CN112739718A - 抗tnfrsf9抗体及其用途 - Google Patents

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董春艳
杨放
陆程远
沈月雷
倪健
郭雅南
陈云云
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Abstract

本公开提供了一种抗TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)抗体、抗原结合片段、及其用途。

Description

抗TNFRSF9抗体及其用途
优先权要求
本申请要求于2018年9月12日提交的PCT申请号PCT/CN 2018/105162的权益。前述全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及抗TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)抗体、抗原结合片段、及其用途。
背景技术
癌症是目前造成人类死亡率最高的疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据，2012年全球癌症发病和死亡病例分别达到1400万和820万。在中国，新诊断的癌症病例为307万，并且死亡人数为220万。
抗癌抗体的最新临床和商业成功引起了对基于抗体的疗法的极大兴趣。需要开发在各种基于抗体的疗法中使用的抗癌抗体以治疗癌症。
发明内容
本公开涉及抗TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9；也称为“4-1BB”或“CD137”)抗体、其抗原结合片段、及其用途。
在一个方面，本公开涉及结合4-1BB(TNF受体超家族成员9)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列；以及包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH CDR 1、2和3氨基酸序列和所述选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、2、3所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、5、6所示；
(2)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、8、9所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、11、12所示；
(3)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、14、15所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、17、18所示；
(4)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、20、21所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、23、24所示；
(5)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、26、27所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、29、30所示；
(6)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:31、32、33所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34、35、36所示；
(7)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:37、38、39所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40、41、42所示；
(8)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:43、44、45所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:46、47、48所示；
(9)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:49、50、51所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:52、53、54所示；
(10)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:55、56、57所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:58、59、60所示；
(11)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:61、62、63所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:64、65、66所示；
(12)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:67、68、69所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:70、71、72所示；
(13)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:73、74、75所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:76、77、78所示；
(14)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:79、80、81所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:82、83、84所示；
(15)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:85、86、87所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:88、89、90所示；
(16)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:91、92、93所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:94、95、96所示；
(17)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:97、98、99所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:100、101、102所示；
(18)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:103、104、105所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:106、107、108所示。
在一些实施方案中，所述VH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，所述VH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，所述VH包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR1、2、3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人4-1BB。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
在一个方面，本公开还涉及一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:225、226、227、228或244所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:221、222、223、224或243所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:232，233、234、235或246所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:229、230、231或245所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:239、240、241、242或248所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:236、237、238或247所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(7)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:19、20、21所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(8)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:22、23、24所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:249所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(9)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:25、26、27所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:252所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(10)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:28、29、30所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:251所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(11)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:31、32、33所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:254所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(12)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:34、35、36所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:253所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(13)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:37、38、39所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:256所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(14)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:40、41、42所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:255所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(15)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:43、44、45所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:258所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(16)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:46、47、48所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:257所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(17)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:49、50、51所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(18)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:52、53、54所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:259所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(19)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:55、56、57所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:262所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(20)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:58、59、60所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:261所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(21)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:61、62、63所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:264所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(22)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:64、65、66所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:263所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(23)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:67、68、69所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:266所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(24)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:70、71、72所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:265所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(25)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:73、74、75所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:268所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(26)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:76、77、78所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:267所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(27)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:79、80、81所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:270所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(28)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:82、83、84所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:269所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(29)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:85、86、87所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:272所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(30)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:88、89、90所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:271所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(31)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:91、92、93所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:274所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(32)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:94、95、96所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:273所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(33)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:97、98、99所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:276所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(34)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:100、101、102所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:275所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(35)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:103、104、105所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:278所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(36)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:106、107、108所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:277所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述VH在与VL配对时特异性结合人4-1BB，或所述VL在与VH配对时特异性结合人4-1BB。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。
在一些实施方案中，所述核酸编码单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述核酸是cDNA。
在一个方面，本公开涉及一种载体，所述载体包含如本文所述的核酸中的一种或多种。在一个方面，本公开还涉及一种载体，所述载体包含如本文所述的核酸中的两种。在一些实施方案中，所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
在一个方面，本公开涉及一种载体对，其中每个载体包含如本文所述的核酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
在一个方面，本公开涉及一种细胞，所述细胞包含如本文所述的载体或载体对。在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
在一个方面，本公开涉及一种细胞，所述细胞包含如本文所述的核酸中的一种或多种。在一个方面，本公开涉及一种细胞，所述细胞包含如本文所述的核酸中的两种。在一些实施方案中，所述两种核酸共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
在一个方面，本公开涉及一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
(a)在足以使如本文所述的细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的抗体或抗原结合片段。
在一个方面，本公开涉及一种结合4-1BB的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选定的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区(VL)包含与选定的VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列是以下之一：
(1)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:221、222、223、224或243，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:225、226、227、228或244；
(2)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:229、230、231或245，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:232、233、234、235或246；
(3)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:236、237、238或247，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:239、240、241、242或248；
(4)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:249，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:250；
(5)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:251，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:252；
(6)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:253，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:254；
(7)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:255，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:256；
(8)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:257，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:258；
(9)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:259，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:260；
(10)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:261，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:262；
(11)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:263，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:264；
(12)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:265，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:266；
(13)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:267，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:268；
(14)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:269，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:270；
(15)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:271，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:272；
(16)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:273，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:274；
(17)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:275，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:276；
(18)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:277，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:278。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人4-1BB。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
在一个方面，本公开涉及一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的、如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
在一个方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，所述受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、口咽癌、卵巢癌、B细胞淋巴瘤、或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、或多发性骨髓瘤。
在一个方面，本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一个方面，本公开涉及一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、以及可药用载体。
在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的抗体药物缀合物、以及可药用载体。
在一些实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG1抗体。
在一个方面，本公开涉及结合4-1BB的IgG1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列；以及包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH CDR1、2和3氨基酸序列和所述选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列选自如表3所示的抗体中的一种。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG1抗体。
在一个方面，本公开涉及结合4-1BB的IgG1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选定的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区(VL)包含与选定的VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列选自如表3所示的抗体中的一种。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG1抗体。
在一个方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗4-1BB IgG1抗体或其抗原结合片段、以及治疗有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是抗PD-1IgG4抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。
在一个方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗4-1BB IgG1抗体或其抗原结合片段、以及治疗有效剂量的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗CTLA4抗体是抗CTLA IgG1抗体或抗CTLA IgG2抗体。在一些实施方案中，所述抗CTLA4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。
如本文所用术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。此类细胞的实施例包括具有以迅速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。所述术语旨在包括癌性生长，例如，肿瘤；致癌过程，转移性组织以及恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理类型或浸润程度如何。还包括各种器官系统的恶性病，例如呼吸系统、心血管系统、肾脏系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝脏系统、胃肠系统和内分泌系统的恶性病；以及腺癌，其包括恶性病，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺部非小细胞癌和小肠癌。“天然产生的”癌症包括除了通过将癌细胞植入受试者而实验性诱导的癌症之外的任何癌症，并且包括例如自发产生的癌症、由患者暴露于一种或多种致癌物引起的癌症、由插入转基因致癌基因或敲除肿瘤抑制基因引起的癌症、以及由感染(例如病毒感染)引起的癌症。术语“癌”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性病。所述术语还包括癌肉瘤，癌肉瘤包括由癌性组织和肉瘤组织组成的恶性病。“腺癌”是指源自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性病。术语“造血性肿瘤疾病(hematopoietic neoplastic disorder)”包括涉及造血起源的增生性细胞/肿瘤细胞的疾病。造血性肿瘤疾病可由骨髓、淋巴或红系谱系或其前体细胞引起。
如本文所用术语“抗体”是指含有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一个)并且能够特异性结合表位的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实施例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可以含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如双特异性抗体、单链抗体、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的所述部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域或轻链的可变结构域)。抗体片段的非限制性实施例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
如本文所用术语“人抗体”是指由人体内存在的内源性核酸(例如，重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，人抗体从人收集或在人细胞培养物(例如，人杂交瘤细胞)中产生。在一些实施方案中，人抗体在非人细胞(例如，小鼠或仓鼠细胞系)中产生。在一些实施方案中，人抗体在细菌或酵母细胞中产生。在一些实施方案中，人抗体在含有未重排或重排的人免疫球蛋白基因座(例如，重链或轻链人免疫球蛋白基因座)的转基因非人动物(例如牛科动物)中产生。
如本文所用术语“嵌合抗体”是指含有在至少两种不同抗体(例如，来自两种不同哺乳动物物种的抗体，例如人抗体和小鼠抗体)中存在的序列的抗体。嵌合抗体的非限制性实施例是含有非人(例如小鼠)抗体的可变结构域序列(例如，轻链和/或重链可变结构域序列的全部或部分)和人抗体的恒定结构域的抗体。嵌合抗体的另外的实施例描述于本文中并且是本领域已知的。
如本文所用术语“人源化抗体”是指含有源自非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的最小序列并且含有源自人免疫球蛋白的序列的非人抗体。在非限制性实施例中，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中所述受体抗体的高变区(例如CDR)残基被来自具有期望特异性、亲和力、以及能力的例如小鼠、大鼠或兔抗体的非人抗体(例如供体抗体)的高变区(例如，CDR)残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人(例如小鼠)免疫球蛋白残基替代。在一些实施方案中，人源化抗体可以含有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰可以进一步改善抗体性能。在一些实施方案中，人源化抗体含有至少一个、并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环(CDR)对应于非人(例如小鼠)免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白的框架区。人源化抗体还可以含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区。可以使用本领域已知的分子生物学方法产生人源化抗体。本文描述了用于产生人源化抗体的方法的非限制性实施例。
如本文所用术语“单链抗体”是指含有能够特异性结合抗原的至少两个免疫球蛋白可变结构域(例如，哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域)的单个多肽。本文描述了单链抗体的非限制性实施例。
如本文所用术语“多聚体抗体”是指含有四个或更多个(例如六个、八个或十个)免疫球蛋白可变结构域的抗体。在一些实施方案中，多聚体抗体能够使一个靶分子(例如4-1BB)与哺乳动物细胞(例如人T细胞、人肿瘤细胞)表面上的至少一个第二靶分子(例如HER2)交联。
如本文所用术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述了根据本发明的方法对其提供治疗的人或非人动物。本发明涵盖了兽医和非兽医应用。人患者可以是成年人或未成年人(例如，18岁以下的人)。除人外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括例如非人灵长类动物(例如猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔形目动物、猪(例如小猪、微型猪(miniature pig))、马、犬、猫科动物、牛科动物及其他家养动物、农场动物和动物园动物。
如本文所用，当提及抗体时，短语“与……特异性结合”和“特异性结合……”是指抗体与其靶分子(例如，4-1BB)相互作用，优选与其他分子相互作用，因为所述相互作用取决于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，试剂通常识别并结合包括特定结构的分子，而不是所有分子。可以将特异性结合靶分子的抗体称为靶标特异性抗体。例如，可以将特异性结合4-1BB分子的抗体称为4-1BB特异性抗体或抗4-1BB抗体。
如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指具有至少两个氨基酸的任何长度的氨基酸聚合物。
如本文所用术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用，是指具有至少两个核苷酸的任何长度的核苷酸聚合物，并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂合体及其修饰。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法及材料；还可使用本领域已知的其他合适方法及材料。所述材料、方法及实施例仅为说明性而不旨在限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目及其他参考文献均通过引用以其全文并入本文。在出现冲突情况下，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下具体实施方式以及附图和权利要求，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1是显示制备抗h4-1BB抗体的示例性方案的第一部分的流程图。
图2是显示制备抗h4-1BB抗体的示例性方案的第二部分的流程图。
图3是一组显示抗h4-1BB抗体与人4-1BB的结合活性的流式细胞术结果。
图4是一组显示分析抗h4-1BB抗体与猴4-1BB(CHO-r4-1BB)、小鼠4-1BB(CHO-m4-1BB)和人-鼠嵌合4-1BB(CHO-c4-1BB)的交叉反应性的流式细胞术结果的图。NC代表阴性对照。
图5是显示使用嵌合抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG4和人4-1BB的表面等离子体共振(SPR)结果的图。
图6是显示使用嵌合抗h4-1BB抗体29-6A5-mHvKv-IgG2和人4-1BB的表面等离子体共振(SPR)结果的图。
图7是显示用小鼠抗h4-1BB抗体1C4和5F9以及乌瑞鲁单抗(urelumab)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图8是显示用小鼠抗h4-1BB抗体1C4和5F9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图9是显示用小鼠抗h4-1BB抗体1C4和5F9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图10是显示用小鼠抗h4-1BB抗体29-6A5、29-4A10、29-5F10、45-8F1、45-4B9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图11是显示用小鼠抗h4-1BB抗体29-6A5、29-4A10、29-5F10、45-8F1、45-4B9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图12是显示用小鼠抗h4-1BB抗体29-6A5、29-4A10、29-5F10、45-8F1、45-4B9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图13是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、和45-2C11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图14是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、和45-2C11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图15是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、和45-2C11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图16是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4、55-8F6、和54-8B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图17是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4、55-8F6、和54-8B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图18是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4、55-8F6、和54-8B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图19是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体54-1A11、55-1E3、55-8H5、和56-2A6治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图20是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体54-1A11、55-1E3、55-8H5、和56-2A6治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图21是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体54-1A11、55-1E3、55-8H5、和56-2A6治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图22是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体58-4B8、69-3C2、和69-4B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图23是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体58-4B8、69-3C2、和69-4B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图24是显示用乌瑞鲁单抗以及小鼠抗h4-1BB抗体58-4B8、69-3C2、和69-4B11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图25是显示用抗h4-1BB抗体30-5F9-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1、30-5F9、16-1C4，乌托鲁单抗(utomilumab)以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图26是显示用抗h4-1BB抗体30-5F9-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1、30-5F9、16-1C4，乌托鲁单抗以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图27是显示用抗h4-1BB抗体30-5F9-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1、30-5F9、16-1C4，乌托鲁单抗以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图28是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2、45-2B3-mHvKv-IgG2、45-7E9-mHvKv-IgG2、45-7G9-mHvKv-IgG2、45-8E2-mHvKv-IgG2、45-8F1-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图29是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2、45-2B3-mHvKv-IgG2、45-7E9-mHvKv-IgG2、45-7G9-mHvKv-IgG2、45-8E2-mHvKv-IgG2、45-8F1-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图30是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2、45-2B3-mHvKv-IgG2、45-7E9-mHvKv-IgG2、45-7G9-mHvKv-IgG2、45-8E2-mHvKv-IgG2、45-8F1-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图31是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、6A5-H2K2-IgG2、6A5以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图32是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、6A5-H2K2-IgG2、6A5以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图33是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、6A5-H2K2-IgG2、6A5以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图34是显示用抗h4-1BB抗体1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG4、5F9-H1K1-IgG4、5F9-H1K2-IgG4、16-1C4、30-5F9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图35是显示用抗h4-1BB抗体1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG4、5F9-H1K1-IgG4、5F9-H1K2-IgG4、16-1C4、30-5F9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图36是显示用抗h4-1BB抗体1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG4、5F9-H1K1-IgG4、-5F9-H1K2-IgG4、16-1C4、30-5F9以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图37是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1(G2)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G3)、16-1C4-mHvKv-IgG4(G4)、16-1C4(G5)以及乌瑞鲁单抗(G6)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图38是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1(G2)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G3)、16-1C4-mHvKv-IgG4(G4)、16-1C4(G5)以及乌瑞鲁单抗(G6)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图39是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1(G2)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G3)、16-1C4-mHvKv-IgG4(G4)、16-1C4(G5)以及乌瑞鲁单抗(G6)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图40是显示用抗h4-1BB抗体54-8B11-mHvKv-IgG2(G2)、55-8F6-mHvKv-IgG2(G3)、56-2A6-mHvKv-IgG2(G4)、69-3C2-mHvKv-IgG2(G5)、61-6A7-mHvKv-IgG2(G6)、70-6F10-mHvKv-IgG2(G7)、70-3F9-mHvKv-IgG2(G8)、45-4B9-mHvkv-IgG2(G9)以及还有乌瑞鲁单抗(G10)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图41是显示用抗h4-1BB抗体54-8B11-mHvKv-IgG2(G2)、55-8F6-mHvKv-IgG2(G3)、56-2A6-mHvKv-IgG2(G4)、69-3C2-mHvKv-IgG2(G5)、61-6A7-mHvKv-IgG2(G6)、70-6F10-mHvKv-IgG2(G7)、70-3F9-mHvKv-IgG2(G8)、45-4B9-mHvkv-IgG2(G9)以及还有乌瑞鲁单抗(G10)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图42是显示用抗h4-1BB抗体54-8B11-mHvKv-IgG2(G2)、55-8F6-mHvKv-IgG2(G3)、56-2A6-mHvKv-IgG2(G4)、69-3C2-mHvKv-IgG2(G5)、61-6A7-mHvKv-IgG2(G6)、70-6F10-mHvKv-IgG2(G7)、70-3F9-mHvKv-IgG2(G8)、45-4B9-mHvkv-IgG2(G9)以及还有乌瑞鲁单抗(G10)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图43是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、1C4-H1K1-IgG2、1C4-H1K2-IgG2、5F9-H1K1-IgG2、5F9-H1K2-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图44是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、1C4-H1K1-IgG2、1C4-H1K2-IgG2、5F9-H1K1-IgG2、5F9-H1K2-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图45是显示用抗h4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、1C4-H1K1-IgG2、1C4-H1K2-IgG2、5F9-H1K1-IgG2、5F9-H1K2-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图46是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG2、乌瑞鲁单抗-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1-N297A、乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-SI以及乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图47是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG2、乌瑞鲁单抗-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1-N297A、乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-SI以及乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图48是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG2、乌瑞鲁单抗-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1-N297A、乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-SI以及乌瑞鲁单抗-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图49是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-SI、16-1C4以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图50是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-SI、16-1C4以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图51是显示用抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11、16-1C4-mHvKv-IgG1-FC-SI、16-1C4以及乌瑞鲁单抗治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图52列出了如由Kabat编号定义的几种抗h4-1BB抗体的CDR序列以及其人源化抗h4-1BB抗体的CDR序列。
图53列出了如由Chothia编号定义的几种抗h4-1BB抗体的CDR序列以及其人源化抗h4-1BB抗体的CDR序列。
图54列出了人4-1BB(“h4-1BB”)、小鼠4-1BB(“m4-1BB”)、猴4-1BB(“rm4-1BB”或“r4-1BB”)和嵌合4-1BB(“chi4-1BB”或“c4-1BB”)的氨基酸序列。
图55列出了基于1C4的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图56列出了基于6A5的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图57列出了基于5F9的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图58列出了几种小鼠抗h4-1BB抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图59是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-mIgG1(G2)、乌瑞鲁单抗-mIgG2A(G3)、16-1C4-mHvKv-mIgG1(G4)、16-1C4-mHvKv-mIgG2A(G5)、乌瑞鲁单抗(G6)、乌瑞鲁单抗-IgG1(G7)、16-1C4-mHvKv-IgG1(G8)和16-1C4-mHvKv-IgG4(G9)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图60是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-mIgG1(G2)、乌瑞鲁单抗-mIgG2A(G3)、16-1C4-mHvKv-mIgG1(G4)、16-1C4-mHvKv-mIgG2A(G5)、乌瑞鲁单抗(G6)、乌瑞鲁单抗-IgG1(G7)、16-1C4-mHvKv-IgG1(G8)和16-1C4-mHvKv-IgG4(G9)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图61是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗-mIgG1(G2)、乌瑞鲁单抗-mIgG2A(G3)、16-1C4-mHvKv-mIgG1(G4)、16-1C4-mHvKv-mIgG2A(G5)、乌瑞鲁单抗(G6)、乌瑞鲁单抗-IgG1(G7)、16-1C4-mHvKv-IgG1(G8)和16-1C4-mHvKv-IgG4(G9)治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图62是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗、乌瑞鲁单抗-IgG1、1C4-mHvKv-IgG1、1C4-mHvKv-IgG4、1C4-H1K1-IgG1、1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG1、1C4-H1K2-IgG4、6A5-H1K2-IgG1、5F9-H1K1-IgG1和1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图63是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗、乌瑞鲁单抗-IgG1、1C4-mHvKv-IgG1、1C4-mHvKv-IgG4、1C4-H1K1-IgG1、1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG1、1C4-H1K2-IgG4、6A5-H1K2-IgG1、5F9-H1K1-IgG1和1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图64是显示用抗h4-1BB抗体乌瑞鲁单抗、乌瑞鲁单抗-IgG1、1C4-mHvKv-IgG1、1C4-mHvKv-IgG4、1C4-H1K1-IgG1、1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG1、1C4-H1K2-IgG4、6A5-H1K2-IgG1、5F9-H1K1-IgG1和1C4-mHvKv-IgG1-FC-V11治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图65是显示用抗h4-1BB抗体1C4-IgG1-H1K1、1C4-IgG4-H1K1、乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG4、可瑞达(Keytruda)-IgG4、1C4-IgG1-H1K1+可瑞达-IgG4、1C4-IgG4-H1K1+可瑞达-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1+可瑞达-IgG4和乌瑞鲁单抗-IgG4+可瑞达-IgG4治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图66是显示用抗h4-1BB抗体1C4-IgG1-H1K1、1C4-IgG4-H1K1、乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG4、可瑞达-IgG4、1C4-IgG1-H1K1+可瑞达-IgG4、1C4-IgG4-H1K1+可瑞达-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1+可瑞达-IgG4和乌瑞鲁单抗-IgG4+可瑞达-IgG4治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图67是显示用抗h4-1BB抗体1C4-IgG1-H1K1、1C4-IgG4-H1K1、乌瑞鲁单抗-IgG1、乌瑞鲁单抗-IgG4、可瑞达-IgG4、1C4-IgG1-H1K1+可瑞达-IgG4、1C4-IgG4-H1K1+可瑞达-IgG4、乌瑞鲁单抗-IgG1+可瑞达-IgG4和乌瑞鲁单抗-IgG4+可瑞达-IgG4治疗的具有MC-38肿瘤细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图68是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有B16-F10癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图69是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有B16-F10癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图70是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有B16-F10癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图71是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有EL4癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重随时间变化的图。
图72是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有EL4癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)体重百分比随时间变化的图。
图73是显示用不同的抗h4-1BB抗体治疗的具有EL4癌细胞的人源化4-1BB小鼠(B-h4-1BB)肿瘤体积随时间变化的图。
图74-75是显示用于分析脾脏样品的两种荧光激活细胞分选(FACS)程序的示意图。
图76-77是显示用于分析肿瘤样品的两种FACS程序的示意图。
图78A是显示肿瘤细胞中CD45+细胞的百分比的图。
图78B是显示肿瘤细胞中CD45+细胞的计数的图。
图78C是显示肿瘤细胞中CD11b+细胞的百分比的图。
图78D是显示肿瘤样品中CD45+细胞中NK细胞的百分比的图。
图79A是显示肿瘤样品中CD45+细胞中CD3+细胞的百分比的图。
图79B是显示肿瘤样品中CD3+细胞中CD8+细胞的百分比的图。
图79C是显示肿瘤样品中CD3+细胞中CD4+FoxP3-细胞的百分比的图。
图79D是显示肿瘤样品中CD3+细胞中Treg细胞的百分比的图。
图80A是显示肿瘤样品中NK细胞中hCD137+细胞的百分比的图。
图80B是显示肿瘤样品中CD3+细胞中hCD137+细胞的百分比的图。
图80C是显示肿瘤样品中CD8+细胞中hCD137+细胞的百分比的图。
图80D是显示肿瘤样品中CD4+FoxP3-细胞中hCD137+细胞的百分比的图。
图80E是显示肿瘤样品中Treg细胞中hCD137+细胞的百分比的图。
图81A是显示肿瘤样品中NK细胞中hCD137+细胞的计数的图。
图81B是显示肿瘤样品中CD3+细胞中hCD137+细胞的计数的图。
图81C是显示肿瘤样品中CD8+细胞中hCD137+细胞的计数的图。
图81D是显示肿瘤样品中CD4+FoxP3-细胞中hCD137+细胞的计数的图。
图81E是显示肿瘤样品中Treg细胞中hCD137+细胞的计数的图。
图82A是显示肿瘤样品中CD3+细胞中CD8+/Treg细胞的百分比的图。
图82B是显示肿瘤样品中CD8+细胞中Ki67+细胞的百分比的图。
图82C是显示肿瘤样品中CD4+FoxP3-细胞中Ki67+细胞的百分比的图。
图82D是显示肿瘤样品中Treg细胞中Ki67+细胞的百分比的图。
图83A是显示肿瘤样品中CD8+细胞中Eomes+细胞的计数的图。
图83B是显示肿瘤样品中CD4+FoxP3+细胞中Eomes+细胞的计数的图。
图83C是显示肿瘤样品中CD8+细胞中T-bet+细胞的计数的图。
图83D是显示肿瘤样品中CD4+FoxP3-细胞中T-bet+细胞的计数的图。
具体实施方式
本公开提供了结合TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9；也称为“4-1BB”或“CD137”)的抗体、其抗原结合片段的实施例。
4-1BB和癌症
免疫系统可以区分体内的正常细胞和被视为“外来”的那些细胞，从而使免疫系统攻击外来细胞，而使正常细胞不受影响。这种机制有时涉及被称为免疫检查点的蛋白。免疫检查点是免疫系统中的分子，其可以调高信号(共刺激分子)或调低信号。
检查点抑制因子可以防止免疫系统攻击正常组织，从而预防自身免疫性疾病。许多肿瘤细胞也表达检查点抑制因子。这些肿瘤细胞通过选择某些免疫检查点途径来逃避免疫监视，特别是在对肿瘤抗原具有特异性的T细胞中(Creelan,Benjamin C.“Update onimmune checkpoint inhibitors in lung cancer.”Cancer Control 21.1(2014):80-89)。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们能够容易地被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
4-1BB(“TNFRSF9”或“CD137”)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。它具有三个N-糖基化位点和一个潜在O-糖基化位点。它是一种I型跨膜蛋白，并且主要表达于T细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞(DC)细胞的表面。人CD137基因位于1P36区(染色体1)，NCBI基因ID为3604，并且编码255个氨基酸。人CD137蛋白分子具有两种形式：膜结合形式和可溶性形式，分别由2.8kb和1.4kb mRNA编码。所述可溶性形式不具有跨膜结构域。CD137的配体是CD137L(4-1BBL)。CD137L属于TNF超家族，并且表达于抗原呈递细胞的表面，所述抗原呈递细胞包括例如树突状细胞、B细胞和巨噬细胞。通过CD137与其受体CD137L的相互作用产生的协同刺激信号诱导T细胞和NK细胞的活化和增殖以及细胞因子的产生。
小鼠CD137基因位于4E2区(染色体4)，NCBI基因ID为21942。人CD137蛋白与小鼠CD137蛋白具有约58％同一性。人CD137的胞质尾区与小鼠CD137有显著差异。特别地，在人CD137的220位和小鼠CD137的254位发现了CD137的胞质结构域中的单个酪氨酸残基。人CD137在推定的Lck结合位点也与小鼠CD137不同，其中小鼠CD137表达CXCP Lck结合基序，而在人CD137中此序列改变为CXFP。人CD137和小鼠CD137在共同的两个位点与TNFR相关因子2结合，所述TNFR相关因子2是介导下游信号传导事件所必要的衔接蛋白，所述下游信号传导事件导致响应于CD137L信号传导的细胞因子(例如IL-2)产生。
CD137及其配体在肿瘤组织中的异常表达表明CD137及其配体在肿瘤发生期间可能具有共刺激信号破坏或失活。特别地，肿瘤血管壁中的CD137表达与肿瘤恶性病有关，并且证据显示抗CD137激动剂抗体可以作用于肿瘤内皮细胞以增强活化的T淋巴细胞的募集，这表明了有另外的作用机制可以解释CD137激动剂抗体的免疫治疗效果。
大量研究已经显示CD137是抗肿瘤生物疗法的潜在靶标之一。抗CD137抗体可以通过诱导T细胞和NK细胞的活化和增殖、增加细胞因子的产生、上调免疫应答、和/或向肿瘤募集活化的T淋巴细胞来杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤生长。迄今为止，已在临床试验中针对治疗黑色素瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和一些晚期实体瘤，对CD137途径的两种抗体(Bristol-Myers Squibb的乌瑞鲁单抗(BMS-663513)和Pfizer的乌托鲁单抗(PF-05082566))进行了测试。一些临床试验已经取得了有希望的初步临床结果。例如，与PD-1抑制剂类似，PF-05082566可以减少40％的滤泡性淋巴瘤(FL)且副作用最小；PF-05082566已与包括例如抗PD-1抗体或抗OX40抗体的其他药物组合使用。初步实验证据还显示癌症靶向药物可以增加NK细胞表面CD137的表达。因此，如果将抗CD137抗体与癌症靶向药物组合施用，其可以增强NK细胞的杀伤效果并改善治疗效果。
CD137及其功能的详细描述可见于：例如Wen等人,“4-1BB ligand-mediatedcostimulation of human T cells induces CD4 and CD8 T cell expansion,cytokineproduction,and the development of cytolytic effector function,”The Journal ofImmunology 168.10(2002):4897-4906；Broll等人,“CD137 expression in tumor vesselwalls:high correlation with malignant tumors,”American journal of clinicalpathology115.4(2001):543-549；和Palazón等人,“Agonist anti-CD137 mAb act ontumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes,”Cancer research 71.3(2011):801-811；Kang等人,“Anti-CD137 suppresses tumorgrowth by blocking reverse signaling by CD137 ligand.”Cancer research(2017):canres-0610；将其各自通过引用以其全文并入。
本公开提供了抗4-1BB抗体、其抗原结合片段、以及使用这些抗4-1BB抗体和抗原结合片段来抑制肿瘤生长和治疗癌症的方法。
抗体和抗原结合片段
本公开提供了抗4-1BB抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段包含本文所述的互补决定区(CDR)、重链可变区、轻链可变区、重链、或轻链。
通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由轻链和重链两类多肽链组成。本公开的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四种免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型或亚类，所述同种型包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD，所述亚类包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可以包含轻链的两个相同拷贝和重链的两个相同拷贝。各自含有一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链在其恒定结构域内经由二硫键彼此结合，以形成抗体的“柄”。各自含有一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链分别经由二硫键结合一条重链。每条轻链的可变区和与其结合的重链的可变区配对。轻链和重链的可变区都包含夹在更保守的框架区(FR)之间的三个高变区。
这些高变区(称为互补决定区(CDR))形成了包含抗体主要抗原结合表面的环。四个框架区主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构的环，并且所述环在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区紧密靠近，并且与来自另一个链的CDR一起形成了抗原结合区。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定所述抗体的CDR区的方法是熟知的，并且CDR的许多定义是常用的。Kabat定义是基于序列可变性，而Chothia定义是基于结构环区域的位置。CDR的最新定义是IMGT定义。IMGT定义基于IMGT数据库，所述数据库管理免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TcR)和主要组织相容性复合体(MHC)分子的核苷酸序列信息。它基于比对超过5000个IG和TcR可变区序列，考虑并结合了FR和CDR的Kabat定义、结构数据和高变环的Chothia表征，为IG和TcR序列提出了统一的编号系统。IMGT编号方案不区分各种免疫球蛋白(即IG或TcR)、链类型(即重链或轻链)或物种。这些鉴定CDR区的方法和各种定义描述于：例如Martin,“Protein sequence and structure analysis of antibody variabledomains,”Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan等人“Analysis and improvements to Kabat and structurally correctnumbering of antibody variable domains,”Molecular immunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人,MethodsEnzymol.203:121-53(1991)；Morea等人,Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月)；Morea等人,J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月)；Chothia等人,Nature 342(6252):877-83(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne,BMC Structural Biology 7:64(2007)；Lefranc,等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains.”Developmental&ComparativeImmunology 27.1(2003):55-77；Kunik,等人,“Structural consensus among antibodiesdefines the antigen binding site.”PLoS computational biology 8.2(2012):e1002388；将其各自通过引用以其全文并入本文。
CDR对于识别抗原表位很重要。如本文所用，“表位”是能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可能为约三、四、五、六或七个氨基酸，但这些氨基酸不是必须位于抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可能取决于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构型。
在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，不同之处在于其恒定区，尤其是其铰链和CH2上部结构域。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且描述于：例如Vidarsson等人,“IgG subclasses and allotypes:from structure toeffector functions.”Frontiers in immunology 5(2014)；Irani等人“Molecularproperties of human IgG subclasses and their implications for designingtherapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.”Molecularimmunology67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk编辑The human IgG subclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.Elsevier,2016；将其各自通过引用以其全文并入本文。
抗体还可以是源自任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、大鼠、骆驼科动物)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、以及包括与另一个多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特异性结合活性的抗体部分，即抗体能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的任何部分，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2和这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体、以及包括作为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实施例包括例如完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体的重链或轻链的单独CDR。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是如本文所述的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜结构域和内结构域融合的融合物。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以提高效力。因此，在一个方面，本公开进一步提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，scFV具有一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV具有两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV具有两个抗原结合区，并且所述两个抗原结合去可以结合各自的靶抗原。
抗4-1BB抗体和抗原结合片段
本公开提供了特异性结合4-1BB的抗体及其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合4-1BB，并且可以促进4-1BB信号传导途径，从而增加免疫应答。
本公开提供了几种抗4-1BB抗体，例如16-1C4(“1C4”)、29-6A5(“6A5”)、30-5F9(“5F9”)、45-2B3(“2B3”)、45-4B9(“4B9”)、45-7E9(“7E9”)、45-7G9(“7G9”)、45-8E11(“8E11”)、45-8E2(“8E2”)、45-8F1(“8F1”)、54-8B11(“8B11”)、55-8F6(“8F6”)、56-2A6(“2A6”)、59-5E4(“5E4”)、61-6A7(“6A7”)、69-3C2(“3C2”)、70-3F9(“3F9”)、和70-6F10(“6F10”)，包括例如小鼠抗体、其嵌合抗体、及其人源化抗体。一些公开的抗体的CDR序列(Kabat定义)和重链可变区和轻链可变区的序列在下表中所示。CDR序列(Chothia定义)在图53中提供。
表1
Figure BDA0002971534390000311
Figure BDA0002971534390000321
例如，如由上表、图52和图53所示，如由Kabat编号定义的，1C4和1C4衍生的抗体(例如，嵌合抗体或人源化抗体)的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:1-3，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4-6。CDR也可以由Chothia系统定义。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列由SEQ ID NO:109-111所示，并且轻链可变结构域的CDR序列由SEQ ID NO:112-114所示。
类似地，如由Kabat编号定义的，6A5和6A5衍生的抗体的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:7-9，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:10-12。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列由SEQ ID NO:115-117所示，并且轻链可变结构域的CDR由SEQ ID NO:118-120所示。
如由Kabat编号定义的，5F9和5F9衍生的抗体的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:13-15，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:16-18。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列由SEQ ID NO:121-123所示，并且轻链可变结构域的CDR由SEQ IDNO:124-126所示。
类似地，2B3、4B9、7E9、7G9、8E11、8E2、8F1、8B11、8F6、2A6、5E4、6A7、3C2、3F9、6F10、和源自这些抗体的抗体的CDR序列(Kabat)以及VH和VL序列在表1中提供。2B3、4B9、7E9、7G9、8E11、8E2、8F1、8B11、8F6、2A6、5E4、6A7、3C2、3F9、6F10、和源自这些抗体的抗体的CDR序列(Chothia)可见于图53。
还提供了人源化抗体的重链可变区和轻可变区的氨基酸序列。由于存在使小鼠抗体人源化的不同方式(例如，可以用不同的氨基酸取代来修饰序列)，抗体的重链和轻链可以具有一个以上形式的人源化序列。人源化1C4抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ IDNO:221-224所示。人源化1C4抗体的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:225-228所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:221-224)中的任一种均可与这些轻链可变区序列(SEQID NO:225-228)中的任一种进行配对。
类似地，人源化6A5抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:229-231所示。人源化6A5抗体的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:232-235所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:229-231)中的任一种均可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:232-235)中的任一种进行配对。
人源化5F9抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:236-238所示。人源化6A5抗体的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:239-242所示。这些重链可变区序列(SEQID NO:236-238)中的任一种均可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:239-242)中的任一种进行配对。
如图55-57中所示，人源化百分比是指重链或轻链可变区序列与国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库中的人抗体序列相比的同一性百分比。最高命中(top hit)是指相对于其他物种，重链或轻链可变区序列更接近特定物种。例如，与人的最高命中是指序列相比于其他物种更接近人。与人和食蟹猴(Macaca fascicular)的最高命中是指序列与人序列和食蟹猴序列具有相同的百分比同一性，并且与其他物种的序列相比，这些百分比同一性最高。在一些实施方案中，人源化百分比大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％。关于如何确定人源化百分比和如何确定最高命中的详细描述在本领域中是已知的，并且描述于：例如Jones,Tim D.等人“The INNs and outs ofantibody nonproprietary names.”MAbs.Vol.8.No.1.Taylor&Francis,2016，其通过引用以其全文并入本文。高人源化百分比通常具有多种优势，例如在人中更安全且更有效、人受试者更容易耐受、和/或更不容易产生副作用。
本公开还提供了嵌合抗体。这些嵌合抗体具有来自小鼠抗体的VH和VL。然而，这些嵌合抗体的恒定结构域来自人抗体(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4)。这些嵌合抗体被标记为mHvKv-IgG。
本公开描述的一些嵌合抗体和人源化抗体在下表中所示。
表2
Figure BDA0002971534390000341
Figure BDA0002971534390000351
此外，在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可以含有选自下组的一个、两个或三个重链可变区CDR：SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:19-21、SEQ ID NO:25-27、SEQ ID NO:31-33、SEQ ID NO:37-39、SEQ ID NO:43-45、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:55-57、SEQ ID NO:61-63、SEQ ID NO:67-69、SEQ ID NO:73-75、SEQ ID NO:79-81、SEQ ID NO:85-87、SEQ ID NO:91-93、SEQ ID NO:97-99、或SEQID NO:103-105；和/或选自下组的一个、两个或三个轻链可变区CDR：SEQ ID NO:4-6、SEQID NO:10-12、SEQ ID NO:16-18、SEQ ID NO:22-24、SEQ ID NO:28-30、SEQ ID NO:34-36、SEQ ID NO:40-42、SEQ ID NO:46-48、SEQ ID NO:52-54、SEQ ID NO:58-60、SEQ ID NO:64-66、SEQ ID NO:70-72、SEQ ID NO:76-78、SEQ ID NO:82-84、SEQ ID NO:88-90、SEQ ID NO:94-96、SEQ ID NO:100-102、或SEQ ID NO:106-108。
在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；所述轻链可变区包含CDR 1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VLCDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。图52(Kabat CDR)和图53(Chothia CDR)中示出了选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列和选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有重链可变结构域，所述重链可变结构域含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:19-21、SEQ ID NO:25-27、SEQ ID NO:31-33、SEQ IDNO:37-39、SEQ ID NO:43-45、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:55-57、SEQ ID NO:61-63、SEQID NO:67-69、SEQ ID NO:73-75、SEQ ID NO:79-81、SEQ ID NO:85-87、SEQ ID NO:91-93、SEQ ID NO:97-99、或SEQ ID NO:103-105。例如，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有重链可变结构域，所述重链可变结构域含有以下的CDR中的一个、两个或三个：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:1；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:2；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO:10-12、SEQ ID NO:16-18、SEQ ID NO:22-24、SEQ ID NO:28-30、SEQ ID NO:34-36、SEQ IDNO:40-42、SEQ ID NO:46-48、SEQ ID NO:52-54、SEQ ID NO:58-60、SEQ ID NO:64-66、SEQID NO:70-72、SEQ ID NO:76-78、SEQ ID NO:82-84、SEQ ID NO:88-90、SEQ ID NO:94-96、SEQ ID NO:100-102、或SEQ ID NO:106-108。例如，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域含有以下的CDR中的一个、两个或三个：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:4；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:5；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的CDR在表1、表3、图52、和图53中所示。
插入、缺失和取代可以在CDR序列内，或在CDR序列的一个末端或两个末端处。
本公开还提供了结合4-1BB的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，基于本领域已知的各种CDR定义，例如Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来确定VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列由表1、表3、图52和图53所示。
本公开还提供了结合4-1BB的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与选定的VH序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含或与选定的VL序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，选定的VH序列和选定的VL序列在表1和表3中。在一些实施方案中，选定的VH序列是SEQID NO:221、222、223、224或243，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:225、226、227、228或244。在一些实施方案中，选定的VH序列是SEQ ID NO:229、230、231或245，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:232、233、234、235或246。在一些实施方案中，选定的VH序列是SEQ ID NO:236、237、238或247，并且选定的VL序列是SEQ ID NO:239、240、241、242或248。
本公开还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如在表1、表3、图52或图53中所示的CDR，或具有如表1、表3和图55-58中所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所述配对的多肽结合4-1BB(例如，人4-1BB)。
在一些方面，本公开还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体或其抗原结合片段(例如，如本文所述的任何抗4-1BB抗体或抗原结合片段)交叉竞争结合4-1BB(例如，人4-1BB)。
抗4-1BB抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)以及多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文提供的另外的抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体(多聚体抗体，例如双特异性抗体)、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内产生的抗体(即胞内抗体)及其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG1抗体或其抗原结合片段。
抗体的片段适合用于所提供的方法，只要其保留了全长抗体的期望亲和力和特异性。因此，结合4-1BB的抗体片段将保留结合4-1BB的能力。Fv片段是含有完整抗原识别位点和结合位点的抗体片段。此区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的紧密结合的二聚体组成，在自然界中可以是共价的，例如scFv。在此结构中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。总之，六个CDR或其子集赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至是一个单一可变结构域(或一个Fv的仅包含三个CDR对抗原具有特异性的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管通常亲和力比整个结合位点低。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scFv形成抗原结合的期望结构。
Fab片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，所述片段通常在其羧基端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸来共价连接。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。
双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含同一多肽链中的VL连接VH(VH和VL)。通过使用太短而不会允许同一条链上两个结构域之间配对的接头迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
线性抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
本公开的抗体和抗体片段可以在Fc区中被修饰以提供期望的效应子功能或血清半衰期。
抗体的多聚化可以通过抗体的天然聚集或通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化的抗体制备物(例如，纯化的IgG1分子)自发形成含有抗体同二聚体以及其他更高阶抗体多聚体的蛋白质聚集体。
或者，可以通过本领域已知的化学连接技术形成抗体同二聚体。例如，可以使用异双功能交联接头(包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙硫基-乙酸酯))来形成抗体多聚体。形成抗体同二聚体的示例性方案描述于：Ghetie等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)。可以通过用胃蛋白酶消化将抗体同二聚体转化为Fab’2同二聚体。形成抗体同二聚体的另一种方式是通过使用描述于以下中的自体(autophilic)T15肽：Zhao等人(J.Immunol.25:396-404,2002)。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。可通过将一对抗体分子之间的界面工程改造以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化来制备双特异性抗体。例如，界面可以含有抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在此方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个大侧链相同或相似大小的补偿“腔”。这提供了用于增加异二聚体相对于其他不需要的终产物如同二聚体的产量的机制。此方法描述于例如WO 96/27011中，其通过引用以其全文并入。
双特异性抗体包括交联的或“异缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，异缀合物中的抗体中的一个可以偶联至亲和素，而另一个可以偶联至生物素。异缀合物抗体也可以使用任何常规的交联方法制备。合适的交联剂和交联技术在本领域中是熟知的，并且公开于美国专利号4,676,980中，其通过引用及其全文并入本文。
由抗体片段产生双特异性抗体的方法也是本领域已知的。例如，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人(Science 229:81,1985)描述了一种程序，其中通过对完整抗体进行蛋白水解裂解以生成F(ab’)2片段。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将生成的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab’TNB衍生物转化为Fab’硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。
本文所述的任何抗体或抗原结合片段可与稳定分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在受试者或溶液中的半衰期的分子)缀合。稳定分子的非限制性实施例包括：聚合物(例如聚乙二醇)或蛋白质(例如血清白蛋白，如人血清白蛋白)。稳定分子的缀合可以增加抗体或抗原结合片段的半衰期或提高其在体外(例如，在组织培养中或当以药物组合物形式存储时)或在体内(例如，在人体内)的生物学活性。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以与治疗剂缀合。包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物可以共价或非共价结合治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类(maytansinoid)(例如DM-1和DM-4)、二酮类、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺及类似物)。
抗体特征
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以阻断4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL)之间的结合。
在一些实施方案中，通过结合4-1BB，抗体可以上调免疫应答。因此，在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是4-1BB激动剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是4-1BB拮抗剂。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段可以将免疫细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞(DC)细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、CD8+和/或CD4+T细胞)的免疫应答、活性或数量提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段可以将免疫细胞的活性或数量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施方式中，抗体(或其抗原结合片段)特异性结合4-1BB(例如，人4-1BB、猴4-1BB、小鼠4-1BB、和/或嵌合4-1BB)，其中解离速率(koff)小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1或小于0.00001s-1。在一些实施方案中，所述解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。
在一些实施方案中，缔合速率(kon)大于1×102/Ms、大于1×103/Ms、大于1×104/Ms、大于1×105/Ms或大于1×106/Ms。在一些实施方案中，缔合速率(kon)小于1×105/Ms、小于1×106/Ms或小于1×107/Ms。
可以从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导亲和力。在一些实施方案中，KD小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M或小于1×10-10M。在一些实施方案中，KD小于50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，KD大于1×10-7M、大于1×10-8M、大于1×10-9M、大于1×10-10M、大于1×10-11M、或大于1×10-12M。在一些实施方案中，抗体结合人4-1BB，其中KD小于或等于约0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、或0.1nM。在一些实施方案中，抗体结合人4-1BB，其中KD小于或等于约0.5nM或0.4nM。
用于测量抗体对抗原的亲和力的通用技术包括例如ELISA、RIA和表面等离子体共振(SPR)。在一些实施方案中，抗体结合人4-1BB(SEQ ID NO:217)、猴4-1BB(例如，恒河猴4-1BB，SEQ ID NO:219)、嵌合4-1BB(SEQ ID NO:220)、和/或小鼠4-1BB(SEQ ID NO:218)。在一些实施方案中，抗体不结合人4-1BB(SEQ ID NO:217)、猴4-1BB(例如，恒河猴4-1BB，SEQID NO:219；或食蟹猴4-1BB)、嵌合4-1BB(SEQ ID NO:220)、和/或小鼠4-1BB(SEQ ID NO:218)。
在一些实施方案中，确定了热稳定性。如本文所述的抗体或抗原结合片段可以具有大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm。
因为IgG可被描述为多结构域蛋白，所以熔解曲线有时显示两个转变或三个转变，具有第一变性温度Tm D1、和第二变性温度Tm D2，以及任选地第三变性温度Tm D3。当存在两个峰时，一个峰指示Fc结构域(Tm D1)的变性，而另一个峰指示Fab结构域(Tm D2)的变性。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体或抗原结合片段具有大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm D1。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或抗原结合片段具有大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm D2。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或抗原结合片段具有大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm D3。
在一些实施方案中，Tm、Tm D1、Tm D2、Tm D3小于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
在一些实施方案中，当温度小于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃时，如本文所述的抗体或抗原结合片段不形成聚集。
在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。例如，在治疗开始后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天，或治疗开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月，可以确定TGI％。如本文所用，使用以下公式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是治疗组在第i天的平均肿瘤体积。T0是治疗组在第零天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积。V0是对照组在第零天的平均肿瘤体积。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是4-1BB激动剂。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是4-1BB拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以提高或降低表达4-1BB的靶细胞中的4-1BB信号转导。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以增强免疫细胞功能(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、和/或树突状细胞)，例如通过增加免疫细胞增殖和/或增加免疫细胞的细胞因子产生(例如，与用所述抗体或抗原结合片段处理前的增殖和/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中，所述细胞因子是γ干扰素。
在一些实施方案中，例如，与处理前的瘤内(浸润)CD8+T效应细胞的数量相比，抗体或抗原结合片段增加瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数量(例如，CD8+效应T细胞的总数量，或例如，CD45+细胞中CD8+的百分比)。在一些实施方案中，例如，与用抗人4-1BB抗体处理前的表达γ干扰素的瘤内(浸润)CD8+T细胞的数量相比，抗体或抗原结合片段增加表达γ干扰素的瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数量(例如，总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分比)。
在一些实施方案中，例如，与用抗体或抗原结合片段处理前的瘤内(浸润)CD4+T细胞的数量相比，所述抗体或抗原结合片段增加瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数量(例如，CD4+效应T细胞的总数量，或例如，CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)。在一些实施方案中，例如，与处理前的表达γ干扰素的瘤内(浸润)CD4+T细胞的数量相比，抗体或抗原结合片段增加表达γ干扰素的瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数量(例如，表达CD4+细胞的总γ干扰素，或例如，总CD4+细胞中表达CD4+细胞的γ干扰素的百分比)。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段增强记忆T细胞功能，例如，通过增加记忆T细胞增殖和/或增加记忆T细胞的细胞因子(例如，γ干扰素)产生。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段不具有功能性Fc区。例如，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
抗h4-1BB IgG1抗体
本公开还显示IgG1亚类抗体出乎意料地比其他亚类具有好得多的肿瘤抑制作用。基于结果但是不希望受理论束缚，据推测，抗h1BB抗体主要通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)来抑制肿瘤生长。FcγRIIIa是参与ADCC活化的主要受体。IgG亚类结合FcγRIIIa的能力各不相同，并且这种差异性结合决定了它们引发一系列功能应答(例如ADCC)的能力。因此，可能是因为IgG1亚类具有与FcγRIIIa的较强结合亲和力，所以IgG1抗体具有比其他亚类更好的肿瘤抑制作用。因此，在一些实施方案中，本公开提供了IgG1抗体(例如，人IgG1抗体)，其具有如本文所述的CDR、VH、和VL。
在一些实施方案中，所述IgG1抗体或其抗原结合片段具有如下表示出的CDR(例如，以Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义)、VH和VL。因此，本公开提供了一种IgG1抗体(例如，人IgG1抗体或人源化IgG1抗体)，其包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列；以及包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3由表3所示。在一些实施方案中，所述IgG1抗体或其抗原结合片段的CDR由Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来定义。在一些实施方案中，所述IgG1抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2、VL CDR3(CDR由Kabat定义来定义)具有由表3所示的序列。在一些实施方案中，所述IgG1抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3(CDR由IMGT定义来定义)具有由表3所示的序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种结合4-1BB的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选定的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区(VL)包含与选定的VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列由下表所示。
表3
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此外，如本文所述的抗体可以具有各种突变。在一些实施方案中，抗体(例如，IgG1抗体)可以具有N297A(EU编号)突变、FC-SI突变(EU编号：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)、或FC-V11突变(EU编号：G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)。在一些实施方案中，如本文所述的抗体的Fc区可以具有以下突变中的一种或多种：N297A、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、G237D、P238D、H268D、P271G、和A330R。
制备抗4-1BB抗体的方法
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人4-1BB的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以向动物注射抗原肽或蛋白质超过一次(例如两次、三次或四次)。
可以使用全长多肽或蛋白质；或者，其抗原肽片段可以用作免疫原。蛋白质的抗原肽包含4-1BB的氨基酸序列的至少8个(例如，至少10个、15个、20个或30个)氨基酸残基，并且包含蛋白质的表位，使得产生的针对所述肽的抗体与所述蛋白质形成特异性免疫复合物。如上所述，人4-1BB的全长序列是本领域已知的(SEQ ID NO:217)。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽(例如人4-1BB的片段)。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
如上所述，可以通过用4-1BB多肽或其抗原肽(例如，4-1BB的一部分)作为免疫原来免疫合适的受试者以制备多克隆抗体。可以通过标准技术(例如使用固定化的4-1BB多肽或肽的酶联免疫吸附测定(ELISA))监测经免疫的受试者的抗体效价随时间的变化。如果需要，可以将抗体分子从哺乳动物(例如从血液)分离，并通过熟知的技术(例如蛋白G或蛋白A色谱法)进一步纯化以获得IgG部分。在免疫后的合适时间，例如当特异性抗体效价最高时，产生抗体的细胞可以从受试者获得并通过以下标准技术用于制备单克隆抗体：例如最初由Kohler等人(Nature 256:495-497,1975)描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunol.Today 4:72,1983)、EBV杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96,1985)、或三源杂交瘤(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是熟知的(通常参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,纽约,NY)。例如使用标准ELISA测定法筛选杂交瘤培养物上清液中结合目标多肽或表位的抗体，检测产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
可以通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、或其抗原结合片段的DNA中或通过肽合成来制备本文所述的抗体或其抗原结合片段的变体。此类变体包括例如组成抗体的抗原结合位点或抗原结合结构域的氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段将对靶蛋白(例如4-1BB)具有提高的亲和力。可以对缺失、插入和/或组合进行任意组合，以获得对靶标具有提高的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入到抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化还可以改变新的翻译后修饰或将新的翻译后修饰引入抗体或抗原结合片段中，例如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得细胞中存在的酶连接不同的糖)、或引入新的糖基化位点。
本文公开的抗体可以来源于任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实施例包括来源于以下的抗体：人、灵长类动物(例如猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠和兔)，包括经过基因工程改造以产生人抗体的转基因啮齿动物。
人和人源化抗体包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(或具有与来源于人种系免疫球蛋白序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中。
人源化抗体通常具有移植了非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们通常取自一种“输入”可变结构域。人源化基本上可以通过将例如啮齿动物CDR或CDR序列替代为人抗体的相应序列来进行。这些方法描述于：例如，Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)；将其各自通过引用以其全文并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人V结构域被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基取代。
选择用于制备人源化抗体的人VH和VL结构域对于降低免疫原性非常重要。根据所谓的“最高拟合(best-fit)”方法，可针对已知人结构域序列的整个文库来筛选小鼠抗体的V结构域的序列。然后接受与小鼠序列最接近的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。
进一步重要的是将抗体人源化，同时保留对抗原的高特异性和亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，可以通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的，并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合FR残基，从而达到所需的抗体特征，如对一种或多种靶抗原亲和力增加。
通常，人抗4-1BB抗体、人源化抗4-1BB抗体或嵌合抗4-1BB抗体的氨基酸序列变体将含有与原始抗体轻链或重链中存在的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性的氨基酸序列。
关于原始序列的同一性通常是在比对序列并引入缺口(必要时)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中存在的氨基酸残基与人抗4-1BB抗体、人源化抗4-1BB抗体或嵌合抗4-1BB抗体或片段中存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。
可以对抗4-1BB抗体或抗原结合片段进行额外的修饰。例如，可以将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在此区域中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可以具有任何增加的体外和/或体内半衰期。还可以使用如例如Wolff等人(Cancer Res.53:2560-2565,1993)描述的异双功能交联接头来制备具有增加的体外和/或体内半衰期的同二聚体抗体。或者，可以将具有两个Fc区的抗体进行工程改造(参见例如，Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230,1989)。
在一些实施方案中，可以对抗4-1BB抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可以通过化学合成或酶促合成、或通过酶促裂解或化学裂解来进行。抗体或抗体片段的其他类型的共价修饰通过使抗体或片段的靶向氨基酸残基与能够与选定侧链或N-末端或C-末端残基反应的有机衍生剂进行反应而引入分子中。
在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖。例如，此种抗体中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，计算相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，络合、杂合和高甘露糖结构)的总和的Asn297糖链内岩藻糖的平均量来确定的岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号，或以Kabat编号的314位)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即在位置294和300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了降低聚糖异质性，可以将抗体的Fc区进一步工程改造以用丙氨酸代替297位的天冬酰胺(N297A)。
在一些实施方案中，为了通过避免Fab-臂交换来提高生产效率，将抗体的Fc区进一步工程改造，以用脯氨酸代替IgG4的228位(EU编号)的丝氨酸(S228P)。关于S228突变的详细描述在以下中进行了描述：例如Silva等人“The S228P mutation prevents in vivoand in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination ofnovel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation.”Journalof Biological Chemistry 290.9(2015):5462-5469，其通过引用以其全文并入。
在一些方面，本公开还提供了本文所述的抗体或其抗原片段用于制造用于癌症治疗的药物的用途。
重组载体
本公开还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如牛痘或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可能涉及使用非致病性(缺陷型)、可复制型病毒，或可以使用复制缺陷性病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常仅发生在互补的病毒包装细胞中。合适的系统公开于：例如Fisher-Hoch等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner等人,1989,Ann.N.Y.Acad Sci.569:86-103；Flexner等人,1990,Vaccine,8:17-21；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld等人,1991,Science,252:431-434；Kolls等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman等人,1993,Circulation,88:2838-2848；以及Guzman等人,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。将DNA整合到此类表达系统的技术是本领域普通技术人员所熟知的。DNA也可以是“裸的”，如例如描述于Ulmer等人,1993,Science,259:1745-1749，和Cohen,1993,Science,259:1691-1692。可以通过将DNA包覆在可生物降解的珠粒上来增加裸DNA的摄取，所述珠粒可有效地转运到细胞中。
为了表达，可以将本文公开的包含编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入序列可操作地连接至合适的启动子(例如异源启动子)，例如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac启动子、大肠杆菌trp启动子和大肠杆菌tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子，仅举几例。其他合适的启动子是技术人员已知的。表达构建体可以进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及(在转录区中)用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录的编码部分可以包括在开始处的翻译起始密码子和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所指出的，表达载体可以包括至少一种可选择标记。此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实施例包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、链霉菌属(Streptomyces)细胞和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2细胞和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，例如CHO细胞、COS细胞、鲍斯(Bowes)黑色素瘤细胞和HK 293细胞；以及植物细胞。用于本文所述的宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括可获得自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；可获得自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可获得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性真核载体包括可获得自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可获得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对于技术人员将是显而易见的。
适用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI启动子和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子、以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV即早期启动子(immediate early promoter)、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、逆转录病毒LTR的启动子，例如劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子、以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用多种含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。对于综述，参见Ausubel等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约,N.Y,以及Grant等人,MethodsEnzymol.,153:516-544(1997)。
可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法将构建体引入宿主细胞中。此类方法描述于许多标准实验室手册中，例如Davis等人,Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其通过引用以其全文并入本文。
可以通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核生物对编码本公开抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，在给定宿主细胞类型中起到增加启动子转录活性的作用。增强子的实施例包括SV40增强子(其位于碱基对100至270的复制起点的后侧)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质间隙或细胞外环境中，可以将适当的分泌信号整合到表达的多肽中。信号可以是多肽内源信号，也可以是异源信号。
多肽(例如抗体)可以以修饰形式，例如融合蛋白(例如GST融合物)或具有组氨酸标签表达，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括另外的异源功能区。例如，可以将另外的氨基酸、特别是带电荷的氨基酸的区域添加到多肽的N-末端，以改善在纯化期间或在随后的处理和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。可以在最终制备多肽之前除去此类区域。向多肽中添加肽部分以引起分泌或排泄，从而提高稳定性并促进纯化，这尤其是本领域熟悉和常规的技术。
本公开还提供了一种核酸序列，所述核酸序列与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且提供了一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
本公开还提供了一种核酸序列，所述核酸序列与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性，并且提供了一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。
在一些实施方案中，本公开涉及编码如本文所述的任何肽的核苷酸序列，或涉及由如本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中，所述氨基酸序列小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、或400个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列(i)包含氨基酸序列；或(ii)由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列是如本文所述的序列中的任一个。
在一些实施方案中，所述核酸序列(i)包含核酸序列；或(ii)由核酸序列组成，其中所述核酸序列是如本文所述的序列中的任一个。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，在第一氨基酸和第二氨基酸或第一核酸序列和第二核酸序列的一者或二者中引入缺口以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。出于比较目的的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少80％，并且在一些实施方案中是参考序列长度的至少90％、95％或100％。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当所述第一序列中的位置被与所述第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，所述分子在此位置处是一致的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。将缺口的数量和每个缺口的长度考虑在内，两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数，需要引入所述缺口以进行两个序列的最佳比对。出于本发明的目的，两个序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定可以使用具有缺口罚分12、缺口延伸罚分4、以及移码缺口罚分5的Blosum 62评分矩阵实现。
具有类似理化特性(同源性百分比)的保守残基如亮氨酸和异亮氨酸的百分比也可用于测量序列相似性。具有相似的理化特性的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括例如具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。
治疗方法
本公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段，所述癌症是例如乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌、或血液恶性病。在一些实施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中，所述受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施方案中，所述受试者患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、默克尔细胞癌、或头颈癌。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗4-1BB抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1抗4-1BB抗体(例如，人IgG1抗4-1BB抗体)。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
此外，由于抗4-1BB抗体可促进免疫应答，本公开提供了用于治疗受试者的感染的方法。感染的类型包括例如，细菌、真菌、病毒、原生动物、和寄生虫疾病。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制疾病的进展。此外，4-1BB抗体治疗(例如，激动性抗体或拮抗性抗体)也可用于治疗自身免疫性疾病、哮喘，并且还可以作为改善疫苗接种的手段。这些方法通常涉及向有需要的受试者施用治疗有效剂量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，“有效剂量”是指足以实现有益或期望结果(包括停止、减慢、延缓或抑制疾病的进展的量或剂量，所述疾病是例如，癌症或自身免疫性疾病。有效剂量将取决于例如待施用抗体、抗原结合片段、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和/或其组合物的受试者的年龄和体重，症状的严重程度和施用途径，因此可以根据个体情况确定施用。
能够一次或多次施用有效剂量。例如，抗体或抗原结合片段的有效剂量是足以改善、终止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延缓患者癌症进展的量，或者是足以改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延缓体外细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如，癌细胞系))增殖的量。如本领域所理解的，抗体或抗原结合片段的有效剂量可能有所不同，具体可以取决于患者病史以及其他因素，例如所用抗体的类型(和/或剂量)。
可以凭经验确定施用本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的有效剂量和方案，并且进行此类确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将取决于例如将接受本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的哺乳动物，施用途径，使用的本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段和/或组合物的特定类型，以及向哺乳动物施用的其他药物。选择抗体或抗原结合片段的合适剂量的指南可见于关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献，例如Handbook of MonoclonalAntibodies,Ferrone等人编辑,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,ch.22和pp.303-357；Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人编辑,Raven Press,纽约,1977,pp.365-389。
有效剂量的抗体的典型日剂量是0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量约为10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。
在本文描述的任何方法中，可以至少每周一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)向受试者施用至少一种抗体、其抗原结合片段或药物组合物(例如，本文描述的任何抗体、抗原结合片段或药物组合物)以及任选地至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段以同一组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂以同一组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，所述至少一种抗体或抗原结合片段以及至少一种另外的治疗剂以两种不同的组合物(例如，含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和含有至少一种另外的治疗剂的固体口服组合物)施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊的形式施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂以持续释放的口服配制品施用。
在一些实施方案中，可以在施用所述至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)之前或之后向受试者施用所述一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，向受试者施用所述一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)，使得受试者中所述一种或多种另外的治疗剂和所述至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)的生物活性期重叠。
在一些实施方案中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向受试者施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)。熟练的医学专业人员可以使用本文所述的任何用于诊断或跟进治疗有效性(例如，观察到至少一种癌症症状)的方法来确定治疗期的长短。如本文所述，熟练的医学专业人员还可以改变向受试者施用的抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种另外的治疗剂)的类型和数量(例如，增加或减少)，并且还可以根据治疗有效性的评估(例如，使用本文所述的和本领域已知的任何方法)来调整(例如，增加或减少)向受试者施用的至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种另外的治疗剂)的剂量或频率。
在一些实施方案中，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或多种抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、布鲁顿(Bruton)酪氨酸激酶(BTK)抑制剂)、以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)抑制剂和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺2，3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂，例如艾卡哚司他(epacadostat)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或多种抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、活化刺猬信号传导途径抑制剂、和选择性降解雌激素受体的药剂。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、白蛋白结合型紫杉酚(Nab-paclitaxel)、曲班尼布(trebananib)、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞格拉非尼、Reolysin、爱宁达、色瑞替尼、舒尼替尼、西罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼、依维莫司、索拉非尼、沃特瑞特(Votrient)、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、长春氟宁、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林(enzastaurin)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择激动剂。
在一些实施方案中，向受试者施用卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。
在一些实施方案中，另外的疗法是化疗或放化疗。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))、抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗(cetuximab))、抗CD319抗体(例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab))、或抗PD1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是特异性结合PD-1、CTLA-4、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、CD40、CD47、CD137、CD154、TIGIT、TIM-3、GITR、或OX40的抗体。
本公开还显示，与抗4-1BB IgG4亚类抗体与一些另外的治疗剂的组合相比，抗4-1BB IgG1亚类抗体与另外的治疗剂的组合具有更好的肿瘤抑制作用。因此，在一个方面，本公开提供了通过向受试者施用治疗有效剂量的抗4-1BB IgG1抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂来治疗所述受试者或杀死肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、或抗OX40抗体。
药物组合物和施用途径
本文还提供了含有本文所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
将药物组合物配制成与其预期施用途径(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔)相容。组合物可以包括无菌稀释剂(例如无菌水或无菌盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂(例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸)、缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)以及等渗剂(例如糖，如葡萄糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨糖醇)或盐(例如氯化钠)或其任何组合。脂质体悬浮液也可用作可药用载体(参见例如美国专利号4,522,811)。可以配制组合物的制剂并将其封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果需要(例如，以可注射配制品形式)，可以通过例如使用包衣(如卵磷脂或表面活性剂)来保持适当的流动性。可以通过整合延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长抗体或其抗原结合片段的吸收。或者，可以通过植入物和微胶囊化的递送系统(可以包括可生物降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和Nova Pharmaceutical,Inc.)来实现控释。
含有本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的一种或多种的组合物可以配制为以剂量单位形式(即，含有预定量活性化合物的物理离散单位，以便于施用和剂量均匀)进行肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔)施用。
组合物的毒性和治疗功效可以通过标准制药学程序在细胞培养物或实验动物(例如猴)中测定。例如，可以测定LD50(对50％群体的致死剂量)和ED50(对50％群体的治疗有效剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的药剂是优选的。当药剂表现出不良副作用时，应注意将潜在损害降到最低(即减少不期望的副作用)。毒性和治疗功效可通过其他标准制药学程序确定。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适当剂量的用于在受试者(例如人)中使用的任何给定药剂。一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效剂量将是在受试者(例如，被鉴定为患有癌症的人受试者或被鉴定为有发展疾病风险中的受试者，例如先前患有癌症但现在已经治愈的受试者)中治疗受试者的疾病(例如，杀死癌细胞)，降低受试者(例如，人)的一个或多个症状的严重程度、频率和/或持续时间的量。可以使用本领域已知的方法，以及通过观察受试者(例如人)的一个或多个症状，由医疗保健专业人员或兽医专业人员确定本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和给药。某些因素(例如疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病)可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时程。
示例性剂量包括本文所述的任何抗体或抗原结合片段的毫克或微克量/千克受试者体重(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg；约500μg/kg至约5mg/kg；或约500μg/kg至约2mg/kg)。尽管这些剂量覆盖范围广，但是本领域普通技术人员将理解，包括抗体及其抗原结合片段的治疗剂在其功效方面不同，并且可以通过本领域已知的方法确定有效剂量。通常，首先施用相对较低的剂量，并且主治医疗保健专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(在仍处于发展阶段时)可以随后并逐步增加剂量，直到获得适当的响应。此外，应理解，针对任何具体受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和受试者的饮食，施用时间，施用途径，排泄速率以及抗体或抗体片段的体内半衰期。
药物组合物可以同施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制造用于如本文所述的多种用途的抗体或其抗原结合片段的方法。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实施例1.产生小鼠抗h4-1BB抗体
为了产生针对人4-1BB(h4-1BB；SEQ ID NO:217)的小鼠抗体，用人4-1BB免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。通过如下所述的以及图1和图2中所示的方法收集抗h4-1BB抗体。
小鼠免疫
用浓度为100μg/ml的His标记的人4-1BB蛋白以20μg/小鼠免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。用佐剂将His标记的人4-1BB蛋白乳化，并将其注射到小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下(s.c.)注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂(CFA)乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白用等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化。第三次注射或加强免疫后三天，收集血液(血清)并使用ELISA分析其抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人4-1BB的表达质粒注射到小鼠中对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。通过使用基因枪，以60μg/小鼠将浓度为1000μg/ul的编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌(肌内注射；i.m.注射)。进行至少四次注射，其中两次注射之间至少间隔14天。在最后一次免疫后七天收集血液(血清)，并通过ELISA测试血清的抗体效价。
此外，在先前免疫后至少十四天进行增强免疫的程序(通过注射质粒或注射蛋白质)。通过尾静脉，向小鼠静脉内注射在表面表达4-1BB抗原的CHO细胞。然后在注射四天后收集脾脏。
SP2/0细胞与脾细胞的融合物
将脾组织磨碎。首先通过CD3ε微珠和抗小鼠IgM微珠选择脾细胞，然后将其与SP2/0细胞融合。然后将细胞与次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基一起接种在96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选术(FACS)对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞添加到96孔板中(2×104个细胞/孔)。使用50μl上清液。实验中使用的抗体是
(1)缀合有荧光素(FITC)的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性，以及
(2)缀合有Alexa
Figure BDA0002971534390000631
647的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简言之，将在初步筛选期间鉴定的阳性孔转移到半固体培养基中，并且鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔注射到B-NDGTM小鼠中(北京百奥赛图基因生物技术有限公司(Beijing Biocytogen)，中国北京)。通过在小鼠腹膜腔内生长杂交瘤细胞而产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部繁殖并产生腹水。腹水中含有高浓度的抗体，可将其收集供以后使用。
抗体的纯化
使用GE AKTA蛋白色谱法(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州，美国)纯化腹水中的抗体。产生了至少27种小鼠抗体。根据期望的特性来选择一些抗体。通过以下所述方法产生的这些选定的小鼠抗体包括例如，16-1C4(“1C4”)、29-6A5(“6A5”)、30-5F9(“5F9”)、45-2B3(“2B3”)、45-4B9(“4B9”)、45-7E9(“7E9”)、45-7G9(“7G9”)、45-8E11(“8E11”)、45-8E2(“8E2”)、45-8F1(“8F1”)、54-8B11(“8B11”)、55-8F6(“8F6”)、56-2A6(“2A6”)、59-5E4(“5E4”)、61-6A7(“6A7”)、69-3C2(“3C2”)、70-3F9(“3F9”)、和70-6F10(“6F10”)等。
确定抗体的VH、VL和CDR区。这些抗体的重链CDR1、CDR2、CDR3，以及轻链CDR1、CDR2、和CDR3氨基酸序列在表1、图52和图53中所示。
实施例2.小鼠抗体的人源化
人源化的起点是小鼠抗体(例如，1C4、6A5和5F9)。测定这些小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
构建1C4的四种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:221-224)和四种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:225-228)，其含有不同的修饰或取代。
构建6A5的三种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:229-231)和四种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:232-235)，其含有不同的修饰或取代。
构建5F9的三种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:236-238)和四种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:239-242)，其含有不同的修饰或取代。
这些人源化重链可变区变体可以与源自同一小鼠抗体的任何轻链可变区变体组合。例如，可以将1C4-H1(SEQ ID NO:221)与基于同一小鼠抗体1C4(例如SEQ ID NO:225-228))的任何人源化轻链可变区变体组合，并且所述抗体将被相应地标记。例如，如果将1C4-H1与1C4-K3(SEQ ID NO:227)组合，那么所述抗体被标记为1C4-H1K3。
实施例3.抗h4-1BB抗体针对人4-1BB的结合活性
从小鼠腹水收集抗h4-1BB抗体，并通过色谱法进行纯化。将用人4-1BB瞬时转染的25μl CHO细胞添加到平板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至最终浓度为10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml。在4℃下，将滴定的抗体添加到每个孔中，并孵育30分钟。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后(1200rpm，5分钟)，将50μl以1:100稀释的FITC标记的抗小鼠IgG Fc抗体(抗mIgG Fc-FITC)添加到每个孔中，并在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤(1200rpm，5分钟)。通过流式细胞术检测FITC的信号。
如图3所示，1C4和5F9与h4-1BB的结合活性很强。在图3中，NC代表阴性对照。
下表总结了流式细胞术分析中具有FITC信号的测试的细胞的百分比。抗体浓度较低时，百分比较高，表明结合亲和力较高。
表4
Figure BDA0002971534390000641
Figure BDA0002971534390000651
实施例4.抗h4-1BB抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合4-1BB的交叉反应性
在每个实验中，用小鼠4-1BB(m4-1BB，SEQ ID NO:218)、猴(恒河猴)4-1BB(r4-1BB，SEQ ID NO:219)或嵌合(小鼠和人)4-1BB(c4-1BB，SEQ ID NO:220)转染CHO细胞。
将25μl CHO细胞添加到每个孔中。将25μl纯化的抗h4-1BB抗体(1μg/ml)添加到每个孔中，并在4℃下孵育30分钟。
用PBS(1200rmp，5min)洗涤两次后，将50μl以1:100稀释的FITC标记的抗小鼠IgGFc抗体(抗mIgG Fc-FITC)添加到每个孔中，然后在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤(1200rmp，5min)。在一些情况下，将PE标记的抗小鼠IgG-Fc抗体(抗mIgG-Fc-PE)用于标记抗体，并以1:500稀释添加到每个测试孔中。通过流式细胞术确定FITC和PE的信号。
如图4所示，1C4和5F9不与小鼠4-1BB交叉反应，但与猴4-1BB(r4-1BB)有很强的交叉反应性，并且与嵌合4-1BB(c4-1BB)有很强的交叉反应性。在图4中，NC代表阴性对照。
测试的抗体与猴(r4-1BB)、小鼠(m4-1BB)、和人-小鼠嵌合4-1BB(c4-1BB)的交叉反应性总结在下表中。
表5
h4-1BB(人) r4-1BB(猴) m4-1BB(小鼠) C4-1BB(嵌合)
16-1C4 有 有 无 有
30-5F9 有 有 无 有
29-4A10 有 有 无 有
29-5F10 有 有 无 有
29-6A5 有 有 无 有
45-4B9 有 有 无 有
45-8F1 有 有 无 有
45-2B3 有 有 无 有
45-2C11 有 有 无 有
45-7E9 有 有 无 有
45-7G9 有 有 无 有
45-8E2 有 有 无 有
54-8B11 有 有 无 有
54-1A11 有 有 无 有
55-1E3 有 有 无 有
55-8H5 有 有 无 有
55-8F6 有 有 无 有
56-1G6 有 无 无 有
61-6A7 有 有 无 有
58-4B8 有 有 无 有
56-2A6 有 非常弱 无 有
69-3C2 有 有 无 有
70-3F9 有 有 无 有
70-6F10 有 有 无 有
69-4B11 有 有 无 有
实施例5.抗h4-1BB抗体的结合亲和力
抗h4-1BB抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)T200生物传感器测量。
将嵌合抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG4(1μg/mL)按照10μL/min注射到BiacoreT200生物传感器中约20秒，以达到期望蛋白质密度(约51.6响应单位(RU))。然后将组氨酸标记的人4-1BB蛋白(h4-1BB-His)以800、200、50、12.5、3.125nM的浓度、按照30μL/min注射180秒。监测解离300秒。在每种甘氨酸滴定(pH 2.0，30μL/min，持续5秒)的最后一次注射后芯片再生。图5示出了16-1C4-mHvKv-IgG4的结果。
通过使用Biacore T200评估软件3.0将数据整体拟合为1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.,1994.Methods Enzymology6.99-110)，从而同时获得缔合速率(kon)和解离速率(koff)。从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)计算亲和力。
如本领域普通技术人员理解的，对每种测试的抗体进行相同的方法，其中将参数(例如抗体浓度)做适当调整。例如，图6示出了29-6A5-mHvKv-IgG2的结果。下表总结了测试的抗体的结果。
表6
Figure BDA0002971534390000671
Figure BDA0002971534390000681
Figure BDA0002971534390000691
如实施例1所述，16-1C4、29-6A5、30-5F9、45-2B3、45-4B9、45-7E9、45-7G9、45-8E11、45-8E2、45-8F1、54-8B11、55-8F6、56-2A6、59-5E4、61-6A7、69-3C2、70-3F9、和70-6F10是小鼠抗h4-1BB抗体。基于这些小鼠抗h4-1BB抗体，产生了嵌合抗h4-1BB抗体，包括例如，16-1C4-mHvKv-IgG4、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG4、45-2B3-mHvKv-IgG2、45-4B9-mHvKv-IgG2、45-7E9-mHvKv-IgG2、45-7G9-mHvKv-IgG2、45-8E11-mHvKv-IgG2、45-8E2-mHvKv-IgG2、45-8F1-mHvKv-IgG2、54-8B11-mHvKv-IgG2、55-8F6-mHvKv-IgG2、56-2A6-mHvKv-IgG2、59-5E4-mHvKv-IgG2、61-6A7-mHvKv-IgG2、69-3C2-mHvKv-IgG2、70-3F9-mHvKv-IgG2、和70-6F10-mHvKv-IgG2。嵌合抗体具有来自相应小鼠抗h4-1BB抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，并具有来自人IgG抗体的恒定结构域(包括例如CL、CH1、CH2和CH3结构域)。
测试的抗体还包括人源化抗体，例如，1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG4、1C4-H1K3-IgG4、1C4-H1K4-IgG4、1C4-H2K1-IgG4、1C4-H2K2-IgG4、1C4-H2K3-IgG4、1C4-H2K4-IgG4、1C4-H3K1-IgG4、1C4-H3K2-IgG4、1C4-H3K3-IgG4、1C4-H3K4-IgG4、1C4-H4K1-IgG4、1C4-H4K2-IgG4、1C4-H4K3-IgG4、1C4-H4K4-IgG4、5F9-H1K1-IgG4、5F9-H1K2-IgG4、5F9-H1K3-IgG4、5F9-H1K4-IgG4、5F9-H2K1-IgG4、5F9-H2K2-IgG4、5F9-H2K3-IgG4、5F9-H2K4-IgG4、5F9-H3K1-IgG4、5F9-H3K2-IgG4、5F9-H3K3-IgG4、5F9-H3K4-IgG4、6A5-H1K1-IgG2、6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、6A5-H1K4-IgG2、6A5-H2K1-IgG2、6A5-H2K2-IgG2、6A5-H2K3-IgG2、6A5-H2K4-IgG2、6A5-H3K1-IgG2、6A5-H3K2-IgG2、6A5-H3K3-IgG2、和6A5-H3K4-IgG2等。所述人源化抗体具有人抗体恒定结构域(包括，例如，CL、CH1、CH2、和CH3结构域)。将重链的人源化可变结构域编号为H1、H2、H3等；并且将轻链的人源化可变结构域编号为K1、K2、K3等。图55、图56、和图57总结了人源化可变结构域的序列。例如，1C4-H1K1-IgG4是基于小鼠抗体1C4并具有人源化重链可变结构域H1(SEQ ID NO:221)和人源化轻链可变结构域K1(SEQ ID NO:225)。类似地，5F9-H1K2-IgG4是基于小鼠抗体5F9并具有人源化重链可变结构域H1(SEQ ID NO:236)和人源化轻链可变结构域K2(SEQ ID NO:240)。
实施例6.抗h4-1BB抗体的热稳定性
使用Protein Thermal ShiftTM染料试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和QuantStudioTM 5实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行Thermofluor测定。所述测定使用与蛋白质展开时暴露的疏水性补丁(hydrophobic patch)结合的荧光染料测量热稳定性。
根据制造商的方案进行实验。将2μL的抗体、10.5μL的水、5μL的Protein ThermalShift缓冲液、和2.5μL的稀释的Protein Thermal Shift染料混合。将样品以1.6℃/秒加热到25℃，然后以0.05℃/秒加热到99℃。
下表总结了几种人源化或嵌合抗h4-1BB抗体的Tm。
表7
Figure BDA0002971534390000701
结果显示本文所述的抗h4-1BB抗体的Tm比乌托鲁单抗和乌瑞鲁单抗的Tm高。
实施例7.小鼠抗h4-1BB抗体的体内测试
为了在体内测试抗h4-1BB抗体并预测这些抗体在人体中的作用，产生了人源化4-1BB小鼠模型。将人源化4-1BB小鼠模型进行工程改造以表达嵌合4-1BB蛋白(SEQ ID NO:220)，其中所述小鼠4-1BB蛋白的一部分胞外区被相应的人4-1BB胞外区替代。小鼠4-1BB(SEQ ID NO:218)的氨基酸残1-183被人4-1BB(SEQ ID NO:217)的氨基酸残基1-184替代。人源化小鼠模型(B-h4-1BB)通过显著降低人和表达小鼠4-1BB的普通小鼠的临床结果之间的差异，提供了在临床环境中测试新治疗性治疗的新工具。关于人源化4-1BB小鼠模型的详细描述可见于PCT/CN 2017/120388中，其通过引用以其全文并入本文。
在结肠癌模型中测试了抗h4-1BB抗体对体内肿瘤生长的作用。将约5×105个MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组。
然后通过腹腔(i.p.)给药向小鼠注射生理盐水(PS)和抗h4-1BB抗体。
以1mg/kg或3mg/kg根据小鼠的体重计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并将肿瘤的体积计算为0.5×(长轴)×(短轴)2。在注射之前、将小鼠分成不同的组时(第一次抗体注射之前)、在抗体注射期间每周两次、以及在安乐死之前测量小鼠的体重。
使用以下公式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是治疗组在第i天的平均肿瘤体积。T0是治疗组在第零天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积。V0是对照组在第零天的平均肿瘤体积。
进行T检验用于统计分析。TGI％高于60％指示肿瘤生长受到明显抑制。P<0.05是指示具有显著差异的阈值。
小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4(“1C4”)和30-5F9(“5F9”)的体内结果
在每个组中，向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、1mg/kg乌瑞鲁单抗(G2)、3mg/kg乌瑞鲁单抗(G3)、1mg/kg的小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4(G4)、3mg/kg的16-1C4(G5)、1mg/kg的小鼠抗h4-1BB抗体30-5F9(G6)或3mg/kg的30-5F9(G7)。
表8
Figure BDA0002971534390000721
在整个治疗期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图7和图8)。在治疗期结束时，观察到在不同组中没有明显的体重差异。结果显示1C4和6A5耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。
用乌瑞鲁单抗、1C4、或6A5治疗的组中肿瘤体积均减小(图9)。
如下表所示，还计算了第19天(分组后19天)的TGI％。
表9
Figure BDA0002971534390000722
结果显示抗h4-1BB抗体1C4和5F9显著抑制肿瘤生长。此外，在1mg/kg和3mg/kg时，1C4和5F9具有相似的TGI％。此结果表明较高剂量的1C4和5F9不能明显提高肿瘤抑制作用。
小鼠抗h4-1BB抗体29-6A5(“6A5”)、29-4A10(“4A10”)、29-5F10(“5F10”)、45-8F1(“8F1”)、和45-4B9(“4B9”)的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照(G1)、3mg/kg 29-6A5(G2)、3mg/kg29-4A10(G3)、3mg/kg 29-5F10(G4)、3mg/kg 45-8F1(G5)、和3mg/kg 45-4B9(G6)。出于比较目的，还向小鼠施用3mg/kg乌瑞鲁单抗(G7)。
表10
Figure BDA0002971534390000731
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的体重全部增加(图10和图11)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。用29-6A5、29-4A10、29-5F10、45-8F1、和45-4B9治疗的组的肿瘤体积在图12中所示。
如下表所示，还计算了第17天(分组后17天)的TGI％。
表11
Figure BDA0002971534390000732
Figure BDA0002971534390000741
结果显示抗h4-1BB抗体6A5、4A10、8F1、4B9均抑制肿瘤生长。此外，6A5和8F1具有比其他测试的抗体(例如，乌瑞鲁单抗)更高的TGI％。
小鼠抗h4-1BB抗体45-8E2(“8E2”)、45-7E9(“7E9”)、45-7G9(“7G9”)、45-2B3(“2B3”)、和45-2C11(“2C11”)的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照(G1)、1mg/kg 45-8E2(G2)、1mg/kg45-7E9(G3)、1mg/kg 45-7G9(G4)、1mg/kg 45-2B3(G5)、和1mg/kg 45-2C11(G6)。出于比较目的，还向小鼠施用1mg/kg乌瑞鲁单抗(G7)。
表12
Figure BDA0002971534390000742
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图13和图14)。在不同组中，观察到体重没有显著的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。
与对照组相比，45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、和45-2C11均抑制肿瘤生长(图15)。如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表13
Figure BDA0002971534390000751
结果显示抗h4-1BB抗体45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、45-2C11均显著抑制肿瘤生长。此外，45-8E2、45-7E9、45-7G9、45-2B3、和45-2C11均具有比乌瑞鲁单抗更高的TGI％。
小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4(“1C4”)、55-8F6(“8F6”)和54-8B11(“8B11”)的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照(G1)、1mg/kg 16-1C4(G2)、1mg/kg55-8F6(G3)、和1mg/kg 54-8B11(G4)。出于比较目的，还向小鼠施用1mg/kg乌瑞鲁单抗(G5)。
表14
Figure BDA0002971534390000752
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图16和图17)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。与对照组相比，16-1C4、55-8F6、和54-8B11均抑制肿瘤生长(图18)。
如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表15
Figure BDA0002971534390000761
结果显示抗h4-1BB抗体16-1C4、55-8F6、和54-8B11均显著抑制肿瘤生长。
小鼠抗h4-1BB抗体54-1A11(“1A11”)、55-1E3(“1E3”)、55-8H5(“8H5”)、和56-2A6(“2A6”)的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、1mg/kg 54-1A11(G2)、1mg/kg 55-1E3(G3)、1mg/kg 55-8H5(G4)、和1mg/kg 56-2A6(G5)。出于比较目的，还向小鼠施用1mg/kg乌瑞鲁单抗(G6)。
表16
Figure BDA0002971534390000762
Figure BDA0002971534390000771
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图19和图20)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图21中。
如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表17
Figure BDA0002971534390000772
结果显示抗h4-1BB抗体54-1A11、55-8H5、和56-2A6均显著抑制肿瘤生长。55-1E3在抑制肿瘤生长方面无效。
小鼠抗h4-1BB抗体58-4B8(“4B8”)、69-3C2(“3C2”)和69-4B11(“4B11”)的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、1mg/kg 58-4B8(G2)、1mg/kg 69-3C2(G3)、和1mg/kg 69-4B11(G4)。出于比较目的，还向小鼠施用1mg/kg乌瑞鲁单抗(G5)。
表18
Figure BDA0002971534390000773
在整个治疗期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加(图22和图23)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图24中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表19
Figure BDA0002971534390000781
结果显示抗h4-1BB抗体58-4B8、69-3C2、和69-4B11均显著抑制肿瘤生长。
实施例8.嵌合抗h4-1BB抗体的体内测试
在4-1BB人源化小鼠(B-h4-1BB)中测试了嵌合抗h4-1BB抗体，以确定其对体内肿瘤生长的作用。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组。
30-5F9-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG2、16-1C4-mHvKv-IgG4、16-1C4-mHvKv-IgG1的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、30-5F9-mHvKv-IgG2(G2)、30-5F9-mHvKv-IgG4(G3)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G4)、16-1C4-mHvKv-IgG4(G5)、16-1C4-mHvKv-IgG1(G6)、30-5F9(G7)、16-1C4(G8)、乌托鲁单抗(G9)、和乌瑞鲁单抗(G10)。
表20
Figure BDA0002971534390000791
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图25和图26)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图27中。
如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表21
Figure BDA0002971534390000792
Figure BDA0002971534390000801
结果显示所有这些抗h4-1BB抗体均可以抑制肿瘤生长。特别地，16-1C4-mHvKv的IgG1亚类(G6)具有比IgG2亚类(G4)和IgG4亚类(G5)更高的TGI％。
16-1C4-mHvKv-IgG2、29-6A5-mHvKv-IgG2、30-5F9-mHvKv-IgG2、45-2B3-mHvKv-IgG2、45-7E9-mHvKv-IgG2、45-7G9-mHvKv-IgG2、45-8E2-mHvKv-IgG2、和45-8F1-mHvKv-IgG2的体内结果
向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G2)、29-6A5-mHvKv-IgG2(G3)、30-5F9-mHvKv-IgG2(G4)、45-2B3-mHvKv-IgG2(G5)、45-7E9-mHvKv-IgG2(G6)、45-7G9-mHvKv-IgG2(G7)、45-8E2-mHvKv-IgG2(G8)、45-8F1-mHvKv-IgG2(G9)、和乌瑞鲁单抗(G10)。
表22
Figure BDA0002971534390000802
Figure BDA0002971534390000811
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图28和图29)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图30中。
如下表所示，还计算了第21天(分组后21天)的TGI％。
表23
Figure BDA0002971534390000812
结果显示所有这些嵌合抗体均可以不同程度地抑制肿瘤生长。
实施例9.人源化抗h4-1BB抗体的体内测试
在4-1BB人源化小鼠(B-h4-1BB)中测试了人源化抗h4-1BB抗体，以证明其对体内肿瘤生长的作用。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组。
人源化抗4-1BB抗体6A5-H1K2-IgG2、6A5-H1K3-IgG2、和6A5-H2K2-IgG2的体内结果
在G1组中，向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照。在治疗组中，向小鼠施用6A5-H1K2-IgG2(G2)、6A5-H1K3-IgG2(G3)、6A5-H2K2-IgG2(G4)、6A5(G5)、和乌瑞鲁单抗(G6)。
表24
Figure BDA0002971534390000821
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图31和图32)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图33中。
如下表所示，还计算了第21天(分组后21天)的TGI％。
表25
Figure BDA0002971534390000822
Figure BDA0002971534390000831
结果显示所有这些人源化抗h4-1BB抗体(G2、G3和G4)均可以抑制肿瘤生长。
人源化抗4-1BB抗体1C4-H1K1-IgG4、1C4-H1K2-IgG4、5F9-H1K1-IgG4、和30-5F9-H1K2-IgG4的体内结果
在G1组中，向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照。在治疗组中，向小鼠施用1C4-H1K1-IgG4(G2)、1C4-H1K2-IgG4(G3)、5F9-H1K1-IgG4(G4)、5F9-H1K2-IgG4(G5)、16-1C4(G6)、30-5F9(G7)和乌瑞鲁单抗(G8)。
表26
Figure BDA0002971534390000832
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图34和图35)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图36中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表27
Figure BDA0002971534390000841
结果显示这些人源化抗h4-1BB抗体具有不同的肿瘤抑制作用。
实施例10.IgG1、IgG2、和IgG4抗体的体内测试
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组。
在G1组中，向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照。向小鼠施用嵌合抗h4-1BB抗体16-1C4-mHvKv-IgG1(G2)、16-1C4-mHvKv-IgG2(G3)、16-1C4-mHvKv-IgG4(G4)、小鼠抗h4-1BB抗体16-1C4(G5)、和乌瑞鲁单抗(G6)。
表28
Figure BDA0002971534390000842
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图37和图38)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图39中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表29
Figure BDA0002971534390000851
结果显示所有这些抗h4-1BB抗体均抑制肿瘤生长。特别地，IgG1亚类具有比IgG2和IgG4亚类更高的TGI％。
实施例11.嵌合抗4-1BB IgG2抗体的体内测试
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组。
在G1组中，向B-h4-1BB小鼠注射生理盐水(PS)作为对照。在治疗组中，通过腹腔(i.p.)注射，向小鼠施用嵌合抗h4-1BB抗体54-8B11-mHvKv-IgG2(G2)、55-8F6-mHvKv-IgG2(G3)、56-2A6-mHvKv-IgG2(G4)、69-3C2-mHvKv-IgG2(G5)、61-6A7-mHvKv-IgG2(G6)、70-6F10-mHvKv-IgG2(G7)、70-3F9-mHvKv-IgG2(G8)、45-4B9-mHvkv-IgG2(G9)、以及还有乌瑞鲁单抗(G10)。
表30
Figure BDA0002971534390000852
Figure BDA0002971534390000861
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图40和图41)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图42中。
如下表所示，还计算了第27天(分组后27天)的TGI％。
表31
Figure BDA0002971534390000862
Figure BDA0002971534390000871
结果显示这些嵌合抗h4-1BB抗体具有不同的肿瘤抑制作用。
实施例12.人源化和嵌合抗4-1BB IgG2抗体的体内测试
将MC-38癌肿瘤细胞皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。
表32
Figure BDA0002971534390000872
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图43和图44)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图45中。
如下表所示，还计算了第21天(分组后21天)的TGI％。
表33
Figure BDA0002971534390000881
结果显示这些人源化和嵌合抗体具有不同的肿瘤抑制作用。
实施例13.人抗4-1BB IgG1抗体具有比其他IgG亚类更好的功效
基于如上所述的16-1C4-mHvKv-IgG1的结果，推测对于同一VH和VL，IgG1亚类具有比其他IgG亚类更好的肿瘤抑制作用。在4-1BB人源化小鼠(B-h4-1BB)中测试了抗h4-1BBIgG抗体的不同亚类，以确定其对体内肿瘤生长的作用。此外，还测试了具有N297A(EU编号)突变的IgG1抗体、具有FC-SI突变(EU编号：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)的IgG1抗体、和具有FC-V11突变(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)的IgG1抗体。所述N297A突变可以降低ADCC作用。所述FC-SI突变可以增加与几乎全部FC受体、特别是FcγRIIIA/IIA的结合亲和力，并且可能增加ADCC作用。并且FC-V11突变可以增加与FcγRIIB的结合亲和力，但是不会增加与FcγRIIA的结合亲和力，从而将降低与FcγRIIIA的结合亲和力。
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。乌瑞鲁单抗是完全人IgG4单克隆抗体。抗体乌瑞鲁单抗-IgG1具有来自乌瑞鲁单抗的VH和VL，并且恒定结构域来自IgG1亚类。类似地，抗体乌瑞鲁单抗-IgG2具有来自乌瑞鲁单抗的VH和VL，并且恒定结构域来自IgG2亚类。抗体乌瑞鲁单抗-IgG4具有来自人IgG4的恒定结构域。
表34
Figure BDA0002971534390000891
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图46和图47)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图48中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表35
Figure BDA0002971534390000892
Figure BDA0002971534390000901
结果证实，与IgG2和IgG4亚类相比，抗h4-1BB IgG1亚类具有较高的肿瘤抑制作用。
实施例14.嵌合抗4-1BB IgG1抗体具有比其他IgG亚类更好的功效
重复进行实验以测试抗h4-1BB IgG抗体的不同亚类。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且如下表所示每周一次(QW)施用不同的抗体。
表36
Figure BDA0002971534390000902
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图49和图50)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图51中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表37
Figure BDA0002971534390000911
结果再次证实，与IgG2和IgG4亚类相比，IgG1亚类具有较高的肿瘤抑制作用。
实施例15.嵌合和人抗4-1BB IgG1抗体具有比其他IgG亚类更好的功效
重复进行实验以测试嵌合和人抗h4-1BB IgG抗体的不同亚类。mIgG2A和人IgG1具有较好的ADCC作用，并且mIgG1和人IgG4具有较弱的或没有ADCC作用。将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且如下表所示每周一次(QW)施用不同的抗体。
表38
Figure BDA0002971534390000912
Figure BDA0002971534390000921
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图59和图60)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图61中。
如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表39
Figure BDA0002971534390000922
结果再次证实，与mIgG1或人IgG4亚类相比，mIgG2A或人IgG1亚类具有较高的肿瘤抑制作用。因此，结果显示抗4-1BB抗体主要通过ADCC来抑制肿瘤生长。
实施例16.与抗4-1BB IgG4抗体相比，抗4-1BB IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到100至150mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。如下讨论，乌瑞鲁单抗是完全人IgG4单克隆抗体。抗体乌瑞鲁单抗-IgG1具有来自乌瑞鲁单抗的VH和VL，并且恒定结构域来自IgG1亚类。
表40
Figure BDA0002971534390000931
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图62和图63)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图64中。
如下表所示，还计算了第24天(分组后24天)的TGI％。
表41
Figure BDA0002971534390000932
Figure BDA0002971534390000941
结果证实，与乌瑞鲁单抗(IgG4)相比，乌瑞鲁单抗-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用；与16-1C4-mHvKv-IgG4抗体相比，16-1C4-mHvKv-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用；与1C4-H1K1-IgG4抗体相比，1C4-H1K1-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用；与1C4-H1K2-IgG4抗体相比，1C4-H1K2-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用。总之，结果显示，对于同一抗原结合结构域，IgG1抗体具有与IgG4抗体相比更高的肿瘤抑制作用。
实施例17.抗h4-1BB抗体组合疗法
将表达人PD-L1的MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到约400mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。可瑞达(派姆单抗)是人源化抗PD-1IgG4抗体。
表42
Figure BDA0002971534390000942
Figure BDA0002971534390000951
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图65和图66)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图67中。
如下表所示，还计算了第25天(分组后25天)的TGI％。
表43
Figure BDA0002971534390000952
结果证实，与1C4-H1K1-IgG4相比，1C4-H1K1-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用；并且与乌瑞鲁单抗-IgG4抗体相比，乌瑞鲁单抗-IgG1抗体具有较高的肿瘤抑制作用。此外，结果显示与单独使用抗4-1抗体或单独使用抗PD-1抗体治疗相比，抗4-1BB抗体与抗PD-1抗体的组合具有较高的肿瘤抑制作用。此外，与抗4-1BB IgG4抗体与抗PD-1抗体的组合相比，抗4-1BB IgG1抗体与抗PD-1抗体的组合具有较高的肿瘤抑制作用。
实施例18.黑色素瘤癌细胞的体内测试
将表达人PD-L1的B16-F10细胞(黑色素瘤细胞系)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到100至150mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。
表44
Figure BDA0002971534390000961
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图68和图69)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图70中。
如下表所示，还计算了第18天(分组后18天)的TGI％。
表45
Figure BDA0002971534390000962
结果显示抗h4-1BB IgG1抗体针对黑色素瘤癌细胞具有优异的肿瘤抑制作用，并且抗h4-1BB IgG1抗体与抗PD-1抗体的组合可以进一步提高肿瘤抑制作用。当G3的TGI％为81.0％时，基于仅存活的4只小鼠计算TGI％，并且G3的存活率仅为4/8。相比之下，G4的存活率为7/8。结果显示组合治疗可显著改善存活率。
实施例19.淋巴瘤癌细胞的体内测试
将EL4细胞(淋巴瘤癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到100至150mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。
表46
Figure BDA0002971534390000971
在整个治疗期间监测小鼠的体重。在治疗期结束时，不同组中小鼠的平均体重全部增加(图71和图72)。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。结果显示这些抗h4-1BB抗体耐受性良好并且对小鼠无明显毒性。每组的肿瘤体积示于图73中。
如下表所示，还计算了第17天(分组后17天)的TGI％。
表47
Figure BDA0002971534390000972
结果显示抗h4-1BB IgG1抗体针对淋巴瘤癌细胞具有优异的肿瘤抑制作用，并且抗h4-1BB IgG1抗体与抗PD-1抗体的组合可以进一步提高肿瘤抑制作用。
实施例20.人源化抗4-1BB抗体作用的进一步分析
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到约200±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组，并且施用如下表所示的不同的抗体。
表48
Figure BDA0002971534390000981
施用两天后，将小鼠处死。收集肿瘤样品和脾脏样品用于进一步分析。如下表所示，记录小鼠的体重。在不同组中，观察到体重没有明显的差异。
表49
Figure BDA0002971534390000982
将收集的肿瘤样品和脾脏样品研磨，并用消化酶处理。将混合物在37℃下孵育60分钟，过滤，洗涤，并重悬为单细胞悬浮液。
将细胞用荧光标记的抗体孵育，并通过流式细胞术分析。将脾脏样品通过如图74和图75所示的程序进行处理。将肿瘤样品通过样品图76和图77所示的程序进行处理。
结果示于图78-83中。如图79D所示，抗4-1BB IgG1抗体可有效降低肿瘤中Treg细胞的百分比，从而增加免疫应答。所述结果也与图82A中的结果一致，其中CD8与Treg的较低比率与不良结果相关。此外，图82A的结果还解释了1C4抗4-1BB抗体具有与乌瑞鲁单抗相比较高的肿瘤抑制作用。
实施例21.抗h4-1BB IgG1抗体的更多测试
重复进行实验以测试抗h4-1BB IgG抗体的不同亚类。
将MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到B-h4-1BB小鼠中。当小鼠的肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分入不同的组(例如，n＝5)，并且通过i.p.给药以1mg/kg或3mg/kg剂量每周两次施用选自表1、表2、和/或表4的抗体的IgG1、IgG2、和IgG4形式。总共进行了6次施用。向其中一组小鼠施用生理盐水(PS)作为对照。
在整个治疗期间监测小鼠的体重和肿瘤体积。在治疗期结束时计算TGI％。
预期与IgG2和IgG4亚类相比，抗h4-1BB IgG1亚类具有较高的TGI％，因此具有较好的肿瘤抑制作用。
其他实施方案
应当理解，虽然已经结合具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 祐和医药科技(北京)有限公司（Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd）
<120> 抗TNFRSF9抗体及其用途
<130> IDC210057
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Asp
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1 5 10
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 113
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 114
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 115
<211> 10
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<213> 人工序列
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1 5 10
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<213> 人工序列
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Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr
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Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
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<213> 人工序列
<400> 119
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
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<213> 人工序列
<400> 120
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<213> 人工序列
<400> 122
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Val Asp Tyr
1
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<213> 人工序列
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<213> 人工序列
<400> 126
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<213> 人工序列
<400> 127
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<213> 人工序列
<400> 128
Tyr Pro Gly Asp Gly Asp
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<213> 人工序列
<400> 129
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<213> 人工序列
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Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
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<213> 人工序列
<400> 132
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<213> 人工序列
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Asn Pro Tyr Asn Asp Asp
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Trp Ser Asp Gly Asn
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<213> 人工序列
<400> 142
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Thr Val Ala
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<213> 人工序列
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Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
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<213> 人工序列
<400> 144
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<213> 人工序列
<400> 145
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile His
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<213> 人工序列
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Tyr Pro Ala Ser Asp Tyr
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Gly Tyr Phe Gly Ser Leu Asp Tyr
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<213> 人工序列
<400> 148
Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Thr Gly Ile His
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<213> 人工序列
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Ser Ala Ser Glu Ser Ile Ser
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<213> 人工序列
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Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Thr Thr
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Met His
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<213> 人工序列
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Tyr Pro Gly Asn Ser Asp
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 154
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<213> 人工序列
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Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
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<213> 人工序列
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Gly His Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr
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Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His
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<213> 人工序列
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Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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<213> 人工序列
<400> 162
Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
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<213> 人工序列
<400> 164
Tyr Pro Gly Asn Ser Asp
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<213> 人工序列
<400> 165
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<213> 人工序列
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 167
Gly Ala Ser Ser Gly Tyr Asn
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<213> 人工序列
<400> 168
Gly Gln Thr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 169
Lys Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
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<211> 6
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<213> 人工序列
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Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 172
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 173
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<213> 人工序列
<400> 174
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 175
Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5 10
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<211> 6
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<213> 人工序列
<400> 176
Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 177
Phe His Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Asn
1 5 10
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<211> 11
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<213> 人工序列
<400> 178
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 179
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 180
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 181
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 182
Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 183
Arg Asp Tyr Leu Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 184
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 185
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 186
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1 5
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<211> 10
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<213> 人工序列
<400> 187
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1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 188
Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 189
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<211> 11
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<213> 人工序列
<400> 190
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 191
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 192
Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Leu Arg Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 193
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 194
Asp Pro Glu Asn Gly Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 195
Gly Leu Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 196
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asp Met Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 197
Leu Thr Ser Asn Leu Ser Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 198
Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Leu Thr
1 5
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<211> 10
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<213> 人工序列
<400> 199
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Phe Gly Met His
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 200
Ser Ser Gly Ser Ser Ala
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 201
Asp Trp Val Asp Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 202
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Val
1 5 10
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 203
Thr Ala Thr Lys Leu Thr Asn
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 204
Gln His Phe Trp Asp Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 205
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 206
Phe Pro Ser Asp Ser Tyr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 207
Phe Gly Ser Ser Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Thr Met Glu Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 208
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 209
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 210
Gln Gln Tyr Trp Thr Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 211
Gly Tyr Ala Phe Asn Asn Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 212
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 212
Tyr Pro Gly Asp Gly Asp
1 5
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 213
Leu Asp Gly Asn Tyr Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 214
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 214
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 215
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 215
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 216
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
<210> 217
<211> 255
<212> PRT
<213> 人
<400> 217
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 218
<211> 256
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 218
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 219
<211> 254
<212> PRT
<213> 猴
<400> 219
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg
195 200 205
Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250
<210> 220
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 220
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu
195 200 205
Phe Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu
245 250 255
Leu
<210> 221
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 221
Gln Val Gln Met Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Ala Gly Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Pro Arg Ala Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 222
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 222
Gln Val Gln Met Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Ala Gly Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Gln Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Pro Arg Ala Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 223
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 223
Gln Val Gln Met Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Ala Gly Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Gln Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Pro Arg Ala Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 224
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 224
Gln Gly Gln Met Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Trp Ile Phe Ala Gly Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Pro Arg Ala Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 225
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 225
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 226
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 226
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 227
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 227
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Arg Ala Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 228
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 228
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Phe Ser Pro Arg Ala Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 229
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 229
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Trp Glu Phe Tyr Tyr Asp Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 230
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 230
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Trp Glu Phe Tyr Tyr Asp Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 231
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 231
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Trp Glu Phe Tyr Tyr Asp Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 232
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 232
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 233
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 233
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 234
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 234
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 235
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 235
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 236
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 236
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 237
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 237
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 238
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 238
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 239
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 239
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 240
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 240
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 241
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 241
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 242
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 242
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 243
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 243
Gln Gly Gln Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Trp Ile Phe Ala Gly Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Pro Arg Ala Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 244
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 244
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Gly Phe Ser Pro Lys Ala Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 245
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 245
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Trp Glu Phe Tyr Tyr Asp Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 246
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 246
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 247
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 247
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 248
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 248
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 249
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 249
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 250
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 250
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 251
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Arg Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 252
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 252
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Val Asn Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln Gln Tyr Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 253
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Asp Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Thr Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Gly Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Ser Ile Thr Ser Val Ser Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 254
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 254
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Cys Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 255
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ala Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gly Tyr Phe Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 256
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 256
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Asn Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Thr Gly
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Ile Asn
100 105
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 257
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Gly Ile Thr Thr Ala Pro Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 258
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 259
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 259
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
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Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 260
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 260
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Met Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 261
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 261
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ile Thr Thr Ala Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 262
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 262
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile His
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Gly Tyr Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 263
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 263
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Lys Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Glu Tyr Tyr Pro Trp Val Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 264
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 264
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
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Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 265
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 265
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Phe His Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 266
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 266
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser His Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 267
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 267
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Asp Tyr Leu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 268
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 268
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Tyr Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 269
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 269
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 270
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 270
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 271
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 271
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
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65 70 75 80
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Ala Glu Gly Leu Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 272
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 272
Gln Ile Ile Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asp Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Thr Pro Trp Ile Tyr
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50 55 60
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85 90 95
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100 105
<210> 273
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 273
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 274
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 274
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
<210> 275
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 275
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 276
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 276
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 277
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 277
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Asn Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Asn Tyr Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 278
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 278
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 279
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 280
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 280
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 281
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<213> 人工序列
<400> 281
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
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<213> 人工序列
<400> 282
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<213> 人工序列
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Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<213> 人工序列
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1 5 10
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<213> 人工序列
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Asp Tyr Trp Met Ser
1 5
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<213> 人工序列
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Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Thr
1 5 10 15
Asn
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<213> 人工序列
<400> 287
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1 5
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<213> 人工序列
<400> 288
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<213> 人工序列
<400> 289
Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1 5
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<213> 人工序列
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Leu Gln Tyr Asp Arg Tyr Pro Phe Thr
1 5
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Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
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<211> 17
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<213> 人工序列
<400> 292
Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
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Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
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<213> 人工序列
<400> 294
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 295
<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 295
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Val Lys Gly
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 11
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<213> 人工序列
<400> 302
Ser Ser His Ala Gly Ser Asn Asn Phe Tyr Val
1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
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Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
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<211> 18
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<213> 人工序列
<400> 304
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Pro Ser Val
1 5 10 15
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<211> 11
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<213> 人工序列
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<211> 13
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<213> 人工序列
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Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 307
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<211> 9
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<213> 人工序列
<400> 308
Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Asn Val Ile
1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 309
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
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<211> 18
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<213> 人工序列
<400> 310
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<213> 人工序列
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<211> 7
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 18
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<213> 人工序列
<400> 316
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
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<213> 人工序列
<400> 319
Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
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Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
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<213> 人工序列
<400> 322
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Pro Ser Val
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Glu Ser
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<211> 11
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<213> 人工序列
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Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 13
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<213> 人工序列
<400> 324
Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 325
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 325
Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
<400> 326
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<213> 人工序列
<400> 327
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 328
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<213> 人工序列
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<211> 13
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<213> 人工序列
<400> 330
Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
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<211> 7
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<213> 人工序列
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Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
<400> 332
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1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列
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Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 334
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Pro Ser Val
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 335
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<211> 13
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<213> 人工序列
<400> 336
Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 337
Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
<400> 338
Gln Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Val Ile
1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 339
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
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<211> 18
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<213> 人工序列
<400> 340
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Pro Ser Val
1 5 10 15
Glu Ser
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<211> 11
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<213> 人工序列
<400> 341
Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
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<211> 13
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<213> 人工序列
<400> 342
Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 343
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列
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1 5
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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1
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 353
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<213> 人工序列
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Asn Ile Gly Ser Lys Ser
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<211> 3
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<213> 人工序列
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Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
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<213> 人工序列
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Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列
<400> 358
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1 5
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<213> 人工序列
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<211> 6
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<213> 人工序列
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Asn Ile Gly Ser Lys Ser
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<211> 3
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Asn Ile Gly Ser Lys Ser
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<213> 人工序列
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Tyr Asp Ser
1
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<213> 人工序列
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Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 375
Gly Tyr Gln Met Arg Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列
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Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
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<213> 人工序列
<400> 377
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<213> 人工序列
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<211> 3
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<213> 人工序列
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Tyr Asp Ser
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<213> 人工序列
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Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Tyr Asn Phe Gly Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 382
Val Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 383
Ala Arg Glu Gly Glu Ala Val Gly Leu Asp Leu Asp Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 385
Tyr Asp Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 387
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 388
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 389
Ala Arg Glu Gly Glu Ala Val Gly Leu Asp Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 390
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 390
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 391
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 391
Tyr Asp Ser
1
<210> 392
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 392
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
1 5
<210> 393
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 393
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 394
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 394
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 395
Ala Arg Glu Gly Glu Ala Val Gly Leu Asp Leu Asp Tyr
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<213> 人工序列
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Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 397
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<212> PRT
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Tyr Asp Ser
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Asn Ile Trp Pro Gly Asn Gly Gly Thr Phe Tyr Gly Glu Lys Phe Met
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Gly
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Gly
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Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Ala Thr Asn Phe Asn Gly Lys Phe Arg
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Gly
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Ala Ala Ser
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Gly Ala Ser
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Gly Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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Ser Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
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Asp
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Gly
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
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Asp
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<213> 人工序列
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Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
<400> 459
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 460
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 461
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 461
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Leu Thr Gly Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 462
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
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Tyr Asp Arg Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 463
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 464
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
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Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 465
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 465
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu His Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
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Phe Cys Ala Arg Val Val Pro Ala Gly Ser Gly Trp Arg Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 466
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 466
Gln Ser Val Leu Ile Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ile Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser His Ala Gly Ser
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Asn Asn Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 467
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 467
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Pro Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 468
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 468
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
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Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 469
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 469
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Arg Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 470
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 470
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
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Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 471
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 471
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
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Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 472
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 472
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
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Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
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Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 473
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Pro Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 474
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 474
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 475
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Pro Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
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115 120
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 476
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1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Asn Lys Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 477
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
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<213> 人工序列
<400> 478
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ile
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<211> 123
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<213> 人工序列
<400> 479
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 480
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Ile Tyr Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ile
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Asn Lys Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 481
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 482
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<400> 483
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 484
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 485
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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115
<210> 486
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 486
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
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<211> 120
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<213> 人工序列
<400> 487
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 488
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 489
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 490
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Val Val
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Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 491
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20 25 30
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 492
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 492
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
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100 105
<210> 493
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 493
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Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Ala Arg Glu Gly Glu Ala Val Gly Leu Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 494
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 494
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
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<210> 495
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 495
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 496
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 496
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 497
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115 120
<210> 498
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 498
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1 5 10 15
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20 25 30
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Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 499
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 499
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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20 25 30
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115 120
<210> 500
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 500
Ser Val Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 501
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 501
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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100 105 110
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<210> 502
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 502
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85 90 95
Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 503
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Tyr Thr Arg Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 504
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 504
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Pro
85 90 95
Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 505
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 505
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Ser
35 40 45
Ser Ile Gly Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 506
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 506
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Trp Val Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105
<210> 507
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 507
Val His Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly
20 25 30
Tyr Ser Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ser Ile Gly Ser Thr Ser Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 508
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 508
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Thr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Trp Val Pro
85 90 95
Phe Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 509
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 509
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Val Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Ser Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 510
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 510
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Ser Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Asn
<210> 511
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 511
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 512
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 512
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 513
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 513
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Thr Val Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Glu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Arg Ser Trp Phe Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 514
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 514
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 515
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 515
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Glu Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Glu Ala Leu Gly Gly Tyr Tyr Glu Leu Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 516
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 516
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu
100 105 110
<210> 517
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 517
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Ile Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ser Phe Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 518
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 518
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Pro Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (57)

1.一种结合4-1BB(TNF受体超家族成员9)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VHCDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及
包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，
其中所述选定的VH CDR 1、2和3氨基酸序列和所述选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、2、3所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、5、6所示；
(2)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7、8、9所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、11、12所示；
(3)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、14、15所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、17、18所示；
(4)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、20、21所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、23、24所示；
(5)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、26、27所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、29、30所示；
(6)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:31、32、33所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34、35、36所示；
(7)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:37、38、39所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40、41、42所示；
(8)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:43、44、45所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:46、47、48所示；
(9)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:49、50、51所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:52、53、54所示；
(10)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:55、56、57所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:58、59、60所示；
(11)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:61、62、63所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:64、65、66所示；
(12)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:67、68、69所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:70、71、72所示；
(13)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:73、74、75所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:76、77、78所示；
(14)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:79、80、81所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:82、83、84所示；
(15)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:85、86、87所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:88、89、90所示；
(16)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:91、92、93所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:94、95、96所示；
(17)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:97、98、99所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:100、101、102所示；
(18)所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:103、104、105所示，以及所述选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:106、107、108所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ IDNO:1、2和3所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ IDNO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ IDNO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人4-1BB。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
8.一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:225、226、227、228或244所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:221、222、223、224或243所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:232，233、234、235或246所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:229、230、231或245所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有由SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:239、240、241、242或248所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合4-1BB；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:236、237、238或247所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(7)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:19、20、21所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(8)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:22、23、24所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:249所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(9)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:25、26、27所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:252所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(10)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:28、29、30所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:251所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(11)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:31、32、33所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:254所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(12)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:34、35、36所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:253所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(13)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:37、38、39所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:256所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(14)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:40、41、42所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:255所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(15)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:43、44、45所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:258所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(16)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:46、47、48所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:257所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(17)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:49、50、51所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(18)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:52、53、54所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:259所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(19)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:55、56、57所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:262所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(20)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:58、59、60所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:261所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(21)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:61、62、63所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:264所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(22)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:64、65、66所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:263所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(23)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:67、68、69所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:266所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(24)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:70、71、72所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:265所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(25)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:73、74、75所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:268所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(26)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:76、77、78所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:267所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(27)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:79、80、81所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:270所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(28)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:82、83、84所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:269所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(29)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:85、86、87所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:272所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(30)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:88、89、90所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:271所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(31)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:91、92、93所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:274所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(32)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:94、95、96所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:273所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(33)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:97、98、99所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:276所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(34)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:100、101、102所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:275所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB；
(35)包含VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:103、104、105所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含由SEQ ID NO:278所示的氨基酸序列的VL配对时结合4-1BB；
(36)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:106、107、108所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含由SEQ ID NO:277所示的氨基酸序列的VH配对时结合4-1BB。
9.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
10.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
11.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:7、8和9所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
12.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:10、11和12所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
13.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有由SEQ ID NO:13、14和15所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
14.根据权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有由SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的核酸，其中所述VH在与VL配对时特异性结合人4-1BB，或所述VL在与VH配对时特异性结合人4-1BB。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。
17.根据权利要求8-16中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码单链可变片段(scFv)。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
19.一种载体，所述载体包含根据权利要求8-18中任一项所述的核酸中的一种或多种。
20.一种载体，所述载体包含根据权利要求8-18中任一项所述的核酸中的两种，其中所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
21.一种载体对，其中每个载体包含根据权利要求8-18中任一项所述的核酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
22.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求19或20所述的载体、或根据权利要求21所述的载体对。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
24.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求8-18中任一项所述的核酸中的一种或多种。
25.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求8-18中任一项所述的核酸中的两种。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中所述两种核酸共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合4-1BB。
27.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
(a)在足以使根据权利要求22-26中任一项所述的细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的抗体或抗原结合片段。
28.一种结合4-1BB的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选定的VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区(VL)包含与选定的VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列是以下之一：
(1)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:221、222、223、224或243，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:225、226、227、228或244；
(2)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:229、230、231或245，以及所述选定的VL序列是SEQID NO:232、233、234、235或246；
(3)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:236、237、238或247，以及所述选定的VL序列是SEQID NO:239、240、241、242或248；
(4)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:249，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:250；
(5)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:251，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:252；
(6)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:253，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:254；
(7)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:255，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:256；
(8)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:257，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:258；
(9)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:259，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:260；
(10)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:261，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:262；
(11)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:263，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:264；
(12)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:265，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:266；
(13)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:267，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:268；
(14)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:269，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:270；
(15)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:271，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:272；
(16)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:273，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:274；
(17)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:275，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:276；
(18)所述选定的VH序列是SEQ ID NO:277，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:278。
29.根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:236的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:240的序列。
30.根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:221的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:225的序列。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人4-1BB。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
33.根据权利要求28-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
34.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的、根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.根据权利要求34所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
36.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者患有实体瘤。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、口咽癌、卵巢癌、B细胞淋巴瘤、或非霍奇金淋巴瘤。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、或多发性骨髓瘤。
40.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
41.一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
42.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、以及可药用载体。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求34或35所述的抗体药物缀合物、以及可药用载体。
44.根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是IgG1抗体。
45.根据权利要求1-7和28-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是人IgG1抗体。
46.一种结合4-1BB的IgG1抗体或其抗原结合片段，所述IgG1抗体或其抗原结合片段包含：
包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中VH CDR1区包含与选定的VHCDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及
包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中VL CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH CDR 1、2和3氨基酸序列和所述选定的VL CDR 1、2和3氨基酸序列选自如表3所示的抗体中的一种。
47.根据权利要求46所述的IgG1抗体或其抗原结合片段，其中所述选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:279-281所示，以及所述选定的VL CDR1、2、3氨基酸序列分别由SEQ ID NO:282-284所示。
48.根据权利要求46所述的IgG1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人IgG1抗体。
49.一种结合4-1BB的IgG1抗体或其抗原结合片段，所述IgG1抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选定的VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区(VL)包含与选定的VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列选自如表3所示的抗体中的一种。
50.根据权利要求49所述的IgG1抗体或其抗原结合片段，其中所述选定的VH序列是SEQID NO:459，以及所述选定的VL序列是SEQ ID NO:460。
51.根据权利要求49所述的IgG1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人IgG1抗体。
52.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗4-1BB IgG1抗体或其抗原结合片段、以及治疗有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是抗PD-1IgG4抗体。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗。
55.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗4-1BB IgG1抗体或其抗原结合片段、以及治疗有效剂量的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗CTLA4抗体是抗CTLA IgG1抗体或抗CTLAIgG2抗体。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗CTLA4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
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