相關申請案之交叉參考
本申請案主張來自2016年3月15日提出申請之美國臨時申請案第62/308,698號之優先權權益。前述申請案之說明書之全部內容以引用方式併入本文中。 本發明提供使用本文所揭示之任一BACE抑制劑與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段組合治療有需要之個體的方法。亦提供套組及組合物。 1.
定義
在闡述本發明之前，應理解，本發明並不限於所闡述之特定方法及實驗條件，此乃因該等方法及條件可有所變化。亦應理解，本文所使用之術語僅出於闡述特定實施例之目的，且並不意欲加以限制，此乃因本發明範圍將僅受限於隨附申請專利範圍。 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之意義。 除非上下文另外明確指明，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a、an)」及「該」包含複數個指示物。 胺基酸在本文中可表示為其眾所周知之三字母符號或由IUPAC-IUB生化術語委員會(Biochemical Nomenclature Commission)推薦之單字母符號。類似地，核苷酸可表示為其公認單字母代碼。 此處應指出，本文所用之「及/或」應理解為兩種指定特徵或組份中之每一者(含有或不含另一者)之具體揭示內容。舉例而言，「A及/或B」應理解為(i) A、(ii) B及(iii) A及B中之每一者之具體揭示內容，正如每一者在本文中個別地陳述一般。 術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。 在此說明書通篇中，詞語「包括(comprise)」或變化形式(例如「包括(comprises或comprising)」)應理解為暗示包含所陳述整數或整數組，但不排除任一其他整數或整數組。 如本文中所使用，在用於提及特定列舉數值時，術語「約」意指該值可自列舉值變化不超過10%。 2.
BACE 抑制劑
本發明提供本文所揭示之任一BACE抑制劑與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之組合的用途，其用於治療有需要之個體。 在一些實施例中，用於本文所闡述任一方法中之適宜BACE抑制劑包含揭示於美國專利8,415,483、8,865,911及9,248,129及美國專利申請案公開案2014/0031379中者，該等案件中之每一者皆以引用方式併入本文中。 在一些實施例中，適用於本發明中之BACE抑制劑係4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺或其醫藥上可接受之鹽。 在一些實施例中，BACE抑制劑係(1r,4r)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺：
或其醫藥上可接受之鹽。 在一些實施例中，適用於本發明中之BACE抑制劑係(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺：
, 或其醫藥上可接受之鹽。 如本文中所使用，「醫藥上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中母體化合物係藉由製備其酸式鹽或鹼式鹽來加以改質。醫藥上可接受之鹽之實例包含(但不限於)鹼性殘基(例如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽、酸性殘基(例如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽及諸如此類。醫藥上可接受之鹽包含(例如)自無毒無機或有機酸形成之母體化合物之無毒鹽或四級銨鹽。舉例而言，該等無毒鹽包含衍生自無機酸(例如鹽酸)者。本發明之醫藥上可接受之鹽可藉由習用化學方法自含有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。通常，可藉由使該等化合物之游離酸或鹼形式與化學計量量之適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在二者之混合物中進行反應來製備該等鹽；通常使用非水性介質，例如二乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。 在一些實施例中，適用於本發明中之BACE抑制劑係化合物：4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]4’’-胺之樟腦磺酸鹽。 在一些實施例中，BACE抑制劑係(1r,4r)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽：
。 在一些實施例中，適用於本發明中之BACE抑制劑係(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽：
。 在一些實施例中，BACE抑制劑係：
在一些實施例中，BACE抑制劑係：
， 其特徵在於提供實質上展現具有如表A中所繪示d-間距值之下列峰之X射線粉末繞射(XRPD)圖案： 表A：經X射線粉末繞射鑑別之峰
在一些實施例中，BACE抑制劑係：
其特徵在於提供實質上展現具有如表B中所繪示d-間距值之下列極強、強及中等峰之X射線粉末繞射圖案： 表B： 經X射線粉末繞射鑑別之峰
如本文中所使用，術語樟腦磺酸鹽亦涵蓋其所有溶劑合物及共晶體。 適用本文中之BACE抑制劑之替代鹽包含琥珀酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、富馬酸鹽及1.5萘二磺酸鹽。 本發明進一步包含本發明化合物之所有互變異構體形式。如本文中所使用，「互變異構體」意指以源於氫原子遷移之平衡存在之其他結構異構體。例如酮-烯醇互變異構現象，其中所得化合物具有酮及不飽和醇之性質。互變異構現象之其他實例包含2H-咪唑-4-胺及其互變異構體1,2-二氫咪唑-5-亞胺以及2H-咪唑-4-硫醇及其互變異構體1,2-二氫咪唑-5-硫酮。應理解，在本說明書通篇之化合物代表圖中，僅繪製或命名化合物之一種可能互變異構體。 本發明化合物進一步包含水合物及溶劑合物。 (1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’,2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽：
化合物(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽可藉由以下步驟獲得：自(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺於適宜溶劑(例如2-丙醇、乙腈或丙酮或該等溶劑與水之混合物)中之溶液開始，然後在室溫與80℃之間之溫度下將所獲得之溶液與(1S)-(+)-10-樟腦磺酸直接混合或將其溶於適宜溶劑(例如2-丙醇或水)中。結晶可藉由蒸發溶劑及/或藉由冷卻溶液或直接以鹽反應物結晶來獲得。可使用晶種來開始結晶。晶種可自批料本身藉由收集少量溶液試樣且然後將其快速冷卻以誘導結晶來製備。然後將晶體添加至批料中作為晶種。 可對根據標準方法製備之試樣實施X射線粉末繞射分析(XRPD)，該等標準方法係(例如)闡述於Giacovazzo, C.等人(1995), Fundamentals of Crystallography, Oxford University Press；Jenkins, R.及Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York；Bunn, C. W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London；或Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley and Sons, New York中者。X射線繞射分析係使用PANanlytical X’Pert PRO MPD繞射儀經96分鐘自1°至60° 2θ來實施。XRPD距離值可在最後小數位上在±2範圍內變化。 相對強度係源於使用可變狹縫量測之繞射圖。 相對於最強峰量測之相對強度表示為極強(vs，相對峰高度大於50%)、強(s，介於25%與50%之間)、中等(m，介於10%與25%之間)、弱(w，介於5%與10%之間)及極弱(vw，低於5%)。熟習此項技術者將瞭解，出於多種原因(包含較佳取向)，在不同試樣與不同試樣製劑之間，XRPD強度可變。熟習此項技術者亦將瞭解，出於多種原因(包含繞射儀中試樣表面位凖之變化)，所量測角度及由此d-間距可出現較小位移。 3.
抗 A β 抗體或抗原結合片段
本發明提供中本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合的用途，其用於治療有需要之個體。 在一些實施例中，用於本文所闡述任一方法中之適宜抗體或抗原結合片段包含揭示於WO 2014/060444及US 2015/0299299 (其中之每一者皆以引用方式併入本文中)中者。 如本文中所定義，「抗體或抗原結合片段」包括至少1、2、3、4、5或6個下列抗體或抗原結合片段中之任一者或多者之CDR：Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383或其生殖系化變體。在一些實施例中，「抗體或抗原結合片段」包括至少1、2、3、4、5或6個下列抗體或抗原結合片段中之任一者或多者之CDR：Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化變體。在特定實施例中，「抗體或抗原結合片段」包括至少1、2、3、4、5或6個Abet0380或其生殖系化變體之CDR。在本申請案通篇中，除非另外明確陳述，否則CDR係使用Chothia、Kabat及/或IMGT系統所鑑別或定義。在將CDR指示為如藉由Chothia、Kabat或IMGT系統所鑑別或定義時，其意指CDR係根據該系統所獲得(例如Chothia CDR、Kabat CDR或IMGT CDR)。可使用該等術語中之任一者來指示提及Chothia、Kabat抑或IMGT CDR。 藉由結合血漿、腦及腦脊髓液(CSF)中之Aβ肽1-42及其N-末端截短物(n-42)之同種型，本發明之抗體或抗原結合片段可防止Aβ n-42 (例如Aβ1-42、Aβ焦3-42及/或Aβ 4-42)同種型在腦及腦血管內之累積或逆轉其沈積。本發明之抗體或抗原結合片段可結合及沈澱血漿及/或腦脊髓液(CSF)中之可溶性Aβ1-42，由此減小Aβ1-42分別在血清及/或CSF中之濃度。在與本文所揭示之任一BACE抑制劑組合使用時，該等抗體或抗原結合片段代表用於阿茲海默氏病及其他與類澱粉變性有關之病狀之治療方式。 在特定實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段對Aβ17-42內或Aβ29-42內之靶表位具有特異性，且相對於非靶表位(例如來自Aβ1-40之表位)以高親和力結合此靶表位，由此靶向與類澱粉斑塊形成有關之主要毒性物質。舉例而言，抗體或抗原結合片段對Aβ1-42所顯示之結合親和力可大於Aβ1-40至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。因此，在一些實施例中，抗體或抗原結合片段較Aβ1-40對於結合Aβ1-42具有選擇性。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可以500 pM或更小之解離常數(KD)結合Aβ1-42。在特定實施例中，抗體或抗原結合片段展示並無至Aβ1-40之顯著結合。在一些實施例中，可使用表面電漿共振且使用單體Aβ肽來測定親和力及結合，如實例中所闡述。 亦可在均相時間解析螢光(HTRF
TM
)分析中量測Aβ結合以測定抗體是否能夠與針對Aβ肽之參考抗體分子競爭結合至Aβ，如實例中所闡述。 HTRF
TM
分析係利用緊密相鄰之供體及受體螢光團之間之螢光共振能量轉移的均相分析技術。可使用該等分析藉由直接或間接使一種所關注分子偶合至供體螢光團(銪(Eu3+)穴狀化合物)且使另一所關注分子偶合至受體螢光團XL665 (穩定交聯之別藻藍蛋白)來量測巨分子相互作用。穴狀化合物分子之激發(在337 nm下)產生620nm下之螢光發射。來自此發射之能量可轉移至與穴狀化合物緊密相鄰之XL665，從而使得自XL665發射特定長壽螢光(在665 nm下)。量測供體(在620 nm下)及受體(在665 nm下)之具體信號，此容許計算補償分析中之著色化合物之存在之665/620 nm比率。 在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可競爭結合至Aβ1-42且由此在HTFR
TM
競爭分析中抑制參考抗體與Aβ1-42 (而非Aβ1-40)之結合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可在HTRF
TM
分析中展示Abet0144GL至Aβ1-42之結合之至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%抑制。 除非另外陳述，否則結合抑制功效可表示為IC
50
值且以nM表示。在功能分析中，IC
50
係減小50%之最大生物反應之抗體分子濃度。在配體結合研究中，IC
50
係將受體結合減小50%之最大具體結合程度之濃度。可藉由以下方式來計算IC
50
：將最大生物反應功能%隨抗體或抗原結合片段濃度之log之變化繪圖且使用軟體程式(例如Prism (GraphPad)或Origin (Origin Labs))擬合數據之S形函數以生成IC
50
值。用於量測或測定功效之適宜分析在業內已眾所周知。 在一些實施例中，在使用Abet0144-GL及Aβ1-42之HTRF
TM
表位競爭分析中，抗體或抗原結合片段可具有5 nM或更小(例如2 nM或更小，例如1 nM或更小)之IC
50
。Abet0144-GL係具有VH域SEQ ID NO: 20及VL域SEQ ID NO: 29之抗體分子。其可以與擬測試抗體分子相同之形式(例如以scFv或IgG (例如IgG1)形式)用於分析中。因此，在HTRF表位競爭分析中，本發明之IgG抗體分子可與Abet0144-GL IgG競爭結合至人類Aβ1-42。此一分析中之功效可小於1 nM。 在特定實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段可較Aβ1-40展示對Aβ1-42之特異性結合，如藉由HTRF
TM
競爭分析所測定。在此一分析中，Aβ1-40可展示並無抗體或抗原結合片段至Aβ1-42肽之結合之顯著抑制，舉例而言，其可在此一分析中展示小於20% (例如小於10%或小於5%)之抑制，且在一些實施例中，在此一分析中展示並無顯著抑制。 在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段識別人類Aβ17-42內、更具體而言人類Aβ29-42內之表位且亦可識別來自其他物種(例如小鼠或大鼠)之Aβ中之其靶表位。可將抗體或抗原結合片段之功效(如在HTRF
TM
競爭分析中使用來自第一物種(例如人類)之Aβ1-42所計算)與抗體或抗原結合片段在相同分析中使用來自第二物種(例如小鼠Aβ1-42)之Aβ1-42之功效進行比較以評價抗體或抗原結合片段對兩種物種中Aβ1-42的交叉反應性程度。如由IC
50
量測所測定，功效可在10倍內或100倍內。如上所述，可使用Abet0144GL作為HTRF
TM
競爭分析中之參考抗體。本文所闡述之抗體或抗原結合片段在人類Aβ1-42分析中之功效可大於非人類Aβ1-42分析。在一些實施例中，抗體係有用的，此乃因其結合一類以上毒性或潛在毒性Aβ蛋白質物質(例如Aβ1-42及3-焦-42類澱粉β)。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可包括在抗體框架(亦即抗體抗原結合域)內具有一或多個CDR (例如CDR組)之抗體分子或其抗原結合片段。舉例而言，抗體分子可包括抗體VH及/或VL域。亦提供抗體分子之VH及VL域作為本發明之一部分。眾所周知，VH及VL域包括互補決定區(「CDR」)及框架區(「FW」)。VH域包括HCDR組且VL域包括LCDR組。抗體分子或其抗原結合片段可包括含有VH CDR1、CDR2及CDR3之抗體VH域及/或含有VL CDR1、CDR2及CDR3之抗體VL域。VH或VL域可進一步包括框架。VH或VL域框架通常包括4個框架區FW1、FW2、FW3及FW4，該等框架區與CDR以下列結構間雜排列：FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4。 在6個短CDR序列中，重鏈之第三CDR (HCDR3)具有較大大小可變性(基本上源於產生其之基因之配置機制之較大多樣性)。其可短至2個胺基酸，但已知最長大小為26。CDR長度亦可根據可由特定潛在框架容納之長度而有所變化。在功能上，HCDR3在抗體特異性之測定中發揮部分作用(Segal等人，PNAS, 71:4298-4302, 1974；Amit等人，Science, 233:747-753, 1986；Chothia等人，J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987；Chothia等人，Nature, 342:877- 883, 1989；Caton等人，J. Immunol., 144:1965-1968, 199；Sharon等人，PNAS, 87:4814-4817, 1990；Sharon等人，J. Immunol., 144:4863-4869, 1990；及Kabat等人，J. Immunol., 147:1709-1719, 1991)。 根據本發明態樣之抗體VH及VL域、FW及CDR之實例列示於表3及4及形成本發明之一部分之隨附序列表中。本文所揭示之所有VH及VL序列、CDR序列、CDR組、HCDR組及LCDR組以及該等要素之組合代表本發明態樣。如本文中所闡述，「CDR組」包括CDR1、CDR2及CDR3。因此，HCDR組係指HCDR1、HCDR2及HCDR3，且LCDR組係指LCDR1、LCDR2及 LCDR3。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係抗體。在一些實施例中，抗體係單株抗體。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係抗原結合片段。抗原結合片段包含(但不限於)諸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb及Fd等分子。已改造包含一或多個抗體抗原結合位點之各種其他抗體分子，包含(例如) Fab
2
、Fab
3
、二價抗體、三價抗體、四價抗體及微小抗體。抗體分子及其構築及使用方法闡述於Holliger & Hudson,
Nature Biotechnology
23(9):1126-1136 2005中。 經由如實例中所闡述多個文庫之進一步最佳化及重組之廣泛製程，自Abet0144GL生成一組抗體純系。該等另外最佳化之純系稱為Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383。其CDR序列及可變域序列可參照表3及4且陳述於序列表中。生殖系化VH及VL域序列Abet0380GL、Abet0377GL、Abet0343GL、Abet0369GL及Abet0382GL展示於表6及表7中。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括至少1、2、3、4、5或6個Abet0380之CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括1、2或3個Abet0380重鏈之CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括1、2或3個Abet0380輕鏈之CDR。表3及4展示，Abet0380具有使用Kabat系統鑑別之CDR組，其中HCDR1係SEQ ID NO: 525 (Kabat殘基31-35)，HCDR2係SEQ ID NO: 526 (Kabat殘基50-65)，HCDR3係SEQ ID NO: 527 (Kabat殘基95-102)，LCDR1係SEQ ID NO: 534 (Kabat殘基24-34)，LCDR2係SEQ ID NO: 535 (Kabat殘基50-56)且LCDR3係SEQ ID NO: 536 (Kabat殘基89-97)。其他最佳化抗體純系以類似方式展示於表3及4中且亦提供作為本發明之態樣。 根據本發明之人類Aβn-42之抗體或抗原結合片段可包括一或多如本文所闡述之個CDR (例如CDR組)。CDR或CDR組可為Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383 CDR組或其生殖系化形式，或可為如本文所闡述之其變體。 在一些實施例中； HCDR1可長5個胺基酸且由Kabat殘基31-35組成； HCDR2可長17個胺基酸且由Kabat殘基50-65組成； HCDR3可長16個胺基酸且由Kabat殘基95-102組成； LCDR1可長11個胺基酸且由Kabat殘基24-34組成； LCDR2可長7個胺基酸且由Kabat殘基50-56組成；及/或 LCDR3可長9個胺基酸且由Kabat殘基89-97組成。 抗體或抗原結合片段可包括表3及4中所列示任一抗體之HCDR1、HCDR2及/或HCDR3及/或LCDR1、LCDR2及/或LCDR3，例如表3或4中所列示任一抗體之CDR組。抗體或抗原結合片段可包括該等抗體中之任一者之VH CDR組。視情況，其亦可包括該等抗體中之一者之VL CDR組。VL CDR可與VH CDR來自相同或不同抗體。本文亦提供包括表3中所列示任一抗體之HCDR組之VH域及/或包括表4中所列示任一抗體之LCDR組之VL域。 抗體或抗原結合片段可包括表3及4中所列示任一抗體之H CDR及/或 L CDR組且在所揭示H CDR及/或L CDR組內具有一或多個胺基酸突變(例如最多5、10或15個突變)。突變可為胺基酸取代、缺失或插入。舉例而言，本發明抗體分子可包括具有一或兩個胺基酸突變(例如取代)之來自Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383或其生殖系化形式中之任一者之H CDR及/或L CDR組。 舉例而言，抗體或抗原結合片段可包括 VH域，其包括Abet0380或Abet0380GL HCDR組，其中Abet0380或Abet0380GL HCDR之胺基酸序列係 HCDR1 SEQ ID NO:525， HCDR2 SEQ ID NO:526，及 HCDR3 SEQ ID NO:527， 或包括具有一或兩個胺基酸突變之Abet0380 HCDR組，及 (ii) VL域，其包括bet0380或Abet0380GL LCDR組，其中Abet0380或Abet0380GL LCDR之胺基酸序列係 LCDR1 SEQ ID NO: 534 LCDR2 SEQ ID NO:535，及 LCDR3 SEQ ID NO:536， 或包括具有一或兩個胺基酸突變之Abet0380或Abet0380GL LCDR組。 可在CDR組內之任一殘基處潛在地進行突變。在一些實施例中，可與Abet0144GL相比在Abet0380、Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383中之任一者之取代位置進行取代，或與Abet0380相比在Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0381、Abet0382及Abet0383中之任一者之取代位置進行取代，或包括其生殖系化形式，如表3及4中所展示。 舉例而言，一或多個取代可位於下列Kabat殘基中之一或多者處： VH FW1中之26、27、28、29或30； VH CDR1中之31、32、33、34或35； VH CDR2中之52a、53、54、55、56、57、58或62； VH CDR3中之98、99、100h或102； VL CDR1中之24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34； VL CDR3中之89、90、92、93、94或97。 特定Kabat殘基位置之可能胺基酸取代之實例展示於表10及12 (對於VH域)及表11及13中(對於VL域)。 如上文所闡述，抗體或抗原結合片段可包括在抗體框架內具有一或多個CDR (例如CDR組)之抗體分子。舉例而言，可將抗體之一或多個CDR或CDR組接枝至框架(例如人類框架)中以提供抗體分子。框架區可為人類生殖系基因區段序列。因此，可將框架生殖系化，藉此框架內之一或多個殘基發生改變以匹配最類似人類生殖系框架中之等效位置之殘基。熟習此項技術者可在生殖系化之前選擇在序列上最接近抗體框架序列之生殖系區段且測試抗體之親和力或活性以證實在本文所闡述分析中生殖系化不顯著減小抗原結合或功效。熟習此項技術者已知人類生殖系基因區段序列且可(例如)自VBASE編譯(VBASE, MRC Centre of Protein Engineering, UK, 1997, http//mrc-cpe.cam.ac.uk)獲得。 如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可為具有在人類生殖系框架(例如Vh3-23 DP-47)中包括HCDR組之VH域之經分離人類抗體分子。因此，VH域框架區FW1、FW2及/或FW3可包括人類生殖系基因區段Vh3-23 DP-47之框架區及/或可藉由使框架殘基突變以匹配此人類生殖系基因區段之框架殘基來進行生殖系化。FW4可包括人類生殖系j區段之框架區。 VH FW1之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 528
。
VH FW1在Kabat位置26-30含有一系列可有助於抗原結合及/或對於CDR1環之結構構象較為重要之殘基。可在SEQ ID NO: 528中包含取代以(例如)與HCDR1之所選序列協同作用。一或多個取代可視情況選自展示於表10或表12中者。 VH FW2之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 529。VH FW3之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 530。VH FW4之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 531
。
通常，抗體或抗原結合片段亦具有(例如)在人類生殖系框架(例如Vλ 23-3 DPL-23)中包括LCDR組之VL域。因此，VL域框架區可包括人類生殖系基因區段Vλ 23-3 DPL-23之框架區FW1、FW2及/或FW3及/或可藉由使框架殘基突變以匹配此人類生殖系基因區段之框架殘基來進行生殖系化。FW4可包括人類生殖系j區段之框架區。VL FW1之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 537
。
VL FW2之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 538。VL FW3之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 539。VL FW4之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 540
。
生殖系化VH或VL域可或可不在一或多個微調殘基處發生生殖系化，但通常不發生生殖系化。 舉例而言，如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可包括與下列重鏈框架區組中之任一者至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列： FW1 SEQ ID NO: 528； FW2 SEQ ID NO: 529； FW3 SEQ ID NO: 530； FW4 SEQ ID NO: 531； 或可包括該組具有1、2、3、4、5、6或7個胺基酸突變(例如取代)之重鏈框架區。 如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可包括與下列重鏈框架區組中之任一者至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列： FW1 SEQ ID NO: 537； FW2 SEQ ID NO: 538； FW3 SEQ ID NO: 539； FW4 SEQ ID NO: 540； 或可包括該組具有1、2、3、4、5或6個胺基酸突變(例如取代)之輕鏈框架區。 非生殖系化抗體分子與生殖系化抗體分子相比具有相同CDR，但具有不同框架。在本文隨附序列表中所展示之抗體序列中，Abet0144-GL、Abet0380-GL、Abet0377-GL、Abet0343-GL、Abet0369-GL及Abet0382-GL之序列係生殖系化序列。本文揭示其序列之其他抗體分子的生殖系化抗體可藉由將其VH及VL域序列之框架區視情況生殖系化成VH域中之Vh3-23 DP-47及VL域中之Vλ 23-3 DPL-23來產生。 通常，使VH域與VL域配對以提供抗體抗原結合位點，但如上文所論述，可單獨使用VH或VL域來結合抗原。舉例而言，可使Abet0380-GL VH域(SEQ ID NO: 524)與Abet0380-GL VL域 (SEQ ID NO: 533)配對，從而形成包括Abet0380-GL VH及VL域之抗體抗原結合位點。提供本文所揭示其他抗體之VH及VL域之類似實施例。在其他實施例中，使Abet0380-GL VH與除Abet0380-GL VL外之VL域配對。業內充分確立輕鏈混雜性。同樣，本發明提供本文所揭示其他VH及VL域之類似實施例。因此，包括VH CDR之VH域或Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382及Abet0383中任一者之生殖系化VH域序列可與包括VL CDR之VL域或來自不同抗體之生殖系化VL域進行配對，舉例而言，VH及VL域可來自選自Abet0319、Abet0321b、Abet0322b、Abet0323b、Abet0328、Abet0329、Abet0332、Abet0342、Abet0343、Abet0369、Abet0370、Abet0371、Abet0372、Abet0373、Abet0374、Abet0377、Abet0378、Abet0379、Abet0380、Abet0381、Abet0382及Abet0383之不同抗體。 抗體或抗原結合片段可包括 (i) 如表14或隨附序列表中針對Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化形式中之任一者中所展示之VH域胺基酸序列， 或包括具有一或兩個胺基酸突變之胺基酸序列；及 (ii) 如表14或隨附序列表中針對Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化形式中之任一者中所展示之VL域胺基酸序列， 或包括具有一或兩個胺基酸突變之胺基酸序列。 抗體分子可包括： (i) 具有與表14中針對Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化形式中之任一者所展示之VH域胺基酸序列至少90%、95%或98%一致之胺基酸序列的VH域；及 (ii) 具有與表14中針對Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化形式中之任一者所展示之VL域胺基酸序列至少90%、95%或98%一致之胺基酸序列的VL域。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可包括分別與Abet0380、Abet0343、Abet0369、Abet0377及Abet0382或其生殖系化形式中之任一者之VH域及VL域至少90%、95%或98%一致之VH域及VL域。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括VH域，其中VH域包括： VH CDR1，其具有SEQ ID NO: 525之胺基酸序列； VH CDR2，其具有SEQ ID NO: 526之胺基酸序列；及 VH CDR3，其具有SEQ ID NO: 527之胺基酸序列。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括VH域，其中VL域包括： VL CDR1，其具有SEQ ID NO: 534之胺基酸序列； VL CDR2，其具有SEQ ID NO: 535之胺基酸序列；及 VL CDR3，其具有SEQ ID NO: 536之胺基酸序列。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括VH域及VL域，其中VH域包括： VH CDR1，其具有SEQ ID NO: 525之胺基酸序列； VH CDR2，其具有SEQ ID NO: 526之胺基酸序列；及 VH CDR3，其具有SEQ ID NO: 527之胺基酸序列；且其中VL域包括： VL CDR1，其具有SEQ ID NO: 534之胺基酸序列； VL CDR2，其具有SEQ ID NO: 535之胺基酸序列；及 VL CDR3，其具有SEQ ID NO: 536之胺基酸序列。 在一些實施例中，VH域包括與SEQ ID NO: 528、SEQ ID NO: 529、SEQ ID NO: 530及SEQ ID NO: 531中之任一者或多者之胺基酸序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之框架區。在一些實施例中，VL域包括與SEQ ID NO: 537、SEQ ID NO: 538、SEQ ID NO: 539及SEQ ID NO: 540中之任一者或多者之胺基酸序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之框架區。在一些實施例中，VH域包括與SEQ ID NO: 524至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包括與SEQ ID NO: 533至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 在一些實施例中，抗體分子或抗原結合片段包括抗體恆定區。抗體分子可為全抗體(例如IgG，亦即IgG1、IgG2或IgG4)，或可為如下文所闡述之抗體片段或衍生物。抗體分子亦可具有其他形式，例如在Fc區中具有YTE (Dall’Acqua等人(2002) J. Immunology, 169: 5171-5180；Dall’Acqua等人(2006) J Biol. Chem. 281(33):23514-24)及/或TM突變(Oganesyan等人(2008) Acta Cryst D64:700-4)之IgG1。 本發明提供具有變體Fc區之本發明之抗體或抗原結合片段，其中該變體包括位置234之苯丙胺酸(F)殘基、位置235之苯丙胺酸(F)殘基或麩胺酸(E)殘基及位置331之絲胺酸(S)殘基，如藉由Kabat中所陳述之EU索引所編號。該等突變組合在下文中稱為三重突變體(TM)。 如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可包括CDR、VH域、VL域、抗體-抗原結合位點或由以下中之任一者之核酸序列及/或載體編碼的抗體分子： (i) 寄存登錄號NCIMB 41889 (Abet0007)； (ii) 寄存登錄號NCIMB 41890 (Abet0380-GL)； (iii) 寄存登錄號NCIMB 41891 (Abet0144-GL)； (iv) 寄存登錄號NCIMB 41892 (Abet0377-GL)。 如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可自寄存登錄號NCIMB 41889、41890、41891或41892之核酸、載體或細胞系產生或生產。舉例而言，可藉由表現寄存登錄號NCIMB 41890之細胞系之核酸或載體來產生抗體或抗原結合片段。可使用任一便利表現系統來表現核酸或載體。或者，可藉由寄存登錄號NCIMB 41889、41890、41891或41892之細胞系來表現抗體或抗原結合片段。 本發明態樣亦提供編碼VH及/或VL域之核酸，其含於登錄號41889、41890、41891或41892之細胞系中；包括該核酸之載體，其含於登錄號41889、41890、41891或41892之細胞系中；及登錄號41889、41890、41891或41892之細胞或細胞系。 本發明之抗體或抗原結合片段可包括與以下部分競爭結合至人類Aβ1-42之抗體抗原結合位點或抗體分子：任一由以登錄號41889、41890、41891或41892寄存之核酸編碼之抗體分子；或包括如隨附序列表中所陳述之Abet007、Abet0380-GL、Abet0144-GL或Abet0377-GL 之VH域及VL域胺基酸序列之抗體分子。 抗體或抗原結合片段通常包括具有抗原結合位點之分子。舉例而言，抗體或抗原結合片段可為抗體分子或包括抗原結合位點之非抗體蛋白質。 可採用單株及其他抗體且使用重組DNA技術產生其他結合靶抗原之抗體或嵌合分子。該等技術可涉及將編碼抗體之免疫球蛋白可變區或CDR之DNA引入不同免疫球蛋白之恆定區或恆定區加上框架區中。例如參見EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400及下文諸多文獻。雜交瘤或其他產生抗體之細胞可經受基因突變或其他變化，此可或可不改變所產生抗體之結合特異性。 抗體改造之其他業內可用技術可分離人類及人類化抗體。舉例而言，可如由Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S,
Antibody Engineering
, Springer-Verlag New York, LLC；2001, ISBN
:
3540413545]所闡述來製備人類雜交瘤。 可使用小鼠抗體基因鈍化且在功能上經人類抗體基因代替同時完整保留小鼠免疫系統之其他組份之轉基因小鼠來分離人類抗體[Mendez, M.等人(1997) Nature Genet, 15(2): 146-156]。可使用業內已知技術(例如揭示於(例如) WO91/09967、US 5,585,089、EP592106、US 565,332及WO93/17105中者)來產生人類化抗體。另外，WO2004/006955闡述人類化抗體之方法，其係基於藉由比較非人類抗體之可變區中CDR序列之規範CDR結構類型與來自人類抗體序列(例如生殖系抗體基因區段)文庫之相應CDR的規範CDR結構類型自人類抗體基因選擇可變區框架序列。與非人類CDR具有類似規範CDR結構類型之人類抗體可變區形成自其選擇人類框架序列之成員人類抗體序列之子組。可進一步根據人類與非人類CDR序列之間之胺基酸類似性來將子組成員分級。在WO2004/006955之方法中，選擇最高等級之人類序列來使用所選子組成員人類框架提供用於構築在功能上代替具有非人類CDR配對物之人類CDR序列之嵌合抗體之框架序列，由此提供具有高親和力及低免疫原性之人類化抗體且無需比較非人類抗體與人類抗體之間之框架序列。亦揭示根據該方法製得之嵌合抗體。 可藉由自藉助合成且組裝於適宜表現載體內之寡核苷酸生成之基因進行表現來產生合成抗體分子，例如如由Knappik等人[Knappik等人，J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86]或Krebs等人[Krebs等人，Journal of Immunological Methods 254 2001 67–84]所闡述。 已展示，全抗體片段(其可在本文中稱為抗體片段或抗原結合片段)可實施結合抗原之功能。抗原結合片段之實例係(i)由VL、VH、CL及CH1域組成之Fab片段；(ii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iii)由單一抗體之VL及VH域組成之Fv片段；(iv)由VH或VL域組成之dAb片段[Ward, E.S.等人，Nature 341, 544-546 (1989)；McCafferty等人(1990) Nature, 348, 552-554；Holt等人(2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]；(v)經分離 CDR區；(vi) F(ab')2片段，其係包括兩個經連接Fab片段之二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域及VL域由容許兩個域締合形成抗原結合位點之肽連接體連接[Bird等人，Science, 242, 423-426, 1988；Huston等人，PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)及(ix)藉由基因融合構築之「二價抗體」、多價或多特異性片段(WO94/13804；Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)。可藉由納入連接VH及VL域之二硫橋來穩定Fv、scFv或二價抗體分子[Reiter, Y.等人，Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]。亦可製備包括接合至CH3域之scFv之微小抗體[Hu, S.等人，Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]。結合片段之其他實例係Fab’，其與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1域之羧基末端處添加數個殘基，該等殘基包含一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸；及Fab’-SH，其係恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基團之Fab’片段。 可自本文所列示之任一抗體開始藉由諸如藉由酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消解及/或藉由化學還原裂解二硫橋等方法來獲得本發明之抗原結合片段。以另一方式，可藉由熟習此項技術者同樣熟知之基因重組技術或藉由肽合成(藉助(例如)自動肽合成劑，例如由Applied Biosystems company所供應者等)或藉由核酸合成及表現來獲得本發明中所包括之抗原結合片段。 本發明之功能抗體片段包含半衰期可藉由化學修飾、尤其藉由聚乙二醇化或藉由納入脂質體中來增加之任一功能片段。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係dAb。dAb (域抗體)係抗體之小單體抗原結合片段，亦即抗體重鏈或輕鏈之可變區。VH dAb天然出現於駱駝科動物(例如駱駝、駱馬)且可藉由使用靶抗原對駱駝科動物實施免疫、分離抗原特異性B細胞且自個別B細胞直接選殖dAb基因來產生。dAb亦可在細胞培養物中產生。 業內可使用各種方法來獲得抗體
。
抗體可為尤其人類、鼠類、嵌合或人類化起源之單株抗體，其可根據熟習此項技術者所熟知之標準方法來獲得。 一般而言，為製備尤其鼠類起源之單株抗體或其功能片段，可提及尤其闡述於「Antibodies」 manual [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988]中之技術或由Köhler及Milstein [Köhler及Milstein, Nature, 256:495-497, 1975]所闡述之自雜交瘤之製備技術。 在一些實施例中，可(例如)自使用人類Aβ1-42或一種含有由單株抗體識別之表位之其片段(例如Aβ17-42)實施免疫之動物細胞來獲得該單株抗體。 WO 2006/072620闡述延伸於免疫球蛋白域之β鏈之間之結構(非CDR)環中之抗原結合位點的改造。可在抗體分子中與天然CDR位置分隔開之區域中(例如在VH或VL域之框架區中)或在抗體恆定域(例如CH1及/或CH3中)改造抗原結合位點。在結構區域中改造之抗原結合位點可附加於或代替藉由VH及VL域之CDR組所形成之抗原結合位點。在多個抗原結合位點存在於抗體分子中之情形下，其可結合相同抗原(靶抗原)，由此增加抗體或抗原結合片段之化合價。或者，多個抗原結合位點可結合不同抗原(靶抗原及一或多個另一抗原)，且此可用於增加效應物功能，延長半衰期或改良抗體分子之活體內遞送。 包括抗體分子之異質製劑亦形成本發明之一部分。舉例而言，該等製劑可為具有全長重鏈及缺乏C-末端離胺酸之重鏈、具有不同醣基化程度及/或具有衍生胺基酸(例如環化N-末端麩胺酸以形成焦麩胺酸殘基)之抗體之混合物。 如上所述，本發明之抗體或抗原結合片段結合人類Aβ1-42。如本文所闡述，可針對親和力及/或HTRF
TM
競爭分析中之抑制功效來將本發明之抗體或抗原結合片段最佳化。通常，功效最佳化涉及使所擇抗體或抗原結合片段之序列(通常係抗體之可變域序列)突變以生成之抗體或抗原結合片段文庫，然後分析抗體或抗原結合片段文庫之功效且選擇較強力之抗體或抗原結合片段。因此，所選「功效最佳化」抗體或抗原結合片段之功效往往高於生成文庫之抗體或抗原結合片段。然而，亦可在並無最佳化下獲得高功效抗體或抗原結合片段，舉例而言，可自初始篩選直接獲得高功效抗體或抗原結合片段。分析及功效更詳細闡述於本文其他處。熟習此項技術者可由此生成具有高功效之抗體或抗原結合片段。 在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可以表3及4中所列示之任一抗體(例如scFv、IgG2、IgG1TM或IgG1)之親和力或以較佳親和力結合人類Aβ1-42。代表性抗體結合親和力展示於表5中。可在適當條件下比較不同抗體或抗原結合片段之結合親和力及中和功效。 可藉助序列改變或突變方法且篩選具有期望特性之抗原抗體或抗原結合片段來獲得本文所闡述之VH及VL域及CDR之變體(包含本文陳述胺基酸序列者及可用於針對Aβ1-42之抗體或抗原結合片段者)。期望特性之實例包含(但不限於)：相對於對抗原具有特異性之已知抗體增加對抗原之結合親和力；相對於對抗原具有特異性之已知抗體增加抗原活性之中和(若該活性係相對於已知抗體或配體在特定莫耳比率下對抗原之已知指定競爭能力)；能夠免疫沈澱複合物；能夠結合至以下指定表位：線性表位(例如使用如本文所闡述之肽結合掃描鑑別之肽序列，例如使用以線性及/或限制構象篩選之肽)或構象表位(藉由非鄰接殘基形成)；及能夠調節人類Aβ1-42之新生物活性。該等方法亦提供於本文中。 可產生本文所揭示抗體分子之變體且用於本發明中。在將多變量數據分析技術應用於結構/性質-活性關係中之計算化學之引導下[例如參見Wold等人，Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics–Mathematics and Statistics in Chemistry (編者：B. Kowalski)；D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6]，可使用熟知數學技術(例如統計學回歸、模式識別及分類)導出抗體之定性活性-性質關係[例如參見Norman等人， Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience；第3版(1998年4月) ISBN: 0471170828；Kandel, Abraham等人， Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (1995年5月11日), ISBN: 0133418847；Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press；(2000年12月), ISBN: 0198507089；Witten, Ian H.等人，Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann；(1999年10月11日), ISBN: 1558605525；Denison David G. T. (編者)等人，Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons；(2002年7月), ISBN: 0471490369；Ghose, Arup K.等人， Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8]。可自抗體序列、功能及三維結構之經驗及理論模型導出抗體性質(例如分析可能接觸殘基或所計算物理化學性質)且可個別地及組合考慮該等性質。 在一些實施例中，由VH域及VL域構成之抗原結合位點通常係由6個多肽環形成：三個來自輕鏈可變域(VL)且三個來自重鏈可變域(VH)。具有已知原子結構之抗體之分析已闡釋序列與抗體組合位點之三維結構之間的關係[Chothia C.等人， Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817；Al-Lazikani等人， Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]。該等關係暗示，除VH域中之第三區域(環)外，結合位點環具有少量主鏈構象中之一者：規範結構。已展示，特定環中所形成之規範結構取決於其大小及在環及框架區中之關鍵位點處某些殘基之存在。 序列-結構關係之此研究可用於預測具有已知序列但具有未知三維結構之抗體中彼等對於維持其CDR環之三維結構且由此維持結合特異性較為重要的殘基。可藉由對比該等預測與來自先導最佳化實驗之輸出來支持該等預測。以結構方式，可使用任一自由獲得或商業包裝(例如WAM) [Whitelegg, N.R.u.及Rees, A.R (2000).Prot. Eng., 12, 815-824]來產生抗體分子之模型[Chothia等人，Science, 223,755-758 (1986)]。然後可使用蛋白質觀察及分析軟體包(例如Insight II (Accelrys, Inc.)或Deep View) [Guex, N.及Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723]來評估CDR中之每一位置之可能取代。然後可使用此資訊來進行很可能對活性具有最小或有益效應之取代。 在CDR、抗體VH或VL域及抗體或抗原結合片段之胺基酸序列內進行取代所需之技術通常可在業內獲得。可在預計可或可不對活性具有最小或有益效應之取代下製得變體序列，且測試結合Aβ1-42之能力及/或任一其他期望性質。 如所論述，本文具有揭示序列之VH及VL域中之任一者之可變域胺基酸序列變體可用於本發明中。 如上所述，本發明態樣提供一者抗體或抗原結合片段(例如抗體分子)，其包括與表8中所列示任一抗體之VH域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之VH域，該VH域之序列展示於下文隨附序列表中；及/或包括與表9中所列示任一抗體之VL域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之VL域，該VL域之序列展示於隨附序列表中。 本發明態樣提供一者抗體或抗原結合片段(例如抗體分子)，其包括具有與本文列示任一抗體之VH CDR組具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之VH CDR組之VH域，VH CDR序列展示於本文中；及/或包括具有與本文所列示任一抗體之VL CDR組具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之VL CDR組之VL域，VL CDR序列展示於本文中。 可用於計算兩個胺基酸序列之一致性%之算法包含(例如)BLAST [Altschul等人 (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]、FASTA [Pearson及Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]或Smith-Waterman算法[Smith及Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197]，例如採用默認參數。 特定可變域可包含一或多個胺基酸序列突變(取代、缺失及/或插入胺基酸殘基)及小於約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變。 可在一或多個框架區及/或一或多個CDR中作出突變。突變通常不損失功能，從而包括由此改變之胺基酸序列之抗體或抗原結合片段可保留結合人類Aβ1-42之能力。其可保留關於未作出改變之抗體或其抗原結合片段之相同定量結合及/或中和能力，例如如在本文所闡述之分析中所量測。包括由此改變之胺基酸序列之抗體或抗原結合片段可改良結合人類Aβ1-42之能力。 突變可包括使用非天然或非標準胺基酸代替一或多個胺基酸殘基、將一或多個胺基酸殘基修飾成非天然或非標準形式或將一或多個非天然或非標準胺基酸插入序列中。本發明序列中之改變之數量及位置之實例闡述於本文其他處。天然胺基酸包含20個根據標準單字母代碼鑑別為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E之「標準」 L-胺基酸。非標準胺基酸包含任一可納入多肽主鏈中或源自現有胺基酸殘基之修飾之其他殘基。非標準胺基酸可為天然或非天然。業內已知若干天然非標準胺基酸，例如4-羥基脯胺酸、5-羥基離胺酸、3-甲基組胺酸、N-乙醯基絲胺酸等[Voet & Voet,
Biochemistry
，第2版，(Wiley) 1995]。彼等衍生於N-α位置之胺基酸殘基僅位於胺基酸序列之N-末端處。通常，在本發明中，胺基酸係L-胺基酸，但其可為D-胺基酸。改變可由此包括將L-胺基酸修飾成D-胺基酸或使用D-胺基酸代替其。亦已知胺基酸之甲基化、乙醯化及/或磷醯化形式，且本發明胺基酸可經受該修飾。 本發明之抗體域及抗體或抗原結合片段中之胺基酸序列可包括上述非天然或非標準胺基酸。可在合成期間或在合成胺基酸序列之後藉由修飾或代替「原始」標準胺基酸來將非標準胺基酸(例如D-胺基酸)納入胺基酸序列中。 非標準及/或非天然胺基酸之使用增加了結構及功能多樣性，且可由此增加在本發明之抗體或抗原結合片段中達成期望結合及中和性質之可能。另外，D-胺基酸及類似物已顯示與標準L-胺基酸相比具有不同藥物動力學特徵，由於具有L-胺基酸之多肽在投與動物(例如人類)之後在活體內降解，意味著D-胺基酸有利於一些活體內應用。 可使用一或多個所選VH及/或VL基因之隨機誘變以在整個可變域內生成突變來生成本發明之攜帶CDR源序列之新穎VH或VL區。此一技術由Gram等人[Gram等人，1992,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89
:3576-3580](其使用易錯PCR)闡述。在一些實施例中，在整個可變域或CDRs組內進行一或兩個胺基酸取代 可使用之另一方法係直接誘變成VH或VL基因之CDR區。該等技術係由Barbas等人[Barbas等人，1994,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91
: 3809-3813]及Schier等人[Schier等人，1996,
J. Mol. Biol. 263
:551-567]揭示。 所有上述技術在業內已眾所周知且熟習此項技術者能夠使用該等技術使用業內常規方法來提供本發明之抗體或抗原結合片段。 本發明之另一態樣提供一種獲得用於人類Aβ1-42之抗體抗原結合位點之方法，該方法包括藉由本文所述VH域之胺基酸序列中取代、缺失或插入一或多個胺基酸之方式來提供該VH域之胺基酸序列變體的VH域，視情況組合由此提供之VH域與一或多個VL域，及測試該VH域或VH/VL組合以鑑別用於Aβ1-42且視情況具有一或多種期望性質之抗體或抗原結合片段或抗體抗原結合位點。該VL域可具有實質上如本文中所述之胺基酸序列。可採用本文所揭示VL域之一或多個序列變體與一或多個VH域組合之類似方法。 如上所述，可將實質上如本文所陳述之CDR胺基酸序列作為CDR納入人類抗體可變域或其實質性部分中。實質上如本文所陳述之HCDR3序列代表本發明實施例且該等序列中之每一者可作為HCDR3納入人類重鏈可變域或其實質性部分中。 本發明中所採用之可變域可自任一生殖系或重排人類可變域獲得或衍生，或可為基於已知人類可變域之共有或實際序列之合成可變域。可變域可衍生自非人類抗體。可使用重組DNA技術將本發明之CDR序列(例如CDR3)引入缺乏CDR (例如CDR3)之可變域譜中。舉例而言，Marks等人[Marks等人，
Bio/Technology
, 1992,
10
:779-783]闡述產生抗體可變域譜之方法，其中結合使用指向或毗鄰可變域區域之5'端之共有引子與指向人類VH基因之第三框架區之共有引子來提供缺乏CDR3之VH可變域譜。Marks等人另外闡述此譜可與特定抗體之CDR3之組合方式。使用類似技術，可使用缺乏CDR3 VH或VL域之譜改組本發明之CDR3源序列，且經改組完整VH或VL域與同族VL或VH域進行組合以提供本發明之抗體或抗原結合片段。該譜然後可展示於適宜宿主系統(例如WO92/01047 (其全部內容以引用方式併入本文中)或下文諸多文獻(包含Kay、Winter及McCafferty [Kay, B.K.、Winter, J.及McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press])中之任一者之噬菌體展示系統)中，從而可選擇適宜抗體或抗原結合片段。譜可由10
4
個以上個體成員(例如至少10
5
、至少10
6
、至少10
7
、至少10
8
、至少10
9
或至少10
10
個成員或更多)中之任一者組成。其他適宜宿主系統包含(但不限於)酵母展示系統、細菌展示系統、T7展示系統、病毒展示系統、細胞展示系統、核糖體展示系統及共價展示系統。 提供製備用於人類Aβ1-42之抗體或抗原結合片段之方法，該方法包括： (a) 提供編碼包含擬代替CDR3或缺乏CDR3編碼區之VH域之核酸之起始譜； (b) 組合該譜與編碼實質上如本文針對VH CDR3 (例如表9中所展示之VH CDR3)所陳述之胺基酸序列之供體核酸，從而將該供體核酸插入該譜中之CDR3區中以提供編碼VH域之核酸產物譜； (c) 表現該產物譜之核酸； (d) 選擇用於人類Aβ1-42之抗體或抗原結合片段；及 (e) 回收該抗體或抗原結合片段或編碼其之核酸。 同樣，可採用組合本發明VL CDR3與編碼包含擬代替CDR3或缺乏CDR3編碼區之VL域之核酸譜之類似方法。 類似地，可將一或多個或所有三個CDR接枝至VH或VL域譜中，然後篩選用於人類Aβ1-42之一或多種抗體或抗原結合片段。 舉例而言，可採用表3或表4中所列示之一或多種抗體之HCDR1、HCDR2及/或HCDR3 (例如HCDR組)，及/或可採用本文所列示之一或多種抗體之LCDR1、LCDR2及/或LCDR3 (例如LCDR組)。 類似地，可採用本文所揭示之其他VH及VL域、CDR組及HCDR組及/或LCDR組。 大部分免疫球蛋白可變域可包括至少三個CDR區以及其插入框架區。該部分亦可包含至少約50%之第一及第四框架區中之任一者或兩者，該50%係在C-末端50%之第一框架區及在N-末端50%之第四框架區。大部分可變域之N-末端或C-末端處之其他殘基可為正常不與天然可變域區有關者。舉例而言，藉由重組DNA技術製得之本發明之抗體或抗原結合片段之構築可使得引入由所引入連接體編碼的N-末端或C-末端殘基以促進選殖或其他操縱步驟。其他操縱步驟包含引入連接體將本發明可變域接合至如本文其他處更詳細論述包含抗體恆定區、其他可變域(例如在產生二價抗體時)或可檢測/功能標記之其他蛋白質序列。 儘管在本發明之一些態樣中抗體或抗原結合片段包括一對VH及VL域，但基於VH或VL域序列之單一結合域形成本發明之其他態樣。眾所周知，單一免疫球蛋白域、尤其VH域能夠以特異性方式結合靶抗原。舉例而言，參見上文之dAb論述。 在任一單一結合域之情形下，可使用該等域篩選能夠形成能夠結合Aβ1-42之二域抗體或抗原結合片段之互補域。此可藉由噬菌體展示篩選方法使用如WO92/01047 (其全部內容以引用方式併入本文中)中所揭示之所謂的分級雙重組合方式來達成，其中使用含有H或L鏈純系之個別群落感染編碼另一鏈(L或H)之純系之完整文庫且根據噬菌體展示技術(例如闡述於參考文獻中者)選擇所得雙鏈抗體或抗原結合片段。此技術亦揭示於Marks等人，
Bio/Technology
, 1992,
10
:779-783中。 本發明之抗體或抗原結合片段可進一步包括抗體恆定區或其部分(例如人類抗體恆定區或其部分)。舉例而言，VL域可在其C-末端附接至包含人類Cκ或Cλ鏈之抗體輕鏈恆定域。類似地，基於VH域之抗體或抗原結合片段可在其C-末端附接至衍生自任一抗體同型(例如IgG、IgA、IgE及IgM)及任一同型子類(尤其係IgG2、IgG1及IgG4)之免疫球蛋白重鏈之全部或一部分(例如CH1域)。在一些實施例中，IgG2可因其缺乏效應物功能而較為有利。在其他實施例中，IgG1可因其效應物功能及製造便利性而較為有利。具有該等性質且穩定可變區之任一合成或其他恆定區變體亦可用於本發明中。 本發明之一態樣提供包括引起或容許如本文所提供之抗體或抗原結合片段至人類Aβ1-42之結合的方法。如所述，該結合可發生於活體內(例如在投與抗體或抗原結合片段或編碼抗體或抗原結合片段之核酸後)，或其可發生於活體外(例如在ELISA、西方印漬、免疫細胞化學、免疫沈澱、親和力層析及生物化學或基於細胞之分析)。 本發明亦提供上述抗體或抗原結合片段用於在競爭分析中量測抗原濃度之用途，亦即藉由在競爭分析中採用如由本發明所提供之抗體或抗原結合片段來量測試樣中之抗原濃度之方法。此方法可無需物理分離結合抗原與未結合抗原。可將報告基因分子連接至抗體或抗原結合片段，從而在結合時發生物理或光學變化。報告基因分子可直接或間接生成可檢測且可量化之信號。報告基因分子可直接或間接、以共價方式(例如經由肽鍵)或以非共價方式進行鏈接。經由肽鍵之鏈接可源於編碼抗體及報告基因分子之基因融合體之重組表現。 可容易地在活體外(例如使用ELISA及/或藉由生物化學競爭分析，例如將特定報告基因分子加標籤至一種可在一或多種其他未加標籤抗體或抗原結合片段存在下檢測之抗體或抗原結合片段者)分析抗體或抗原結合片段之間之競爭，從而使得能夠鑑別結合相同表位或重疊表位之抗體或抗原結合片段。該等方法易於為熟習此項技術者所習知，且更詳細闡述於本文中。 本發明擴展至與本文所定義之任一抗體或抗原結合片段(例如表3及4中所列示之任一抗體，例如以IgG2、IgG1或IgG1三重突變(「TM」；Oganesyan等人(2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4)形式)競爭結合至人類Aβ1-42之抗體或抗原結合片段。可容易地在活體外(例如)藉由將特定報告基因分子加標籤至一種可在一或多種其他未加標籤抗體或抗原結合片段存在下檢測之抗體或抗原結合片段來分析抗體或抗原結合片段之間之競爭，從而使得能夠鑑別結合相同表位或重疊表位之抗體或抗原結合片段。可(例如)使用ELISA來測定競爭，其中將Aβ1-42固定至板上且向板中添加第一加標籤或經標記抗體或抗原結合片段以及一或多種其他未加標籤或未標記抗體或抗原結合片段。藉由由加標籤抗體或抗原結合片段發射之信號之降低來觀察與加標籤抗體或抗原結合片段競爭之未加標籤抗體或抗原結合片段的存在。 競爭分析亦可用於表位定位中。在一種情況下，可使用表位定位來鑑別由視情況可具有最佳化中和及/或調節特性之抗體或抗原結合片段結合之表位。此一表位可為線性或構象表位。構象表位可包括至少兩個Aβ之不同片段，其中在Aβ肽以其三級或四級結構摺疊時，該等片段彼此靠近定位以形成由Aβ抑制劑(例如Aβ -抗體或抗原結合片段)識別之構象表位。在測試競爭時，可採用抗原之肽片段，尤其係包含所關注表位或基本上由其組成之肽。可使用在任一端具有表位序列加上一或多個胺基酸之肽。本發明之抗體或抗原結合片段可使得其抗原結合由含有或包含給定序列之肽抑制。 如本文中所使用，術語「經分離」係指本發明之抗體或抗原結合片段或編碼該等抗體或抗原結合片段之核酸根據本發明通常所處之狀態。因此，可提供本發明之經分離及/或純化之抗體或抗原結合片段、VH及/或VL域及編碼核酸分子及載體，例如自其天然環境以實質上純或均質形式或在核酸情形下不含或實質上不含除編碼具有所需功能之多肽之序列外之源核酸或基因。經分離成員及經分離核酸不含或實質上不含與其天然締合之材料，例如其他與其一起發現於天然環境或其製備環境(例如細胞培養物，在藉由重組DNA技術在活體外或在活體內實踐該製備時)中之多肽或核酸。可使用稀釋劑或佐劑調配成員及核酸且亦出於實踐目的進行分離-舉例而言，通常將成員與明膠或其他載劑混合(若用於塗覆用於免疫分析中之微量滴定板)，或與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑混合(在用於診斷或療法中時)。可天然地或藉由異源真核細胞(例如CHO或NS0 (ECACC 85110503)細胞)系統對抗體或抗原結合片段實施醣基化，或其可(例如在藉由表現於原核細胞中而產生時)未醣基化。 4.
核酸、細胞及產生方法
在其他態樣中，本發明提供經分離核酸，其包括編碼本發明之抗體或抗原結合片段、VH域及/或VL域之序列；及製備本發明之抗體或抗原結合片段、VH域及/或VL域之方法，其包括在使得產生該抗體或抗原結合片段、VH域及/或VL域之條件下表現該核酸，及將其回收。編碼核酸序列之實例陳述於各表及隨附序列表中。本發明核酸序列可包括DNA或RNA且可完全或部分地係合成序列。除非上下文另外需要，否則所提及如本文所陳述之核苷酸序列涵蓋具有指定序列之DNA分子，且涵蓋具有指定序列之RNA分子(其中使用U代替T)。 本發明亦提供呈質體、載體(例如質體或噬菌體載體)、轉錄或表現盒(其包括至少一種(例如)可操作地連接至調控元件之上述多核苷酸)之形式之構築體。 另一態樣提供含有本發明之核酸及/或載體或使用其轉變之宿主細胞。本發明亦提供包括一或多種上述構築體之重組宿主細胞系。編碼所提供任一CDR或CDR組或VH域或VL域或抗體抗原結合位點或抗體分子(例如scFv或IgG (例如IgG2、IgG1或IgG1TM))之核酸序列以及產生編碼產物之方法(該方法包括自其編碼核酸序列進行表現)形成本發明之一態樣。可便利地藉由在適當條件下培養含有核酸之重組宿主細胞來達成表現。在藉由表現產生後，可分離VH或VL域或抗體或抗原結合片段及/或使用任一適宜技術純化，然後視需要使用。 因此，本發明之另一態樣係產生抗體VH可變域之方法，該方法包含自編碼核酸序列引起表現。此一方法可包括在產生該抗體VH可變域之條件下培養宿主細胞。 提供產生VL可變域及包括VH及/或VL域之抗體或抗原結合片段之類似方法作為本發明之其他態樣。 產生方法可包括分離及/或純化產物之步驟。產生方法可包括將產物調配成包含至少一種其他組份(例如醫藥上可接受之賦形劑)之組合物。 用於在各種不同宿主細胞中選殖及表現多肽之系統已眾所周知。適宜宿主細胞包含細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母及桿狀病毒系統及轉基因植物及動物。業內已充分確立抗體及抗體片段在原核細胞中之表現。綜述可例如參見Plückthun [Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]。常用細菌宿主係大腸桿菌(
E. coli
)。 熟習此項技術者亦可利用培養物中真核細胞中之表現作為用於產生抗體或抗原結合片段之選擇[Chadd HE及Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194；Andersen DC及Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117；Larrick JW及Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418]。 業內可用於表現異源多肽之哺乳動物細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎細胞、NS0小鼠黑素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人類胚胎腎細胞、人類胚胎視網膜細胞及許多其他細胞系。 可選擇或構築視需要含有適當調控序列(包含啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及其他序列)之適宜載體。載體可視需要為質體(例如噬粒)或病毒載體(例如'噬菌體) [Sambrook及Russell,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual
：第3版，2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]。許多用於操縱核酸(例如在製備核酸構築體、誘變、測序、將DNA引入細胞中及基因表現及分析蛋白質時)之已知技術及方案詳細闡述於Ausubel等人[Ausubel等人編輯，
Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons，第4版，1999]中。 本發明之另一態樣提供含有如本文所揭示之核酸之宿主細胞。此一宿主細胞可為活體外細胞且可位於培養物中。此一宿主細胞可為活體內細胞。宿主細胞之活體內存在可容許將本發明之抗體或抗原結合片段細胞內表現為「內抗體」或細胞內抗體。內抗體可用於基因療法。 另一態樣提供包括將本發明核酸引入宿主細胞中之方法。引入可採用任一可用技術。對於真核細胞而言，適宜技術可包含鈣磷酸鹽轉染、DEAE-右旋糖酐轉染、電穿孔、脂質體調介之轉染及使用逆轉錄病毒或其他病毒(例如牛痘(Vaccinia))或(對於昆蟲細胞而言)桿狀病毒(Baculovirus)之轉導。核酸中宿主細胞、尤其真核細胞中之引入可使用病毒或基於質體之系統。質體系統可以游離方式維持或可納入宿主細胞或人工染色體中。納入可藉由在單一或多個基因座處隨機或靶向整合一或多個拷貝來進行。對於細菌細胞而言，適宜技術可包含氯化鈣轉變、電穿孔及使用噬菌體之轉染。 在引入後可(例如)藉由在用於表現基因之條件下培養宿主細胞來引起或容許自核酸之表現。可藉由熟習此項技術者已知之方法來純化表現產物。 可將本發明核酸整合至宿主細胞之基因體(例如染色體)中。根據標準技術，可藉由納入促進基因體重組之序列來促進整合。 本發明亦提供包括在表現系統中使用如上文所陳述之構築體以表現上述抗體或抗原結合片段或多肽之方法。 5.
治療方法
本發明提供使用本文所揭示任一分子之任一組合治療患有疾病或病症之個體之方法。在一些實施例中，本發明提供使用以下部分治療患有疾病或病症之個體之方法：a)本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段，及b)本文所揭示之任一BACE抑制劑。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包括： VH CDR1，其具有SEQ ID NO: 525之胺基酸序列； VH CDR2，其具有SEQ ID NO: 526之胺基酸序列； VH CDR3，其具有SEQ ID NO: 527之胺基酸序列； VL CDR1，其具有SEQ ID NO: 534之胺基酸序列； VL CDR2，其具有SEQ ID NO: 535之胺基酸序列；及 VL CDR3，其具有SEQ ID NO: 536之胺基酸序列。在一些實施例中，BACE抑制劑係
或其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，BACE抑制劑係
之樟腦磺酸鹽。在一些實施例中，BACE抑制劑係
。 對於本文所闡述之任一方法而言，本發明涵蓋一種方法之任一步驟或多個步驟與來自另一方法之任一步驟或多個步驟之組合。該等方法涉及向有需要之個體投與有效量之適用於特定疾病或病症之本發明的任一化合物。在具體實施例中，該等方法涉及向有需要之個體遞送本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑的組合。 在一些實施例中，疾病或病症係任一與Aβ累積有關之疾病或病症。在一些實施例中，Aβ累積係Aβ之腦及/或海馬體累積。在一些實施例中，Aβ累積係神經元內累積。在一些實施例中，Aβ累積係細胞外累積。在一些實施例中，Aβ累積位於內皮細胞中。在一些實施例中，Aβ累積位於視網膜中。在一些實施例中，Aβ累積位於腦血管中。在一些實施例中，本文所揭示之任一治療方法可用於預防、減小或逆轉(例如清除) Aβ累積。 在一些實施例中，疾病或病症係神經退化性疾病或病症。在特定實施例中，疾病或病症係阿茲海默氏病、唐氏症候群、黃斑退化或認知損害。在一些實施例中，個體係哺乳動物。在特定實施例中，個體係人類。 在一些實施例中，向個體投與治療有效劑量之本文所揭示之任一BACE抑制劑與治療有效劑量之本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段的組合。術語「治療有效劑量」或「治療有效量」意指針對投與者產生期望效應之劑量或量。精確劑量取決於治療目的，且可由熟習此項技術者使用已知技術來確定(例如參見Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。 本發明尤其係關於在生成患者中之有益治療反應(例如減少CSF中之Aβ1-42、減小斑塊負荷、抑制斑塊形成、減小神經炎營養不良、改良認知功能及/或逆轉、減小或預防認知衰退)之條件下向患者藉由投與本發明之治療抗體來治療患者之阿茲海默氏病及其他類澱粉蛋白生成疾病(例如預防或治療類澱粉蛋白生成疾病)。 術語「治療(treatment、treating)」、「緩解」及諸如此類在本文中通常用於意指獲得期望藥理學及/或生理學效應，且亦可用於係指改良、緩解所治療病狀之一或多種症狀及/或降低其嚴重程度。效應可預防性(就完全或部分地延遲疾病、病狀或其症狀之發作或復發而言)，及/或可為治療性(就部分地或完全治癒疾病或病狀及/或可歸因於該疾病或病狀之不良效應而言)。本文所用之「治療」涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病或病狀之任一治療，且包含以下中之任一者或多者：(a)預防疾病或病狀發生於可易患疾病或病狀但尚未診斷為患有該疾病或病狀之個體中；(b)抑制疾病或病狀(例如阻止其發生)；或(c)減輕疾病或病狀(例如使得疾病或病狀消退，提供一或多種症狀之改良)。舉例而言，阿茲海默氏病之「治療」涵蓋該疾病之完全逆轉或治癒或可歸因於阿茲海默氏病之病狀及/或不良效應的任一範圍改良。僅闡釋而言，阿茲海默氏病之「治療」包含改良與阿茲海默氏病有關之下列效應中之任一者或其組合：精神衰退、精神錯亂、妄想、定向障礙、健忘、精力難以集中、不能產生新記憶、攻擊、焦慮、易怒、個性變化、缺乏克制、憤怒、情感淡漠、普遍不滿、孤獨、情緒波動、抑鬱、幻覺、偏狂、食慾不振、煩亂不安、不能組合肌肉移動、言語混亂、突觸損害、神經元損失、類澱粉β累積、τ過磷酸化、τ蛋白累積、類澱粉斑塊形成及神經原纖維纏結形成。可易於根據業內已知之標準方法及技術來評價該等病狀中之任一者之改良。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)之有效性。藉由疾病方法治療之個體群體包含患有不期望病狀或疾病之個體以及處於發生病狀或疾病風險下之個體。 在一些實施例中，本文所揭示之治療可預防Aβ n-42物質在腦中之生成及/或累積。在一些實施例中，Aβ n-42物質係Aβ1-42、Aβ焦3-焦-42、Aβ 4-42或Aβ11-焦-42中之一或多者。在一些實施例中，本文所揭示之治療可預防Aβ1-43累積。在一些實施例中，本文所揭示之治療可預防Aβ寡聚物及/或斑塊之生成及/或累積。 本發明提供預防或治療與患者腦中之Aβ類澱粉沈積有關之疾病之方法。該等疾病包含阿茲海默氏病、唐氏症候群及認知損害。認知損害可在具有或不具有類澱粉蛋白生成疾病之其他特性下發生。本發明提供治療黃斑退化(與Aβ有關之病狀)之方法。本發明方法可涉及向患者投與有效劑量之特異性結合至1-42 Aβ及其N-末端截短物之抗體與本文所揭示之任一BACE抑制劑的組合。 本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段可與本文所揭示之任一BACE抑制劑組合用於治療方案中以預防或改善神經病變及(在一些患者中)與阿茲海默氏病有關之認知損害。 適於治療之患者包含展示症狀之患者亦及處於疾病風險下但尚未展示症狀之個體。對於阿茲海默氏病而言，生活足夠長時間之任一者皆具有潛在風險。本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段可與本文所揭示之任一BACE抑制劑組合使用且預防性投與並未對個體患者之風險進行任何評價之個體。適於治療之患者包含具有阿茲海默氏病之已知基因風險之個體，例如與此疾病具有血親之個體及藉由分析基因或生物化學標記物來測定風險者。阿茲海默氏病傾向之基因標記物包含APP基因突變、尤其在位置717及位置670及671之突變(分別稱為Hardy及Swedish突變)。其他風險標記物係早老素基因PS1及PS2及ApoE4之突變、AD家族史、高膽固醇血症或動脈粥樣硬化。可藉由與阿茲海默氏病有關之特徵性癡呆以及藉由上述風險因子之存在來診斷患有該疾病之個體。可利用諸多診斷測試來鑑別個體之阿茲海默氏病。該等方式包含量測CSFτ及Aβ1-42濃度。升高之τ及降低之Aβ1-42濃度可預示AD之存在。亦可藉由NINCDS-ADRDA或DSM-IV-TR準則來診斷患有阿茲海默氏病之個體。在一些實施例中，擬治療阿茲海默氏病係輕度(早期)、中等(中期)或嚴重(晚期)阿茲海默氏病。 在無症狀患者中，治療可始於任一年齡(例如至少10、20、30歲年齡)。通常，在晚年生命(例如在患者達到其40多歲、50多歲、60多歲或70多歲時)開始治療。治療可涉及在一定時間段(其可為患者餘生之持續時間)內之多個劑量。可藉由量測隨時間之抗體濃度來監測投與重複劑量之需要。因阿茲海默氏病可在唐氏症候群患者中具有早期發作，故與在非唐氏症候群患者中相比，可在生命早期(例如在患者至少為10、20、30歲年齡時)開始投與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合。 對於預防而言，以足以消除或減小風險、減弱嚴重程度或延遲疾病(包含疾病之生物化學、組織學、認知損害及/或行為症狀、其併發症及在發生疾病期間呈現之中間病理學表型)之發作之量將醫藥組合物或藥劑投與易患阿茲海默氏病或另外處於阿茲海默氏病風險下之患者。對於治療應用而言，以足以治癒或至少部分地阻止疾病症狀(生物化學、組織學、認知損害及/或行為症狀，包含其併發症及在發生疾病時之中間病理學表型)之量將組合物或藥劑投與懷疑或已經患有此一疾病之患者。 治療方法可包括(i)鑑別患有如本文所提及與類澱粉變性有關之病狀之患者，及(ii)投與治療有效劑量之本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與治療有效劑量之本文所揭示之任一BACE抑制劑的組合，其中血漿及/或CSF中之Aβ1-42濃度有所降低，且類澱粉變性得以減小。 因此，本發明之其他態樣提供治療方法，其包括投與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合、包括僅本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段或其與本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合之醫藥組合物、包括僅本文所揭示之任一BACE抑制劑或其與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之組合之醫藥組合物；及此一抗體或抗原結合片段及/或BACE抑制劑之用途，其用以製造用於投與之藥劑，例如在製備藥劑或醫藥組合物之方法(包括調配抗體或抗原結合片段及/或BACE抑制劑與醫藥上可接受之賦形劑)中。醫藥上可接受之賦形劑可如下化合物或化合物組合：其進入醫藥組合物中，不激起二級反應且使得(例如)促進抗體或抗原結合片段之投與、增加其壽命及/或其在身體中之效能、增加其在溶液中之溶解性或另外改良其保存。該等醫藥上可接受之媒劑已眾所周知且由熟習此項技術者根據所選活性化合物之性質及投與模式來加以調適。 通常以醫藥組合物形式來投與如本文所闡述之抗體或抗原結合片段，該形式可除抗體或抗原結合片段外亦包括至少一種組份。因此，除抗體或抗原結合片段外，根據本發明且用於本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知之其他材料。該等材料應無毒且應不干擾活性成份之效能。載劑或其他材料之精確性質取決於投與途徑。 通常以醫藥組合物形式來投與如本文所闡述之BACE抑制劑，該形式除抗體或抗原結合片段外亦可包括至少一種組份。因此，除抗體或抗原結合片段外，根據本發明且用於本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知之其他材料。該等材料應無毒且應不干擾活性成份之效能。載劑或其他材料之精確性質取決於投與途徑。 在一些實施例中，藉助下列投與途徑中之任一者或多者將本文所揭示之任一BACE抑制劑及/或任一抗體或其抗原結合片段投與個體：非經腸、真皮內、肌內、腹膜腔內、心肌內、靜脈內、皮下、肺、鼻內、眼內、硬膜外、鞘內、顱內、心室內及口服途徑。 在一些實施例中，將本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑以同一組合物投與。在一些實施例中，將本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與包括本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合物以分開組合物投與。在一些實施例中，若將包括本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之組合物與包括本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合物分開投與，則藉由相同投與途徑將該等組合物投與個體。在一些實施例中，藉由不同投與途徑將組合物投與個體。在一些實施例中，經由注射將包括本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之組合物投與個體。在一些實施例中，注射係靜脈內注射。在一些實施例中，注射係皮下注射。在一些實施例中，將包括本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合物經口投與個體。 在一些實施例中，在與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段組合投與個體時，本文所揭示之任一BACE抑制劑之醫藥有效劑量小於BACE抑制劑在單獨投與時之醫藥有效劑量。在一些實施例中，在與本文所揭示之任一BACE抑制劑組合投與個體時，本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之醫藥有效劑量小於抗體或抗原結合片段在單獨投與時之醫藥有效劑量。 對於可注射調配物而言(例如對於靜脈內或皮下注射而言)，活性成份將呈非經腸可接受水溶液形式，該水溶液無熱原且具有適宜pH、等滲性及穩定性。端視分子之物理化學性質及遞送途徑，如本文所闡述之抗體或抗原結合片段可調配成液體、半固體或固體形式。調配物可包含賦形劑或賦形劑組合，例如：糖、胺基酸及表面活性劑。液體調配物可包含多種抗體濃度及pH。可藉由(例如)凍乾、噴霧乾燥或藉由超臨界流體技術乾燥來產生固體調配物。可藉由注射(例如經皮下或經靜脈內)給予治療。可藉由脈衝輸注、尤其使用降低劑量之抗體或抗原結合片段來投與治療。可根據治療之物理化學特性、疾病特殊考慮或最佳化效能或最小化副效應之需求來確定投與途徑。一種特定投與途徑係靜脈內途徑。另一投與本發明醫藥組合物之途徑係皮下途徑。使用無針器件之皮下注射亦係有利的。在一些實施例中，藉助注射將本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段投與個體。 本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段及本文所揭示之任一BACE抑制劑可同時或依序投與個體。在一些實施例中，將本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段/BACE抑制劑組合療法進一步與其他治療進行組合。 在一些實施例中，本發明之任一抗體或抗原結合片段及本發明之任一BACE抑制劑可用於製造藥劑。藥劑可分開或組合投與個體，且因此可包括呈組合製劑或分開製劑形式之抗體或抗原結合片段及BACE抑制劑。分開製劑可用於促進分開及依序或同時投與，且容許藉由不同途徑(例如口服及可注射(例如靜脈內及/或皮下)投與)來投與組份。 在一些實施例中，可將本文所揭示之任一組合療法(例如涉及投與本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段與本文所揭示之任一BACE抑制劑之組合之任一療法)與其他療法組合投與個體。在一些實施例中，其他療法包含(但不限於)記憶訓練練習、記憶輔助器、認知訓練、飲食療法、職能療法、物理療法、精神病學療法、按摩、針刺、針灸、運動輔助器、動物輔助及諸如此類。在一些實施例中，其他療法係向個體投與其他醫藥組份。在一些實施例中，可使用其他醫藥組份來提供顯著協同效應，尤其係抗體或抗原結合片段與一或多種其他藥物之組合。在一些實施例中，將其他醫藥組份與本文所揭示之任一BACE抑制劑及/或本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段同時或依序或作為組合製劑來投與以用於治療本文所列示之一或多種病狀。在一些實施例中，其他醫藥組份係小分子、多肽、抗體、反義寡核苷酸及/或siRNA分子。在一些實施例中，其他醫藥組份係以下中之任一者或多者：多奈派齊(donepezil) (Aricept)、加蘭他敏(glantamine) (Razadyne)、美金剛(memantine) (Namenda)、利凡斯的明(rivastigmine) (Exelon)或塔克寧(tacrine) (Cognex)。在一些實施例中，其他醫藥組份係抗抑鬱劑、抗焦慮劑、抗精神病劑或安眠藥。在一些實施例中，本發明之任一抗體或抗原結合片段及上述其他醫藥組份中之一或多者可用於製造藥劑。藥劑可分開或組合投與個體，且因此可包括呈組合製劑或分開製劑形式之抗體或抗原結合片段及其他組份。分開製劑可用於促進分開及依序或同時投與，且容許藉由不同途徑(例如口服、靜脈內及非經腸投與)來投與組份。 在一些實施例中，本發明之任一BACE抑制劑及上述其他醫藥組份中之一或多者可用於製造藥劑。藥劑可分開或組合投與個體，且因此可包括呈組合製劑或分開製劑形式之BACE抑制劑及其他組份。分開製劑可用於促進分開及依序或同時投與，且容許藉由不同途徑(例如口服及非經腸投與)來投與組份。 在一些實施例中，本發明之任一抗體或抗原結合片段及上述其他醫藥組份中之一或多者可用於製造藥劑。藥劑可分開或組合投與個體，且因此可包括呈組合製劑或分開製劑形式之抗體或抗原結合片段及其他組份。分開製劑可用於促進分開及依序或同時投與，且容許藉由不同途徑(例如口服及非經腸投與)來投與組份。 可將所提供組合物投與哺乳動物。投與通常係以治療有效量進行，此足以向患者展示益處。該益處可至少改善至少一種症狀。實際投與量及投與速率及時程將取決於所治療之性質及嚴重程度、所治療特定哺乳動物、個體患者之臨床病狀、病症病因、組合物遞送位點、抗體或抗原結合片段及/或BACE抑制劑之類型、投與方法、投與時間安排及開業醫師已知之其他因素。治療處方(例如劑量決定等)係由全科從業者及其他醫師負責且可取決於症狀嚴重程度及/或所治療疾病之進展。可藉由比較活體外活性及動物模型中之活體內活性來測定本發明之抗體或抗原結合片段及/或本發明BACE抑制劑之治療有效量或適宜劑量。已知將測試動物中之有效劑量外推至人類之方法。可在開始時投與較高載量劑量，隨後投與一或多個較低劑量。可在醫師之判斷下以每天、每週兩次、每週或每月之間隔來重複治療。可每2至4週(對於皮下投與)及每4至8週(對於靜脈內投與)來進行治療。治療可為週期性，且投與之間之時段為約兩週或更長(例如約三週或更長、約4週或更長或約每月一次)。 熟習此項技術者根據本發明將明瞭本發明之各個其他態樣及實施例。 出於所有目的，本說明書中所提及之所有文件(包含資料庫參考及登錄號、專利、專利申請案及公開案)之全部內容皆以引用方式併入本文中。 除非上下文另外指示，否則上述特徵之說明及定義並不限於本發明之任一特定態樣或實施例且同樣應用於所闡述之所有態樣及實施例。 現將藉由實例方式且參照附圖及表來闡釋本發明之某些態樣及實施例。 6.
套組
在一些實施例中，本發明提供一種套組，其包括本文所揭示之任一BACE抑制劑及本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，BACE抑制劑位於適於經口投與之組合物中。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段位於適於靜脈內或皮下投與之組合物中。
實例
使用NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA. Scotland, UK來寄存下列序列： 大腸桿菌TOP10細胞Abet0007 = NCIMB 41889 大腸桿菌TOP10細胞Abet0380-GL = NCIMB 41890 大腸桿菌TOP10細胞Abet0144-GL = NCIMB 41891 大腸桿菌TOP10細胞Abet0377-GL = NCIMB 41892 寄存日期= 2011年11月02日
實例 1. 經由使包含側接微調殘基之所有 6 個 CDR 突變來最佳化 Abet0144-GL 抗體
下文闡述來自特定抗Aβ抗體親代純系Abet0144-GL之新抗Aβ抗體之最佳化及表徵。
1.1 Abet0144-GL 親代純系至與核糖體展示相容之 scFv 形式之轉化
將親代純系在製備中自IgG1-TM形式轉化成單鏈可變片段(scFv)形式以用於親和力最佳化。單獨擴增密碼子最佳化之可變重鏈(V
H
)及可變輕鏈(V
L
)域以及其各別IgG載體且添加特異性選殖位點及撓性連接體區。然後實施重組PCR以生成完整scFv構築體，將該構築體選殖至含有核糖體展示所需之結構特徵之經修飾pUC載體(pUC-RD)中。該等特徵包含5’及3’莖環(用以防止mRNA轉錄物由外核酸酶降解)、Shine-Dalgarno序列(用以促進核糖體至mRNA轉錄物之結合)及geneIII間隔體(容許經轉譯scFv分子摺疊同時仍保持附接至核糖體) (Groves等人，2005)。
1.2 藉由靶向誘變來最佳化 Abet0144-GL
使用靶向誘變方式利用基於親和力之核糖體展示選擇來進一步最佳化主要抗體(Abet0144-GL)以改良對人類類澱粉β 1-42肽之親和力。藉由使用如由Clackson及Lowman (Clackson等人，2004)所闡述之標準分子生物學技術實施所有6個可變重(V
H
)鏈及可變輕(V
L
)鏈互補決定區(CDR)之藉寡核苷酸定向誘變來產生衍生自Abet0144-GL之大scFv核糖體文庫。將來自每一CDR之突變序列親和力最佳化為單獨文庫。亦使用靶向誘變將位於V
H
CDR1前面之5個微調殘基(Kabat殘基26-30)隨機化且組合該等序列並使用剩餘V
H
CDR1文庫使其成熟。對所有文庫實施基於親和力之核糖體展示選擇以富集對人類類澱粉β 1-42肽具有較高親和力之變體。基本上如先前所闡述實施選擇(Hanes等人，2000)。 簡而言之，將Abet0144-GL主要純系之6個靶向誘變文庫(一個文庫涵蓋每一CDR)單獨轉錄至mRNA中。使用受阻轉譯製程，形成mRNA-核糖體-scFv三元複合物(Hanes等人，1997)。然後對該等複合物實施4輪選擇(在降低濃度之合成生物素化人類類澱粉β 1-42肽(Bachem, Germany；cat: H-5642) (100 nM至10 nM)存在下培育)以選擇對人類類澱粉β 1-42肽具有較高親和力之變體。然後將彼等結合至抗原之複合物捕獲於經鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)塗覆之順磁性珠粒(Dynabeads™, Invitrogen, UK；cat: 112-05D)且洗滌掉非特異性核糖體複合物。隨後自結合核糖體複合物分離mRNA，逆轉錄至cDNA且然後藉由PCR擴增。將此DNA用於下一輪選擇中。 在4輪親和力成熟之後，選殖出每一選擇輸出以用於篩選目的。藉由以下方式將藉由核糖體展示分離之ScFv選殖至噬粒載體pCANTAB6中：對核糖體展示構築體實施
Not
I/
Nco
I其餘限制性內核酸酶消解(New England BioLabs, USA；cat: R0189L, R0193L)，隨後基本上如由McCafferty等人(McCafferty等人，1994)所闡述使用T4 DNA連接酶連接至
Not
I/
Nco
I消解之pCANTAB6 (New England BioLabs, USA；cat: M0202L)。
1.3 使用表位競爭分析鑑別經改良純系
將自1.2部分中所闡述靶向誘變方式之第3及4輪選擇隨機選擇之2024個scFv表現於細菌中以產生未純化周質scFv。在競爭形式分析中使用HTRF™平臺來闡釋彼等能夠經由與Abet0144-GL IgG1-TM相同之表位結合合成人類類澱粉β 1-42肽之scFv。具體而言，在單一濃度之每一未純化周質測試scFv存在下於鏈黴抗生物素蛋白穴狀化合物(與生物素化類澱粉β 1-42肽締合)及抗人類Fc XL665 (與Abet0144-GL IgG1-TM締合)之間量測螢光共振能量轉移(FRET)。肽上之Abet0144-GL IgG1-TM表位由scFv成功佔用導致FRET減小，如在螢光讀板儀上所量測。 藉由分析在不存在競爭劑肽下Abet0144-GL IgG1-TM至合成人類類澱粉β 1-42肽之結合來測定「總」結合信號。藉由分析在測試scFv試樣存在下Abet0144-GL IgG1-TM至合成人類類澱粉β 1-42肽之結合來導出「試樣」信號。最後，藉由分析藉由檢測試劑混合劑單獨調介之螢光來測定「穴狀化合物空白」信號。 將未純化周質scFv供應至由50 mM pH 7.4 MOPS、0.5 mM EDTA及0.5 M蔗糖組成之試樣緩衝液中。為進行描述，將scFv試樣稀釋於384孔V形底板中之分析緩衝液(由50 mM pH 7.4 MOPS、0.4 M氟化鉀、0.1%無脂肪酸牛血清白蛋白及0.1% Tween 20 (v/v)組成)中直至原始儲備液濃度之50%。使用液體處置機器人將5 µl每一新稀釋scFv轉移至黑色、淺、實底、非結合384孔分析板之「試樣」孔中。藉由多通道移液管以下列順序將剩餘試劑(在分析緩衝液中製得)添加至分析板中：5 µl試樣緩衝液(添加至「總」及「穴狀化合物空白」孔中)、10 µl分析緩衝液(添加至「穴狀化合物空白」孔中)、5 µl 2 nM Abet0144-GL IgG1-TM (添加至「試樣」及「總」孔中)、5 µl 5 nM生物素化人類類澱粉β 1-42肽(添加至「試樣」及「總」孔中)及5 µl由6 nM鏈黴抗生物素蛋白穴狀化合物及60 nM抗His6-XL665組成之檢測混合劑(添加至所有孔中)。密封分析板且然後在室溫下於暗處培育3小時，然後在620及665 nm發射波長下於螢光讀板儀上量測時間解析螢光。 藉由計算每一試樣之δF %值來分析數據。根據方程式1來測定δF %。 方程式1：
隨後使用δF值計算正規化結合值，如方程式2中所闡述。 方程式2：
對顯示顯著抑制Abet0144-GL IgG1-TM至類澱粉β 1-42肽之結合之未純化周質scFv實施DNA測序(Osbourn等人，1996；Vaughan等人，1996)。將發現具有獨特蛋白質序列之scFv表現於大腸桿菌中且藉由親和力層析進行純化，隨後實施緩衝液交換。 藉由在上述表位競爭分析中測試scFv稀釋液系列(通常4 pM - 1200 nM)來測定每一純化scFv之功效。同樣，藉由計算每一試樣之δF %及總結合%值來分析數據。另外，亦如方程式3中所闡述來計算每一濃度之經純化scFv之抑制%值： 方程式3： 抑制% = 100 -總結合% 使用科學繪圖軟體將ScFv試樣濃度針對抑制%繪圖，且使用非線性回歸曲線擬合任一濃度依賴性反應。使用界定至值-1之希爾斜率(Hill-slope)自該等分析獲得IC
50
值。來自此輪選擇之最強力純系Abet0286具有1.8 nM之IC
50
且來自V
L
CDR1靶向誘變文庫。 試劑/設備來源：MOPS (Sigma, UK；cat: M9381)、氟化鉀(BDH chemicals, USA；cat: A6003)、無脂肪酸牛血清白蛋白(Sigma, UK；cat: A6003)、Tween 20 (Sigma, UK；cat: P2287)、Abet0144-GL IgG1-TM (內部產生)、生物素化人類類澱粉β 1-42肽(rpeptide, USA；cat: A1117)、鏈黴抗生物素蛋白穴狀化合物(Cisbio, France；cat: 610SAKLB)、抗His6-XL665 (Cisbio, France；cat: 61HISXLB)、384孔分析板(Corning, Costar Life Sciences；cat: 3676)、384孔稀釋板(Greiner BioOne, Germany；cat: 781280)、液體處置機器人(MiniTrak™, Perkin Elmer, USA)、螢光讀板儀(Envision™, Perkin Elmer, USA)、HTRF技術(Cisbio International, France)、繪圖/統計學軟體(Prism, Graphpad USA)。
1.4 重組成功選擇輸出以產生 「 二元 」 文庫且隨後對其實施親和力最佳化
使用1.3部分中所闡述之表位競爭分析來判斷特定scFv-核糖體文庫是否在前4輪選擇中親和力成熟。兩個文庫V
H
CDR3及V
L
CDR2靶向誘變文庫已展示較親代Abet0144-GL純系並無改良 且並不進一步進行試驗。 剩餘4個靶向誘變文庫(涵蓋V
H
CDR1、V
H
CDR2、V
L
CDR1及V
L
CDR3)已展示親和力改良且以成對方式進行重組以產生6個「二元」重組文庫(其中6個CDR中之兩者發生突變)。舉例而言，使涵蓋V
H
CDR1之親和力成熟文庫與親和力成熟V
H
CDR2文庫隨機重組以生成V
H
1:V
H
2文庫。剩餘文庫產生為：V
H
1:V
L
1、V
H
1:V
L
3、V
H
2:V
L
1、V
H
2:V
L
3及V
L
1:V
L
3。如先前所闡述(1.2部分)來選殖出每一重組文庫之子組且發送用於測序以驗證每一文庫之完整性。 然後如先前所闡述(1.2部分)在降低濃度之生物素化合成人類類澱粉β 1-42肽(在第5及6輪分別為5 nM及2 nM)存在下繼續選擇。如上所述，選殖出每一選擇輸出以用於篩選目的(1.2部分)。 如1.3部分中所闡述在表位競爭分析中篩選1936個隨機選自第5及6輪選擇之scFv。因該等純系之功效有所增加，故在添加至析板中之前首先將未純化scFv稀釋至25%。如前所述，將展示顯著抑制性質之純系發送用於DNA測序，且產生獨特純系並如經純化scFv (1.3部分)進行分析。來自該等選擇之最強力純系Abet0303具有0.84 nM之功效且來自V
H
1:V
H
2重組文庫。
1.5 重組二元選擇輸出以產生「三元」文庫且隨後對其實施親和力最佳化
使用1.3部分中所闡述之表位競爭分析來判斷每一二元文庫是否在前兩輪選擇(5及6)中親和力成熟。所有文庫皆展示親和力改良，且由此可考慮用於進一步親和力成熟。 將6個二元文庫(1.4部分)與第4輪成功輸出(1.2部分)以成對方式重組以形成4個「三元」重組文庫(其中6個CDR中之三者發生突變)。舉例而言，將V
H
2:V
L
3二元文庫(第6輪輸出)與V
H
CDR1靶向誘變文庫(第4輪輸出)重組以生成V
H
1:V
H
2:V
L
3文庫。亦藉由組合V
H
1:V
H
2二元文庫(第6輪輸出)與V
L
CDR3靶向誘變文庫(第4輪輸出)來產生類似構築體。彙集該兩個個別文庫以產生V
H
1:V
H
2:V
L
3三元文庫。 應注意不能破壞共最佳化之CDR之間之協同作用。舉例而言，不能使V
H
1:V
L
3二元文庫與V
H
CDR2靶向誘變文庫重組，此乃因此操縱會破壞共最佳化之V
H
CDR1及V
L
CDR3序列之間之協同作用。在表1中給出所有三元文庫及其來源之完整列表。如先前所闡述(1.2部分)選殖出每一重組文庫之子組且發送用於測序以驗證每一文庫之完整性。
表 1 ：
在第二先導最佳化活動之第7及8輪期間成熟之4個三元文庫之闡述。每一文庫包括兩個自第6輪輸出二元文庫及第4輪輸出靶向誘變文庫之隨機成對重組生成之組成文庫。 然後如先前所闡述(1.2部分)在降低濃度之生物素化合成人類類澱粉β 1-42肽(在第7及8輪分別為500 pM及200 pM)存在下繼續選擇。如上所述，選殖出每一選擇輸出以用於篩選目的(1.2部分)。 如1.3部分中所闡述在表位競爭分析中篩選1408個隨機選自第7及8輪選擇之scFv。對於「二元」篩選二元，在添加至分析板中之前首先將未純化scFv稀釋至25%。如前所述，將展示顯著抑制性質之純系發送用於DNA測序，且產生獨特純系並如經純化scFv (1.3部分)進行分析。來自該等選擇之最強力純系Abet0343具有0.48 nM之功效且來自V
H
1:V
H
2:V
L
3重組文庫。
3.6 重組三元選擇輸出以產生「四元」文庫且隨後對其實施親和力最佳化
使用1.3部分中所闡述之表位競爭分析來判斷每一三元文庫是否在前兩輪選擇(7及8)中親和力成熟。所有文庫皆展示親和力改良，且由此可考慮用於進一步親和力成熟。 將V
H
1:V
H
2:V
L
1三元文庫(第8輪輸出)與V
L
CDR3靶向誘變文庫(第4輪輸出)重組且將V
H
2:V
L
1:V
L
3三元文庫(第8輪輸出)與V
H
CDR1靶向誘變文庫(第4輪輸出)重組。單獨地，將V
H
1:V
H
2二元文庫(第6輪輸出)與V
L
1:V
L
3二元文庫(第6輪輸出)重組。然後彙集該三個個別文庫以產生單一「四元」文庫V
H
1:V
H
2:V
L
1:V
L
3 (其中6個CDR中之4者發生突變)。 應注意不能破壞共最佳化之CDR之間之協同作用。舉例而言，不能使V
H
1:V
L
2:V
L
3三元文庫與V
L
CDR1靶向誘變文庫重組，此乃因此操縱會破壞共最佳化之V
H
CDR1/V
H
CDR2及V
L
CDR3序列之間之協同作用。如先前所闡述(1.2部分)來選殖出每一重組文庫之子組且發送用於測序以驗證每一文庫之完整性。 然後如先前所闡述(1.2部分)在降低濃度之生物素化合成人類類澱粉β 1-42肽(在第9至11輪為50 pM至10 pM)存在下繼續選擇。如上所述，選殖出每一選擇輸出以用於篩選目的(1.2部分)。 如1.3部分中所闡述在表位競爭分析中篩選1672個隨機選自第9至11輪選擇之scFv。因該等純系之功效有所增加，故在添加至析板中之前首先將未純化scFv稀釋至3.13%。如前所述，將展示顯著抑制性質之純系發送用於DNA測序，且產生獨特純系並如經純化scFv (1.3部分)進行分析。來自該等選擇之最強力純系Abet0377具有0.32 nM之功效(n=2個數據)。試樣抑制曲線展示於圖1中，且24個最高功效純系之數據展示於表2中。相應蛋白質序列列示於表3及4中。
表 2 ：
在Abet0144-GL HTRF™表位競爭分析中評估時最佳化scFv純系之實例性功效數據。在實施分析一次以上時，提供IC
50
值之絕對範圍。
表 3
(參見下文)：本文所闡述之最佳化非生殖系化純系之VH域之序列比對。突出顯示自親代序列(Abet0144-GL)之變化。根據Kabat編號系統來指定殘基。
表 4
(參見下文)：本文所闡述之最佳化非生殖系化純系之VL域之序列比對。突出顯示自親代序列(Abet0144-GL)之變化。根據Kabat編號系統來指定殘基。應注意，Abet0378具有存在於VL序列中之位置91之琥珀終止密碼子「B」，其係在最佳化期間隨著自麩醯胺酸之變化而引入。以scFv片段形式在用於表現之大腸桿菌菌株TG1中產生抗體，其中琥珀終止密碼子讀取為麩醯胺酸。
表3
表4
1.7 藉由表面電漿共振對呈經純化 scFv 形式之親和力改良純系實施動力學描述
使用表面電漿共振分析在HTRF™表位競爭分析(1.3-1.6部分)中較親代序列Abet0144-GL顯著改良對人類類澱粉β 1-42肽之結合親和力之經純化scFv純系。簡言之，使用ProteOn蛋白質相互作用陣列系統(BioRad, USA)評價每一經純化scFv與以合成方式所產生人類類澱粉β 1-42肽之間之相互作用之動力學參數。該等實驗係基本上如由Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所闡述來實施。 使用如下分析來估計每一測試scFv與人類類澱粉β 1-42之間之結合親和力：其中將生物素化合成人類類澱粉β 1-42肽(rPeptide, USA；cat: A1117)在5個不同表面密度下經由生物素/鏈黴抗生物素蛋白相互作用以非共價方式結合至專有鏈黴抗生物素蛋白晶片(NTA 176-5021)。在循環之間藉由10 mM pH 2.0甘胺酸之單一60秒注射去除結合至肽之scFv來再生晶片表面。再生不會顯著損失scFv結合能力。 使scFv以100 - 200 nM依序通過肽表面足夠量時間以觀察可可信地適用於適當結合模型之感測圖。自主要數據組扣除不相關scFv空白以減小任何緩衝液假像或非特異性結合效應之影響。然後將適當結合模型擬合至數據。 對於Abet0380 scFv而言，締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及解離常數(KD)分別為1.93 × 10
5
M
-1
s
-1
、2.85 × 10
-5
s
-1
及148 pM。該等參數係源自數據之1:1蘭格繆爾擬合。
表 5 ：
如藉由表面電漿共振所測定之結合至合成生物素化人類類澱粉β 1-42肽之最佳化scFv純系之實例性動力學數據。
1.8 親和力改良 scFv 至人類 IgG1-TM 之再格式化
藉由將可變重鏈(V
H
)及可變輕鏈(V
L
)域分別亞選殖至表現全人類抗體重及輕鏈之載體中來將ScFv再格式化成IgG1-TM。將可變重鏈選殖至含有人類重鏈恆定域及調控元件之哺乳動物表現載體(pEU 1.4)中以在哺乳動物細胞中表現全IgG1-TM重鏈。類似地，將可變輕鏈域選殖至哺乳動物表現載體(pEU 4.4)中以用於表現人類λ輕鏈恆定域及調控元件，從而在哺乳動物細胞中表現全IgG輕鏈。 為獲得呈IgG形式之抗體，將重鏈及輕鏈IgG表現載體瞬時轉染至HEK293-EBNA哺乳動物細胞(Invitrogen, UK；cat: R620-07)中，其中表現IgG且分泌至培養基中。彙集收穫物並過濾，然後純化。使用蛋白質A層析來純化IgG。將培養物上清液加載至適當陶瓷蛋白質A管柱(BioSepra - Pall, USA)上並使用50 mM pH 8.0 Tris-HCl、250 mM NaCl洗滌。使用0.1 M檸檬酸鈉(pH 3.0)自管柱洗脫結合之IgG且藉由添加Tris-HCl (pH 9.0)來中和。使用NAP-10緩衝液交換管柱(GE Healthcare, UK；cat: 17-0854-02)將經洗脫材料緩衝液交換至PBS中且使經純化IgG通過0.2 μm過濾器。使用基於IgG之胺基酸序列之消光係數以分光光度方式來測定IgG濃度。使用SEC-HPLC且藉由SDS-PAGE分析經純化IgG之聚集或降解。
1.9 生殖系化
基於相應scFv之實驗表徵，選擇5種最強力IgG用於生殖系化。純系Abet0343、Abet0369、Abet0377、Abet0380及Abet0382之經純化scFv皆展現小於750 pM之IC
50
值，如藉由表位競爭分析所測定(表2)；且皆具有小於250 pM之實驗解離常數，如藉由表面電漿共振所測定(表5)。 生殖系化製程係由將V
H
及V
L
域中之框架殘基恢復至最接近生殖系序列以相同地匹配人類抗體組成。對於最佳化抗體譜系之V
H
域而言，此係Vh3-23 (DP-47)，且對於V
L
域而言，其係Vλ3-3r (DPL-23)。對於Abet0380而言，V
H
域之Kabat位置43之1個殘基需要發生改變(表6)且V
L
域之Kabat位置81之1個殘基需要發生改變(表7)。剩餘4個序列需要2至5個變化(表6及7)。除Abet0343之輕鏈序列中之殘基2 (其與側接殘基1及3同時生殖系化)外，微調殘基(Foote等人，1992)並不生殖系化。使用標準定點誘變技術利用適當致突變引子如由Clackson及Lowman (Clackson等人，2004)所闡述來實施該等胺基酸殘基之生殖系化。
表6：5種選擇用於生殖系化之純系之V
H
域之序列比對。藉由陰影框指示兩個恢復至生殖系之殘基。藉由圓(●)指示微調殘基之位置。
表 7 ：
5種選擇用於生殖系化之純系之VL域之序列比對。藉由陰影框指示13個恢復至生殖系之殘基。藉由圓(●)指示微調殘基之位置。Abet0343中之微調殘基2與殘基1及3同時恢復至生殖系。恢復此殘基不影響抗體功效。
1.10 使用表面電漿共振測定親和力最佳化 IgG 之結合動力學
使用表面電漿共振分析親和力最佳化IgG (1.8部分)及其生殖系化配對物(1.9部分)之結合動力學。簡言之，使用BIAcore T-100 (GE Healthcare, UK)生物感測器儀器評價每一測試IgG與以合成方式所產生人類類澱粉β 1-42肽之間之相互作用之動力學參數。該等實驗係基本上如由Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所闡述來實施。 使用如下分析來估計每一測試IgG與人類類澱粉β 1-42之間之結合親和力：其中藉由本身胺連接至專有CM5晶片之蛋白質G表面以共價方式捕獲每一抗體。在循環之間藉由10 mM pH 2.0甘胺酸之配對40秒注射去除配體及所結合抗體來再生晶片表面。然後將測試抗體再應用於每一肽注射。 使合成人類類澱粉β 1-42肽(0.063 - 1024 nM)之一系列稀釋液依序通過抗體表面足量時間以觀察可可信地擬合至適當結合模型之感測圖。自每一IgG數據組扣除空白參考流動槽數據且自主要數據組扣除雙重參考之僅零濃度抗體緩衝液空白。然後使用BIAevaluation軟體將適當結合模型同時擬合至來自每一分析物滴定之數據。 使用所計算Chi
2
值來評價數據有效性，其中可接受值在2 RU
2
下。使用殘差估計擬合之整體成功性，其中2 RU下之偏差可接受。 Abet0380-GL (生殖系化) IgG1-TM之實例結果展示於圖2中。締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及解離常數(KD)分別為9.52 × 10
5
M
-1
s
-1
、3.07 × 10
-4
s
-1
及322 pM。該等參數係源自數據之1:1蘭格繆爾擬合。
1.11 使用表面電漿共振特定描述親和力最佳化 IgG
使用表面電漿共振驗證親和力最佳化IgG對人類類澱粉β 1-42肽之特異性。簡言之，使用BIAcore2000 (GE Healthcare, UK)生物感測器儀器評價每一測試IgG與多種小肽(包含以合成方式所產生人類類澱粉β 1-42及人類類澱粉β 1-40)之間之相互作用之動力學參數。該等實驗係基本上如由Karlsson等人(Karlsson等人，1991)所闡述來實施。 使用如下分析來估計每一測試IgG與每一肽之間之相互作用：其中藉由本身胺連接至專有CM5晶片之蛋白質G表面以非共價方式捕獲抗體。使用5次施加單循環方式(5 application single cycle approach)觀察抗體與肽之間之相互作用。在循環之間藉由10 mM pH 2.0甘胺酸之配對40秒注射去除配體及所結合抗體來再生晶片表面。然後將測試抗體再應用於每一肽注射循環。 使每一測試肽(介於64 nM與1024 nM之間)依序通過抗體表面足量時間以觀察不展示結合或有信心可適用於適當結合模型之感測圖。自每一IgG數據組扣除空白參考流動槽數據且自主要數據組扣除雙重參考之僅零濃度抗體緩衝液空白。 Abet0380-GL (生殖系化) IgG1-TM之實例性結果展示於圖3中。兩種肽(生物素化人類類澱粉β 1-42 (rPeptide, USA；cat: A1117)及未標記鼠類類澱粉β 1-42 (rPeptide, USA；cat: A1008))展示至抗體之強結合，而兩種肽生物素化人類類澱粉β 1-40 (rPeptide, USA；cat: A1111)及未標記鼠類類澱粉β 1-40 (rPeptide, USA；cat: A1007)展示不結合至抗體。
1.12 使用活體外免疫組織化學分析自然類澱粉 β 之最強力 IgG 之親和力
測試最強力IgG之結合至類澱粉β之能力，從而估計該等純系對類澱粉β肽之自然形式之親和力。簡言之，在人類阿茲海默氏病腦切片及Tg2576小鼠腦切片上篩選主要抗體以鑑別在活體外結合至類澱粉斑塊之抗類澱粉β 1-42抗體。 在該等實驗中，自患有嚴重阿茲海默氏病之兩個個體(ApoE基因型3/3，Braak期6；及ApoE基因型4/3，Braak期5)之額葉皮質分離人類腦組織。作為對照，自一個非癡呆個體(ApoE基因型3/3，Braak期1)分離等效組織。自處於15個月齡(2隻小鼠)及22個月齡(2隻小鼠)之Tg2576小鼠分離小鼠腦組織。在2、5、10及20 ug ml
-1
之濃度下測試抗體。 在一個實驗中，Abet0380-GL IgG1-TM抗體染色核心斑塊(CP)，其中在Tg2576腦切片上評分為4且在人類AD腦切片上評分為3。其亦以較小程度染色瀰漫性斑塊(DP)及腦類澱粉血管病(CAA)斑塊。與之相比，陽性對照抗體在毗鄰切片上之所有斑塊(CP、DP、CAA)上於相同條件下產生3-4之評分。代表性影像展示於圖4中。
1.13 藉由西方印漬證實 Abet0380-GL IgG1-TM Aβ42 識別特徵
為在SDS-PAGE之前使Aβ42寡聚物發生交聯，如下所述來實施PICUP (光誘導之肽交聯)。藉由將2 μl儲備液(在10 mM下)添加至18 μl 1×PBS中來產生1 mM Ru(Bpy)溶液。另外，藉由將2 μl儲備液(在200 mM下)添加至18 μl 1×PBS中來產生20 mM過硫酸銨溶液(APS)。將未用儲備液立即速凍於乾冰上且將其放回-80℃冷凍器中。在暗室中，將5 μl Ru(Bpy)添加至80 ul聚集物(純10 uM試樣)中，隨後添加5 μl APS。使用燈將試樣在暗室中輻照10sec。立即添加30ul (4×) LDS試樣緩衝液。 然後對交聯(PICUP)及未交聯Aβ1-42聚集物實施SDS-PAGE。將溶液在70℃下於熱塊中培育10分鐘。同時，藉由組合5 μl Magic Mark XP西方蛋白質標準物、5 μl Novex Sharp預染色蛋白質標準物來產生標記物。在培育10分鐘之後，將試樣加上標記物加載於含有MES運行緩衝液之NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠(1.0 mm，15個孔，15 μl/孔)上。將凝膠在200 V下運行35分鐘。 然後使用來自Invitrogen之iBlot機器將凝膠在20V下印漬於PVDF膜上保持7分鐘(程式P3)。 在完成印漬後，拆解凝膠堆疊且然後將PVDF膜在室溫及輕微旋轉下於50 ml 4% MPBST (於PBST中之4% Marvel)中阻斷一小時。然後使用解剖刀切割印漬物以用於使用個別抗體進行探究。此過程係與一級抗體溶液(2ug/ml，於10 ml 3% MPBST中)培育1小時。 接下來，使用PBST將膜洗滌5次且每次5分鐘，且然後在室溫下於二級抗體溶液(於10 ml PBST中之1 μl抗人類Fc特異性HRP偶聯物)中培育1小時。使用PBST將膜洗滌3次且使用PBS洗滌2次，每次5分鐘。 在最終洗滌期間，將化學發光SuperSignal West Dura受質(Thermo Scientific；34075)升溫至室溫。組合各600ul之2種溶液。自PVDF膜傾析PBS，且然後使用移液管利用混合Dura試劑覆蓋膜。使反應進行約5分鐘(在此期間，設置VerscDoc成像系統)且然後使用30sec暴露獲取影像(且使用變換濾波器增強)。代表性影像展示於圖5中。
實例 2. 證實 Abet0380-GL IgG1-TM 抗體之特定功能反應之活體內研究 2.1 藉由游離類澱粉 β 1-42 肽之活體內減少來進行 Abet0380-GL IgG1-TM 之功能表徵
藉由以5 ml/kg靜脈內注射25 mM組胺酸、7%蔗糖、0.02% p80 pH 6.0表面活性劑之投藥媒劑來使8週齡雄性白化哈蘭斯-道(Harlan Sprague-Dawley)大鼠(
n
= 8-12)接受單一劑量之Abet0380-GL IgG1-TM抗體。投藥溶液係在即將投藥之前製得。在指示時間下將動物麻醉且自小腦延髓池抽吸腦脊髓液(CSF)。在採樣20分鐘內將CSF試樣在大約3000 ×
g
及4℃下離心10分鐘以去除細胞或碎屑。然後將試樣冷凍於乾冰上且儲存於-70℃下用於後續分析。 藉由斷頭術來處死動物，解剖腦組織且自腦組織在二乙胺(DEA；Fluka, Sigma, UK；cat: 31729)中提取類澱粉β肽。簡言之，使經冷凍腦組織在0.2% DEA及50 mM NaCl (Merck, USA；cat: 1.06404.1000)中均質化。使腦均質物在133,000 ×
g
超離心1小時。使用2 M Tris-HCl (TRIZMA
®
-鹽酸鹽；Sigma, UK；cat: 93363)將所回收上清液中和至pH 8.0且儲存於-70℃直至分析。根據瑞典農業部(Swedish Board of Agriculture)提供之相關導則及條例來實施動物實驗。動物實驗之特定倫理委員會：Stockholm Södra Animal Research Ethical Board提供倫理許可。 測量大鼠CSF中之游離類澱粉β 1-42肽係使用免疫沈澱以去除結合Abet0380-GL之類澱粉β 1-42肽，隨後藉由獲自Invitrogen之商業ELISA套組分析進行。簡言之，將蛋白質A珠粒(Dynabeads
®
蛋白質A；Invitrogen, UK；cat: 100-02D)之溶液添加至96孔無襯邊板(non-skirted plate)(0.2 ml聚丙烯；VWR International, UK；cat: 10732-4828)中並利用TBST (50 mM TBS；Sigma, UK；cat: T6664加0.1% Tween20)使用磁鐵(DynaMag™ 96側；Invitrogen, UK；cat: 123.31D)洗兩次以自溶液分離珠粒。將解凍大鼠CSF試樣(40 μl)添加至每一孔中且在40℃以傾斜旋轉培育1小時。然後使用磁鐵將珠粒丸化且將30 μl免疫沈澱之CSF試樣轉移至ELISA套組(小鼠類澱粉β(1-42)比色ELISA套組；Invitrogen, UK；cat: KMB3441)已添加70 μl標準稀釋劑緩衝液(補充有蛋白酶抑制劑；Roche, UK；cat: 11836153001)之96孔板中。向板中添加校準標準試樣一式兩份，且將板在室溫振盪培育2小時。使用400 μl洗滌緩衝液將板洗4次，將100 μl檢測抗體溶液添加至每一孔中且將板在室溫振盪培育1小時。再次，使用400 μl洗滌緩衝液將板洗4次，將100 μl二級抗體工作溶液添加至每一孔中且將板在室溫振盪培育30分鐘。最後，使用400 μl洗滌緩衝液將板洗4次，將100 μl穩定化色素原添加至每一孔中且將板在室溫於暗處培育30分鐘。為停止反應，將100 μl終止溶液添加至每一孔中且在2小時內於450 nm吸光度讀取板。分析單一CSF試樣且使用Prism 4 (GraphPad, USA)利用單因子ANOVA對log轉變數據在不針對多個對比調節下實施數據分析。 使用經修改小鼠類澱粉β (1-42)比色ELISA套組(Invitrogen, UK；cat: KMB3441)來量測大鼠腦均質物中之總(游離及Abet0380-GL結合)類澱粉β 1-42肽。藉由過量Abet0380-GL IgG1-TM抗體代替套組檢測抗體且藉由抗人類IgG HRP-偶聯物抗體(Jackson ImmunoResearch, UK；cat: 109-035-098)代替二級抗體。簡言之，將50 μl以1:2稀釋於試樣稀釋劑(補充有蛋白酶抑制劑；Roche, UK；cat: 11836153001)中之解凍腦均質物及標準試樣一式兩份添加至96孔ELISA板中。將過量Abet0380-GL IgG1-TM抗體(50 μl, 4 μg/ml)添加至每一孔中且然後將板在室溫下培育3小時。使用400 μl洗滌緩衝液將板洗滌4次，將100 μl二級抗體工作溶液添加至每一孔中且將板在室溫下培育30分鐘。最後，使用400 μl洗滌緩衝液將板洗滌4次，將100 μl穩定化色素原添加至每一孔中且將板在室溫下於暗處培育15分鐘。為停止反應，將100 μl終止溶液添加至每一孔中且在2小時內於450 nm吸光度下讀取板。使用Prism 4 (GraphPad, USA)利用單因子ANOVA對log轉變數據在並不針對多個對比進行調節下實施數據分析。 使用小鼠類澱粉β (1-40)比色ELISA套組(Invitrogen, UK；cat: KMB3481)量測大鼠腦均質物中之總類澱粉β 1-40肽。簡言之，將50 μl解凍腦均質物及標準試樣(稀釋於試樣稀釋劑(補充有蛋白酶抑制劑；Roche, UK；cat: 11836153001)中)一式兩份添加至96孔ELISA板中。將50 μl檢測抗體溶液添加至每一孔中且將板在室溫下培育3小時。使用400 μl洗滌緩衝液將板洗滌4次，將100 μl二級抗體工作溶液添加至每一孔中且將板在室溫下培育30分鐘。最後，使用400 μl洗滌緩衝液將板洗滌4次，將100 μl穩定化色素原添加至每一孔中且將板在室溫下於暗處培育30分鐘。為停止反應，將100 μl終止溶液添加至每一孔中且在2小時內於450 nm吸光度下讀取板。使用Prism 4 (GraphPad, USA)利用單因子ANOVA對log轉變數據在並不針對多個對比進行調節下實施數據分析。
2.2 藉由游離類澱粉 β 1-42 肽之活體內減少來進行 Abet0380-GL IgG1-TM 之功能表徵
在2.1部分中所闡述之分析中，在投藥之後72或168小時，單一劑量之20 mg/kg Abet0380-GL IgG1-TM抗體將大鼠中游離類澱粉β 1-42肽之CSF濃度減小至量化限值(數據未展示)。為進一步探究Abet0380-GL IgG1-TM抗體之活體內效應，在14天內向大鼠投與0.25、0.5、1、5或10 mg/kg之每週劑量。在第二劑量之後168小時對動物實施安樂死以量測CSF中游離類澱粉β 1-42肽以及腦組織中總類澱粉β 1-42或1-40肽之濃度。 游離類澱粉β 1-42之劑量依賴性降低顯示於CSF中(圖6A)。兩個最高劑量5 mg/kg及10 mg/kg將類澱粉β 1-42肽減少至所用分析中之量化限值，而在與媒劑對照相比時，劑量0.5 mg/kg及1 mg/kg分別將類澱粉β 1-42肽顯著減少47%及61%。最低劑量0.25 mg/kg將CSF中之游離類澱粉β 1-42肽減少14%，但不能達成統計學顯著性。因Abet0380-GL IgG1-TM抗體隔離類澱粉β 1-42肽，故在腦組織中顯示總類澱粉β 1-42肽之劑量依賴性增加(圖6B)。然而，腦組織中總類澱粉β 1-40肽之濃度不受影響(圖6C)，由此證實Abet0380-GL IgG1-TM對類澱粉β 1-42肽之特異性。總而言之，來自大鼠研究之上述結果證實，Abet0380-GL IgG1-TM抗體減小CSF中游離類澱粉β 1-42肽之濃度且
ED50
介於0.5 mg/kg與1 mg/kg之間。
2.3 Abet0380-GL IgG1TM 之功能表徵 - 活體內非斑塊結合之驗證 - 在投與年老 Tg2576 小鼠周邊劑量之後 168 小時 Abet0380-GL IgG1-TM 並不在活體內結合至類澱粉 β 斑塊
測試Abet0380-GL IgG1-TM在單一周邊劑量之後結合至年老Tg2576小鼠中之類澱粉β斑塊之能力。根據由瑞典農業部提供之相關導則及條例來實施動物實驗。藉由動物實驗之特定倫理委員會：Stockholm Södra Animal Research Ethical Board來提供倫理許可。藉由靜脈內注射使用25 mM組胺酸、7%蔗糖、0.02% p80 pH 6.0表面活性劑之5 mL/kg投藥媒劑使17個月齡雌性Tg2576小鼠(n=5)接受單一劑量之媒劑、30 mg/kg陽性對照抗體或10 mg/kg或30 mg/kg Abet0380-GL IgG1-TM抗體。在投藥之後168小時，將動物深度麻醉且使用室溫PBS灌注，隨後使用冷(4℃)磷酸鹽緩衝之4%低聚甲醛(PFA)灌注。然後藉由斷頭術來處死動物且解剖腦且在4℃下於PFA中浸漬固定72小時。將固定劑更換為含有0.1%疊氮化鈉之PBS且將組織儲存於4℃下直至進一步處理。 對腦切片實施免疫組織化學以評估Abet0380-GL IgG1-TM至類澱粉β斑塊之活體內結合程度。簡言之，製備經石蠟包埋之腦切片以用於免疫組織化學。使用來自Epitomics之兔抗小鼠IgG1及IgG2特異性二級抗體檢測Abet0380-GL IgG1-TM或沈積於腦實質內之陽性對照抗體。在Ventana機器人上使用OmniMap檢測系統(Ventana Medical Systems, USA)實施染色。對於離體摻加而言，在活體外使用過量注射Abet0380-GL IgG1-TM或陽性對照抗體將連續組織切片染色。二級抗體及色素原與上文相同。 在10×光學放大率下以盲式實施染色評分。標注經修飾斑塊之分佈。根據自0 (無斑塊染色)至最大4 (深度斑塊修飾)之相對強度量表對斑塊標記之強度進行評分。 在10 mg/kg或30 mg/kg之周邊劑量之後168小時，Abet0380-GL IgG1-TM並不在活體內修飾類澱粉β斑塊或腦類澱粉血管病(CAA)斑塊。陽性對照抗體顯示強烈至較低之活體內斑塊修飾。部分及局部分佈圖案顯而易見，且在所有動物中具有核心斑塊、瀰漫性斑塊及CAA。代表性影像展示於圖7中。來自相同動物之腦組織與Abet0380-GL IgG1-TM及陽性對照抗體之離體摻加證實了注射抗體之先前證實之離體斑塊結合能力(未展示)。
實例 3. 抗 A β 1-42 序列
抗體分子之實例性序列列示於隨附序列表中，包含實例性抗體VH域、VL域、個別CDR序列、HCDR組、LCDR組及框架區。 比較表5中所列示24種最佳化純系之序列。表8及9分別展示VH及VL域之間之序列一致性%。
表 8 ：
本文所闡述之24種非生殖系化及5種生殖系化抗體之整個V
H
序列(Kabat殘基1→113)中之序列一致性。所有序列皆在Abet0380-GL主要純系之86.4% (突出顯示值)內。
表 9 ：
本文所闡述之24種非生殖系化及5種生殖系化抗體之整個VL序列(Kabat殘基1→107)中之序列一致性。所有序列皆在Abet0380-GL主要純系之88.7% (突出顯示值)內。
表 10 ：
VH CDR內之每一位置之殘基及微調殘基之實例。
表 11 ：
V
L
CDR內之每一位置之殘基之實例。
表 12 ：
在24種最佳化純系中之VH CDR及FW1中觀察到之取代
表 13 ：
在24種最佳化純系中之VL CDR中觀察到之取代
表 14 ：
本文所提及之抗體序列與本文件末尾處序列表中之序列之間的對應。
實例 4 ： Abet0380-GL IgG1-TM 在競爭結合實驗中之特異性
在競爭結合實驗中檢驗Abet0380-GL IgG1-TM之特異性。簡言之，將Abet0380-GL IgG1-TM (0.5nM)與多種不同濃度(10uM至最低0.17nM)之一組全長、截短及焦人類Aβ肽(Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-16、Aβ12-28、Aβ17-42、Aβ焦-3-42或Aβ焦-11-42) 一起培育(在室溫下1hr)。 在Abet0380-GL IgG1-TM與Aβ肽之間培育後，添加N-末端生物素Aβ1-42 (1.5nM)，隨後添加銪穴狀化合物標記之抗人類Fc抗體 (0.8nM) (CisBio目錄編號61HFCKLB)及鏈黴抗生物素蛋白-XL
ent!
(5nM) (CisBio目錄編號611SAXLB)。然後將分析液在室溫下進一步培育2hr，然後在Envision讀板儀(PerkinElmer)上使用標準均相時間解析螢光(HTRF)讀取方案進行讀取。在不存在競爭下，然後可經由時間解析螢光共振能量轉移(TR-FRET) (因銪穴狀化合物供體鄰近XL
665
受體螢光團)量測N-末端生物素Aβ1-42與Abet0380-GL IgG1-TM (分別與鏈黴抗生物素蛋白-XL
ent!
及銪穴狀化合物標記之抗人類Fc抗體複合)之相互作用。藉由測試肽對應Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42相互作用之競爭由此使得分析信號有所減小。將結果表示為特異性結合%，100%特異性結合係源自含有鏈黴抗生物素蛋白-XL
ent!
(5nM)、N-末端生物素Aβ1-42 (1.5nM)、Abet0380-GL IgG1-TM (0.5nM)及銪穴狀化合物標記之抗人類Fc抗體(0.8nM)之孔。0%特異性結合係源自已移除Abet0380-GL IgG1-TM之孔。 最終最終分析體積為20µl且在包括pH7.4 MOPS (50mM)、氟化鉀(0.4M)、tween 20 (0.1%)及無脂肪酸BSA (0.1%)之分析緩衝液中製備所有試劑。在低體積384孔黑色分析板(Costar 3676)中實施分析。 總而言之，使用Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-42、Aβ焦-3-42及Aβ焦-11-42觀察到Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42結合之抑制，其中此組之IC
50
值介於10
-8
莫耳濃度至10
-9
莫耳濃度之間。使用Aβ1-16或Aβ12-28觀察到並無Abet0380-GL IgG1-TM: N-末端生物素Aβ1-42結合之抑制(圖8)。
實例 5 ： 抗體 Abet0144-GL 在正常大鼠 PK-PD 研究中隔離類澱粉 β 1-42 之能力
在正常大鼠中於PK-PD研究中探究抗體Abet0144-GL隔離類澱粉β 1-42之能力。經2週(在第0及7天)向大鼠經靜脈內每週投與Abet0144-GL (10 mg/kg或40 mg/kg)或媒劑，且在第2劑量之後一週處死。對CSF進行採樣以用於游離及總類澱粉β 1-42量測，且對腦進行採樣以用於總類澱粉β 1-42量測。使用上述分析量測總及總類澱粉β 1-42濃度。 如圖9中所展示，CSF中之游離類澱粉β 1-42並未由10 mg/kg或40 mg/kg Abet0144-GL顯著改變(在與媒劑相比時，分別增加5%及18%；圖9)。CSF中之總類澱粉β 1-42在10 mg/kg下顯著增加38%，且在40 mg/kg下顯著增加139%。腦組織中之總類澱粉β 1-42亦在10 mg/kg及40 mg/kg下分別顯著增加16%及50%。總而言之，來自正常大鼠中之此研究之數據證實，Abet0144-GL對CSF中之游離類澱粉β 1-42濃度並無顯著效應，而增加CSF及腦中之總類澱粉β 1-42濃度。此係自對靶具有數十nM範圍親和力之抗體所預計之特徵。
實例 6 ： 6'- 溴螺 [ 環己烷 -1,2'- 茚 ]-1',4(3'H)- 二酮
在20℃-30℃下，將第三丁醇鉀(223 g, 1.99 mol)裝填至含有6-溴-1-二氫茚酮(8.38 kg, 39.7 mol)於THF (16.75 L)中之經攪拌混合物之100 L反應器中。然後在15分鐘內將丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8 mol)裝填至混合物中同時使溫度保持在20℃-30℃之間。在20℃-30℃下在20分鐘內添加第三丁醇鉀(89.1 g, 0.79 mol)溶於THF (400 mL)中之溶液，然後添加丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8 mol)，然後在20℃-30℃下在20分鐘內添加第三份溶於THF (400 mL)中之第三丁醇鉀(90 g, 0.80 mol)，隨後第三次添加丙烯酸甲酯(2.33 L, 25.8 mol)。在20℃-30℃下在1小時內將溶於THF (21.9 L)中之第三丁醇鉀(4.86 kg, 43.3 mol)裝填至反應器中。將反應物加熱至大約65℃且蒸餾掉23 L溶劑。將反應溫度降至60℃且在55℃-60℃下在30分鐘內將溶於水(51.1 L)中之50%氫氧化鉀水溶液(2.42 L, 31.7 mol)添加至混合物中，然後在60℃下將混合物攪拌6小時，在2小時內冷卻至20℃。在20℃下攪拌12小時之後，過濾固體材料，使用水(8.4 L)與THF (4.2 L)之混合物洗滌兩次，且然後在50℃下在真空下乾燥以產生6'-溴螺[環己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(7.78 kg；26.6 mol)。
1
H NMR (500 MHz, DMSO-
d 6
) δ ppm 1.78 - 1.84 (m, 2 H), 1.95 (td, 2 H), 2.32 - 2.38 (m, 2 H), 2.51 - 2.59 (m, 2 H), 3.27 (s, 2 H), 7.60 (d, 1 H), 7.81 (m, 1 H), 7.89 (m, 1 H)。
實例 7 ： (1r,4r)-6'- 溴 -4- 甲氧基螺 [ 環己烷 -1,2'- 茚 ]-1'(3'H)- 酮
在約0℃-5℃下經約25分鐘，將溶於DCM (3.8 L)中之硼烷第三丁基胺複合物(845 g, 9.7 mol)裝填至6'-溴螺[環己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮(7.7 kg, 26.3 mol)於DCM (42.4 L)中之漿液中。將反應物在0℃-5℃下攪拌1小時，然後分析證實轉化率＞98%。裝填自氯化鈉(2.77 kg)、水(13.3 L)及37%鹽酸(2.61 L, 32 mol)製備之溶液。將混合物升溫至約15℃且在沉降分層後分離各相。將有機相與甲烷磺酸甲酯(2.68 L, 31.6 mol)及四丁基氯化銨(131 g, 0.47 mol)一起返回至反應器中且在20℃下劇烈攪動混合物。然後經約1小時將50%氫氧化鈉(12.5 L, 236 mol)裝填至經劇烈攪動之反應混合物中且在20℃下將反應物劇烈攪動過夜。添加水(19 L)且在分離之後棄除水相。將有機層加熱至約40℃且蒸餾掉33 L溶劑。裝填乙醇(21 L)且在溫度增加下重新開始蒸餾(在高達79℃下蒸餾掉22 L)。在約75℃下裝填乙醇(13.9 L)。使溫度保持在72℃-75℃之間經30分鐘裝填水(14.6 L)。抽出約400 mL溶液至500 mL聚乙烯瓶中且使試樣自發結晶。將批料冷卻至50℃，然後將結晶漿液試樣回添至溶液中。將混合物冷卻至40℃。在4小時內將混合物冷卻至20℃，然後將其攪拌過夜。過濾掉固體，使用乙醇(6.6 L)及水(5 L)之混合物洗滌並在50℃及真空下乾燥以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[環己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(5.83 kg, 18.9 mol)
1
H NMR (500 MHz, DMSO-
d 6
) δ ppm 1.22-1.32 (m, 2 H), 1.41 - 1.48 (m, 2 H), 1.56 (td, 2 H), 1.99 - 2.07 (m, 2 H), 3.01 (s, 2 H), 3.16 - 3.23 (m, 1 H), 3.27 (s, 3 H), 7.56 (d, 1 H), 7.77 (d, 1 H), 7.86 (dd, 1 H)。
實例 8 ： (1r,4r)-6'- 溴 -4- 甲氧基螺 [ 環己烷 -1,2'- 茚 ]-1'(3'H)- 亞胺鹽酸鹽 在環境溫度下，將(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[環己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-酮(5.82 kg；17.7 mol)裝填至100 L反應器中，然後裝填乙醇鈦(IV) (7.4 L；35.4 mol)及第三丁基亞磺醯胺(2.94 kg；23.0 mol)於2-甲基四氫呋喃(13.7 L)中之溶液。攪拌混合物且加熱至82℃。在82℃下保持30分鐘之後進一步增加溫度(最高97℃)且蒸餾掉8 L溶劑。將反應物冷卻至87℃且添加2-甲基四氫呋喃(8.2 L)以獲得82℃之反應溫度。在82℃下將反應液攪拌過夜。升高反應溫度(至97℃)且蒸餾掉8.5 L溶劑。將反應液冷卻至87℃且添加2-甲基四氫呋喃(8.2 L)以獲得82℃之反應溫度。在3.5小時之後，進一步增加反應溫度(至97℃)並蒸餾掉8 L溶劑。將反應液冷卻至87℃且添加2-甲基四氫呋喃(8.2 L)以獲得82℃之反應溫度。在2小時之後，進一步增加反應溫度(至97℃)並蒸餾掉8.2 L溶劑。將反應液冷卻至87℃且添加2-甲基四氫呋喃(8.2 L)以獲得82℃之反應溫度。在82℃下將反應液攪拌過夜。進一步增加反應溫度(至97℃)並蒸餾掉8 L溶劑。將反應液冷卻至25℃。裝填二氯甲烷(16.4 L)。向單獨反應器中添加水(30 L)且劇烈攪動並添加硫酸鈉(7.54 kg)，且將所得溶液冷卻至10℃。將硫酸(2.3 L, 42.4 mol)添加至水溶液中並將溫度調節至20℃。抽出6 L酸性水溶液且儲存待用。經5分鐘且在良好攪動下，將有機反應混合物裝填至酸性水溶液中。使用二氯甲烷(16.4 L)洗滌有機反應容器，且亦將二氯甲烷洗滌溶液添加至酸性水中。將混合物攪拌15分鐘且然後使其沉降20分鐘。使底部水相流出，且添加儲存之6 L酸性洗滌液，隨後添加水(5.5 L)。將混合物攪拌15分鐘且然後使其沉降20分鐘。使底部有機層流出至壇中且棄除上部水層。將有機層回填至容器中，然後回填硫酸鈉(2.74 kg)，且將混合物攪動30分鐘。過濾硫酸鈉且使用二氯甲烷(5.5 L)洗滌，並將合併之有機層裝填至清潔器皿中。加熱批料以供蒸餾(收集31 L，最高溫度為57℃)。將批料冷卻至40℃且添加二氯甲烷(16.4 L)。加熱批料以供蒸餾(收集17 L，最高溫度為54℃)。將批料冷卻至20℃且添加二氯甲烷(5.5 L)及乙醇(2.7 L)。使溫度保持在16℃-23℃之間經45分鐘將於二乙醚中之2 M氯化氫(10.6 L；21.2 mol)裝填至反應物中。在20℃下將所得漿液攪拌1小時，隨後過濾固體並使用二氯甲烷與二乙醚之1:1混合物(3 × 5.5 L)洗滌3次。在50℃及真空下乾燥固體以得到(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[環己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亞胺鹽酸鹽(6.0 kg；14.3 mol；藉由
1
H NMR分析為82% w/w)
1
H NMR (500 MHz, DMSO-
d 6
) δ ppm 130 (m, 2 H), 1.70 (d, 2 H), 1.98 (m, 2 H), 2.10 (m, 2 H), 3.17 (s, 2 H), 3.23 (m, 1 H), 3.29 (s, 3 H), 7.61 (d, 1 H), 8.04 (dd, 1 H), 8.75 (d, 1 H), 12.90(br s,2H)。
實例 9 ： (1r,4r)-6’- 溴 -4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’(3’’H)- 硫酮 將原甲酸三甲基酯(4.95 L；45.2 mol)及二異丙基乙胺(3.5 L；20.0 mol)裝填至含有於異丙醇(50.5 L)中之(1r,4r)-6'-溴-4-甲氧基螺[環己烷-1,2'-茚]-1'(3'H)-亞胺鹽酸鹽(6.25 kg；14.9 mol)之反應器中。攪拌反應混合物且在1小時內加熱至75℃以獲得澄清溶液。將溫度設定為70℃且經1小時裝填2-側氧基硫代丙醯胺於異丙醇中之2 M溶液(19.5 kg；40.6 mol)，然後在69℃下將反應物攪拌過夜。使用(1r,4r)-6’-溴-4-甲氧基-5’’-甲基-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’(3’’H)-硫酮(3 g；7.6 mmol)向該批料加晶種且將溫度降至60℃並攪拌1小時。藉由蒸餾濃縮混合物(蒸餾溫度為約60℃；蒸餾掉31 L)。在1小時內及60℃下添加水(31 L)，然後在90分鐘內將溫度降至25℃，隨後將混合物攪拌3小時。過濾固體，使用異丙醇(2 × 5.2 L)洗滌兩次且在40℃下在真空下乾燥以產生(1r,4r)-6’-溴-4-甲氧基-5’’-甲基-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’(3’’H)-硫酮(4.87 kg；10.8 mol；藉助
1
H NMR之分析為87% w/w)。
實例 10 ： (1r,1’R,4R)-6’- 溴 -4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’- 胺 D(+)-10- 樟腦磺酸鹽 將於甲醇中之7 M氨(32 L；224 mol)裝填至含有(1r,4r)-6’-溴-4-甲氧基-5’’-甲基-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’(3’’H)-硫酮(5.10 kg；11.4 mol)及二水合乙酸鋅(3.02 kg；13.8 mol)之反應器中。密封反應器且將混合物加熱至80℃並攪拌24小時，然後將其冷卻至30℃。裝填1-丁醇(51L)且藉由真空蒸餾掉約50 L來濃縮反應混合物。添加1-丁醇(25 L)且藉由真空蒸餾27 L來濃縮混合物。將混合物冷卻至30℃並裝填1 M氫氧化鈉(30 L；30 mol)。將兩相混合物攪動15分鐘。分離掉底部水相。裝填水(20 L)且將混合物攪動30分鐘。分離掉底部水相。將有機相加熱至70℃，然後裝填(1S)-(+)-10-樟腦磺酸(2.4 kg；10.3 mol)。將混合物在70℃下攪拌1小時且然後經3小時斜降至20℃。過濾固體，使用乙醇(20 L)洗滌且在50℃下在真空中乾燥以產生(1r,4r)-6’-溴-4-甲氧基-5’’-甲基-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺(+)-10-樟腦磺酸鹽(3.12 kg；5.13 mol；藉助
1
H NMR之分析為102% w/w)。
實例 11 ： (1r,1’R,4R)-4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -6’-[5-( 丙 -1- 炔 -1- 基 ) 吡啶 -3- 基 ]-3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’- 胺 將溶於水(0.1 L)中之Na
2
PdCl
4
(1.4 g；4.76 mmol)及3-(二-第三丁基鏻)丙烷磺酸鹽(2.6 g；9.69 mmol)裝填至含有於1-丁醇(7.7 L)與水(2.6 L)之混合物中之(1r,4r)-6’-溴-4-甲氧基-5’’-甲基-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺(+)-10-樟腦磺酸鹽(1 kg；1.58 mol)、碳酸鉀(0.763 kg；5.52 mol)之容器中。使用氮小心地將混合物惰性化，隨後裝填5-(丙-1-炔基)吡啶-3-基
酸(0.29 kg；1.62 mol)並再次小心地使用氮將混合物惰性化。將反應混合物加熱至75℃且攪拌2小時，然後分析展示完全轉化。將溫度調節至45℃。停止攪拌且分離掉底部水相。使用水(3 × 4 L)將有機層洗滌3次。將反應溫度調節至22℃且裝填膦SPM32捕獲劑(0.195 kg)並將混合物攪動過夜。過濾掉捕獲劑且使用1-丁醇(1 L)洗滌。藉由在減壓下蒸餾將反應物濃縮至3 L。裝填乙酸丁酯(7.7 L)且再次藉由在減壓下蒸餾將混合物濃縮至3 L。裝填乙酸丁酯(4.8 L)且將混合物加熱至60℃。將混合物攪拌1小時，然後藉由在減壓下蒸餾將其濃縮至約4 L。將溫度設定為60℃且經20分鐘添加庚烷(3.8 L)。經3小時將混合物冷卻至20℃且然後攪拌過夜。過濾固體且使用乙酸丁酯:庚烷(2 × 2 L)之1:1混合物洗滌兩次。在50℃下在真空下乾燥產物以產生(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺(0.562 kg；1.36 mol；藉助
1
H NMR之分析為100% w/w)。
1
H NMR (500 MHz, DMSO-
d 6
) δ ppm 0.97 (d, 1 H), 1.12-1.30 (m, 2 H), 1.37-1.51 (m, 3 H), 1.83 (d, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 2.17 (s, 2 H), 2.89-3.12 (m, 3 H), 3.20 (s, 3 H), 6.54 (s, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 7.40 (d, 1 H), 7.54 (d, 1 H), 7.90(s,1H). 8.51(d,1H), 8.67(d,1H)。
實例 12 ： (1r,1’R,4R)-4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -6’-[5-( 丙 -1- 炔 -1- 基 ) 吡啶 -3- 基 ]-3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’- 胺之樟腦磺酸鹽之製備 在60℃下將1.105 kg (1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺溶於8.10 L 2-丙醇及475 mL水中。然後在60℃下裝填1.0莫耳當量(622克) (1S)-(+)-10樟腦磺酸。攪動漿液直至所有(1S)-(+)-10樟腦磺酸皆溶解為止。在60℃下添加第二份2-丙醇(6.0 L)且然後蒸餾內容物直至收集4.3 L餾出物為止。然後在65℃下裝填9.1 L庚烷。延遲1小時後批料變不透明。然後在約75℃下再次蒸餾且收集8.2 L餾出物。然後經2 hr將批料冷卻至20℃且保持在該溫度下過夜。然後過濾批料且使用1.8 L 2-丙醇與2.7 L庚烷之混合物洗滌。最後在減壓下及50℃下乾燥該物質。產量為1.44 kg (83.6% w/w)。
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d
6
) δ ppm 12.12 (1H, s), 9,70 (2H, d,
J
40.2), 8.81 (1H, d,
J
2.1), 8.55 (1H, d,
J
1.7), 8.05 (1H, dd,
J
2.1, 1.7), 7.77 (1H, dd,
J
7.8, 1.2), 7.50 (2H, m), 3.22 (3H, s), 3.19 (1H, d,
J
16.1), 3.10 (1H, d,
J
16.1), 3.02 (1H, m), 2.90 (1H, d,
J
14.7), 2.60 (1H, m), 2.41 (1H, d,
J
14.7), 2.40 (3H, s), 2.22 (1H, m), 2.10 (3H, s), 1.91 (3H, m), 1.81 (1H, m), 1.77 (1H, d,
J
18.1), 1.50 (2H, m), 1.25 (6H, m), 0.98 (3H, s), 0.69 (3H, s)。
實例 13 ： 測試 (1r,1’R,4R)-4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -6’-[5-( 丙 -1- 炔 -1- 基 ) 吡啶 -3- 基 ]-3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’- 胺之活性
使用序列方法來測試(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之活性程度：
TR-FRET 分析
TR-FRET中所使用之β-分泌酶製備如下： 使用ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK哺乳動物表現載體選殖人類β-分泌酶(AA 1 - AA 460)之可溶性部分之cDNA。將該基因融合至IgG1之Fc域(親和力標籤)且穩定選殖至HEK 293細胞中。將經純化sBACE-Fc在-80℃下儲存於pH 9.2 Tris緩衝液中，且具有40%之純度。 在反應緩衝液(乙酸鈉、chaps、triton x-100、pH4.5 EDTA)中將酶(截短型)稀釋至6 μg/mL (儲備液為1.3 mg/mL)且將受質(銪)CEVNLDAEFK(Qsy7)稀釋至200 nM (儲備液為120 μM)。使用機器人系統Biomek FX及Velocity 11進行所有液體處置且將酶及受質溶液保持於冰上直至將其置於機器人系統中為止。向板中添加酶(9 μl)，然後添加1 μl於二甲基亞碸中之化合物，混合且預培育10分鐘。然後添加受質(10 μl)，混合且在室溫下進行反應15分鐘。藉由添加終止溶液(7 μl，乙酸鈉，pH 9)來停止反應。在Victor II讀板儀上使用340nm之激發波長及615nm之發射波長來量測產物之螢光。在Costar 384孔圓底、低體積、非結合表面板(Corning 3676號)中實施分析。酶之最終濃度為2.7 μg/ml；受質之最終濃度為100 nM (Km為約250 nM)。二甲基亞碸對照(而非測試化合物)定義100%活性程度且0%活性係藉由不含酶(使用反應緩衝液代替)之孔所定義。對照抑制劑亦用於劑量反應分析中且具有約150 nM之IC
50
。
稀釋 TR-FRET 分析
在稀釋TR-FRET分析中進一步測試化合物，條件如上文針對TR-FRET分析所闡述，但使用小50倍之酶及6.5 h長反應時間且在室溫下於暗處進行測試。
sAPP β 釋放分析
將SH-SY5Y細胞於含有Glutamax、10% FCS及1%非必需胺基酸之DMEM /F-12中培養且以7.5-9.5×10
6
個細胞/瓶之濃度冷凍保藏並儲存在‑140℃下。將細胞解凍且以100 μL細胞懸浮液/孔以約10000個細胞/孔之濃度接種至384孔組織培養處理板中之含有Glutamax、10% FCS及1%非必需胺基酸之DMEM /F-12中。然後在37℃、5% CO
2
下將細胞板培育7-24 h。去除細胞培養基，然後添加30 µL於含有Glutamax、10% FCS、1%非必需胺基酸及1% PeSt之DMEM /F-12中稀釋至最終濃度為1% DMSO之化合物。在37℃、5% CO
2
下將化合物與細胞一起培育17 h (過夜)。使用Meso Scale Discovery (MSD)板來檢測sAPPβ釋放。在室溫下在振盪下將MSD sAPPβ板於Tris洗滌緩衝液(40 µL/孔)中之1% BSA中封阻1 h且在Tris洗滌緩衝液中洗滌1次(40 µL/孔)。將20 µL培養基轉移至預封阻且洗滌之MSD sAPPβ微量板中，且將細胞板進一步用於ATP分析中以量測細胞毒性。在室溫下將MSD板振盪培育2 h且棄除培養基。每孔添加10 µL檢測抗體(1 nM)，隨後在室溫下振盪培育2 h並然後棄除培養基。每孔添加40 µL讀取緩衝液且在SECTOR成像儀中讀取板。
ATP 分析
如sAPPβ釋放分析中所指示，在自細胞板轉移出20 μL培養基用於sAPPβ檢測之後，使用該等板使用來自Cambrex BioScience之量測細胞總ATP之ViaLightTM加上細胞增殖/細胞毒性套組來分析細胞毒性。該分析係根據製造商之方案來實施。簡言之，每孔添加10 μL細胞溶解試劑。將板在室溫下培育10 min。在添加25 μL ViaLightTM加上ATP試劑之後兩分鐘，在Wallac Victor2 1420多標記計數器中量測發光。毒性(tox)臨限值為低於對照之75%之信號。
結論
(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺異構體之IC
50
值匯總於下表15中。
a
來自稀釋FRET分析之IC
50
。
實例 14 ： (1r,1’R,4R)-4- 甲氧基 -5’’- 甲基 -6’-[5-( 丙 -1- 炔 -1- 基 ) 吡啶 -3- 基 ]-3’H- 二螺 [ 環己烷 -1,2’- 茚 -1’2’’- 咪唑 ]-4’’- 胺之樟腦磺酸鹽之活性
可使用下列方法來測試(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽之活性程度：
TR-FRET 分析
TR-FRET中所使用之β-分泌酶製備如下： 使用ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK哺乳動物表現載體選殖人類β-分泌酶(AA 1 - AA 460)之可溶性部分之cDNA。將該基因融合至IgG1之Fc域(親和力標籤)且穩定選殖至HEK 293細胞中。將經純化sBACE-Fc在-80℃下儲存於50 mM甘胺酸(pH 2.5)中，使用1 M Tris將pH調節至pH 7.4，且純度為40%。 在反應緩衝液(乙酸鈉、chaps、triton x-100、EDTA pH4.5)中將酶(截短型)稀釋至6 μg/mL (儲備液為1.3 mg/mL)且將TruPoint BACE1受質稀釋至200 nM (儲備液為120 μM)。在二甲基亞碸(最終DMSO濃度為5%)中混合酶與化合物且在室溫下預培育10分鐘。然後添加受質且在室溫下將反應物培育15分鐘。藉由藉由添加0.35 vol終止溶液(乙酸鈉，pH 9)來終止反應。在激發波長為340-485 nm且發射波長為590-615 nm之Victor II讀板儀上量測產物之螢光。酶之最終濃度為2.7 μg/ml；受質之最終濃度為100 nM (Km為約250 nM)。二甲基亞碸對照(而非測試化合物)定義100%活性程度且0%活性係由不含酶(使用反應緩衝液替代)之孔或由已知抑制劑2-胺基-6-[3-(3-甲氧基苯基)苯基]-3,6-二甲基-5H-嘧啶-4-酮之飽和劑量來定義。對照抑制劑亦用於劑量反應分析中且具有約150 nM之IC50。 在此分析中，(1r,1’R,4R)-4-甲氧基-5’’-甲基-6’-[5-(丙-1-炔-1-基)吡啶-3-基]-3’H-二螺[環己烷-1,2’-茚-1’2’’-咪唑]-4’’-胺之樟腦磺酸鹽具有0.2 nM之平均IC
50
。
sAPP β 釋放分析
將SH-SY5Y細胞於含有Glutamax、10% FCS及1%非必需胺基酸之DMEM /F-12中培養且以7.5-9.5×10
6
個細胞/瓶之濃度冷凍保藏並儲存在‑140℃下。將細胞解凍且以100 μL細胞懸浮液/孔以約10000個細胞/孔之濃度接種至384孔組織培養處理板中之含有Glutamax、10% FCS及1%非必需胺基酸之DMEM /F-12中。然後在37℃、5% CO
2
下將細胞板培育7-24 h。去除細胞培養基，然後添加30 µL於含有Glutamax、10% FCS、1%非必需胺基酸及1% PeSt之DMEM /F-12中稀釋至最終濃度為1% DMSO之化合物。在37℃、5% CO
2
下將化合物與細胞一起培育17 h (過夜)。使用Meso Scale Discovery (MSD)板來檢測sAPPβ釋放。在室溫下在振盪下將MSD sAPPβ板於Tris洗滌緩衝液(40 µL/孔)中之1% BSA中封阻1 h且在Tris洗滌緩衝液中洗滌1次(40 µL/孔)。將20 µL培養基轉移至預封阻且洗滌之MSD sAPPβ微量板中，且將細胞板進一步用於ATP分析中以量測細胞毒性。在室溫下將MSD板振盪培育2 h且棄除培養基。每孔添加10 µL檢測抗體(1 nM)，隨後在室溫下振盪培育2 h並然後棄除培養基。每孔添加40 µL讀取緩衝液且在SECTOR成像儀中讀取板。
ATP 分析
如sAPPβ釋放分析中所指示，在自細胞板轉移出20 μL培養基用於sAPPβ檢測之後，使用該等板使用來自Cambrex BioScience之量測細胞總ATP之ViaLightTM加上細胞增殖/細胞毒性套組來分析細胞毒性。該分析係根據製造商之方案來實施。簡言之，每孔添加10 μL細胞溶解試劑。在室溫下將板培育10 min。添加25 μL重構之ViaLightTM加上ATP試劑後2 min時量測發光。毒性(tox)臨限值為低於對照之75%之信號。
實例 15 ：向阿茲海默氏病之動物模型投與抗體或抗原結合片段及 BACE 抑制劑
將代表性抗體或抗原結合片段(例如Abet0380-GL)及代表性BACE抑制劑(例如
之樟腦磺酸鹽) 組合投與下列代表性動物模型中之任一者中：闡述於Games等人，1995, Nature, 373(6514):523-7中之PDAPP小鼠；闡述於Eketjall等人，2016, Journal of Alzheimer’s Disease, 50(4): 1109-1123中之C57BL/6小鼠或Dunkin-Hartley天竺鼠；闡述於上文實例2中之斯普拉-道來(Sprague-Dawley)大鼠或Tg2576小鼠。向對照動物模型投與相應劑量之僅抗體或抗原結合片段、僅BACE抑制劑單獨或媒劑對照。以與實例2中所闡述一致之方式經靜脈內投與抗體或抗原結合片段。以類似於Eketjall等人所闡述之方式經口投與BACE抑制劑。監測小鼠關於組合療法對小鼠有毒之任何徵象(例如監測虛弱、昏睡、體重損失、死亡之徵象)，且相應地調節每一藥物之劑量以達成最大治療效應，同時最小化任何細胞毒性效應。以類似於上文實例2中及Eketjall等人所闡述之方式監測來自動物之腦、血漿及CSF試樣之生物分析(例如彼等試樣中之Aβ濃度之生物分析)。亦在小鼠中使用業內已知之行為及/或認知分析來評價不同治療條件之效應。投與組合療法之動物模型中大於對照動物模型之測試參數(例如Aβ
n-42
濃度)之改良(例如Aβ
1-42
濃度之較大減小)表明，組合療法較單獨之BACE抑制劑或抗體或抗原結合片段之治療可更有效地解決參數。熟習此項技術者知曉測試組合療法之效應之其他模型及其他參數。例如參見Bogstedt等人，2015, Journal of Alzheimer’s Disease, 46:1091-1101。
參考文獻
Bannister等人(2006).
Biotechnol. Bioeng. 94
, 931-937. Bard, F等人(2000).
Nat. Med. 6
, 916-919. Borchelt等人(1996).
Neuron 17
, 1005-1013. Citron, M.等人(1998).
Neurobiol. Dis. 5
, 107-116. Clackson, T.及Lowman, H. B. (2004).
Phage display: a practical approach
, Oxford University Press. De Strooper, B. (2007).
EMBO Rep. 8
, 141-146. DeMattos, R. B.等人(2001).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98
, 8850-8855. Duff, K.等人(1996).
Nature 383
, 710-713. Foote, J.及Winter, G. (1992).
J. Mol. Biol. 224
, 487-499. Gilman, S.等人(2005).
Neurology 64
, 1553-1562. Glabe, C. (2000).
Nat. Med. 6
, 133-134. Golde, T. E., Das, P.及Levites, Y. (2009). CNS & Neuro. Dis. - Drug Targets
8
, 31-49 Greeve, I.等人(2004).
J. Neurosci. 24
, 3899-3906. Groves, M. A.及Osbourn, J. K. (2005).
Expert Opin. Biol. Ther. 5
, 125-135. Hanes, J., Jermutus, L.及Pluckthun, A. (2000).
Methods Enzymol. 328
, 404-430. Hanes, J.及Pluckthun, A. (1997).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94
, 4937-4942. Hawkins, R. E., Russell, S. J.及Winter, G. (1992).
J. Mol. Biol. 226
, 889-896. Hoet, R. M.等人(2005).
Nat. Biotechnol. 23
, 344-348. Iijima, K.等人(2004).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101
, 6623-6628. Karlsson, R., Michaelsson, A.及Mattsson, L. (1991).
J. Immunol Methods 145
, 229-240. Kuperstein, I.等人(2010).
EMBO J. 29
, 3408-3420. Lambert, M. P.等人(1998).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95
, 6448-6453. Levites, Y.等人(2006).
J. Clin. Invest. 116
, 193-201. Matsuoka, Y.等人(2003).
J. Neurosci. 23
, 29-33. McCafferty, J.等人(1994).
Appl. Biochem. Biotechnol. 47
, 157-171; discussion 171-153. McGowan, E.等人(2005).
Neuron 47
, 191-199. Mucke, L.等人(2000).
J. Neurosci. 20
, 4050-4058. Oganesyan, V.等人(2008).
Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64
, 700-704. Orgogozo, J. M.等人(2003).
Neurology 61
, 46-54. Osbourn, J. K.等人(1996).
Immunotechnology 2
, 181-196. Persic, L.等人(1997).
Gene 187
, 9-18. Portelius, E.等人(2010).
Acta Neuropathol. 120
, 185-193. Pride, M.等人(2008).
Neurodegener. Dis. 5
, 194-196. Schenk, D.等人(1999).
Nature 400
, 173-177. Schenk, D. B.等人(2000).
Arch. Neurol. 57
, 934-936. Scheuner, D.等人(1996).
Nat. Med. 2
, 864-870. Schier, R.等人(1996).
J. Mol. Biol. 255
, 28-43. Selkoe, D. J. (1999).
Nature 399
, A23-31. Thompson, J.等人(1996).
J. Mol. Biol. 256
, 77-88. Tomlinson, I. M.等人(1992).
J. Mol. Biol. 227
, 776-798. Vassar, R.等人(1999).
Science 286
, 735-741. Vaughan, T. J.等人(1996).
Nat. Biotechnol. 14
, 309-314. Walsh, D. M.等人(2002).
Nature 416
, 535-539. Walsh, D. M.等人(2005a).
Biochem. Soc. Trans. 33
, 1087-1090. Walsh, D. M.等人(2005b).
J. Neurosci. 25
, 2455-2462. Wang, H. W.等人(2002).
Brain Res. 924
, 133-140. Weller, R. O.及Nicoll, J. A. (2003).
Neurol. Res. 25
, 611-616. Wilcock, D. M.等人(2006).
J. Neurosci. 26
, 5340-5346. Wilcock, D. M.及Colton, C. A. (2009).
CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 8
, 50-64. Younkin, S. G. (1995).
Ann. Neurol. 37
, 287-288. Younkin, S. G. (1998).
J. Physiol. Paris 92
, 289-292. 其他參考文獻包含於文件中。