CN117304315B - 抗il-6的纳米抗体及其在il-6相关疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗IL‑6的纳米抗体及其在IL‑6相关疾病中的应用，本发明提供了一种抗IL‑6的纳米抗体6C9、编码所述纳米抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体、含有所述表达载体的重组宿主细胞、IL‑6检测试剂盒、药物组合物和生物制剂等，以及其在与IL‑6相关的疾病的诊断和治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗IL-6的纳米抗体及其在IL-6相关疾病中的应用，具体涉及一种抗IL-6的纳米抗体6C9及其在诊断和/或治疗IL-6相关疾病中的应用。
背景技术
白介素-6（IL-6）的表达增多与多种疾病过程相关，包括阿尔兹海默症、自身免疫（如类风湿性关节炎）、炎症、心肌梗死、佩吉特病、骨质疏松症、实体瘤、前列腺癌和膀胱癌、某些神经性癌症、B细胞恶性肿瘤等。IL-6最初被描述为B细胞刺激因子，现在被称为多效性细胞因子，具有多种关键的生物学功能，包括刺激炎症和免疫反应、促进造血和肿瘤发生。它由免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞瞬时产生，但也由其他细胞谱系在各种刺激下（如感染或组织损伤）产生。此外，IL-6作为干细胞扩增和分化的辅助因子与造血相关。在某些情况下，IL-6与增殖途径有关，因为它与其他因子一起作用，如肝素结合上皮生长因子和肝细胞生长因子。因此，阻断白介素-6在许多病理情况下可能是有益的。
白介素6受体（IL-6R）是一种I型跨膜蛋白，在1988年被描述为造血细胞因子受体超家族成员，其基因位于人染色体1q21.3，在单核细胞、巨噬细胞等淋巴细胞均有表达，充当多功能细胞因子IL-6的受体。研究显示，IL-6R除了在多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、卡波西肉瘤、肝癌细胞异常高表达外，还在某些白血病细胞中高表达。该通路的受阻可导致急/慢性炎症、自身免疫性疾病或肿瘤的发展。因此，靶向IL-6/IL-6R轴可作为干预许多与IL-6相关的炎性或肿瘤疾病的有效靶点。纳米抗体，又称为单域抗体（VHH），只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。其重链可变区具有与重链抗体相当的稳定性和抗原结合活性，其大小仅为2.4×4 nm，是能够结合抗原的最小片段，与传统抗体相比，VHH单域抗体分子量小且表达量高，化学稳定性好，亲和力高并且与人源抗体同源性高，免疫原性低等优点。
目前，本领域尚缺乏对IL-6蛋白具有较好的亲和力、特异性、阻断IL-6与IL-6R结合的活性的纳米抗体。
发明内容
针对上述现有技术中本领域存在的技术缺陷，本发明的目的在于提供抗IL-6的纳米抗体及其在IL-6相关疾病中的应用，本发明采用了如下技术方案实现上述发明目的：
纳米抗体
首先，本发明提供了一种针对IL-6蛋白的纳米抗体。
进一步，所述纳米抗体包含互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3为如SEQ ID NO:4所示的纳米抗体中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。
进一步，所述纳米抗体还包含框架区FR1、FR2、FR3、FR4，所述FR1、FR2、FR3、FR4为如SEQ ID NO:4所示的纳米抗体中的框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
进一步，所述纳米抗体的结构为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一些实施方案中，所述CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示或分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70%同一性。
在一些实施方案中，本发明所述CDR1、CDR2、CDR3对应的氨基酸序列并不局限于如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，采用任何CDR编号方案（现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案）对如SEQ ID NO:4所示的纳米抗体中的CDR1、CDR2、CDR3进行定义得到的CDR1、CDR2、CDR3对应的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内，由这些CDRs构成的纳米抗体同样落入本发明的保护范围。
在优选的实施方案中，所述CDR1、CDR2、CDR3是根据IMGT编号方案、Chothia编号方案、Kabat编号方案、Martin（增强型Chothia）编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种定义或任意多种（两种或两种以上）组合定义得到的，经上述定义方式定义得到的CDR1、CDR2、CDR3对应的序列同样包含在本发明的保护范围内。
在某一具体实施方案中，根据IMGT编号方案定义得到的CDR1、CDR2、CDR3对应的氨基酸序列分别如下：GRTVDHYYA（SEQ ID NO:6）、IRSDGGGSDRT（SEQ ID NO:7）、AASASPRRTVKNDRGSRRYRLNFPRWYSRDYDY（SEQ ID NO:8）。
在某一具体实施方案中，根据Chothia编号方案定义得到的CDR1、CDR2、CDR3对应的氨基酸序列分别如下：GRTVDHYY（SEQ ID NO:9）、RSDGGGSDR（SEQ ID NO:10）、SASPRRTVKNDRGSRRYRLNFPRWYSRDYDY（SEQ ID NO:11）。
在某一具体实施方案中，根据Kabat编号方案定义得到的CDR1、CDR2、CDR3对应的氨基酸序列分别如下：HYYAMG（SEQ ID NO:12）、SIRSDGGGSDRTSYADSVKG（SEQ ID NO:13）、SASPRRTVKNDRGSRRYRLNFPRWYSRDYDY（SEQ ID NO:14）。
在一些实施方案中，包含两条或多条本发明第一方面提供的纳米抗体的结合分子是多价纳米抗体；包含两条或多条不同特异性纳米抗体（其中一条为本发明第一方面提供的纳米抗体）的结合分子是多特异性纳米抗体。多价纳米抗体或多特异性纳米抗体通过连接子连接多个纳米抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成，例如(G4S)3、(G4S)4等等。这样形成的多价纳米抗体、多特异性纳米抗体同样包含在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，在不实质性影响纳米抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明所述的纳米抗体对应的序列改变一个或更多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个）氨基酸，以获得所述纳米抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括但并不限于：一个或多个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所公知的。这样取代的氨基酸残基可以是、也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
在某一具体实施方案中，本发明所述的各种纳米抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明提供的纳米抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明提供的纳米抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
如本文中所使用，术语“纳米抗体”，是指在羊驼外周血液中存在的一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）（该重链可变区中包含互补决定区CDR1-3以及框架区FR1-4）和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段（scFv）那样容易相互黏连，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
“纳米抗体”在诸多方面均显著优于传统抗体。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，克服了传统抗体的开发周期长、稳定性较低、保存条件苛刻等缺陷。具体而言，相比于常规抗体，纳米抗体的优势有：(1) 分子量小，可穿透血脑屏障；(2) 原核或真核系统中高表达；(3) 特异性强，亲和力高；(4) 对人的免疫原性弱。
如本文中所使用，术语“同一性”可与术语“同源性”相互替换使用，是指两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60%同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95%同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
核酸分子
其次，本发明提供了一种编码本发明第一方面所述的纳米抗体的核酸分子。
进一步，所述编码本发明第一方面所述的纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步，本发明所述的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
进一步，由于遗传密码的简并性，可制得大量同时编码本发明所述纳米抗体的核酸，因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸（均编码本发明所述的纳米抗体）。所以，本发明还涉及与上述核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%同一性的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明提供的纳米抗体核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将本发明所述纳米抗体的编码序列和表达标签（如6×His）融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子（核酸、蛋白等）包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
表达载体
再次，本发明提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸分子的表达载体。
进一步，所述表达载体包括用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子（例如核酸、质粒、或病毒等），其通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
重组宿主细胞
再次，本发明提供了一种包含本发明第三方面所述的表达载体的重组宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞可包括微生物（例如细菌）、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科（enterobacteriaceae）的成员，例如大肠杆菌（Escherichiacoli）或沙门氏菌（Salmonella）的菌株；芽孢杆菌科（Bacillaceae）例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌（Pneumococcus）；链球菌（Streptococcus）和流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）。适当的微生物包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。适当的动物宿主细胞系包括但不限于：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、猴肾细胞（COS）、人肝细胞癌细胞（例如HepG2）等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本IL-6结合特性的抗体来进行选择。
在一些实施方案中，所述重组宿主细胞可采用将编码本发明所述的纳米抗体的序列转化入合适的哺乳动物宿主细胞中制备得到。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将核苷酸包装在病毒（或病毒载体中）并用病毒（或载体）转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知的。
生产方法
再次，本发明提供了一种生产本发明第一方面所述的纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
(1) 培养本发明第四方面所述的重组宿主细胞，获得含有纳米抗体的培养物；
(2) 从所述培养物中分离或回收得到本发明第一方面所述的纳米抗体。
阻断方法
再次，本发明提供了一种体外阻断IL-6与IL-6R结合的方法，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的纳米抗体体外阻断IL-6与IL-6R结合。
检测方法
再次，本发明提供了一种基于非诊断目的地检测IL-6蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1) 将待测样品与本发明第一方面所述的纳米抗体或包含本发明第一方面所述的纳米抗体的检测剂接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成抗原-抗体复合物则表明待测样品中存在IL-6蛋白。
物质
再次，本发明提供了如下任一种物质：
(1) 一种IL-6结合分子，所述IL-6结合分子为包含一条或多条本发明第一方面所述的纳米抗体的单价或多价纳米抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体或其抗原结合片段；
(2) 一种IL-6检测剂，所述IL-6检测剂包含本发明第一方面所述的纳米抗体和/或所述IL-6结合分子；
(3) 一种IL-6检测试剂盒，所述IL-6检测试剂盒包含本发明第一方面所述的纳米抗体、所述IL-6结合分子和/或所述IL-6检测剂；
(4) 一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本发明第一方面所述的纳米抗体和/或所述IL-6结合分子，以及与其偶联的偶联物，所述偶联物包括药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白和/或VLP；
(5) 一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的纳米抗体、所述IL-6结合分子和/或所述免疫偶联物；
(6) 一种药物制剂，所述药物制剂包含本发明第一方面所述的纳米抗体、所述IL-6结合分子、所述免疫偶联物和/或所述药物组合物。
在一些实施方案中，所述检测剂中的本发明第一方面所述的纳米抗体和/或所述IL-6结合分子可用可检测的标记基团进行标记，合适的标记基团包括但不限于：放射性同位素或放射性核素（例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、荧光基团（例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体）、酶促基团（例如辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶）、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位（例如亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）、MRI（磁共振成像）或CT（电子计算机X射线断层扫描技术）造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明所述纳米抗体的标记。
在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括识别IL-6的纳米抗体（本发明第一方面提供）或IL-6结合分子（本发明第八方面提供）、用于溶解待测样品的裂解介质、检测所需的通用试剂和缓冲液（如各种缓冲液、检测标记、检测底物等）。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有安全有效量（例如0.001-99wt%，较佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%）的本发明第一方面提供的纳米抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体或赋形剂包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术中已知的物质。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
在一些实施方案中，用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道（诸如经口）递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术（诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射）为本领域技术人员所公知的。
在一些实施方案中，药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式（例如冻干）。
应用
再次，本发明提供了如下任一方面应用：
(1) 本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的重组宿主细胞在制备用于检测IL-6的检测剂或检测试剂盒中的应用；
(2) 本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的IL-6结合分子和/或IL-6检测剂在制备与IL-6相关的疾病的诊断产品中的应用；
(3) 本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的IL-6结合分子和/或IL-6检测剂在非诊断目的地检测IL-6蛋白中的应用；
(4) 本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞和/或本发明第八方面中所述的免疫偶联物在制备治疗和/或预防与IL-6相关的疾病的药物组合物或生物制剂中的应用。
诊断方法
此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断与IL-6相关的疾病的方法，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的IL-6结合分子、IL-6检测剂和/或检测试剂盒对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中IL-6蛋白的水平。
进一步，本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的IL-6结合分子、IL-6检测剂和/或检测试剂盒可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与IL-6相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测待测样品中IL-6的存在。可以体内或体外进行IL-6的检测。适用于检测IL-6存在与否的方法的实例包括但不限于：ELISA、FACS、RIA等。
治疗方法
最后，本发明还提供了一种治疗和/或预防与IL-6相关的疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、药物组合物和/或生物制剂。
进一步，采用的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、药物组合物和/或生物制剂的治疗和/或预防有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小（体重、体表或器官大小）和/或状况（年龄和一般健康状况）而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
进一步，给药频率将取决于所用配制物中结合分子的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量（可含有或不含有相同量的所需分子）施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
进一步，所述药物组合物的施用途径是根据已知的任何施用方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内（脑实质内）、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。
如本文中所使用，术语“受试者”和术语“患者”可互换使用，包括任何生物体，优选为动物，更优选为哺乳动物（例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等），且最优选为人。
如本文中所使用，术语“施用”，当将其应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、检测剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”可以是指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触。“施用”还意指通过试剂、组合物或通过另一种细胞体外和离体处理细胞，当所述“处理”应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
如本文中所使用，术语“治疗”，是指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明第一方面所述的纳米抗体的治疗剂，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称作“治疗有效量”）可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻，所述评价可根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student’ t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检（H检验）、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
如本文中所使用，术语“与IL-6相关的疾病”，包括但不限于：成人类风湿关节炎、全身型幼年特发性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、巨细胞动脉炎、巨淋巴结增生症、免疫治疗引起的细胞因子风暴、成人斯蒂尔病、复发性多软骨炎、Ⅱ型糖尿病、强直性脊柱炎、甲状腺相关性眼病、类风湿关节炎引起的心血管疾病、风湿性多肌痛、急性移植物抗宿主病、非ST段抬高型心肌梗死、系统性红斑狼疮、精神分裂症、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、浆细胞白血病、淋巴瘤、B-淋巴组织增生、前列腺癌、骨质疏松症、恶病质、银屑病、肾小球系膜增生性肾小球肾炎、葡萄膜炎、卵巢癌、抗中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎、视神经脊髓炎、慢性肾小球肾炎、结直肠癌等等，任何与IL-6表达相关的疾病均落入在本发明所述的“与IL-6相关的疾病”的范围内。
附图说明
图1为抗体6C9的SDS-PAGE电泳图（还原），其中，自左向右，泳道1：蛋白分子量Marker；泳道2：发酵液；泳道3：上样流穿液；泳道4：纯化后6C9；
图2为ELISA检测抗体6C9亲和力的结果图；
图3为抗体6C9抑制人IL-6与人IL-6R结合的结果图；
图4为抗体6C9与IL-6结合的特异性结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 筛选针对人白介素6（hIL-6）的纳米抗体（VHH）
1、实验方法
1.1 构建噬菌体抗体库
借助计算机辅助分子设计构建的全人源纳米抗体库（VHH抗体库），利用噬菌体展示技术筛选候选抗体。
（1）展示的噬菌体库黏附人白介素6；
（2）反复洗涤去除非特异性结合，洗脱并收集展示结合人白介素6的噬菌体；
（3）再次感染大肠杆菌，挑选单克隆展示于噬菌体表面，ELISA筛选识别人白介素6的阳性克隆。
1.2 抗体基因序列的测定、分析
阳性克隆送到苏州金唯智生物科技有限公司进行抗体基因序列测定，对测序结果用DNAMAN和数据库进行检索分析。
2、实验结果
通过上述实验方法筛选出了能够识别人白介素6的人源化VHH抗体6C9，6C9的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示
表1 人源化VHH抗体6C9的氨基酸序列和核苷酸序列
实施例2 抗IL-6的VHH抗体6C9的制备
1、实验方法
（1）利用PCR方法扩增抗体6C9序列，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入表达载体中（表达载体包含人IgG1 Fc区域序列，6C9序列C末端与人IgG1 Fc片段中间添加G4SG4SG4SG4S柔性Linker）；
（2）将表达载体转染进哺乳动物细胞中，进行表达。收集表达上清，利用GE公司的Protein A FF蛋白柱进行纯化；
（3）用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1 mol/L pH 8 .5 TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01 mol/L的PBS透析72 h，0.22 μm滤膜过滤除菌；
（4）利用SDS-PAGE实验检测抗体的表达及纯化情况，以及利用BCA方法检测纯化抗体浓度，4℃保存。
2、实验结果
抗体6C9的SDS-PAGE电泳结果图如图1所示，其中，自左向右的泳道依次如下，泳道1：蛋白分子量Marker；泳道2：发酵液；泳道3：上样流穿液；泳道4：纯化后6C9，以上结果表明本实施例成功制备得到了抗IL-6的VHH抗体6C9。
实施例3 ELISA检测抗体6C9与人IL-6的结合
1、实验方法
使用碳酸盐缓冲液（Sigma Cat# C3041）将IL-6稀释至0.5 μg/mL，100 μL/孔，室温包被2 h，500 rpm，洗板3次后，使用SuperBlock (Thermo Fisher Scientific Inc.,Cat.# 37515) 150 μL/孔，750 rpm，室温孵育1 h。拍干酶标板后，加入系列稀释的6C9，浓度从0.08 ng/mL至7500 ng/mL，750 rpm，室温孵育1 h。洗板6次后加入1:60000稀释的GoatAnti-Human IgG HRP (SouthernBiotech Cat.# 2049-5)，750 rpm，室温孵育1 h，洗板6次后加入TMB显色液并用稀硫酸终止反应。OD450/630 nm双波长检测OD值。使用SoftMax®Pro软件拟合并计算EC50值。
2、实验结果
结果如图2和表2所示，结果显示，6C9具有较高的与人IL-6蛋白结合的亲和力（nM水平）。
表2 抗体6C9的亲和力结果
实施例4 抗体6C9抑制人IL-6与人IL-6R的结合
1、实验方法
使用碳酸盐缓冲液（Sigma Cat# C3041）将IL-6稀释至1 μg/mL，100 μL/孔，室温包被2 h，500 rpm，洗板3次后，使用SuperBlock (Thermo Fisher Scientific Inc.,Cat.# 37515) 150 μL/孔，500 rpm，室温孵育1 h。拍干酶标板后，加入系列稀释的6C9，浓度从20.5 ng/mL至5000 ng/mL，IL-6R-His 250 ng/mL，500 rpm，室温孵育1 h。洗板6次后加入1:20000稀释的Rabbit Anti-His IgG HRP (SinoBiological Cat.# 105327-MM02T-H)，500 rpm，室温孵育1 h，洗板6次后加入TMB显色液并用稀硫酸终止反应。OD450/630 nm双波长检测OD值。
2、实验结果
结果如图3所示，结果显示，抗体6C9能够相对较好地抑制IL-6与其受体IL-6R的相互作用，具有一定的抑制人IL-6与IL-6R结合的能力，且与人IL-6也具有较强亲和力，可用于人IL-6配体结合相关实验，例如ELISA、胶体金等试剂盒的开发和应用中，还可用于多种与IL-6相关疾病的治疗中，例如自身免疫疾病、慢性炎症、恶性肿瘤、及细胞因子风暴综合征（CSS）等。
实施例5 抗体6C9的特异性
1、实验方法
使用碳酸盐缓冲液（Sigma Cat# C3041）将IL-6、VEGF、TNFα、GP130、PD-L1稀释至2μg/mL，100 μL/孔，室温包被1 h，500 rpm，洗板3次后，使用含5%脱脂奶粉的PBST 150 μL/孔，500 rpm，室温孵育1 h。拍干酶标板后，加入500 ng/mL的6C9，洗板6次后加入20 ng/mL酶标二抗，500 rpm，室温孵育1 h，洗板6次后加入TMB显色液并用稀硫酸终止反应。OD450/630 nm双波长检测OD值。
2、实验结果
结果如图4所示，结果显示，抗体6C9特异的结合IL-6，与其他受试蛋白无明显交叉反应，表明了所述抗体6C9特异性良好。
Claims (16)
1.一种针对IL-6蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示。
2.一种编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸分子。
3.一种包含权利要求2所述的核酸分子的表达载体。
4.一种包含权利要求3所述的表达载体的重组宿主细胞。
5.一种生产权利要求1所述的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 培养权利要求4所述的重组宿主细胞，获得含有纳米抗体的培养物；
(2) 从所述培养物中分离或回收得到权利要求1所述的纳米抗体。
6.一种体外阻断IL-6与IL-6R结合的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用权利要求1所述的纳米抗体体外阻断IL-6与IL-6R结合。
7.一种基于非诊断目的地检测IL-6蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 将待测样品与权利要求1所述的纳米抗体或包含权利要求1所述的纳米抗体的检测剂接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成抗原-抗体复合物则表明待测样品中存在IL-6蛋白。
8.一种IL-6检测剂，其特征在于，所述IL-6检测剂包含权利要求1所述的纳米抗体。
9.一种IL-6检测试剂盒，其特征在于，所述IL-6检测试剂盒包含权利要求1所述的纳米抗体和/或权利要求8所述的IL-6检测剂。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包含权利要求1所述的纳米抗体，以及与其偶联的偶联物，所述偶联物包括药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白和/或VLP。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的纳米抗体和/或权利要求10所述的免疫偶联物。
12.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含权利要求1所述的纳米抗体、权利要求10所述的免疫偶联物和/或权利要求11所述的药物组合物。
13.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体和/或权利要求4所述的重组宿主细胞在制备用于检测IL-6的检测剂或检测试剂盒中的应用。
14.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的重组宿主细胞、权利要求8所述的IL-6检测剂在制备IL-6表达疾病的诊断产品中的应用。
15.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求4所述的重组宿主细胞、权利要求8所述的IL-6检测剂在非诊断目的地检测IL-6蛋白中的应用。
16.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的重组宿主细胞和/或权利要求10所述的免疫偶联物在制备治疗和/或预防IL-6表达疾病的药物组合物或生物制剂中的应用。
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