离心管中，保存备用。

其滴度应在 2X10¹¹以上。

3. 以纯化的重组人 TNFa蛋白（购自上海欣百诺生物工程有限公司）为抗原，常规方法包被 25毫升细胞培养瓶。

4. 包被后的细胞瓶中加入不少于 βΧΚΓ噬菌体颗粒， 37度温育 1小时。

5. 倒掉瓶中的液体，用 10毫升加入了 l%T_Ween-20的 PBS洗涤培养瓶 10次。

6. 在培养瓶中加入 1毫升对数期的 TG1细胞， 37度温育震荡培养 16小时。

7. 重复步，共进行 4个重复循环。

8. 将上述获得的细胞稀释至 100000细胞 /ml后在加入 0. 1%氨苄青霉素的 1. 5%琼脂平板上进行培养以获得单克隆。

9. 取上述平板上的克隆在 96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作 960个克隆

( 10块 96孔板）。

10. 将上述深孔板在 96孔板离心机上 5000RPM离心 20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于 4度备用。

11. 取 96孔板 10块，每孔中加入人 TNFa ( lOug/ml ) 10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清 10微升， 37度温育 1小时后用含有 l%T_Ween-20的 PBS洗涤 20次。

12. 加入 1微升 HRP标记的羊抗 M13单抗， 37度温育 30分钟后用 l%Tween-20的 PBS 洗涤 10次。 13. 加入含有 0. 025%DAB显色剂的 PBS 200微升和 1微升 1%的 0₂， 37度温育显色 20 分钟后在读板机上读取 595纳米处的光吸收。

14. 根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。

从上述抗体库中淘筛出 486个阳性克隆，根据其显色强度，选 4个最强的克隆进行亲和力鉴定。

亲和力测定采用 Scatchard分析法 (Munson et al, 1980, Anal. BioChem. , 107 : 220 ) 进行。结果表明， 4B3、 5F8、 5G4和 7E2四个克隆的单抗的亲和力分别达到 5. 17X10— ⁷， 5. 21X10— ⁸， 7. 16X10— ⁸和 5. 43X10— ⁶。分子进化：

上述结果表明， 5F8、 5G4两株单克隆抗体的亲和力均已达到 nM的水平。为了进一步提高其亲和力，按照常规方法对技术参数较高的 5F8 重链的 CDR3 (氨基酸序列为 ndegapydh)进行了饱禾口随机突变 ( Saturated random mutat ion ) , 构建了次级抗体库。按照前述淘筛（Panning) 的操作步骤，以 Humira Fab为阳性对照，经 4轮淘筛过程筛选出了 876个阳性克隆，获得了亲和力〉10— ^w的高亲和力 Fab克隆 6个： 7B4、 2H7、 4D3、 6F5、 3C9、 3H6，其中 7B4、 2H7的亲和力达到 10— ¹²量级，达到或超过 Humira Fab 的水平。这 6个克隆将用于进一步鉴定其中和能力。实施例 3 Fab抗体对 TNFa中和能力的研究

通过以下方法检测从上述克隆纯化的 Fab抗体对人 TNFa的中和能力。

1. 取对数生长期的 L929细胞，用消化液常规消化后充分分散细胞，并用细胞培养液稀释到 2 X 10⁵细胞 /毫升。

2. 取 96孔板 4块，每孔中加入 100微升细胞悬浮液， 5%(：0₂培养箱中 37度培养 24 小时。

3. 用广 2μ_§/πι1放线菌素 D和 0. 001微克 /毫升 TNFa标准品（上海欣百诺生物科技有限公司产品）的细胞培养液将待测样品稀释至 10微克 /毫升、 1. 0微克 /毫升、 0. 1 微克 /毫升、 0. 01微克 /毫升、 0. 001微克 /毫升、 0. 0001微克 /毫升和 0. 00001微克 /毫升。

4. 每孔加入 100 微升各种稀释度的样品，每个稀释度 3 个孔。阴性对照只加入含 Γ2μ_§/ιιι1放线菌素 D的细胞培养液。阳性对照中加入高剂量的 TNFa (2μ_§/ιιι1 ) 细胞培养液。

5. 5%(：0₂培养箱中 37度培养 24小时或更长。培养时间根据阳性对照孔中的细胞全部死亡确定。

6. 用 ΜΤΤ染色后在读板机上读取光密度数据。对数据进行作图（结果见图 3)。由试验数据可以看出，7Β4、2Η7的中和能力明显高于 Humira Fab，其余克隆则与 Humira

Fab大体相当或略低。实施例 4全长抗人 TNFa抗体的制备

1. Fab克隆 7B4、 2H7的 DNA测序

把上述 7B4、 2H7克隆采用 MBI公司试剂盒进行测序，操作按照说明书进行。结果显示，该两个克隆分别为人 IgGl抗体的重链和轻链 Fab区域的编码基因。测序结果如下：

TGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC (SEQ ID NO: 7 687bp) 其编码的多肽氨基酸序列分别为：

2. 人 IgGl重链 Fc片段编码序列的获得为了进行全长抗体的基因表达，我们合成了人 IgGl 重链的信号肽序列 (MEFGLSWLFLVAILKGVQC)和重链 Fc编码序列，以便构成完整的抗人 TNFa抗体基因。根据文献，人 IgGl 重链 Fc片段的 DNA编码序列如下：

人 IgGl重链的信号肽编码序列为：（5' →3' ) (SEQ ID NO: 11) 人 IgGl重链的 Fc片段的 DNA序列（5 ' →3' ) (SEQ ID NO: 12)

上述序列根据常规基因合成方法合成。

以同样方法在轻链加上信号肽（MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC, SEQ ID NO: 13 ) 编码序列 NO: 14), 即可构成轻链的全长 DNA分子。

3. 全长抗人 TNF单抗基因及表达产物的获得把上述 Fc片段与前述重链可变区编码区按照常规 Overlapping PCR方法进行拼接。在此过程中在 5' -添加 Sail切点，在 3' -添加 Xbal切点，并在两个各添加两个保护碱基。拼接后的重链全长片段长度为 1428bp。此片段为全长的重链编码区， 7B4和 2H7的重链全序列分别如下 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18)： SEQ ID NO: 15

¾AGTAAGTCTA

ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGtctagagc (1432bp) 编码的氨基酸序列为：

Seq ID NO: 16

ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGtctagagc (1432bp)

其编码的氨基酸序列为：

SEQ ID NO: 18

以同样方法在轻链 Fab (SEQ ID NO: 1) 加上信号肽 ( MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC ) 编码

5' -端和 3' -端分别添加上 Nhel和 EcoRI切点及保护碱基，即可构成轻链的全长 DNA分子（SEQ ID NO: 19)。

SEQ ID NO: 19

ctgctagcATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTgTTGTGGCTGCGCGGAGCACGGTGcGAA

AGTCCTTCAACCGGGGCGAATGCTAGgaattctc(723bp) 把前述轻链编码区（SEQ ID NO: 19)克隆到 pGPl载体（图 2) 的 Nhel/EcoRI位点上，正确克隆记作 pGPIL, 然后把前述重链编码区 (SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 17) 分别克隆到 pGPIL的 Sall/Xbal位点上，正确克隆分别记作 pGP17B4L和 pGP12H7L。表达产物鉴定符合预期。

4. CH0细胞的转染与筛选用 pGP17B4L和 pGP12H7L质粒 DNA按照常规方法转染 CH0细胞。

本发明采用脂质体法（LipoFamine 2000, Invitrogen) 对 CH0细胞进行转染，转染试剂盒购自 Invitrogene公司，转染时分别取上述纯化的分别带有重链和轻链的质粒 100微克作为 DNA样品对 CH0细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。

转染后的 CH0细胞经连续 3周的 G418筛选，其浓度从 0. 05μΜ到 10μΜ，每两周增加一次浓度，每次用量约为前一次的 2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为： 15%胎牛血清（Gibco) +RPM1640/DEME。于 37度 5%C0₂培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用 ELISA方法分别检测抗体的表达，并挑选表达较高的克隆用于制备重组抗体表达产物。

表达产物的纯化采用 GE公司的 Protein A Sepharose CL-4B (产品编号： 17-0963-02) 进行，操作按照厂家说明书进行。两种表达质粒的表达产物分别记作 7B4L和 2H7L。表达产物经鉴定符合预期。实施例 5 全长抗人 TNFa抗体对人 TNFa中和能力的研究以实施例 3的方法鉴定上述纯化的全长抗体对人 TNFa的中和能力，阳性对照为 Humira。试验结果见图 4。

由试验数据可以看出，全长 7B4L和 2H7L比全长 Humim的中和能力明显提高。

Claims

权利要求

1. 一种抗人 TNFa抗体，其特征在于，其轻链氨基酸序列包含 SEQ ID NO: 8，重链氨基酸序列包含 SEQ ID NO: 9或 SEQ ID NO: 10。

2. 如权利要求 1所述抗人 TNFa抗体，其特征在于，所述抗人 TNFa抗体的重链的全长氨基酸序列为 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID NO: 18。

3. 一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求 1所述抗人 TNFa抗体的轻链。

4. 如权利要求 3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包括 SEQ ID N0: 5。

5. 一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求 1所述抗人 TNFa抗体的全长重链。

6. 如权利要求 5所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包括 SEQ ID NO: 15或 SEQ ID NO: 17。

7. 如权利要求 1所述抗人 TNFa抗体的 Fab抗体。

8. 权利要求 1或权利要求 2所述抗人 TNFa抗体，或权利要求 7所述抗人 TNFa抗体的 Fab 抗体在制备治疗与 TNFa相关的炎症的药物上的应用。