KR100619546B1 - 히스톤 ｈ2ａ 및/또는 ｈ2ｂ에 대한 인간 모노클로날자가항체 및 그 단편 - Google Patents

히스톤 ｈ2ａ 및/또는 ｈ2ｂ에 대한 인간 모노클로날자가항체 및 그 단편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히스톤 Ｈ2Ａ 및/또는 Ｈ2Ｂ에 대한 인간 모노클로날 자가항체 또는 그 단편에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 파지 디스플레이를 이용하여 SLE 환자의 PBL (peripheral blood leukocytes)로부터 분리된 히스톤 H2A 및/또는 H2B에 특이적인 인간 항히스톤 mAb 및 그 단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 SLE 환자의 PBL로부터 유래된 히스톤 H2A 및 H2B에 특이적인 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 함유하므로 인간의 SLE를 비롯한 자가면역질환의 치료에 유용하다.
항히스톤, SLE, 파지 디스플레이, 자가항체, H2A, H2B

Description

히스톤 Ｈ2Ａ 및/또는 Ｈ2Ｂ에 대한 인간 모노클로날 자가항체 및 그 단편{Human Monoclonal Autoantibodies to Histones H2A and/or H2B and the Segment Thereof}
도 1은 항 히스톤 모노클로날 항체(mAbs)의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 도시한 것이다. R 돌연변이에 관련되는 잔기들은 이탤릭체로 나타냈고, 점라인(germline) 서열과 동일한 잔기는 대시(-)로 나타냈다. EMBL/GenBank 접근번호는 다음과 같다: SLEhis16: AY569442; SLEhis18: AY569444; SLEhis19: AY569446; 및 SLEhis22: AY569448.
도 2는 항 히스톤 mAbs의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 도시한 것이다. R 돌연변이에 관련되는 잔기들은 이탤릭체로 나타냈고, 점라인(germline) 서열돠 동일한 잔기는 대시(-)로 나타냈다. EMBL/GenBank 접근번호는 하기와 같다: SLEhis16: AY569449; SLEhis18: AY569443; SLEhis19: AY569445; 및 SLEhis22: AY569447.
도 3은 본 발명에 따른 SLEhis22의 가용성 Fab의 면역블롯팅 분석을 도시한 것이다. 히스톤 H1(레인 1), H2A(레인 2), H2B(레인 3), H3(레인 4), 및 H4(레인 5)는 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리한 히스톤을 쿠마시 브리언트 블루로 염색한 결 과 사진(A)이고, SLEhis22로부터의 가용성 Fab를 이용한 면역블롯팅으로 분석한 결과사진(B)이다.
도 4는 본 발명에 따른 SLEhis22의 가용성 Fab에 대한 ELISA 결과를 도시한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 히스톤 Ｈ2Ａ 및/또는 Ｈ2Ｂ에 대한 인간 모노클로날 자가항체 또는 그 단편에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 파지 디스플레이를 이용하여 SLE 환자의 PBL (peripheral blood leukocytes)로부터 분리된 히스톤 H2A 및/또는 H2B에 특이적인 인간 항히스톤 mAb 및 그 단편에 관한 것이다.
발명의 배경
히스톤은 몇가지 SLE(systemic lupus erythematosus: 전신홍반성낭창)와 같은 자가면역 질병에서 주요 자가항원이다. 항히스톤 항체들(Abs)은 SLE 환자와 자연발생적 자가면역 질병에 걸리기 쉽게 만들어져 있는 NZB/NZW 및 MRL/Mp-lpr/lpr 스트레인(strain)과 같은 마우스의 혈청에서 검출되고(Gioud et al., J. Immunol., 131:269, 1983; Monestier et al., Clin. Exp. Immunol., 99:37, 1995; Brick et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 54:372, 1990), 타입 1 자가면역 감염을 가지는 환자에서 검출된다 (Chen et al., J. Gastroenterol. Hepatol., 13, 483, 1998). 상기와 같은 자가항체의 생산은 질병의 활성과 상호 관련성이 있다(Gioud et al., J. Immunol., 131:269, 1983; Schett et al., Arthritis Rheum., 43:420, 2000; O’Dell et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 47:343, 1988; Teodorescu et al., Clin. Immunol., 110:145, 2004).
자가항체의 구체적인 분자 분석은 자가항체 생산의 기초 기전 및 질병유발(pathogenesis)에서의 그 역할을 이해하는데 중요하다. 몇몇 항히스톤 mAb의 구조 및 특성은 단지 마우스에서만 보고된 바 있다 (Monestier et al., Mol. Immunol., 30:1069, 1993; Di Valerio et al., J. Immunol., 155:2258, 1995; Monestier, Eur. J. Immunol., 21:1725, 1991). 여러 다른 히스톤과 H2A 및 H2B 히스톤 단편에 대한 다양한 특이성을 갖는 mAb가 루프스 마우스로부터 분리된 것이 보고되었지만, 인간 항히스톤 Ab의 가변(V) 영역에 대한 정보는 아직까지 알려지지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 파지 디스플레이를 이용하여 SLE 환자의 PBL (peripheral blood leukocytes)로부터 히스톤 H2A 및 H2B에 특이적인 네 개의 인간 항히스톤 mAb를 단리하고, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 결정·분석하여 SLE 환자에게 적용하기 위한 항체 또는 그 단편을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
결국 본 발명의 목적은 SLE 환자의 PBL로부터 유래된 히스톤 H2A 및/또는 H2B에 특이적인 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 함유하는, SLE 환자에게 적용하기 위한, 항체 또는 그 단편을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 경쇄 가변영역으로 가지고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 중쇄 가변영역으로 가지는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 히스톤 H2A 및/또는 H2B에 특이적으로 결합함을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그 단편을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 항체의 경쇄 가변영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항체의 중쇄 가변영역을 각각 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 히스톤H2A 및/또는 H2B 특이적 항체의 중쇄 CDR 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 히스톤 H2A 및/또는 H2B 특이적 항체의 경쇄 CDR을 각각 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 경쇄 가변영역으로 가지는 항체 또는 그 단편 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 중쇄 가변영역으로 가지는 항체 또는 그 단편을 각각 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 중쇄 CDR로 갖는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 경쇄 CDR로 갖는 항체 또는 그 단편을 각각 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 중쇄 CDR로 가지며, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 경쇄 CDR로 가지는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그 단편을 이용하여 제조된 인간 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 인간 항체 또는 그 단편은 파지 디스플레이 방법으로 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
히스톤은 DNA와 결합하여 뉴클레오좀을 형성하는 양이온성 단백질이다. SLE를 가지는 환자의 혈청(serum)은 개별 히스톤, 보다 복잡한 결정요소(determinant) (예를 들면, H2A-H2B 다이머), 또는 히스톤 펩티드에 대한 자가항체를 함유한다 (Monestier et al., Mol. Immunol., 30:1069, 1993; Monestier et al., Rheu. Dis. Clin. N. Am., 18:415, 1992; Stemmer et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 76:82, 1995).
인간 항히스톤 자가항체의 구조적 특징을 결정하기 위하여 본 발명자들은 SLE(systemic lupus erythematosus) 환자의 PBL(peripheral blood lymphocyte)로부터 클로닝된 네 개의 mAb 가변영역을 분석하였다. 인간의 히스톤 H2A 및 H2B에 대한 모노클로날 자가항체(autoantibody)인 SLEhis22는 히스톤 H2A 및 H2B에 특이적이었다.
본 발명에서 인용된 서열번호는 각각 다음과 같다.
서열번호 1 : SLEhis22 경쇄 가변영역의 아미노산 서열
서열번호 2 : SLEhis22 중쇄 가변영역의 아미노산 서열
서열번호 3 : SLEhis22 경쇄 가변영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열
서열번호 4 : SLEhis22 중쇄 가변영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열
서열번호 5 : SLEhis22 CDRH1의 아미노산 서열
서열번호 6 : SLEhis22 CDRH2의 아미노산 서열
서열번호 7 : SLEhis22 CDRH3의 아미노산 서열
서열번호 8 : SLEhis22 CDRL1의 아미노산 서열
서열번호 9 : SLEhis22 CDRL2의 아미노산 서열
서열번호 10 : SLEhis22 CDRL3의 아미노산 서열
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 H2A 및 H2B에 특이적인 항체의 분리
(1) 항원-결합 단편(Fab)의 PCR 증폭 및 라이브러리 구축
SLE 처치를 위한 약을 복용하지 않은, SLE로 진단된 환자의 PBL(peripheral blood leukocytes)로부터 전체 RNA를 분리하였다 (아주대학교 메디컬센터). 상기 환자는 10명의 환자로부터 스크린된 세럼 내에 항히스톤 Ab의 가장 높은 타이터(titer)를 보이는 환자이다. 상기 분리된 전체 RNA로부터 단일나선 cDNA 합성 키트(Pharmacia)를 사용하여 단일나선 cDNA를 합성한 다음, 세 단계 PCR 시리즈를 이용하여 인간 항원-결합 단편 (Fab; antigen-binding fragment) 라이브러리를 구축하였다. 1차 PCR에서, 개별의 VH, VL, CH1, 및 CL 유전자들을 각각 증폭하고, 2차 오버래핑 신장(extension) PCR을 통하여 Fd 및 경쇄 서열을 생성하였다. 3차 오버래핑 신장 PCR을 통해, Fd와 Vκ혹은 Fd와 Vλ의 전체 길이 Fab를 생성하였다.
파지미드(phagemid) 벡터로서, pComb3X (GenBank Accession No. AF268281)는 두개의 리보좀-결합 사이트 및 시그널 펩티드를 포함하고 있다. 개별의 Fd 및 경쇄는 페리플라즘으로 이동하여 이곳에서 조립되어 파지 파티클의 표면상에서 디스플레이된다. 각 중쇄가변 및 경쇄가변 유전자 패밀리에 대한 5' 프라이머와 IgG H 사슬과 κ또는 λ경쇄에 대한 3' 불변영역 프라이머를 선행기술에 기술된 방법에 따라 합성하였다 (Barbas et al., A Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). 전체 길이 Fab PCR 산물을 클 로닝하는데 이용되는 파지 디스플레이 벡터의 5' 및 3' 말단 상에 비대칭의 Sfi I 제한효소(restriction endonuclease) 사이트가 있다 (Andris-Widhopf et al., J. Immunol. Meth., 242:159, 2000).
약 1500bp의 최종 산물을 정제한 다음, 이를 pComb3X 벡터에 삽입하였다. Fab 인서트(insert)를 함유하는 재조합 pComb3X로 XL-1/Blue(Stratagene) 콤피턴트 세포(competent cell)를 형질전환하였다. 파지미드를 함유하는 XL-1/Blue 세포가 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene)로 감염시키면, Fab를 코딩하는 DNA를 가지는 패키지화된 파지의 생산이 가능하였다.
(2) 특이적 Fab 클론의 선별 및 분리된 클론의 특징 결정
히스톤(Roche)에 특이적으로 결합하는 클론의 선별은 종래기술에 따라 수행하였다 (Barbas et al., 2001; Andris-Widhopf et al., 2000). 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트(Costar)를 0.1M NaHCO3, pH 7.6에서 5㎍/ml 히스톤으로 약 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척한 후, TBS(Tris-buffered saline; 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl)에 녹인 5%의 BSA(bovine serum albumin)로 상온에서 두 시간동안 블록하였다. 플레이트를 TBS로 한번 세척한 후, 40㎕의 신선하게 준비된 파지 파티클, 5㎕의 10% BSA, 및 5㎕의 10×TBS를 첨가한 다음, 혼합물을 두시간동안 37℃에서 인큐베이트하였다.
이후에, 웰을 0.5% Tween 20 (TBST)를 함유하는 TBS로 다섯번 세척하고, 50㎕의 0.1M HCl/글리신(pH 2.2)으로 상온에서 두 번에 걸쳐 인큐베이트함으로써 결 합된 파지 파티클을분리하였다. 상기 분리된 파티클을 15㎕의 1M Tris/HCl(pH 8.0)를 첨가하여 중화시킨 다음, 중화된 115㎕의 파지 파티클에 활발하게 성장하는 XL-1/Blue 세포(Stratagene) 2ml를 첨가한 후, 혼합물을 상온에서 15분동안 방치하였다.
다음으로 6ml의 카베니실린(carbenicillin) 50㎍/ml 및 테트라싸이클린(tetracycline) 20㎍/ml을 함유하는 SB(Super Broth; 30g의 트립톤, 20g의 이스트 추출물, 10g Mops/l, pH 7)를 첨가하고, 세포들을 1ml의 VCSM13에 첨가한 후, 37℃에서 두 시간동안 성장시켰다. 카베니실린/테트라싸이클린을 함유하는 SB를 1ℓ플라스크에서 최종부피가 100ml이 되도록 첨가하였다. 37℃에서 두 시간후에, 카나마이신(kanamycin)(50㎍/ml)을 첨가하고 배양물을 밤새도록 37℃에서 성장시켰다. 성장 종료후에 15분 동안, 4℃에서 3000g으로 원심분리하여 배양물을 분리하였다. 상등물에 PEG-8000 (4%) 및 NaCl (3%)을 첨가하고, 그 혼합물을 30분동안 얼음상에서 인큐베이트하였다.
다음으로, 15분 동안, 4℃에서 15,000g으로 원심분리한 다음, 상등물을 제거하고, 파지 펠렛을 2ml의 1% BSA/TBS에서 다시 부유시켰다. 부유된 용액은 2차 라운드 패닝(panning)에 이용하였다. 2차 라운드의 패닝후에, 파지 상등물 및 파지미드 DNA를 회수하였고 상등물을 파지 ELISA에 사용하였다.
(3) 파지 ELISA
파지 상등물은 항원에 대한 항체 결합 특이성에 근거를 두고 선별하였다. 마 이크로타이터 플레이트는, 4℃에서 밤새도록 0.1M NaHCO3(pH 7.6)에 녹인 5㎍/ml의 히스톤으로 코팅하였다. 5% BSA/TBS로 블로킹한 후, 파지 상등물은 웰에 이중으로 첨가하였고, 플레이트는 37℃에서 두 시간동안 인큐베이트하였다. 이후에 플레이트를 TBST로 여섯번 세척하고, 37℃에서 1시간동안 5% BSA/TBS에 희석된 HRP(horseradish peroxidase)-결합 항-M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 반응시켰다. 플레이트를 TBST로 여섯번 세척한 후에, 50㎕의 TMB(tetramethyl benzidine) 기질(ZYMED)과 반응시킨 다음, 50㎕의 1M HCl로 반응을 중지시켰다. 최종적으로, ELISA reader ELX 808 IU (BIO-TEK)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
(4) Fab 가변영역 유전자의 시퀀싱
파지 ELISA에서 양성 클론으로부터의 파지미드 DNA를 Sfi I 제한효소로 잘라 삽입된 DNA 크기를 분석한 다음, 자동 시퀀서(sequencer)를 이용하여 시퀀싱하였다 (Biocore Technology). 서열 데이터는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 및 DNAPLOT (V BASE)를 이용하여 분석하였다. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 위한 프라이머들은 하기와 같다:
서열번호 11 (중쇄가변영역): 5'-ACCTATTGCCTACGGCAGCCG-3'
서열번호 12 (경쇄 가변영역): 5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3'
(5) 가용성 Fab의 제조
파지 코트 단백질 pⅢ를 포함하지 않는 가용성 Fab를 생산하기 위하여, 앰버(amber) 코돈을 정지코돈으로 인식하는 비억제 세포주인 일렉트로콤피턴트 TOP10F' 세포(Invitrogen)를 파지 Fab를 함유하는 파지미드로 형질전환시켰다. 개별의 콜로니는 37℃에서 카베니실린, 테트라싸이클린 및 20mM의 MgCl2를 포함하는 SB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.4~0.5가 될 때까지 배양하였다.
1mM 이소프로필 티오갈락토피라노시드(isopropyl thiogalactopyranoside)의 존재하에 30℃에서 밤새 세포를 배양함으로써 Fab 발현을 유도하였다. 배양 종료 후 세포를 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 매 리터 배양물당 10ml 아이스-콜드 TES 버퍼 (0.2M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 0.5M 수크로스)에 다시 부유시켰다. 다음으로 증류수로 1:3 희석한 아이스-콜드 TES 버퍼를 첨가하고, 혼합물을 30분동안 얼음에서 인큐베이트하였다. 그 다음으로 혼합물을 20분동안 15,000g에서 원심분리하고, 상등물을 가용성 페리플라즘 추출물로서 이용하였다. 가용성 Fab는 발현 유도된 세포배양 상등액으로부터도 수득하였다.
(6) 가용성 Fab의 면역블롯 분석
가용성 Fab를 15% SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF(polyvinylidene fluoride)막 (Millipore)으로 전기영동적으로 옮겼다. 막을 상온에서 1시간동안 5% 스킴 밀크/TBST로 블록한 다음, TBST로 세척한 후, 1% 스킴 밀크/TBST 내에서 1:1000로 희석된 항-인간 IgG (Fab 특이적) mAb-HRP (Sigma)로 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 다음으로 막을 TBST로 더 세척하고, 면역반응성 단백질은 ECL 시약 (Amersham Pharmacia)으로 검출하였다.
히스톤과 결합하는 가용성 Fab의 면역블롯팅 분석을 위하여, 개별의 히스톤(Roche)은 15% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. Fab 반응성 분석을 위하여, PVDF 막상에서 분리된 히스톤을 가용성 Fab와 함께 인큐베이트하였다.
(7) 히스톤 결합을 위한 직접 결합 ELISA
파지 상등물 대신에 가용성 Fab을 히스톤 코팅된 마이크로타이터 웰에 인큐베이트한 점을 제외하고 파지 ELISA에서 설명되었던 바와 같은 방법으로 직접 결합 ELISA를 수행하였다. 결합된 Fab를 1% BSA/TBS에서 1:40,000의 비율로 희석된 비오틴 결합 항-인간 염소 IgG(Sigma) 및 스트렙타비딘(streptavidin)-알카린 포스파타제(Sigma)와 반응시켰다. 알카린 포스파타제 기질을 각 웰에 첨가한 후, 405nm에서 흡광도를 ELISA reader ELX 808 IU (BIO-TEK)로 판독하였다.
실시예 2: 인간 항히스톤 항체의 서열 분석
인간 항히스톤 mAb의 구체적인 분자구조를 분석하기 위하여, SLE 환자의 PBL로부터 정제된 RNA에서 생성된 cDNA를 이용하였다. 먼저 파지 디스플레이에 의해 히스톤 H2A 및 H2B에 특이적인 4개의 mAb(SLEhis16; SLEhis18; SLEhis19; 및 SLEhis22)를 생성하고, 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역 DNA 서열을 결정하였다. 이중 항원결합 효율이 가장 좋은 SLEhis22은 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역의 DNA 서열이 각각 서열번호 3 및 서열번호 4이었다. SLEhis22는 인간에서 가장 큰 유전자 패밀리인 VH3 유전자 패밀리를 이용하고, VKIII 유전자 패밀리의 A27 멤버(member)로부터 유래된 것이다 (표 1 참조).
Fab clone VH gene usuage CDR3-VH length (a.a) IP of VH VL gene usage CDR3-VL length (a.a) IP of VL
VH family DH JH VL family JL
SLEhis16 4-59 D3-3 JH6 17 8.6 O8 JK3 9 5.1
SLEhis18 5-51 D6-19 JH4 11 6.1 L25 JK2 9 8.7
SLEhis19 3-33 D4-23 JH1 12 9.0 L6 JK1 8 9.1
SLEhis22 3-33 Unknown JH5 10 9.3 A27 JK1 9 8.7
실시예 3: 항체 또는 그 단편의 특징
(1) 일차 구조 분석
상기 mAb에 의해 이용된 유전자 단편의 점라인(germline) 대칭파트(counterparts)와의 비교를 통하여, CDR 혹은 FR(framework region) 양쪽에서 높은 비율로 돌연변이가 일어난 다른 mAb와 달리, SLEhis22 중쇄 가변영역은 CDR에서는 치환돌연변이 혹은 사일런트(silent) 돌연변이가 없고, 단지 4 가지의 치환돌연변이를 FR에서만 함유하는 것을 알 수 있었다 (표 2).
No. of clones (isotypes) Identity to GL (%) No. of mutation R/S ratio
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR’S FR’S
R S R S R S R S R S
SLEhis16 VH 96 2 0 0 0 1 1 1 1 1 4 1/1 4/5
SLEhis18 VH 91 1 3 0 0 0 0 7 2 5 4 7/2 6/7
SLEhis19 VH 96 1 0 0 1 1 0 1 1 3 1 1/2 5/1
SLEhis22 VH 98 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0/0 4/0
SLEhis16 VL 97 0 1 0 0 1 1 2 0 1 0 2/0 2/2
SLEhis18 VL 92 3 1 3 2 0 3 0 0 3 1 3/2 6/5
SLEhis19 VL 95 0 0 4 0 0 0 1 0 2 3 5/0 2/3
SLEhis22 VL 97 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1/0 1/2
SLEhis22 mAb 중쇄 가변영역 유전자 및 점라인 유전자들 사이의 유사성은 98%로 다른 mAb에 비해 높았고, 경쇄 가변영역 유전자에서의 점라인 유전자와의 유사성은 97%로 높았다. SLEhis22 mAb 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 유전자의 CDR에서 전체적인 R/S 비는 0/0 및 1/0이었고, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 유전자의 FR에서 전체적인 R/S 비는 4/0 및 1/2이었다.
항체의 서열분석결과, 중쇄가변 및 경쇄가변 영역은 전체에 음으로 하전된 많은 아미노산 잔기(아스파테이트 및 글루타메이트)를 포함한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 및 도 2). 도 1은 항 히스톤 mAbs의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 도시한 것이다. R 돌연변이에 관련되는 잔기들은 이탤릭체로 나타냈고, 점라인(germline) 서열과 동일한 잔기는 대시(-)로 나타냈다. EMBL/GenBank 접근번호는 다음과 같다: SLEhis16: AY569442; SLEhis18: AY569444; SLEhis19: AY569446; 및 SLEhis22: AY569448. 도 2는 항 히스톤 mAbs의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 도시한 것이다. R 돌연변이에 관련되는 잔기들은 이탤릭체로 나타냈고, 점라인(germline) 서열과 동일한 잔기는 대시(-)로 나타냈다. EMBL/GenBank 접근번호는 다음과 같다: SLEhis16: AY569449; SLEhis18: AY569443; SLEhis19: AY569445; 및 SLEhis22: AY569447. 중쇄 가변영역의 CDR2 및 CDR3 대부분은 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다.
(2) 면역블롯팅을 통한 결합 특성의 결정
mAb의 결합특성을 확인하기 위해, TOP10F' 세포를 파지 Fab를 함유하는 파지미드로 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포에서 유전자 발현을 유도한 다음, 가용성 Fab를 배양 상등액 또는 페리플라즘의 추출물로부터 수득하였다.
다음으로, 개별 히스톤에 대한 Fab의 결합특성은 면역블롯팅에 의하여 분석하였다. Fab의 식별되는 분자량은 약 27kDa이었다. 도 3은 히스톤과 결합하는 가용성 Fab의 면역블롯팅 분석을 도시한 것이다. 히스톤 H1(레인 1), H2A(레인 2), H2B(레인 3), H3(레인 4), 및 H4(레인 5)는 SDS-PAGE로 분리하였다. (A)는 분리한 히스톤을 쿠마시 브리언트 블루로 염색한 결과 사진이고, (B)는 SLEhis22로부터의 가용성 Fab를 이용한 면역블롯팅으로 분석한 결과사진(B)이다.
도 3의 (A)에 나타난 바와 같이, 히스톤 H2A, H2B 및 H3을 포함하는 레인에서, 15~20kDa의 주 밴드가 있었고, 미확인된 마이너 밴드가 높은 분자량 위치에 있었다. 히스톤 H1은 30kDa 보다 약간 큰 분자량 위치에서 주 밴드로 검출된 반면, 히스톤 H4의 주밴드는 15kDa이었다. 개별 히스톤과의 가용성 Fab의 반응성은 도 3 의 (B)에 나타낸 바와 같다. SLEhis22는 H2A, H2B 및 H3과 강하게 반응하였고, H1 또는 H4와는 매우 약하게 반응하였다. 동일한 양상이지만 전반적으로 약한 반응성이 다른 mAb에서도 얻어졌다.
(3) ELISA를 통한 결합 특성의 결정
본 발명에 따른 SLEhis22 항체의 결합특성을 좀 더 알아보기 위하여, 개별 히스톤을 마이크로타이터 플레이트에 코팅되는 항원으로 이용한 직접 결합 ELISA를 수행하였다. 마이크로타이터 플레이트 웰(microtiter plate well)은 각각의 히스톤 또는 혼합된 히스톤으로 코팅하였고, 각 mAb로부터 얻은 가용성 Fab와 인큐베이트하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항히스톤 mAb(SLEhis22)는 상대적으로 H3에 약한 결합을 보였고, 히스톤 H2A에 가장 강한 결합을 보였으며, 그 다음은 H2B에 강한 결합을 보였다. 반면, 히스톤 H1, H4, 또는 이중나선 DNA에는 결합하지 않았다. 본 발명에 따른 항히스톤 mAb의 H3 또는 전체 히스톤으로의 결합은 H2A 및 H2B로의 결합에 비하여 약하였다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 항히스톤 mAb(SLEhis22)는 H2A 및/또는 H2B에 특이적으로 강하게 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 히스톤 Ｈ2Ａ 및/또는 Ｈ2Ｂ에 특이적인 항히스톤 인간 모노클로날 자가항체 및 그 단편을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 항체 및 그 단편은 SLE 환자의 PBL로부터 유래된 히스톤 H2A 및 H2B에 특이적인 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 함유하므로 인간의 SLE를 비롯한 자가면역질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 경쇄 가변영역으로 가지고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 중쇄 가변영역으로 가지는 항체 또는 그의 항원결합 단편 (Fab).
  2. 제1항에 있어서, 히스톤 H2A 및/또는 H2B에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원결합 단편 (Fab).
  3. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원결합 단편 (Fab)을 코딩하는 DNA 서열.
  4. 제3항에 있어서, 경쇄 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 서열이 각각 서열번호 3 및 서열번호 4임을 특징으로 하는 DNA 서열.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 항체의 경쇄 가변영역.
  6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항체의 중쇄 가변영역.
  7. 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 히스톤H2A 및/또는 H2B 특이적 항체의 중쇄 CDR.
  8. 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 히스톤 H2A 및/또는 H2B 특이적 항체의 경쇄 CDR.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 중쇄 CDR로 가지며, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 경쇄 CDR로 가지는 항체 또는 그의 항원결합 단편 (Fab).
  14. 삭제
  15. 삭제
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