CN109195630A - 用于治疗与淀粉样蛋白β累积相关的病症的BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段的组合 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于治疗具有与淀粉样蛋白β累积相关的疾病或病症的主体的方法，其包括向所述主体施用BACE抑制剂和结合淀粉样蛋白βn‑42的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述疾病或病症是阿尔茨海默病。

Description

用于治疗与淀粉样蛋白β累积相关的病症的BACE抑制剂和抗 体或抗原结合片段的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月15日提交的美国临时申请号62/308,698的优先权的权益。前述申请的说明书以其整体通过引用并入本文。
背景
阿尔茨海默病(AD)是特征在于恶化认知损害和记忆且减弱患者的社会和职业功能的神经退化性疾病。该疾病引起脑内神经细胞的损失，其产生关于语言和高级功能(诸如判断、计划、组织和推理)的认知困难，这可最终导致人格改变。疾病晚期的特征在于独立功能的完全损失。
在组织学上，AD(偶发性和家族性)由细胞内神经原纤维缠结(NFT)和细胞外斑块的存在来定义。斑块是源自淀粉样蛋白前体蛋白(APP，发现于脑中的神经元和星形细胞中的跨膜蛋白)的异常裂解的淀粉样蛋白β肽(Aβ)的聚集物。Aβ沉积物也发现于AD患者的血管中。胆碱能神经元在AD中尤其脆弱，且后续神经递质衰退影响其他神经递质系统。其他疾病症状包括氧化应激、炎症和神经元细胞凋亡(程序性细胞死亡)。在AD患者中，广泛神经元细胞死亡导致认知衰退且最终导致患者的死亡。(Younkin, 1995；Borchelt等人，1996；Selkoe, 1999)。AD在具有唐氏综合征的患者中的发生频率是一般群体的3至5倍。具有唐氏综合征的患者也更可能在比其他成人更年轻的年龄发生AD。
当前治疗仅是症状性的，且有效性最小且仅在有限持续时间内导致症状的较小改善。据信，Aβ的过度产生或Aβ水平的变化是偶发性和早发型AD的发病机制中的关键事件，且由于该原因，Aβ已成为用于开发经设计以a)减少其形成(Vassar等人，1999)或b)活化加速其从脑的清除的机制的药物的主要靶标。
淀粉样蛋白级联假设提出，Aβ肽的产生不利地影响神经元功能，由此导致AD中的神经元死亡和痴呆。Aβ从由分泌酶依次切割以生成不同长度的物质的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)产生。结束于残基42的Aβ是通过处理APP而产生的Aβ物质的次要组分。其他形式包括Aβ1-40和N-末端截短物Aβn-40。然而，结束于残基42的Aβ最易于聚集且驱动沉积成淀粉样蛋白斑块。除了更易于聚集以外，Aβ1-42肽形成已显示对培养物中的神经元有毒的可溶性低n聚合物(或寡聚物)。不同于较大显著原纤维沉积物，寡聚物在典型病理学测定中不能检测到。已从AD脑分离出具有类似特性的寡聚物且这些比斑块与疾病进展更紧密相关(Younkin, 1998；Walsh等人，2005a；Walsh等人，2005b)。许多Aβ的同种型(包括Aβ1-42、pGluAβ3-42、Aβ3-42和4-42)在AD脑中起主导作用，其中Aβ1-42和Aβ4-42是家族性和偶发性AD的海马和皮质中的主要形式(Portelius等人，2010)。
先前已研究几种被动接种疫苗策略。针对Aβ的抗体的外周施用足以减小淀粉样蛋白负荷(Bard等人，2000)。尽管在这些实验中实现相对适度的抗体血清水平，但被动施用的抗体能够穿过血-脑屏障且进入中枢神经系统中，修饰斑块且诱导先前存在的淀粉样蛋白的清除。在Aβ1-40特异性抗体、Aβ1-42特异性抗体和针对针对Aβ的残基1-16的抗体之间的比较中，显示所有抗体都减少小鼠脑中的Aβ累积(Levites等人，2006)。代表性的有用抗Aβ抗体的实例包括描述于WO 2014/060444中的那些。
用于治疗疾病(诸如阿尔茨海默病或唐氏综合征)的额外有吸引力的治疗靶标是BACE抑制。Aß肽源自APP在C-末端通过一种或多种γ-分泌酶的切割和在N-末端通过β-分泌酶 (也称为天冬胺酰蛋白酶或Asp2或β位点APP裂解酶(BACE))的切割，作为β-淀粉样蛋白生成途径的一部分。BACE活性直接与来自APP的Aβ肽的生成相关(Sinha等人，Nature,1999, 402, 537-540)，且研究逐渐表明BACE的抑制抑制Aβ肽的产生(Roberds, S. L.等人，Human Molecular Genetics, 2001, 10, 1317-1324)。BACE是1型膜结合蛋白，其被合成为具有部分活性的酶原，且大量表达于脑组织中。认为其代表主要β-分泌酶活性，且认为其为Aβ产生的限速步骤。因此，降低或阻断BACE活性的药物应当减少脑中或其中Aβ或其片段沉积的别处的Aβ水平和Aβ片段的水平，且因此减缓淀粉样蛋白斑块的形成和AD或涉及Aβ或其片段沉积的其他疾病的进展。
需要减少Aβ形成(例如通过抑制负责其形成的酶)且活化加速Aβ从脑的清除的机制(例如通过结合存在的Aβ且靶向其用于清除)的新型疗法。
发明概述
在一些实施方案中，本公开提供了治疗具有与Aβ累积相关的疾病或病症的主体的方法，其包括向所述主体施用：a)药学上有效量的BACE抑制剂，其中所述BACE抑制剂是：或其药学上可接受的盐；和b)药学上有效量的包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐(camsylate salt)：
。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：
。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
。
在一些实施方案中，用于本文公开的任何方法中的抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个Abet0380或其种系化变体的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含Abet0380或其种系化变体的重链的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含Abet0380或其种系化变体的轻链的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实施方案中，所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 528、SEQ ID NO: 529、SEQID NO: 530和SEQ ID NO: 531的氨基酸序列具有至少90%同一性的框架区。在一些实施方案中，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO: 528、SEQ ID NO: 529、SEQ ID NO: 530和SEQ IDNO: 531的氨基酸序列的框架区。在一些实施方案中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO:537、SEQ ID NO: 538、SEQ ID NO: 539和SEQ ID NO: 540的氨基酸序列具有至少90%同一性的框架区。在一些实施方案中，所述VL结构域包含具有SEQ ID NO: 537、SEQ ID NO:538、SEQ ID NO: 539和SEQ ID NO: 540的氨基酸序列的框架区。在一些实施方案中，所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 524具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 533具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 524具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 533具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合片段是scFv。在一些实施方案中，所述抗原结合片段是Fab'。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人类IgG1或人类IgG2。在一些实施方案中，所述抗体是人类IgG1-TM、IgG1-YTE或IgG1-TM-YTE。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人类抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段以500 pM或更小的解离常数(KD)结合单体Aβ1-42且不结合Aβ1-40或以大于1mM的KD结合Aβ1-40。在一些实施方案中，所述抗体是有用的，因为其结合多于一种类型的毒性或潜在毒性Aβ蛋白(例如Aβ1-42和3-焦-42淀粉样蛋白β(3-pyro-42 amyloid beta))。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段结合淀粉样蛋白β17-42肽(Aβ17-42)和淀粉样蛋白β29-42肽(Aβ29-42)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段结合3-焦-42淀粉样蛋白β肽和11-焦-42淀粉样蛋白β肽。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段结合淀粉样蛋白β1-43肽(Aβ1-43)。
在一些实施方案中，待使用本文公开的任何方法治疗的疾病或病症选自：阿尔茨海默病、唐氏综合征和/或黄斑退化。在一些实施方案中，所述疾病或病症是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是唐氏综合征。在一些实施方案中，所述疾病或病症是黄斑退化。在一些实施方案中，将所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段同时施用于主体。在一些实施方案中，分开施用所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段在相同组合物中。在一些实施方案中，经口施用所述BACE抑制剂。在一些实施方案中，静脉内施用所述抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，皮下施用所述抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述主体是人。在一些实施方案中，所述方法改善认知能力或阻止进一步认知损害。在一些实施方案中，所述方法改善记忆或阻止进一步痴呆。
在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含与抗体或抗原结合片段组合用于治疗与Aβ累积相关的疾病或病症的BACE抑制剂，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；且其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含与BACE抑制剂组合用于治疗与Aβ累积相关的疾病或病症的抗体或抗原结合片段，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；且其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实施方案中，所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，本公开提供了药剂盒，其包含BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；且其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。在一些实施方案中，所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
附图简述
图1显示通过增加纯化的竞争剂scFv (●)的浓度来抑制人类淀粉样蛋白β1-42肽和Abet0144-GL IgG1-TM复合物的形成。最强效scFv克隆中的4种Abet0369 (图1A)、Abet0377(图1B)、Abet0380 (图1C)和Abet0382 (图1D)都比亲本Abet0144-GL scFv序列(■)显示显著改善功效。
图2显示以1024 nM (上迹线)至63 pM (下迹线)肽的浓度结合固定Abet0380-GLIgG1-TM抗体的人类淀粉样蛋白β1-42肽的表面等离子共振(BIAcore)迹线。将每条迹线都拟合至1:1 Langmuir模型。
图3显示一系列结合固定的Abet0380-GL IgG1-TM抗体的淀粉样蛋白β肽的表面等离子共振(BIAcore)迹线。存在与生物素化人类淀粉样蛋白β1-42肽(上迹线)和未标记的鼠淀粉样蛋白β1-42肽(第二迹线)的明显结合。没有与生物素化的人类淀粉样蛋白β1-40肽或未标记的鼠淀粉样蛋白β1-40肽(平坦线)的可辨别的结合。
图4显示来自Abet0380-GL IgG1-TM的体外免疫组织化学染色的样品图像。(A)阳性对照抗体显示人类AD脑切片(ApoE基因型3/3，Braak期6；5 μg/ml抗体)上的强斑块识别(评分= 4)。(B) Abet0380-GL IgG1-TM先导克隆显示邻近脑切片(10 μg/ml)上的强斑块识别(评分= 3)。(C)相同阳性对照抗体显示Tg2576小鼠脑切片(22个月龄小鼠；20 μg/ml抗体)上的强斑块识别(评分= 4)。(D) Abet0380-GL IgG1-TM先导克隆显示邻近小鼠脑切片(20 μg/ml)上的强斑块识别(评分= 4)。
图5显示使用Abet0380-GL IgG1TM的Aβ42聚集物制备和检测的Western印迹分析。(A)非光交联的(非PICUP) Aβ42聚集物的Abet0380-GL IgG1TM检测。(B)光交联的Aβ42聚集物(PICUP)的Abet0380-GL IgG1TM检测。我们在本文证实，Abet0380-GL IgG1TM特异性识别Aβ1-42单体和低n寡聚物物质(最多达且包括五聚体)。
图6显示通过增加在14天内接受重复每周剂量的Sprague-Dawley大鼠中的Abet0380-GL IgG1-TM抗体的剂量的CSF中游离淀粉样蛋白β1-42肽的水平的剂量依赖性降低(A)、脑组织中总淀粉样蛋白β1-42肽的增加(B)和脑组织中总淀粉样蛋白β1-40肽的未受影响水平(C)。
图7显示在向年老Tg2576小鼠施用外周剂量之后168小时来自Abet0380-GL IgG1-TM与淀粉样蛋白β斑块的体内结合的免疫组织化学分析的样品图像。以30 mg/kg给予的阳性对照抗体显示强体内斑块识别(A)，而以30(B)或10(C) mg/kg给予的Abet0380-GL IgG1-TM不显示任何体内斑块修饰。
图8显示用一定范围的不同浓度(10uM最低至0.17nM)的一组全长、截短和焦化(pyro)人类Aβ肽(Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-16、Aβ12-28、Aβ17-42、Aβ焦-3-42或Aβ焦-11-42)的竞争结合实验中的Abet0380-GL IgG1-TM的特异性。关键词：
x轴显示Aβ肽的以log M计的浓度，y轴显示%特异性结合。用Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-42、Aβ焦-3-42和Aβ焦-11-42观察到Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42结合的抑制，其中对于该组，IC50值范围为10-8至10-9摩尔浓度。用Aβ1-16或Aβ12-28未观察到Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42结合的抑制。
图9显示在正常大鼠PK-PD研究中抗体Abet0144-GL隔离淀粉样蛋白β1-42的能力。x轴显示媒介物或Abet0144-GL的浓度(10mg/kg或40 mg/kg)，y轴显示CSF中的总淀粉样蛋白β1-42的以pg/ml计的浓度。CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42并不由10或40 mg/kgAbet0144-GL显著改变(当与媒介物相比时分别增加5%和18%)。CSF中的总淀粉样蛋白β1-42显著增加38% (在10 mg/kg下)和139% (在40 mg/kg下)。脑组织中的总淀粉样蛋白β1-42也在10 mg/kg和40 mg/kg下分别显著增加16%和50%。来自正常大鼠中的该研究的数据表明，Abet0144-GL对CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42水平并无显著效应，而增加CSF和脑两者中的总淀粉样蛋白β1-42水平。
详述
本公开提供了用本文公开的任何BACE抑制剂与本文公开的任何抗体或抗原结合片段的组合治疗有需要的主体的方法。还提供了药剂盒和组合物。
1. 定义
在描述本公开之前，应理解，本公开并不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，且并不意欲限制，因为本公开的范围将仅受限于随附权利要求。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。
除非上下文另外明确指明，否则本说明书和随附权利要求中所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含多个指示物。
氨基酸在本文中可指其众所周知的三字母符号或由IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission推荐的单字母符号。类似地，核苷酸可指其公认的单字母代码。
此处便利地指出，当本文使用时，“和/或”应理解为两种指定特征或组分中的每一种(具有或不具有另一种)的具体公开内容。例如，“A和/或B”应理解为(i) A、(ii) B和(iii) A和B中的每一种的具体公开内容，就如同每种在本文中个别地陈述一样。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变型(诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
如本文所用，当用于提及特定列举数值时，术语“约”意味着该值可从列举值变化不超过10%。
2. BACE抑制剂
本公开提供了本文公开的任何BACE抑制剂与本文公开的任何抗体或抗原结合片段的组合用于治疗有需要的主体的用途。
在一些实施方案中，用于本文所述的任何方法中的合适的BACE抑制剂包括公开于美国专利8,415,483、8,865,911和9,248,129和美国专利申请公开2014/0031379(其各自都通过引用并入本文)中的那些。
在一些实施方案中，适用于本公开中的BACE抑制剂是4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是(1r,4r)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，适用于本公开中的BACE抑制剂是(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺：
或其药学上可接受的盐。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐；等。药学上可接受的盐包括(例如)由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的无毒盐或季铵盐。例如，此类无毒盐包括衍生自无机酸(诸如盐酸)的那些。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备此类盐；通常使用非水性介质，如二乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
在一些实施方案中，适用于本公开中的BACE抑制剂是化合物：4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]4''-胺的樟脑磺酸盐。
在一些实施方案中，BACE抑制剂是(1r,4r)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺：的樟脑磺酸盐。
在一些实施方案中，适用于本公开中的BACE抑制剂是(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺：的樟脑磺酸盐。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
。
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
其特征在于提供实质上展现具有如表A中所绘制的d-间距值的以下峰的X射线粉末衍射(XRPD)图案：
表A：X射线粉末衍射鉴定的峰
在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是：
其特征在于提供实质上展现具有如表B中所绘制的d-间距值的以下非常强、强和中等峰的X射线粉末衍射图案：
表B：
X射线粉末衍射鉴定的峰
如本文所用，术语樟脑磺酸盐还涵盖其所有溶剂化物和共晶体。
适用于本文中的BACE抑制剂的替代盐包括琥珀酸盐、盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、富马酸盐和1.5萘二磺酸盐。
本公开进一步包括本公开的化合物的所有互变异构体形式。如本文所用，“互变异构体”意指以由氢原子迁移导致的平衡存在的其他结构异构体。例如酮-烯醇互变异构现象，其中所得化合物具有酮和不饱和醇的特性。互变异构现象的其他实例包括2H-咪唑-4-胺和其互变异构体1,2-二氢咪唑-5-亚胺以及2H-咪唑-4-硫醇和其互变异构体1,2-二氢咪唑-5-硫酮。应理解，在本说明书通篇的化合物代表中，仅绘制或命名化合物的可能互变异构体之一。
本公开的化合物进一步包括水合物和溶剂化物。
(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1',2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐：
。
化合物(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐可以通过如下获得：从(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺于合适溶剂(例如2-丙醇、乙腈或丙酮或这些与水的混合物)中的溶液开始，随后在室温和80℃之间的温度下将获得的溶液与(1S)-(+)-10-樟脑磺酸直接混合或与溶解于合适溶剂(例如2-丙醇或水)中的(1S)-(+)-10-樟脑磺酸混合。结晶可通过蒸发溶剂和/或通过冷却溶液或直接作为盐反应物结晶来获得。可使用晶种来开始结晶。晶种可以从批料本身通过采样小体积溶液且然后将其快速冷却以诱导结晶来制备。然后将晶体添加至批料中作为晶种。
可对根据标准方法制备的样品进行X射线粉末衍射分析(XRPD)，所述标准方法例如描述于Giacovazzo, C.等人(1995), Fundamentals of Crystallography, OxfordUniversity Press; Jenkins, R.和Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-RayPowder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York; Bunn, C. W. (1948),Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; 或Klug, H. P. & Alexander,L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley and Sons, New York中的那些。X射线衍射分析使用PANanlytical X’Pert PRO MPD衍射仪持续96分钟从1°至60° 2θ来进行。XRPD距离值可在最后小数位上在±2范围内变化。
相对强度推导自用可变狭缝测量的衍射图。
相对于最强峰测量的相对强度作为非常强(vs，高于50%相对峰高度)、强(s，25%至50%相对峰高度)、中等(m，10%至25%相对峰高度)、弱(w，5%至10%相对峰高度)和非常弱(vw，低于5%相对峰高度)给出。本领域技术人员将理解，出于多种原因(包括优选取向)，在不同样品和不同样品制剂之间，XRPD强度可变。本领域技术人员还将理解，出于多种原因(包括衍射仪中样品表面水平的变化)，测量的角度和由此d-间距中可以出现较小位移。
3. 抗Aβ抗体或抗原结合片段
本公开提供了本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂的组合用于治疗有需要的主体的用途。
在一些实施方案中，用于本文所述的任何方法中的合适抗体或抗原结合片段包括公开于WO 2014/060444和US 2015/0299299 (其各自都通过引用并入本文)中的那些。
如本文所定义，“抗体或抗原结合片段”包含至少1、2、3、4、5或6个以下抗体或抗原结合片段中的任何一种或多种的CDR：Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383或其种系化变体。在一些实施方案中，“抗体或抗原结合片段”包含至少1、2、3、4、5或6个以下抗体或抗原结合片段中的任何一种或多种的CDR：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化变体。在具体实施方案中，“抗体或抗原结合片段”包含至少1、2、3、4、5或6个Abet0380或其种系化变体的CDR。在本申请通篇中，除非另外明确陈述，否则CDR使用Chothia、Kabat和/或IMGT系统鉴定或定义。当将CDR指示为如通过Chothia、Kabat或IMGT系统鉴定或定义时，其意指CDR与该系统一致(例如ChothiaCDR、Kabat CDR或IMGT CDR)。可以使用这些术语中的任一种来指示是否提及Chothia、Kabat或IMGT CDR。
通过结合血浆、脑和脑脊髓液(CSF)中的Aβ肽1-42和其N-末端截短物(n-42)的同种型，本公开的抗体或抗原结合片段可以防止Aβn-42 (例如Aβ1-42、Aβ焦3-42和/或Aβ4-42)同种型在脑和脑血管内的累积或逆转其沉积。根据本公开的抗体或抗原结合片段可以结合和沉淀血浆和/或脑脊髓液(CSF)中的可溶性Aβ1-42，由此减小Aβ1-42分别在血清和/或CSF中的浓度。当与本文公开的任何BACE抑制剂组合使用时，这些抗体或抗原结合片段代表用于阿尔茨海默病和其他与淀粉样变性相关的病况的治疗方法。
在具体实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段对Aβ17-42内或Aβ29-42内的靶表位是特异性的，且相对于非靶表位(例如来自Aβ1-40的表位)以高亲和力结合该靶表位，由此靶向与淀粉样蛋白斑块形成相关的主要毒性物质。例如，抗体或抗原结合片段对Aβ1-42展现的结合亲和力可以是对Aβ1-40的至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。因此，在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段相比于Aβ1-40选择性结合Aβ1-42。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以500 pM或更小的解离常数(KD)结合Aβ1-42。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段显示没有与Aβ1-40的显著结合。在一些实施方案中，可使用表面等离子共振并使用单体Aβ肽来测定亲和力和结合，如实施例中所述。
也可在均相时间分辨的荧光(HTRFTM)测定中测量与Aβ的结合以确定所述抗体是否能够与针对Aβ肽的参考抗体分子竞争结合Aβ，如实施例中所述。
HTRFTM测定是利用紧密相邻的供体和受体荧光团之间的荧光共振能量转移的均相测定技术。可使用此类测定来通过直接或间接使一种目标分子偶联至供体荧光团(铕(Eu3+)穴状化合物)且使另一目标分子偶联至受体荧光团XL665 (稳定交联的别藻蓝蛋白)来测量大分子相互作用。穴状化合物分子的激发(在337 nm下)产生620nm下的荧光发射。来自该发射的能量可转移至与穴状化合物紧密相邻的XL665，导致从XL665发射特定长时的荧光(在665 nm下)。测量供体(在620 nm下)和受体(在665 nm下)的具体信号，这允许计算补偿测定中的着色化合物的存在的665/620 nm比率。
在一些实施方案中，根据本公开的抗体或抗原结合片段可竞争与Aβ1-42的结合且因此在HTFRTM竞争测定中抑制参考抗体与Aβ1-42 (而非Aβ1-40)的结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可在HTRFTM测定中显示Abet0144GL对于Aβ1-42的结合的至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%抑制。
除非另外陈述，否则结合抑制功效可表示为IC50值且以nM表示。在功能测定中，IC50是使生物反应减小其最大值的50%的抗体分子浓度。在配体-结合研究中，IC50是使受体结合减小最大特异性结合水平的50%的浓度。可如下计算IC50：将最大生物反应的%绘制为抗体或抗原结合片段浓度的log的函数并使用软件程序(诸如Prism (GraphPad)或Origin(Origin Labs))以拟合数据的S形函数以生成IC50值。用于测量或测定功效的合适的测定是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，在用Abet0144-GL和Aβ1-42的HTRFTM表位竞争测定中，抗体或抗原结合片段可以具有5 nM或更小(例如2 nM或更小，例如1 nM或更小)的IC50。Abet0144-GL是具有VH结构域SEQ ID NO: 20和VL结构域SEQ ID NO: 29的抗体分子。其可以与待测试的抗体分子相同的形式(例如以scFv或IgG (例如IgG1)形式)用于测定中。因此，在HTRF表位竞争测定中，根据本公开的IgG抗体分子可与Abet0144-GL IgG竞争结合人类Aβ1-42。这种测定中的功效可小于1 nM。
在具体实施方案中，根据本公开的抗体或抗原结合片段可显示对Aβ1-42比对Aβ1-40的特异性结合，如通过HTRFTM竞争测定所测定。在这种测定中，Aβ1-40可显示无抗体或抗原结合片段与Aβ1-42肽的结合的显著抑制，例如，其可以在这种测定中显示小于20% (例如小于10%或小于5%)的抑制，并且在一些实施方案中，在这种测定中显示并无显著抑制。
在一些实施方案中，根据本公开的抗体或抗原结合片段识别人类Aβ17-42内、更具体地人类Aβ29-42内的表位且也可识别来自其他物种(例如小鼠或大鼠)的Aβ中的其靶表位。可将抗体或抗原结合片段的功效(如在HTRFTM竞争测定中使用来自第一物种(例如人类)的Aβ1-42所计算)与抗体或抗原结合片段在相同测定中使用来自第二物种的Aβ1-42(例如小鼠Aβ1-42)的功效进行比较以评价抗体或抗原结合片段对两种物种的Aβ1-42的交叉反应性的程度。如由IC50测量所测定，功效可在10倍内或100倍内。如上所示，可使用Abet0144GL作为HTRFTM竞争测定中的参考抗体。本文所述的抗体或抗原结合片段在人类Aβ1-42测定中的功效可大于非人类Aβ1-42测定中的功效。在一些实施方案中，所述抗体是有用的，因为其结合多于一种类型的毒性或潜在毒性Aβ蛋白物质(例如Aβ1-42和3-焦-42淀粉样蛋白β)。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含在抗体框架(即抗体抗原结合结构域)内具有一个或多个CDR (例如CDR的集合)的抗体分子或其抗原结合片段。例如，抗体分子可包含抗体VH和/或VL结构域。还提供了抗体分子的VH和VL结构域作为本公开的一部分。如众所周知，VH和VL结构域包含互补决定区(“CDR”)和框架区(“FW”)。VH结构域包含HCDR的集合且VL结构域包含LCDR的集合。抗体分子或其抗原结合片段可包含含有VH CDR1、CDR2和CDR3的抗体VH结构域和/或含有VL CDR1、CDR2和CDR3的抗体VL结构域。VH或VL结构域可进一步包含框架。VH或VL结构域框架通常包含4个框架区FW1、FW2、FW3和FW4，其以以下结构散布有CDR：FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4。
在6个短CDR序列中，重链的第三CDR (HCDR3)具有较大大小可变性(基本上由于产生其的基因的排列机制的较大多样性)。其可短至2个氨基酸，尽管已知最长大小为26。CDR长度也可根据可由特定潜在框架容纳的长度而变化。在功能上，HCDR3在抗体特异性的测定中发挥部分作用(Segal等人, PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit等人, Science, 233:747-753, 1986; Chothia等人, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia等人,Nature, 342:877- 883, 1989; Caton等人, J. Immunol., 144:1965-1968, 199;Sharon等人, PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon等人, J. Immunol., 144:4863-4869,1990; 和Kabat等人, J. Immunol., 147:1709-1719, 1991)。
根据本公开的方面的抗体VH和VL结构域、FW和CDR的实例列于表3和4和形成本公开的一部分的随附序列表中。本文公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR的集合、HCDR的集合和LCDR的集合以及这些要素的组合代表本公开的方面。如本文所述，“CDR的集合”包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDR的集合是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，且LCDR的集合是指LCDR1、LCDR2和 LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于分子诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb和Fd。已工程改造包括一个或多个抗体抗原结合位点的各种其他抗体分子，包括例如Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和微小抗体。抗体分子和其构建和使用方法描述于Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 2005中。
通过如实施例中所述多个文库的进一步优化和重组的广泛方法，从Abet0144GL生成一组抗体克隆。这些进一步优化的克隆称为Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383。其CDR序列和可变结构域序列可参照于表3和4且陈述于序列表中。种系化VH和VL结构域序列Abet0380GL、Abet0377GL、Abet0343GL、Abet0369GL和Abet0382GL显示于表6和表7中。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个Abet0380的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含1、2或3个Abet0380重链的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含1、2或3个Abet0380轻链的CDR。表3和4显示，Abet0380具有使用Kabat系统鉴定的CDR的集合，其中HCDR1是SEQ ID NO: 525 (Kabat残基31-35)，HCDR2是SEQ ID NO: 526 (Kabat残基50-65)，HCDR3是SEQ ID NO: 527(Kabat残基95-102)，LCDR1是SEQ ID NO: 534 (Kabat残基24-34)，LCDR2是SEQ ID NO:535 (Kabat残基50-56)且LCDR3是SEQ ID NO: 536 (Kabat残基89-97)。其他优化的抗体克隆以类似方式显示于表3和4中且还提供为本公开的方面。
根据本公开的人类Aβn-42的抗体或抗原结合片段可包含一个或多个如本文所述的CDR，例如CDR的集合。CDR或CDR的集合可以是Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383 CDR的集合或其种系化形式，或可以是如本文所述的其变体。
在一些实施方案中；
HCDR1可长5个氨基酸，其由Kabat残基31-35组成；
HCDR2可长17个氨基酸，其由Kabat残基50-65组成；
HCDR3可长16个氨基酸，其由Kabat残基95-102组成；
LCDR1可长11个氨基酸，其由Kabat残基24-34组成；
LCDR2可长7个氨基酸，其由Kabat残基50-56组成；和/或
LCDR3可长9个氨基酸，其由Kabat残基89-97组成。
抗体或抗原结合片段可包含表3和4中所列的任何抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如表3或4中所列的任何抗体的CDR的集合。所述抗体或抗原结合片段可包含这些抗体中的任一种的VH CDR的集合。任选地，其也可包含这些抗体之一的VL CDR的集合。VL CDR可与VH CDR来自相同或不同抗体。本文还提供了包含表3中所列的任何抗体的HCDR的集合的VH结构域和/或包含表4中所列的任何抗体的LCDR的集合的VL结构域。
抗体或抗原结合片段可包含表3和4中所列的任何抗体的H CDR和/或 L CDR的集合且在所公开的H CDR和/或L CDR的集合内具有一个或多个氨基酸突变(例如最多达5、10或15个突变)。突变可以是氨基酸取代、缺失或插入。例如，本公开的抗体分子可包含具有一个或两个氨基酸突变(例如取代)的来自Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383或其种系化形式中的任一种的H CDR和/或L CDR的集合。
例如，所述抗体或抗原结合片段可包含
VH结构域，其包含Abet0380或Abet0380GL HCDR的集合，其中Abet0380或Abet0380GLHCDR的氨基酸序列是
HCDR1 SEQ ID NO:525，
HCDR2 SEQ ID NO:526，和
HCDR3 SEQ ID NO:527，
或包含具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380 HCDR的集合，和
(ii) VL结构域，其包含Abet0380或Abet0380GL LCDR的集合，其中Abet0380或Abet0380GL LCDR的氨基酸序列是
LCDR1 SEQ ID NO: 534
LCDR2 SEQ ID NO:535，和
LCDR3 SEQ ID NO:536，
或包含具有一个或两个氨基酸突变的Abet0380或Abet0380GL LCDR的集合。
可在CDR的集合内的任一残基处潜在地进行突变。在一些实施方案中，可与Abet0144GL相比在Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383或其种系化形式中的任一种中的取代位置进行取代，或与Abet0380相比在Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382和Abet0383或其种系化形式中的任一种中的取代位置进行取代，如表3和4中所示。
例如，一个或多个取代可位于以下Kabat残基中的一个或多个处：
VH FW1中的26、27、28、29或30；
VH CDR1中的31、32、33、34或35；
VH CDR2中的52a、53、54、55、56、57、58或62；
VH CDR3中的98、99、100h或102；
VL CDR1中的24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34；
VL CDR3中的89、90、92、93、94或97。
特定Kabat残基位置的可能氨基酸取代的实例显示于表10和12(对于VH结构域)和表11和13(对于VL结构域)中。
如上所述，抗体或抗原结合片段可包含在抗体框架内具有一个或多个CDR (例如CDR的集合)的抗体分子。例如，可将抗体的一个或多个CDR或CDR的集合接枝至框架(例如人类框架)中以提供抗体分子。框架区可以是人类种系基因区段序列。因此，可将框架种系化，由此框架内的一个或多个残基发生改变以匹配最类似人类种系框架中的等效位置的残基。技术人员可在种系化之前选择在序列上最接近于抗体框架序列的种系区段且测试抗体的亲和力或活性以证实在本文所述测定中种系化不显著减小抗原结合或功效。本领域技术人员已知人类种系基因区段序列且可例如从VBASE编译(VBASE, MRC Centre of ProteinEngineering, UK, 1997, http//mrc-cpe.cam.ac.uk)获得。
如本文所述的抗体或抗原结合片段可以是具有在人类种系框架(例如Vh3-23 DP-47)中包含HCDR的集合的VH结构域的分离的人类抗体分子。因此，VH结构域框架区FW1、FW2和/或FW3可包含人类种系基因区段Vh3-23 DP-47的框架区和/或可通过使框架残基突变以匹配该人类种系基因区段的框架残基来进行种系化。FW4可包含人类种系j区段的框架区。
VH FW1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 528。VH FW1在Kabat位置26-30含有一系列可有助于抗原结合和/或对于CDR1环的结构构象重要的残基。可在SEQ ID NO: 528中包括取代以例如与HCDR1的所选序列协同作用。一个或多个取代可任选地选自显示于表10或表12中的那些。
VH FW2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 529。VH FW3的氨基酸序列可以是SEQ IDNO: 530。VH FW4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 531。
通常，抗体或抗原结合片段还具有例如在人类种系框架(例如Vλ 23-3 DPL-23)中包含LCDR的集合的VL结构域。因此，VL结构域框架区可包含人类种系基因区段Vλ 23-3DPL-23的框架区FW1、FW2和/或FW3和/或可通过突变框架残基以匹配该人类种系基因区段的框架残基来进行种系化。FW4可包含人类种系j区段的框架区。VL FW1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 537。VL FW2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 538。VL FW3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 539。VL FW4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 540。
种系化的VH或VL结构域可以在或可以不在一个或多个Vernier残基处进行种系化，但通常不进行种系化。
例如，如本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含与以下重链框架区的集合中的任一者具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列：
FW1 SEQ ID NO:528；
FW2 SEQ ID NO:529；
FW3 SEQ ID NO:530；
FW4 SEQ ID NO:531；
或可以包含具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸突变(例如取代)的所述重链框架区的集合。
如本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含与以下重链框架区的集合中的任一者具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列：
FW1 SEQ ID NO:537；
FW2 SEQ ID NO:538；
FW3 SEQ ID NO:539；
FW4 SEQ ID NO:540；
或可以包含具有1、2、3、4、5或6个氨基酸突变(例如取代)的所述轻链框架区的集合。
非种系化抗体分子与种系化抗体分子相比具有相同CDR，但具有不同框架。在本文随附序列表中所显示的抗体序列中，Abet0144-GL、Abet0380-GL、Abet0377-GL、Abet0343-GL、Abet0369-GL和Abet0382-GL的序列是种系化的。本文公开其序列的其他抗体分子的种系化抗体可通过将其VH和VL结构域序列的框架区任选地种系化成VH结构域中的Vh3-23DP-47和VL结构域中的Vλ 23-3 DPL-23来产生。
通常，使VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，尽管如上文所讨论，可单独使用VH或VL结构域来结合抗原。例如，可使Abet0380-GL VH结构域(SEQ ID NO:524)与Abet0380-GL VL结构域 (SEQ ID NO: 533)配对，使得形成包含Abet0380-GL VH和VL结构域的抗体抗原结合位点。提供本文所公开的其他抗体的VH和VL结构域的类似实施方案。在其他实施方案中，使Abet0380-GL VH与除Abet0380-GL VL外的VL结构域配对。本领域充分确立轻链混杂性。再次，本公开提供本文公开的其他VH和VL结构域的类似实施方案。因此，包含VH CDR的VH结构域或Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382和Abet0383中任一种的种系化VH结构域序列可与包含VL CDR的VL结构域或来自不同抗体的种系化VL结构域进行配对，例如，VH和VL结构域可来自选自Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382和Abet0383的不同抗体。
抗体或抗原结合片段可以包含
(i) 如表14或随附序列表中针对Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化形式中的任一种中所示的VH结构域氨基酸序列，
或包含具有一个或两个氨基酸突变的该氨基酸序列；和
(ii) 如表14或随附序列表中针对Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化形式中的任一种中所示的VL结构域氨基酸序列，
或包含具有一个或两个氨基酸突变的该氨基酸序列。
抗体分子可以包含：
(i) 具有与表14中针对Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化形式中的任一种所示的VH结构域氨基酸序列具有至少90%、95%或98%同一性的氨基酸序列的VH结构域；和
(ii) 具有与表14中针对Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化形式中的任一种所示的VL结构域氨基酸序列具有至少90%、95%或98%同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以包含分别与Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377和Abet0382或其种系化形式中的任一种的VH结构域和VL结构域具有至少90%、95%或98%同一性的VH结构域和VL结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含VH结构域，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含VH结构域，其中所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3；和
其中所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 528、SEQ ID NO: 529、SEQID NO: 530和SEQ ID NO: 531中的任何一种或多种的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的框架区。在一些实施方案中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 537、SEQ ID NO: 538、SEQ ID NO: 539和SEQ ID NO: 540中的任何一种或多种的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的框架区。在一些实施方案中，所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 524具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 533具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体分子或抗原结合片段包含抗体恒定区。抗体分子可以是全抗体(诸如IgG，即IgG1、IgG2或IgG4)，或可以是如下文所述的抗体片段或衍生物。抗体分子也可具有其他形式，例如在Fc区中具有YTE (Dall’Acqua等人 (2002) J. Immunology,169: 5171-5180; Dall’Acqua等人 (2006) J Biol. Chem. 281(33):23514-24)和/或TM突变(Oganesyan等人(2008) Acta Cryst D64:700-4)的IgG1。
本公开提供了具有变体Fc区的本公开的抗体或抗原结合片段，其中所述变体包含位置234的苯丙氨酸(F)残基、位置235的苯丙氨酸(F)残基或谷氨酸(E)残基和位置331的丝氨酸(S)残基，如通过Kabat中所述的EU索引所编号。此类突变组合在下文中称为三重突变体(TM)。
如本文所述的抗体或抗原结合片段可包含CDR、VH结构域、VL结构域、抗体-抗原结合位点或由以下中的任一种的核酸序列和/或载体编码的抗体分子：
(i)保藏登录号NCIMB 41889 (Abet0007)；
(ii)保藏登录号NCIMB 41890 (Abet0380-GL)；
(iii)保藏登录号NCIMB 41891 (Abet0144-GL)；
(iv)保藏登录号NCIMB 41892 (Abet0377-GL)。
如本文所述的抗体或抗原结合片段可从保藏登录号NCIMB 41889、41890、41891或41892的核酸、载体或细胞系产生或可产生。例如，可通过表达保藏登录号NCIMB 41890的细胞系的核酸或载体来产生抗体或抗原结合片段。可使用任何便利表达系统来表达核酸或载体。或者，可通过保藏登录号NCIMB 41889、41890、41891或41892的细胞系来表达抗体或抗原结合片段。
本公开的方面还提供编码VH和/或VL结构域的核酸，其含于登录号41889、41890、41891或41892的细胞系中；包含所述核酸的载体，其含于登录号41889、41890、41891或41892的细胞系中；和登录号41889、41890、41891或41892的细胞或细胞系。
根据本公开的抗体或抗原结合片段可包含与以下竞争结合至人类Aβ1-42的抗体抗原结合位点或抗体分子：由以登录号41889、41890、41891或41892保藏的核酸编码的任何抗体分子；或包含如随附序列表中所述的Abet007、Abet0380-GL、Abet0144-GL或Abet0377-GL 的VH结构域和VL结构域氨基酸序列的抗体分子。
抗体或抗原结合片段通常包含具有抗原结合位点的分子。例如，抗体或抗原结合片段可以是抗体分子或包含抗原结合位点的非抗体蛋白。
可采用单克隆和其他抗体并使用重组DNA技术的技术来产生其他结合靶抗原的抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加上框架区中。例如参见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400和大量随后文献。杂交瘤或其他产生抗体的细胞可进行基因突变或其他变化，其可改变或可不改变产生的抗体的结合特异性。
抗体工程改造的领域中可用的其他技术可分离人类和人源化抗体。例如，可如由Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545]所述来制备人类杂交瘤。
可使用其中小鼠抗体基因被失活并在功能上用人类抗体基因代替、同时完整保留小鼠免疫系统的其他组分的转基因小鼠来分离人类抗体[Mendez, M.等人(1997) NatureGenet, 15(2): 146-156]。可使用本领域已知的技术(诸如公开于例如WO91/09967、US 5,585,089、EP592106、US 565,332和WO93/17105中的那些)来产生人源化抗体。另外，WO2004/006955描述使抗体人源化的方法，其基于通过比较非人类抗体的可变区中CDR序列的规范(canonical) CDR结构类型与来自人类抗体序列(例如种系抗体基因区段)文库的相应CDR的规范CDR结构类型从人类抗体基因选择可变区框架序列。与非人类CDR具有类似规范CDR结构类型的人类抗体可变区形成由其选择人类框架序列的成员人类抗体序列的子集。可进一步根据人类和非人类CDR序列之间的氨基酸类似性来将子集成员分级。在WO2004/006955的方法中，选择最高等级的人类序列来使用所选子集成员人类框架提供用于构建用非人类CDR配对物在功能上代替人类CDR序列的嵌合抗体的框架序列，由此提供具有高亲和力和低免疫原性的人源化抗体且无需比较非人类抗体和人类抗体之间的框架序列。还公开了根据该方法制备的嵌合抗体。
可通过从借助合成且组装于合适表达载体内的寡核苷酸生成的基因进行表达来产生合成抗体分子，例如如由Knappik等人[Knappik等人 J. Mol. Biol. (2000) 296,57-86]或Krebs等人[Krebs等人 Journal of Immunological Methods 254 2001 67–84]所述。
已显示，全抗体的片段(其可在本文中称为抗体片段或抗原结合片段)可行使结合抗原的功能。抗原结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域组成的dAb片段[Ward, E.S. 等人, Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty等人 (1990) Nature, 348, 552-554; Holt等人 (2003) Trends in Biotechnology 21,484-490]；(v)分离的CDR区；(vi) F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接[Bird等人, Science, 242, 423-426, 1988; Huston等人, PNASUSA, 85, 5879-5883, 1988]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”、多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger, P.等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)。可通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体分子[Reiter, Y.等人，Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]。也可制备包含接合至CH3结构域的scFv的微小抗体[Hu, S.等人，Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]。结合片段的其他实例是Fab’，其与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处添加数个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸；和Fab’-SH，其为恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’片段。
可从本文所列的任何抗体开始通过诸如通过酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原裂解二硫桥的方法来获得本公开的抗原结合片段。以另一种方式，可通过本领域技术人员同样众所周知的基因重组技术或通过肽合成(借助例如自动肽合成仪，诸如由Applied Biosystems公司供应的那些等)或通过核酸合成和表达来获得本公开中所包含的抗原结合片段。
根据本公开的功能抗体片段包括其半衰期可通过化学修饰、尤其通过聚乙二醇化或通过并入脂质体中来增加的任一功能片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是dAb。dAb (结构域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区。VH dAb天然存在于骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼)且可通过用靶抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞且从个别B细胞直接克隆dAb基因来产生。dAb也可在细胞培养物中产生。
本领域可使用各种方法来获得抗体。所述抗体可以是单克隆抗体，尤其人类、鼠、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，其可根据本领域技术人员众所周知的标准方法来获得。
一般而言，为了制备尤其鼠来源的单克隆抗体或其功能片段，可提及具体描述于手册"Antibodies” [Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988]中的技术或由Köhler和Milstein [Köhler和Milstein, Nature, 256:495-497, 1975]所述的从杂交瘤制备的技术。
在一些实施方案中，可例如从用人类Aβ1-42或含有由所述单克隆抗体识别的表位的其片段(例如Aβ17-42)免疫的动物细胞来获得该单克隆抗体。
WO 2006/072620描述了延伸于免疫球蛋白结构域的β链之间的结构(非CDR)环中的抗原结合位点的工程改造。可在抗体分子中与CDR的天然位置分开的区域中(例如在VH或VL结构域的框架区中)或在抗体恒定结构域(例如CH1和/或CH3中)工程改造抗原结合位点。在结构区域中工程改造的抗原结合位点可附加于或代替通过VH和VL结构域的CDR的集合所形成的抗原结合位点。在多个抗原结合位点存在于抗体分子中的情况下，其可结合相同抗原(靶抗原)，由此增加抗体或抗原结合片段的化合价。或者，多个抗原结合位点可结合不同抗原(靶抗原和一个或多个另一抗原)，且这可用于增加效应物功能，延长半衰期或改善抗体分子的体内递送。
包含抗体分子的异质制剂也形成本发明的一部分。例如，此类制剂可以是具有全长重链和缺乏C-末端赖氨酸的重链、具有各种糖基化程度和/或具有衍生的氨基酸(诸如环化N-末端谷氨酸以形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。
如上所示，根据本公开的抗体或抗原结合片段结合人类Aβ1-42。如本文所述，可针对亲和力和/或HTRFTM竞争测定中的抑制功效来将本公开的抗体或抗原结合片段优化。通常，功效优化涉及使所选抗体或抗原结合片段的序列(通常抗体的可变结构域序列)突变以生成抗体或抗原结合片段的文库，然后测定功效且选择更强效的抗体或抗原结合片段。因此，所选“功效优化的”抗体或抗原结合片段的功效倾向于高于生成文库的抗体或抗原结合片段的功效。然而，也可在并未优化的情况下获得高功效抗体或抗原结合片段，例如，可从初始筛选直接获得高功效抗体或抗原结合片段。测定和功效更详细描述于本文别处。技术人员可因此生成具有高功效的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以表3和4中所列的任何抗体(例如scFv、IgG2、IgG1TM或IgG1)的亲和力或以更好的亲和力结合人类Aβ1-42。代表性抗体结合亲和力显示于表5中。可在适当条件下比较不同抗体或抗原结合片段的结合亲和力和中和功效。
可借助序列改变或突变且筛选具有期望特性的抗原抗体或抗原结合片段的方法来获得本文所述的VH和VL结构域和CDR的变体(包括本文陈述其氨基酸序列和可用于针对Aβ1-42的抗体或抗原结合片段的那些)。期望特性的实例包括但不限于：相对于对抗原具有特异性的已知抗体增加对抗原的结合亲和力；相对于对抗原具有特异性的已知抗体增加抗原活性的中和，如果该活性是相对于已知抗体或配体在特定摩尔比率下对抗原的已知指定竞争能力，免疫沉淀复合物的能力，结合以下指定表位的能力：线性表位(例如使用如本文所述的肽结合扫描鉴定的肽序列，例如使用以线性和/或受限构象筛选的肽)或构象表位(通过非邻接残基形成)，和调节人类Aβ1-42的新生物活性的能力。此类方法还提供于本文中。
可产生本文公开的抗体分子的变体并用于本公开中。在将多变量数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中的计算化学的引导下[例如参见Wold, 等人 Multivariatedata analysis in chemistry. Chemometrics–Mathematics and Statistics inChemistry (编辑: B. Kowalski); D. Reidel Publishing Company, Dordrecht,Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6]，可使用众所周知的数学技术(诸如统计学回归、模式识别和分类)推导出抗体的定性活性-性质关系[例如参见Norman等人， AppliedRegression Analysis. Wiley-Interscience；第3版(1998年4月) ISBN: 0471170828；Kandel, Abraham等人， Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR, (1995年5月11日), ISBN: 0133418847；Krzanowski, Wojtek.Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford StatisticalScience Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press；(2000年12月), ISBN:0198507089；Witten, Ian H.等人，Data Mining: Practical Machine Learning Toolsand Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann；(1999年10月11日),ISBN: 1558605525；Denison David G. T. (编辑)等人，Bayesian Methods forNonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability andStatistics). John Wiley & Sons；(2002年7月), ISBN: 0471490369；Ghose, Arup K.等人， Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools,and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8]。可从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型推导出抗体的特性(例如分析可能接触残基或计算的物理化学特性)且可个别和组合地考虑这些特性。
在一些实施方案中，由VH结构域和VL结构域构成的抗原结合位点通常由6个多肽环形成：三个来自轻链可变结构域(VL)且三个来自重链可变结构域(VH)。具有已知原子结构的抗体的分析已阐明序列和抗体组合位点的三维结构之间的关系[Chothia C. 等人Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, 等人. JournalMolecular Biology (1997) 273(4), 927-948]。这些关系暗示，除VH结构域中的第三区域(环)外，结合位点环具有少量主链构象之一：规范结构。已显示，特定环中形成的规范结构取决于其大小和在环和框架区中的关键位点处某些残基的存在。
该序列-结构关系的研究可用于预测序列已知、但三维结构未知的抗体中对于维持其CDR环的三维结构且因此维持结合特异性重要的那些残基。可通过比较预测与来自先导优化实验的输出来支持这些预测。以结构方法，可使用任何自由获得或商业包装(诸如WAM) [Whitelegg, N.R.u.和Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824]来产生抗体分子的模型[Chothia等人，Science, 223,755-758 (1986)]。然后可使用蛋白可视化和分析软件包(诸如Insight II (Accelrys, Inc.)或Deep View [Guex, N.和Peitsch, M.C.Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723])来评估CDR中的每个位置处的可能取代。然后可使用该信息来进行可能对活性具有最小或有益效应的取代。
在CDR、抗体VH或VL结构域和抗体或抗原结合片段的氨基酸序列内进行取代所需的技术通常可在本领域获得。可在预计可对活性或可不对活性具有最小或有益效应的取代下制备变体序列，且测试结合Aβ1-42的能力和/或任何其他期望特性。
如所讨论，可根据本公开采用本文具体公开其序列的VH和VL结构域中的任一种的可变结构域氨基酸序列变体。
如上所述，本公开的方面提供了抗体或抗原结合片段(诸如抗体分子)，其包含与表8中所列的任何抗体的VH结构域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的VH结构域，其VH结构域的序列显示于下文随附序列表中；和/或包含与表9中所列的任何抗体的VL结构域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的VL结构域，其VL结构域的序列显示于随附序列表中。
本公开的方面提供了抗体或抗原结合片段(诸如抗体分子)，其包含具有与本文所列的任何抗体的VH CDR的集合具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的VH CDR的集合的VH结构域，其VH CDR序列显示于本文中；和/或包含具有与本文所列的任何抗体的VL CDR的集合具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的VL CDR的集合的VL结构域，其VL CDR序列显示于本文中。
可用于计算两个氨基酸序列的%同一性的算法包括例如BLAST [Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]、FASTA [Pearson和Lipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448]或Smith-Waterman算法[Smith和Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197]，例如采用默认参数。
具体可变结构域可包括一个或多个氨基酸序列突变(氨基酸残基的取代、缺失和/或插入)和小于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。
可在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中进行突变。突变通常不导致功能的损失，从而包含因此改变的氨基酸序列的抗体或抗原结合片段可保留结合人类Aβ1-42的能力。其可保留与其中未进行改变的抗体或其抗原结合片段相同的定量结合和/或中和能力，例如如在本文所述的测定中所测量。包含因此改变的氨基酸序列的抗体或抗原结合片段可具有结合人类Aβ1-42的改善的能力。
突变可包括用非天然存在或非标准氨基酸代替一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然存在或非标准形式或将一个或多个非天然存在或非标准氨基酸插入序列中。本公开的序列中的改变的数量和位置的实例描述于本文别处。天然存在的氨基酸包括20个根据其标准单字母代码标识为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E的“标准” L-氨基酸。非标准氨基酸包括可并入多肽主链中或源自现有氨基酸残基的修饰的任何其他残基。非标准氨基酸可以是天然存在或非天然存在的。本领域已知几种天然存在的非标准氨基酸，诸如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰基丝氨酸等[Voet & Voet, Biochemistry，第2版，(Wiley) 1995]。衍生于其N-α位置的那些氨基酸残基仅位于氨基酸序列的N-末端处。通常，在本公开中，氨基酸是L-氨基酸，但其可以是D-氨基酸。改变可因此包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸或用D-氨基酸代替其。还已知氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酰化形式，且本公开的氨基酸可进行此类修饰。
本公开的抗体结构域和抗体或抗原结合片段中的氨基酸序列可包含上述非天然或非标准氨基酸。可在合成期间或在合成氨基酸序列之后通过修饰或代替“原始”标准氨基酸来将非标准氨基酸(例如D-氨基酸)并入氨基酸序列中。
非标准和/或非天然存在的氨基酸的使用增加了结构和功能多样性，且可因此增加在本公开的抗体或抗原结合片段中实现期望结合和中和特性的潜能。另外，已显示D-氨基酸和类似物与标准L-氨基酸相比具有不同药代动力学概况，这是由于具有L-氨基酸的多肽在施用于动物(例如人类)之后在体内降解，意味着D-氨基酸对于一些体内应用是有利的。
可使用一个或多个所选VH和/或VL基因的随机诱变以在整个可变结构域内生成突变来生成本公开的携带CDR源序列的新型VH或VL区。这种技术由Gram等人[Gram等人,1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580](其使用易错PCR)描述。在一些实施方案中，在整个可变结构域或CDR的集合内进行一个或两个氨基酸取代。
可使用的另一种方法是直接诱变成VH或VL基因的CDR区。此类技术由Barbas等人[Barbas等人，1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813]和Schier等人[Schier等人，1996, J. Mol. Biol. 263:551-567]公开。
所有上述技术在本领域本身已知且技术人员能够使用此类技术来使用本领域常规方法来提供本公开的抗体或抗原结合片段。
本公开的一个进一步方面提供了用于获得用于人类Aβ1-42的抗体抗原结合位点的方法，所述方法包括通过本文所述的VH结构域的氨基酸序列中取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的方式来提供作为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选地组合因此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域，和测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合以鉴定用于Aβ1-42且任选地具有一种或多种期望特性的抗体或抗原结合片段或抗体抗原结合位点。所述VL结构域可具有实质上如本文所述的氨基酸序列。可采用其中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合的类似方法。
如上所示，可将实质上如本文所述的CDR氨基酸序列作为CDR并入人类抗体可变结构域或其实质性部分中。实质上如本文所述的HCDR3序列代表本公开的实施方案且这些各自可作为HCDR3并入人类重链可变结构域或其实质性部分中。
本公开中采用的可变结构域可从任何种系或重排的人类可变结构域获得或衍生，或可以是基于已知人类可变结构域的共有或实际序列的合成可变结构域。可变结构域可衍生自非人类抗体。可使用重组DNA技术将本公开的CDR序列(例如CDR3)引入缺乏CDR (例如CDR3)的可变结构域谱(repertoire)中。例如，Marks等人[Marks等人，Bio/Technology,1992, 10:779-783]描述了产生抗体可变结构域谱的方法，其中结合使用指向或邻近可变结构域区域的5'端的共有引物与指向人类VH基因的第三框架区的共有引物来提供缺乏CDR3的VH可变结构域谱。Marks等人进一步描述了该谱可以如何与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，可用缺乏CDR3 VH或VL结构域的谱改组本公开的CDR3衍生的序列，且改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域进行组合以提供本公开的抗体或抗原结合片段。该谱然后可展示于合适宿主系统(诸如WO92/01047 (其以其整体通过引用并入本文)或随后大量文献(包括Kay、Winter和McCafferty [Kay, B.K.、Winter, J.和McCafferty, J.(1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, SanDiego: Academic Press])中的任一种的噬菌体展示系统)中，使得可选择合适抗体或抗原结合片段。谱可由104个以上个体成员(例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员或更多)中的任何组成。其他合适宿主系统包括但不限于酵母展示、细菌展示、T7展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。
提供了制备人类Aβ1-42的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a) 提供了编码包括待代替的CDR3或缺乏CDR3编码区的VH结构域的核酸的起始谱；
(b) 组合所述谱与编码实质上如本文针对VH CDR3 (例如表9中所示的VH CDR3)所述的氨基酸序列的供体核酸，使得将所述供体核酸插入该谱中的CDR3区中以提供编码VH结构域的核酸产物谱；
(c) 表达所述产物谱的核酸；
(d) 选择用于人类Aβ1-42的抗体或抗原结合片段；和
(e) 回收所述抗体或抗原结合片段或编码其的核酸。
再次，可采用组合本公开的VL CDR3与编码包括待代替的CDR3或缺乏CDR3编码区的VL结构域的核酸谱的类似方法。
类似地，可将一个或多个或所有三个CDR接枝至VH或VL结构域谱中，然后筛选针对人类Aβ1-42的一种或多种抗体或抗原结合片段。
例如，可采用表3或表4中所列的一种或多种抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3 (例如HCDR的集合)，和/或可采用本文所列的一种或多种抗体的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3 (例如LCDR的集合)。
类似地，可采用本文公开的其他VH和VL结构域、CDR的集合和HCDR的集合和/或LCDR的集合。
大部分免疫球蛋白可变结构域可包含至少三个CDR区以及其插入框架区。该部分也可包括至少约50%的第一和第四框架区中的任一者或两者，该50%是第一框架区的C-末端50%和第四框架区的N-末端50%。大部分可变结构域的N-末端或C-末端处的额外残基可以是正常不与天然可变结构域区相关的那些。例如，通过重组DNA技术制备的本公开的抗体或抗原结合片段的构建可导致引入由引入的接头编码的N-末端或C-末端残基以促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头将本公开的可变结构域接合至如本文别处更详细讨论的包括抗体恒定区、其他可变结构域(例如在产生双抗体中)或可检测/功能标记物的其他蛋白序列。
尽管在本公开的一些方面中抗体或抗原结合片段包含一对VH和VL结构域，但基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域形成本公开的进一步方面。已知，单一免疫球蛋白结构域、尤其VH结构域能够以特异性方式结合靶抗原。参见，例如，上文的dAb的讨论。
在任一单一结合结构域的情况下，可使用这些结构域筛选能够形成能够结合Aβ1-42的二结构域抗体或抗原结合片段的互补结构域。这可通过噬菌体展示筛选方法使用如WO92/01047 (其以其整体通过引用并入本文)中公开的所谓的分层双重组合方法来实现，其中使用含有H或L链克隆的个别集落来感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库且根据噬菌体展示技术(诸如描述于参考文献中的那些)选择所得双链抗体或抗原结合片段。该技术还公开于Marks等人，Bio/Technology, 1992, 10:779-783中。
本公开的抗体或抗原结合片段可进一步包含抗体恒定区或其部分(例如人类抗体恒定区或其部分)。例如，VL结构域可在其C-末端附接至包括人类Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定结构域。类似地，基于VH结构域的抗体或抗原结合片段可在其C-末端附接至衍生自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同种型子类(尤其是IgG2、IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或一部分(例如CH1结构域)。在一些实施方案中，IgG2可以由于其缺乏效应物功能而有利。在其他实施方案中，IgG1可以由于其效应物功能和制造便利性而有利。具有这些特性且稳定可变区的任何合成或其他恒定区变体也可用于本公开中。
本公开的一个方面提供了包括引起或允许如本文所提供的抗体或抗原结合片段与人类Aβ1-42的结合的方法。如所示，这种结合可发生于体内(例如在施用抗体或抗原结合片段或编码抗体或抗原结合片段的核酸后)，或其可发生于体外(例如在ELISA、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和力色谱和生物化学或基于细胞的测定)。
本公开还提供了上述抗体或抗原结合片段用于在竞争测定中测量抗原水平的用途，也就是说通过在竞争测定中采用如由本公开提供的抗体或抗原结合片段来测量样品中的抗原的水平的方法。这可无需物理分离结合的抗原与未结合的抗原。将报告分子连接至抗体或抗原结合片段，使得在结合时发生物理或光学变化，这是一种可能性。报告分子可直接或间接生成可检测且可定量的信号。报告分子可直接或间接、共价(例如经由肽键)或非共价进行连接。经由肽键的连接可以是编码抗体和报告分子的基因融合体的重组表达的结果。
可容易地在体外测定抗体或抗原结合片段之间的竞争，以使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的抗体或抗原结合片段，例如使用ELISA和/或通过生物化学竞争测定，诸如将特定报告分子标记至一种抗体或抗原结合片段，其可在一种或多种其他未标记的抗体或抗原结合片段存在的情况下被检测到。此类方法易于为本领域普通技术人员所知，且更详细描述于本文中。
本公开延伸至与本文所定义的任何抗体或抗原结合片段(例如表3和4中所列的任何抗体，例如以IgG2、IgG1或IgG1三重突变(“TM”；Oganesyan等人(2008) ActaCrystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4)形式)竞争结合人类Aβ1-42的抗体或抗原结合片段。可容易地在体外测定抗体或抗原结合片段之间的竞争，以使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的抗体或抗原结合片段，例如通过将特定报告分子标记至一种抗体或抗原结合片段，其可在其他未标记的抗体或抗原结合片段存在的情况下被检测来。可例如使用ELISA来测定竞争，其中将Aβ1-42固定至板上且向板中添加第一标签或标记的抗体或抗原结合片段以及一种或多种其他未标签化或未标记的抗体或抗原结合片段。通过由标签化的抗体或抗原结合片段发射的信号的降低来观察与标签化的抗体或抗原结合片段竞争的未标签化的抗体或抗原结合片段的存在。
竞争测定也可用于表位定位中。在一种情况下，可使用表位定位来鉴定由任选地可具有优化中和和/或调节特征的抗体或抗原结合片段结合的表位。这种表位可以是线性或构象的。构象表位可包含至少两个Aβ的不同片段，其中在Aβ肽以其三级或四级结构折叠时，所述片段彼此靠近定位以形成由Aβ的抑制剂(诸如Aβ -抗体或抗原结合片段)识别的构象表位。在测试竞争时，可采用抗原的肽片段，尤其是包括目标表位或基本上由其组成的肽。可使用在任一端具有表位序列加上一个或多个氨基酸的肽。根据本公开的抗体或抗原结合片段可使得其抗原结合由具有或包括给定序列的肽抑制。
如本文所用，术语“分离的”是指本公开的抗体或抗原结合片段或编码此类抗体或抗原结合片段的核酸将通常根据本公开的状态。因此，可提供本公开的分离和/或纯化的抗体或抗原结合片段、VH和/或VL结构域和编码核酸分子和载体，例如来自其天然环境以实质上纯或均质形式或在核酸情况下不含或实质上不含除编码具有所需功能的多肽的序列外的来源的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸不含或实质上不含与其天然缔合的材料，诸如其他与其一起发现于天然环境或其制备环境(例如细胞培养物，在通过重组DNA技术在体外或在体内实施这种制备时)中的多肽或核酸。可用稀释剂或助剂配制成员和核酸且还出于实践目的进行分离-例如，通常将成员与明胶或其他载体混合(如果用于包被用于免疫测定中的微量滴定板)，或与药学上可接受的载体或稀释剂混合(当用于诊断或疗法中时)。可天然地或通过异源真核细胞(例如CHO或NS0 (ECACC 85110503)细胞)系统将抗体或抗原结合片段糖基化，或其可(例如如果通过在原核细胞中表达而产生)未糖基化。
4. 核酸、细胞和产生方法
在进一步方面，本公开提供了分离的核酸，其包括编码本公开的抗体或抗原结合片段、VH结构域和/或VL结构域的序列；和制备本公开的抗体或抗原结合片段、VH结构域和/或VL结构域的方法，其包括在使得产生所述抗体或抗原结合片段、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸，和将所述抗体或抗原结合片段、VH结构域和/或VL结构域回收。编码核酸序列的实例陈述于表格和随附序列表中。根据本公开的核酸序列可包含DNA或RNA且可以是完全或部分合成的。除非上下文另外需要，否则对如本文所述的核苷酸序列的提及涵盖具有指定序列的DNA分子，且涵盖具有指定序列的RNA分子(其中使用U代替T)。
本公开还提供了呈质粒、载体(诸如质粒或噬菌体载体)、转录或表达盒(其包含至少一种例如可操作地连接至调控元件的上述多核苷酸)的形式的构建体。
一个进一步方面提供了含有本公开的核酸和/或载体或用其转化的宿主细胞。本公开还提供了包含一种或多种上述构建体的重组宿主细胞系。编码所提供的任何CDR或CDR的集合或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子(例如scFv或IgG (例如IgG2、IgG1或IgG1TM))的核酸序列以及产生编码产物的方法(该方法包括从其编码核酸序列表达)形成本发明的一个方面。可便利地通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来实现表达。在通过表达产生后，可使用任何合适技术分离和/或纯化VH或VL结构域或抗体或抗原结合片段，然后适当使用。
因此，本公开的另一个方面是产生抗体VH可变结构域的方法，该方法包括从编码核酸序列引起表达。这种方法可包括在产生所述抗体VH可变结构域的条件下培养宿主细胞。
提供了用于产生VL可变结构域和包含VH和/或VL结构域的抗体或抗原结合片段的类似方法作为本公开的进一步方面。
产生方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。产生方法可包括将产物配制成包含至少一种额外组分(诸如药学上可接受的赋形剂)的组合物。
用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统和转基因植物和动物。本领域已充分确立抗体和抗体片段在原核细胞中的表达。对于综述，参见例如Plückthun[Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]。常用的细菌宿主是大肠杆菌。
本领域技术人员也可利用培养物中真核细胞中的表达作为用于产生抗体或抗原结合片段的选择[Chadd HE和Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology12: 188-194; Andersen DC和Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology13: 117; Larrick JW和Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418]。
本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人类胚胎肾细胞、人类胚胎视网膜细胞和许多其他细胞系。
可适当时选择或构建含有适当调控序列(包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他序列)的合适载体。载体可适当时为质粒(例如噬菌粒)或病毒载体(例如'噬菌体) [Sambrook和Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第3版，2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]。许多用于操纵核酸(例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达)和分析蛋白的已知技术和方案详细描述于Ausubel等人[Ausubel等人编辑，Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，第4版，1999]中。
本公开的一个进一步方面提供了含有如本文所公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以是体外的且可在培养物中。这种宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在可允许将本公开的抗体或抗原结合片段细胞内表达为“内抗体”或细胞内抗体。内抗体可用于基因疗法。
另一个方面提供了包括将本公开的核酸引入宿主细胞中的方法。引入可采用任一可用技术。对于真核细胞，合适技术可包括钙磷酸盐转染、DEAE-右旋糖酐转染、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘(Vaccinia))或(对于昆虫细胞)杆状病毒的转导。宿主细胞、尤其真核细胞中核酸的引入可使用基于病毒或基于质粒的系统。质粒系统可附加体地维持或可并入宿主细胞或人工染色体中。并入可通过在单一或多个基因座处随机或靶向整合一个或多个拷贝来进行。对于细菌细胞，合适技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在引入后可例如通过在用于表达基因的条件下培养宿主细胞来引起或允许从核酸的表达。可通过本领域技术人员已知的方法来纯化表达产物。
可将本公开的核酸整合至宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，可通过包括促进基因组重组的序列来促进整合。
本公开还提供了包括在表达系统中使用如上文所述的构建体以表达上述抗体或抗原结合片段或多肽的方法。
5. 治疗方法
本公开提供了使用本文公开的任何分子的任何组合治疗具有疾病或病症的主体的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用以下物质治疗具有疾病或病症的主体的方法：a)本文公开的任何抗体或抗原结合片段，和b)本文公开的任何BACE抑制剂。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3；
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是 或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂是。
对于本文所述的任何方法，本公开涵盖一种方法的任何一个或多个步骤与来自另一种方法的任何一个或多个步骤的组合。这些方法涉及向有需要的个体施用有效量的适用于特定疾病或病症的本公开的任何化合物。在具体实施方案中，这些方法涉及向有需要的主体递送本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂的组合。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是任何与Aβ累积相关的疾病或病症。在一些实施方案中，Aβ累积是Aβ的脑和/或海马累积。在一些实施方案中，Aβ累积是神经元内的。在一些实施方案中，Aβ累积是细胞外的。在一些实施方案中，Aβ累积在内皮细胞中。在一些实施方案中，Aβ累积在视网膜中。在一些实施方案中，Aβ累积在脑血管中。在一些实施方案中，本文公开的任何治疗方法可用于预防、减小或逆转(例如清除)Aβ累积。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是神经退化性疾病或病症。在具体实施方案中，所述疾病或病症是阿尔茨海默病、唐氏综合征、黄斑退化或认知损害。在一些实施方案中，所述主体是哺乳动物。在具体实施方案中，所述主体是人类。
在一些实施方案中，向主体施用治疗有效剂量的本文公开的任何BACE抑制剂与治疗有效剂量的本文公开的任何抗体或抗原结合片段的组合。术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”意指产生施用其所针对的期望效应的剂量或量。精确剂量将取决于治疗目的，且可由本领域技术人员使用已知技术(例如参见Lloyd (1999) The Art, Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)来确定。
本公开尤其涉及在生成患者中的有益治疗反应(例如减少CSF中的Aβ1-42、减小斑块负荷、抑制斑块形成、降低神经炎营养不良、改善认知功能和/或逆转、减小或预防认知衰退)的条件下向患者通过施用本公开的治疗抗体来治疗患者中的阿尔茨海默病和其他淀粉样蛋白生成疾病(例如预防或治疗淀粉样蛋白生成疾病)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“缓解”等在本文中通常用于意指获得期望药理学和/或生理学效应，且也可用于是指改善、缓解所治疗病况的一种或多种症状和/或降低其严重程度。效应可以是预防性(就完全或部分地延迟疾病、病况或其症状的发作或复发而言)，和/或可以是治疗性(就部分地或完全治愈疾病或病况和/或可归因于该疾病或病况的不良效应而言)。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物、尤其人类的疾病或病况的任何治疗，且包括以下中的任何一种或多种：(a)预防疾病或病况发生于可易患疾病或病况、但尚未诊断为具有该疾病或病况的主体中；(b)抑制疾病或病况(例如阻止其发生)；或(c)减轻疾病或病况(例如引起疾病或病况消退，提供一种或多种症状的改善)。例如，阿尔茨海默病的“治疗”涵盖该疾病的完全逆转或治愈或可归因于阿尔茨海默病的病况和/或不良效应的任何范围改善。仅仅为了说明，阿尔茨海默病的“治疗”包括改善与阿尔茨海默病相关的以下效应中的任一种或其组合：精神衰退、精神错乱、妄想、定向障碍、健忘、难以集中精神、不能产生新记忆、攻击、激动、易怒、个性变化、缺乏克制、愤怒、冷漠、普遍不满、孤独、情绪波动、抑郁、幻觉、偏执狂、食欲不振、坐立不安、不能组合肌肉移动、言语混乱、突触损害、神经元丢失、淀粉样蛋白β累积、tau过磷酸化、tau蛋白累积、淀粉样蛋白斑块形成和神经原纤维缠结形成。可容易地根据本领域已知的标准方法和技术来评价任何这些病况的改善。也可监测上文未列出的其他症状以确定治疗神经退化性疾病(诸如阿尔茨海默病)的有效性。通过疾病方法治疗的主体群体包括患有不期望病况或疾病的主体以及处于发展病况或疾病风险下的主体。
在一些实施方案中，本文公开的治疗预防Aβn-42物质在脑中的生成和/或累积。在一些实施方案中，Aβn-42物质是Aβ1-42、Aβ焦3-焦-42、Aβ4-42或Aβ11-焦-42中的一种或多种。在一些实施方案中，本文公开的治疗预防Aβ1-43累积。在一些实施方案中，本文公开的治疗预防Aβ寡聚物和/或斑块的生成和/或累积。
本公开提供了预防或治疗与患者脑中的Aβ淀粉样蛋白沉积相关的疾病的方法。此类疾病包括阿尔茨海默病、唐氏综合征和认知损害。认知损害可在具有或不具有淀粉样蛋白生成疾病的其他特性下发生。本公开提供了治疗黄斑退化(与Aβ相关的病况)的方法。本公开的方法可涉及向患者施用有效剂量的特异性结合1-42 Aβ和其N-末端截短物的抗体与本文公开的任何BACE抑制剂的组合。
本文公开的任何抗体或抗原结合片段可以与本文公开的任何BACE抑制剂组合用于治疗方案中用于预防或改善神经病变和(在一些患者中)与阿尔茨海默病相关的认知损害。
适于治疗的患者包括显示症状的患者以及处于疾病风险下、但未显示症状的个体。对于阿尔茨海默病，生活足够长时间的任何人都可能处于风险下。本文公开的任何抗体或抗原结合片段可与本文公开的任何BACE抑制剂组合使用且预防性施用于主体，而并未对主体患者的风险进行任何评价。适于治疗的患者包括具有阿尔茨海默病的已知遗传风险的个体，例如与该疾病具有血亲的个体和通过分析遗传或生物化学标记物来确定风险的那些。阿尔茨海默病倾向的基因标记物包括APP基因突变、尤其在位置717和位置670和671的突变(分别称为Hardy和Swedish突变)。其他风险标记物是早老素基因PS1和PS2和ApoE4的突变、AD家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。可通过与阿尔茨海默病相关的特征性痴呆以及通过上述风险因素的存在来诊断患有该疾病的个体。可利用许多诊断测试来帮助鉴定个体中的阿尔茨海默病。这些包括CSF tau和Aβ1-42水平的测量。升高的tau和降低的Aβ1-42水平可指示AD的存在。也可通过NINCDS-ADRDA或DSM-IV-TR标准来诊断患有阿尔茨海默病的个体。在一些实施方案中，待治疗的阿尔茨海默病是轻度(早期)、中等(中期)或严重(晚期)阿尔茨海默病。
在无症状患者中，治疗可以开始于任何年龄(例如至少10、20、30岁)。通常，在晚年生命(例如当患者达到其40多岁、50多岁、60多岁或70多岁时)开始治疗。治疗可以涉及在一定时间段(其可以是患者余生的持续时间)内的多个剂量。可通过测量随时间的抗体水平来监测施用重复剂量的需要。由于阿尔茨海默病可在唐氏综合征患者中具有早期发作，所以与在非唐氏综合征患者中相比，可在生命早期(例如当患者至少为10、20、30岁时)开始施用本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂的组合。
对于预防，以足以消除或减小疾病(包括疾病的生物化学、组织学、认知损害和/或行为症状、其并发症和在发生疾病期间呈现的中间病理学表型)的风险、减弱其严重程度或延迟其发作的量将药物组合物或药剂施用于易患阿尔茨海默病或另外处于阿尔茨海默病风险下的患者。对于治疗应用，以足以治愈或至少部分地阻止疾病的症状(生物化学、组织学、认知损害和/或行为症状，包括其并发症和在发生疾病时的中间病理学表型)的量将组合物或药剂施用于怀疑患有或已经患有这种疾病的患者。
治疗方法可以包括(i)鉴定具有如本文所提及与淀粉样变性相关的病况的患者，和(ii)施用治疗有效剂量的本文公开的任何抗体或抗原结合片段与治疗有效剂量的本文公开的任何BACE抑制剂的组合，其中血浆和/或CSF中的Aβ1-42的水平降低，且减少淀粉样变性。
因此，本公开的进一步方面提供了治疗方法，其包括施用本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂的组合、包含单独或与本文公开的任何BACE抑制剂组合的本文公开的任何抗体或抗原结合片段的药物组合物、包含单独或与本文公开的任何抗体或抗原结合片段组合的本文公开的任何BACE抑制剂的药物组合物；和这种抗体或抗原结合片段和/或BACE抑制剂在制造用于施用的药剂，例如在制备药剂或药物组合物的方法(包括配制抗体或抗原结合片段和/或BACE抑制剂与药学上可接受的赋形剂)中的用途。药学上可接受的赋形剂可以是如下化合物或化合物的组合：其进入药物组合物中，不激起二级反应且允许例如促进抗体或抗原结合片段的施用、增加其寿命和/或其在身体中的效力、增加其在溶液中的溶解性或另外其保存的改善。这些药学上可接受的媒介物是众所周知的且由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和施用模式来调整。
通常将以药物组合物的形式来施用如本文所述的抗体或抗原结合片段，所述形式除了抗体或抗原结合片段以外还可包含至少一种组分。因此，除了抗体或抗原结合片段以外，根据本公开且用于根据本公开使用的药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应当无毒且应当不干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径。
通常将以药物组合物的形式来施用如本文所述的BACE抑制剂，所述形式除了抗体或抗原结合片段以外还可包含至少一种组分。因此，除了抗体或抗原结合片段以外，根据本公开且用于根据本公开使用的药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应当无毒且应当不干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质取决于施用途径。
在一些实施方案中，借助以下施用途径中的任何一种或多种将本文公开的任何BACE抑制剂和/或任何抗体或其抗原结合片段施用于主体：肠胃外、真皮内、肌内、腹膜内、心肌内、静脉内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外、鞘内、颅内、心室内和口服途径。
在一些实施方案中，将本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂在同一组合物中施用。在一些实施方案中，将本文公开的任何抗体或抗原结合片段与包含本文公开的任何BACE抑制剂的组合物在分开组合物中施用。在一些实施方案中，如果将包含本文公开的任何抗体或抗原结合片段的组合物与包含本文公开的任何BACE抑制剂的组合物分开施用，则通过相同施用途径将所述组合物施用于主体。在一些实施方案中，通过不同施用途径将组合物施用于主体。在一些实施方案中，经由注射将包含本文公开的任何抗体或抗原结合片段的组合物施用于主体。在一些实施方案中，所述注射是静脉内的。在一些实施方案中，所述注射是皮下的。在一些实施方案中，将包含本文公开的任何BACE抑制剂的组合物经口施用于主体。
在一些实施方案中，当与本文公开的任何抗体或抗原结合片段组合施用于主体时，本文公开的任何BACE抑制剂的药学上有效剂量小于BACE抑制剂当单独施用时的药学上有效剂量。在一些实施方案中，当与本文公开的任何BACE抑制剂组合施用于主体时，本文公开的任何抗体或抗原结合片段的药学上有效剂量小于抗体或抗原结合片段当单独施用时的药学上有效剂量。
对于可注射制剂(例如对于静脉内或皮下注射)，活性成分将呈肠胃外可接受水溶液的形式，所述水溶液无热原且具有合适pH、等渗性和稳定性。根据分子的物理化学特性和递送途径，如本文所述的抗体或抗原结合片段可配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括宽范围的抗体浓度和pH。可通过例如冻干、喷雾干燥或通过超临界流体技术干燥来产生固体制剂。可通过注射(例如皮下或静脉内)给予治疗。可通过脉冲输注、尤其用渐降剂量的抗体或抗原结合片段来施用治疗。可根据治疗的物理化学特性、疾病特殊考虑或优化效力或最小化副作用的需求来确定施用途径。一种特定施用途径是静脉内的。另一种施用本公开的药物组合物的途径是皮下的。使用无针装置的皮下注射也是有利的。在一些实施方案中，借助注射将本文公开的任何抗体或抗原结合片段施用于主体。
本文公开的任何抗体或抗原结合片段和本文公开的任何BACE抑制剂可同时或依次施用于主体。在一些实施方案中，将本文公开的任何抗体或抗原结合片段/BACE抑制剂组合疗法进一步与其他治疗进行组合。
在一些实施方案中，本公开的任何抗体或抗原结合片段和本公开的任何BACE抑制剂可用于制造药剂。所述药剂可用于分开或组合施用于个体，且因此可包含作为组合制剂或分开制剂的抗体或抗原结合片段和BACE抑制剂。分开制剂可用于促进分开和依次或同时施用，且允许通过不同途径(例如口服和可注射(例如静脉内和/或皮下)施用)来施用组分。
在一些实施方案中，可将本文公开的任何组合疗法(例如涉及施用本文公开的任何抗体或抗原结合片段与本文公开的任何BACE抑制剂的组合的任何疗法)与额外疗法组合施用于主体。在一些实施方案中，额外疗法包括但不限于记忆训练练习、记忆辅助器、认知训练、饮食疗法、职能疗法、物理疗法、精神病学疗法、按摩、针刺、针压、助行器、辅助动物等。在一些实施方案中，额外疗法是向主体施用额外药用组分。在一些实施方案中，可使用额外药用组分来提供显著协同效应，尤其是抗体或抗原结合片段与一种或多种其他药物的组合。在一些实施方案中，将额外药用组分与本文公开的任何BACE抑制剂和/或本文公开的任何抗体或抗原结合片段同时或依次或作为组合制剂来施用用于治疗本文所列的一种或多种病况。在一些实施方案中，额外药用组分是小分子、多肽、抗体、反义寡核苷酸和/或siRNA分子。在一些实施方案中，额外药用组分是以下中的任何一种或多种：多奈派齐(Aricept)、加兰他敏(Razadyne)、美金刚(Namenda)、利斯的明(Exelon)或他克林(Cognex)。在一些实施方案中，额外药用组分是抗抑郁剂、抗焦虑剂、抗精神病剂或安眠药。在一些实施方案中，本公开的任何抗体或抗原结合片段和上述额外药用组分中的一种或多种可用于制造药剂。所述药剂可用于分开或组合施用于个体，且因此可包含作为组合制剂或分开制剂的抗体或抗原结合片段和额外组分。分开制剂可用于促进分开和依次或同时施用，且允许通过不同途径(例如口服、静脉内和肠胃外施用)来施用组分。
在一些实施方案中，本公开的任何BACE抑制剂和上述额外药用组分中的一种或多种可用于制造药剂。所述药剂可用于分开或组合施用于个体，且因此可包含作为组合制剂或分开制剂的BACE抑制剂和额外组分。分开制剂可用于促进分开和依次或同时施用，且允许通过不同途径(例如口服和肠胃外施用)来施用组分。
在一些实施方案中，本公开的任何抗体或抗原结合片段和上述额外药用组分中的一种或多种可用于制造药剂。所述药剂可用于分开或组合施用于个体，且因此可包含作为组合制剂或分开制剂的抗体或抗原结合片段和额外组分。分开制剂可用于促进分开和依次或同时施用，且允许通过不同途径(例如口服和肠胃外施用)来施用组分。
可将提供的组合物施用于哺乳动物。施用通常以治疗有效量进行，这足以向患者显示益处。这种益处可至少改善至少一种症状。实际施用量和施用速率和时程将取决于所治疗者的性质和严重程度、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病况、病症的病因、组合物的递送位点、抗体或抗原结合片段和/或BACE抑制剂的类型、施用方法、施用的安排和医师已知的其他因素。治疗的处方(例如关于剂量的决策等)由全科从业者和其他医师负责且可取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。可通过比较其体外活性和动物模型中的体内活性来测定本公开的抗体或抗原结合片段和/或本公开的BACE抑制剂的治疗有效量或合适剂量。将测试动物中的有效剂量外推至人类的方法是已知的。可施用初始较高载量剂量，随后施用一个或多个较低剂量。可根据医师处理以每天、每周两次、每周或每月间隔来重复治疗。可以每2至4周(对于皮下施用)和每4至8周(对于静脉内施用)来进行治疗。治疗可以是周期性，且施用之间的时段为约两周或更长(例如约三周或更长、约4周或更长或约每月一次)。
本公开的各个进一步方面和实施方案将是本领域技术人员鉴于本公开显而易见的。
出于所有目的，本说明书中所提及的所有文件(包含数据库参考和登录号、专利、专利申请和公开)以其整体通过引用并入本文。
除非上下文另外指示，否则上述特征的说明和定义并不限于本公开的任何特定方面或实施方案且同样应用于所述的所有方面和实施方案。
现在将通过实例的方式且参照附图和表格来说明本公开的某些方面和实施方案。
6. 药剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了药剂盒，其包含本文公开的任何BACE抑制剂和本文公开的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述BACE抑制剂在适于经口施用的组合物中。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段在适于静脉内或皮下施用的组合物中。
实施例
已经用NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn,Aberdeen, AB21 9YA. Scotland, UK来保藏以下序列：
大肠杆菌TOP10细胞Abet0007 = NCIMB 41889
大肠杆菌TOP10细胞Abet0380-GL = NCIMB 41890
大肠杆菌TOP10细胞Abet0144-GL = NCIMB 41891
大肠杆菌TOP10细胞Abet0377-GL = NCIMB 41892
保藏日期= 2011年11月02日。
实施例1. 通过包括侧接Vernier残基的所有6个CDR的突变来抗体优化Abet0144- GL
下文提供了来自特定抗Aβ抗体亲本克隆Abet0144-GL的新抗Aβ抗体的优化和表征的描述。
1.1 Abet0144-GL亲本克隆至与核糖体展示相容的scFv形式的转化
将亲本克隆在制备中从IgG1-TM形式转化成单链可变片段(scFv)形式用于亲和力优化。从其各别IgG载体分开扩增密码子优化的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域且添加特异性克隆位点和柔性接头区。然后进行重组PCR以生成完整scFv构建体，将该构建体克隆至含有核糖体展示所必需的结构特征的修饰的pUC载体(pUC-RD)中。这些特征包括5’和3’茎环(以防止mRNA转录物由外核酸酶降解)、Shine-Dalgarno序列(以促进核糖体与mRNA转录物的结合)和geneIII间隔区(其允许翻译的scFv分子折叠，同时仍保持附接至核糖体)(Groves等人，2005)。
1.2通过靶向诱变来优化Abet0144-GL
使用靶向诱变方法用基于亲和力的核糖体展示选择来进一步优化先导抗体(Abet0144-GL)以改善对人类淀粉样蛋白β1-42肽的亲和力。通过使用如由Clackson和Lowman (Clackson等人，2004)所述的标准分子生物学技术进行所有6个可变重(VH)链和可变轻(VL)链互补决定区(CDR)的寡核苷酸定向诱变来产生衍生自Abet0144-GL的大scFv-核糖体文库。将来自每个CDR的突变序列亲和力优化为单独文库。还使用靶向诱变将在VHCDR1前面的5个Vernier残基(Kabat残基26-30)随机化且组合这些序列并用剩余VHCDR1文库进行成熟。对所有文库进行基于亲和力的核糖体展示选择以富集对人类淀粉样蛋白β1-42肽具有较高亲和力的变体。基本上如先前所述进行选择(Hanes等人，2000)。
简而言之，将Abet0144-GL先导克隆的6个靶向诱变文库(一个文库涵盖每一CDR)分开转录为mRNA。使用受阻翻译的方法，形成mRNA-核糖体-scFv三元复合物(Hanes等人，1997)。然后对这些复合物进行4轮选择(在渐降浓度的合成生物素化人类淀粉样蛋白β1-42肽(Bachem, Germany；目录：H-5642) (100 nM至10 nM)存在的情况下孵育)以选择对人类淀粉样蛋白β1-42肽具有较高亲和力的变体。然后将那些结合至抗原的复合物捕获于链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性珠粒(Dynabeads™, Invitrogen, UK；目录：112-05D)且洗涤掉非特异性核糖体复合物。随后从结合的核糖体复合物分离mRNA，逆转录至cDNA且然后通过PCR扩增。将该DNA用于下一轮选择。
在4轮亲和力成熟之后，克隆出每一选择输出用于筛选目的。通过如下将通过核糖体展示分离的ScFv克隆至噬粒载体pCANTAB6中：对核糖体展示构建体进行NotI/NcoI限制性内切核酸酶消化(New England BioLabs, USA；目录：R0189L, R0193L)，随后基本上如McCafferty等人(McCafferty等人，1994)所述使用T4 DNA连接酶 (New England BioLabs,USA；目录：M0202L)连接至NotI/NcoI消化的pCANTAB6中。
1.3使用表位竞争测定鉴定改善的克隆
将来自部分1.2中所述的靶向诱变方法的第3和4选择轮随机选择的2024个scFv在细菌中表达以产生未纯化的周质scFv。在竞争形式测定中使用HTRF™平台来阐释能够经由与Abet0144-GL IgG1-TM相同的表位结合合成人类淀粉样蛋白β1-42肽的那些scFv。具体地，在单一浓度的每种未纯化的周质测试scFv存在的情况下在链霉抗生物素蛋白穴状化合物(与生物素化淀粉样蛋白β1-42肽缔合)和抗人类Fc XL665 (与Abet0144-GL IgG1-TM缔合)之间测量荧光共振能量转移(FRET)。肽上的Abet0144-GL IgG1-TM表位被scFv的成功占用导致FRET减小，如在荧光读板仪上所测量。
通过分析在竞争剂肽不存在的情况下Abet0144-GL IgG1-TM与合成的人类淀粉样蛋白β1-42肽的结合来测定‘总’结合信号。通过分析在测试scFv样品存在的情况下Abet0144-GL IgG1-TM与合成的人类淀粉样蛋白β 1-42肽的结合来导出‘样品’信号。最后，通过分析通过单独的检测试剂混合物介导的荧光来测定‘穴状化合物空白’信号。
将未纯化的周质scFv供应于由50 mM MOPS (pH 7.4)、0.5 mM EDTA和0.5 M蔗糖组成的样品缓冲液中。对于概况分析，将scFv样品稀释于384孔V-底板中的测定缓冲液(由50 mM MOPS (pH 7.4)、0.4 M氟化钾、0.1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白和0.1% Tween 20(v/v)组成)中直至原始储备液浓度的50%。使用液体处置机器人将5 µl每种新稀释的scFv转移至黑色、浅、实底、非结合384孔测定板的‘样品’孔中。通过多通道移液器以下列顺序将剩余试剂(在测定缓冲液中制得)添加至测定板中：5 µl样品缓冲液(添加至‘总’和‘穴状化合物空白’孔中)、10 µl测定缓冲液(添加至‘穴状化合物空白’孔中)、5 µl 2 nMAbet0144-GL IgG1-TM (添加至‘样品’和‘总’孔中)、5 µl 5 nM生物素化的人类淀粉样蛋白β1-42肽(添加至‘样品’和‘总’孔中)和5 µl由6 nM链霉抗生物素蛋白穴状化合物和60nM抗His6-XL665组成的检测混合物(添加至所有孔中)。密封测定板且然后在室温下于暗处孵育3小时，然后在荧光读板仪上在620和665 nm发射波长下测量时间分辨的荧光。
通过计算每种样品的%ΔF 值来分析数据。根据方程1来测定%ΔF 。
方程1：
随后使用ΔF值计算归一化的结合值，如方程2中所述。
方程2：
对表明显著抑制Abet0144-GL IgG1-TM与淀粉样蛋白β1-42肽的结合的未纯化的周质scFv进行DNA测序(Osbourn等人，1996；Vaughan等人，1996)。将发现具有独特蛋白序列的scFv在大肠杆菌中表达且通过亲和力色谱进行纯化，随后进行缓冲液交换。
通过在上述表位竞争测定中测试scFv的稀释系列(通常4 pM - 1200 nM)来测定每种纯化的scFv的功效。再次，通过计算每种样品的%ΔF 和%总结合值来分析数据。另外，还如方程3中所述来计算每种浓度的纯化的scFv的%抑制值：
方程3：
%抑制 = 100 -%总结合。
使用科学绘图软件将ScFv样品浓度针对%抑制绘图，并使用非线性回归曲线拟合任何浓度依赖性响应。用定义至-1的值的希尔斜率(Hill-slope)从这些分析获得IC50值。来自此轮选择的最强效克隆Abet0286具有1.8 nM的IC50且来自VLCDR1靶向诱变文库。
试剂/设备来源：MOPS (Sigma, UK；目录：M9381)、氟化钾(BDH chemicals, USA；目录：A6003)、不含脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma, UK；目录：A6003)、Tween 20 (Sigma,UK；目录：P2287)、Abet0144-GL IgG1-TM (内部产生)、生物素化的人类淀粉样蛋白β1-42肽(rpeptide, USA；目录：A1117)、链霉抗生物素蛋白穴状化合物(Cisbio, France；目录：610SAKLB)、抗His6-XL665 (Cisbio, France；目录：61HISXLB)、384孔测定板(Corning,Costar Life Sciences；目录：3676)、384孔稀释板(Greiner BioOne, Germany；目录：781280)、液体处置机器人(MiniTrak™, Perkin Elmer, USA)、荧光读板仪(Envision™,Perkin Elmer, USA)、HTRF技术(Cisbio International, France)、绘图/统计学软件(Prism, Graphpad USA)。
1.4重组成功选择输出以产生‘二元’文库且随后对其进行亲和力优化
使用部分1.3中所述的表位竞争测定来判断特定scFv-核糖体文库是否在前4轮选择中已亲和力成熟。两个文库VHCDR3和VLCDR2靶向诱变文库已显示比亲本Abet0144-GL克隆并无改善且并不进一步进行测试。
剩余4个靶向诱变文库(覆盖VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1和VLCDR3)已显示亲和力改善且以成对方式进行重组以产生6个“二元”重组文库，其中6个CDR中的两者突变。例如，使覆盖VHCDR1的亲和力成熟文库与亲和力成熟VHCDR2文库随机重组以生成VH1:VH2文库。剩余文库产生为：VH1:VL1、VH1:VL3、VH2:VL1、VH2:VL3和VL1:VL3。如先前所述(部分1.2)来克隆出每个重组文库的子集且送去测序以验证每个文库的完整性。
然后如先前所述(部分1.2)在渐降浓度的生物素化的合成人类淀粉样蛋白β1-42肽(在第5和6轮分别为5 nM和2 nM)存在的情况下继续选择。如前所述，克隆出每个选择输出用于筛选目的(部分1.2)。
如部分1.3中所述在表位竞争测定中筛选1936个随机选自第5和6选择轮的scFv。由于这些克隆的功效增加，所以在添加至测定板之前首先将未纯化的scFv稀释至25%。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去DNA测序，且产生独特克隆并如纯化的scFv (部分1.3)进行分析。来自这些选择的最强效克隆Abet0303具有0.84 nM的功效且来自VH1:VH2重组文库。
1.5重组二元选择输出以产生“三元”文库且随后对其进行亲和力优化
使用部分1.3中所述的表位竞争测定来判断每个二元文库是否在前两选择轮(5和6)中已亲和力成熟。所有文库都已显示亲和力改善，且因此考虑用于进一步亲和力成熟。
将6个二元文库(部分1.4)与成功的第4轮输出(部分1.2)以成对方式重组以形成4个“三元”重组文库，其中6个CDR中的三个被突变。例如，将VH2:VL3二元文库(第6轮输出)与VHCDR1靶向诱变文库(第4轮输出)重组以生成VH1:VH2:VL3文库。还通过组合VH1:VH2二元文库(第6轮输出)与VLCDR3靶向诱变文库(第4轮输出)来产生类似构建体。合并这两个个别文库以产生VH1:VH2:VL3三元文库。
注意不破坏已共优化的CDR之间的协同作用。例如，不使VH1:VL3二元文库与VHCDR2靶向诱变文库重组，因为此操纵会破坏共优化的VHCDR1和VLCDR3序列之间的协同作用。在表1中给出所有三元文库和其来源的完整列表。如先前所述(部分1.2)克隆出每个重组文库的子集且送去测序以验证每个文库的完整性。
表1：在第二先导优化活动的第7和8轮期间成熟的4个三元文库的描述。每个文库包含两个从第6轮输出二元文库和第4轮输出靶向诱变文库的随机成对重组生成的组成文库。
然后如先前所述(部分1.2)在渐降浓度的生物素化的合成人类淀粉样蛋白β 1-42肽(在第7和8轮分别为500 pM和200 pM)存在的情况下继续选择。如前所述，克隆出每个选择输出用于筛选目的(部分1.2)。
如部分1.3中所述在表位竞争测定中筛选1408个随机选自第7和8选择轮的scFv。对于“二元”筛选，在添加至测定板之前首先将未纯化的scFv稀释至25%。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去DNA测序，且产生独特克隆并如纯化的scFv (部分1.3)进行分析。来自这些选择的最强效克隆Abet0343具有0.48 nM的功效且来自VH1:VH2:VL3重组文库。
3.6重组三元选择输出以产生“四元”文库且随后对其进行亲和力优化
使用部分1.3中所述的表位竞争测定来判断每个三元文库是否在前两轮选择(7和8)中已亲和力成熟。所有文库都显示亲和力改善，且因此考虑用于进一步亲和力成熟。
将VH1:VH2:VL1三元文库(第8轮输出)与VLCDR3靶向诱变文库(第4轮输出)重组并将VH2:VL1:VL3三元文库(第8轮输出)与VHCDR1靶向诱变文库(第4轮输出)重组。分开地，将VH1:VH2二元文库(第6轮输出)与VL1:VL3二元文库(第6轮输出)重组。然后合并这三个个别文库以产生单一“四元”文库VH1:VH2:VL1:VL3，其中6个CDR中的4个被突变。
注意不破坏已共优化的CDR之间的协同作用。例如，不使VH1:VL2:VL3三元文库与VLCDR1靶向诱变文库重组，因为此操纵会破坏共优化的VHCDR1/VHCDR2和VLCDR3序列之间的协同作用。如先前所述(部分1.2)来克隆出每个重组文库的子集且送去测序以验证每一文库的完整性。
然后如先前所述(部分1.2)在渐降浓度的生物素化的合成人类淀粉样蛋白β1-42肽(在第9至11轮为50 pM至10 pM)存在的情况下继续选择。如前所述，克隆出每一选择输出用于筛选目的(部分1.2)。
如部分1.3中所述在表位竞争测定中筛选1672个随机选自第9至11选择轮的scFv。由于这些克隆的功效增加，所以在添加至测定板之前首先将未纯化的scFv稀释至3.13%。如前所述，将显示显著抑制特性的克隆送去DNA测序，且产生独特克隆并如纯化的scFv (部分1.3)进行分析。来自这些选择的最强效克隆Abet0377具有0.32 nM的功效(n=2个数据)。样品抑制曲线显示于图1中，且24个最高功效克隆的数据显示于表2中。相应蛋白序列列于表3和4中。
表2：在Abet0144-GL HTRF™表位竞争测定中评估时优化的scFv克隆的示例性功效数据。在进行多于一次测定时，提供IC50值的绝对范围。
表3(参见下文)：本文所述的优化的非种系化克隆的VH结构域的序列比对。突出显示来自亲本序列(Abet0144-GL)的变化。根据Kabat编号系统来指定残基。
表4(参见下文)：本文所述的优化的非种系化克隆的VL结构域的序列比对。突出显示来自亲本序列(Abet0144-GL)的变化。根据Kabat编号系统来指定残基。注意，Abet0378具有存在于VL序列中的位置91的琥珀终止密码子“B”，其在优化期间随着从谷氨酰胺的变化而引入。在用于表达的大肠杆菌菌株TG1中产生作为scFv片段的抗体，其中琥珀终止密码子读取为谷氨酰胺。
1.7通过表面等离子共振对呈纯化的scFv形式的亲和力改善的克隆进行动力学概 况分析
使用表面等离子共振在HTRF™表位竞争测定(部分1.3-1.6)中分析比亲本序列Abet0144-GL显示对人类淀粉样蛋白β1-42肽的结合亲和力的显著改善的纯化的scFv克隆。简言之，使用ProteOn蛋白相互作用阵列系统(BioRad, USA)来评价每种纯化的scFv和合成产生的人类淀粉样蛋白β1-42肽之间的相互作用的动力学参数。这些实验基本上如Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所述来进行。
使用测定来估计每种测试scFv和人类淀粉样蛋白β1-42之间的结合亲和力，在所述测定中，将生物素化的合成人类淀粉样蛋白β1-42肽(rPeptide, USA；目录：A1117)以5种不同表面密度经由生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用非共价方式结合至专有链霉抗生物素蛋白芯片(NTA 176-5021)。在循环之间通过10 mM pH 2.0甘氨酸的单一60秒注射以去除结合至肽的scFv来再生芯片表面。再生不会导致scFv结合能力的显著损失。
使每种scFv以100 - 200 nM依次通过肽表面足够量时间以观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。从主要数据集减去不相关scFv空白以减小任何缓冲液假象或非特异性结合效应的影响。然后将适当结合模型拟合至数据。
对于Abet0380 scFv，缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别为1.93 x 105 M-1 s-1、2.85 x 10-5 s-1和148 pM。这些参数源自对数据的1:1 Langmuir拟合。
表5：如通过表面等离子共振所测定的结合合成的生物素化人类淀粉样蛋白β1-42肽的优化scFv克隆的示例性动力学数据。
1.8亲和力改善的scFv至人类IgG1-TM的再格式化
通过将可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域分别亚克隆至表达全人类抗体重和轻链的载体中来将ScFv再格式化成IgG1-TM。将可变重链克隆至含有人类重链恒定结构域和调控元件的哺乳动物表达载体(pEU 1.4)中以在哺乳动物细胞中表达全IgG1-TM重链。类似地，将可变轻链结构域克隆至哺乳动物表达载体(pEU 4.4)中用于表达人类λ轻链恒定结构域和调控元件，以在哺乳动物细胞中表达全IgG轻链。
为了获得作为IgG的抗体，将重链和轻链IgG表达载体瞬时转染至HEK293-EBNA哺乳动物细胞(Invitrogen, UK；目录：R620-07)中，其中表达IgG且分泌至培养基中。合并收获物并过滤，然后纯化。使用蛋白A色谱来纯化IgG。将培养物上清液加载至适当陶瓷蛋白A柱(BioSepra - Pall, USA)上并使用50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、250 mM NaCl洗涤。使用0.1 M柠檬酸钠(pH 3.0)从柱洗脱结合的IgG且通过添加Tris-HCl (pH 9.0)来中和。使用NAP-10缓冲液交换柱(GE Healthcare, UK；目录：17-0854-02)将洗脱的材料缓冲液交换至PBS中且使纯化的IgG通过0.2 μm过滤器。使用基于IgG的氨基酸序列的消光系数来分光光度测定IgG浓度。使用SEC-HPLC且通过SDS-PAGE分析纯化的IgG的聚集或降解。
1.9种系化
基于其相应scFv的实验表征，选择5种最强效IgG用于种系化。克隆Abet0343、Abet0369、Abet0377、Abet0380和Abet0382的纯化的scFv都展现小于750 pM的IC50值，如通过表位竞争测定所测定(表2)，且都具有小于250 pM的实验解离常数，如通过表面等离子共振所测定(表5)。
种系化方法由将VH和VL结构域中的框架残基恢复至最接近的种系序列以相同地匹配人类抗体组成。对于优化的抗体谱系的VH结构域，这是Vh3-23 (DP-47)，且对于VL结构域，其为Vλ3-3r (DPL-23)。对于Abet0380，VH结构域的Kabat位置43的1个残基需要改变(表6)且VL结构域的Kabat位置81的1个残基需要改变(表7)。剩余4个序列需要2至5个变化(表6和7)。除Abet0343的轻链序列中的残基2 (其与侧接残基1和3同时种系化)外，Vernier残基(Foote等人，1992)并不种系化。使用标准定点诱变技术用适当致突变引物如由Clackson和Lowman (Clackson等人，2004)所述来进行这些氨基酸残基的种系化。
1.10使用表面等离子共振测定亲和力优化的IgG的结合动力学
使用表面等离子共振来分析亲和力优化的IgG (部分1.8)和其种系化的对应物(部分1.9)的结合动力学。简言之，使用BIAcore T-100 (GE Healthcare, UK)生物传感器仪器来评价每种测试IgG与合成产生的人类淀粉样蛋白β 1-42肽之间的相互作用的动力学参数。这些实验基本上如Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所述来进行。
使用测定来估计每种测试IgG和人类淀粉样蛋白β 1-42之间的结合亲和力，在所述测定中，通过本身胺连接至专有CM5芯片的蛋白G表面非共价捕获每种抗体。在循环之间通过10 mM pH 2.0甘氨酸的配对40秒注射以去除配体和结合的抗体来再生芯片表面。然后将测试抗体再应用于每次肽注射。
使合成的人类淀粉样蛋白β 1-42肽(0.063 - 1024 nM)的一系列稀释液依次通过抗体表面足量时间以观察可置信地拟合至适当结合模型的传感图。从每个IgG数据集减去空白参考流动室数据且从主要数据集双重参考减去仅零浓度抗体缓冲液空白。然后使用BIAevaluation软件将适当结合模型同时拟合至来自每一分析物滴定的数据。
使用计算的Chi2值来评价数据的有效性，其中可接受值在2 RU2下。使用残差估计拟合的整体成功性，其中2 RU下的偏差可接受。
Abet0380-GL (种系化) IgG1-TM的实施例结果显示于图2中。缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)分别为9.52 x 105 M-1 s-1、3.07 x 10-4 s-1和322 pM。这些参数源自对数据的1:1 Langmuir拟合。
1.11使用表面等离子共振分析亲和力优化的IgG的特异性概况
使用表面等离子共振来验证亲和力优化的IgG对人类淀粉样蛋白β1-42肽的特异性。简言之，使用BIAcore2000 (GE Healthcare, UK)生物传感器仪器来评价每种测试IgG和一定范围的小肽(包括合成产生的人类淀粉样蛋白β1-42和人类淀粉样蛋白β1-40)之间的相互作用的动力学参数。这些实验基本上如Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所述来进行。
使用测定来估计每种测试IgG和每种肽之间的相互作用，在所述测定中，通过本身胺连接至专有CM5芯片的蛋白G表面非共价捕获抗体。使用5次施加单循环方法观察抗体和肽之间的相互作用。在循环之间通过10 mM甘氨酸(pH 2.0)的配对40秒注射以去除配体和结合的抗体来再生芯片表面。然后将测试抗体再应用于每一肽注射循环。
使每种测试肽(在64 nM和1024 nM之间)依次通过抗体表面足量时间以观察不显示结合或可置信地拟合至适当结合模型的传感图。从每个IgG数据集减去空白参考流动室数据且从主要数据集双重参考减去仅零浓度抗体的缓冲液空白。
Abet0380-GL (种系化) IgG1-TM的示例性结果显示于图3中。两种肽(生物素化的人类淀粉样蛋白β1-42 (rPeptide, USA；目录：A1117)和未标记的鼠淀粉样蛋白β1-42(rPeptide, USA；目录：A1008))显示与抗体的强结合，而两种肽生物素化的人类淀粉样蛋白β1-40 (rPeptide, USA；目录：A1111)和未标记的鼠淀粉样蛋白β1-40 (rPeptide, USA；目录：A1007)显示不与抗体结合。
1.12使用体外免疫组织化学的天然淀粉样蛋白β的最强效IgG的亲和力
测试最强效IgG的与淀粉样蛋白β结合的能力，其目标在于估计这些克隆对淀粉样蛋白β肽的天然形式的亲和力。简言之，在人类阿尔茨海默病脑切片和Tg2576小鼠脑切片上筛选先导抗体以鉴定在体外与淀粉样蛋白斑块结合的抗淀粉样蛋白β1-42抗体。
在这些实验中，从具有严重阿尔茨海默病的两个个体(ApoE基因型3/3，Braak期6；和ApoE基因型4/3，Braak期5)的额叶皮质分离人类脑组织。作为对照，从一个非痴呆个体(ApoE基因型3/3，Braak期1)分离等效组织。从15个月龄(2只小鼠)和22个月龄(2只小鼠)的Tg2576小鼠分离小鼠脑组织。在2、5、10和20 ug ml-1的浓度下测试抗体。
在一次实验中，Abet0380-GL IgG1-TM抗体染色核心斑块(CP)，其中在Tg2576脑切片上评分为4且在人类AD脑切片上评分为3。其还染色弥漫性斑块(DP)和脑淀粉样蛋白血管病(CAA)斑块，但程度较低。相比之下，阳性对照抗体在邻近切片上的所有斑块(CP、DP、CAA)上在相同条件下产生3-4的评分。代表性图像显示于图4中。
1.13通过western印迹证明Abet0380-GL IgG1-TM Aβ42识别概况
为了在SDS-PAGE之前交联Aβ42寡聚物，如下所述来实施PICUP (光诱导的肽交联)。通过将2 μl储备液(在10 mM下)添加至18 μl 1×PBS中来产生1 mM Ru(Bpy)的溶液。另外，通过将2 μl储备液(在200 mM下)添加至18 μl 1×PBS中来产生20 mM过硫酸铵的溶液(APS)。将未使用的储备液立即速冻于干冰上并将其返回至-80℃冷冻器中。在暗室中，将5 μl Ru(Bpy)添加至80 ul聚集物(纯10 uM样品)中，随后添加5 μl APS。用灯将样品在暗室中辐照10sec。立即添加30ul (4×) LDS样品缓冲液。
然后对交联(PICUP)和未交联Aβ1-42聚集物进行SDS-PAGE。将溶液在70℃下于热块中孵育10分钟。同时，通过组合5 μl Magic Mark XP Western蛋白标准品、5 μl NovexSharp预染色蛋白标准品来产生标记物。在孵育10分钟之后，将样品加上标记物加载至含有MES运行缓冲液的NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝胶(1.0 mm，15孔，15 μl/孔)上。将凝胶在200 V下运行35分钟。
然后使用来自Invitrogen的iBlot机器将凝胶在20V下印迹于PVDF膜上持续7分钟(程序P3)。
一旦完成印迹，拆开凝胶堆叠物且然后将PVDF膜在室温和轻微旋转下在50 ml 4%MPBST (PBST中的4% Marvel)中封闭一小时。然后用解剖刀切割印迹物用于用个别抗体探测。这与一抗溶液(2ug/ml，在10 ml 3% MPBST中)孵育1小时。
接下来，将膜用PBST洗涤5次，每次5分钟，且然后在室温下在二抗溶液(10 mlPBST中的1 μl抗人类Fc特异性-HRP缀合物)中孵育1小时。将膜用PBST洗涤3次并用PBS洗涤2次，每次5分钟。
在最终洗涤期间，使化学发光SuperSignal West Dura底物(Thermo Scientific；34075)温热至室温。组合各600ul的2种溶液。从PVDF膜倾析PBS，且然后使用移液器来用混合Dura试剂覆盖膜。使反应进行~5分钟(在此期间，设置VerscDoc成像系统)且然后用30sec暴露获取图像(并使用变换滤光片增强)。代表性图像显示于图5中。
实施例2. 证明Abet0380-GL IgG1-TM抗体的特定功能反应的体内研究
2.1通过游离淀粉样蛋白β1-42肽的体内减少的Abet0380-GL IgG1-TM的功能表征
通过以5 ml/kg静脉内注射25 mM组氨酸、7%蔗糖、0.02% p80表面活性剂(pH 6.0)的给药媒介物来使8周龄雄性白化Harlan Sprague-Dawley大鼠(n= 8-12)接受单一剂量的Abet0380-GL IgG1-TM抗体。给药溶液在临给药之前制备。在所示时间将动物麻醉且从小脑延髓池抽吸脑脊髓液(CSF)。在采样20分钟内将CSF样品在近似3000 ×g和4℃下离心10分钟以去除细胞或碎片。然后将样品冷冻于干冰上且储存于-70℃下用于后续分析。
通过断头术来处死动物，解剖脑组织且从在二乙胺(DEA；Fluka, Sigma, UK；目录：31729)中的脑组织提取淀粉样蛋白β肽。简言之，使冷冻的脑组织在0.2% DEA和50 mMNaCl (Merck, USA；目录：1.06404.1000)中均质化。使脑均质物以133,000 ×g超离心1小时。用2 M Tris-HCl (TRIZMA®-盐酸盐；Sigma, UK；目录：93363)将回收的上清液中和至pH8.0且储存于-70℃直至分析。根据Swedish Board of Agriculture提供的相关指南和条例来进行动物实验。动物实验的专门伦理委员会：Stockholm Södra Animal ResearchEthical Board提供伦理许可。
大鼠CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42肽的测量如下进行：使用免疫沉淀以去除Abet0380-GL结合的淀粉样蛋白β1-42肽，随后通过获得自Invitrogen的商业ELISA试剂盒进行分析。简言之，将蛋白A珠粒(Dynabeads®蛋白A；Invitrogen, UK；目录：100-02D)的溶液添加至96孔无缘板(non-skirted plate)(聚丙烯0.2 ml；VWR International, UK；目录：10732-4828)中并用TBST (50 mM TBS；Sigma, UK；目录：T6664加0.1% Tween20)使用磁体(DynaMag™ 96侧；Invitrogen, UK；目录：123.31D)洗涤两次以从溶液分离珠粒。将解冻的大鼠CSF样品(40 μl)添加至每个孔中并在40℃下以倾斜旋转孵育1小时。然后将珠粒使用磁体沉淀并将30 μl免疫沉淀的CSF样品转移至来自ELISA试剂盒(小鼠淀粉样蛋白β(1-42)比色ELISA试剂盒；Invitrogen, UK；目录：KMB3441)已经添加70 μl标准稀释剂缓冲液(补充有蛋白酶抑制剂；Roche, UK；目录：11836153001)的96孔板中。将校准标准样品一式两份添加至板中，并将板在室温下振荡孵育2小时。将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl检测抗体溶液添加至每个孔中并将板在室温下振荡孵育1小时。再次，将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl二抗工作溶液添加至每个孔中并将板在室温下振荡孵育30分钟。最后，将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl稳定化色原添加至每个孔中并将板在室温下于暗处孵育30分钟。为了停止反应，将100 μl终止溶液添加至每个孔中并在2小时内以450 nm的吸光度读板。分析单一CSF样品并使用Prism 4 (GraphPad, USA)用单因子ANOVA对对数转化的数据在不针对多重比较调节的情况下进行数据分析。
使用小鼠淀粉样蛋白β(1-42)比色ELISA试剂盒(Invitrogen, UK；目录：KMB3441)的修改版本来进行大鼠脑均质物中的总(游离和Abet0380-GL结合)淀粉样蛋白β1-42肽的测量。通过过量Abet0380-GL IgG1-TM抗体代替试剂盒检测抗体且通过抗人类IgG HRP-缀合物抗体(Jackson ImmunoResearch, UK；目录：109-035-098)代替二抗。简言之，将50 μl1:2稀释于样品稀释剂(补充有蛋白酶抑制剂；Roche, UK；目录：11836153001)中的解冻的脑均质物和标准样品一式两份添加至96孔ELISA板中。将过量Abet0380-GL IgG1-TM抗体(50 μl, 4 μg/ml)添加至每个孔中且然后将板在室温下孵育3小时。将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl二抗工作溶液添加至每个孔中并将板在室温下孵育30分钟。最后，将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl稳定化色原添加至每个孔中并将板在室温下于暗处孵育15分钟。为了停止反应，将100 μl终止溶液添加至每个孔中并在2小时内以450nm的吸光度读板。使用Prism 4 (GraphPad, USA)用单因子ANOVA对对数转化的数据在不针对多重比较调节的情况下进行数据分析。
使用小鼠淀粉样蛋白β(1-40)比色ELISA试剂盒(Invitrogen, UK；目录：KMB3481)来进行大鼠脑均质物中的总淀粉样蛋白β1-40肽的测量。简言之，将50 μl解冻的脑均质物和标准样品(稀释于样品稀释剂(补充有蛋白酶抑制剂；Roche, UK；目录：11836153001)中)以一式两份添加至96孔ELISA板中。将50 μl检测抗体溶液添加至每个孔中并将板在室温下孵育3小时。将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl二抗工作溶液添加至每个孔中并将板在室温下孵育30分钟。最后，将板用400 μl洗涤缓冲液洗涤4次，将100 μl稳定化色原添加至每个孔中并将板在室温下于暗处孵育30分钟。为了停止反应，将100 μl终止溶液添加至每个孔中并在2小时内以450 nm的吸光度读板。使用Prism 4 (GraphPad, USA)用单因子ANOVA对对数转化的数据在不针对多重比较调节的情况下进行数据分析。
2.2通过游离淀粉样蛋白β1-42肽的体内减少的Abet0380-GL IgG1-TM的功能表征
在部分2.1中所述的测定中，在给药之后72或168小时，单一剂量的20 mg/kg的Abet0380-GL IgG1-TM抗体将大鼠中游离淀粉样蛋白β1-42肽的CSF水平降低至定量限值(数据未显示)。为了进一步研究Abet0380-GL IgG1-TM抗体的体内效应，经14天向大鼠施用0.25、0.5、1、5或10 mg/kg的每周剂量。在第二剂量之后168小时将动物安乐死以测量CSF中游离淀粉样蛋白β1-42肽以及脑组织中总淀粉样蛋白β1-42或1-40肽的水平。
游离淀粉样蛋白β1-42的剂量依赖性降低显示于CSF中(图6A)。5 mg/kg和10 mg/kg的两个最高剂量将淀粉样蛋白β1-42肽降低至所用测定中的定量限值，而当与媒介物对照相比时，0.5 mg/kg和1 mg/kg的剂量分别将淀粉样蛋白β1-42肽显著降低47%和61%。最低剂量0.25 mg/kg给出CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42肽的14%减少，但不能达到统计学显著性。由于Abet0380-GL IgG1-TM抗体隔离淀粉样蛋白β1-42肽，所以在脑组织中表明总淀粉样蛋白β1-42肽的剂量依赖性增加(图6B)。然而，脑组织中总淀粉样蛋白β1-40肽的水平不受影响(图6C)，因此证明Abet0380-GL IgG1-TM对淀粉样蛋白β1-42肽的特异性。总之，来自大鼠研究的上述结果显示，Abet0380-GL IgG1-TM抗体降低CSF中游离淀粉样蛋白β1-42肽的水平且ED 50 在0.5 mg/kg和1 mg/kg之间。
2.3 Abet0380-GL IgG1TM的功能表征-体内非斑块结合的证明-在给予年老 Tg2576小鼠外周剂量之后168小时Abet0380-GL IgG1-TM在体内不结合淀粉样蛋白β斑块
测试Abet0380-GL IgG1-TM在单一外周剂量之后结合年老Tg2576小鼠中的淀粉样蛋白β斑块的能力。根据Swedish Board of Agriculture提供的相关指南和条例来进行动物实验。动物实验的专门伦理委员会：Stockholm Södra Animal Research Ethical Board提供伦理许可。通过以5 mL/kg静脉内注射25 mM组氨酸、7%蔗糖、0.02% p80表面活性剂(pH6.0)的给药媒介物使17个月龄雌性Tg2576小鼠(n=5)接受单一剂量的媒介物、30 mg/kg阳性对照抗体或10 mg/kg或30 mg/kg Abet0380-GL IgG1-TM抗体。在给药之后168小时，将动物深度麻醉并用室温PBS灌注，随后用冷(4℃)磷酸盐缓冲的4%多聚甲醛(PFA)灌注。然后通过断头术来处死动物且解剖脑并在4℃下于PFA中浸渍固定72小时。将固定剂更换为含有0.1%叠氮化钠的PBS并将组织储存于4℃下直至进一步处理。
对脑切片进行免疫组织化学以评估Abet0380-GL IgG1-TM与淀粉样蛋白β斑块的体内结合程度。简言之，制备石蜡包埋的脑切片用于免疫组织化学。使用来自Epitomics的兔抗小鼠IgG1和IgG2特异性二抗进行Abet0380-GL IgG1-TM或沉积于脑实质内的阳性对照抗体的检测。在Ventana机器人上使用OmniMap检测系统(Ventana Medical Systems, USA)进行染色。对于离体掺料，在体外用过量注射的Abet0380-GL IgG1-TM或阳性对照抗体将连续组织切片染色。二抗和色原与上文相同。
在10×光学放大率下以盲化方式进行染色的评分。注明修饰斑块的分布。根据从0(无斑块染色)直至4 (深度斑块修饰)的相对强度量表对斑块标记的强度进行评分。
在10 mg/kg或30 mg/kg的外周剂量之后168小时，Abet0380-GL IgG1-TM并不在体内修饰淀粉样蛋白β斑块或脑淀粉样血管病(CAA)。阳性对照抗体表明强烈至低的体内斑块修饰。部分和局部分布模式是显而易见的，并在所有动物中具有核心斑块、弥漫性斑块和CAA。代表性图像显示于图7中。来自相同动物的脑组织用Abet0380-GL IgG1-TM和阳性对照抗体的离体掺入证实了注射抗体的先前证实的离体斑块结合能力(未显示)。
实施例3. 抗Aβ1-42序列
抗体分子的序列的实例列于随附序列表中，包含实例抗体VH结构域、VL结构域、个别CDR序列、HCDR的集合、LCDR的集合和框架区。
比较表5中所列的24种优化克隆的序列。表8和9分别显示VH和VL结构域之间的序列同一性%。
表 10：VH CDR和Vernier残基内的每个位置处的残基的实例。
表 11：VL CDR内的每个位置处的残基的实例。
表 12：24种优化克隆中的VH CDR和FW1中观察到的取代
表 13：24种优化克隆中的VL CDR中观察到的取代。
表 14：本文提及的抗体序列和本文件末尾处序列表中的序列之间的对应关系。
实施例4：Abet0380-GL IgG1-TM在竞争结合实验中的特异性
在竞争结合实验中检查Abet0380-GL IgG1-TM的特异性。简言之，将Abet0380-GLIgG1-TM (0.5nM)与一定范围的不同浓度(10uM低至0.17nM)的一组全长、截短和焦化人类Aβ肽(Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-16、Aβ12-28、Aβ17-42、Aβ焦-3-42或Aβ焦-11-42) 一起孵育(在室温下1小时)。
在Abet0380-GL IgG1-TM和Aβ肽之间孵育后，添加N-末端生物素Aβ1-42 (1.5nM)，随后添加铕穴状化合物标记的抗人类Fc抗体 (0.8nM) (CisBio目录号61HFCKLB)和链霉抗生物素蛋白-XLent! (5nM)(CisBio目录号611SAXLB)。然后将测定物在室温下再孵育2小时，然后在Envision读板仪(PerkinElmer)上使用标准均相时间分辨的荧光(HTRF)读取方案进行读取。在竞争不存在的情况下，然后可经由时间分辨的荧光共振能量转移(TR-FRET) (由于铕穴状化合物供体和XL665受体荧光团的邻近)测量N-末端生物素Aβ1-42与Abet0380-GLIgG1-TM (分别与链霉抗生物素蛋白-XLent!和铕穴状化合物标记的抗人类Fc抗体复合)的相互作用。通过测试肽对Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42相互作用的竞争因此导致测定信号的降低。将结果表示为%特异性结合，其中100%特异性结合源自含有链霉抗生物素蛋白-XLent!(5nM)、N-末端生物素Aβ1-42 (1.5nM)、Abet0380-GL IgG1-TM (0.5nM)和铕穴状化合物标记的抗人类Fc抗体(0.8nM)的孔。0%特异性结合源自已省略Abet0380-GLIgG1-TM的孔。
最终测定体积为20µl并在包含MOPS (pH7.4)(50mM)、氟化钾(0.4M)、tween 20(0.1%)和不含脂肪酸的BSA (0.1%)的测定缓冲液中制备所有试剂。在低体积384孔黑色测定板(Costar 3676)中进行测定。
总之，用Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-42、Aβ焦-3-42和Aβ焦-11-42观察到Abet0380-GLIgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42结合的抑制，其中对于该组，IC50值范围为10-8至10-9摩尔浓度。用Aβ1-16或Aβ12-28观察到没有Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42结合的抑制(图8)。
实施例5：在正常大鼠PK-PD研究中抗体Abet0144-GL隔离淀粉样蛋白β1-42的能力
在正常大鼠中的PK-PD研究中研究抗体Abet0144-GL隔离淀粉样蛋白β1-42的能力。持续2周(在第0和7天)每周向大鼠静脉内施用Abet0144-GL (10 mg/kg或40 mg/kg)或媒介物，并在第2剂量之后一周处死。采样CSF用于游离和总淀粉样蛋白β1-42测量，且采样脑用于总淀粉样蛋白β1-42测量。使用上述测定测量游离和总淀粉样蛋白β1-42水平。
如图9中所示，CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42并未由10 mg/kg或40 mg/kgAbet0144-GL显著改变(当与媒介物相比时，分别增加5%和18%；图9)。CSF中的总淀粉样蛋白β1-42在10 mg/kg下显著增加38%，并在40 mg/kg下显著增加139%。脑组织中的总淀粉样蛋白β1-42也在10 mg/kg和40 mg/kg下分别显著增加16%和50%。总之，来自正常大鼠中的该研究的数据证明，Abet0144-GL对CSF中的游离淀粉样蛋白β1-42水平并无显著效应，而增加CSF和脑中的总淀粉样蛋白β 1-42浓度。这是从对靶标具有数十nM范围内的亲和力的抗体所预计的概况。
实施例6：6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮
在20-30℃下，将叔丁醇钾(223 g, 1.99 mol)装填至含有6-溴-1-茚酮(8.38 kg,39.7 mol)于THF (16.75 L)中的搅拌混合物的100 L反应器中。然后在15分钟期间将丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8 mol)装填至混合物中，同时将温度保持在20-30℃之间。添加叔丁醇钾(89.1 g, 0.79 mol)溶解于THF (400 mL)中的溶液，然后在20-30℃下在20分钟期间添加丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8 mol)。然后添加第三份溶解于THF (400 mL)中的叔丁醇钾(90 g, 0.80 mol)，随后在20-30℃下在20分钟期间第三次添加丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8mol)。在20-30℃下在1小时期间将溶解于THF (21.9 L)中的叔丁醇钾(4.86 kg, 43.3mol)装填至反应器中。将反应物加热至大约65℃且蒸馏掉23 L溶剂。将反应温度降至60℃并在55-60℃下在30分钟期间将溶解于水(51.1 L)中的50%氢氧化钾水溶液(2.42 L, 31.7mol)添加至混合物中，然后在60℃下将混合物搅拌6小时，在2小时期间冷却至20℃。在20℃下搅拌12小时之后，过滤固体材料，用水(8.4 L)和THF (4.2 L)的混合物洗涤两次，且然后在50℃下在真空下干燥以产生6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(7.78 kg；26.6mol)。1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.78 - 1.84 (m, 2 H), 1.95 (td, 2 H),2.32 – 2.38 (m, 2 H), 2.51 - 2.59 (m, 2 H), 3.27 (s, 2 H), 7.60 (d, 1 H),7.81 (m, 1 H), 7.89 (m, 1 H)。
实施例7：(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮
在大约0-5℃下经大约25分钟，将溶解于DCM (3.8 L)中的硼烷叔丁基胺络合物(845g, 9.7 mol)装填至6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(7.7 kg, 26.3 mol)于DCM (42.4 L)中的浆液中。将反应物在0-5℃下搅拌1小时，然后分析证实转化率＞98%。装填从氯化钠(2.77 kg)、水(13.3 L)和37%盐酸(2.61 L, 32 mol)制备的溶液。将混合物温热至大约15℃并在沉降分层后分离各相。将有机相与甲磺酸甲酯(2.68 L, 31.6 mol)和四丁基氯化铵(131 g, 0.47 mol)一起返回至反应器中并将混合物在20℃下剧烈搅动。然后经大约1小时将50%氢氧化钠(12.5 L, 236 mol)装填至经剧烈搅动的反应混合物中并将反应物在20℃下剧烈搅动过夜。添加水(19 L)并在分离之后丢弃水相。将有机层加热至大约40℃且蒸馏掉33 L溶剂。装填乙醇(21 L)并在温度渐增下重新开始蒸馏(在最高达79℃下蒸馏掉22 L)。在大约75℃下装填乙醇(13.9 L)。经30分钟装填水(14.6 L)，使温度保持在72-75℃之间。抽出大约400 mL溶液至500 mL聚乙烯瓶中且使样品自发结晶。将批料冷却至50℃，然后将结晶浆液样品回添至溶液中。将混合物冷却至40℃。在4小时期间将混合物冷却至20℃，然后将其搅拌过夜。过滤固体，用乙醇(6.6 L)和水(5 L)的混合物洗涤并在50℃和真空下干燥以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(5.83kg, 18.9 mol) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.22-1.32 (m, 2 H), 1.41 - 1.48(m, 2 H), 1.56 (td, 2 H), 1.99 - 2.07 (m, 2 H), 3.01 (s, 2 H), 3.16 – 3.23(m, 1 H), 3.27 (s, 3 H), 7.56 (d, 1 H), 7.77 (d, 1 H), 7.86 (dd, 1 H)。
实施例8：(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐
在环境温度下，将(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(5.82kg；17.7 mol)装填至100 L反应器中，然后装填乙醇钛(IV) (7.4 L；35.4 mol)和叔丁基亚磺酰胺(2.94 kg；23.0 mol)于2-甲基四氢呋喃(13.7 L)中的溶液。将混合物搅拌并加热至82℃。在82℃下30分钟之后，进一步增加温度(最高达97℃)且蒸馏掉8 L溶剂。将反应物冷却至87℃且添加2-甲基四氢呋喃(8.2 L)，得到82℃的反应温度。在82℃下将反应物搅拌过夜。升高反应温度(至97℃)且蒸馏掉8.5 L溶剂。将反应物冷却至87℃且添加2-甲基四氢呋喃(8.2 L)，得到82℃的反应温度。在3.5小时之后，进一步增加反应温度(至97℃)并蒸馏掉8 L溶剂。将反应物冷却至87℃且添加2-甲基四氢呋喃(8.2 L)，得到82℃的反应温度。在2小时之后，进一步增加反应温度(至97℃)并蒸馏掉8.2 L溶剂。将反应物冷却至87℃且添加2-甲基四氢呋喃(8.2 L)，得到82℃的反应温度。将反应物在82℃下搅拌过夜。进一步增加反应温度(至97℃)并蒸馏掉8 L溶剂。将反应物冷却至25℃。装填二氯甲烷(16.4 L)。向单独反应器中添加水(30 L)且剧烈搅动并添加硫酸钠(7.54 kg)，并将所得溶液冷却至10℃。将硫酸(2.3 L, 42.4 mol)添加至水溶液中并将温度调节至20℃。抽出6 L酸性水溶液且储存待用。经5分钟并在良好搅动下，将有机反应混合物装填至酸性水溶液中。用二氯甲烷(16.4 L)洗涤有机反应容器，且还将二氯甲烷洗涤溶液添加至酸性水中。将混合物搅拌15分钟且然后使其沉降20分钟。使下部水相流出，且添加储存的6 L酸性洗涤液，随后添加水(5.5 L)。将混合物搅拌15分钟且然后使其沉降20分钟。使下部有机层流出至广口玻璃瓶中且丢弃上部水层。将有机层回填至容器中，随后回填硫酸钠(2.74 kg)，并将混合物搅动30分钟。过滤硫酸钠并用二氯甲烷(5.5 L)洗涤，并将合并的有机层装填至清洁容器中。加热批料用于蒸馏(收集31 L，最高温度为57℃)。将批料冷却至40℃且添加二氯甲烷(16.4 L)。加热批料用于蒸馏(收集17 L，最高温度为54℃)。将批料冷却至20℃且添加二氯甲烷(5.5L)和乙醇(2.7 L)。经45分钟将二乙醚中的2 M氯化氢(10.6 L；21.2 mol)装填至反应物中，使温度保持在16-23℃之间。将所得浆液在20℃下搅拌1小时，随后过滤固体并用二氯甲烷和二乙醚的1:1混合物洗涤3次(3 × 5.5 L)。在50℃和真空下干燥固体以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐(6.0 kg；14.3 mol；通过1HNMR测定为82% w/w) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6)ppm 130 (m, 2 H), 1.70 (d, 2 H),1.98 (m, 2 H), 2.10 (m, 2 H), 3.17 (s, 2 H), 3.23 (m, 1 H), 3.29 (s, 3 H),7.61 (d, 1 H), 8.04 (dd, 1 H), 8.75 (d, 1 H), 12.90(br s,2H)。
实施例9：(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1' 2''-咪唑]-4''(3''H)-硫酮
将原甲酸三甲酯(4.95 L；45.2 mol)和二异丙基乙胺(3.5 L；20.0 mol)装填至含有异丙醇(50.5 L)中的(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[环己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亚胺盐酸盐(6.25 kg；14.9 mol)的反应器中。将反应混合物搅拌并在1小时期间加热至75℃，使得获得澄清溶液。将温度设定为70℃且经1小时装填2-氧代硫代丙酰胺于异丙醇中的2 M溶液(19.5 kg；40.6 mol)，然后将反应物在69℃下搅拌过夜。将该批料用(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''(3''H)-硫酮(3 g；7.6mmol)接种并将温度降至60℃并搅拌1小时。通过蒸馏浓缩混合物(蒸馏温度为大约60℃；蒸馏掉31 L)。在1小时期间和60℃下添加水(31 L)，然后在90分钟期间将温度降至25℃，随后将混合物搅拌3小时。过滤固体，用异丙醇洗涤两次(2 × 5.2 L)并在40℃下在真空下干燥以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''(3''H)-硫酮(4.87 kg；10.8 mol；通过1H NMR测定为87% w/w)。
实施例10：(1r,1'R,4R)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚- 1'2''-咪唑]-4''-胺D(+)-10-樟脑磺酸盐
将甲醇中的7 M氨(32 L；224 mol)装填至含有(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''(3''H)-硫酮(5.10 kg；11.4 mol)和乙酸锌二水合物(3.02 kg；13.8 mol)的反应器中。将反应器密封并将混合物加热至80℃并搅拌24小时，然后将其冷却至30℃。装填1-丁醇(51L)且通过真空蒸馏掉大约50 L来浓缩反应混合物。添加1-丁醇(25 L)且通过真空蒸馏27 L来浓缩混合物。将混合物冷却至30℃并装填1 M氢氧化钠(30 L；30 mol)。将两相混合物搅动15分钟。分离掉下部水相。装填水(20 L)并将混合物搅动30分钟。分离掉下部水相。将有机相加热至70℃，然后装填(1S)-(+)-10-樟脑磺酸(2.4 kg；10.3 mol)。将混合物在70℃下搅拌1小时且然后经3小时斜降至20℃。过滤固体，用乙醇(20 L)洗涤并在50℃下在真空中干燥以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺(+)-10-樟脑磺酸盐(3.12 kg；5.13mol；通过1H NMR测定为102% w/w)。
实施例11：(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3- 基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺
将溶解于水(0.1 L)中的Na2PdCl4(1.4 g；4.76 mmol)和3-(二-叔丁基鏻)丙磺酸盐(2.6 g；9.69 mmol)装填至含有1-丁醇(7.7 L)和水(2.6 L)的混合物中的(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基-5''-甲基-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺(+)-10-樟脑磺酸盐(1 kg；1.58 mol)、碳酸钾(0.763 kg；5.52 mol)的容器中。将混合物用氮气小心地惰性化，随后装填5-(丙-1-炔基)吡啶-3-基硼酸(0.29 kg；1.62 mol)并将混合物再次小心地用氮气惰性化。将反应混合物加热至75℃且搅拌2小时，然后分析显示完全转化。将温度调节至45℃。停止搅拌且分离掉下部水相。将有机层用水洗涤3次(3 × 4 L)。将反应温度调节至22℃且装填膦SPM32清除剂(0.195 kg)并将混合物搅动过夜。过滤掉清除剂并用1-丁醇(1L)洗涤。将反应物通过在减压下蒸馏来浓缩至3 L。装填乙酸丁酯(7.7 L)并将混合物再次通过在减压下蒸馏来浓缩至3 L。装填乙酸丁酯(4.8 L)并将混合物加热至60℃。将混合物搅拌1小时，然后将其通过在减压下蒸馏来浓缩至大约4 L。将温度设定为60℃且经20分钟添加庚烷(3.8 L)。将混合物经3小时冷却至20℃且然后搅拌过夜。过滤固体并用乙酸丁酯:庚烷的1:1混合物洗涤两次(2 × 2 L)。将产物在50℃下在真空下干燥以得到(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺(0.562 kg；1.36 mol；通过1H NMR测定为100% w/w)。1H NMR (500MHz, DMSO-d 6) ppm 0.97 (d, 1 H), 1.12-1.30 (m, 2 H), 1.37-1.51 (m, 3 H),1.83 (d, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 2.17 (s, 2 H), 2.89-3.12 (m, 3 H), 3.20 (s, 3H), 6.54 (s, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 7.40 (d, 1 H), 7.54 (d, 1 H), 7.90(s,1H).8.51(d,1H), 8.67(d,1H)。
实施例12：(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3- 基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐的制备
在60℃下将1.105 kg (1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺溶解于8.10 L 2-丙醇和475mL水中。然后在60℃下装填1.0摩尔当量(622克) (1S)-(+)-10樟脑磺酸。搅动浆液直至所有(1S)-(+)-10樟脑磺酸都溶解。在60℃下添加第二份2-丙醇(6.0 L)且然后蒸馏内容物直至收集4.3 L馏出物。然后在65℃下装填9.1 L庚烷。延迟1小时后批料变不透明。然后在约75℃下进行额外蒸馏且收集8.2 L馏出物。然后将批料经2小时冷却至20℃且在该温度下保持过夜。然后过滤批料并用1.8 L 2-丙醇和2.7 L庚烷的混合物洗涤。最后在减压下和50℃下干燥该物质。产量为1.44 kg (83.6% w/w)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.12(1H, s), 9,70 (2H, d, J 40.2), 8.81 (1H, d, J 2.1), 8.55 (1H, d, J 1.7), 8.05(1H, dd, J 2.1, 1.7), 7.77 (1H, dd, J 7.8, 1.2), 7.50 (2H, m), 3.22 (3H, s),3.19 (1H, d, J 16.1), 3.10 (1H, d, J 16.1), 3.02 (1H, m), 2.90 (1H, d, J14.7), 2.60 (1H, m), 2.41 (1H, d, J 14.7), 2.40 (3H, s), 2.22 (1H, m), 2.10(3H, s), 1.91 (3H, m), 1.81 (1H, m), 1.77 (1H, d, J 18.1), 1.50 (2H, m), 1.25(6H, m), 0.98 (3H, s), 0.69 (3H, s)。
实施例13：测试(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶- 3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的活性
使用以下方法来测试(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的活性水平：
TR-FRET测定
TR-FRET中使用的β-分泌酶制备如下：
使用ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK哺乳动物表达载体克隆人类β-分泌酶(AA 1 - AA460)的可溶性部分的cDNA。将该基因融合至IgG1的Fc结构域(亲和力标签)且稳定克隆至HEK 293细胞中。将纯化的sBACE-Fc在-80℃下储存于Tris缓冲液(pH 9.2)中，且具有40%的纯度。
在反应缓冲液(乙酸钠、chaps、triton x-100、EDTA (pH4.5))中将酶(截短形式)稀释至6 μg/mL (储备液为1.3 mg/mL)并将底物(铕)CEVNLDAEFK(Qsy7)稀释至200 nM (储备液为120 μM)。使用机器人系统Biomek FX和Velocity 11用于所有液体操作并将酶和底物溶液保持于冰上，直至将其置于机器人系统中。向板中添加酶(9 μl)，然后添加1 μl二甲基亚砜中的化合物，混合且预孵育10分钟。然后添加底物(10 μl)，混合并在室温下进行反应15分钟。通过添加终止溶液(7 μl，乙酸钠，pH 9)来停止反应。在Victor II读板仪上用340nm的激发波长和615nm的发射波长来测量产物的荧光。在Costar 384孔圆底、低体积、非结合表面板(Corning #3676)中进行测定。酶的最终浓度为2.7 μg/ml；底物的最终浓度为100 nM (~250 nM的Km)。二甲基亚砜对照(而非测试化合物)定义100%活性水平且0%活性通过缺乏酶(用反应缓冲液代替)的孔定义。对照抑制剂还用于剂量反应测定中且具有~150nM的IC50。
稀释的TR-FRET测定
在稀释的TR-FRET测定中进一步测试化合物，条件如上文针对TR-FRET测定所述，但用1/50的酶和6.5 h长反应时间在室温下于暗处进行测试。
sAPPβ释放测定
将SH-SY5Y细胞在含有Glutamax、10% FCS和1%非必需氨基酸的DMEM /F-12中培养且以7.5-9.5x106个细胞/瓶的浓度冷冻保存并储存在-140℃下。将细胞解冻且以100 μL细胞悬浮液/孔以约10000个细胞/孔的浓度接种至384孔组织培养处理板中的含有Glutamax、10%FCS和1%非必需氨基酸的DMEM /F-12中。然后将细胞板在37℃、5% CO2下孵育7-24 h。去除细胞培养基，随后添加30 µL于含有Glutamax、10% FCS、1%非必需氨基酸和1% PeSt的DMEM/F-12中稀释至最终浓度为1% DMSO的化合物。在37℃、5% CO2下将化合物与细胞一起孵育17 h (过夜)。使用Meso Scale Discovery (MSD)板来检测sAPPβ释放。将MSD sAPPβ板在室温下在振荡下于Tris洗涤缓冲液(40 µL/孔)中的1% BSA中封闭1 h并在Tris洗涤缓冲液(40 µL/孔)中洗涤1次。将20 µL培养基转移至预封闭且洗涤的MSD sAPPβ微量板中，并将细胞板进一步用于ATP测定中以测量细胞毒性。在室温下将MSD板振荡孵育2 h且丢弃培养基。每孔添加10 µL检测抗体(1 nM)，随后在室温下振荡孵育2 h且然后丢弃。每孔添加40 µL读取缓冲液并在SECTOR成像仪中读取板。
ATP测定
如sAPPβ释放测定中所示，在从细胞板转移20 μL培养基用于sAPPβ检测之后，使用所述板来使用来自Cambrex BioScience的测量细胞总ATP的ViaLightTM Plus细胞增殖/细胞毒性试剂盒来分析细胞毒性。该测定根据制造商的方案来进行。简言之，每孔添加10 μL细胞裂解试剂。将板在室温下孵育10 min。在添加25 μL 重构的ViaLightTM Plus ATP试剂之后两分钟，在Wallac Victor2 1420多标记计数器中测量发光。毒性(tox)阈值为低于对照的75%的信号。
结果
(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺异构体的IC50值概述于下表15中。
TR-FRET测定中的IC<sub>50</sub> (nM) sAPPβ释放测定中的IC<sub>50</sub> (nM)
0.57<sup>a</sup> 0.10
a 来自稀释FRET测定的IC50。
实施例14：(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3- 基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐的活性
可以使用以下方法来测试(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐的活性水平：
TR-FRET测定
TR-FRET中使用的β-分泌酶制备如下：
使用ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK哺乳动物表达载体克隆人类β-分泌酶(AA 1 - AA460)的可溶性部分的cDNA。将该基因融合至IgG1的Fc结构域(亲和力标签)且稳定克隆至HEK 293细胞中。将纯化的sBACE-Fc在-80℃下储存于50 mM甘氨酸(pH 2.5)中，用1 M Tris调节至pH 7.4，且具有40%的纯度。
在反应缓冲液(乙酸钠、chaps、triton x-100、EDTA (pH4.5))中将酶(截短形式)稀释至6 μg/mL (储备液为1.3 mg/mL)并将TruPoint BACE1底物稀释至200 nM (储备液为120 μM)。将二甲基亚砜(最终DMSO浓度为5%)中的酶和化合物混合并在室温下预孵育10分钟。然后添加底物并将反应物在室温下孵育15分钟。通过添加0.35体积终止溶液(乙酸钠，pH 9)来停止反应。在Victor II读板仪上用340-485 nm的激发波长和590-615 nm的发射波长来测量产物的荧光。酶的最终浓度为2.7 μg/ml；底物的最终浓度为100 nM (~250 nM的Km)。二甲基亚砜对照(而非测试化合物)定义100%活性水平且0%活性由不含酶(用反应缓冲液替代)的孔或由已知抑制剂2-氨基-6-[3-(3-甲氧基苯基)苯基]-3,6-二甲基-5H-嘧啶-4-酮的饱和剂量来定义。对照抑制剂还用于剂量反应测定中且具有~150 nM的IC50。
(1r,1'R,4R)-4-甲氧基-5''-甲基-6'-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3'H-二螺[环己烷-1,2'-茚-1'2''-咪唑]-4''-胺的樟脑磺酸盐在该测定中具有0.2 nM的平均IC50。
sAPPβ释放测定
将SH-SY5Y细胞在含有Glutamax、10% FCS和1%非必需氨基酸的DMEM /F-12中培养且以7.5-9.5x106个细胞/瓶的浓度冷冻保存并储存在-140℃下。将细胞解冻且以100 μL细胞悬浮液/孔以约10000个细胞/孔的浓度接种至384孔组织培养处理板中的含有Glutamax、10%FCS和1%非必需氨基酸的DMEM /F-12中。然后将细胞板在37℃、5% CO2下孵育7-24 h。去除细胞培养基，随后添加30 µL于含有Glutamax、10% FCS、1%非必需氨基酸和1% PeSt的DMEM/F-12中稀释至最终浓度为1% DMSO的化合物。在37℃、5% CO2下将化合物与细胞一起孵育17 h (过夜)。使用Meso Scale Discovery (MSD)板来检测sAPPβ释放。将MSD sAPPβ板在室温下在振荡下于Tris洗涤缓冲液(40 µL/孔)中的1% BSA中封闭1 h并在Tris洗涤缓冲液中(40 µL/孔)洗涤1次。将20 µL培养基转移至预封闭且洗涤的MSD sAPPβ微量板中，并将细胞板进一步用于ATP测定中以测量细胞毒性。在室温下将MSD板振荡孵育2 h且丢弃培养基。每孔添加10 µL检测抗体(1 nM)，随后在室温下振荡孵育2 h且然后丢弃。每孔添加40 µL读取缓冲液并在SECTOR成像仪中读取板。
ATP测定
如sAPPβ释放测定中所示，在从细胞板转移20 μL培养基用于sAPPβ检测之后，使用所述板来使用来自Cambrex BioScience的测量细胞总ATP的ViaLightTM Plus细胞增殖/细胞毒性试剂盒来分析细胞毒性。该测定根据制造商的方案来进行。简言之，每孔添加10 μL细胞裂解试剂。将板在室温下孵育10 min。添加25 μL重构的ViaLightTM Plus ATP试剂后2min，测量发光。毒性(tox)阈值为低于对照的75%的信号。
实施例15：将抗体或抗原结合片段和BACE抑制剂施用于阿尔茨海默病的动物模型
将代表性抗体或抗原结合片段(例如Abet0380-GL)和代表性BACE抑制剂(例如的樟脑磺酸盐)组合施用于以下代表性动物模型中的任一种中：描述于Games等人, 1995, Nature, 373(6514):523-7中的PDAPP小鼠；描述于Eketjall等人, 2016, Journal of Alzheimer’s Disease, 50(4): 1109-1123中的C57BL/6小鼠或Dunkin-Hartley豚鼠；描述于上文实施例2中的Sprague-Dawley大鼠或Tg2576小鼠。向对照动物模型施用相应剂量的单独的抗体或抗原结合片段、单独的BACE抑制剂或媒介物对照。以与实施例2中所述一致的方式静脉内施用抗体或抗原结合片段。以类似于Eketjall等人所述的方式经口施用BACE抑制剂。监测小鼠关于组合疗法对小鼠有毒的任何体征(例如监测虚弱、昏睡、体重损失、死亡的体征)，且相应地调节每种药物的剂量以实现最大治疗效应，同时使任何细胞毒性效应最小化。以类似于上文实施例2中和Eketjall等人所述的方式监测来自动物的脑、血浆和CSF样品的生物分析(例如那些样品中的Aβ水平的生物分析)。还在小鼠中使用本领域已知的行为和/或认知测定来评价不同治疗条件的效应。施用组合疗法的动物模型中大于对照动物模型的测试参数(诸如Aβn-42水平)的改善(例如Aβ1-42水平的较大减小)表明，组合疗法比用单独的BACE抑制剂或抗体或抗原结合片段的治疗更有效地解决该参数。技术人员知道测试组合疗法的效应的其他模型和其他参数。例如参见Bogstedt等人, 2015, Journal of Alzheimer’s Disease, 46:1091-1101。
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其他参考文献包括于文本中。

Claims (63)

1.治疗具有与Aβ累积相关的疾病或病症的主体的方法，其包括向所述主体施用：
a)药学上有效量的BACE抑制剂，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；和
b)药学上有效量的包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR的抗体或抗原结合片段。
2.权利要求1的方法，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐。
3.权利要求1的方法，其中所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：
。
4.权利要求1的方法，其中所述BACE抑制剂是：
。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个Abet0380或其种系化变体的CDR。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含Abet0380或其种系化变体的重链的CDR。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含Abet0380或其种系化变体的轻链的CDR。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 528、SEQ IDNO: 529、SEQ ID NO: 530和SEQ ID NO: 531的氨基酸序列具有至少90%同一性的框架区。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述VH结构域包含具有SEQ ID NO: 528、SEQID NO: 529、SEQ ID NO: 530和SEQ ID NO: 531的氨基酸序列的框架区。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 537、SEQ IDNO: 538、SEQ ID NO: 539和SEQ ID NO: 540的氨基酸序列具有至少90%同一性的框架区。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO: 537、SEQID NO: 538、SEQ ID NO: 539和SEQ ID NO: 540的氨基酸序列的框架区。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 524具有至少90%同一性的氨基酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 533具有至少90%同一性的氨基酸序列。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述VH结构域包含与SEQ ID NO: 524具有至少95%同一性的氨基酸序列。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述VL结构域包含与SEQ ID NO: 533具有至少95%同一性的氨基酸序列。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524的氨基酸序列。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533的氨基酸序列。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。
23.权利要求22的方法，其中所述抗原结合片段是scFv。
24.权利要求22的方法，其中所述抗原结合片段是Fab'。
25.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
27.权利要求25或26的方法，其中所述抗体是IgG抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述抗体是人类IgG1或人类IgG2。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体是人类IgG1-TM、IgG1-YTE或IgG1-TM-YTE。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是人类抗体或抗原结合片段。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段以500 pM或更小的解离常数(KD)结合单体Aβ1-42，且不结合Aβ1-40或以大于1 mM的KD结合Aβ1-40。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段结合淀粉样蛋白β17-42肽(Aβ17-42)和淀粉样蛋白β29-42肽(Aβ29-42)。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段结合3-焦-42淀粉样蛋白β肽和11-焦-42淀粉样蛋白β肽。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合片段结合淀粉样蛋白β1-43肽(Aβ1-43)。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、唐氏综合征和/或黄斑退化。
37.权利要求36的方法，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病。
38.权利要求36的方法，其中所述疾病或病症是唐氏综合征。
39.权利要求36的方法，其中所述疾病或病症是黄斑退化。
40.权利要求1-39中任一项的方法，其中将所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段同时施用于主体。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中分开施用所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段。
42.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段在相同组合物中。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中经口施用所述BACE抑制剂。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其中静脉内施用所述抗体或抗原结合片段。
45.权利要求1-43中任一项的方法，其中皮下施用所述抗体或抗原结合片段。
46.权利要求1-45中任一项的方法，其中所述主体是人类。
47.权利要求1-46中任一项的方法，其中所述方法改善认知能力或阻止进一步认知损害。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述方法改善记忆或阻止进一步痴呆。
49.组合物，其包含与抗体或抗原结合片段组合用于治疗与Aβ累积相关的疾病或病症的BACE抑制剂，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；和其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。
50.组合物，其包含与BACE抑制剂组合用于治疗与Aβ累积相关的疾病或病症的抗体或抗原结合片段，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；和其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。
51.权利要求49或50的组合物，其中所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：
。
52.权利要求49或50的组合物，其中所述BACE抑制剂是：
。
53.权利要求49-52中任一项的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
54.权利要求49-53中任一项的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
55.权利要求49-54中任一项的组合物，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
56.权利要求49-55中任一项的组合物，其中所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
57.药剂盒，其包含BACE抑制剂和抗体或抗原结合片段，其中所述BACE抑制剂是：
或其药学上可接受的盐；且其中所述抗体或抗原结合片段包含至少1、2、3、4、5或6个来自Abet0380、Abet0342、Abet0369、Abet 0377或Abet0382或其种系化变体中的任一种的CDR。
58.权利要求57的药剂盒，其中所述BACE抑制剂是以下的樟脑磺酸盐：
。
59.权利要求57的药剂盒，其中所述BACE抑制剂是：
。
60.权利要求57-59中任一项的药剂盒，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VH结构域包含SEQ ID NO: 524中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
61.权利要求57-60中任一项的药剂盒，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中所述VL结构域包含SEQ ID NO: 533中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
62.权利要求57-61中任一项的药剂盒，其中所述VH结构域包含：
具有SEQ ID NO: 525的氨基酸序列的VH CDR1；
具有SEQ ID NO: 526的氨基酸序列的VH CDR2；和
具有SEQ ID NO: 527的氨基酸序列的VH CDR3。
63.权利要求57-62中任一项的药剂盒，其中所述VL结构域包含：
具有SEQ ID NO: 534的氨基酸序列的VL CDR1；
具有SEQ ID NO: 535的氨基酸序列的VL CDR2；和
具有SEQ ID NO: 536的氨基酸序列的VL CDR3。
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