JPH08504080A

JPH08504080A - 変性された抗体、それに関連する生成物及び方法

Info

Publication number: JPH08504080A
Application number: JP5514647A
Authority: JP
Inventors: ポールウィンター，グレゴリー; ジョセフカー，フランシス; ジョセフハリス，ウィリアム
Original assignee: スコットゲンリミティド
Priority date: 1992-02-19
Filing date: 1993-02-19
Publication date: 1996-05-07
Also published as: CA2130452A1; DE69331903T2; EP0629240B1; DE69331903D1; GB2278604A; GB9203459D0; WO1993017105A1; AU3570193A; EP0629240A1; JP2004073210A; GB9416347D0; CA2130452C; GB2278604B

Abstract

(57)【要約】本発明は、生来の抗体において１又は複数の対応する体細胞変異誘発された残基を置換する選択された生殖系アミノ酸残基を含むことによる、実質的に免疫不活性である変性された抗体に関する。そのような抗体の鋼製に使用するための遺伝を製造する方法においては、生来の抗体における１又は複数の体細胞変異誘発されたアミノ酸残基が変性のための適切な候補体として同定される。１又は複数の体細胞変異誘発されたアミノ酸残基を置換するための選択された生殖系アミノ酸残基をコードするヌクレオチドコード配列が製造される。変性された抗体は、抗体に特異的抗原を結合する能力を付与する相補性決定領域（CDR）を含んで成る可変（Ｖ）領域；及び選択され、且つ卓越した生殖系枠組み構造を有する。そのような抗体の調製に使用するための遺伝子を製造する方法においては、（ｉ）特異的抗原に対する特異性を有するCDRをコードするCDRコードヌクレオチド配列を得；そして（ii）それらのCDRコードヌクレオチド配列と選択された生殖系枠組み構造をコードする枠組み構造コードヌクレオチド配列とを組合す段階が存在する。

Description

【発明の詳細な説明】変性された抗体、それに関連する生成物及び方法本発明は、変性された抗体、そのような抗体に関連する生成物及び方法に関する。同じか又は異なった種の既知に生殖系（germ-line）同等物の配列への組換えD NA技法による一定の抗体配列の転換のための方法が記載されている。モノクローナル抗体への組換えDNA技法の適用は、実施されるべきそれらの抗体における人工の改良を可能にして来た。特に、ヒトヘルスケアーにおける改良された適用を有する組換え抗体が創造されて来た。Kohler and Milstein（Kohle r，G．and Milstein，C.，Naturo，256，495〜497，1975）のハイブリドーマ技法は、多くのゲッ歯動物のモノクローナル抗体の創造のために使用されて来たが、しかしヒト抗体を創造するためにこの技法を使用することはひじょうに困難であることがわかった。 EP第125023号（Genentech）及びEP第120694号（Celltech）は、異なった種及び源からの抗体可能（Ｖ）及び不変（Ｃ）領域を含んで成る紐換えDNAを通してのキメラ性抗体の改良を開示する。典型的には、この技法は、マウスＶ領域及びヒト不変領域を有する医薬抗体、たとえばLoBuglio，A.F.など、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，86，4220〜4224，1989により記載される抗体の創造に適用されて来た。それにもかかわらず、そのような抗体における外来性Ｖ領域は、免疫応答を誘発する傾向があり（Bruggemann，M.など、J.Exp.Med.，170，2153〜2157，1 989を参照のこと）、従って治療効果を制限する。代わりのキメラ性抗体はGB第2188638号（Winter）により教授されており、それによれば、抗体Ｖ領域は、異なった源からの相補性決定領域（CDR）及びＶ領域枠組み構造から成る。そのような再−形状化された（CDR−移植された）抗体を生成するための方法は、ゲッ歯動物のCDR、ヒトＶ領域枠組み構造及びヒト不変領域を組込む医薬抗体の創造に適用されて来た（Riechmann，L．など、Nature ，332，323〜327，1988）。従って、そのような抗体におけるＶ領域は、これまで記載されたキメラ性抗体におけるその対応する領域よりもヒト患者において免疫応答をほとんど誘発しない。生存補乳類における抗体産生の固体発生は複雑な工程であるが、それにもかかわらず、たとえばRoitt，I.，Essential Immunology，BlackMell Scientific Pu blishersに十分に記載されている。すべての補乳類は、Ｖ領域遺伝子の複数のセグメントを含んで成る免疫グロブリンＨ及びＬ鎖に対応する遺伝子座を有する。たとえば、複数の不変領域遺伝子の他に数500個の免疫グロブリンＨ鎖遺伝子、いくつかの連合（“Ｊ”）及び多様性（“Ｄ”）セグメント（後者はＨ鎖のみに利用される）が存在する。初期の生殖系の配置は、主にＢ細胞を除いて、ほとんどの細胞に保存されており、ここで細胞が成熟するにつれて、免疫グロブリンＨ及びＬ鎖Ｖ領域は組換え出来事にゆだねられ、それによって特定のＶ領域遺伝子がＤ（Ｈ鎖のみ）、Ｊ及び不変領域に並置されるようになる。結合（組換え）の正確な点においてある“ 滑り（slippage）”により結合されるセグメント及びドメインのひじょうに多くの数の過変異が、未熟Ｂ細胞により示され得る種々の一次抗体分子に生じる。それにもかかわらず、それらの抗体分子は、アミノ酸配列が生殖系Ｖ領域遺伝子によりコードされる配列に応対するＶ領域を含む。そのような生殖系Ｖ領域抗体分子は生物の生命において初期に免疫システムに提供されたものとして推定され、そして従って“自己（self）”として認識される。抗体産生未熟Ｂ細胞の抗原への続く暴露に続いて、Ｈ及びＬ鎖免疫グロブリンＶ領域遺伝子は、成熟Ｂ細胞生成の高い親和性抗体が誘導する体細胞変異出来事を受ける。従って、それらの配列は、初期生殖系配置から変動し始める。本発明は、Ｂ細胞の成熟におけるＶ領域遺伝子の体細胞変異の間、CDRが変異誘発するのみならず、またＶ領域枠組み構造（ここで、残基の大部分はいづれか有意な程度に結合する抗原に関連し、又はその抗原に影響を及ぼさないと思われる）が変異誘発する知識に一部基づかれる。Ｖ領域枠組み構造におけるそのような明らかにランダムな体細胞変異の結果が、生物による“自己”の代わりに“外来性”として認識され得るアミノ酸配列を含む“非生殖系”枠組み構造を有する抗体の創造である。さらに、本発明はまた、個々のCDR（異なった抗体間でそれらの過度変動性に基づいて定義される）は体細胞変異に広範的にゆだねられるが、個々の抗体分子は、合計のCDRアミノ酸配列の一部のみを用いて抗原に結合する発見に一部基づかれる。従って、CDR配列の一部は抗原結合に関して余剰であり、そしてランダム変異がそのような領域内に生成し、そのアミノ酸配列は抗原結果に対して有害な効果を有さないが、しかし“外来性”実在物として認識され得る。従って、この知識に基づけば、本発明は、生来の抗体における体細胞突然変化誘発された１又は複数の対応する残基を置換する１又は複数の選択された生殖系アミノ酸残基を含んで成る変性された抗体を開示する。それらの抗体は、特定抗原及び主に生殖系枠組み構造配列を結合する能力を有する抗体を供給するCDRを含んで成るＶ領域を有する。本発明はまた、そのような抗体の調製に使用するための遺伝子を製造するための方法も提供する。遺伝子はＨ鎖及び／又はＬ鎖をコードする。場合によっては、CDRは生殖系配列に対応する残基を有するかも知れない。その遺伝子は抗体を製造するために発現工程に使用され得、そして従って、同じか又は他の種の生殖系同等物への１つの種の抗体の転換及び生殖系同等物中への組換え（たとえば再形状化された）抗体の転換を提供する。生来の抗体における１又は複数の対応する体細胞変異誘発された残基を置換する選択された生殖系アミノ酸残基を有する変性された抗体、及びより特定には、選択されたＶ領域及び主に生殖系枠組み構造並びに任意に、生殖系CDR残基を有する変性された抗体、並びにそのような抗体を生成するための方法は、科学又は特許文献にはこれまで記載されたことはない。組換えキメラ性抗体（たとえば、Rudikoff，S．et al.，Proc，Natl．Acad．S ci．USA，79，1979-80，1982；Bruggemann，M．et al.，EMBO J.，1，629-634， 1982；Oi，V.T．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80，825-829，1983；Ne uberger M.S．et al.，EMBO J.，2，1373-1378，1983；Boulianne，G.L．et al. ，Nature，312，643-646，1984；EP125023（Genentech）；Neuberger M．et al. ，Nature314，268-270，1985に記載される）において、Ｖ領域遺伝子フラグメントは、成熟高親和性モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞に由来する。従って、生殖系Ｖ領域に近い未熟抗体は予想されなかった。同様に、組換え再形状化された（CDR−移植された）抗体（たとえば、humanis ed antibodies described in Jones，P.T．et al.，Nature，321，522-525，198 6；Riechmann，L. et al.，1988，loc．cit.；Verhoeyen，M．et al.，Science ，239，1534-1536，1988：Queen，C．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86 ，10029-10033， 1989；Tempest，P．et al.，Biotechnology，9，266-271，1991；Gorlnan，S.D ．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，4181-4185，1991；Co.，M.S．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，2869-2873，1991，J．Adair et al.，P CT/GB90/02017に記載される）においては、ヒトＶ領域枠組み構造は成熟抗体又は骨髄タンパク質に由来するが、CDRは成熟高親和性モノクローナル抗体を生成するネズミハイブリドーマ細胞に由来した。キメラ性又は再形状化された抗体についてのそれらの記載から、生殖系Ｖ領域枠組み構造の使用を推定できるものではなかった。Padlanなど、（Mol．Immunol ogy 28 No.415 p489-498（1991））は、分子の抗原性はその表面に依存するので、同種抗体の暴露された残基の決定及び、それと宿主抗体に通常見出される残基との置換は認識の問題及び従って、抗原性の問題を減じる前提に基づかれる“再 −表面化（Re−surfacing）（又は“ベニア化（veneering）”）技法を記載する。この可能性は、マウス抗体の人間化に関して探究されて来た。しかしながら、Ｂ細胞成熟の間、体細胞成熟を受けた抗体の特徴を示す他の種の残基と暴露された残基との置換えの教授が存在する。その教授は、生殖系Ｖ領域枠組み構造配列の使用に拡張しなかった。さらに、Padlanなど、により記載されたアプローチは、部分的配列のみ、すなわち暴露された表面残基のみの使用を包含する。生殖系アミノ酸残基、たとえば本明細書に開示されるようなＶ領域枠組み構造の使用に関しての関係は存在しなかった。従って、本願出願の開示は、たとえば治療的に使用される場合、抗体の免疫原性効果を最少にするために、選択された生殖系アミノ酸残基、たとえば特に生殖系骨格を用いて、そのような抗体の“再表面化”を提供する。本発明は、ひじょうに低い抗原性を有する抗体（及びそれらの生成方法）を提供する。抗体は同種抗体に由来し、そして微量の宿主タイプの主な生殖系Ｖ領域枠組み構造配列を有する。そのような方法は、暴露された（表面）枠組み構造残基の置換をほとんど不可避的に包含する。従って、問題の抗体のための生殖系Ｖ領域枠組み構造を利用する本発明の方法は、生来の宿主抗体表面を有する抗体の容易且つ効果的な創造を提供する。成熟Ｂ細胞を収穫するために選択された抗原をヒトに注射することは許容されるとは思われないので、大部分のヒトモノクローナル抗体はリンパ球培養物のインビトロ抗原感作又はhu−SCIDマウスの免疫化のような技法により創造される。そのような技法においては、比較的少ないか又はまったく存在しない抗体成熟が、EBV形質転換を通しての不滅化又は体細胞融合の前に生じる。これは、生殖系Ｖ領域枠組み構造及びまた、高い程度に生殖系CDRを有する抗体の偶然な生成をもたらす。しかしながら、ほとんど又はまったく、体細胞成熟及び抗体成熟は生じず、そしてＶ領域遺伝子のレパートリーに制限されたサズが存在するので、それらの抗体は抗原に対して低い親和性をたぶん有するであろう。さらに、生殖系配列のための特定の選択は存在していない。特に、生殖系Ｖ領域の配列は知られておらず、そしてモノクローナル生成細胞系が確立された後に単に決定され得る。対照的に、本発明の方法は、生来の抗体における１又は複数の対応する体細胞変異誘発された残基を置換する選択された生殖系アミノ酸残基を有する変性された抗体の計画的構成を提供する。その選択された生殖系アミノ酸残基は既知の生殖系Ｖ領域枠組み構造配列を含んで成る。本発明の方法は、生殖系Ｖ領域枠組み構造に高い親和性結合を付与する体細胞変異誘発された成熟CDRの移植を提供する。そのような構造体はハイブリドーマによる感作及び不滅化又は他の技法により生成され得ない。これまで論じられたように、たとえある抗体成熟が存在し、それによって親和性を改良したとしても、体細胞変異はCDRのみに制限されず、そして変異はまた、枠組み構造領域にも生じ、その結果、それらの配列は元の生殖系の配列から相当に逸脱する。従って、成熟が存在しない場合、その結果は生殖系枠組み構造領域を有するひじょうに低い親和性抗体をもたらす。他方、成熟が生じた場合、その結果は高い親和性抗体をもたらすが、しかし枠組み構造領域は生殖系配列から逸脱する。さらに、CDR及びＶ領域枠組み構造は同じ程及びたぶん同じ個々の源に起因したであろう。本発明の抗体及び生成方法においては、選択された生殖系アミノ酸残基は生来の抗体の源／種よりもむしろ異なった個々の源／種に起因する。たとえば、CDR 配列及び生殖系Ｖ領域枠組み構造配列は、異なった個々の源に起因し、そして実際、たぶん起因、そしてまた、異なった種にも起因する。本発明は、特に、疾病の治療への使用又はインビボ診断のために抗体に適用である。反復された投与に基づく疾病の部位への抗体分子の好結果を産む標的決定は、ほとんど又はまったく免疫反応を誘発しないそれらの抗体に依存する。それらの抗体の生殖系Ｖ領域含有率の最大化は、それらの反復投与に応答していづれの免疫反応も最少にするであろう。従って、それらの抗体は、たとえば慢性疾患の処置においてより使用されるであろう。また、いくらかの成熟抗体Ｖ領域枠組み構造はヒトVHIII遺伝子ファミリーにおいてプロテインＡ結合のような生物学的活性を有するように思えることも注目されるべきである。自己抗体は活性のもう１つの例を提供し、たとえばリウマチ様関節炎において、自己抗体は免疫グロブリン分子のFcに結合する。ヒト多関節炎自己抗体のVK遺伝子は、正常な個人のVKIIIファミリーの抗体に比較して、抗体GM60及び生殖系配列K562の両者とは枠組み構造３（フェニルアラニン〜バリン）において残基62のみで異なっているように思われる。それらの抗体のCDRは同一である。これは、Ｖ領域における少々の枠組み構造置換さえ可能性ある効果をもたらすことを示唆する。同様に、Ｖ領域枠組み構造はまた、外部抗原の類似体（mimics）を担持する。たとえば、16.6により定義される通常のイディオタイプは、特定の枠組み構造の単一の体細胞変異により偶然に創造される。従って、不必要なＶ領域枠組み構造変異は有害であり、そして従って、生殖系Ｖ領域枠組み構造の使用及び最少の配列変化は有益であろう。本発明は、生来の抗体における１又は複数の対応する体細胞変異誘発された残基を置換する１又は複数の選択された生殖系アミノ酸残基を含んで成る変性された抗体を提供する。その変性された抗体は、前記生来の抗体の抗原結合能力に不可欠である１又は複数のアミノ酸残基を保存する。変性された抗体は、特定抗原を結合する能力を有する抗体を供給する相補性決定領域（CDR）を含んで成る可変（Ｖ）領域；及び選択され、そして卓越した生殖系枠組み構造を有する。 CDRは生殖系CDRコード配列からの１又は複数の残基；及びＢ細胞変異の間、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域遺伝子からの１又は複数の残基を含んで成る。その枠組み構造は、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域遺伝子からの１又は複数の残基を含んで成り、そしてここで、前記残基は抗体の抗原結合能力に対して不可欠である。選択された生殖系枠組み構造は、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造に対して相同であり得る。この場合、抗原Ｖ領域遺伝子はCDRを含むことができる。 CDR及び選択された生殖系枠組み構造は異なった種に起因する。選択された生殖系枠組み構造は抗体の外表面を形成できる。本発明はまた、適切な候補体として、生来の抗体における１又は複数の体細胞変異誘発されたアミノ酸残基を同定し；そして前記同定された１又は複数の体細胞変異誘発されたアミノ酸残基を置換するように選択された生殖系アミノ酸残基をコードするヌクレオチドコード配列を製造することを含んで成る、変性された抗体の調製に使用するための遺伝子を製造するための方法を提供する。その方法は、前記ヌクレオチドコード配列が生来の抗体の抗原結合的に不可欠である１又は複数のアミノ酸残基をコードするような前記コード配列を製造することを含んで成る。本発明はまた、上記のような変性された抗体の調製に使用するための遺伝子を製造するための方法も提供し、ここで前記方法は、次の段階：（１）CDRをコードするCDRコードヌクレオチド配列を得；そして（２）それらのCDRコードヌクレオチド配列と選択された生殖系枠組み構造をコードする枠組み構造コードヌクレオチド配列とを組合すことを含んで成る。その方法は、CDRコードヌクレオチド配列における１又は複数の残基を生殖系C DRコード配列からの対応する異なった残基により置換する段階を包含する。前記方法は、前記枠組み構造コードヌクレオチド配列における１又は複数の残基を、Ｂ細胞成熟の問、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域の枠組み構造からの異なった残基により置換する段階を包含し、そしてここで、前記異なった残基は抗体の抗原結合能力のために不可欠である。前記方法は、Ｂ細胞成熟の間、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造に対する相同性に基づいて生殖系Ｖ領域の枠組み構造を選択することを含んで成る。前記方法は、Ｂ細胞成熟の間、体細胞変異を受け、そして前記CDRをコードする抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造に対する相同性に基づいて生殖系Ｖ領域の枠組み構造を選択することを含んで成る。 CDRコードヌクレオチド配列は生殖系Ｖ領域のために遺伝子上に移植され得る。その枠組み構造コードヌクレオチド配列は、Ｂ細胞成熟の間、体細胞変異を受けた抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造をコードするヌクレオチド配列を置換する。前記遺伝子は抗体Ｈ鎖、抗体Ｌ鎖又はそのフラグメントをコードする。前記方法は、異なった種に由来するCDRコード及び枠組み構造コードヌクレオチド配列を選択する段階を包含する。本発明はまた、上記のような方法により得られる遺伝子を発現することを含んで成る方法を提供する。本発明はまた、成分として上記のような抗体を有する医薬又は診断調製物を提供する。本発明はまた、ヒト又は動物患者を処置するために上記抗体を用いることを含んで成る方法を提供する。本発明はまた、診断技法に上記のような抗体を用いることを含んで成る方法を提供する。ヒト枠組み構造のいづれかの生殖系同等物（たとえば、抗体人体化のための“ 制限された”又は“固定された枠組み構造”手段に都合良く使用されるNEWM及び／又はKOL（VH）及びREI（VK）可変領域枠組み構造）を包含するいづれかの生殖系可変領域が、本発明の方法に使用され得る。前記“固定された枠組み構造”アプローチは、ａ）問題の抗体のCDRが移植され；そしてｂ）元の抗体と同じレベルに抗原結合を保持するために不可欠であるそれらのネズミ枠組み構造残基を導入する、制眼された数のＶ領域生殖系同等物ヒト枠組み構造を用いることを包含する。人体適応化のためへの固定された枠組み構造を使用するこの手段は十分に確立されており、そして特許出願PCT/GB91/01554及びTompestP.など、Biotechnology 9，226〜271ページ（1991）に報告されている。 W090/07861においてProtein Design Labs及びPNAS 86（1989）10029〜10033ページにおいてQueenなどは、所望する特異性を有するネズミ抗体に基づいて人体適合された抗体の創造を教授する。初めに、ヒト可変領域がネズミ可変領域に対する最大の相同性に基づいて選択される。次に、ネズミCDRが、前記選択されたヒト可変領域においてヒトCDRを置換するために使用される。彼らはまた、ネズミCDRと相互作用すると思われるいくつかのネズミ枠組み構造残基の包含も教授した。従って、その得られる変性された抗体は所望する結合性質（元のネズミ抗体に由来する）を保持した。しかしながら、追加のネズミ枠組み構造残基が、ヒトに投与される場合、外来物として見なされる抗体に寄与する機会が存在する。 W090/07861は、マッチング、続くCDR機能及び可能な枠組み構造調篩のために生殖系可変領域の使用を教授する。従って、本発明の出順の教授に基づけば、生殖系可変領域（たとえばヒト生殖系可変領域）がたとえばネズミ抗体の可変領域への体細胞変異を受けた遺伝子の可変領域に対する実質的な相同性に基づいて選択され得る新規アブローチが提供される。本発明の範囲内の及び上記のような“固定された枠組み構造”アプローチは、置換のために使用されるCDRを含んで成るネズミ可変領域に対して最とも相同的なマッチを有さないＶ領域枠組み構造の限定された数の生殖系同等物を使用することにおいてWO90/07861の方法とは異なる。さらに、元の抗原と同じレベルの抗原結合性を保持するために不可欠であるそれらの必須の枠組み構造残基のみの組込みが存在する。感染性及び他のタイプの疾病の診断、予防及び処理のために最少の免疫性を有する変性された抗体の必要性が存在するので、生殖系Ｖ領域枠組み構造同等物（固定された枠組み構造又は他のもの）の手段と共に組合された、最少の枠組み構造及び／又はCDR変化の組合せが新しく且つ高い魅力的なアプローチを提供する。一定の環境下で、生殖系Ｖ領域枠組み構造は、外部抗原をまねるエピトープを担持することが知られ、又は担持すると思われる。この場合、そのようなエピトープを担持しないことが知られている生殖系Ｖ領域枠組み構造同等物を使用することが好ましい。たとえば“固定された枠組み構造”アプローチは都合良く使用され得る。次に、これは、最少の配列変化と共に、所望する結合特徴を有する“ 免疫−不活性（immonosilent）”抗体を生成する最良の機会を提供する。上記のような“免疫−不活性”抗体同等物を利用する相対的利益は、たとえば種々の実験用動物モデル、たとえばゲッ歯動物及び霊長類において抗体に対するインビボ応答、クリアランス時間、等を調査し、そして元の抗体についての同等の試験結果に、標準のＶ領域移植形（通用できる場合）及び生殖系同等物を比較することによって試験され、そして評価され得る。SCIDマウス及びインビトロ抗体培養システムがまた、特定形の抗体が免疫応答を誘発するかどうかについての比較データを得るために使用され得る。たとえば、ヒト適合された抗体が試験される場合、SCID−hnマウス又はインビトロヒト−リンパ球培養物がアッセイシステムとして使用され得る。同様に、患者の抗血清が処理の間、応答について試験され得る。適切に調節された類似するシステムが他の種について使用され得る。LoBug1io A.F．など、1989 前記により提示されるような動物モデルの使用が、それらの相対的Ｖ領域免疫性に関してモノクローナル抗体の予備臨床評価において助けになる。一定の抗体に同じ種の生殖系同等物を創造するための本発明の方法は次の基本的スケムを含んで成る。（ｉ）一定の抗体のＨ及びＬ鎖Ｖ領域ヌクレオチド配列が決定される。（ii）同じ種の抗体のＨ及びＬ鎖生殖系Ｖ領域配列がそのような予備決定された配列の収集から固定される。（iii）一定の抗体のＶ領域枠組み構造配列がその対応する生殖系Ｖ領域枠組み構造配列により置換される。（iv）場合によっては、一定の抗体のCDR配列内の個々の残基が、その対応する生殖系CDRからの個々の残基により、可能な限り置換される。本発明のもう１つの方法においては、１つの種の一定の抗体からのCDRが種々の種の抗体の生殖系Ｖ領域上に移植される。この方法は次の基本的なスケムを含んで成る。（ｉ）１つの種の一定の抗体のＨ及びＬ鎖Ｖ領域ヌクレオチド配列が決定される。（ii）種々の種の抗体のＨ及びＬ鎖生殖系Ｖ領域配列が、そのような予備決定された配列の収集から固定され又はそのような生殖系Ｖ領域を含んで成る予備構成された組換え体（固定された枠組み構造アプローチ）の収集から選択される。（iii）１種の種からの一定の抗体のＶ領域枠組み構造配列がもう１種の種のその対応する生殖系Ｖ領域枠組み構造配列により置換され、又は１種の種の一定の抗体のＶ領域からのCDR配列が種々の種の抗体のその対応する生殖系Ｖ領域上に移植される。（iv）場合によっては、１つの種の一定の抗体のCDR配列内の個々の残基が、種々の種の対応する生殖系CDRからの個々の残基により、可能な限り置換される。両者の方法における基本的スケムの段階（ｉ）に関しては、生殖系の形で創造される一定の抗体のためのＶ領域配列は、たとえばハイブリドーマ（又は骨髄種）に、一次Ｂ細胞の集団に、又は、他方、抗原結合により選択された特定抗体とＶ領域遺伝子の組合せライブラリーに由来する。上記両方法の基本的スケムの段階（ii）〜（iv）は、可能な限り高い生殖系配列の含有率を伴って、できるだけ高い親和性の生殖系抗体を必要により達成するために追加の操作を受ける。段階（ii）においては、従って、一定の抗体Ｖ領域にできるだけ密接に相同である生殖系Ｖ領域を、同じ種の相同グループ（たとえばKabat，E.A．など、Sequ ences of Proteins of Immunological Interest，US Dept of Health and Human Services，US Government Printing Officeにより定義されるのと同じサブグループ）から又は一定の抗体Ｖ領域に最っとも密接にマッチする生殖系種の相同グループから選択することが所望される。両方法に関しては、生殖系Ｖ領域遺伝子の選択は、集団においてほとんど又はまったく変動を有さない好ましい生殖系Ｖ領域遣伝子が選択されるように集団におけるそれらの遺伝子の対立遺伝子変動の頻度により影響されるであろうことが認識されるであろう。ある場合、コンセンサス生殖系配列（相同グループにおいてコンセンサスの生殖系配列である）を使用することは可能である（しかし、ほとんど所望されない）。段階（iii）においては、最終生殖系抗体の結合親和性をたぶん改良する一定の抗体からのいづれかのアミノ酸残基を保持することが所望される。これはたぶん、生殖系への転換の前、元の抗体から保持されているＶ領域枠組み構造残基を包含する。段階（iv）においては、抗原への結合において包含される一定の抗体からのCD Rにおける唯一のキー残基を保持することが所望される。ほとんどの場合、一定の抗体のＨ鎖CDR３残基の大部分が生殖系Ｖ領域Ｈ鎖CDR３に保持されるが、しかし他のCDRにおいては、少数のアミノ酸残基が生殖系抗体に保持されるべきである。両方法の基本的スケムからの段階（iv）は任意ではあるが、それは、CDRがまた生殖系である場合、好都合である。試験クローンのVH CDR３はユニークであるが（生殖系カウンターパーツは存在しない）、しかし他のCDRは生殖系遺伝子に比較して少数のアミノ酸置換を有するであろう。CDR１及び２におけるキー残基の維持は、バクテリオファージ表示技法（McCafferty，J.など.，Nature，348， 552〜554，1990）と共に組合される場合、面倒である必要はない。従って、たとえば所望する特異性を有する抗体のVH CDR３は、上記のような選択された生殖系Ｖ領域遺伝子中に移植され得、そして構造体が結合について試験される。CDR１及び２における変化が必要とされる場合、個々のCDRにおけるすべての変化を起こすように企画された混合されたオリゴヌクレオチドは、SUE-RCRによるＶ−遺伝子にアセンブルされ得る（Ho,S.N.など.，Gene，77,51〜59，1989）。次に、配列のレパ-トリーがファージ中にクローン化され、そしてライブラリーが製造される。次に、最高の親和性のファージ抗体が選択され、そして配列決定され、結合のために必要なCDR１及び２における置換が決定される。次に、適切な結合性質、すなわち生殖系からの最少の変化を有する配列が選択される。従って、基本的スケムへの追加の変性が現在の技法を用いてひじょうに容易に実施され得ることが見出され得る。たとえば抗体ファージ表示技法（McCafferty ，J.など.，1990前記）を用いて、生殖系残基を有する種々の数の置換を包含する一定の抗体からの個々のCDRの多くの変異体がスクリーンされ得る。同様に、生殖系枠組み構造における一定の抗体からの枠組み構造の多くの変動がまたスクリーンされ得る。実際、多くの異なったCDRの変異体、及び所望には枠組み構造の変異体を含むようにオリゴヌクレオチドの混合物を合成し、そしてたとえばPC R介在オーバーラップ拡張によりそれらのオリゴヌクレオチドをＶ領域遺伝子中にアセンブリーし、ファージ表示のためにベクター中にクローン化し、そしてアフィニティークロマトグラフィー及び／又は他のパンニング技法を用いて、高い親和性の抗体Ｖ領域を選択することが便利である。次に、選択された高親和性クローンが配列決定され、上記のような最少数の非生殖系残基を有するＶ領域を含んで成る変異体が同定される。当業者は、可変領域CDR又は枠組み構造における選択された生殖系アミノ酸配列への最少の変性が抗原への結合性を高めるために必要とされることを理解するであろう。CDRの一部が結合に寄与する程度に異なった抗体間に変動が存在するであろうことが理解される。これは、生殖系CDR配列を包含する異なった抗体の能力において差異が存在するであろうことを意味する。生殖系枠組み構造及び生殖系CDR配列は抗原結合に関連するCDR残基に対して同じ又は異なった種に起因することがまた好ましい。さらに、生殖系Ｖ領域は、同じ又は異なった種又は源からの種々の異なった不変領域に関連する。生殖系Ｖ領域は、関連する抗体不変領域ドメインにより又はそれによらないで生成され得、又は非抗体フラグメント、タンパク質、種々のラベル又は他の成分に融合される遺伝子又はタンパク質として生成され得る。Ｈ及びＬ鎖Ｖ領域枠組み構造におけるヒト生殖系配列、ヒト不変領域及び非ヒトCDR（但し、可能な場合、前記CDR内にヒト生殖系残基を有する）を含んで成る、医薬用途のための抗体が生成され得ることが本発明の特定の特徴である。本発明の方法は、生殖系Ｖ領域を有する抗体を創造するために多くの異なった手段を提供する。まず最初に、選択された生殖系Ｖ領域を含んで成るクローン化されたDNAフラグメントが複製可能ベクターに得られ、そしてそれらのＶ領域遺伝子におけるCDR配列が、特定の抗原結合（置換された抗体遺伝子の発現に起因する抗体において）を生成するために他の源からのCDR配列により置換され得る。第２に、存在する体細胞変異誘発された抗体遺伝子のＶ領域枠組み構造が、生殖系同等物への１又は複数の体細胞変異誘発された残基の置換により変性され得る。上記のように、本発明の方法は、特定の種に関連するすべての構造のためにＶ領域枠組み構造の単一の、又は制限された数の生殖系同等物を用いることができ（たとえばヒト適合化目的及びそれらの生殖系同等物のためへのNEWH及び／又は KOL VH及びREI Vと可変ドメインの使用）、又は代わりに、それぞれ個々の抗体のためにＶ領域枠組み構造の最良にマッチされた生殖系同等物を使用する。本発明は例示されるが、しかし次の例及び図により制限されない。第１図は、ヒト生殖系再形状化された（CDR−移植された抗体（“再形状化された”）Ｈ（VH）及びＬ（VK）鎖可変ドメインの前駆体ネズミ抗体Ｄ1.3（“ネズミ”）配列（Verhoeyenなど.，1988前記）に対する比較をなす。枠組み構造（ “FR１−４”）は、それぞれVH及びVKのために生殖系Ｖ及びＪ遣伝子H3HU26／JH ６及びK1HU12／JK4 に由来する。（H3HU26，K1HU12は、NBRF−PIRのデータベースの番号である）。第２図は、生殖系抗体による抗原結合のために必要なCDR配列のみをトランスファーするために生殖系CDRの変性を最少にするための方法論を例示する。段階（ａ）においては、生殖系VH及びVLドメインが適切なバクテリオファージ表示ベクター、たとえばFd−CAT1（McCaffertyなど.，1990,前記）上にアセンブルされる。段階（ｂ）においては、生殖系転換のための一定のモノクローナル抗体からのＨ鎖CDR３（VHCDR３）が、生殖系VHCDR３と置換され、そして得られた抗体可変ドメインがファージ表示又は一本鎖Fvフラグメントの単離及び結合の分析のいづれかにより試験される。段階（ｃ）においては、オリゴヌクレオチドの混合物が、一定のモノクローナル抗体からの対応する残基を有する、最少数の生殖系VH CDR１及びVHCDR２残基の置換をもたらすために使用される。次に、抗原に対して最良の結合性を生成する可変ドメインが、続くバクテリオファージの増殖ラウンド及び抗原によるパンニングを通して選択される。必要なら、次に段階（ｃ）は、CDR又は枠組み構造領域への追加の変性を導入するためにくり返えされ得る。第３図は、元のＤ1.3VH及びVK配列とマウス生殖系転換マウスモノクローナル抗体Ｄ1.3（第１図を参照のこと）との比較を示す。この場合、枠組み構造はそれぞれ生殖系Ｖ及びＪ遺伝子HVMS14／JH２及びKVMSK２／JK１に由来する。セクションａ）１及びｂ）１における第４図は、マッチされたヒト生殖系と元の再形状化された（ヒト適合された）同等物HuRSV19FNS抗体（Tempest P.など、 1991，前記）との比較を示す。この場合、生殖系枠組み構造は、それぞれVH及び VKのための生殖系遺伝子DP−68／JH6（Jomlinson I.など、1992，前記）及びHK1 37に由来する（GERMVH及びGERMVK）。さらに、生殖系転換RSV（RSVGLVH／VH）と元のヒト適合されたHuRSV19抗体及びマッチされた生殖系配列との比較が、製造される枠組み構造をさらに例示するためにａ）２−３及びｂ）２ −３に示される。注：CDRはボックスでかこまれ、そして必須枠組み構造残基は下線が引かれている。第５図は、RSV生殖系抗体とａ）１及びｂ）１の元のヒト適合されたRSV抗体との比較をなす。ａ）２及びｂ）２における比較は、RSV生殖系同等物の生成に使用されるマッチされた生殖系遺伝子配列情報に一直線に並べられた元のRSVヒト適合化のための基礎として使用される元のNEWM／REI抗体遣伝子である。この図は、生殖系配列がNEWM／REI枠組み構造にマッチし、そして製造されたアミノ酸置換がそれらの枠組み構造領域内に存在することを示す。いくつかのCDR残基は生殖系及びRSV又はNEWM／REI抗体に共通するが、CDRは成熟CDRを形成するためにかなりの程度、逸脱されたことがこの図及び第４図の両者から見出される。注： CDRはボックスでかこまれ、そして必須枠組み構造残基は下線が引かれている。第６図は、RSV19生殖系ELISAからの結果のグラフである。HuRSV19は元のヒト適合されたRSV19FNS抗体であり、RSVGLVHはHuGLRSV19 VHFNS／HuRSV19VK構造体であり、RSVGLVKはHrRSV19HFNS／HuGLRSV19VK構造体であり、そしてRSVGLは完全 RSV19生殖系抗体である。アッセイ条件及び結果は本明細書内で論議される。セクションａ）１及びｂ）１における第７図は、ヒト適合された3A4D10抗体と RSV19ヒト生殖系抗体配列との比較を示す。セクションａ）２及びｂ）２は、RSV 19ヒト生殖系配列にマッチされたマウス3A4D10抗体を示す。セクションａ）３及びｂ）３は、ヒト適合された3A4D10抗体とその生殖系同等物との比較を示す。3A 4D10抗体の抗原親和性及び特異性は、マウスに見出されるのと同じCDR配列（及び必須枠組み構造残基）の移植により保持され得る。これは、転換がマウス抗体からヒト生殖系枠組み構造抗体に又は同等のヒト適合された抗体から対応するヒト生殖系抗体に直接的に行なわれる場合、真実である。注：すべてのCDRはボックスによりかこまれ、3A4D10 CDR残はブランクのままであり、そしてすべての必須枠組み構造残基は下線が引かれている。例１この例は、生殖系Ｖ領域配列を有する対応するヒト適合された抗体を生成するために、CDRのトランスファーによるマウスモノクローナル抗体の再形状化（ヒト適合化）を示す。対象のモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマ細胞系から出発して、前記ハイブリドーマにおけるRNAからのその対応するＨ及びＬ鎖可変配列を決定するための適切な方法が、Orlandiなど.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86，383 3〜3837，1989年により記載される。マウスCDR及びヒト生殖系枠組み構造領域を含んで成る、生殖系再形状化抗体をコードする遺伝子が、生殖系Ｈ及びＬ鎖Ｖ領域におけるCDRを置換するために部位特異的変異誘発により生成され得る（Richmannなど.，1988,前記を参照のこと）。他方、生殖系再形状化抗体をコードする遺伝子は遺伝子合成によりアセンブルされ得る（Jones P.T．など.，1986,前記）。第１図は、マウス抗−リゾチーム抗体Ｄ1.3（Verhoeyen，M．など.，1988，前記）のＨ及びＬ鎖からのCDRを含んで成る生殖系再形状化抗体のアミノ酸配列、及びH3HU26（Ｈ鎖）及びK1HU12（Ｌ鎖）に由来するその対応する生殖系枠組み構造領域を示す。それらの生殖系枠組み構造領域は、マウスＤ1.3Ｖ領域枠組み構造に対しての密接した相同性に基づいて選択される（比較のために第１図に示される）。第１図はまた、リゾチームへの効果的な結合を促進する傾向があるマウスＤ1.3Ｈ鎖アミノ酸残基94の生殖系枠組み構造における包含を例示する。生殖系再形状化Ｈ及びＬ鎖を含む遺伝子を、複製できる発現ベクター中にクローン化し、そして一定のドメイン、たとえばヒトIgG１（Ｈ鎖）及びヒトカッパ（Ｌ鎖）のための遺伝子に連結することができる（Orlandiなど.，1989,前記）。次に、それらは、生殖系再形状化抗体の続く生成のために補乳類細胞中にコトランスフェクトされ得る。生殖系Ｖ領域へのマウスモノクローナル抗体のＶ領域からの完全CDR配列のトランスファーの代用として、効果的な抗体結合のために必要なCDR配列成分のみのトランスファーのための方法論が採用され得る（第２図）。従って、たとえばヒト生殖系Ｈ及びＬ鎖、たとえばH3HU26及びK1HU12をコードする遺伝子が一本鎖Fv′s（scFv′s）中にアセンブリーされ、そしてその対応する抗体Ｖドメインがバクテリオファージ粒子上に示される（McCafferty，J.など .，1990，前記）。第１の場合、次に、Ｄ1.3抗体のＨ鎖CDR３のみが選択されたＨ鎖生殖系Ｖ領域遺伝子中に移植され、そしてリゾチーム結合の効率が確かめられる。続いて、必要なら、生殖系Ｈ鎖CDR１及びCDR２の最少置換が、それらの位置で個々に変更を生ぜしめるオリゴヌクレオチドの混合物を用いて種々の位置で変異誘発により実施され得る。バクテリオファージ粒子上での表示により、及びリゾチーム親和性をカラム上での“パンニング”により、リゾチームのための最高の親和性を有するそれらの変異可変ドメインが選択される。同様に、最少に置換された生殖系Ｌ鎖CDRがバクテリオファージ粒子表示及びパンニングにより試験される。他の種の対応する生殖系抗体へのモノクローナル抗体の転換のための追加の意見は、Ｖ領域配列の二段階生殖系比較、続くCDR変性により達成され得る。たとえば、マウスＶ領域配列とマウス生殖系Ｖ領域配列とを比較できる。良好なマッチが達成される場合、適切なマウス生殖系Ｖ配列が続いて、ヒト（又は他の種）生殖系配列と比較され、そして最良のマッチが決定される。この二段階比較アプローチは、マウスＶ領域のヒト生殖系同等物を生成するための追加の変性のためにひじょうに適切であるヒト（又は他の種）生殖系領域の選択を可能にする。次に、所望する結合性を得るために生殖系Ｖ領域へのマウスモノクローナルのＶ領域からの完全又は部分CDR配列のトランスファーが実施され得る。その比較は、ヒト生殖系Ｖ領域枠組み構造が適切であることを示す他に、また、CDR成分残基が効果的な抗体結合のために必要であることを示唆する。例２この例は、同じ種のその生殖系同等物への一定のモノクローナル抗体の転換を示す。一定のモノクローナル抗体に対応するクローン化されたＨ及びＬ鎖Ｖ頷域ドメインから出発して、生殖系への転換が、生殖系中にそれらを転換するためにＶ領域枠組み構造の部位特異的変異誘発により便利に達成される。他方、生殖系Ｖ領域は遺伝子合成により生成され得る。第３図は、親抗体配列に比較してマウスモノクローナル抗体Ｄ1.3（例１を参照のこと）のＨ及びＬ鎖についての生殖系誘導体を示す。この例においては、Ｄ1.3Ｈ及びＬ鎖配列（それぞれHVMS14及びKVMSK2）に対して良好な相同性を有する生殖系Ｖ霞域が生殖系転換のための基礎として選択される。この例に記截されるように、Ｄ1.3抗体からの唯一のキーC DR残基が、Ｖドメインの表示及びバクテリオファージのパンニングを通して、マッチされた生殖Ｖ領域上にトランスファーされ得る。例３この例は、その最とも近い生殖系同等物への再形状化された（CDR −移植された）抗体の転換を示す。第４図は、ヒト生殖系再形状化された抗体のアミノ酸配列と呼吸シンシチウムウィルスに対して特異的な前から存在する再形状化された（ヒト適合化された）抗体との比較を示す（Tempest P.など.，Biote chnology 9 226〜227ページ、1991）。その再形状化された抗体は、それぞれNEW M（Saul，F.A.など.，J．Biol．Chem．253，585〜597，1978）及びREI（Epp，0 ．など.，Eur．J．Biochem．45，513〜524，1974）骨髄腫タンパク質に由来するＨ及びＬ鎖Ｖ領域ドメイン上に移植された、RSVに対して特異的なマウスモノクローナル抗体RSV19からのCDRを元来含んで成る。この例においては、生殖系可変領域（VHのためにはDP68／JH6及びVKのためにはHK137）への転換は、Ｈ及びＬ鎖再形状化抗体遺伝子の部位特異的変異誘発により最とも便利には達成される。第４図はまた、RSV19モノクローナル抗体に元来由来し、そしてRSVへの効果的な結合のために重要であることが示されている、Ｈ鎖アミノ酸残基91〜94の生殖系枠組み構造における包含を例示する（TempestP.など.，Biotechnology 9 226〜271 ページ、1991）。再び、所望には、Ｄ1.3抗体からのキーCDR残基のみが、生殖系Ｖ領域上にトランスファーされ、そして所望する抗体構造体が例１に記載されるようにＶドメインの表示及びバクテリオファージのパンニングを通して選択される。実験方法及び結果第１のそれらの試験は、例３に表示されているように、生殖系同等物へのヒト適合されたRSV19抗体の転換を包含する。マッチする生殖系同等物を得るためへの配列比較ヒト適合されたRSV19 Ｖ領域配列（Tempest P.など.，Biotechnology9 226〜 271ページ、1991）を、Tomlinsonなど.，J．Mol．Biol．227，776〜798ページ、 1992から又はGenbank（Intelligonekics Ins）から得られたデータから得られた生殖系配列に比較し、そして比較をDnast ar Inc．のDNASTARプログラムを用いて行なった。第５図は、残基がVH及びVK可変ドメインをそれらの同等物生殖系配列に転換するために変更されたことを示す。RSV19 VH及びVKドメインの変異誘発 VK転換は５個のアミノ酸残基の置換を包含するが、VH転換は10個のそのような置換を必要としたことが見出される。両者の場合、置換されるべきアミノ酸がその配列を通して平等に分散された。VH及びVKヒトRSV19遺伝子がＭ13中にクローン化され、そして一本鎖DNAが個々の構造体から調製された。５つの変異誘発オリゴヌクレオチドがVK配列を転換するために合成され、そして他の５つのオリゴヌクレオチドが所望する生殖系同等物にVH配列を転換するために合成された（第６図）。前記オリゴヌクレオチドは、Verhoeyenなど、Science，239 1534〜153 6ページ、1988に類似する態様でオリゴヌクレオチド指図された部位特異的変異誘発により必要とされるDNA変化をもたらすために同時に使用される。１ピコモルの個々のリン酸化されたオリゴヌクレオチドが、500ngの一本鎖DNAに添加された。プライマーを、70℃に加熱し、そして室温にゆっくりと冷却することによって鋳型にアニールした。部位特異的変異誘発の後、前記DNAをコンピテントＥ．コリ TG１細胞中に形質転換した。一本鎖DNAを個々のプラークから調製し、そしてSequenase（United States Biochemicals）を用いてのジデオキシ法を用いて配列決定した。一部の変異体のみが得られる場合、それらは、完全な変異体が得られるまで、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、追加のラウンドの変異誘発にゆだねられた。生殖系RSV19 VH及びVK遺伝子を発現ベクター（Orlandiなど.，19 89前記）中にクローン化し、プラスミドpHuGLRSV19VHFNS及びpHuGLRSV19VKを生成した。IgG Ｈ鎖プロモーター、適切なスプライス部位及びシグナルペプチド配列と共にGLVH遺伝子を、Hi nd III及びBamH Ｉによる消化によりＭ13から切断し、そしてネズミIgＨ鎖エンハンサー、ヒトIgG１不変領域、SV40プロモーター、哺乳類細胞における選択のためのgpt遺伝子及びＥ．コリにおける複製及び選択のための遣伝子を含む発現ベクター中にクローン化した。pHuGLRSV19VKプラスミドの構成は実質的に同じであるが、但し、この構成体においては、gpt遺伝子がヒグロマイシン耐性遺伝子により及びIgG１がヒトカッパ不変領域により置換された。抗体発現５μｇのpHuGLRSV19VHFNS又はpHuRSV19VHFNS及び10μｇのpHuGLRSV19VK又はpH uRSV19VKを、RSV19抗体の組合せ、すなわちGLVH／VK，VH／GLVK，GLVH／GLVK及び元のVH／VKのためにPvuＩにより線状化した。そのDNAを一緒に混合し、エタノール沈殿し、そして水25μｌに溶解した。約10⁷個のYB２／０細胞を、半等密性まで増殖し、遠心分離により収穫し、そしてエレクトロポレーションキュベットにおいて消化されたDNAと共にDMEMに再懸濁した。氷上での５分間の後、細胞に9 60UFでの170Ｖの一回のパルスを与え（Gene Pulser，Bio-Rad）、そして氷上でさらに20分間、放置した。次に、細胞を20mlのDMEM＋10％ FCS中に置き、そして 48時間、回復せしめた。この時点で、細胞を24ウェルのプレート中に分配し、そして選択的培地（DMEM，10％FCS，0.8mg／mlのマイコフェノール酸、250mg／ml のキサンチン）を適用した。３〜４日後、培地及び死滅細胞を除去し、そして新鮮な選択培地により置換した。トランスフェクタントクローンは８〜10日後、裸眼で見ることができた。抗体産生クローンをELISAにより試験し、そしてクローンを、それらが600mlの体積（５つのフラスコにおいて）において増殖するまで拡張した。抗体を、プロテインＡ沈殿を用いて収穫し、そして抗体の溶出を、プロテインＡ−抗体材料により小さなカートリッジをパックし、 0.1Ｍのトリス（pH8.0）により洗浄し、次に0.01Ｍのトリス（pH8.0）により洗浄し、そして100mMのグリシン（pH3.0）緩衝液を用いて溶出することによって達成した。１mlの画分を100μｌの１Ｍトリス（pH8.0）により中和し、そしてOD／ 280を測定した。抗体含有画分をプールし、そして抗体をPBS緩衝液に対して一晩透析した。続いて、抗体をフィルター殺菌し、DO／280を測定し、そして＋４℃ で貯蔵した。混合及び一対のHgGLRSV／HuRSV及び完全HuGLRSV19抗体が元のHuRSV19のように十分に結合するかいなかを比較するための抗原結合アッセイを、Tempest P.など .，Biotechnology 9 226〜271ページ、1991により記載されるようにして実施した。種々の構造体の組合せの結果は第６図に示される。結果生殖系HuRSV19をアッセイする場合、抗体構造体は元のHuRSV19抗体と同じ結合性質を示した。同様に、HuGLRSV19VHFNS／HuRSV19VK及びHuRSV19VHFNS／HuGLRSV 19VK構造体はまた、結合性質の低下を示さなかった。従って、それらの結果は、生殖系HuRSV19 Ｈ及びＬ鎖がそれらの個々の抗原結合性質を保持し、そして完全なヒト生殖系抗体が由来したHuRSV19抗体と同じ結合特性を示すことを示唆した。従って、HuRSV19抗体をその生殖系同等物に転換しない枠組み構造置換は、抗体の結合性質に対して有害な効果を有さないように思える。第２組の実験は、生殖系可変傾域上へのCDR（及びいづれかの必須の枠組み構造残基）の移植を包含する。この実験においては、抗体3a4D10（抗−クロストリジウムペルフィンゲンス（Clostridium Perfingens）αトキシン）はマウスモノクローナル及びまたヒト適合化された抗体として作用する。CDRの配列は知られており、そしてさらに、結合性を維持するために不可欠である枠組み構造の変性が決定された。マウス及びヒト3a410抗体（ブランクのCDRを伴う）のＶ領域配列及び生殖系枠組み構造抗体とのそれらの比較が第７図に示される。この実験においては、NEWM ／REI生殖系Ｖ領域枠組み構造（存在するRSV19抗体のその生殖系同等物への転換の工程において生成される）が、3a4D10のための適切なCDRが移植されるであろう基礎として使用されるであろう。CDRは元のマウス抗体と同一である。従って、この実験は、モノクローナルのCDRが異なった種の生殖系枠組み構造にトランスファーされる例１を具体化するように企画されている。抗体はまたヒト適合化された形で存在するので、実験はまた、抗体のCDRが同じ種の生殖系枠組み構造にトランスファーされる例２を具体化するようにも見える。このアプローチは、生殖系同等物が枠組み構造上へのCDRの移植により生成され、そして従って枠組み構造の元のCDRを置換することにおいて例３とは異なる。例３においては、生殖系同等物が、存在する枠組み構造の転換により生成され、そして従ってCDR移植を包含しない。すべての両者の場合、抗体の必須枠組み構造変性は、結合を保持するために行なわれるべきであり、そしてその結果、また、生殖系抗体を構成する場合に導入されるべきである。それらの構造体を創造することに包含されるDNA操作及び発現技法は、最初の実験に論ぜられた技法と同一である。６個の3a4D10CDRをヒト生殖系NEWM／REI枠組み構造上に移植を行ない、そして必須の枠組み構造の変化を生ぜしめるためには、６個のオリゴヌクレオチドが必要とされる。マイクロ−タイタ−プレートのウェルを、１μｇのホスホリパーゼＣタイプXi V（Sigma P4039）により４℃で一晩被覆した。ブロッキング及び洗浄の後、ネズミ及び試験抗体を、室温で１時間、適用した。ウェルを空にし、洗浄し、そして固定された抗体を、１：1000に希釈されたペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗− マウス又はヤギ抗−ヒトIgG抗体（Sera-labs）と共に室温で１時間インキュベーションすることによって検出した。ペルオキシダーゼ活性のための基質は、標準の緩衝条件下でのＯ−フェニレンジアミン（OPD）及びハイドロジンペルオキシダーゼであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者カー，フランシスジョセフイギリス国，アバーディーンシェアエービー23 ８エックスユー，バルメディー, ザホールディングス，ビーチレア（番地なし) (72)発明者ハリス，ウィリアムジョセフイギリス国，アングスディーディー７６ディーアール，カーナスティー，シーザーアベニュ３

Claims

【特許請求の範囲】１．生来の抗体において１又は複数の対応する体細胞変異誘発された残基を置換する、１又は複数の選択された生殖系アミノ酸残基を含んで成る変性された抗体。２．前記生来の抗体の抗原結合能力に不可欠である１又は複数のアミノ酸残基を転換する請求の範囲第１項記載の変性された抗体。３．抗体に特異的抗原を結合する能力を付与する相補性決定領域（CDR）；及び選択され、そして卓越した生殖系枠組み構造を含んで成る可変（Ｖ）領域を有する請求の範囲第１又は２項記載の変性された抗体。４．前記CDRが、生殖系CDRコード配列からの１又は複数の残基；及びＢ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受ける抗体Ｖ領域遺伝子からの１又は複数の残基を含んで成る請求の範囲第３項記載の変性された抗体。５．前記枠組み構造が、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受けた抗体Ｖ領域遺伝子からの１又は複数の残基を含んで成り、そして前記残基が前記抗体の抗原結合能力に不可欠である請求の範囲第３又は４項記載の変性された抗体。６．前記選択された生殖系枠組み構造が、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受けた抗体Ｖ領域遣伝子の枠組み構造に相同である請求の範囲第３〜５のいづれか１項記載の変性された抗体。７．前記抗体Ｖ領域遺伝子が前記CDRを含んで成る請求の範囲第６項記載の変性された抗体。８．前記CDR及び選択された生殖系枠組み構造が異なった種に起因する請求の範囲第３〜７のいづれか１項記載の変性された抗体。９．前記選択された生殖系枠組み構造が前記抗体の外表面を形成する請求の範囲第３〜８のいづれか１項記載の変性された抗体。 10．請求の範囲第１項記載の変性された抗体の調製に使用するための遺伝子の製造方法であって、変性のための適切な候補体として生来の抗体における１又は複数の体細胞変異誘発されたアミノ酸残基を同定し；そして前記同定された１又は複数の変異誘発されたアミノ酸残基を置換するように選択された生殖系アミノ酸残基をコードするヌクレオチドコード配列を製造することを含んで成る方法。 11．前記生来の抗体の抗原結合能力に不可欠である１又は複数のアミノ酸残基をコードするように前記ヌクレオチドコード配列を製造することを含んで成る請求の範囲第10項記載の方法。 12．請求の範囲第３項記載の変性された抗体の調製に使用するための遺伝子の製造方法であって、下記段階：（１）CDRをコードするCDRコードヌクレオチド配列を得；そして（２）それらのCDRコードヌクレオチド配列と選択された生殖系枠組み構造をコードする枠組み構造コードヌクレオチド配列とを組合すことを含んで成る方法。 13．前記CDRコードヌクレオチド配列における１又は複数の残基を生殖系CDRコード配列からの対応する異なった残基により置換する段階を含んで成る請求の範囲第12項記載の方法。 14．前記枠組み構造コードヌクレオチド配列における１又は複数の残基を、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受けた抗体Ｖ領域の枠組み構造からの異なった残基により置換する段階を含んで成り、そしてここで、前記異なった残基が前記抗体の抗原結合能力に不可欠である請求の範囲第12又は13項記載の方法。 15．Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受けた抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造に対する相伺性に基づいて生殖系Ｖ領域の枠組み構造を選択することを含んで成る請求の範囲第12〜14のいづれか１項記載の方法。 16．Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受け、そして前記CDRをコードする抗体Ｖ領域遺伝子の枠組み構造に対する相同性に基づいて生殖系Ｖ領域の枠組み構造を選択することを含んで成る請求の範囲第15項記載の方法。 17．前記CDRコードヌクレオチド配列が生殖系Ｖ領域のための遺伝子上に移植される請求の範囲第12〜16のいづれか１項記載の方法。 18．前記枠組み構造コードヌクレオチド配列が、Ｂ細胞変異の間、体細胞変異誘発を受けた抗体Ｖ領域の枠組み構造をコードするヌクレオチド配列を置換する請求の範囲第12〜16のいづれか１項記載の方法。 19．前記遺伝子が抗体Ｈ鎖又はそのフラグメントをコードする請求の範囲第12 〜16のいづれか１項記載の方法。 20．前記遺伝子が抗体Ｌ鎖又はそのフラグメントをコードする請求の範囲第12 〜16のいづれか１項記載の方法。 21．異なった種に由来する、CDRコード及び枠組み構造コードヌクレオチド配列を選択する段階を含んで成る請求の範囲第12〜20のいづれか１項記載の方法。 22．請求の範囲第10〜21のいづれか１項記載の方法により得られる遺伝子を発現することを含んで成る、抗体の製造方法。 23．成分として、請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の抗体を有する、医薬又は診断用調製物。 24．ヒト又は動物患者を処理するために請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の抗体を用いることを含んで成る方法。 25．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の抗体を診断技法に用いることを含んで成る方法。