WO2013147076A1 - インテグリンα8β1の機能を阻害する事による線維化の抑制 - Google Patents

インテグリンα8β1の機能を阻害する事による線維化の抑制 Download PDF

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恭之 横崎
教尚 西道
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Definitions

  • the present invention relates to an antifibrotic agent.
  • Fibrosis is generally known as a disease caused by a tissue that hardens and loses its normal function when a connective tissue containing collagen or the like grows and is replaced with a normal tissue. It occurs in the liver, lungs, kidneys, heart, skin, etc. For example, when a large amount of fibrosis occurs in liver tissue, cirrhosis results.
  • Non-Patent Document 1 describes the results of examining gene expression in lungs that developed fibrosis. According to the results, 178 genes were highly expressed in fibrotic lung tissue, and about 1000 genes were highly expressed unless caught by a significant difference (p ⁇ 0.01 in TNoM and Student's t-test). is doing.
  • Non-Patent Document 2 describes that integrin ⁇ 8 ⁇ 1 was highly expressed in lungs that developed fibrosis.
  • Patent Document 1 describes an antibody that inhibits the binding of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its ligand.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1 do not describe the results of treating fibrosis. Fibrosis is a particularly difficult disease to treat among various diseases. It tells us that there is only one existing marketed therapeutic to the best of our knowledge. One of them is the general name pirfenidone (Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.). Moreover, even that single therapeutic agent is a therapeutic agent approved only in Japan, and the US FDA has not been approved as an ineffective drug.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel and effective antifibrotic agent.
  • the inventors of the present application in 1) fibrosis model mice 1) improvement of fibrosis findings in histopathological images, 2) collagen ⁇ 1 (I) and smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) Suppression of increase in gene expression level or protein level 3) Suppression of increase in hydroxyproline level reflecting the amount of collagen accumulated as an index of fibrosis. In order to suppress this, it was effective to administer a substance that inhibits the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the increase / decrease and distribution pattern of gene expression in fibrotic tissues were examined.
  • the amount and distribution may change because the molecules do not necessarily require the action of the molecule, but share the expression regulation mechanism with other molecules. Therefore, there are generally many molecules whose expression is enhanced in one disease state.
  • the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 no one has been able to show functional evidence related to fibrosis in the past, but the present inventors have revealed this for the first time in the examples described later. In this example, it was surprising that at the animal level, a clear change (improvement) in histopathological findings and suppression of the above indicators were observed.
  • an antifibrotic agent comprising an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist is provided. If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed.
  • the present invention also provides an antifibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically binds to at least one amino acid in the cap subdomain of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region. If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed.
  • a therapeutic agent for a disease that occurs with the progression of fibrosis including an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist. If this therapeutic agent is used, the disease which arises with the progress of fibrosis can be treated.
  • fibrosis can be suppressed by using a novel and effective antifibrotic agent.
  • FIG. 1 shows the results of thawing a human ⁇ 9-introduced chicken cell line with a surfactant and immunoprecipitation with an anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2.
  • FIG. 2 shows the results of FACS analysis using a human ⁇ 9-introduced chicken cell line and anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of FACS analysis by reacting the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 wild type, R120 mutant, and P161 mutant with the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example.
  • FIG. 1 shows the results of thawing a human ⁇ 9-introduced chicken cell line with a surfactant and immunoprecipitation with an anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2.
  • FIG. 2 shows the results of FACS analysis using a human ⁇ 9-introduced chicken cell line and anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of FACS analysis by reacting the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody or control ⁇ 8 antibody according to the Example with the R120 mutant (stable expression strain) of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • FIG. 5 shows the results obtained by measuring the inhibitory activity against the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example.
  • FIG. 6 shows the results obtained by measuring the cross-reactivity of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to Example to human and mouse sputum integrin ⁇ 8 ⁇ 1 by FACS analysis.
  • FIG. 5 shows the results obtained by measuring the inhibitory activity against the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example.
  • FIG. 6 shows the results obtained by measuring the cross-reactivity of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to Example to human and mouse sputum integrin ⁇ 8 ⁇ 1 by FACS analysis.
  • FIG. 7 shows the results obtained by measuring the cross-reactivity of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to Example to human and rat sputum integrin ⁇ 8 ⁇ 1 by FACS analysis.
  • FIG. 8 shows the result of alignment of R120 of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 derived from each tumor organism and the amino acid sequence of the surrounding region.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining the administration schedule of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the Example to the BDL mouse.
  • FIG. 10 is a photograph of a liver section of a BDL mouse stained with Masson trichrome when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example is administered or not.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the expression levels of Col ⁇ 1 (I) and ⁇ -SMA in the liver of a BDL mouse when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example is administered or not.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the hydroxyproline content in the liver of BDL mice when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example is administered or not.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the administration schedule of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example to CCl 4 mice.
  • FIG. 14 is a photograph of a liver section of CCl 4 mice stained with Masson trichrome when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example is administered or not.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the protein expression level of ⁇ -SMA in the liver of a CCl 4 mouse when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example was administered or not.
  • FIG. 16 shows the results of measurement of hydroxyproline content in the liver of CCl 4 mice when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example was administered or not.
  • FIG. 17 is a view for explaining the administration schedule of an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to Example to a pulmonary fibrosis mouse.
  • FIG. 18 is a photograph of lung sections of pulmonary fibrosis mice stained with HE when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example is administered or not.
  • FIG. 19 shows the results of measuring the expression levels of Col ⁇ 1 (I) and ⁇ -SMA in the lungs of pulmonary fibrosis mice when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example was administered or not.
  • FIG. 20 shows the results of measuring the change in body weight of pulmonary fibrosis mice when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example was administered or not.
  • FIG. 21 shows the results of measurement of hydroxyproline content in the lungs of pulmonary fibrosis mice when the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example was administered or not.
  • FIG. 22 shows the results obtained by measuring the inhibitory activity against anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the example.
  • FIG. 23 shows the results of FACS analysis of the cross-reactivity of anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibodies according to Examples to human and mouse sputum integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of FACS analysis by reacting the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 S132 mutant (stable expression strain) with the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody or control ⁇ 8 antibody according to Example.
  • One embodiment of the present invention is a novel antifibrotic agent.
  • This antifibrotic agent is, for example, an antifibrotic agent including an antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • An integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist can inhibit fibrosis, as demonstrated in the examples described below. Therefore, fibrosis can be suppressed by using an antifibrotic agent having the above configuration.
  • fibrosis is typically known as a disease caused by the growth of connective tissue composed of collagen or the like and the replacement of the tissue with normal tissue, resulting in loss of normal function due to tissue hardening. Yes. For example, it occurs in the liver, lungs, kidneys, heart, skin, and the like. For example, when a large amount of fibrosis occurs in the liver tissue, cirrhosis is caused. In addition to cirrhosis, malignant tumors may develop in each tissue as fibrosis progresses.
  • integrin ⁇ 8 ⁇ 1 is a receptor protein that is typically present on the cell membrane surface as a heterodimer composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain.
  • DNA sequence and amino acid sequence of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 refer to, for example, GenBank, which is a database of National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • the amino acid sequence of the ⁇ chain may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, for example.
  • the amino acid sequence of the ⁇ chain may be, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the ⁇ chain and the ⁇ chain include a form including or not including a signal peptide. Examples of the ligand include osteopontin, fibronectin, vitronectin, and tenascin.
  • the form of the antagonist is not particularly limited, but an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that inhibits the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and a ligand is preferable.
  • an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically binds to at least one amino acid in the cap subdomain of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region is preferable.
  • the antagonist is preferably an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically binds to R120 of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region, or S132 and its peripheral region.
  • the antagonist is preferably an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that can bind to any integrin ⁇ 8 ⁇ 1 derived from human, mouse, or rat.
  • the antagonist is preferably an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that inhibits the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • the antagonist is preferably an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that has no binding property to the R120K mutant or S132A mutant of the integrin ⁇ 8 chain and has binding property to the wild type of the integrin ⁇ 8 chain.
  • the antagonist comprises that the heavy chain CDRs 1, 2, and 3 comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, and the light chain CDRs 1, 2, and 3 are SEQ ID NOs: 4, 5, and An anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody comprising 6 amino acid sequences is preferred.
  • the antagonist is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its ligand, and may be, for example, an antibody, a protein, a low molecular compound, a high molecular compound, or a nucleic acid.
  • one embodiment of the present invention is an antifibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically binds to R120 of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region, or S132 and its peripheral region.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically recognizes R120 of the integrin ⁇ 8 chain and its surrounding region, or S132 and its surrounding region, can suppress fibrosis, as demonstrated in Examples described later. Therefore, fibrosis can be suppressed by using an antifibrotic agent having the above configuration.
  • one embodiment of the present invention is an anti-fibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that specifically binds to at least one amino acid in the cap subdomain of the integrin ⁇ 8 chain, or the amino acid and its peripheral region. If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed.
  • An embodiment of the present invention also includes an anti-fibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that has no binding to the R120K mutant or S132A mutant of the integrin ⁇ 8 chain and has binding to the wild type of the integrin ⁇ 8 chain. It is. Anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that does not bind to the integrin ⁇ 8 chain R120K mutant or S132A mutant and binds to the wild type of the integrin ⁇ 8 chain, as demonstrated in the examples below, fibrosis. Can be suppressed. Therefore, fibrosis can be suppressed by using an antifibrotic agent having the above configuration.
  • One embodiment of the invention also includes an anti-fibrin comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that is not binding to one or more cap subdomain variants of the integrin ⁇ 8 chain and has binding to the wild type of the integrin ⁇ 8 chain.
  • Agent If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed.
  • the integrin ⁇ 8 chain cap subdomain variant is a mutant integrin ⁇ 8 chain in which at least one amino acid in the cap subdomain is mutated.
  • an antibody that does not bind to a cap subdomain mutant only needs to have binding ability to at least one mutant, and an amino acid in a cap subdomain different from that mutant is mutated. It may have a binding property to the mutant.
  • One embodiment of the present invention is an antifibrotic agent comprising a polynucleotide encoding an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that inhibits the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that inhibits the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 can suppress fibrosis, as demonstrated in Examples described later. Therefore, if an antifibrotic agent having the above-described configuration is used, fibrosis can be suppressed as a result of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody being expressed from the polynucleotide.
  • one embodiment of the present invention is an antifibrotic agent comprising an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist precursor.
  • An integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist can inhibit fibrosis, as demonstrated in the examples described below. Therefore, if an antifibrotic agent having the above-described configuration is used, fibrosis can be suppressed as a result of the formation of the antagonist from the precursor.
  • one embodiment of the present invention is an antifibrotic agent comprising an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 function inhibitor. Inhibiting the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 can suppress fibrosis, as demonstrated in the examples described below. Therefore, fibrosis can be suppressed by using an antifibrotic agent having the above configuration.
  • one embodiment of the present invention is a method for suppressing or treating fibrosis using the antagonist or anti-fibrotic agent according to this embodiment. According to this method, by suppressing fibrosis, it is possible to treat a disease that occurs with the progression of fibrosis or fibrosis.
  • One embodiment of the present invention is a collagen accumulation inhibitor containing an antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1. Or it is the method of suppressing accumulation of collagen.
  • the antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 can suppress the accumulation of collagen as demonstrated in the examples described later. Therefore, if a collagen accumulation inhibitor having the above-described configuration is used, collagen accumulation can be suppressed.
  • One embodiment of the present invention is an expression inhibitor of collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA containing an antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • it is a method of suppressing the expression of collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA.
  • the antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 can suppress the expression of collagen ⁇ 1 (I) and ⁇ -SMA, as demonstrated in Examples described later. Therefore, the expression of collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA can be suppressed by using the collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA expression inhibitor having the above-described configuration.
  • GenBank etc. can be referred for the amino acid sequence and DNA sequence of collagen ⁇ 1 (I) and ⁇ -SMA.
  • one embodiment of the present invention is a hydroxyproline production inhibitor containing an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist. Or it is the method of suppressing the production of hydroxyproline.
  • the antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 can suppress the production of hydroxyproline, as demonstrated in the examples described below. Therefore, if the hydroxyproline production inhibitor which has the said structure is used, the production of hydroxyproline can be suppressed.
  • the quantification of hydroxyproline may be performed, for example, according to the procedure described in the examples below, or in “Inayama et al., Keio J Med. Vol.27, No.1, 43-46 (1978)”. You may carry out by the method of description.
  • the collagen ⁇ 1 (I) or non-normal cell expressing the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and having an increased expression level of collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA compared to normal cells a method for inhibiting the expression of ⁇ -SMA, comprising a step of bringing an antagonist of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 into contact with the non-normal cell. According to this method, the disease can be suppressed by inhibiting the expression of collagen ⁇ 1 (I) or ⁇ -SMA.
  • Another embodiment of the present invention is a method for inhibiting the production of hydroxyproline in an abnormal tissue that expresses integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and has an increased amount of hydroxyproline produced as compared to a normal tissue.
  • a method comprising the step of contacting an antagonist of ⁇ 8 ⁇ 1 and the non-normal tissue. According to this method, the disease can be suppressed by inhibiting the production of hydroxyproline.
  • R120 of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region represent the amino acid sequence at positions 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, or 126 of the integrin ⁇ 8 chain.
  • the containing region is preferred. Alternatively, it may be a region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 of the integrin ⁇ 8 chain.
  • the peripheral region is not particularly limited as long as it includes a region that becomes an epitope of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody.
  • the above-mentioned positions 114 to 126 are positions calculated based on the integrin ⁇ 8 chain when the signal peptide is included.
  • positions 114 to 126 above are positions 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, and 88.
  • the amino acids corresponding to may be respectively represented.
  • the specific binding of an antibody to a specific region includes recognition of the specific region as an epitope by the antibody. Recognizing as an epitope includes recognizing as a part of an epitope. That an antibody specifically binds to a specific amino acid and its peripheral region includes that the antibody specifically recognizes and binds to the specific amino acid and its surrounding three-dimensional structure.
  • S132 of integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region represent the amino acid sequence at positions 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, or 138 of integrin ⁇ 8 chain. It may be an area to include.
  • the 126th to 138th positions are positions calculated based on the integrin ⁇ 8 chain when the signal peptide is included. Therefore, when the integrin ⁇ 8 chain does not contain a signal peptide, positions 126 to 138 are positions 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, and 100.
  • the amino acids corresponding to may be respectively represented.
  • the peripheral region of the amino acid is, for example, a region recognized by the antibody according to the present embodiment as an epitope.
  • the peripheral region of the amino acid may include 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids before and after the amino acid as long as the antibody recognizes it as an epitope.
  • the cap subdomain of the integrin ⁇ chain may contain cap subdomain inserts 1 to 4.
  • the ⁇ chain site to which the antibody according to this embodiment binds is preferably in the insert 1 from the viewpoint of stably suppressing fibrosis.
  • Insert 1 is, for example, integrin ⁇ chain 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, or 132. It may be a rank.
  • the above-mentioned positions 113 to 132 may mean amino acids corresponding to positions 75 to 94, respectively.
  • Insert 2 is, for example, at positions 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, or 171 of the integrin ⁇ chain. Also good. When the integrin ⁇ 8 chain does not contain a signal peptide, the above positions 154 to 171 may mean amino acids corresponding to positions 116 to 133, respectively. Insert 3 may be, for example, at position 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, or 199 of the integrin alpha chain.
  • the above positions 187 to 199 may mean amino acids corresponding to positions 149 to 161, respectively.
  • Insert 4 is, for example, at position 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, or 250 of the integrin alpha chain. Also good.
  • the above positions 233 to 250 may mean amino acids corresponding to positions 195 to 212, respectively.
  • An example of the position of the cap subdomain of the integrin family is described, for example, in Xiao et al., Nature. 2004 Nov 4; 432 (7013): 59-67.
  • the state in which the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 is inhibited by the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody is, for example, that the amount of binding when reacting integrin ⁇ 8 ⁇ 1 with its ligand is significantly reduced compared to normal.
  • Significantly decreased may be, for example, a state in which the amount of binding is 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01, or 0 times.
  • This magnification may be equal to or less than any one of the values exemplified here, or within the range of any two values.
  • the function of integrin ⁇ 8 ⁇ 1 is particularly clearly inhibited, it is preferably reduced to 0.5 times or less, more preferably 0.1 times or less.
  • the amount of binding is measured by, for example, contacting the integrin ⁇ 8 ⁇ 1-expressing cells with a plate on which a ligand is immobilized, and measuring the number of adhered cells by absorbance after staining, as in the method described in the Examples below. May be.
  • “significantly” may include, for example, a case where statistical significance is evaluated using Student's t test (one-sided or two-sided) and p ⁇ 0.05. Or the state in which the difference has arisen substantially is included.
  • the state in which the antibody does not bind to the antigen includes a state in which the antibody does not completely bind to the antigen, or a state in which the binding amount of the antibody to the antigen is extremely low.
  • the binding property between the antibody and the antigen may be measured by, for example, flow cytometry analysis (FACS) analysis after reacting the antibody and the antigen-expressing cell.
  • FACS analysis is an analysis method that typically determines the characteristics of a cell by irradiating a cell flowing in a flow cell with laser light and measuring parameters from forward scattered light and side scattered light from the cell.
  • the antibody when the peak when the antibody and the antigen-expressing cell are reacted is substantially or not significantly different from the peak when the antibody and the non-antigen-expressing cell are reacted, the antibody It may be determined that there is no connectivity.
  • the antibody binds to the antigen when the peak when the antibody and the antigen-expressing cell react is substantially or significantly changed compared to the peak when the antibody and the non-antigen-expressing cell react. It may be determined that the state has sex.
  • the state having no binding property is a state in which the binding rate constant (Ka) measured by the surface plasmon resonance measuring apparatus is 0.2, 0.1, 0.05, or 0.01 times that of the case having binding property. Also good. This magnification may be equal to or less than any one of the values exemplified here, or within the range of any two values.
  • the state where gene expression is inhibited includes the state where gene expression is significantly inhibited. Alternatively, it may be 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100% inhibited. This ratio may be greater than or equal to any one of the values exemplified here, or may be within the range of any two values. From the viewpoint of suppressing fibrosis, 50% or more is preferable, and 70% or more is more preferable. Or, for example, the expression level is 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01, or 0 times lower than the expression level of the gene in the tissue in which fibrosis occurs. May be.
  • This magnification may be equal to or less than any one of the values exemplified here, or within the range of any two values. From the viewpoint of suppressing fibrosis, it is preferably reduced to 0.5 times or less, more preferably 0.1 times or less.
  • the state in which the gene expression level is suppressed is the same as the state in which the gene expression level is decreased.
  • the state where the production of hydroxyproline is inhibited includes the state where the production of hydroxyproline is significantly inhibited. Alternatively, it may be 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100% inhibited. This ratio may be greater than or equal to any one of the values exemplified here, or may be within the range of any two values. Or, for example, it includes a state in which the amount of hydroxyproline produced in the tissue in which fibrosis occurs is reduced 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.2, 0.1, or 0 times. This magnification may be equal to or less than any one of the values exemplified here, or within the range of any two values. From the viewpoint of suppressing fibrosis, it is preferably reduced to 0.9 times or less. In the present specification, the state where the production amount of hydroxyproline is suppressed is the same state as the state where the production of hydroxyproline is inhibited.
  • the increase includes, for example, a state where the increase is 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 5, 10, or 40 times.
  • This magnification may be greater than or equal to any one of the values exemplified here, or may be within the range of any two values.
  • the precursor of the ligand includes a substance that can have the same structure as the ligand as a result of a structural change caused by reaction with an arbitrary substance in vivo or in vitro.
  • amino acid is a general term for organic compounds having an amino group and a carboxyl group.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention includes a “specific amino acid sequence”
  • any amino acid in the amino acid sequence may be chemically modified. Even in such a case, it can be said that the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention includes the above-mentioned “specific amino acid sequence”.
  • N-terminal modification for example, acetylation, myristoylation, etc.
  • C-terminal modification for example, amidation, glycosylphosphatidylinositol addition, etc.
  • side chain modification for example, phosphorylation, sugar chain addition, etc.
  • the polynucleotide includes a polynucleotide or a base, or an equivalent thereof composed of a plurality of bonded forms.
  • Nucleotides and bases include DNA bases or RNA bases.
  • the equivalents include, for example, DNA bases or RNA bases that have undergone chemical modification such as methylation, or nucleotide analogs.
  • Nucleotide analogs include unnatural nucleotides.
  • the “base sequence” is a sequence of nucleotides constituting the polynucleotide or an equivalent thereof. In the description of the base sequence, A, T, G, and C include adenine and its equivalent, thymine and its equivalent, guanine and its equivalent, cytosine and its equivalent, respectively.
  • T and U can be interchanged with each other according to the application.
  • Polynucleotides can be synthesized using a DNA / RNA synthesizer. In addition, it can be purchased from a DNA base or RNA base synthesis contract company (for example, Invitrogen). The polynucleotide may be a vector or a plasmid.
  • vectors examples include plasmids derived from Escherichia coli (for example, pET-Blue), plasmids derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110), plasmids derived from yeast (for example, pSH19), animal cell expression plasmids (for example, pA1-11), ⁇ phage, etc.
  • Bacteriophages, virus-derived vectors and the like can be used.
  • These vectors may contain components necessary for protein expression, such as a promoter, a replication origin, or an antibiotic resistance gene.
  • the vector may be an expression vector.
  • a cell can be transformed with a polynucleotide or a vector encoding the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention can be produced by a method known in the art.
  • the transformant may be a cell of a human or other mammal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, cow, monkey, etc.). Examples of mammalian cells include Chinese hamster ovary cells (CHO cells), monkey cells COS-7, and the like. Alternatively, the transformant may be Escherichia genus, yeast or the like.
  • the introduction of the above polynucleotide or vector into cells and the production of antibodies can be performed according to methods known in the art.
  • a method for introducing a polynucleotide or vector into a cell for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, adenovirus method, retrovirus method, microinjection, etc. can be used (Revised 4th edition: Xinjiang Genetic Engineering Handbook) , Yodosha (2003): 152-179.).
  • a production method using antibody cells for example, the method described in "Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 128-142.” Can be used.
  • Antibody purification methods include, for example, ammonium sulfate, ethanol precipitation, protein A, protein G, gel filtration chromatography, anion, cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyl chromatography Apatite chromatography, lectin chromatography, or the like can be used (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 27-52.).
  • bond means a connection between substances.
  • the linkage can be either covalent or non-covalent, and includes, for example, ionic bonds, hydrogen bonds, hydrophobic interactions, or hydrophilic interactions.
  • recognition in an antigen-antibody reaction can be used in the meaning usually used in the field of antibody engineering, and includes, for example, the meaning of specific binding.
  • one or more may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 20 or more, or a range of any of these It may be within.
  • the origin of the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 to which the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention binds is not particularly limited, but human, mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, horse, cat, dog, Any one or more of marmoset, monkey, and chimpanzee may be used.
  • humans are preferable from the viewpoint of using anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody as a therapeutic agent.
  • mice and rats are preferred.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention may be a monoclonal antibody. If it is a monoclonal antibody, it can be made to act on integrin ⁇ 8 ⁇ 1 more efficiently than a polyclonal antibody.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention may be an antibody fragment having antigen binding activity (hereinafter also referred to as “antigen-binding fragment”).
  • antigen-binding fragment an antibody fragment having antigen binding activity
  • there are effects such as an increase in stability or an increase in antibody production efficiency.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention may be an antibody that binds to a wild-type or mutant type of integrin ⁇ 8 ⁇ 1. Variants include those resulting from differences in DNA sequences between individuals. However, the integrin ⁇ 8 chain R120K mutant or S132A mutant preferably has no binding property.
  • the amino acid sequence of the wild type or mutant ⁇ chain preferably has 80% or more homology, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, particularly preferably. Has a homology of 95% or more.
  • the amino acid sequence of the wild-type or mutant ⁇ chain preferably has 80% or more homology, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, particularly preferably Has a homology of 95% or more.
  • the class of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, IgM, IgD, IgG, IgA, or IgE.
  • heavy chain CDR1, 2, and 3 comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, and light chain CDR1, 2, and 3 are represented by SEQ ID NOs: 4, 5, respectively.
  • an anti-fibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody comprising 6 amino acid sequences.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody containing this specific amino acid sequence can suppress fibrosis as demonstrated in Examples described later. Therefore, fibrosis can be suppressed by using an antifibrotic agent having the above configuration.
  • the heavy chain CDR1, 2, and 3 comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively, and the light chain CDR1, 2, and 3 are represented by SEQ ID NOs: 13, 14 respectively. And an anti-fibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody comprising 15 amino acid sequences. If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed. Also, in one embodiment of the present invention, the heavy chain CDR1, 2, and 3 comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17, and 18, respectively, and the light chain CDR1, 2, and 3 are represented by SEQ ID NOs: 19, 20, respectively. And an anti-fibrotic agent comprising an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody comprising 21 amino acid sequences. If this antifibrotic agent is used, fibrosis can be suppressed.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody whose amino acid sequence is specified may have some degree of deletion, substitution, addition or the like.
  • An antibody in which such deletion, substitution, addition or the like has been made can be produced, for example, by site-directed mutagenesis, random mutagenesis, or biopanning using an antibody phage library.
  • site-specific mutagenesis method for example, KOD -Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.) Can be used. It is possible to select an antibody having the same activity as that of the wild type from mutant antibodies into which deletions, substitutions, additions and the like have been introduced by performing various characterizations such as FACS analysis and ELISA.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody has a function of inhibiting the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its agonist, one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added as compared to the wild type. It may be an antibody comprising the amino acid sequence. Alternatively, as long as it has a function of inhibiting the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its agonist, it may be an antibody comprising an amino acid sequence having 90% or more identity compared to the wild type. Alternatively, as long as it has a function of inhibiting the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its agonist, it hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence encoding the wild-type amino acid sequence. It may be an antibody comprising an amino acid sequence encoded by the base sequence of the nucleic acid to be soybeans.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 5, 10, 14, 16, or 20 has a function of inhibiting the binding between the integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and its agonist
  • the amino acid sequence of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody An amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, or 21 indicates that the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody binds integrin ⁇ 8 ⁇ 1 to its agonist.
  • it may be an amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acids of each amino acid sequence are deleted, substituted, inserted or added.
  • the “plurality” may be 15, 10, 8, 6, 4, or 2, It may be less than any of those values. The smaller the number, the better. This is because the smaller the “plurality”, the closer to the original anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody.
  • a polypeptide that has been deleted, added, inserted, or substituted by another amino acid residue of one or more amino acid residues maintains its biological activity (Mark et al ., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep; 81 (18): 5562-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10 (20): 6487-6500., Wang et al. , Science. 1984 Jun 29; 224 (4656): 1431-1433.).
  • the amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, Y), a sulfur atom-containing side chain Amino acids (C, M) having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), and aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) may be mentioned (the parentheses represent single letter symbols of amino acids). Substitutions
  • “90% or more” used for representing amino acid sequence identity may be, for example, 90, 95, 98, 99, or 100%. Alternatively, it may be greater than or within the range of any one of them. A larger number is preferable. This is because the greater the “90% or more”, the closer to the original anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody.
  • the identity may be calculated according to a method known in the art, based on the ratio of the number of amino acids identical in the amino acid sequence between two or more. Before calculating the ratio, the amino acid sequences of the amino acid sequences to be compared are aligned, and a gap is introduced into a part of the amino acid sequence if necessary to maximize the same ratio. Methods for alignment, percentage calculation, comparison methods, and related computer programs are well known in the art (eg, BLAST, GENETYX, etc.). In the present specification, “identity” can be expressed by a value measured by BLAST of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) unless otherwise specified. Blastp can be used with the default setting for Algorithm when comparing amino acid sequences with BLAST. Measurement results are quantified as Positives or Identities.
  • the following conditions can be adopted as stringent conditions.
  • Use low ionic strength and high temperature for washing eg, 50 ° C., 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate
  • a denaturing agent such as formamide (eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, And 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate) or (3) 20% formamide, 5 ⁇ SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / ml denaturation Incubate overnight at 37 ° C.
  • formamide eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody comprises a heavy chain, VH, heavy chain CDR1 to 3 or heavy chain FR1 to 4 encoded by the plasmid of the accession number NITE BP-824, NITE BP-826, or NITE BP-828. You may go out. Alternatively, it may contain a light chain, VL, light chain CDR1 to 3 or light chain FR1 to 4 encoded by the plasmid of accession number NITE BP-825, NITE BP-827, or NITE BP-829.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody may be an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that can be obtained from a cell containing the plasmid of the accession number NITE BP-824, NITE BP-826, or NITE BP-828.
  • the cell may further contain a plasmid having a deposit number of NITE BP-825, NITE BP-827, or NITE BP-829.
  • the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody is obtained from a cell containing a vector encoding the heavy chain or VH of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody encoded by the plasmid of the accession number NITE BP-824, NITE BP-826, or NITE BP-828. It may be an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody.
  • This vector may further encode the light chain or VL of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody encoded by the plasmid of the accession number NITE BP-825, NITE BP-827, or NITE BP-829.
  • the cell may further contain a vector encoding the light chain or VL of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody encoded by the plasmid of the accession number NITE BP-825, NITE BP-827, or NITE BP-829.
  • the plasmid size of the above-mentioned accession number NITENBP-824 is about 6.8 kbp.
  • the size of the region encoding the heavy chain of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody is approximately 1.7 kbp.
  • the plasmid size of the accession number NITE BP-825 is about 6.5 kbp.
  • the size of the region encoding the light chain of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody is about 1 Kbp.
  • an antibody includes a molecule or population thereof that can specifically bind to a particular epitope on an antigen.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody can exist in various forms, for example, Fv, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, diabody, single chain antibody (for example, scFv), dsFv, multispecific antibody ( (E.g., bivalent specific antibody), peptide or polypeptide having antigen binding properties, chimeric antibody (e.g., mouse-human chimeric antibody, etc.), mouse antibody, humanized antibody, human antibody, or equivalents (or equivalents) 1 or more types selected from the group consisting of:
  • the antibody includes an antibody modified product or an antibody unmodified product. In the modified antibody, an antibody and various molecules such as polyethylene glycol may be bound.
  • the modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody using a known technique.
  • a polyclonal antibody is an immunogen containing an antigen of interest in mammals (e.g., rats, mice, guinea pigs, rabbits, cows, monkeys, etc.), birds, etc., in order to induce the production of polyclonal antibodies specific for the antigen. Can be produced.
  • Administration of the immunogen may involve infusion of one or more immunizing agents and, if desired, an adjuvant.
  • Adjuvants may be used to increase the immune response and may include Freund's adjuvant (complete or incomplete), mineral gel (such as aluminum hydroxide), or surfactant (such as lysolecithin) .
  • Immunization protocols are known in the art and may be performed by any method that elicits an immune response, depending on the host organism chosen (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 86-91). .).
  • Monoclonal antibodies include cases where the individual antibodies that make up the population are antibodies that substantially correspond to a single epitope, except for antibodies that have mutations that can occur naturally in small quantities. Alternatively, the individual antibodies that make up the population may be antibodies that are substantially identical except for antibodies that have mutations that can occur naturally in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and differ from normal polyclonal antibodies, which typically include different antibodies corresponding to different epitopes. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are useful in that they can be synthesized from hybridoma cultures that are not contaminated by other immunoglobulins.
  • the form “monoclonal” may be characterized as being derived from a substantially homogeneous population of antibodies, but does not mean that the antibodies must be produced in any particular way.
  • the monoclonal antibody in the present specification is prepared by a method similar to the hybridoma method described in “Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517): 495-497.”. May be.
  • the monoclonal antibody used in the present invention may be produced by a method similar to the recombinant method as described in US Pat. No. 4,816,567.
  • the monoclonal antibody herein can be expressed as “Clackson et al., Nature.
  • Fv is an antibody containing an antigen recognition site.
  • This region contains a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain by non-covalent bonds.
  • the three CDRs of each variable domain can interact to form an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer.
  • Fab is a fragment obtained by treating an antibody containing the Fab region and Fc region with the proteolytic enzyme papain, and approximately half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are linked via a part of disulfide bonds.
  • Antibody. Fab can be obtained, for example, by treating the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to an embodiment of the present invention containing a Fab region and an Fc region with the proteolytic enzyme papain.
  • F (ab ′) 2 is, for example, an antibody containing two sites corresponding to Fab among fragments obtained by treating an antibody containing Fab region and Fc region with proteolytic enzyme pepsin.
  • F (ab ′) 2 can be obtained, for example, by treating the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention containing the Fab region and the Fc region with the proteolytic enzyme pepsin. For example, it can be prepared by linking the following Fab ′ with a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ′ is, for example, an antibody obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • F (ab ′) 2 can be obtained by treating with a reducing agent dithiothreitol.
  • ScFv is an antibody in which VH and VL are linked via an appropriate peptide linker.
  • scFv obtains cDNA encoding VH and VL of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention, constructs a polynucleotide encoding VH-peptide linker-VL, and incorporates the polynucleotide into a vector Can be produced using cells for expression.
  • Diabody is an antibody having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • diabody constructs a polynucleotide encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, incorporates the obtained polynucleotide into a vector, and produces it using expression cells. it can.
  • DsFv is an antibody in which a polypeptide in which a cysteine residue is introduced into VH and VL is bound via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the position to be introduced into the cysteine residue should be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Reiter et al., Protein Eng. 1994 May; 7 (5): 697-704.) Can do.
  • An antigen-binding peptide or polypeptide is an antibody comprising antibody VH, VL, or CDR1, 2, or 3 thereof.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • Fv etc. DNA encoding a region such as Fv in the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention can be incorporated into an expression vector and produced using an expression cell. Alternatively, it may be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBOC method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBOC method t-butyloxycarbonyl method
  • the antigen-binding fragment may be one or more of Fv and the like.
  • Chimeric antibodies are typically those in which variable regions of antibodies between heterologous organisms and antibody constant regions are linked, and can be easily constructed by gene recombination techniques.
  • Methods for producing chimeric antibodies are known in the art.
  • a mouse-human chimeric antibody can be produced by the method described in “Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1; 91 (3): 969-973.”.
  • the basic method for producing a mouse-human chimeric antibody is, for example, encoding the mouse leader sequence and variable region sequence present in the cloned cDNA, the human antibody constant region already present in the expression vector of a mammalian cell.
  • the mouse leader sequence and variable region sequence present in the cloned cDNA may be linked to a sequence encoding a human antibody constant region and then linked to a mammalian cell expression vector.
  • the fragment of the human antibody constant region can be of any human antibody H chain constant region and human antibody L chain constant region, for example, for human H chain, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3 or C ⁇ 4, For the L chain, C ⁇ or C ⁇ can be mentioned, respectively.
  • a humanized antibody typically has one or more CDRs from a non-human species and a framework region (FR) from a human immunoglobulin, as well as a constant region from a human immunoglobulin, to the desired antigen. It is an antibody that binds.
  • Humanization of antibodies can be performed using various techniques known in the art (Almagro et al., FRont Biosci. 2008 2008 Jan 1; 13: 1619-1633.). For example, CDR grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.), Re-surfacing (roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A.
  • FR shuffle (Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.).
  • amino acid residues in the human FR region may be substituted with corresponding residues from the CDR donor antibody. This FR substitution can be performed by methods well known in the art (Riechmann et al., Nature, 1988 Mar 24; 332 (6162): 323-327.).
  • FR residues important for antigen binding may be identified by modeling the interaction of CDR and FR residues.
  • unusual FR residues at specific positions may be identified by sequence comparison.
  • a human antibody is typically an antibody in which a variable region and a constant region of a heavy chain and a region including a variable region and a constant region of a light chain that constitute an antibody are derived from a gene encoding human immunoglobulin.
  • the main production methods include a transgenic mouse method for producing human antibodies, a phage display method, and the like.
  • the transgenic mouse method for producing human antibodies if a functional human Ig gene is introduced into a mouse in which endogenous Ig has been knocked out, human antibodies having various antigen-binding abilities can be produced instead of mouse antibodies. Furthermore, if this mouse is immunized, a human monoclonal antibody can be obtained by a conventional hybridoma method.
  • phage display method a foreign gene is fused to the N-terminal side of the coat protein (g3p, g10p, etc.) of filamentous phages such as M13 and T7, which are typically E. coli viruses. It is a system for expressing as a protein. For example, it can be prepared by the method described in “Vaughan et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14 (3): 309-314.”.
  • the antibody may be any antibody by CDR-grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.) Or the heavy chain CDR of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention or It may be prepared by grafting light chain CDRs.
  • a region excluding the heavy chain CDR or light chain CDR of the DNA encoding the heavy chain CDR or light chain CDR of the anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody according to the embodiment of the present invention and a known human or non-human organism antibody Can be obtained by ligation to a vector according to a method known in the art and then expressing the DNA using a known cell.
  • a method known in the art for example, a method of randomly mutating amino acid residues of the antibody and screening for highly reactive ones, or The region excluding the heavy chain CDR or light chain CDR may be optimized using a phage display method or the like.
  • FR shuffle (Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.), or a method of replacing amino acid residues or packaging residues of vernier zones (JP 2006-241026, or Foote et al., J J Mol Mol Biol. 1992 Mar 20; 224 (2): 487-499.) May be used to optimize the FR region.
  • Heavy chain is the main component of full-length antibody. Typically, it is linked to the light chain by a disulfide bond and a non-covalent bond.
  • VH variable region
  • the amino acid sequence is not constant even for antibodies of the same class, and in general, VH has a large specificity and affinity for antigen. It is known to contribute.
  • VH-only molecule was produced in "Reiter et al., J Mol Biol. 1999 Jul 16; 290 (3): 685-98.”, It was found to bind specifically to the antigen with high affinity. Is described.
  • “Wolfson W, Chem Biol. 2006 13 Dec; 13 (12): 1243-1244.” Describes that among camel antibodies, there is only a heavy chain antibody without a light chain. Has been.
  • CDR complementarity determining region
  • Fv variable region: including heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL)
  • CDR1, CDR2, and CDR3 consisting of about 5 to 25 amino acid residues.
  • CDR3 is known to have the highest contribution in the binding of antibodies to antigens.
  • CDR is a region that determines the specificity of an antibody for an antigen
  • the amino acid sequence varies greatly between antibodies, and is also referred to as a hypervariable region.
  • the Fv region other than CDR is called the framework region (FR) and consists of FR1, FR2, FR3, and FR4, and is relatively well conserved among antibodies (Kabat et al., ⁇ Sequence of Proteins of Immunological Interest '' US Dept. Health and Human Services, 1983.). That is, it can be said that the factor characterizing the reactivity of the antibody is heavy chain CDR3, and then heavy chain CDR.
  • Kabat's definition (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), or Chothia's definition (Chothia et al.,. J. Mol. , 1987; 196: 901-917) may be employed.
  • the definition of Kabat is adopted as a preferred example, but it is not necessarily limited to this.
  • the determination may be made in consideration of both the Kabat definition and the Chothia definition.
  • an overlapping part of the CDR according to each definition or a part including both the CDRs according to each definition can also be a CDR.
  • Martin et al.'S method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86, which uses Oxford-Molecular's-AbM-antibody-modeling-software), which is a compromise between the definition of Kabat and the definition of Chothia. : 9268-9272).
  • the anti-fibrotic agent includes a therapeutic agent for suppressing fibrosis.
  • the therapeutic agent of the disease which arises with progress of fibrosis is included.
  • the antifibrotic agent may be an agent for suppressing fibrosis for use in regenerative medicine.
  • the treatment means that the subject's disease (including fibrosis) or one or more symptoms associated with the disease can exhibit a symptom improving effect or a preventive effect.
  • Therapeutic agents include prophylactic agents.
  • the antifibrotic agent may be a pharmaceutical composition containing one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition can be produced by any method known in the technical field of pharmaceutics, for example, by mixing the active ingredient and the carrier.
  • the anti-fibrotic agent may be one that uses an active ingredient alone or may be used by mixing with an optional ingredient.
  • the shape of the carrier is not particularly limited.
  • an effective route for treatment for example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or oral administration.
  • the administration form may be, for example, an injection, capsule, tablet, granule or the like.
  • An aqueous solution for injection may be stored in, for example, a vial or a stainless steel container.
  • the aqueous solution for injection may contain, for example, physiological saline, sugar (for example, trehalose), NaCl, or NaOH.
  • the antifibrotic agent may contain, for example, a buffer (for example, phosphate buffer), a stabilizer and the like.
  • the dose is not particularly limited, but may be, for example, 0.25 or 0.5 mg / body at a time, and may be within the range of those values.
  • the dosing interval is not particularly limited, and for example, it may be administered every 3 days for 2 weeks or twice a week for 4 weeks.
  • the dose, administration interval, and administration method can be appropriately selected depending on the age, weight, symptom, target organ, etc. of the subject. It may also be administered in combination with an appropriate chemotherapeutic agent.
  • the antifibrotic agent preferably contains a therapeutically effective amount or an effective amount of an active ingredient that exhibits a desired action.
  • a subject is a human or a mammal other than a human (e.g., mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, cat, dog, marmoset, monkey, chimpanzee, etc. Any one or more).
  • a human e.g., mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, cat, dog, marmoset, monkey, chimpanzee, etc. Any one or more).
  • Example 1 Preparation of anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody (1) Immunization Mouse Integrin ⁇ 8 chain cDNA was cloned into a mammalian expression vector. Next, the expression vector was transfected into a chicken lymphoblastoid cell line by electroporation, and then a drug was added to select expression cells. The resulting mouse integrin ⁇ 8 chain expressing cell line was hyperimmunized to chickens. The antibody titer in chicken serum was measured by flow cytometry (FACS) analysis. For FACS analysis, the general protocol of FACSCalibur (BD, USA) was followed.
  • FACS flow cytometry
  • this human ⁇ 9-introduced chicken cell line was thawed with a surfactant and immunoprecipitated with an anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2 (FIG. 1).
  • Two bands appear in lane 1, indicating that the human ⁇ 9 chain forms a complex with other molecules.
  • Lane 2 is immunoprecipitation of ⁇ 9-transfected SW480 (human colon cancer cell line) expressing integrin ⁇ 9 ⁇ 1, and it can be seen that the two bands in Lane 1 are ⁇ 9 chain and ⁇ 1 chain.
  • FACS analysis was performed using a human ⁇ 9-introduced chicken cell line and anti-human ⁇ 9 antibody Y9A2 (FIG. 2). Compared to the histogram of unstained cells, the histogram shifts to the right when reacted with antibody, indicating that human ⁇ 9 is expressed on the membrane surface. Therefore, it is considered that a heterodimer of ⁇ 8 chain and ⁇ 1 chain is also formed in the integrin ⁇ 8 chain expressing cell line.
  • the amino acid sequence of the mouse mouse integrin ⁇ 8 chain is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the plasmid containing the DNA sequence encoding the heavy chain of the # 3 antibody, # 5 antibody, or # 26 antibody is a product of the National Institute of Technology and Evaluation, the Patent Microorganism Deposit Center (2-5 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture). -8) are deposited in Japan on October 16, 2009. Thereafter, the plasmids deposited in Japan were transferred to international deposits based on the Budapest Treaty on October 12, 2010 under the accession numbers NITE BP-824, NITE BP-826, or NITE BP-828, respectively.
  • plasmids containing the DNA sequence encoding the # 3 antibody, # 5 antibody, or # 26 antibody light chain were deposited domestically on October 16, 2009, respectively, at the National Institute of Technology and Evaluation of the National Institute of Technology and Technology. Has been. Further, the plasmids deposited in Japan were transferred to international deposits based on the Budapest Treaty on October 12, 2010 under the accession numbers NITE BP-825, NITE BP-827, or NITE BP-829, respectively. These six deposited plasmids were prepared using the expression vector in (5) above.
  • heavy chains CDR1, 2, and 3 of antibody # 3 are SYDMV (SEQ ID NO: 1), IYSAGSGPQYAPAVKG (SEQ ID NO: 2), and ADSTYCASGSCYAADSID (SEQ ID NO: 3), respectively.
  • the light chains CDR1, 2, and 3 of antibody # 3 are SGGGSWYG (SEQ ID NO: 4), DNTNRPS (SEQ ID NO: 5), and GSADSTDAV (SEQ ID NO: 6), respectively.
  • CDR is a site involved in antigen binding specificity of anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody.
  • the heavy chains CDR1, 2, and 3 of the # 5 antibody are SYDMA (SEQ ID NO: 10), IDDDDSFTLYGAAVKG (SEQ ID NO: 11), and VGDGYCGWSACGGSID (SEQ ID NO: 12), respectively. Further, the light chains CDR1, 2, and 3 of antibody # 5 are SGDESYYG (SEQ ID NO: 13), SNDKRPS (SEQ ID NO: 14), and GXYDSSTYAGI (SEQ ID NO: 15), respectively.
  • the heavy chains CDR1, 2, and 3 of the # 26 antibody are GHDMA (SEQ ID NO: 16), IGSSGSNTNYGTAVKG (SEQ ID NO: 17), and PGSCYGCTPDAGEID (SEQ ID NO: 18), respectively.
  • the light chains CDR1, 2, and 3 of the # 26 antibody are SGSSGSYYGY (SEQ ID NO: 19), ESTKRPS (SEQ ID NO: 20), and GNEDSSYVGI (SEQ ID NO: 21), respectively.
  • X represents an amino acid that could not be analyzed in the amino acid analysis.
  • Example 2 Epitope evaluation Eight human ⁇ 8 chain cDNAs (R120, K125, S132, P161, Y199, A238, A260, S261) were prepared, and CHO cells were expressed transiently. Reacted. Antibody # 3 retained reactivity with wild-type and 7 mutants (K125, S132, P161, Y199, A238, A260, S261), but with R120 mutated (R120 mutant) ) Did not react. FIG. 3 shows the results of FACS analysis by reacting # 3 antibody with wild type, R120 mutant, and P161 mutant.
  • Example 3 Evaluation of inhibitory activity against integrin ⁇ 8 ⁇ 1 Mouse osteopontin (2.5 mg / ml) was immobilized on a 96-well plate. Next, ⁇ 8-expressing K562 cells were added to the plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, and # 3 antibody was added at the concentration shown in FIG. In FIG. 5, A570nm detects adherent cells. The lower the A570nm value, the less the binding between ⁇ 8-expressing K562 cells and osteopontin.
  • antibody # 3 inhibited the binding between ⁇ 8-expressing K562 cells and osteopontin (FIG. 5). That is, antibody # 3 functioned as an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist. Further, when the antibody-free time was 100, an inhibitory activity of 60% or more was observed at an antibody concentration of 0.05 ⁇ g / ml. Further, an inhibitory activity of 70% or more was observed at an antibody concentration of 0.10 ⁇ g / ml, and an inhibitory activity of 95% or more was observed at an antibody concentration of 0.25 ⁇ g / ml or more.
  • Example 4 Evaluation of cross-reactivity (1) Evaluation of reactivity to human and mouse integrin ⁇ 8 ⁇ 1 Using # 3 antibody to human integrin ⁇ 8 chain expressing SW480 cell line and mouse integrin ⁇ 8 chain expressing SW480 cell line Cross reactivity was investigated by FACS analysis. The results are shown in FIG. When using either the human integrin ⁇ 8 chain expressing SW480 cell line or the mouse integrin ⁇ 8 chain expressing SW480 cell line, the peak position is clearly on the right side when the # 3 antibody is reacted compared to when it is not reacted. Shifted. Also, there was no change in the peak at the time of Mock. This indicates that antibody # 3 can bind to both human and mouse integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • Rat integrin ⁇ 8 chain cDNA was cloned and transiently expressed in CHO cells, and the reactivity with # 3 antibody was confirmed by FACS.
  • As a positive control transiently expressing cells of human integrin ⁇ 8 subunit were used.
  • antibody # 3 reacted with rat integrin ⁇ 8 chain.
  • the reactivity was similar to that when reacted with human integrin ⁇ 8 chain.
  • BDL Biliary ligation model mouse
  • FIG. 10 is a tissue image around a triad consisting of a bile duct, a portal vein, and a hepatic artery.
  • the upper panel shows the case where # 3 antibody was not administered.
  • the amount of collagen fibers stained blue is increased, and newly formed micro bile ducts are observed, resulting in bile duct hyperplasia.
  • the epithelium proliferates in a relatively large bile duct, and infiltration of inflammatory cells is seen around the bile duct. Red color is liver parenchymal cells.
  • the lower panel shows the case of # 3 antibody administration. Compared to the upper panel, the lower panel shows a similar increase in microbile ducts, but the degree of increase in collagen fibers is significantly less. It can be seen that bile duct ligation increases the internal pressure of the bile duct and increases the bile duct, but the accompanying fibrosis is suppressed by antibody administration.
  • Col ⁇ 1 (I) expression increased more than 40 times in BDL mice compared to normal mice. This value decreased to a value of 10 times or less by administration of # 3 antibody. That is, the administration of # 3 antibody inhibited the expression of Col ⁇ 1 (I) in BDL mice by 75% or more. In addition, the expression of ⁇ -SMA increased about 9 times or more in BDL mice than in normal mice. This value decreased to 5 times or less by administration of # 3 antibody. That is, the administration of # 3 antibody inhibited the expression of Col ⁇ 1 (I) in BDL mice by about 50%.
  • mouse liver tissue was homogenized in 6N HCl to 100 mg / ml.
  • the mixture was centrifuged at 800 ⁇ g for 15 minutes to recover the supernatant.
  • 266 ⁇ l of dH 2 O was added to make a total of 0.3 ml.
  • 0.1 ml of chloramine-T solution was added.
  • the chloramine-T solution was 0.336 g (final 0.84%) of chloramine-T, 0.56 ml (final 42 mM) of 3M NaOAc, 0.02 g (final 2.6 mM) of citric acid, and 15.8 ml (final 39.5%) of isopropanol.
  • dimethylbenzaldehyde solution a solution in which 0.248 g of p-dimethylaminobenzaldehyde, 0.27 ml of perchloric acid (60%) and 0.73 ml of isopropanol were mixed was used.
  • CCl 4 mouse Evaluation of therapeutic effect using carbon tetrachloride-induced fibrosis model mouse (CCl 4 mouse)
  • CCl 4 mouse 50% carbon tetrachloride using olive oil as a solvent was subcutaneously administered to the mice at 2 ml / kg body.
  • endotoxin-free # 3 antibody was administered at 0.25 mg / body twice per week for 4 weeks in the peritoneum of mice.
  • CCl 4 mice not administered with anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody were also prepared.
  • the fibrosis index was measured as follows.
  • Example 7 Evaluation of therapeutic effect using bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mouse (pulmonary fibrosis mouse) (1) Administration to pulmonary fibrosis mouse As shown in FIG. For induction of crystallization, bleomycin (Nippon Kayaku) was administered into the trachea of mice at 1.25 U / kg body to produce bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice. In addition, endotoxin-free # 3 antibody was administered at 10 mg / body intraperitoneally in mice every 3 days for 2 weeks. As a control, a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mouse in which physiological saline was administered into the peritoneal cavity was also prepared and compared. Furthermore, the fibrosis index was measured as follows.
  • FIG. 20 shows the relative expression level when the expression level in the # 3 antibody-administered mouse is 1.
  • the expression of ⁇ -SMA was 4 times or more and that of Col1 ⁇ 1 (I) was 8 times or more compared to the # 3 antibody administration group.
  • Administration of # 3 antibody suppressed the expression of fibrosis-related genes in the lung in the bleomycin model.
  • Example 8 Evaluation of inhibitory activity of antibody # 5 and antibody # 26 against integrin ⁇ 8 ⁇ 1 Nephronectin (2.5 mg / ml) was immobilized on a 96-well plate. Next, K562 cells in which ⁇ 8 ⁇ 1 was forcibly expressed were treated with # 3 antibody, # 5 antibody, or # 26 antibody at a concentration of 0.05 to 5 ⁇ g / ml, and then added to the plate so as to give 1 ⁇ 10 E5 cells / well. After culturing for 1 hour, the attached cells were stained and the absorbance was measured.
  • antibody # 3, antibody # 5, and antibody # 26 inhibited the binding between ⁇ 8 ⁇ 1-expressing K562 cells and nephronectin (FIG. 22).
  • This result shows that antibody # 3, antibody # 5, and antibody # 26 function as integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonists. From this, it is considered that the # 5 antibody and the # 26 antibody have the property of suppressing fibrosis like the # 3 antibody.
  • Example 9 Evaluation of cross-reactivity of antibody # 5 and antibody # 26 Using human and mouse-derived breast cancer cell lines that expressed integrin ⁇ 8 ⁇ 1 (Hs578T and 4T1, respectively), antibody # 3, antibody # 5, and The cross-reactivity of # 26 antibody was investigated by FACS analysis. As a result, when using both human and mouse-derived cells, the reaction of # 3 antibody, # 5 antibody, and # 26 antibody resulted in a clear peak position on the right side compared to the case of no reaction. Shifted ( Figure 23). This indicates that # 5 antibody and # 26 antibody can bind to both human and mouse integrin ⁇ 8 ⁇ 1.
  • Example 10 Evaluation of epitope of # 5 antibody # 5 antibody having an ⁇ 8 ⁇ 1 inhibitory activity was prepared using a chicken as a host in the same manner as the # 3 antibody.
  • the human ⁇ 8 chain sequence has a site different from the chicken ⁇ 8 ⁇ 1 sequence. It should be recognized. Therefore, a total of 22 human ⁇ 8 chain mutant cDNAs in which amino acids different from the chicken ⁇ 8 ⁇ 1 sequence were mutated in the human ⁇ 8 chain sequence were prepared. This human ⁇ 8 chain mutant was transiently expressed in CHO cells and reacted with antibody # 5.
  • the # 5 antibody did not react with the S132 mutant and retained reactivity with the wild type and the other 21 mutants.
  • the ⁇ chain S132 recognized by the # 5 antibody and the R120 recognized by the # 3 antibody are both located in the cap subdomain of the ⁇ chain. Therefore, it was suggested that it is important to recognize amino acids in the cap subdomain in order to be an antibody that inhibits the binding between integrin ⁇ 8 ⁇ 1 and osteopontin.
  • Examples 1 to 10 show that fibrosis can be suppressed by using an integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antagonist. Further, it is shown that fibrosis can be suppressed by using an anti-integrin ⁇ 8 ⁇ 1 antibody that recognizes R120 of the integrin ⁇ 8 chain and its peripheral region, or S132 and its peripheral region.

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Abstract

　新規で且つ有効な抗線維化剤を取得する。　インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤を用いる。又は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤を用いる。又は、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤を用いる。なお上記アンタゴニストは、例えばヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。

Description

インテグリンα8β1の機能を阻害する事による線維化の抑制
　本発明は、抗線維化剤に関する。
　線維症は、一般的に、コラーゲンなどを構成要素とする結合組織が増生し正常組織に置きかわることによって、組織が硬化し正常な機能が失われることによって生じる疾患として知られている。肝臓、肺、腎臓、心臓、皮膚などに生じる。例えば、肝組織に多量の線維化が生じた場合には、肝硬変に至る。
　線維症の研究例としては、非特許文献1に、線維症を発症した肺の遺伝子発現を調べた結果が記載されている。その結果によれば、線維化した肺組織では178個の遺伝子が高発現しており、有意差(p<0.01 in TNoM and Student's t-test)に囚われなければおおよそ1000個程度の遺伝子が高発現している。また非特許文献2には、線維症を発症した肺でインテグリンα8β1が高発現したことが記載されている。また特許文献1には、インテグリンα8β1とそのリガンドの結合を阻害する抗体が記載されている。
国際公開第2011/049082号
"Up-regulation and profibrotic role of osteopontin in human idiopathic pulmonary fibrosis." Pardo et al., PLoS Med. 2005 Sep;2(9):e251. Epub 2005 Sep 6. "Expression of the integrin alpha8beta1 during pulmonary and hepatic fibrosis." Levine et al., Am J Pathol. 2000 Jun;156(6):1927-35.
　しかしながら、上記非特許文献1～2及び特許文献1には、線維症を治療した結果は記載されていない。線維症は、種々の疾患の中でも特に治療の難しい疾患である。それは、現存する市販の治療薬が、本願発明者らの知っている限りでたったの一つしかないことが物語っている。その一つとは、一般名ピルフェニドン(塩野義製薬(株))である。しかも、そのたった一つの治療薬でさえ、日本でのみ承認された治療薬であり、米国のFDAでは薬剤としての効果が不十分であるとして承認されなかったという経緯がある。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規で且つ有効な抗線維化剤を提供することを目的とする。
　本願発明者らは、後述する実施例に記載の通り、線維症モデルマウスにおいて、１）病理組織像における線維化所見の改善、２）コラーゲンα1(I)及び平滑筋アクチン(α-SMA)の遺伝子発現量あるいは蛋白量の増加の抑制、３）線維化の指標となるコラーゲンの集積量を反映するヒドロキシプロリン量の増加の抑制に成功した。この抑制には、インテグリンα8β1の機能を阻害する物質を投与することが有効であった。
　なお、上述の通り非特許文献1及び2では、線維化組織における遺伝子の発現量の増減や分布のパターンが調べられていた。しかしながら、量や分布は、必ずしもその分子の作用が必要とされなくとも、他の分子と発現調節機構を共有しているために変化することがある。そのため、一般的に一つの病態において発現が亢進する分子は数多く存在する。インテグリンα8β1に関しては、過去に誰も線維化に関与する機能的な証拠を示すことができなかったが、本願発明者らは後述する実施例で初めてこれを明らかにした。この実施例において、動物レベルで、はっきりと、病理組織所見の変化(改善)、及び上記指標の抑制が観測されたことは驚くべきことであった。
　即ち本発明によれば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤が提供される。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明によれば、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤が提供される。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明によれば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬が提供される。この治療薬を用いれば、線維化の進行に伴って生じる疾患を治療することができる。
　本発明によれば、新規で且つ有効な抗線維化剤を用いることによって、線維化を抑制することができる。
図1は、ヒトα9導入ニワトリ細胞株を界面活性剤で融解させ、抗ヒトα9抗体Y9A2で免疫沈降した結果を表した図である。 図2は、ヒトα9導入ニワトリ細胞株と抗ヒトα9抗体Y9A2を用いてFACS解析を行った結果を表した図である。 図3は、インテグリンα8β1の野生型、R120変異体、及びP161変異体に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。 図4は、インテグリンα8β1のR120変異体(安定発現株)に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体又は対照α8抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。 図5は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、インテグリンα8β1に対する阻害活性を測定した結果である。 図6は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びマウス インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。 図7は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びラット インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。 図8は、各腫生物由来のインテグリンα8β1のR120及びその周辺領域のアミノ酸配列に関して、アライメントを行った結果である。 図9は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、BDLマウスへの投与スケジュールを説明するための図である。 図10は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝切片をマッソントリクローム染色したときの写真である。 図11は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝臓におけるCol α1(I)とα-SMAの遺伝子発現量を測定した結果である。 図12は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝臓における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。 図13は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、CCl4マウスへの投与スケジュールを説明するための図である。 図14は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝切片をマッソントリクローム染色したときの写真である。 図15は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝臓におけるα-SMAの蛋白発現量を測定した結果である。 図16は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝臓における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。 図17は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、肺線維症マウスへの投与スケジュールを説明するための図である。 図18は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺切片をHE染色したときの写真である。 図19は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺におけるCol α1(I)とα-SMAの遺伝子発現量を測定した結果である。 図20は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの体重の推移を測定した結果である。 図21は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。 図22は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、インテグリンα8β1に対する阻害活性を測定した結果である。 図23は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びマウス インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。 図24は、インテグリンα8β1のS132変異体(安定発現株)に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体又は対照α8抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
　本発明の一実施形態は、新規の抗線維化剤である。この抗線維化剤は、例えば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　なお「線維化」は、典型的には、コラーゲンなどを構成要素とする結合組織が増生し正常組織に置きかわることによって、組織が硬化し正常な機能が失われることによって生じる疾患として知られている。例えば、肝臓、肺、腎臓、心臓、皮膚などに生じる。また例えば、肝組織に多量の線維化が生じた場合には、肝硬変に至る。また肝硬変以外にも、線維化の進行に伴い、各組織に悪性腫瘍が生じることがある。
　また「インテグリンα8β1」は、典型的には、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーとして細胞膜表面に存在する受容体蛋白質である。インテグリンα8β1のDNA配列およびアミノ酸配列は、例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースであるGenBank等を参照できる。α鎖のアミノ酸配列は、例えば配列番号7のアミノ酸配列であってもよい。β鎖のアミノ酸配列は、例えば配列番号8のアミノ酸配列であってもよい。α鎖とβ鎖は、シグナルペプチドを含む形態、又は含まない形態を含む。またリガンドとしては、例えばオステオポンチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、又はテネイシンを挙げることができる。
　本明細書においてアンタゴニストの形態は特に限定されないが、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号1、2、及び3のアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号4、5、及び6のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8β1とそのリガンドの結合を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば抗体、蛋白質、低分子化合物、高分子化合物、又は核酸であってもよい。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域と特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域を特異的に認識する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸、又はそのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖の1つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。なお、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン変異体とは、キャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸が変異している変異型のインテグリンα8鎖である。ここで、キャップサブドメイン変異体に結合性を有さない抗体は、少なくとも1つの変異体に対して結合性を有さなければよく、その変異体とは別のキャップサブドメイン内のアミノ酸が変異している変異体に対しては結合性を有していてもよい。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、上記ポリヌクレオチドから上記抗インテグリンα8β1抗体が発現した結果、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストの前駆体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、上記前駆体から上記アンタゴニストが生じた結果、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1の機能阻害剤を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1の機能を阻害すると、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、本実施形態に係るアンタゴニスト又は抗線維化剤を用いた、線維化を抑制又は治療する方法である。この方法によれば、線維化を抑制することによって、線維化又は線維化の進行に伴って生じる疾患を治療できる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、コラーゲン集積抑制剤である。又は、コラーゲンの集積を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、コラーゲンの集積を抑制することができる。そのため、上記構成を有するコラーゲン集積抑制剤を用いれば、コラーゲンの集積を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現抑制剤である。又は、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、コラーゲンα1(I)及びα-SMAの発現を抑制することができる。そのため、上記構成を有するコラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現抑制剤を用いれば、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を抑制することができる。なお、コラーゲンα1(I)及びα-SMAのアミノ酸配列及びDNA配列はGenBank等を参照できる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、ヒドロキシプロリン産生抑制剤である。又は、ヒドロキシプロリンの産生を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、ヒドロキシプロリンの産生を抑制することができる。そのため、上記構成を有するヒドロキシプロリン産生抑制剤を用いれば、ヒドロキシプロリンの産生を抑制することができる。なおヒドロキシプロリンの定量は、例えば、後述の実施例に記載の手順で行ってもよく、又は"Inayama et al., Keio J Med. Vol.27, No.1, 43-46 (1978) "に記載の方法等で行ってもよい。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1を発現し、且つコラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現量が正常細胞に比べて増加している非正常細胞の、上記コラーゲンα1(I)又は上記α-SMAの発現を阻害する方法であって、インテグリンα8β1のアンタゴニストと、上記非正常細胞とを接触させる工程を含む、方法である。この方法によれば、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を阻害することによって、疾患を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1を発現し、且つヒドロキシプロリンの産生量が正常組織に比べて増加している非正常組織の、上記ヒドロキシプロリンの産生を阻害する方法であって、インテグリンα8β1のアンタゴニストと、上記非正常組織とを接触させる工程を含む、方法である。この方法によれば、ヒドロキシプロリンの産生を阻害することによって、疾患を抑制することができる。
　本明細書においてインテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域は、インテグリンα8鎖の114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、又は126位のアミノ酸配列を含む領域が好ましい。又は、インテグリンα8鎖の配列番号9のアミノ酸配列を含む領域であってもよい。この周辺領域は、上記抗インテグリンα8β1抗体のエピトープとなる領域を含んでいれば特に限定されない。なお、上記の114～126位は、シグナルペプチドを含む場合のインテグリンα8鎖を基準として計算したときの位置である。そのため、インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の114～126位は、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、及び88位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。なお、抗体が特定の領域に特異的に結合することは、抗体が特定の領域をエピトープとして認識することを含む。エピトープとして認識するとは、エピトープの一部として認識することを含む。抗体が特定のアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合することは、抗体が特定のアミノ酸及びその周辺の立体構造を特異的に認識して結合することを含む。
　本明細書においてインテグリンα8鎖のS132及びその周辺領域は、インテグリンα8鎖の126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、又は138位のアミノ酸配列を含む領域であってもよい。なお、上記の126～138位は、シグナルペプチドを含む場合のインテグリンα8鎖を基準として計算したときの位置である。そのため、インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の126～138位は、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、及び100位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。上記のアミノ酸の周辺領域は、例えば、本実施形態に係る抗体がエピトープとして認識する領域である。上記のアミノ酸の周辺領域は、抗体がエピトープとして認識する領域であれば、そのアミノ酸の前後1、2、3、4、5、又は6アミノ酸を含んでいてもよい。
　本明細書においてインテグリンα鎖のキャップサブドメインは、キャップサブドメインインサート1～4を含んでいてもよい。本実施形態に係る抗体が結合するα鎖の部位は、安定的に線維化を抑制する観点からは、インサート1内にあることが好ましい。インサート1は、例えば、インテグリンα鎖の113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、又は132位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の113～132位は、75～94位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート2は、例えば、インテグリンα鎖の154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、又は171位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の154～171位は、116～133位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート3は、例えば、インテグリンα鎖の187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、又は199位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の187～199位は、149～161位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート4は、例えば、インテグリンα鎖の233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、又は250位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の233～250位は、195～212位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インテグリンファミリーのキャップサブドメインの位置の例は、例えば、Xiao et al., Nature. 2004 Nov 4;432(7013):59-67.に記載されている。
　本明細書において、抗インテグリンα8β1抗体によってインテグリンα8β1の機能に阻害が生じている状態は、例えば、インテグリンα8β1とそのリガンドとを反応させたときの結合量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。有意に減少とは、例えば、上記結合量が0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、又は0倍に減少している状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。インテグリンα8β1の機能が特に明確に阻害される点からは、0.5倍以下に減少していることが好ましく、0.1倍以下に減少していることがさらに好ましい。なお上記結合量は、例えば、後述の実施例に記載の方法のように、リガンドを固定化したプレートにインテグリンα8β1発現細胞を接触させ、接着した細胞数を染色後に吸光度で測定することによって測定してもよい。また本明細書において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定(片側又は両側)を使用して評価し、p<0.05であるときを含んでいてもよい。又は、実質的に差異が生じている状態を含む。
　本明細書において抗体が抗原に結合性を有さない状態は、抗体が抗原に完全に結合しない状態、又は抗体の抗原への結合量が著しく低い状態を含む。抗体と抗原の結合性は、例えば、抗体と抗原発現細胞を反応させた後、フローサイトメトリー (FACS)解析によって測定してもよい。FACS解析とは、典型的には、フローセル内を流れる細胞にレーザー光をあて、細胞からの前方散乱光、側方散乱光からパラメータを測定し、細胞の特性を決める解析手法である。例えば、抗体と抗原非発現細胞を反応させたときのピークに比べて、抗体と抗原発現細胞を反応させたときのピークが、実質的に又は有意に変動していない場合に、抗体が抗原に結合性を有さない状態と判断してもよい。一方で、抗体と抗原非発現細胞を反応させたときのピークに比べて、抗体と抗原発現細胞を反応させたときのピークが、実質的に又は有意に変動した場合に、抗体が抗原に結合性を有する状態と判断してもよい。又は、結合性を有さない状態は、表面プラズモン共鳴測定装置によって測定した結合速度定数(Ka)が、結合性を有する場合と比べて、0.2、0.1、0.05、又は0.01倍の状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
　本明細書において、遺伝子の発現が阻害されている状態は、遺伝子の発現が有意に阻害されている状態を含む。又は、40、50、60、70、80、90、又は100％阻害されていてもよい。この割合は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、50％以上が好ましく、70％以上がさらに好ましい。又は、例えば、線維化が生じている組織における遺伝子の発現量に比べて、発現量が0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、又は0倍に減少している状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、0.5倍以下に減少していることが好ましく、0.1倍以下に減少していることがさらに好ましい。なお、本明細書において遺伝子の発現量が抑制されている状態は、上記の遺伝子の発現量が減少している状態と同様の状態である。
　本明細書において、ヒドロキシプロリンの産生が阻害されている状態は、ヒドロキシプロリンの産生が有意に阻害されている状態を含む。又は、40、50、60、70、80、90、又は100％阻害されていてもよい。この割合は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。又は、例えば、線維化が生じている組織におけるヒドロキシプロリンの産生量に比べて、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.2、0.1、又は0倍に減少している状態を含む。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、0.9倍以下に減少していることが好ましい。なお、本明細書においてヒドロキシプロリンの産生量が抑制されている状態は、上記のヒドロキシプロリンの産生が阻害されている状態と同様の状態である。
　本明細書において増加は、例えば1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、又は40倍に増加している状態を含む。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
　本明細書においてリガンドの前駆体とは、in vivo又はin vitroにおいて任意の物質と反応し構造変化が起こった結果、上記リガンドと同じ構造になり得る物質を含む。
　本明細書においてアミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。一般的に、蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばN末端修飾(例えば、アセチル化、ミリストイル化等)、C末端修飾(例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等)、又は側鎖修飾(例えば、リン酸化、糖鎖付加等)等が知られている。
　本明細書においてポリヌクレオチドは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、DNA塩基又はRNA塩基を含む。上記の等価物は、例えばDNA塩基又はRNA塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「塩基配列」とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド又はその等価物の配列である。塩基配列の記載において、A、T、G、Cは、それぞれアデニン及びその等価物、チミン及びその等価物、グアニン及びその等価物、シトシン及びその等価物を含む。また、TとU (ウラシル)は、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。なお、ポリヌクレオチドはDNA／RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基又はRNA塩基合成の受託会社(例えば、インビトロジェン社等)から購入することもできる。またポリヌクレオチドはベクター又はプラスミドであってもよい。
　上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド(例えばpET-Blue)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110)、酵母由来プラスミド(例えばpSH19)、動物細胞発現プラスミド(例えばpA1-11)、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、蛋白質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体をコードするポリヌクレオチド又はベクターで細胞を形質転換することができる。この形質転換体を用いれば、当該技術分野で公知の方法によって、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を作製できる。形質転換体は、ヒトや他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等)の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、サル細胞COS-7などが挙げられる。又は、形質転換体はEscherichia属菌、酵母等であってもよい。
　上記のポリヌクレオチド又はベクターの細胞への導入と抗体の生産は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。ポリヌクレオチド又はベクターの細胞への導入方法として例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、又はマイクロインジェクションなどを使用できる(改訂第4版 新 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社(2003):152-179.)。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):128-142."に記載の方法を使用できる。
　抗体の精製方法は、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインA、プロテインG、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、又はレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる(タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):27-52.)。
　本明細書において「結合する」とは、物質間の連結を意味する。連結は共有結合又は非共有結合のいずれであってもよく、例えば、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、又は親水性相互作用が挙げられる。本明細書において抗原抗体反応における「認識する」とは、抗体工学分野で通常用いられる意味で使用でき、例えば、特異的に結合するという意味を含む。
　本明細書において「1種以上」とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは20種であっても良く、それらいずれかの値以上、又は範囲内であっても良い。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体が結合するインテグリンα8β1の由来は特に限定されないが、ヒト、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、及びチンパンジーのいずれか1種以上であってもよい。この中でも、抗インテグリンα8β1抗体を治療薬として使用する観点からはヒトが好ましい。又は、非臨床試験で使用するモデル動物として特に適しているという観点からは、マウス及びラットが好ましい。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にインテグリンα8β1に対して作用させることができる。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、抗原結合活性を有する抗体断片(以下、「抗原結合性断片」と称することもある)であっても良い。この場合、安定性が上昇する、又は抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、インテグリンα8β1の野生型又は変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のDNA配列の差異に起因するものを含む。但し、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体には結合性を有さないことが好ましい。野生型又は変異型のα鎖のアミノ酸配列は、配列番号7に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80％以上の相同性を有し、より好ましくは90％以上の相同性を有し、特に好ましくは95％以上の相同性を有している。野生型又は変異型のβ鎖のアミノ酸配列は、配列番号8に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80％以上の相同性を有し、より好ましくは90％以上の相同性を有し、特に好ましくは95％以上の相同性を有している。
　本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体のクラスは特に限定されないが、例えばIgM、IgD、IgG、IgA、又はIgEであってもよい。
　また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号1、2、及び3のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号4、5、及び6のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この特定のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号10、11、及び12のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号13、14、及び15のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号16、17、及び18のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号19、20、及び21のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。
　なお一般的に、抗体のアミノ酸配列にある程度の欠失、置換、挿入、付加等が生じても、抗体の機能はある程度保たれることが知られている。そのため、上記のアミノ酸配列が特定された抗インテグリンα8β1抗体は、ある程度の欠失、置換、付加等が生じていてもよい。そのような欠失、置換、付加等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、又は抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD -Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.)を使用できる。欠失、置換、付加等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
　また上記抗インテグリンα8β1抗体は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型の時に比べて、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。又は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型の時に比べて、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。又は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列にコードされているアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。
　上記の配列番号1、5、10、14、16、又は20のアミノ酸配列は、上記抗インテグリンα8β1抗体がインテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、それぞれのアミノ酸配列の1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列であってもよい。また、上記の配列番号2、3、4、6、11、12、13、15、17、18、19、又は21のアミノ酸配列は、上記抗インテグリンα8β1抗体がインテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、それぞれのアミノ酸配列の1、2、又は3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列であってもよい。
　上記抗インテグリンα8β1抗体において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加している場合、「複数個」は15、10、8、6、4、又は2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。この数は少ないほど好ましい。なぜならば、上記「複数個」が少ないほど、もとの抗インテグリンα8β1抗体に近い特性を有していることになるからである。なお一般に、1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)。
　上記抗インテグリンα8β1抗体において、1又は複数個のアミノ酸が別のアミノ酸に置換している場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、及び芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は「保存的置換」と総称される。
　上記抗インテグリンα8β1抗体において、アミノ酸配列の同一性を表すときに用いる「90％以上」は、例えば90、95、98、99、又は100％であってもよい。又はそれらいずれかの値以上、又は範囲内であってもよい。この数は大きいほど好ましい。なぜならば、上記「90％以上」が大きいほど、もとの上記抗インテグリンα8β1抗体に近い特性を有していることになるからである。
　本明細書において同一性は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において同一なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えばBLAST、GENETYX等)。本明細書において「同一性」は、特に断りのない限りNCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのAlgorithmには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositives又はIdentitiesとして数値化される。
　本明細書においてストリンジェントな条件は、例えば以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v／v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％のポリビニルピロリドン／50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、又は(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、及び20mg／mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％又はそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、又はそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照することができる。
　また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドにコードされる重鎖、VH、重鎖CDR1～3、又は重鎖FR1～4を含んでいてもよい。又は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる軽鎖、VL、軽鎖CDR1～3、又は軽鎖FR1～4を含んでいてもよい。
　また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドを含む細胞から得ることができる、抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。またこの細胞は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドをさらに含んでいてもよい。
　また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の重鎖又はVHをコードするベクターを含む細胞から得ることができる、抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。このベクターは、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖又はVLをさらにコードしていてもよい。またこの細胞は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖又はVLをコードずるベクターをさらに含んでいてもよい。
　なお、上記受託番号NITE BP-824のプラスミドのサイズは約6.8 kbpである。このプラスミドにおいて抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域のサイズは約1.7 kbpである。この抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域の上流及び下流には、それぞれKpn I及びPinA Iの制限酵素サイトがある。そのため、受託番号NITE BP-824のプラスミドをKpn I及びPinA Iで処理することによって、抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。また、上記受託番号NITE BP-825のプラスミドのサイズは約6.5 kbpである。このプラスミドにおいて抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域のサイズは約1 kbpである。この抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域の上流及び下流には、それぞれHind III及びXba Iの制限酵素サイトがある。そのため、受託番号NITE BP-825のプラスミドをHind III及びXba Iで処理することによって、抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。また、上記受託番号BP-826、NITE BP-828、NITE BP-827、NITE BP-829のプラスミドについても、公知の手法を用いて,抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。
　本明細書において抗体は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子又はその集団を含む。また抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。また抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、diabody、一本鎖抗体(例えば、scFv)、dsFv、多価特異的抗体(例えば、二価特異的抗体)、抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチド、キメラ抗体(例えば、マウス-ヒトキメラ抗体等)、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はそれらの同等物(又は等価物)からなる群から選ばれる1種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物又は抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
　ポリクローナル抗体は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等)、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、及び所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント(完全又は不完全)、ミネラルゲル(水酸化アルミニウム等)、又は界面活性物質(リゾレシチン等)等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある(タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):86-91.)。
　モノクローナル抗体は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。又は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本明細書におけるモノクローナル抗体は、"Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。又は、本明細書におけるモノクローナル抗体は、"Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628."又は"Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。又は、"タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法でよって作製してもよい。
　Fvは、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。
　Fabは、例えば、Fab領域及びFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Fabは、例えば、Fab領域及びFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を、蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
　F(ab')2は、例えば、Fab領域及びFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabに相当する部位を2つ含む抗体である。F(ab')2は、例えば、Fab領域及びFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を、蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。
　Fab'は、例えば、F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、F(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
　scFvは、VHとVLとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。scFvは、例えば、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、VH-ペプチドリンカー-VLをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
　diabodyは、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、例えば、scFvをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
　dsFvは、VH及びVL中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はReiterらにより示された方法(Reiter et al., Protein Eng. 1994 May;7(5):697-704.)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチドは、抗体のVH、VL、又はそれらのCDR1、2、もしくは3を含んで構成される抗体である。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　上記のFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチド(以下、「Fv等」と称することもある)の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体におけるFv等の領域をコードするDNAを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。又は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBOC法(t-ブチルオキシカルボニル法)などの化学合成法によって生産してもよい。なお本明細書において、抗原結合性断片は上記Fv等の1種以上であってもよい。
　キメラ抗体は、典型的には、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、マウス-ヒトキメラ抗体は、"Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及び可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。又は、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及び可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域及びヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を、L鎖のものについてはCλ又はCκを各々挙げることができる。
　ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、及びヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング(Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.)、Re-surfacing (roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973.)、又はFRシャッフル(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.)などが挙げられる。抗原結合を改変するために(好ましくは改善するために)、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である(Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-327.)。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。又は、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。
　ヒト抗体は、典型的には、抗体を構成する重鎖の可変領域及び定常領域、軽鎖の可変領域及び定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質(g3pやg10pなど)のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。
　また抗体は、CDR-grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.)によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体の重鎖CDR又は軽鎖CDRをグラフティングすることで作製してもよい。又は、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体の重鎖CDR又は軽鎖CDRをコードするDNAと、公知のヒト又はヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖CDR又は軽鎖CDRを除く領域をコードするDNAとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗インテグリンα8β1抗体の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法(例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、又はファージディスプレイ法など)を用いて、重鎖CDR又は軽鎖CDRを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、FRシャッフル(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.)、又はバーニヤゾーンのアミノ酸残基又はパッケージング残基を置換する方法(特開2006-241026、又はFoote et al., J Mol Biol.1992 Mar 20;224(2):487-499.)を用いて、FR領域を最適化してもよい。
　重鎖 (heavy chain)は、全長抗体の主な構成要素である。典型的には、軽鎖 (light chain)とジスルフィド結合及び非共有結合によって結合している。重鎖のN末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域(VH)と呼ばれる領域が存在し、一般的に、VHが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、"Reiter et al., J Mol Biol. 1999 Jul 16;290(3):685-98."にはVHのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、"Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec;13(12):1243-1244."にはラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。
　CDR (相補性決定領域、complementarity determining region)は、抗体において、実際に抗原に直接接触して結合部位を形成している領域である。一般的にCDRは、抗体のFv (可変領域：重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む)上に位置している。また一般的にCDRは、5～25アミノ酸残基程度からなるCDR1、CDR2、CDR3が存在する。そして、特に重鎖のCDRが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またCDRの中でも、CDR3が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、"Willy et al., Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 356, Issue 1, 27 April 2007, Pages 124-128"には重鎖CDR3を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。また、CDRは抗体の抗原に対する特異性を決定する領域であるため、抗体間でアミノ酸配列が大きく異なり、超可変領域ともよばれている。CDR以外のFv領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれ、FR1、FR2、FR3およびFR4からなり、抗体間で比較的よく保存されている(Kabat et al.,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983.)。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因は重鎖CDR3であり、次に重鎖CDRであるといえる。
　CDRの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Kabatの定義 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))、又はChothiaの定義(Chothia et al., J. Mol. Biol.,1987;196:901-917)を採用してもよい。本明細書においては、Kabatの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるCDRの重複部分を、又は各々の定義によるCDRの両方を含んだ部分をCDRとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268-9272)がある。
　本明細書において抗線維化剤は、線維化抑制用の治療薬を含む。又は、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬を含む。又は、抗線維化剤は再生医療に用いるための線維化抑制用の薬剤であってもよい。なお本明細書において治療は、被験者の疾患（線維化を含む）又は疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることをいう。治療薬は予防薬を含む。
　また抗線維化剤は、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また抗線維化剤は、有効成分を単独で用いるものであってもよいし、任意の成分と混合して用いるものであってもよい。また上記担体の形状は特に限定されない。
　投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体医薬を投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、又はステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、又はNaOH等を配合してもよい。また抗線維化剤は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。
　投与量は特に限定されないが、例えば、一回につき0.25又は0.5mg/bodyであってもよく、それらの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、2週間、3日毎に投与してもよく、4週間、週に2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、被験者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択することが可能である。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。また抗線維化剤は、治療有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。なお上記のコラーゲン集積抑制、コラーゲンα1(I)及びα-SMAの発現抑制剤、ヒドロキシプロリン産生抑制剤についても、抗線維化剤と同様の投与方法を用いることが好ましい。
　本明細書において被験者は、ヒト又はヒトを除く哺乳動物(例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、及びチンパンジー等のいずれか1種以上)を含む。
　本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
　以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜実施例１＞抗インテグリンα8β1抗体の作製
　（１）免疫
　マウス インテグリンα8鎖のcDNAをほ乳動物発現ベクターにクローニングした。次に、その発現ベクターをニワトリリンパ芽球様細胞株にエレクトロポレーション法でトランスフェクトした後、薬剤を添加して発現細胞の選択をおこなった。得られたマウス インテグリン α8鎖発現細胞株をニワトリに過免疫した。ニワトリ血清中抗体価の測定はフローサイトメトリ(FACS)解析にて実施した。FACS解析に関してはFACSCalibur (BD,USA)の一般的なプロトコールに従った。
　なお、インテグリンα8鎖はβ1鎖とヘテロダイマーを形成することが鳥類、ほ乳類いずれにおいても確かめられている(Bossy B, et al, EMBO J 10(9): 2375-2385, 1991； J Cell Sci 108:537-544,1995)。但し、ほ乳類のα鎖と鳥類のβ鎖がヘテロダイマーを形成できるかについての具体的な実験データは公表されていない。そのため、ヒトのα9とニワトリのβ1がヘテロダイマーを形成し、インテグリン分子として細胞膜表面に発現するかを、以下の手順で確かめた。まず、ヒトα9 cDNAをニワトリ細胞株に導入し薬剤選択により安定発現株を得た。次に、このヒトα9導入ニワトリ細胞株を界面活性剤で融解させ、抗ヒトα9抗体Y9A2で免疫沈降した(図1)。レーン1に二本のバンドが現れ、ヒトα9鎖が他の分子と複合体を形成していることがわかる。レーン2はインテグリンα9β1を発現しているα9-transfected SW480 (ヒト大腸癌細胞株)の免疫沈降であり、比較するとレーン1の二つのバンドはα9鎖とβ1鎖であることがわかる。
　さらに、ヒトα9導入ニワトリ細胞株と抗ヒトα9抗体Y9A2を用いてFACS解析を行った(図2)。無染色細胞のヒストグラムに比べ抗体と反応させた場合ヒストグラムが右にシフトしており、ヒトα9が膜表面に発現している事がわかる。従って上記インテグリンα8鎖発現細胞株においても、同様にα8鎖とβ1鎖とのヘテロダイマーが形成されていると考えられる。なお、上記のマウス インテグリンα8鎖のアミノ酸配列は、配列番号7に示すアミノ酸配列である。
　（２）scFv ファージ抗体ライブラリーの作製
　免疫をおこなったニワトリから脾臓を摘出した後、リンパ球を分離した。得られたリンパ球からRNAを抽出してcDNAの合成を行いscFv ファージ抗体ライブラリーを作製した。 ファージ抗体ライブラリーの作製に関しては、"nakamura et al., J Vet Med Sci. 2004 Jul;66(7):807-14"に記載の一般的な手法に従った。
　（３）パニング選択
　scFv ファージ抗体ライブラリーをマウス インテグリンα8鎖非発現細胞株に添加して非特異ファージの吸収操作をおこなった後、マウス インテグリンα8鎖発現細胞株と反応させた。有機溶媒で洗浄後、マウス インテグリンα8鎖発現細胞株に特異的に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させた。4回パニングをおこなった後、ライブラリーの反応性をマウス インテグリンα8鎖発現細胞株を用いたFACS解析で確認した。3rd ライブラリーの反応性が高かったため、3rd ライブラリーからファージのクローニングを行い、陽性クローンを選択した後、配列を決定した。細胞パニングに関しては、"Giordano et al., Nat Med. 2001 Nov;7(11):1249-53."に記載の方法に従った。
　（４）ヒトインテグリンα8鎖交差クローンの選択
　ヒトインテグリンα8鎖にも交差反応する抗体を取得するため、ヒト インテグリンα8鎖発現ニワトリリンパ芽球様細胞株を作製した。FACS解析によりヒトインテグリンα8鎖発現細胞株にも交差反応するクローンの選択をおこなった。
　（５）組換えIgY (rIgY)抗体への組換え
　以上の実験により得られたscFv ファージ抗体をコードするDNA鎖を鋳型にして、VH、VLのPCR増幅をおこなった後、ニワトリ抗体のleader配列、定常領域とoverlap PCRを行いrIgY発現ベクターへクローニングした。作製したH鎖、L鎖のコンストラクトをほ乳類培養細胞にトランスフェクトした後、発現した抗体の精製をおこなった。rIgY抗体への組換えに関しては、"Shimamoto et al., Biologicals. 2005 Sep;33(3):169-74."に記載の手法に従った。以上の手順により、抗インテグリンα8β1抗体(モノクローナル抗体)を3種（#3抗体、#5抗体、#26抗体）作製した。
　なお、#3抗体、#5抗体、又は#26抗体の重鎖をコードするDNA配列を含むプラスミドは、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)にそれぞれ2009年10月16日付で国内寄託されている。さらにその後、国内寄託した上記プラスミドは、2010年10月12日付でそれぞれ受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828として、ブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
　また、#3抗体、#5抗体、又は#26抗体の軽鎖をコードするDNA配列を含むプラスミドは、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにそれぞれ2009年10月16日付で国内寄託されている。さらにその後、国内寄託した上記プラスミドは、2010年10月12日付でそれぞれ受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829として、ブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。これら寄託したプラスミド6つは、上記（５）において発現ベクターを用いて作製したものである。
　また、#3抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SYDMV (配列番号1)、IYSAGSGPQYAPAVKG (配列番号2)、ADSTYCASGSCYAADSID (配列番号3)である。また、#3抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGGGSWYG (配列番号4)、DNTNRPS (配列番号5)、GSADSTDAV (配列番号6)である。CDRは抗インテグリンα8β1抗体の抗原結合特異性に関わる部位である。#5抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SYDMA (配列番号10)、IDDDDSFTLYGAAVKG (配列番号11)、VGDGYCGWSACGGSID (配列番号12)である。また、#5抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGDESYYG (配列番号13)、SNDKRPS (配列番号14)、GXYDSSTYAGI (配列番号15)である。#26抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、GHDMA (配列番号16)、IGSSGSNTNYGTAVKG (配列番号17)、PGSCYGCTPDAGEID (配列番号18)である。また、#26抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGSSGSYYG (配列番号19)、ESTKRPS (配列番号20)、GNEDSSYVGI (配列番号21)である。なお、Xはアミノ酸解析において解析不能であったアミノ酸を表す。
　＜実施例２＞エピトープの評価
　8種のヒトα8鎖cDNA (R120、K125、S132、P161、Y199、A238、A260、S261)を作製し、CHO細胞に一過性発現をさせ、#3抗体と反応させた。#3抗体は、野生型、及び7種の変異体(K125、S132、P161、Y199、A238、A260、S261)に対しては反応性を保持したが、R120を変異させたもの(R120変異体)には反応しなかった。#3抗体と、野生型、R120変異体、及びP161変異体とを反応させ、FACS解析を行った結果を図3に示す。次に、一過性発現法のためR120K変異体が十分に発現していない可能性を除外するため、安定発現株を作製し同様に反応させたところやはり反応がみられなかった。また、R120K変異体は対照α8抗体とは良く反応し、十分に発現している事を確認した(図4)。これら結果は、#3抗体が認識するエピトープは、R120及びその周辺領域であることを示している。
　＜実施例３＞インテグリンα8β1に対する阻害活性評価
　96-wellプレートにマウスオステオポンチン(2.5 mg/ml)を固相化した。次に、そのプレートにα8発現K562細胞を1x10 E5細胞/wellで加えるとともに、#3抗体を図5に示した濃度で加えた。図5において、A570nmは接着細胞を検出している。A570nmの値が低いほど、α8発現K562細胞とオステオポンチンの結合が少ないことを表している。
　その結果、#3抗体は、α8発現K562細胞とオステオポンチンとの結合を阻害していた(図5)。即ち、#3抗体はインテグリンα8β1のアンタゴニストとして機能していた。また、抗体非添加時を100とすると、抗体濃度が0.05 μg/mlで60％以上の阻害活性がみられた。また、抗体濃度が0.10 μg/mlで70％以上、抗体濃度が0.25 μg/ml以上で95％以上の阻害活性がみられた。
　＜実施例４＞交差反応性の評価
　（１）ヒト及びマウスインテグリンα8β1への反応性評価
　#3抗体を用いて、ヒト インテグリンα8鎖発現SW480細胞株、及びマウス インテグリンα8鎖発現SW480細胞株への交差反応性を、FACS解析により調査した。その結果を図6に示す。ヒト インテグリンα8鎖発現SW480細胞株、及びマウス インテグリンα8鎖発現SW480細胞株のどちらを用いたときにも、#3抗体を反応させると、反応させないときに比べて、ピークの位置が明確に右側にシフトした。またMockのときにはピークに変動はなかった。このことから、#3抗体は、ヒト及びマウス両方のインテグリンα8β1に結合できることが示された。
　（２）ラットインテグリンα8β1への反応性評価
　ラットインテグリンα8鎖cDNAをクローニングしCHO細胞に一過性発現させ、#3抗体との反応性をFACSで確かめた。ポジティブコントロールとして、ヒトインテグリンα8サブユニットの一過性発現細胞を用いた。図7に示すように、#3抗体は、ラットインテグリンα8鎖と反応した。その反応性は、ヒトインテグリンα8鎖と反応させたときと同程度であった。
　（３）その他生物由来インテグリンα8β1への反応性評価
　上記実施例2の結果によれば、#3抗体の認識するエピトープは、R120及びその周辺領域である。この部分のラットのアミノ酸配列を調べたところ、マウス、及びヒトと全く同じであった。そこで、他の種の配列もデータベースから収集しアラインメントを行った(図8)。その結果、ウシ、ブタ、イヌ、ハムスター、マーモセット、アカゲザル、テナガザル、チンパンジーもR120およびN-末6残基、C-末6残基の合計13残基(TNNRKIRVNGTKE、配列番号9)において100％の相同性を認めた。従って、#3抗体は、ハムスター、ウシ、ブタ、イヌ、マーモセット、アカゲザル、テナガザル、チンパンジーのインテグリンα8β1とも反応性を有すると考えられる。
　＜実施例５＞胆管結紮による線維化モデルマウス(Bile Duct Ligation (BDL)マウス)を用いた治療効果の評価
　（１）BDLマウスへの投与
　図9に示すように、Day 0で、肝線維化の誘導のためにマウスの胆管を結紮し、肝内胆管周辺に線維化を生じる所謂BDLマウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を0.5 mg/bodyでマウスの腹腔内に2週間、3日毎に投与した。比較のため、抗インテグリンα8β1抗体非投与のBDLマウスも作製した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。
　（２）マッソントリクローム染色
　BDLマウスの肝組織の線維化を検討するため、マッソントリクローム染色を行った。図10は胆管、門脈、肝動脈からなる三つ組(biliary triad)の周辺の組織像である。上パネルは、#3抗体非投与の場合である。上パネルでは、青色に染色されたコラーゲン線維の量が増加しており、新規に形成された微小胆管が認められ胆管増生を生じている。また比較的大きな胆管では上皮が増殖しており、また胆管周辺には炎症細胞の浸潤が見られる。赤色は肝実質細胞である。下パネルは、#3抗体投与の場合である。下パネルでは上パネルと比較すると、微小胆管の増生は同様に認められるもののコラーゲン線維の増加の程度が著しく少ない。胆管の結紮により胆管内圧が上がり胆管の増生を来しているが、それに伴う線維化は抗体投与により抑制されていることがわかる。
　（３）Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現の測定
　BDLマウスの肝臓における、コラーゲンα1(Col α1(I))とα平滑筋アクチン(α-SMA)の遺伝子発現を、定量PCR法で分析し、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。。正常マウスのものを1とした場合の相対発現量を図11に示す。
　Col α1(I)の発現は、BDLマウスにおいて、正常マウスの40倍以上に増加した。この値は、#3抗体投与によって10倍以下の値まで減少した。即ち、#3抗体投与によってBDLマウスのCol α1(I)の発現が、75％以上阻害された。また、α-SMAの発現は、BDLマウスにおいて、正常マウスの約9倍以上に増加した。この値は、#3抗体投与によって5倍以下の値まで減少した。即ち、#3抗体投与によってBDLマウスのCol α1(I)の発現が、約50％阻害された。
　（４）ヒドロキシプロリンの定量
　ヒドロキシプロリンは組織中のコラーゲン量を反映し、線維化定量の標準的な方法として用いられる。BDLマウスの肝臓におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図12に示す。BDLマウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって240 μg/g肝臓組織から150μg/g肝臓組織に減少した。
　なお、ヒドロキシプロリンの測定は以下の手順で行った。まず、マウス肝組織を6N HCl中でホモジナイズし100 mg/mlとした。次に110 ℃で24時間静置後、800 x gで15分間遠心分離し上清を回収した。上清20 μlに8 N NaOHを14 μl 添加して中和した後、dH2Oを266 μl 加えてトータル0.3 mlとした。さらに、等量のisopropanolと混和後、0.1 mlのクロラミン-T溶液を加えた。室温で10分間静置後、0.5 mlのジメチルアミノベンズアルデヒド溶液を添加し、よく混和し、スピンダウンさせた。呈色反応は50 ℃で90分間行った。その後、室温で5分間クールダウンさせた後、プレートに150 μl分注してA590を測定した。そして、標品をから作製した検量線を用いて定量した。なお、クロラミン-T溶液は、クロラミン-Tを0.336 g (final 0.84%)、3M NaOAcを0.56 ml (final 42 mM)、クエン酸を0.02 g (final 2.6 mM)、isopropanolを15.8 ml (final 39.5%)含み、dH2Oでトータル40 mlになるように調整した溶液を使用した。またジメチルベンズアルデヒド溶液は、p-dimethylaminobenzaldehydeを0.248 g、過塩素酸(60 %)を0.27 ml、isopropanolを0.73 ml混合した溶液を使用した。
　＜実施例６＞四塩化炭素誘導性の線維化モデルマウス(CCl4マウス)を用いた治療効果の評価
　（１）CCl4マウスへの投与
　図13に示すように、Day 1で、肝線維化の誘導のために、オリーブオイルを溶媒とした50％四塩化炭素をマウスの皮下に2 ml/kg bodyで投与し、CCl4マウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を0.25 mg/bodyでマウスの腹膜内に4週間、週に2回投与した。比較のため、抗インテグリンα8β1抗体非投与のCCl4マウスも作製した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。
　（２）マッソントリクローム染色
　CCl4マウスの肝切片をマッソントリクローム染色した。その結果を図14に示す。上パネルは、#3抗体非投与の場合である。上パネルでは、肝小葉周辺のグリソン鞘(Grisson's capsules)に一致してコラーゲンの増生が見られた。青く染まっているのがコラーゲン線維であり、肝の小葉構造に従って6角形状に増生している。下パネルは、#3抗体投与の場合である。下パネルでは、上パネルでみられた肝小葉周辺のグリソン鞘の肥厚が、ほとんど見られない。
　（３）α-SMAの発現量
　正常マウスと#3抗体投与／非投与CCl4マウスの肝臓におけるα-SMAの発現量をウエスタンブロッティングで観察した。その結果を図15に示す。CCl4マウスでは、#3抗体非投与のとき、ノーマルマウスに比べてα-SMAの発現量が増加した(抗体(-)、n=3)。一方で、抗インテグリンα8β1抗体投与によって、α-SMAの発現量が減少した(抗体(+)、n=3)。右端レーンはポジティブコントロール(LX2細胞の抽出物)を表している。
　（４）ヒドロキシプロリンの定量
　CCl4マウスの肝臓におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図16に示す。CCl4マウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって220 μg/g肝臓組織から177 μg/g肝臓組織に減少した。
　以上の実施例5及び6の結果、#3抗体を用いることによって、１）肝線維モデルマウスの病理組織学的線維化所見の改善、２）コラーゲンα1(I)及びα-SMAの遺伝子発現量の増加の抑制、３）ヒドロキシプロリン量の増加の抑制ができることが明らかになった。このように、動物レベルで、はっきりと、病理組織所見の変化が観測されたことは驚くべきことであったが、それは線維化に伴い産生される分子を定量化した数値により裏付けられていた。
　＜実施例7＞ブレオマイシン誘発性の肺線維症モデルマウス（肺線維症マウス）を用いた治療効果の評価
　（１）肺線維症マウスへの投与
　図17に示すように、Day 0で、肺線維化の誘導のために、ブレオマイシン（日本化薬）をマウスの気管内に1.25 U/kg bodyで投与し、ブレオマイシン誘導肺線維症モデルマウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を10 mg/bodyでマウスの腹腔内に2週間、3日毎に投与した。対照として、生理食塩水を腹腔に投与したブレオマイシン誘誘導肺線維症モデルマウスも作製し比較した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。
　（２）病理像
　ブレオマイシン誘導肺線維症マウスの、ブレオマイシン投与21日後の病理像（HE染色）を示す（図18）。左の対照群のマウスでは著しい線維化が生じており、炎症性細胞の浸潤や線維芽細胞増成、線維素の沈着などにより正常肺胞構造が失われている。一方、右の抗体投与群マウスでは、正常肺に比べれば肺胞隔壁の肥厚や炎症細胞浸潤が認められるが、肺胞構造は保たれており、対照群に比べ線維化は強く抑制されている。
　（３）体重の推移
　ブレオマイシン誘導肺線維化マウスにおいては、線維化の程度に関連して、体重の増加抑制や減少が認められる。上記の肺線維症マウスの体重の推移を測定した（図19）。その結果、#3抗体非投与マウスでは、ブレオマイシン投与3日後から7日後にかけて平均1.8g（約10%）の体重減少が認められた。一方で、#3抗体投与マウスでは、ほとんど体重の減少が見られなかった。即ち、#3抗体投与によって、線維化に起因する体重減少が抑制されたと考えられる。
　（４）Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現の測定
　上記の肺線維症マウスの肺における、Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現を、定量PCR法で分析し、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。#3抗体投与マウスにおける発現量を1とした場合の相対発現量を図20に示す。
　抗体非投与マウスでは#3抗体投与群に比べα-SMAの発現は4倍以上、Col α1(I)は8倍以上であった。#3抗体投与により、ブレオマイシンモデルにおける線維化関連遺伝子の肺における発現が抑制されていた。
　（５）ヒドロキシプロリンの定量
　上記の肺線維症マウスの肺におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図21に示す。肺線維症マウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって840.7 μg/g肺組織から602.8 μg/g肺組織に減少した。
　＜実施例8＞インテグリンα8β1に対する#5抗体及び#26抗体の阻害活性評価
　96-wellプレートにネフロネクチン(2.5 mg/ml)を固相化した。次に、α8β1を強制発現させたK562細胞を0.05～5μg/mlの濃度の#3抗体、#5抗体、又は#26抗体で処理した後、1x10 E5細胞/wellとなるように上記プレートに加え、１時間培養後、附着細胞を染色し吸光度を測定した。
　その結果、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体は、α8β1発現K562細胞とネフロネクチンとの結合を阻害していた（図22）。この結果は、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体が、インテグリンα8β1のアンタゴニストとして機能していることを示している。またこのことから、#5抗体及び#26抗体は、#3抗体と同様に線維化を抑制する性質を有していると考えられる。
　＜実施例9＞#5抗体及び#26抗体の交差反応性の評価
　インテグリンα8β1を発現したヒト及びマウス由来の乳がん細胞株（それぞれHs578T、4T1）を用いて、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体の交差反応性をFACS解析により調査した。その結果、ヒト及びマウス由来細胞のどちらを用いたときにも、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体それぞれを反応させると、反応させないときに比べて、ピークの位置が明確に右側にシフトした（図23）。このことから、#5抗体及び#26抗体それぞれは、ヒト及びマウス両方のインテグリンα8β1に結合できることが示された。
　＜実施例10＞#5抗体のエピトープの評価
　α8β1阻害作用をもつ#5抗体は、#3抗体同様ニワトリを宿主として作製したものであり、ヒトα8鎖配列の中でニワトリα8β1配列と異なる部位を認識しているはずである。そこで、ヒトα8鎖配列の中でニワトリα8β1配列と異なるアミノ酸に変異を入れた、計22種のヒトα8鎖変異体cDNAを作製した。このヒトα8鎖変異体をCHO細胞に一過性発現させ、#5抗体と反応させた。#5抗体は、S132変異体とは反応せず、野生型、及びその他の21種の変異体に対しては反応性を保持していた。次に、一過性発現法ではS132変異体が十分に発現していない可能性を除外するため、安定発現株を作製し同様に反応させたが、やはり反応がみられなかった。S132変異体は対照α8抗体とは良く反応し、十分に発現している事を確認した(図24)。この対象α8抗体は、上記22種の変異部位以外の部位を認識する抗体である。これら結果は、#5抗体が認識するエピトープは、S132及びその周辺領域であることを示している。
　#5抗体が認識したα鎖のS132と、#3抗体が認識したR120は、いずれもα鎖のキャップサブドメインに位置している。従って、インテグリンα8β1とオステオポンチンとの結合を阻害する抗体であるためには、キャップサブドメイン内のアミノ酸を認識することが重要であることが示唆された。
　以上の実施例1～10の結果は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを用いることによって、線維化を抑制できることを示している。また、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域を認識する、抗インテグリンα8β1抗体を用いることによって、線維化を抑制できることを示している。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (10)

  1. 　インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤。
  2. 　前記アンタゴニストが、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1に記載の抗線維化剤。
  3. 　前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1又は2に記載の抗線維化剤。
  4. 　前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1～3いずれかにに記載の抗線維化剤。
  5. 　前記アンタゴニストが、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体である、請求項2～4いずれかに記載の抗線維化剤。
  6. 　前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖の1つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1～5いずれかに記載の抗線維化剤。
  7. 　前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1～6いずれかに記載の抗線維化剤。
  8. 　前記抗インテグリンα8β1抗体が、モノクローナル抗体である、請求項2～7いずれかに記載の抗線維化剤。
  9. 　前記抗インテグリンα8β1抗体が、抗原結合性断片である、請求項2～8いずれかに記載の抗線維化剤。
  10. 　インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬。
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