CN111320691A - 一种抗人4-1bb单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗人4‑1BB单克隆抗体及其应用。本发明公开的抗4‑1BB抗体，含有重链可变区VH和轻链可变区VL，VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；VH和VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列为序列3的第31‑35位、第50‑65位和第98‑100位；VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列为序列4的第24‑39位、第55‑61位和第94‑102位。本发明的抗人4‑1BB抗体能与4‑1BB分子结合并表现出许多优良特性，4‑1BB抗体也可用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病患者的血液或组织中的H4‑1BB。

Description

一种抗人4-1BB单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域中，一种抗人4-1BB单克隆抗体及其应用。
背景技术
4-1BB，也称作CD137、TNFRSF9等，是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白，其是由Kwon和Weissman在激活的鼠T细胞克隆分化筛选过程中首先发现的。Schwarzh等从人活化T细胞中分离出与鼠4-1BB具有同源性的人4-1BB (hu4-1BB),并将其命名为CD137。4-1BB是Ⅰ型膜糖蛋白，不同于PD-1/PD-L，4-1BB 的表达具有激活依赖性，其介导T细胞活化的共刺激信号，广泛存在于免疫细胞包括激活的NK细胞、活化的T细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞表面。
人的4-1BB具有255个氨基酸，在细胞表面以单体和二聚体形式表达，并且易于与配体形成三聚体，进而开启信号转导。
研究表明，4-1BB介导的共刺激信号可增强T细胞的功能，提高T细胞对肿瘤细胞的监视和病毒感染的免疫防御作用。一些4-1BB激动剂抗体能够增加共刺激分子表达，并且显著增强T细胞免疫应答，引起抗肿瘤功效。进一步的，4-1BB单一治疗和组合治疗肿瘤模型已经确定持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答。4-1BB信号途径还可诱导体内CD4+T细胞介导的免疫耐受，阻止自身免疫性疾病的发生、发展。通过干预4-1BB途径的作用来调节淋巴细胞的免疫功能，有可能成为新的免疫治疗途径。
目前，关于4-1BB的激动剂药物，最快的还处在临床研发阶段，而且为数不多，不能满足各种疾病包括癌症的对于免疫治疗方法的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种人4-1BB(H4-1BB)的结合分子，即4-1BB抗体，其结合H4-1BB并能阻断H4-1BB与人4-1BB配体(H4-1BBL)的结合。
本发明所要解决的技术问题是克服目前4-1BB抗体的排异性小、抗体效价高的问题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抗4-1BB抗体，所述抗4-1BB抗体含有重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述VH的CDR1的氨基酸序列如序列3的第31-35位氨基酸所示；
所述VH的CDR2的氨基酸序列如序列3的第50-65位氨基酸所示；
所述VH的CDR3的氨基酸序列如序列3的第98-100位氨基酸所示；
所述VL的CDR1的氨基酸序列如序列4的第24-39位氨基酸所示；
所述VL的CDR2的氨基酸序列如序列4的第55-61位氨基酸所示；
所述VL的CDR3的氨基酸序列如序列4的第94-102位氨基酸所示。
所述VH和VL的框架区可来源于人或模式动物，如小鼠。
所述抗4-1BB抗体是下述的a)或b)或c)或d)：
a)由权利要求1中所述VH和所述VL连接得到的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有权利要求1中所述VH和所述VL的Fab；
d)含有权利要求1中所述VH和所述VL的完整抗体。
所述抗4-1BB抗体的所述VH的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-111位所示；所述抗4-1BB抗体的所述VL的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-112位所示。
所述抗4-1BB抗体由重链和轻链组成，所述重链的氨基酸序列是序列表中序列3，所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列4。
本发明还提供了与所述抗4-1BB抗体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述抗4-1BB抗体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR1的编码序列如序列表中序列1的第91-105位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR2的编码序列如序列表中序列1的第148-195 位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR3的编码序列如序列表中序列1的第292-300 位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR1的编码序列如序列表中序列2的第70-117位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR2的编码序列如序列表中序列2的第163-183 位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR3的编码序列如序列表中序列2的第280-306 位核苷酸所示。
进一步，
所述抗4-1BB抗体中所述VH的编码序列如序列表中序列1的第1-333位所示；所述抗4-1BB抗体中所述VL的编码序列如序列表中序列2的第1-336位所示。
所述抗4-1BB抗体由重链和轻链组成，所述重链的编码序列为序列表中序列1，所述轻链的编码序列为序列表中序列2。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
B2)所述的含有编码抗4-1BB抗体的核酸分子的表达盒(抗4-1BB抗体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达抗4-1BB抗体的DNA，该DNA不但可包括启动抗4-1BB 抗体基因转录的启动子，还可包括终止抗4-1BB抗体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述抗4-1BB抗体基因表达盒的重组载体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pCDNA3.4载体。
所述重组载体可为pCDNA3.4-H和pCDNA3.4-L。所述pCDNA3.4-H为将重链基因甲用XbaI和HindIII酶切后与经XbaI和HindIII酶切pCDNA3.4载体得到的载体骨架连接得到的重组载体，所述重链基因甲由在序列1的5’端依次加上XbaI的识别序列 (5’-TCTAGA-3’)、kozak共识别序列(5’-GCCACC-3’)和singal peptide的编码序列(5’- ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTCTGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)，然后在序列1的3’末端依次加上终止子(TGA)和HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’) 得到，singal peptide的编码序列与序列1的5’端相连，TGA与序列1的3’端相连。
所述pCDNA3.4-L为将轻链基因甲用XbaI和HindIII酶切后与经XbaI和HindIII 酶切pCDNA3.4载体得到的载体骨架连接得到的重组载体，所述轻链基因甲由在序列2 的5’端依次加上XbaI的识别序列(5’-TCTAGA-3’)、kozak共识别序列 (5’-GCCACC-3’)和singalpeptide的编码序列(5’- ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCCACCGGC-3’)，然后在序列2的3’末端依次加上终止子(TGA)和HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’) 得到，singal peptide的编码序列与序列2的5’端相连，TGA与序列2的3’端相连。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
所述转基因动物细胞系和转基因植物细胞系均非繁殖材料。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述抗4-1BB抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述抗4-1BB抗体的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码B1)所述抗4-1BB抗体且具有所述抗4-1BB抗体活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述抗4-1BB抗体的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本发明还提供了下述C1或C2的成套试剂：
C1、成套试剂，由所述抗4-1BB抗体与抗CD3抗体组成；
C2、成套试剂，由所述生物材料与所述抗CD3抗体组成。
所述成套试剂具有如下M1-M11中任一功能：
M1、促进T淋巴细胞IFN-γ和/或IL-2分泌；
M2、促进T淋巴细胞活化和/或增殖；
M3、抑制Th1或Th17细胞的凋亡；
M4、治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病；
M5、治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病；
M6、治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应；
M7、治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病；
M8、治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病；
M9、治疗和/或预防和/或诊断肿瘤；
M10、阻断4-1BB/4-1BBL信号通路；
M11、检测4-1BB。
本发明还提供了所述抗4-1BB抗体，或所述生物材料，或所述成套试剂的下述任一应用：
A1、在制备促进T淋巴细胞IFN-γ分泌产品中的应用；
A2、在促进T淋巴细胞IFN-γ分泌中的应用；
A3、在制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品中的应用；
A4、在促进T淋巴细胞活化和/或增殖中的应用；
A5、在制备抑制Th1或Th17细胞的凋亡产品中的应用；
A6、在抑制Th1或Th17细胞的凋亡中的应用；
A7、在制备治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病产品中的应用；
A8、在治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病中的应用；
A9、在制备治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病产品中的应用；
A10、在治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病中的应用；
A11、在制备治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应产品中的应用；
A12、在治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应中的应用；
A13、在制备治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病产品中的应用；
A14、在治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病中的应用；
A15、在制备治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病产品中的应用；
A16、在治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病中的应用；
A17、在制备治疗和/或预防和/或诊断肿瘤产品中的应用；
A18、在治疗和/或预防和/或诊断肿瘤中的应用；
A19、在制备阻断4-1BB/4-1BBL信号通路产品中的应用；
A20、在阻断4-1BB/4-1BBL信号通路中的应用；
A21、在制备检测4-1BB产品中的应用；；
A22、在检测4-1BB中的应用。
所述自身免疫疾病可为系统性红斑狼疮。
本发明还提供了具有如下M1-M9中任一功能的产品，所述产品含有所述抗4-1BB抗体，或所述生物材料，或所述成套试剂；
M1、促进T淋巴细胞IFN-γ分泌；
M2、促进T淋巴细胞活化和/或增殖；
M3、抑制Th1或Th17细胞的凋亡；
M4、治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病；
M5、治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病；
M6、治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应；
M7、治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病；
M8、治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病；
M9、治疗和/或预防和/或诊断肿瘤；
M10、阻断4-1BB/4-1BBL信号通路；
M11、检测4-1BB。
所述产品可为药物或疫苗。
本发明所述肿瘤可为实体肿瘤，如前列腺癌、黑素瘤或上皮癌。
本发明的4-1BB抗体能与4-1BB分子结合并表现出许多优良特性。这些特性包括例如与人4-1BB分子高亲和力结合，与猴4-1BB分子有交叉反应，其与H4-1BB的结合能介导免疫反应增强，显著增加IFN-γ的表达量，即表明刺激CD4+T和CD8+T细胞增殖，说明该抗体可以通过调节免疫细胞活性进而对免疫系统进行调控，能够运用于免疫增强物抗肿瘤或抗病毒免疫反应的免疫增强物，或T细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节物。本发明的4-1BB抗体也可用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病患者的血液或组织中的H4-1BB。
附图说明
图1为单克隆抗体HKB6的蛋白电泳图谱。1+：杂交瘤来源抗体还原电泳(上下两条带分别为重链及轻链)；2+：体外表达的抗体还原电泳(上下两条带分别为重链及轻链)，重链为50kD，轻链为25kD；1-：杂交瘤来源抗体非还原电泳；2-：体外表达的抗体非还原电泳；M：标准蛋白分子量，从上至下条带大小依次为180kD、130kD、95kD、 72kD、55kD、43kD、34kD、26kD、17kD。
图2为ELISA检测HKB6与4-1BB特异性结合活性结果。(A)图为HKB6与人4-1BB 亲和力结果，(B)图为HKB6与猴4-1BB亲和力结果。
图3为FACS检测高表达4-1BB分子的CHO-K1稳转细胞株结果。(A)为高表达人 4-1BB的CHO-K1细胞株(CHO-h4-1BB)的鉴定，由图中可以看出阳性克隆比例为 96.91％，以常规不表达人4-1BB分子的CHO-k1作为本底对照；(B)为高表达猴4-1BB 的CHO-K1细胞株(CHO-Cy4-1BB)鉴定，由图中可以看出阳性克隆比例为94.30％，以常规不表达猴4-1BB分子的CHO-k1作为本底对照。
图4为流式细胞仪(FACS)检测单克隆抗体HKT8与CHO-K1细胞上4-1BB分子的结合活性。(A)图为HKB6与人4-1BB结合活性检测结果，(B)图为HKB6与猴4-1BB结合活性检测结果。
图5为ELISA检测HKB6与人4-1BBL竞争结合。横坐标中2.0、1.5、1.0、0.5 和0.0分别为H4-1BBL与HKB6的质量浓度比分别为100：1、30:1、10:1、3:1、1:1 的结果。
图6为FACS检测HKB6与人4-1BBL竞争结合。横坐标为HKB6与4-1BBL质量浓度配比的比值。
图7为体外检检测HKB6对CD4+T细胞刺激反应。
图8为体外检检测HKB6对CD8+T细胞刺激反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的 5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pCDNA3.4载体(Invitrogen，Cat:A14697)。
实施例1、抗人4-1BB抗体的制备
一、抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
选用4～6周龄的Balb/c小鼠3只和C57b1/6小鼠3只，以人4-1BB为抗原，用 100μgricin于腹股沟皮下免疫，每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接ELISA检测抗体产生情况，选择合适的免疫的小鼠，摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合制备抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株。
用ELISA筛选抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞。用10μg/ml人4-1BB(h4-1BB) 包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液，于37℃孵育1小时，再用PBST洗板3次，加入4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 (ThermoFisher公司)于37℃孵育45min，PBST洗板3次后，用四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)底物显色后，于450nm波长测定OD值。
用ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法。将培养板置于37℃、5％的CO2孵箱中培养，约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性并且长势好的单克隆细胞株进行扩大培养，即得到抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株，及时冻存细胞株。
二、抗人4-1BB抗体的制备
将步骤一所得阳性并且长势好的抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株逐级扩大培养，离心(10000rpm离心10分钟)，取上清，将所得上清用Protein G亲和层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡Protein G柱(GE公司)，然后培养上清过柱，先采用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mM NaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mM NaCl， pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30KDa浓缩离心管浓缩获得所述抗体即获得单克隆抗体—抗人4-1BB抗体(将该抗体命名为HKB6)。
纯化、浓缩后，对收集的样品进行SDS-PAGE电泳，HKB6抗体的SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。
对得到的抗人4-1BB抗体进行测序，结果显示，所得抗人4-1BB抗体为完整抗体，该抗体由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列为序列表中序列3，轻链的氨基酸序列为序列表中序列4。重链可变区VH的氨基酸序列为序列表中序列3的第1-111位，其 CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为序列3的第31-35位、第50-65位和第98-100位；轻链可变区VL的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-112位，其CDR1、CDR2和CDR3 的序列分别为序列4的第24-39位、第55-61位和第94-102位。
在抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株中，经测序得到编码HKB6重链的DNA分子(记为重链编码基因)的序列为序列表中序列1，编码HKB6轻链的DNA分子(记为轻链编码基因)的序列为序列表中序列2。
三、抗人4-1BB抗体的表达与纯化
根据测序得到的基因序列，合成全长基因序列，并分别在序列1和序列2的5’端依次加上XbaI的识别序列(5’-TCTAGA-3’)、kozak共识别序列(5’-GCCACC-3’) 和singalpeptide的编码序列(5’- ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTCTGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)，singal peptide的编码序列与序列1和序列2的5’端相连，然后分别在序列1和序列2的3’末端依次加上终止子(TGA)和HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)，TGA与序列 1和序列2的3’端相连，将由序列1和序列2得到的新的DNA序列分别记为重链基因甲和轻链基因甲。人工合成重链基因甲，将重链基因甲用XbaI和HindIII酶切后与经 XbaI和HindIII酶切pCDNA3.4载体得到的载体骨架连接，得到重组载体，将该重组载体记为pCDNA3.4-H；将轻链基因甲用XbaI和HindIII酶切后与经XbaI和HindIII 酶切pCDNA3.4载体得到的载体骨架连接，得到重组载体，将该重组载体记为 pCDNA3.4-L。将pCDNA3.4-H和pCDNA3.4-L导入到人胚胎肾细胞系HEK293F(ATCC美国细胞库)，得到重组细胞，然后将重组细胞放入37℃、5％CO2振荡培养箱中培养，转速120rpm。培养三天后，利用Protein A亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白，即得到体外表达的抗人4-1BB抗体。对抗人4-1BB抗体进行测序，结果显示，该抗体由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列为序列表中序列3，轻链的氨基酸序列为序列表中序列4，即该抗体为HKB6。通过BCA方法对纯化的HKB6蛋白含量进行测定。将纯化的HKB6分别在还原和非还原条件下利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量和纯度。结果显示如图1所示，体外表达得到的抗体与杂交瘤细胞株来源抗体纯度一致，轻、重链大小一致，即说明通过在细胞内导入目的基因，也能够得到目的抗体HKB6。
实施例2、单克隆抗体亲和力鉴定
一、ELISA检测单克隆抗体HKB6与人和猴4-1BB的亲和力
采用实施例1的杂交瘤细胞株得到的HKB6进行如下实验：
所用试剂包括：人抗原4-1BB(h4-1BB)和猴抗原4-1BB(Cy4-1BB)，96孔酶标板(Nunc公司)、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记亲和素、显色底物和终止液。
常规器材和试剂如下：
其中，铺板缓冲液为pH为7.0的磷酸盐缓冲液；
洗涤液为向pH为7.0的磷酸盐缓冲液添加Tween 20得到的溶液，洗涤液中Tween20的体积百分比含量为0.05％。
封闭液为向洗涤液中添加BSA得到的溶液，封闭液中BSA的含量为10g/L。
辣根过氧化物酶标记亲和素(即辣根过氧化物酶标记羊抗鼠)为ThermoFisher 公司产品。
显色底物为四甲基联苯胺。
终止液为1M硫酸水溶液。
其中，pH为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；氯化钠在pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，氯化钾在pH 为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，磷酸二氢钾在pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，磷酸氢二钠在pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。
将抗原H4-1BB用铺板缓冲液稀释，得到抗原浓度为1μg/ml的抗原溶液，每孔加100μl抗原溶液铺板，4℃过夜。用洗涤液洗板三次，然后每孔加300μl封闭液，37℃封闭1小时；用洗涤液洗板三次，将实施例1得到的单克隆抗体HKB6用浓度为10g/L 的BSA稀释液(由pH为7.0的磷酸盐缓冲液溶解BSA得到)稀释，得到抗体浓度为 1000ng/ml的初始抗体溶液，再用BSA稀释液对初始抗体溶液进行4倍倍比稀释，得到抗体浓度分别为1000ng/ml、250ng/ml、62.5ng/ml、15.63ng/ml、3.91ng/ml、 0.98ng/ml和0.24ng/ml的抗体稀释液，然后将各溶液取100μl加至96孔板中，每个浓度设置两个复孔，振荡1小时；用洗涤液洗板三次，然后向每孔加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液100μl，振荡0.5小时，其中辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液为利用含有10g/L BSA的pH为7.0的磷酸盐缓冲液将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释8000倍得到的溶液；用洗涤液洗板三次，然后每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl；避光显色4分钟，加 1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450nm下测OD值。
以抗体Utomilumab(辉瑞制药有限公司，根据该抗体专利(专利号：US8337850B2)中公开序列合成所得)替换HKB6作为阳性对照。
通过上述步骤，实验证明HKB6单克隆抗体与人和猴的4-1BB分子均有很高的亲和力，如图2和表1所示。
表1、ELISA检测HKB6与h4-1BB亲和力检测结果
Figure BDA0001908220910000101
实施例1中两种方法得到的抗人4-1BB抗体(即HKB6)均得到了相似的结果。
二、FACS检测单克隆抗体HKB6与人和猴4-1BB亲和力
采用实施例1的杂交瘤细胞株得到的HKB6进行如下实验：
所用试剂包括：
FACS缓冲液，该缓冲液为向PBS中添加BSA和叠氮化钠得到的溶液，该缓冲液中BSA的质量百分比浓度为2％，叠氮化钠的质量百分比浓度为0.02％；
羊抗人FITC二抗(Sigma公司，避光保存)。
将人源4-1BB分子基因序列(如序列表5所示，包含酶切位点)，用XbaI和HindIII酶切后，与pCDNA3.4载体经XbaI和HindIII酶切得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒，即得到能表达人4-1BB的重组质粒。
将猴源4-1BB分子基因序列(如序列表6所示，包含酶切位点)，用XbaI和HindIII酶切后，与pCDNA3.4载体经XbaI和HindIII酶切得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒，即得到能表达猴4-1BB的质粒。
提前培养足够量的CHO-K1细胞(ATCC)，至密度在3-5x 106/ml。转染在6孔板中进行，每孔需要准备5μg左右能表达人或猴4-1BB的重组质粒。以6孔板的一个孔为例，在0.125ml Opti-MEM培养基(Gibco)中加入8μl Lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen)，用手指弹匀或枪头混匀，得到试剂A，室温静置5分钟；在0.125ml OptiMEM培养基中加入5μg能表达人或猴4-1BB的重组质粒和10μl Lipofectamine3000转染试剂得到试剂B，室温静置5分钟；将试剂A和试剂B混合，混匀，室温静置20-30分钟(混合物需要在1小时内做完转染)；对CHO-K1细胞进行处理，先用PBS洗两遍，再用OptiMEM培养基洗一遍，最后补加250μlOptiMEM培养基；将A和B的混合液加入相应孔中，并置于培养箱中培养24hr，5％CO2；24小时后，将转染OptiMEM培养基去掉，加入含有1.5mg/ml G418的DME-F12培养基，继续进行加压处理，得到高表达人或猴4-1BB的CHO-K1细胞株。
下述实验使用的待测细胞为高表达人4-1BB的CHO-K1细胞株(CHO-h4-1BB)。 CHO-h4-1BB细胞的FACS鉴定结果如图3中A，由图中可以看出阳性克隆比例为96.91％，以常规不表达人4-1BB分子的CHO-k1作为本底对照；FACS检测中所用抗体为 anti-human CD137(Biolegend,货号309811)。
使用T75瓶培养待测细胞至80％满度，PBS洗一遍，胰酶消化，收集细胞(每瓶细胞数在106个左右)，加RPMI164培养基吹打，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。将收集的细胞，用约1ml FACS缓冲液重悬清洗，1000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀。再用750μl的FACS缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液，进行细胞计数，细胞悬液中细胞浓度为1×107个细胞/ml。准备各个稀释梯度的HKB6抗体稀释液(HKB6 抗体稀释液的制备方法同步骤一)，共得到HKB6抗体浓度分别为20μg/ml、6.667μg/ml、 2.222μg/ml、0.741μg/ml、0.247μg/ml、0.082μg/ml和0.027μg/ml的HKB6抗体稀释液，向各个离心管中各加入20μl HKB6抗体稀释液，每个离心管中加入一种抗体浓度的抗体稀释液，将加入抗体浓度为0μg/ml的抗体稀释液的离心管作为空白对照。向加有不同浓度抗体的各离心管中加入25μl的细胞悬液，混匀后，孵育30min，每隔 10min轻弹混匀。用1ml FACS缓冲液清洗两次后，加入利用FACS缓冲液稀释后的羊抗人FITC二抗，吹打重悬，避光孵育30min，每隔10min轻弹混匀。再次用1ml FACS 缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl FACS缓冲液重悬，转移到FACS管中，置于冰上避光，上机检测。将抗体Utomilumab(辉瑞制药有限公司)作为阳性对照。
通过上述步骤，实验证明HKB6单克隆抗体与人4-1BB分子具有很高的结合活性，如图4中A和表2所示。
按照上述步骤，使用高表达猴4-1BB的CHO-K1细胞株(CHO-Cy4-1BB)检测HKB6 单克隆抗体与猴4-1BB结合活性。CHO-Cy4-1BB细胞的FACS鉴定结果如图3中B，由图中可以看出阳性克隆比例为94.30％，以常规不表达猴4-1BB分子的CHO-k1作为本底对照；FACS检测中所用抗体为Utomilumab。准备好足量的CHO-Cy4-1BB细胞，抗体稀释到浓度为6μg/ml、2μg/ml、0.67μg/ml、0.22μg/ml、0.074μg/ml和0.024μg/ml, 设置阳性对照抗体Utomilumab(辉瑞制药有限公司)。
通过上述步骤，实验证明HKB6单克隆抗体与猴4-1BB分子具有很高的结合活性，如图4中B和表2所示。
表2、FACS检测4-1BB抗体亲和力检测结果
Figure BDA0001908220910000121
实施例1中两种方法得到的抗人4-1BB抗体(即HKB6)均得到了相似的结果。
实施例3、单克隆抗体对H4-1BB与4-1BBL竞争结合实验
一、ELISA检测配体竞争结合
采用实施例1的杂交瘤细胞株得到的HKB6进行如下实验：
将抗原人H4-1BB蛋白用实施例2的铺板缓冲液稀释，得到抗原浓度为1μg/ml 的抗原溶液，每孔加100μl抗原溶液铺板，4℃过夜；用实施例2的洗涤液洗板三次，然后每孔加300μl实施例2的封闭液，37℃封闭1小时；将实施例1得到的HKB6用实施例2的BSA浓度为10g/L的专用样品稀释液稀释，得到HKB6抗体浓度为0.2μg/ml 的HKB6抗体溶液，向HKB6抗体溶液中添加人4-1BBL(H4-1BBL)，设置五种HKB6与 H4-1BBL配比，得到五种H4-1BBL&HKB6溶液，这五种溶液中H4-1BBL与HKB6的质量浓度比分别为100：1、30:1、10:1、3:1、1:1，将H4-1BBL&HKB6溶液100μl加入板内，每种溶液设置两个复孔，振荡1小时；然后向每孔加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液100μl，振荡0.5小时，其中辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液为利用含有 10g/L BSA的pH为7.0的磷酸盐缓冲液将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释4000倍得到的溶液；用洗涤液洗板三次，每孔加TMB 100μl。避光显色4分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450nm下测OD值。
将HKB6替换为阴性对照抗人4-1BB抗体(Biolegend,货号309811)，抗人4-1BB 抗体与4-1BBL没有竞争关系。
通过上述步骤，实验证明HKB6单克隆抗体与H4-1BB有高亲和力(图5)，并且与人4-1BBL的结合位点有竞争关系，即该单克隆抗体在一定程度上随着药物剂量会阻断 4-1BB/4-1BBL信号通路。实施例1中两种方法得到的抗人4-1BB抗体(即HKB6)均得到了相似的结果。
二、FACS检测配体竞争结合
采用实施例1的杂交瘤细胞株得到的HKB6进行如下实验：
实验使用的待测细胞为高表达人4-1BB的CHO-K1细胞株(CHO-h4-1BB)。
使用T75瓶培养CHO-h4-1BB细胞至80％满度，PBS洗一遍，胰酶消化，收集细胞 (每瓶细胞数在106个左右)，加RPMI培养基吹打，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。将收集的CHO-h4-1BB细胞，用约1ml FACS缓冲液重悬清洗，1000rpm离心 5min，弃上清，收集沉淀。再用750μl的FACS缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液，进行细胞计数，细胞悬液中细胞浓度为1×107个细胞/ml。用FACS缓冲液将4-1BBL(人 4-1BBL蛋白带有人Fc标签，根据4-1BBL公开序列合成，4-1BBL的序列(如序列表序列7)稀释到4-1BBL浓度为2μg/ml，得到4-1BBL溶液，向4-1BBL溶液中添加单克隆抗体HKB6，设置六种HKB6与4-1BBL配比，共得到六种HKB6&4-1BBL溶液，这六种 HKB6&4-1BBL溶液中HKB6与4-1BBL质量浓度配比分别为120:1、30:1、7.5:1、1.88:1、 0.47:1、0.12:1。向各离心管中加入20μl HKB6&4-1BBL溶液，每个试管中一种溶液，其中抗体浓度为0μg/ml的作为空白对照。向各离心管中加入25μl的细胞悬液，混匀后，孵育30min，每隔10min轻弹混匀。用1ml FACS缓冲液清洗两次后，加入利用 FACS缓冲液稀释后的羊抗人FITC二抗，吹打重悬，避光孵育30min，每隔10min轻弹混匀。再次用1mlFACS缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl FACS缓冲液重悬，转移到FACS管中，置于冰上避光，上机检测。
将HKB6替换为阴性对照抗人4-1BB抗体(Biolegend,货号309811)，抗人4-1BB 抗体与4-1BBL没有竞争关系。
通过上述步骤，得到如图6结果，实验证实了ELISA竞争结果，再次证明HKB6 单克隆抗体与人4-1BBL在H4-1BB分子上的结合表位有竞争，该单克隆抗体一定程度上会阻断4-1BB/4-1BBL信号通路。实施例1中两种方法得到的抗人4-1BB抗体(即 HKB6)均得到了相似的结果。
实施例4、体外药效实验检测4-1BB抗体功能效应
采用实施例1的杂交瘤细胞株得到的HKB6进行如下实验：
(一)抗体包板
将anti-CD3抗体(Biolegend,货号317325)利用PBS稀释到1μg/ml，得到 anti-CD3抗体溶液；将实施例1得到的抗人4-1BB抗体(HKB6)取高、中、低三个浓度，利用PBS进行稀释，分别得到HKB6浓度为4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml的 HKB6溶液。将anti-CD3抗体溶液分别与三种HKB6溶液按照1:1的体积比混合均匀后，加入96孔板包板，50μl/孔，设3个复孔。再将96孔板静置于4℃冰箱内过夜。第二天使用前，用PBS清洗三次。设置阳性对照抗体为Utomilumab，阴性对照抗体为IgG (Biolegend,货号403601)。
(二)人CD4+T细胞分离
从健康人中抽取全血20ml，使用淋巴细胞分离液(Sigma公司)，按照其说明书操作分离PBMC细胞，并使用人CD4+T细胞磁珠(BD公司，货号557767)，根据说明书分离纯化得到人CD4+T细胞，备用。
(三)人CD8+T细胞分离
从健康人中抽取全血20ml，使用淋巴细胞分离液(Sigma公司)，按照其说明书操作分离PBMC细胞，并使用人CD8+T细胞磁珠(BD公司，货号557766)，根据说明书分离纯化得到人CD8+T细胞，备用。
(四)细胞铺板
将步骤(二)的CD4+T细胞接种至步骤(一)包板后的96细胞培养板中，CD4+T 细胞接种密度为1×105个/孔，细胞接种好后，将96孔板放于37℃，5％CO2培养箱中培养2天，收集细胞上清，ELISA检测细胞因子INF-γ的分泌量。
INF-γ分泌量的检测步骤如下：取anti-INF-γ抗体(Biolegend公司的anti-human INF-γ)用铺板缓冲液稀释，得到浓度为1μg/ml的稀释液，每孔加100μl稀释液铺板，4℃过夜；用洗涤液洗板三次，然后每孔加300μl封闭液，37℃封闭1小时；用洗涤液洗板三次，然后将实施例5中得到的细胞上清用BSA稀释，每孔加入100μl，每个浓度设置两个复孔，振荡1小时；用洗涤液洗板三次，然后向每孔加另一种 Bio-anti-INF-γ抗体(Biolegend公司的Bio-anti human INF-γ)，振荡1小时；用洗涤液洗板三次。再向孔中加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液100μl，振荡0.5 小时，其中辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释液为利用含有10g/L BSA的pH为7.0的磷酸盐缓冲液将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠稀释8000倍得到的溶液；用洗涤液洗板三次，然后每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司) 100μl；避光显色4分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450 nm下测OD值。
按照上述方法，将CD4+T细胞替换为步骤(三)的CD8+T细胞，其他步骤均不变，检测细胞因子INF-γ的分泌量。
具体检测结果见图7和图8，结果显示，HKB6抗体作用后，能够刺激T细胞活化，显著增加IFN-γ的表达量，此种作用呈现药物剂量依赖性。即说明本发明的HKB68 抗体可以调节免疫细胞活性进而对免疫系统进行调控，能够运用于抗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等相关药物的制备中。实施例1中两种方法得到的抗人4-1BB抗体(即HKB6)均得到了相似的结果。
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caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60
acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc acctatgata taagctggat tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggactg gtggaggcac aaattataat 180
tcaactttca tgtccagact gagcatcaac aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag ggtggactac 300
tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaga ccacaccccc tagcgtgtat 360
ccactggccc ccggatccgc tgctcagaca aactctatgg tgacactggg atgcctggtg 420
aagggctact tccctgagcc tgtgacagtg acatggaact ctggatctct gtcttctggc 480
gtgcacacat tccctgctgt gctgcagtct gacctgtata cactgtcttc ttctgtgaca 540
gtgcctagct ctacatggcc ttctgagaca gtgacatgca acgtggctca ccctgcttct 600
tctacaaagg tggacaagaa gatcgtgcct agagactgcg gctgcaagcc ttgcatctgc 660
acagtgcctg aggtgtcttc tgtgttcatc ttccctccta agcctaagga cgtgctgaca 720
atcacactga cacctaaggt gacatgcgtg gtggtggaca tctctaagga cgaccctgag 780
gtgcagttct cttggttcgt ggacgacgtg gaggtgcaca cagctcagac acagcctaga 840
gaggagcagt tcaactctac attcagaagc gtgtctgagc tgcctatcat gcaccaggac 900
tggctgaacg gaaaggagtt caagtgcaga gtgaactctg ctgctttccc tgctcctatc 960
gagaagacca tcagcaagac taagggcaga cctaaggctc ctcaggtgta tacaatccct 1020
cctcctaagg agcagatggc taaggacaag gtgtccctga catgcatgat cacagacttc 1080
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cagaagtcca actgggaggc tggcaacaca ttcacctgct ctgtgctgca cgagggcctg 1260
cacaaccacc acacagagaa gtctctgtct cactctcctg gcaag 1305
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ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
cctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaaatac acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaagag ctgatgctgc tcctacagta 360
tcgatcttcc ctcctagctc tgaacagctg actagcggag gagcctctgt ggtgtgcttc 420
ctgaacaact tctaccctaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg cagcgagcgc 480
cagaacggcg tgctgaacag ctggacagac caggactcta aggactctac atactctatg 540
tctagcacac tgaccctgac caaggacgag tacgagcgcc acaactctta cacctgcgag 600
gctacccaca agacctctac atctcctatc gtgaagtcct tcaaccgcaa cgagtgc 657
<210> 3
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Thr Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
100 105 110
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
115 120 125
Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
165 170 175
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
180 185 190
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
195 200 205
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
210 215 220
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
225 230 235 240
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
245 250 255
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
260 265 270
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
275 280 285
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
355 360 365
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
370 375 380
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
385 390 395 400
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
405 410 415
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 789
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
tctagagcca ccatgggcaa ctcctgctac aacatcgtgg ccaccctgct gctggtgctg 60
aacttcgagc gcacccgctc cctgcaggac ccatgctcca attgtcccgc cggcaccttc 120
tgcgataaca ataggaacca gatctgctct ccctgtcccc ctaatagctt tagctccgcc 180
ggaggacaga ggacatgcga catctgtaga cagtgcaagg gcgtgttcag gacccgcaag 240
gagtgttcta gcacaagcaa cgccgagtgc gactgtaccc ctggatttca ctgcctggga 300
gcaggatgtt ccatgtgcga gcaggattgt aagcagggcc aggagctgac caagaagggc 360
tgcaaggact gctgtttcgg caccttcaac gatcagaaga ggggcatctg tcgcccttgg 420
accaactgca gcctggatgg caagtccgtg ctggtgaatg gcacaaagga gagggacgtg 480
gtgtgcggac cttctccagc cgatctgagc ccaggcgcct cctctgtgac cccaccagca 540
ccagcaagag agcctggaca ctccccacag atcatctcct tctttctggc cctgacctct 600
acagccctgc tgttcctgct gttctttctg accctgaggt tttccgtggt gaagaggggc 660
cgcaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cccttcatga gacccgtgca gaccacacag 720
gaggaggatg gctgctcttg taggtttcca gaggaggagg agggaggatg tgagctgtga 780
tgactcgag 789
<210> 6
<211> 783
<212> DNA
<213> 猴（Primates）
<400> 6
tctagagcca ccatgggcaa ctcctgttac aatatcgtgg ccaccctgct gctggtgctg 60
aacttcgagc ggacaagaag cctgcaggac ctgtgctcca attgtcctgc cggcaccttc 120
tgcgataaca atcggagcca gatctgctcc ccatgtcccc ctaactcttt tagctccgcc 180
ggaggacaga ggacatgcga catctgtaga cagtgcaagg gcgtgtttaa gacccggaag 240
gagtgttcta gcacatctaa tgccgagtgc gactgtatca gcggctatca ctgcctgggc 300
gccgagtgta gcatgtgcga gcaggattgt aagcagggcc aggagctgac caagaagggc 360
tgcaaggact gctgtttcgg caccttcaac gatcagaaga ggggcatctg tcgcccctgg 420
accaactgct ctctggatgg caagagcgtg ctggtgaatg gcacaaagga gagagacgtg 480
gtgtgcggcc cttccccagc agatctgtct cctggcgcct cctctgccac cccacccgcc 540
ccagccaggg agcccggcca ctccccccag atcatcttct ttctggccct gaccagcaca 600
gtggtgctgt tcctgctgtt ctttctggtg ctgcggttta gcgtggtgaa gcggtccaga 660
aagaagctgc tgtacatctt caagcagcct tttatgaggc cagtgcagac cacacaggag 720
gaggacggct gctcctgtag gttcccagag gaggaggagg gaggatgcga gctgtgactc 780
gag 783
<210> 7
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250

Claims (10)

1.抗4-1BB抗体，含有重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述VH的CDR1的氨基酸序列如序列3的第31-35位氨基酸所示；
所述VH的CDR2的氨基酸序列如序列3的第50-65位氨基酸所示；
所述VH的CDR3的氨基酸序列如序列3的第98-100位氨基酸所示；
所述VL的CDR1的氨基酸序列如序列4的第24-39位氨基酸所示；
所述VL的CDR2的氨基酸序列如序列4的第55-61位氨基酸所示；
所述VL的CDR3的氨基酸序列如序列4的第94-102位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的抗4-1BB抗体，其特征在于：所述抗4-1BB抗体是下述的a)或b)或c)或d)：
a)由权利要求1中所述VH和所述VL连接得到的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有权利要求1中所述VH和所述VL的Fab；
d)含有权利要求1中所述VH和所述VL的完整抗体。
3.根据权利要求1或2所述的抗4-1BB抗体，其特征在于：所述抗4-1BB抗体的所述VH的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-111位所示；所述抗4-1BB抗体的所述VL的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-112位所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的抗4-1BB抗体，其特征在于：所述抗4-1BB抗体由重链和轻链组成，所述重链的氨基酸序列是序列表中序列3，所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列4。
5.与权利要求1-4中任一所述抗4-1BB抗体相关的生物材料，为B1)至B16)中的任一种：
B1)编码权利要求1-4中任一所述抗4-1BB抗体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
6.根据权利要求1-5中任一所述的生物材料，其特征在于：
所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR1的编码序列如序列表中序列1的第91-105位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR2的编码序列如序列表中序列1的第148-195位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VH的CDR3的编码序列如序列表中序列1的第292-300位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR1的编码序列如序列表中序列2的第70-117位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR2的编码序列如序列表中序列2的第163-183位核苷酸所示；
所述抗4-1BB抗体中所述VL的CDR3的编码序列如序列表中序列2的第280-306位核苷酸所示。
7.根据权利要求5或6所述的生物材料，其特征在于：
所述抗4-1BB抗体中所述VH的编码序列如序列表中序列1的第1-333位所示；所述抗4-1BB抗体中所述VL的编码序列如序列表中序列2的第1-336位所示；
进一步，所述抗4-1BB抗体由重链和轻链组成，所述重链的编码序列为序列表中序列1，所述轻链的编码序列为序列表中序列2。
8.成套试剂，为下述C1或C2：
C1、成套试剂，由权利要求1-4中任一所述抗4-1BB抗体与抗CD3抗体组成；
C2、成套试剂，由权利要求5-7中任一所述生物材料与所述抗CD3抗体组成。
9.权利要求1-4中任一所述抗4-1BB抗体，或权利要求5-7中任一所述生物材料，或权利要求8所述成套试剂的下述任一应用：
A1、在制备促进T淋巴细胞IFN-γ分泌产品中的应用；
A2、在促进T淋巴细胞IFN-γ分泌中的应用；
A3、在制备促进T淋巴细胞活化和/或增殖产品中的应用；
A4、在促进T淋巴细胞活化和/或增殖中的应用；
A5、在制备抑制Th1或Th17细胞的凋亡产品中的应用；
A6、在抑制Th1或Th17细胞的凋亡中的应用；
A7、在制备治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病产品中的应用；
A8、在治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病中的应用；
A9、在制备治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病产品中的应用；
A10、在治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病中的应用；
A11、在制备治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应产品中的应用；
A12、在治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应中的应用；
A13、在制备治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病产品中的应用；
A14、在治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病中的应用；
A15、在制备治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病产品中的应用；
A16、在治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病中的应用；
A17、在制备治疗和/或预防和/或诊断肿瘤产品中的应用；
A18、在治疗和/或预防和/或诊断肿瘤中的应用；
A19、在制备阻断4-1BB/4-1BBL信号通路产品中的应用；
A20、在阻断4-1BB/4-1BBL信号通路中的应用；
A21、在制备检测4-1BB产品中的应用；；
A22、在检测4-1BB中的应用。
10.具有如下M1-M9中任一功能的产品，含有权利要求1-4中任一所述抗4-1BB抗体，或权利要求5-7中任一所述生物材料，或权利要求8所述成套试剂；
M1、促进T淋巴细胞IFN-γ分泌；
M2、促进T淋巴细胞活化和/或增殖；
M3、抑制Th1或Th17细胞的凋亡；
M4、治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病；
M5、治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病；
M6、治疗和/或预防和/或诊断移植排斥反应；
M7、治疗和/或预防和/或诊断超敏反应疾病；
M8、治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病；
M9、治疗和/或预防和/或诊断肿瘤；
M10、阻断4-1BB/4-1BBL信号通路；
M11、检测4-1BB。
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