CN115956089A - 抑制性抗enpp1抗体 - Google Patents

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Abstract

在某些方面，本文提供了抑制性抗ENPP1抗体及其抗原结合片段。在一些方面，本文提供了使用本文提供的所述抗体来治疗心肌梗塞的方法。在某些方面，本文提供了编码本文提供的所述抗体的核酸分子、包含此类核酸的宿主细胞以及使用此类宿主细胞来制备本文提供的所述抗体的方法。在一些方面，本文还提供了包含本文提供的所述抗体的药物组合物。

Description

抑制性抗ENPP1抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月4日提交的美国临时专利申请序列号63/019,773的优先权权益，该临时专利申请的内容据此以引用的方式整体并入本文。
政府支持
本发明受政府支持在美国国家卫生研究院颁发的资助号HL137241、AR075867和美国国防部颁发的资助号W81XWH-17-1-0464下进行。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
在急性缺血性损伤后，心脏使死亡心肌再生的能力很差，并且丧失的心肌被非收缩性疤痕组织替代。这种疤痕组织增加了其余心肌的血液动力学负担，并且随时间推移，心室通常会衰竭，导致心室扩张、纤维化恶化和心脏功能的进行性下降的循环。瘢痕组织是心脏损伤后死亡和心血管结局的独立预测因子。每年有超过700,000名患者被诊断为心力衰竭，其中超过40％是心脏病发作或心肌梗塞的结果。因此，调节心脏伤口愈合以将心脏损伤反应从纤维化反应重定向到修复性反应，同时使不良的心脏功能重塑和下降最小化是心血管治疗的未满足的需求。
发明内容
在某些方面，本文提供了涉及特异性结合至ENPP1并且抑制ENPP1的抗体的组合物和方法，此类抗体可以用于例如促进心肌梗塞后受试者的心脏伤口愈合。因此，在某些实施方案中，本文提供了对ENPP1具有特异性的抗体、包含此类抗体的药物组合物、制备此类抗体的方法以及使用此类抗体例如治疗心肌梗塞、改善心脏伤口愈合以及预防心力衰竭的方法。
附图说明
图1展示了ENPP1在心脏伤口愈合中的作用。(A)损伤导致肌细胞释放ATP。(B)损伤诱导心脏成纤维细胞表达ENPP1，所述ENPP1将ATP水解为AMP和PPi。(C)AMP/PPi或另外的下游物质诱导炎性细胞因子的表达，(D)炎性细胞因子作用于成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞以诱导细胞死亡。(E)非肌细胞的细胞死亡导致伤口愈合中断。
图2A显示了示例性qPCR结果，其表明与同一心脏的未受损伤的区域相比，ENPP1在心脏的受损伤的区域的表达增加(n＝10只动物/组，**p<0.01)。
图2B显示了在缺血性心脏损伤后同一心脏的未受损伤的和受损伤的区域的ENPP1的示例性蛋白质印迹分析(M1、M2和M3是指经受缺血性损伤的动物的心脏)，其中GAPDH作为上样对照，以及展示同一心脏的受损伤的区域与未受损伤的区域的ENPP1蛋白表达增加的程度的半定量密度测定法(n＝5只动物/组，*p<0.05)。
图2C是示例性显微照片，其显示了心脏的未受损伤的和受损伤的区域的苏木精和伊红染色(上图)以及ENPP1的免疫染色(下图，绿色)。方框展示了成像的区域。n＝5只动物的代表性图像。
图3是示例性显微照片，其显示在缺血性心脏损伤后在心脏的受损伤的区域中ENPP1由心脏成纤维细胞表达。在损伤后7天，在TCF21MerCreMer:R26Rtdtomato(图A)和Col1a2CreERT:R26Rtdtomato(图B)的心脏的未受损伤的和受损伤的区域(损伤后第7天)中ENPP1的表达展示出心脏成纤维细胞(红色，箭头)的ENPP1(绿色)表达显著增加。在损伤后野生型小鼠的波形蛋白(成纤维细胞标志物，图C)的免疫染色显示，表达波形蛋白的心脏成纤维细胞(红色，箭头)同样表达ENPP1。
图4A和4B是使用10X基因组学平台进行的在损伤后7天心脏中的非肌细胞的单细胞RNA测序的示例性结果。图4A是在损伤后7天使用典型转录物组学标志进行的心脏中的不同细胞群的聚类图示，其显示了心脏成纤维细胞、巨噬细胞和其他细胞类型的群体。图4B是ENPP1表达的叠加图，其展示了成纤维细胞的表达占优势，巨噬细胞和其他分散细胞类型的表达程度较低。
图5A是展示在心脏损伤后在不同时间点心脏中的不同外切核苷酸酶的基因表达的热图。红色矩形标示了ENPP1表达，在损伤后3、7、14和21天与未受损伤的组织(Un)相比，所述ENPP1在受损伤的组织(In)中的表达显著增加。
图5B是显示从野生型和ENPP1突变体(ENPP1asj/asj)小鼠提取的受损伤的组织的ATP水解活性的示例性图，并且展示了在野生型小鼠的受损伤的组织中水解活性显著增加，而突变体小鼠则未观察到此结果(*p<0.05，n＝5)。
图6A是示例性显微照片，其显示在存在ATP的情况下表达ENPP1的心脏成纤维细胞(绿色)和肌细胞(红色)的共培养物诱导心脏成纤维细胞的细胞死亡。在不存在(图A)或存在(图B)ATP的情况下，将对照心脏成纤维细胞(绿色)与新生大鼠心肌细胞一起共培养，然后通过流式细胞术来估计细胞存活率。在不存在(图C)或存在(图D)ATP的情况下，将过表达ENPP1(绿色)的心脏成纤维细胞与心肌细胞一起共培养。图D中的绿色染色细胞的显著减少表明活心脏成纤维细胞的数量显著减少。在此系统中未观察到心肌细胞的显著死亡。
图6B是显示在图6A中进行的测定法的流式细胞术结果的示例性图。
图7是示例性明视野显微照片和定量图，其显示ENPP1诱导促凋亡分子从心肌细胞的释放，所述促凋亡分子诱导多种驻留心脏细胞的细胞死亡、恶化细胞死亡和炎症。将ENPP1和ATP添加至心肌细胞并收集条件培养基。将ENPP1条件培养基添加至在单独的培养皿上生长的其他心脏驻留细胞，诸如巨噬细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞和平滑肌细胞。在用对照或条件培养基孵育48小时后，用明视野显微镜对经处理的细胞成像，并且对细胞进行流式细胞术，以通过PI染色来确定细胞死亡程度。数据表明，在用ENPP1和ATP条件培养基处理后，明相显微镜下的贴壁细胞的数量减少，细胞死亡增加，并且PI阳性细胞的数量显著增加(**p<0.01，*p<0.05，n＝6)。
图8是显示在对照或异丙肾上腺素输注后在100个小鼠品系中ENPP1表达的遗传变异的图。在异丙肾上腺素输注3周后，100个小鼠品系心脏中的归一化的ENPP1表达。在大多数品系的异丙肾上腺素输注(红色条柱)后，ENPP1表达的遗传变异表明，与对照条件(黑色条柱)相比，在异丙肾上腺素后心脏ENPP1表达增加。
图9是展示心脏性状(心脏质量、射血分数、LVID(心室大小)、E/A比率、间质纤维化和心率)与100个品系中的心脏ENPP1表达的相关性的示例性图。在每个图中，每个点代表一个小鼠的品系，并且归一化的ENPP1表达沿着X轴绘制。Y轴表示心脏性状的测量值。显示了两种不同的条件(对照和在异丙肾上腺素输注后)。ENPP1与对照条件下的心脏性状不具有强相关性。ENPP1与在异丙肾上腺素输注后的心脏质量、纤维化、心室大小、E/A比率和射血分数具有强相关性。表现出更高的ENPP1表达的品系具有更大的肌细胞质量(增生)、更多的纤维化，并且表现出射血分数和缩短分数降低以及心室扩张。对于展示出这些遗传相关性的特异性的情况，ENPP1与心率不具有相关性(p值和双相关系数以红色表示)。
图10是网络模块，并且显示出ENPP1(以红色圆圈突出显示)是此网络模块中的一个重要节点(Yu等人2018)。
图11A和11B是Cre(-)ENPP1fl/fl对照和ENPP1 CKO小鼠的示例性M型超声心动图帧。
图11C和11D是显示在Cre(-)ENPP1fl/fl和ENPP1 CKO小鼠中收缩期和舒张期的EF/FS和LVID的测量值的示例性图(在每个时间点，对于对照，n＝17只小鼠，对于ENPP1 CKO，n＝22只小鼠，*P<0.01，**p<0.05)。
图12A和12B是在结扎部位从心尖(图A)经中部心室到基部(图B)按顺序切割的示例性心脏切片。Cre(-)ENPP1fl/fl小鼠或ENPP1 CKO小鼠经受心脏损伤。在心脏损伤后四周，收集心脏并按顺序切割切片。
图12C和12D是显示在图12A中从中部心室和心尖获得的切片的平均纤维化面积以及在每个组中表现出重度纤维化(>40％)、中度纤维化(20％-40％)和轻度纤维化(<20％)的动物的百分比的示例性图(对于Cre(-)，n＝9，对于ENPP1 CKO，n＝12。*p<0.05)。
图13A和13B是散点图，其表明与ENPP1 CKO小鼠相比，WT(Cre-)小鼠具有显著更高的活化的成纤维细胞标志物和活化的巨噬细胞标志物的表达。
图13C是WT和ENPP1cKO小鼠之间的GO途径的示例性图，其表明与ENPP1CKO动物相比，在WT中，调节促炎性通路、胶原蛋白和胞外基质的基因的表达显著提高。ENPP1的抑制显著减弱了这种促炎性和促纤维化途径(每个组中的3个心脏被用于单细胞测序分析)。
图14A和14B是M型超声心动图帧，其显示了在缺血损伤后7天，在媒介物(图A)或杨梅黄酮(图B)施用(在损伤当天开始)后的心室和心壁。
图14C和14D是显示在4周内媒介物和杨梅黄酮注射的动物的射血分数和缩短分数的定量的示例性图(n＝8只动物/组；p<0.05)。
图15是靶向人ENPP1的ENPP1单克隆抗体(mAb)的示例性亲和力结合曲线。将过表达全长ENPP1的HEK细胞与不同浓度的ENPP1 mAb一起孵育，然后进行流式细胞术，以确定平均荧光强度，该平均荧光强度作为结合的读数。然后在Graph Pad Prism中绘制数据，并且计算Kd，结果为3.516nM。在相同浓度下的IgG被用作对照。
图16是显示还原的和去糖基化的ENPP1单克隆抗体的分子量和表征的示例性质谱图。在CHO细胞系中重组制备的ENPP1单克隆抗体是IgG1κ同种型，重链为大约48kD，轻链为大约24kD。
图17是显示单克隆抗体12-J-4在抑制ENPP1方面的作用的示例性图。在基于萤光素酶的测定法中，在存在或不存在ENPP1+/-mAb或IgG对照的情况下将ATP与萤光素酶一起孵育。在不存在ENPP1的情况下，获得高发光信号。然而，当添加ENPP1时，发光降低，但是与IgG相比，在添加有12-J-4的样品中发光显著更高。
图18A是显示ENPP1 mAb抑制ENPP1介导的细胞死亡的示例性显微照片。将心脏成纤维细胞(绿色)与心肌细胞(红色)一起共培养，然后添加媒介物(图A)或者重组ENPP1和ATP和IgG(图B)或者重组ENPP1和ATP和12-J-4ENPP1mAb(图C)。图像在48小时后采集，并且在IgG对照孔中显示出细胞死亡和心脏成纤维细胞脱壁(图B)。然而，在存在ENPP1mAb的情况下细胞死亡和脱壁显著减少(图C)。
图18B是显示根据在图18A中进行的测定法通过流式细胞术测量的细胞死亡(PI+)的结果的示例性图。结果表明，在存在ENPP1mAb的情况下PI+细胞显著减少。
具体实施方式
本文描述了特异性结合至ENPP1的抗体(例如，单克隆抗体)。因此，本文提供了分离的抗体、制备此类抗体的方法、治疗心肌梗塞的方法、促进心脏伤口愈合的方法、预防心力衰竭的方法以及包含本文公开的ENPP1特异性抗体的药物组合物。
在一些方面，本文提供了与抗体12-J4-A相关的抗ENPP1抗体(例如，具有一个或多个与抗体12-J4-A相同的CDR和/或与12-J4-A竞争抗原结合)。表1中提供了抗体12-J4-A的CDR序列。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQID NO:1的CDRL1、SEQ IDNO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:4的CDRH1、SEQ ID NO:5的CDRH2和SEQID NO:6的CDRH3。
表1.12-J4-A CDR序列
Figure BDA0004014042770000061
Figure BDA0004014042770000071
在某些实施方案中，本文提供的与12-J4-A相关的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区和/或轻链可变区包含氨基酸序列和/或由核酸序列编码，所述序列与表2中列出的序列具有至少90％同一性(例如，至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性和/或100％同一性)。
表2.12-J4-A可变区序列
Figure BDA0004014042770000072
Figure BDA0004014042770000081
在一些方面，本文提供了与抗体14-O17-A相关的抗ENPP1抗体(例如，具有一个或多个与抗体14-O17-A相同的CDR和/或与14-O17-A竞争抗原结合)。抗体14-O17-A的CDR序列提供于表3中。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11的CDRL1、SEQ ID NO:12的CDRL2和SEQ ID NO:13的CDRL3。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14的CDRH1、SEQ ID NO:15的CDRH2和SEQ ID NO:16的CDRH3。
表3.14-O17-A序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
L1 RASQSISKYLH 11
L2 YISQSIS 12
L3 QQSYSWPWT 13
H1 GYTFTSY 14
H2 NPYNDG 15
H3 RGYYDYDGLDY 16
在某些实施方案中，本文提供的与14-O17-A相关的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区和/或轻链可变区包含氨基酸序列和/或由核酸序列编码，所述序列与表4中列出的序列具有至少90％同一性(例如，至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性和/或100％同一性)。
表4.14-O17-A可变区序列
Figure BDA0004014042770000091
在一些方面，本文提供了与抗体5-H7-A相关的抗ENPP1抗体(例如，具有一个或多个与抗体5-H7-A相同的CDR和/或与5-H7-A竞争抗原结合)。抗体5-H7-A的CDR序列提供于表5中。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:21的CDRL1、SEQ ID NO:22的CDRL2和SEQ ID NO:23的CDRL3。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24的CDRH1、SEQ ID NO:25的CDRH2和SEQID NO:26的CDRH3。
表5.5-H7-A CDR序列
Figure BDA0004014042770000101
在某些实施方案中，本文提供的与5-H7-A相关的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区和/或轻链可变区包含氨基酸序列和/或由核酸序列编码，所述序列与表6中列出的序列具有至少90％同一性(例如，至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性和/或100％同一性)。
表6.5-H7-A可变区序列
Figure BDA0004014042770000102
Figure BDA0004014042770000111
在某些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合至ENPP1。在一些实施方案中，本文提供的抗体结合至ENPP1并且抑制ENPP1。
如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体以及它们的任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，这些高变区称为互补决定区(CDR)，它们之间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
抗体通常以高亲和力特异性结合至它们的同源抗原，所述高亲和力以10-5至10-11M或更小的解离常数(KD)表示。任何大于约10-4M的KD通常被认为表示非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”至抗原的抗体是指以高亲和力结合至抗原和基本上相同的抗原的抗体，这意味着具有的KD为10-7M或更小、优选地10-8M或更小、甚至更优选地5×10-9M或更小、以及最优选地在10-8M和10-10M之间或更小，但是不以高亲和力结合至不相关的抗原。如果抗原表现出与给定抗原的高度序列同一性，例如，如果它表现出与给定抗原的序列的至少80％、至少90％、优选地至少95％、更优选地至少97％、或甚至更优选地至少99％序列同一性，则它与给定抗原“基本上相同”。
在一些实施方案中，本文提供的抗体可以来自通常已知的同种型中的任一者，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中被分为子类：在人中，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及在小鼠中，IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白，例如，IgG1，存在于若干同种异型中，这些同种异型在至多几个氨基酸上彼此不同。“抗体”包括，例如，天然存在的和非天然存在的抗体二者；单克隆抗体和多克隆抗体二者；嵌合抗体和人源化抗体二者；人抗体和非人抗体二者；全合成抗体；以及单链抗体。
在某些实施方案中，本文提供了本文公开的抗体的抗原结合部分(例如，与12-JA-A、14-O17-A和/或5-H7-A相关的抗体)。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指保持特异性结合至抗原(例如，ENPP1)的能力的抗体的一个或多个片段。此类“片段”的长度例如在约8和约1500个氨基酸之间，合适地长度在约8和约745个氨基酸之间，合适地约8至约300，例如约8至约200个氨基酸，或长度为约10至约50或100个氨基酸。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。如本文所述，术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，它是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，它由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，它由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，它由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，这些CDR可以任选地通过合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，所述接头使它们能够被制备为单个蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域的技术人员已知的常规技术来获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含抗体12-JA-A、14-O17-A和/或5-H7-A的一个或多个CDR(例如，如表1、3和5中所提供)。抗体的“CDR”是根据Kabat、Chothia、AbM、Contact的定义和/或构象定义或者本领域熟知的任何CDR确定方法来鉴定的高变区内的氨基酸残基。抗体CDR可以被鉴定为Kabat等人最初定义的高变区。参见，例如，Kabat等人,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,NIH,Washington D.C.。CDR的位置也可以被鉴定为Chothia等人最初描述的结构环结构。参见，例如，Chothia等人,1989,Nature 342:877-883。CDR鉴定的其他方法包括“AbM定义”，它是Kabat和Chothia之间的折衷方案，并且使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(现为
Figure BDA0004014042770000131
)来衍生化，或者基于所观察的抗原接触的CDR的“contact定义”，如MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745所示。在另一种方法中，在本文中称为CDR的“构象定义”，CDR的位置可以被鉴定为对抗原结合具有焓贡献的残基。参见，例如，Makabe等人,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。另外其他CDR边界定义可以不严格遵循上述方法之一，但是仍将与Kabat CDR的至少一部分重叠，虽然根据特定残基或残基组的预测或实验结果，它们可以是缩短的或延长的，或者甚至整个CDR都不会显著影响抗原结合。如本文所用，CDR可以指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文所用的方法可以采用根据这些方法中的任一者来定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定实施方案，CDR可以根据Kabat、Chothia、延伸、AbM、Contact和/或构象定义中的任一者来定义。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体，或者其中所有抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体的组合物。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性并且具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的抗体或抗体组合物。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含融合至永生化细胞的B细胞，所述B细胞从转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得，所述转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体。“人源化”抗体是指其中非人抗体的CDR结构域外部的一些、大多数或全部氨基酸被对应的来源于人免疫球蛋白的氨基酸替换的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外部的一些、大多数或所有氨基酸已经被来自人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区域内的一些、大多数或所有氨基酸则未改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、置换或修饰是允许的，只要它们不消除抗体结合至特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保持了与原始抗体相似的抗原特异性。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。“嵌合抗体”是指其中可变区来源于一个物种而恒定区来源于另一个物种的抗体，诸如其中可变区来源于小鼠抗体而恒定区来源于人抗体的抗体。
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以是任何同种型的。如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。在一些实施方案中，本文提供的抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE同种型抗体。
“Fc区”(可结晶片段区)或“Fc结构域”或“Fc”是指介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与定位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体或经典补体系统的第一组分(C1q)的结合的抗体的重链的C-末端区域。因此，Fc区包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的抗体的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，所述片段来源于抗体的两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区包含每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及在Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从第C226位或第P230位处的氨基酸残基(或者这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基末端，其中编号根据Kabat中的EU索引来进行。人IgG Fc区的CH2结构域从约第231位氨基酸延伸至约第340位氨基酸，而CH3结构域定位于Fc区域中的CH2结构域的C-末端侧，即，它从IgG的约第341位氨基酸延伸至约第447位氨基酸。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体，或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。Fc也可以指单独或在包含Fc的蛋白质多肽的上下文中的此区域，诸如“包含Fc区的结合蛋白”，也称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素)。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型(参见，例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”是指将CH1结构域连接至CH2结构域的重链恒定区的结构域，包括铰链的上部、中部和下部(Roux等人J.Immunol.1998161:4083)。铰链在抗体的结合区和效应子区之间提供不同程度的灵活性，并且还为两个重链恒定区之间的分子间二硫键提供位点。如本文所用，对于所有IgG同种型，铰链开始于Glu216并且结束于Gly237(Roux等人,1998J Immunol 161:4083)。
术语“铰链”包括野生型铰链以及它们的变体(例如，非天然存在的铰链或经修饰的铰链)。例如，术语“IgG2铰链”包括野生型IgG2铰链和具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，置换、缺失或添加)的变体。示例性IgG2铰链变体包括IgG2铰链，其中1、2、3个或全部4个半胱氨酸(C219、C220、C226和C229)被改变为另一种氨基酸。在一个具体实施方案中，IgG2包含C219S置换。在某些实施方案中，铰链是包含来自至少两种同种型的序列的杂合铰链。例如，铰链可以包含来自一种同种型的上铰链、中铰链或下铰链以及来自一种或多种其他同种型的铰链的其余部分。例如，铰链可以是IgG2/IgG1铰链，并且可以包含，例如，IgG2的上铰链和中铰链以及IgG1的下铰链。铰链可以具有效应子功能或不具有效应子功能。例如，野生型IgG1的下铰链提供了效应子功能。
术语“CH1结构域”是指将可变结构域连接至重链恒定结构域中的铰链的重链恒定区。如本文所用，CH1结构域开始于A118并且结束于V215。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域以及它们的变体(例如，非天然存在的CH1结构域或经修饰的CH1结构域)。例如，术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域和具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，置换、缺失或添加)的变体。示例性CH1结构域包括具有突变的CH1结构域，所述突变修饰抗体的生物学活性，诸如ADCC、CDC或半衰期。本文提供了影响抗体的生物学活性的对CH1结构域的修饰。
术语“CH2结构域”是指将铰链连接至重链恒定结构域中的CH3结构域的重链恒定区。如本文所用，CH2结构域开始于P238并且结束于K340。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域以及它们的变体(例如，非天然存在的CH2结构域或经修饰的CH2结构域)。例如，术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域和具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，置换、缺失或添加)的变体。示例性CH2结构域包括具有突变的CH2结构域，所述突变修饰抗体的生物学活性，诸如ADCC、CDC或半衰期。在某些实施方案中，CH2结构域包含降低效应子功能的置换A330S/P331S。本文提供了影响抗体的生物学活性的对CH2结构域的其他修饰。
术语“CH3结构域”是指位于重链恒定区中的CH2结构域的C-末端的重链恒定区。如本文所用，CH3结构域开始于G341并且结束于K447。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域以及它们的变体(例如，非天然存在的CH3结构域或经修饰的CH3结构域)。例如，术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域和具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，置换、缺失或添加)的变体。示例性CH3结构域包括具有突变的CH3结构域，所述突变修饰抗体的生物学活性，诸如ADCC、CDC或半衰期。本文提供了影响抗体的生物学活性的对CH3结构域的修饰。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体所特异性结合的抗原(例如，ENPP1)上的位点。表位可以由连续氨基酸形成(通常是线性表位)或者由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成(通常是构象表位)。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保持，但并非总是得以保持，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个具有独特空间构象的氨基酸。用于确定给定抗体所结合的表位的方法(即，表位作图)是本领域熟知的并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定法，其中测试重叠或连续的肽(例如，ENPP1)与给定抗体(例如，抗ENPP1抗体)的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域和本文所述的技术，例如，X射线晶体学、2维核磁共振和HDX-MS(参见，例如，Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris编,(1996))。
提及两种或更多种抗体的术语“结合相同的表位”是指抗体结合至氨基酸残基的相同区段，如通过给定方法所确定。用于确定抗体是否结合至与本文所述的抗体“相同的ENPP1上的表位”的技术包括，例如，表位作图方法，诸如，抗原:抗体复合物晶体的X射线分析，它提供了原子分辨率的表位，以及氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而丧失结合通常被认为是表位组分的指示。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于所关注的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。预期具有相同的VH和VL或相同的CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体结合至相同的表位。
在某些实施方案中，本文提供了与12-JA-A、14-O17-A和/或5-H7-A竞争抗原结合的抗体。“与另一种抗体竞争与抗原的结合”的抗体是指抑制(部分或完全)另一种抗体与靶蛋白的结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争与靶标的结合，即一种抗体是否抑制另一种抗体与靶标的结合以及抑制的程度，可以使用已知的竞争实验来确定。在某些实施方案中，一种抗体与另一种抗体竞争与靶标的结合，以及抑制另一种抗体与靶标的结合达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以有所不同，具体取决于哪种抗体是“阻断性抗体”(即，首先与靶标一起孵育的冷抗体)。竞争测定法可以如例如Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或“Using Antibodies”的第11章,Ed Harlow和David Lane编,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999所述进行。竞争性抗体结合至相同的表位、重叠表位或邻近表位(例如，如通过空间位阻所证实)。
其他竞争性结合测定法包括：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(参见Stahli等人,Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人,J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(参见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记进行的固相直接标记RIA(参见Morel等人,Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人,Virology176:546(1990))；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体结合至预定抗原上的表位。通常，抗体(i)以大约小于10-7M诸如大约小于10- 8M、10-9M或10-10M或甚至更小的平衡解离常数(KD)结合，如使用预定抗原作为分析物以及抗体作为配体在BIACORE 2000仪器中通过例如表面等离子共振(SPR)技术，或者抗体与抗原阳性细胞的结合的斯卡查德(Scatchard)分析所确定，并且(ii)以比与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍的亲和力与预定抗原结合。
在某些方面，本文提供了编码本文提供的抗体的核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。
还提供了本文所示的序列的“保守序列修饰”，例如，在表1-6中，即，不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸置换，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变来将修饰引入序列中。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有相似的侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗ENPP1抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选地被另一个来自相同的侧链家族的氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
在某些实施方案中，本文提供了与本文提供的序列基本上同源的核酸分子。对于核酸，术语“基本上同源”表示两个核酸或它们的指定序列在最佳比对和比较时是相同的，在至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，以及更优选地至少约98％至99.5％的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下与链的互补链杂交时，存在基本上同源。
在某些实施方案中，本文提供了具有与本文提供的序列基本上同源的重链和/或轻链的抗体。对于多肽，术语“基本上同源”表示两个多肽或它们的指定序列在最佳比对和比较时是相同的，在至少约80％的氨基酸，通常至少约90％至95％，以及更优选地至少约98％至99.5％的氨基酸中具有适当的氨基酸插入或缺失。
考虑到需要引入以实现两个序列的最佳比对的空位的数量和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同的位置的数量的函数(即，同源性％＝相同的位置的数量/位置的总数×100)。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实例中所述。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包(万维网地址gcg.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))(已被纳入ALIGN程序(2.0版))，使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(已被纳入GCG软件包(网址http://www.gcg.com)中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文提供的抗体的重链和/或轻链的载体。如本文所用，术语“载体”是指能够转运已与其连接的其他核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，这些载体具有相同的功能。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文公开的核酸分子的宿主细胞。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是已经将重组表达载体引入当中的细胞。应理解，此类术语不仅意指特定的主体细胞，而且意指此类细胞的后代细胞。在接续传代中由于突变或环境影响而可以发生某些修饰，因此此类后代可以实际上并不等同于亲代细胞，但其仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
在某些方面，本文提供了治疗心肌梗塞的方法，所述方法通过将本文提供的抗体和/或药物组合物施用于受试者来进行。如本文所用，“施用”是指使用本领域的技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一者，将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的抗体的优选的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射来进行，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用途径。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。
在某些实施方案中，本文提供的方法治疗受试者的心肌梗塞。如本文所用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指所进行的任何类型的干预或过程，或者将活性剂施用于受试者，以达到逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生物化学指标的进展、发展、严重性或复发的目的。治疗可以针对患有疾病的受试者或未患有疾病的受试者(例如，用于预防)。
在某些实施方案中，给接受治疗的受试者施用有效剂量的本文提供的抗体。术语“有效剂量”或“有效的剂量”被定义为足以实现或至少部分实现所期望的效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当药物或治疗剂单独或与另一种治疗剂组合使用时，通过疾病症状的严重度的降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防因疾病折磨而导致的损伤或残疾来证实促进疾病消退的药物的任何量。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，它是当药物单独或与另一种治疗剂组合施用于具有患上疾病的风险或患有疾病的复发的受试者时，抑制疾病的发展或复发的药物的任何量。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病的发展或复发的能力可以使用技术从业人员已知的多种方法，诸如在临床试验期间的人受试者中，在预测在人体中的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定药剂的活性来评估。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有心肌梗塞的受试者。在本文提供的某些实施方案中，受试者是人。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本文所述的各个方面在以下小节中进一步详细描述。
实施例
心脏成纤维细胞中的ENPP1介导ATP切割为AMP和PPi。这种将ATP切割为AMP和PPi是向肌细胞发出的信号，肌细胞随后释放小分子/代谢物，所述小分子/代谢物是促炎性的并且诱导多种非肌细胞(包括成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)的细胞死亡(图1)。通过遗传手段产生的成纤维细胞特异性ENPP1的缺失导致梗塞后伤口愈合的显著改善，以及炎症减少，重塑减弱和心脏功能显著改善。ENPP1的抑制增加心肌梗塞后心脏的伤口愈合，从而减少炎症并且更好地保护损伤后的心脏功能。本文公开了特异性靶向ENPP1并且抑制ENPP1的单克隆抗体，以及使用此类抗体作为用于治疗心肌梗塞、促进心脏伤口愈合和预防心力衰竭的治疗剂的方法。
实施例1：在心肌梗塞后在心脏中诱导ENPP1表达。
使野生型雄性和雌性小鼠经受心肌梗塞(永久结扎)，并在损伤后7天收获心脏，并进行qPCR和蛋白质印迹以确定ENPP1表达(图2A和2B)。与同一心脏或经受假损伤的动物的心脏的未受损伤的区域相比，在心脏的受损伤的区域中，ENPP1表达增加。受损伤的心脏样品的蛋白质印迹表明ENPP1表达显著增加(图2B)。ENPP1的免疫染色表明在心肌的受损伤的区域中ENPP1表达显著增加(图2C)。因此，这些观察结果表明，在小鼠缺血性心脏损伤后，在受损伤的区域中诱导ENPP1。然后，使缺乏ENPP1活性的ENPP1突变小鼠(ENPP1asj/asj小鼠)经受缺血性心脏损伤，并且观察到在突变小鼠中梗塞组织的ATP水解显著减弱(p<0.05，n＝3)，这表明ENPP1是胞外ATP水解的主要介质(Albright等人2015)。
实施例2：ENPP1主要由心脏的受损伤的区域中的心脏成纤维细胞表达。
使野生型雄性和雌性小鼠经受缺血性心脏损伤。在损伤后7天收获心脏，并且使用一套成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌和其他心肌细胞标志物进行双重免疫染色和流式细胞术。Col1a2CreERT:R26RtdTomato小鼠和TCF21MerCre Mer:R26RtdTomato小鼠(在这些小鼠中，成纤维细胞用tdtomato荧光团进行遗传标记)。这些小鼠已经被用于标记心脏成纤维细胞，并且在损伤前10天给这些小鼠施用他莫昔芬，以活化Cre并且标记心脏成纤维细胞(Acharya等人2012,Ubil等人2014)。据发现，在受损伤的心脏中，心脏成纤维细胞是ENPP1表达的主要来源(图3)。通过免疫染色未发现肌细胞表达ENPP1，这通过心脏消化和对肌细胞进行qPCR和蛋白质印迹来证实(在成纤维细胞上ENPP1的表达高1000倍；数据未示出)。流式细胞术还表明，通过MEFSK4和Thy1.2表达鉴定的心脏成纤维细胞占表达ENPP1的细胞的80％-90％。最后，在缺血性损伤后7天对受损伤的心脏中的非肌细胞进行单细胞测序，ENPP1的表达主要在成纤维细胞中观察到。ENPP1在巨噬细胞、内皮细胞等中也有一定程度的表达(图4A和4B)。
实施例3：ENPP1是心脏损伤后水解胞外ATP的主要酶。
对心脏的受损伤的和未受损伤的部分进行RNA测序，并分析所有报告的哺乳动物外切核苷酸酶以及ENPP1家族的其他成员的表达变化(图5A)。如图5A所示，ENPP1是在研究的所有时间点与未受损伤的状态相比基因表达显著增加的唯一外切核苷酸酶。为了确定ENPP1与其他已知的外核苷酸酶相比在胞外ATP水解中的生理学意义，使ENPP1突变小鼠(ENPP1asj/asj)经受缺血性心脏损伤。ENPP1asj/asj小鼠已经在文献中有所充分描述，并且在酶的胞外催化结构域中具有单个氨基酸置换，这使得催化结构域缺乏活性(Li等人2013)。使ENPP1asj/asj小鼠经受缺血性心脏损伤，并在损伤后7天测量梗塞组织的ATP水解活性(Albright等人2015)。在图5B中，ATP水解活性在ENPP1突变小鼠中显著降低，从而证实ENPP1是在梗塞心脏中介导ATP水解的主要酶。
实施例4：ENPP1具有促炎性并且可导致炎性分子从心肌细胞释放。
缺血性心脏损伤导致胞外ATP释放(继发于垂死心肌细胞的胞内内容物的释放以及跨肌细胞膜的转运/泄漏增加)(Burnstock 2017)。当过表达ENPP1的心脏成纤维细胞与心肌细胞一起共培养时，ATP的添加诱导心脏成纤维细胞的严重细胞死亡，但是当过表达ENPP1的心脏成纤维细胞在不存在心肌细胞的情况下生长时则不会如此(图6A和6B)。为了更严格地研究这一点，进行条件培养基实验，其中在用重组ENPP1蛋白和ATP处理心肌细胞后收集的条件培养基被添加至在单独的培养皿中生长的内皮细胞、成纤维细胞的平滑肌细胞。在用来自ENPP1和ATP处理的肌细胞的条件培养基处理的驻留细胞中观察到严重细胞死亡(图7)。ENPP1/ATP诱导促凋亡分子的释放，所述促凋亡分子通过在巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中发挥促凋亡性死亡来诱导细胞死亡和炎症恶化。使用LC/MS(液相色谱/质谱)进行广泛代谢表达谱分析，并初步鉴定促炎性候选物为神经酰胺，已知神经酰胺具有促炎性作用。这些体外实验提供了关于ENPP1在调节受损伤的心脏中的炎症和重塑方面的潜在作用的深入见解。
实施例5：遗传证据表明ENPP1在心肌梗塞后的心脏修复方面发挥关键作用并且是 功能结局的决定因素。
将包含大约100只近交系和重组小鼠品系的杂交小鼠多样性组用于鉴定调节成纤维细胞活化的关键基因(Rau等人2017,Yu等人2018)。给包含100只近交系和重组品系小鼠的杂交小鼠多样性组通过连续皮下输注施用异丙肾上腺素3周。异丙肾上腺素诱导心肌细胞增生和间质纤维化，并且已知异丙肾上腺素会使心脏舒张功能恶化，降低心肌顺应性(Wang等人2016)。每周对动物进行超声心动检查，以测量多个心脏性状(包括影响心脏顺应性的性状)，并收获心脏，以确定肌细胞增生和间质纤维化的进展。对每个小鼠品系的基因表达变化进行分析，映射方法将ENPP1鉴定为与不良结局密切相关的最高“命中”(Rau等人2015)。首先，观察到HMDP中的100个品系中的ENPP1表达的自然变化，尤其是在异丙肾上腺素输注后(图8)。其次，ENPP1表达增加与不良重塑和心脏结局具有强相关性。对于表现出心脏中的ENPP1表达增加、肌细胞增生程度增加、间质纤维化负担增加的小鼠品系，表现出心室扩张和顺应性恶化，这些表型与异丙肾上腺素诱导的心脏损伤后的不良心室重塑一致(图9)。这种系统遗传学方法利用映射方法和群体中的基因的自然变异，将ENPP1鉴定为异丙肾上腺素诱导的心脏损伤后调节心脏纤维化和增生的关键模块(图10)(Rau等人2017)。因此，这些观察结果表明，ENPP1是损伤后心脏重塑和功能的有力预测因子。
实施例6：ENPP1的遗传抑制导致损伤后心脏功能的保留。
在心脏成纤维细胞中条件性缺失的ENPP1是通过使具有成纤维细胞cre驱动子(Col1a2CreERT)的小鼠与ENPP1锚定的小鼠杂交以产生ENPP1 CKO(条件性敲除小鼠)来产生。ENPP1的条件性缺失导致损伤后心脏功能的显著保留和不良心脏重塑减弱(图11A-11D)。组织学分析与超声心动检查所观察的功能改善一致。与Cre(-)同窝小鼠相比，ENPP1CKO小鼠表现出纤维化显著减少并且具有较厚的疤痕(图12A和12B)。疤痕变薄以及随后的壁重塑和心室扩张是继发于不良心脏重塑的常见表型，因此这些数据表明，ENPP1的遗传缺失与心肌梗塞后显著更好的心脏重塑相关。在ENPP1 CKO动物中，中部心室的纤维化区域显著减少50％(图12C)。然后，在组织学切片上，对所有经受心脏损伤的动物的纤维化严重度进行纤维化分级，分为重度(>40％)、中度(20-40％)和轻度(<20％)。另外与功能数据一致的是，在ENPP1 CKO组中，表现出严重纤维化修复反应(不良心室重塑的替代物)的动物比例显著降低(图12D)。对ENPP1 CKO小鼠和Cre(-)同窝小鼠的心脏进行单细胞RNA测序。发现免疫标志物和纤维化标志物减少，同时血管新生增加，这表明了伤口愈合从更促纤维化性到更促修复性的总体转变(图13A-13C)。这些体内基因缺失实验为使用ENPP1单克隆抗体(mAb)来减弱心肌梗塞后的不良重塑提供了强有力的基本原理。
实施例7：心脏损伤后ENPP1的药理学抑制导致损伤后心脏功能的更好保留。
在缺血性心脏损伤后的前14天杨梅黄酮(ENPP1小分子抑制剂)的施用与显著的梗塞后有益效果和心脏功能下降的减弱相关(图14A-14D)。因此，这些数据提供了令人信服的证据，即心脏损伤后ENPP1的抑制是预防心力衰竭发展的治疗策略。
实施例8：针对ENPP1的单克隆抗体的合成和制备用于心肌梗塞的临床前模型的药 理学用途。
ENPP1的抗体是针对人重组蛋白而产生的，并且与鼠ENPP1具有显著的交叉反应性，因为该蛋白在大多数物种中是基本上保守的。该抗体是与Lake Pharma合作使用单克隆抗体(mAb)产生的标准技术来产生的，所述技术包括免疫、杂交瘤上清液的收集和测试、杂交瘤的克隆以及通过多重亲和力测定法进一步确认，然后以重组方式选择和产生ENPP1mAb。获得若干克隆，观察到12-J-4抗体对ENPP1活性具有最有效的结合和抑制作用(图15)。已经对选定的杂交瘤进行了测序，并在CHO细胞系上产生了重组单克隆，并通过电泳图和质谱进行了表征。重链的分子量为大约48kD，轻链为24kD。同种型是IgG1κ(图16)，甚至在纳摩尔浓度下也能有效抑制ENPP1(图17)。
然后，使用体外功能测定法来收集ENPP1 mAb的功能数据。如上文的实施例所示，ENPP1表达诱导心肌细胞释放促炎性和促凋亡分子，这些分子在损伤区域的许多细胞类型中诱导细胞死亡。为了测试ENPP1 mAb，进行了体外功能测定法，其中将心脏成纤维细胞与心肌细胞一起孵育，然后添加媒介物、重组ENPP1和ATP和IgG，或者重组ENPP1和ATP和12-J-4ENPP1mAb。重组ENPP1和ATP的添加诱导细胞死亡，但是ENPP1mAb(12-J-4克隆)的伴随添加则显著消除细胞死亡(图18A和18B)。
以引用的方式并入
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和序列登录号据此以引用的方式整体并入，如同特别地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一样。如有冲突，则以本申请(包括本文的任何定义)为准。
等效方案
本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效物意图由以下权利要求涵盖。

Claims (44)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区序列，其与表2、表4或表6中列出的重链可变区序列具有至少约95％序列同一性；和/或
b)轻链序列，其与表2、表4或表6中列出的轻链可变区序列具有至少约95％同一性。
2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:6、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:26的重链CDRH3序列。
3.如权利要求2所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:24的重链CDRH1序列。
4.如权利要求2或权利要求3所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:25的重链CDRH2序列。
5.如权利要求2至4中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:23的轻链CDRL3序列。
6.如权利要求2至5中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21的轻链CDRL1序列。
7.如权利要求2至6中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22的轻链CDRL2序列。
8.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链，其包含SEQ ID NO:4的CDRH1、SEQ ID NO:5的CDRH2和SEQ ID NO:6的CDRH3；以及
b)轻链，其包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3。
9.如权利要求8所述的抗体，所述抗体包含：
i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性；以及
ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性。
10.如权利要求8所述的抗体，所述抗体包含：
i)SEQ ID NO:7的重链可变区序列；以及
ii)SEQ ID NO:9的轻链可变区序列。
11.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链，其包含SEQ ID NO:14的CDRH1、SEQ ID NO:15的CDRH2和SEQ ID NO:16的CDRH3；以及
b)轻链，其包含SEQ ID NO:11的CDRL1、SEQ ID NO:12的CDRL2和SEQ ID NO:13的CDRL3。
12.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：
i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性；以及
ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性。
13.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：
i)SEQ ID NO:17的重链可变区序列；以及
ii)SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。
14.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链，其包含SEQ ID NO:24的CDRH1、SEQ ID NO:25的CDRH2和SEQ ID NO:26的CDRH3；以及
b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的CDRL1、SEQ ID NO:22的CDRL2和SEQ ID NO:23的CDRL3。
15.如权利要求14所述的抗体，所述抗体包含：
i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性；以及
ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性。
16.如权利要求14所述的抗体，所述抗体包含：
i)SEQ ID NO:27的重链可变区序列；以及
ii)SEQ ID NO:29的轻链可变区序列。
17.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如权利要求1-16中任一项所述的抗体竞争与ENPP1的结合。
18.如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、嵌合的或人源化的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是完整IgG同种型抗体。
20.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自Fv、Fav、F(ab')2)、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双抗体的抗原结合抗体片段。
21.如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合至ENPP1。
22.如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制ENPP1活性。
23.如权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是12-JA-A、14-O17-A或5-H7-A。
24.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与抗体12-JA-A、或14-O17-A、或5-H7-A竞争与ENPP1的结合。
25.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1-24中任一项所述的抗体的重链可变区。
26.如权利要求25所述的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:28具有至少95％同一性的序列。
27.如权利要求25所述的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:28的序列。
28.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1-25中任一项所述的抗体的轻链可变区。
29.如权利要求28所述的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的序列。
30.如权利要求28所述的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:30的序列。
31.一种载体，所述载体包含如权利要求25-30中任一项所述的核酸。
32.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
(a)包含如权利要求25-29中任一项所述的核酸；
(b)包含如权利要求31所述的载体；和/或
(c)表达如权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
33.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养如权利要求43所述的宿主细胞，以允许表达所述抗体或其抗原结合片段；以及(ii)回收所表达的所述抗体或其抗原结合片段。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.一种治疗受试者的心肌梗塞的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
36.一种预防受试者的心力衰竭的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
37.一种促进受试者的心脏伤口愈合的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
38.一种预防受试者的心脏组织的异位钙化的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
39.一种预防受试者的心脏组织的瘢痕形成的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
40.一种预防受试者的扩张性心肌病的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
41.一种增强受试者的心脏修复的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
42.一种预防心肌细胞的细胞死亡的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于受试者。
43.一种防止一种或更多种促炎性分子从受试者的心脏肌细胞释放的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
44.一种抑制受试者的ENPP1活性的方法，所述方法包括将如权利要求34所述的药物组合物施用于所述受试者。
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