CN104487092A - 对于由阻碍整合素α8β1功能引起的纤维化的抑制 - Google Patents

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Abstract

获得新型且有效的抗纤维化剂。使用含有整合素α8β1的拮抗剂的抗纤维化剂。或者，使用一种抗纤维化剂，其含有：与整合素α8链的帽端亚结构域中的至少1个氨基酸及其周边区域，特异结合的抗整合素α8β1抗体。或者，使用一种抗纤维化剂，其含有：与整合素α8链的R120及其周边区域，或S132及在其周边区域特异结合的抗整合素α8β1抗体。所述拮抗剂也可以是：例如，与来自人，小鼠，和大鼠的任意一个物种中的整合素α8β1，可以结合的抗整合素α8β1抗体。

Description

对于由阻碍整合素α8β1功能引起的纤维化的抑制
技术领域
本发明涉及抗纤维化剂。
背景技术
纤维化症通常为人所知的是指：以胶原蛋白等为组成成分的结缔组织增加，代替了正常组织，由此导致组织硬化，失去正常功能，从而产生疾病。产生于肝脏，肺，肾脏，心脏，在皮肤等处。例如，如果肝组织产生大量纤维化，导致肝硬变。
作为纤维化症的研究例子，非专利文献1中记载了：产生纤维化症的肺的基因表达的研究结果。根据所述结果，纤维化肺组织中的178个基因高表达，如果以显著差(p<0.01in TNoM and Student’s t-test)来算，大概有1000个左右的高表达基因。另外非专利文献2记载了：用纤维化症肺整合素α8β1的高表达。
另外专利文献1记载了：阻碍整合素(Integrin)α8β1与其配体结合的抗体。
【先行技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】国际公开第2011/049082号
【非专利文献】
【非专利文献1】"Up-regulation and profibrotic role of osteopontin inhuman idiopathic pulmonary fibrosis."Pardo et al.,PLoS Med.2005Sep；2(9):e251.Epub 2005Sep 6.
【非专利文献2】"Expression of the integrin alpha8beta1duringpulmonary and hepatic fibrosis.
"Levine et al.,Am J Pathol.2000Jun；156(6):1927-35.
发明内容
【发明要解决的课题】
然而，所述非专利文献1～2及专利文献1中没有记载：治疗纤维化症的结果。纤维化症，是众多疾病中特别难治的疾病。就本专利申请的发明人所知：市售的治疗药物只有一种，其普通名吡非尼酮(Pirfenidone，盐野义制药株式会社制备)。而且这唯一的治疗药，只在日本被认可为治疗药，美国FDA认为其药效不足，没有认可该药物。
本发明鉴于为所述情况，目的是：提供新型且有效的抗纤维化剂。
【解决课题的手段】
本发明人，如下述实施例的记载：纤维化症的小鼠模型，1)观察病理组织图像，纤维化得到改善；2)胶原蛋白α1(I)以及平滑肌肌动蛋白(Actin)(α-SMA)的基因表达量或蛋白量的增加被抑制；3)反映纤维化的指标胶原蛋白积累量的羟脯氨酸(Hydroxyproline)的量，其增加被成功抑制。所抑制的是：阻碍整合素α8β1功能的物质被投入而发挥效果。
另外，所述非专利文献1及2中，研究了纤维化组织的基因表达量的增减或分布图。然而，量或分布，并不一定意味着该分子的作用是必要的，其与其他分子共有表达调节机制从而产生变化的情况也是有的。因此，一般情况下，在一个疾病中表达增加的分子有多个。有关整合素α8β1，过去没有人能指出其与纤维化相关的功能方面的证据,本发明人在下述实施例中首次发现了这一点。在所述实施例中，得出的令人吃惊的结果：在动物级别，清楚地观察到病理组织的变化(改善)，以及所述指标被抑制。
本发明提供：含有整合素α8β1的拮抗剂(Antagonist)的抗纤维化剂。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明还提供：含有特异性结合的抗整合素α8抗体的抗纤维化剂，其特异性结合的部位是整合素α8链的帽端亚结构域内(Capsubdomain)至少一个氨基酸及其周边区域。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明还提供：含有整合素α8β1拮抗剂治疗药，用于治疗随着纤维化的进行而产生的疾病。如果使用所述治疗药，可以治疗随着纤维化的进行而产生的疾病。
【发明的效果】
使用本发明的新型且有效的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
附图说明
图1表示的是：以表面活性剂溶解导入了人α9的鸡细胞系，以抗人α9抗体Y9A2免疫沉淀的结果。
图2表示的是：使用导入了人α9的鸡细胞系和抗人α9抗体Y9A2，进行FACS分析的结果。
图3表示的是：将整合素α8β1野生型、R120突变体以及P161突变体，与实施例的抗整合素α8β1抗体反应，进行FACS分析的结果。
图4表示的是：将整合素α8β1的R120突变体(稳定表达株)，与实施例的抗整合素α8β1抗体或对照α8抗体反应，进行FACS分析的结果图。
图5表示的结果是：测量实施例的抗整合素α8β1抗体对于整合素α8β1的阻碍活性。
图6表示的结果是：通过FACS分析，检测实施例的抗整合素α8β1抗体对于人及小鼠整合素α8β1的交叉反应性。
图7表示的结果是：通过FACS分析，检测实施例的抗整合素α8β1抗体对于人及大鼠整合素α8β1的交叉反应性。
图8表示的结果是：针对各种生物而来的整合素α8β1的R120及其周边区域的氨基酸序列，进行比对(Alignment)。
图9说明的是：将实施例的抗整合素α8β1抗体向BDL小鼠给药的日程表。
图10表示的是：将实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，将BDL小鼠的肝切片以Masson染色法染色的照片。
图11表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，BDL小鼠肝脏的Colα1(I)和α-SMA的基因表达量的检测结果。
图12表示的是：在将实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，BDL小鼠的肝脏中羟脯氨酸含量的结果。
图13表示的是：将实施例的抗整合素α8β1抗体向CCl4小鼠给药的日程表。
图14表示的是：将实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，对CCl4小鼠肝切片进行Masson染色的照片。
图15表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，在CCl4小鼠的肝脏中α-SMA的蛋白表达量的检测结果。
图16表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，CCl4小鼠的肝脏中羟脯氨酸含量的测量结果。
图17表示的是：将实施例的抗整合素α8β1抗体向肺纤维化症小鼠的给药日程表。
图18表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或者不给药时，将肺纤维化症小鼠的肺切片进行HE染色后的照片。
图19表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，肺纤维化症小鼠肺中Colα1(I)和α-SMA的基因表达量的检测结果。
图20表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，肺纤维化症小鼠的体重变化的测量结果。
图21表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体给药或不给药时，肺纤维化症小鼠肺中羟脯氨酸含量的检测结果。
图22表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体阻碍整合素α8β1的阻碍活性的检测结果。
图23表示的是：实施例的抗整合素α8β1抗体对于人以及小鼠整合素α8β1的交叉反应性，通过FACS分析检测而得到的结果。
图24表示的是：将整合素α8β1S132突变体(稳定表达株)，与实施例的抗整合素α8β1抗体或对照α8抗体进行反应，进行FACS分析而得到的结果。
具体实施方式
以下，就本发明的实施方式进行详细说明。另外，对于相同的内容，为了避开重复，适当省略其说明。
本发明的一种实施方式是是新型抗纤维化剂。所述抗纤维化剂是，例如，含有整合素α8β1拮抗剂的抗纤维化剂。整合素α8β1的拮抗剂，在下述实施例中被证明：能抑制纤维化。因此，如果用含有所述组成的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
就「纤维化」而言，为人所知的典型是：以胶原蛋白等为组成要素的结缔组织增长，替换正常组织，因此组织硬化，失去正常功能，从而产生疾病。例如，在肝脏，肺，肾脏，心脏，皮肤等中产生。或例如，如果肝组织产生大量纤维化，以至于产生肝硬变。另外，除了肝硬变，随着纤维化的进行，各组织中有时产生恶性肿瘤。
就「整合素α8β1」而言，典型的是：由α链和β链组成的为异二聚体的、且存在于细胞膜表面的受体蛋白质。整合素α8β1DNA序列及氨基酸序列，可以参考例如National Center for Biotechnology Information(NCBI)的数据库GenBank等。α链的氨基酸序列可以是：例如序列编号(SEQ IDNO：)7的氨基酸序列。β链的氨基酸序列可以是：例如序列编号8的氨基酸序列。α链和β链含有：含信号肽的种类，或不含的种类。另外，作为配体可以有举出的例子有：例如骨桥蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白或腱生蛋白。
在本说明书中对于拮抗剂的种类没有特别限定,不过优选为：阻碍整合素α8β1和配体结合的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：在整合素α8链的帽端亚结构域内的至少1个氨基酸及其周边区域上，特异结合的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂是，在整合素α8链的R120及其周边区域上，或在S132及其周边区域上，特异结合的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂是，可以特异结合来自人，小鼠(mouse)，以及大鼠(rat)中任意一个的整合素α8β1的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂为，阻碍整合素α8β1功能的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂为，对于整合素α8链的R120k突变体或S132A突变体没有结合性，对于整合素α8链的野生型具有结合性的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂为，重链CDR1、2以及3分别含有序列编号为1、2以及3的氨基酸序列，且轻链CDR1、2以及3分别含有序列编号为4、5以及6的氨基酸序列的抗整合素α8β1抗体。或者优选为：所述拮抗剂为，如果是阻碍整合素α8β1及其配体结合的物质，则没有特别限定，例如可以是抗体，蛋白质，低分子化合物，高分子化合物，或核酸。
本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其中含有与整合素α8链的R120及其周边区域，或S132及其周边区域特异结合的抗整合素α8β1抗体。与整合素α8链的R120及其周边区域，或S132及其周边区域特异性结合的抗整合素α8β1抗体，如下述实施例所证明，能抑制纤维化。因此，如果使用含有所述组成的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：在整合素α8链的帽端亚结构域内的至少1个氨基酸上，或在该氨基酸及其周边区域上特异结合的抗整合素α8β1抗体。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：对于整合素α8链的R120k突变体或S132A突变体没有结合性，对于整合素α8链的野生型有结合性的抗整合素α8β1抗体。对于整合素α8链的R120k突变体或S132A突变体没有结合性，对于整合素α8链的野生型有结合性的抗整合素α8β1抗体，在下述实施例中被证明：能抑制纤维化。因此，如果使用具有所述组成的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：对于整合素α8链的1个以上的帽端亚结构域突变体没有结合性，对于整合素α8链的野生型有结合性的抗整合素α8β1抗体。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。另外，整合素α8链的帽端亚结构域突变体指的是：帽端亚结构域内的至少1个氨基酸发生了突变的突变型整合素α8链。在此处，对于帽端亚结构域突变体没有结合性的抗体：可以是对于至少1个突变体不具有结合性；也可以是对于不同于所述突变体的，而位于其他帽端亚结构域内的氨基酸发生突变的突变体具有结合性。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：编码阻碍整合素α8β1功能的抗整合素α8β1抗体的多核苷酸(Polynucleotide)。阻碍整合素α8β1功能的抗整合素α8β1抗体，如下述实施例所证明，能抑制纤维化。因此，如果使用含有所述组成的抗纤维化剂，从所述多核苷酸表达所述抗整合素α8β1抗体，其结果是能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：整合素α8β1拮抗剂的前体(Precursor)。整合素α8β1拮抗剂，如下述实施例所证明，能抑制纤维化。因此，如果使用含有所述组成的抗纤维化剂，由所述前体产生所述拮抗剂，结果是能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抗纤维化剂，其含有：整合素α8β1的功能阻碍剂。阻碍整合素α8β1的功能，如下述实施例所证明，能抑制纤维化。因此，如果使用含有所述组成的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式是一种抑制或治疗纤维化的方法，使用本实施方式中的拮抗剂或抗纤维化剂。
根据所述方法，通过抑制纤维化，可以治疗纤维化或随着纤维化进行而产生的疾病。
另外，本发明的一种实施方式是一种胶原蛋白积累(Accumulation)抑制剂，其含有整合素α8β1的拮抗剂；或者是一种胶原蛋白积累(Accumulation)抑制的方法。整合素α8β1的拮抗剂，如下述实施例所证明，能抑制胶原蛋白的积累。因此，如果使用含有所述组成的胶原蛋白积累抑制剂，能抑制胶原蛋白的积累。
另外，本发明的一种实施方式是一种胶原蛋白α1(I)或α-SMA的表达抑制剂，其含有整合素α8β1的拮抗剂；或是一种抑制胶原蛋白α1(I)或α-SMA表达的方法。整合素α8β1的拮抗剂，如下述实施例所证明，可以抑制胶原蛋白α1(I)及α-SMA的表达。因此，如果使用含有所述组成的胶原蛋白α1(I)或α-SMA的表达抑制剂，可以抑制胶原蛋白α1(I)或抑制α-SMA的表达。胶原蛋白α1(I)和α-SMA的氨基酸序列及DNA序列可以参照GenBank等。
另外，本发明的一种实施方式是一种羟脯氨酸生成的抑制剂，其含有整合素α8β1拮抗剂；或是一种抑制羟脯氨酸生成的方法。整合素α8β1拮抗剂，如下述实施例所证明，能抑制羟脯氨酸的产生。因此，如果使用含有所述组成的羟脯氨酸生成抑制剂，能抑制羟脯氨酸的产生。羟脯氨酸的含量测定，例如，可以按照下述实施例中记载的步骤进行，也可以使用"Inayama et al.,Keio J Med.Vol.27,No.1,43-46(1978)"等所述的方法。
本发明的一种实施方式是：表达整合素α8β1，并且对于胶原蛋白α1(I)或α-SMA的表达量高于正常细胞的非正常细胞中的，上述胶原蛋白α1(I)或上述α-SMA的表达具有阻碍的方法。该方法含有使整合素α8β1拮抗剂和所述非正常细胞接触的步骤。根据所述方法，通过阻碍胶原蛋白α1(I)或α-SMA的表达，能抑制疾病。
本发明的一种实施方式是：表达整合素α8β1，并且对于羟脯氨酸的产生量高于正常组织的非正常组织中的，上述羟脯氨酸的产生具有阻碍的方法，该方法含有使整合素α8β1拮抗剂和和所述非正常组织接触的步骤。根据所述方法，通过阻碍羟脯氨酸的产生，能抑制疾病。
在本说明书中，整合素α8链的R120及其周边区域，优选为：含有整合素α8链的第114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，或126位氨基酸序列的区域。或是也可以含有整合素α8链的序列编号9的氨基酸序列的区域。其周边区域，如果含有所述抗整合素α8β1抗体的表位(Epitope)区域的话，则没有特别限定。另外，所述114～126位是：以含有信号肽时的整合素α8链为基准计算时而得的位置。因此，整合素α8链不含有信号肽时，所述114～126位，其意思可以是：分别相当于76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，和88位的氨基酸。另外，就抗体在特定区域特异结合而言，包括：抗体将特定区域作为表位识别。作为表位识别，包括：作为表位的一部分识别。就抗体特定的氨基酸及在其周边区域的特异结合而言，包括：抗体对于特定的氨基酸及其周边的立体结构，特异识别、结合。
本说明书中，整合素α8链的S132及其周边区域，可以是：含有整合素α8链的126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，或138位氨基酸序列的区域。另外，所述126～138位：以含有信号肽时整合素α8链为基准计算而得的位置。因此，整合素α8链不含有信号肽时，所述的126～138位，其意思可以是：分别相当于88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，和100位的氨基酸。所述氨基酸的周边区域是：例如，将本实施方式的抗体作为表位识别的区域。所述的氨基酸周边区域，如果是将抗体作为表位识别的区域，也可以含有所述氨基酸前后的1，2，3，4，5，或6个氨基酸。
在本说明书中，整合素α链的帽端亚结构域，可以包括帽端亚结构域插入部(Cap subdomain insert)1～4。本实施方式的抗体结合的α链的部位，考虑到稳定地抑制纤维化，优选为位于插入部1中。插入部1可以是：例如整合素α链的113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，或132位。整合素α8链不含有信号肽时，所述的113～132位，其意思可以是：分别相当于75～94位的氨基酸。插入部2可以是：例如整合素α链的154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，或171位。整合素α8链不含有信号肽时，所述154～171位，其意思可以是：分别相当于116～133位的氨基酸。插入部3可以使：例如，整合素α链的187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，或199位。整合素α8链不含有信号肽时，所述187～199位，其意思可以是：分别相当于149～161位的氨基酸。插入部4可以是：例如，整合素α链的233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，或250位。整合素α8链不含有信号肽时，所述的233～250位，其意思可以是：分别相当于195～212位的氨基酸。整合素家族的帽端亚结构域的位置的例子是，例如，《Xiao et al.,Nature.2004Nov 4；432(7013)∶59-67.》中记载的。
在本说明书中，通过抗整合素α8β1抗体阻碍整合素α8β1功能的状态，包括：例如，使整合素α8β1与所述配体反应时的结合量，相对于正常时有意义的减少。所述有意义的减少可以是：例如，所述结合量减少至0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.01，或0倍。所述倍率，可以是：在此举出的任意1个值以下，或任意2个值的范围内。考虑到整合素α8β1的功能被特别明确地阻碍，优选为减少至0.5倍以下，更加优选为减少至0.1倍以下。所述结合量可以是：例如，如下属实施例所述的方法那样，在固定了配体的基板(plate)中，使整合素α8β1表达细胞接触、以吸光强度测量粘着后的细胞数，从而测得结合量。在本说明书中「有意义」可以是：例如以Student's t-test(单侧或两侧)评估统计学的显著差，其p<0.05时的情况。或包括:产生具有实际差异的状态。
在本说明书，抗体对于抗原没有结合性的状态包括：抗体抗原完全不结合的状态，或抗体向抗原的结合量显著少的状态。抗体和抗原的结合性可以是：例如，使抗体和抗原表达细胞反应之后，通过流式细胞技术(FACS)分析测量。所谓FACS分析是：其典型的为，用激光照射在流通池内流动的细胞，检测从细胞来的前方散射光、侧面来的散射光的参数，鉴定细胞特性的分析方法。例如可以是：抗体和抗原非表达细胞反应时的峰，与抗体和抗原表达细胞反应时的峰相比较，本质上不具有有意义的变化时，判断为抗体对于抗原不具有结合性。另一方面可以是：抗体和抗原非表达细胞反应时的峰，与抗体和抗原表达细胞反应时的峰相比较，本质上具有有意义的变化时，判断为抗体对于抗原具有结合性。或者没有结合性的状态可以是：通过表面等离子体共振测量装置测量结合速率常数(Ka)，与有结合性时相比可以是0.2，0.1，0.05，或0.01倍的状态。所述倍率，可以使在此举出的任意1个值以下，或任意2个值的范围内。
在本说明书中，基因表达被阻碍的状态，包括：基因表达被有意义的阻碍的状态。或者可以是被阻碍40，50，60，70，80，90，或100％。所述百分比，可以是在此举出的任意1个值以上，或任意2个值的范围内。从抑制纤维化的观点来看，优选为50％以上，更加优选为70％以上。或者可以使：例如，与产生纤维化的组织中基因表达量相比，表达量减少至0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.01，或0倍的状态。所述倍率，可以是在此举出的任意1个值以下，或任意2个值的范围内。从抑制纤维化的观点来看，优选减少至0.5倍以下，更加优选为减少至0.1倍以下。另外，本说明书基因的表达量被抑制的状态，与所述的基因表达量减少的状态为相同状态。
在本说明书中，羟脯氨酸的产生被阻碍的状态，包括：羟脯氨酸的产生被有意义地阻碍的状态。或者可以是：被40，50，60，70，80，90，或100％地阻碍。所述比例，可以是在此举出的任意1个值以上，或任意2个值的范围内。或者是，例如，包括：与产生纤维化的组织中羟脯氨酸的产生量相比，减少至0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.2，0.1，或0倍的状态。所述倍率，可以是在此举出的任意1个值以下，或任意2个值的范围内。从抑制纤维化的观点来看，优选为减少至0.9倍以下。另外，在本说明书中，羟脯氨酸的产生量被抑制的状态，与所述羟脯氨酸的产生被阻碍的状态为相同状态。
在本说明书中，增加指的是，包括：例如增加至1.2，1.3，1.4，1.5，2，2.5，3，5，10，或40倍的状态。所述倍率，可以是在此举出的任意1个值以上，或任意2个值的范围内。
在本说明书中，所谓配体的前体是，含有下述物质：在in vivo或in vitro中，与任意物质反应结构发生变化，其结果是，可以成为与所述配体结构相同的物质。
在本说明书中，氨基酸是：有氨基和羧基的有机化合物的总称。本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体包含「特定的氨基酸序列」时，所述氨基酸序列中任意一个氨基酸可以被化学修饰。可以是这种的情况下，本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体，也可以被称为：含有所述「特定的氨基酸序列」。一般情况下，就蛋白质中的氨基酸在生物体内被化学修饰而言，是：例如N末端修饰(例如，乙酰化，肉豆蔻酰化等)，C末端修饰(例如，酰胺化，糖基磷脂化(Glycosylphosphatidylinositol)加成等，或侧链修饰(例如，磷酸化，糖链加成等)等。
在本说明书中，多核苷酸(Polynucleotide)，包括：核苷酸或碱基，或其等价物(Equivalents)，复数结合的状态下组成的物质。核苷酸及碱基含有：DNA碱基或RNA碱基。所述的等价物，含有：例如DNA碱基或RNA碱基被甲基化等化学修饰的物质，或含有核苷酸类似物。核苷酸类似物，含有非天然的核苷酸。所谓「碱基序列」，是组成多核苷酸的核苷酸或所述等价物的序列。在碱基序列的记载中，A，T，G，C，分别含有：腺嘌呤及所述等价物，胸腺嘧啶及所述等价物，鸟嘌呤及所述等价物，胞嘧啶及所述等价物。
另外T和U(尿嘧啶)，可以根据用途互相替换。另外，多核苷酸可以采用DNA/RNA合成装置合成。另外，可以从DNA碱基或RNA碱基合成的受托公司(例如，Invitrogen公司等)购买。另外，多核苷酸也可以载体(vector)或是质粒。
作为所述载体，可以使用：例如，来自大肠杆菌的质粒(例如pET-Blue)，来自枯草菌的质粒(例如pUB110)，来自酵母的质粒(例如pSH19)，动物细胞表达质粒(例如pA1-11)，λ噬菌体等噬菌体，来自病毒的载体等。
这些载体，可以含有：启动子，复制起始点，或耐抗菌素的基因等，蛋白质表达所需要的组成要素。载体可以是表达载体。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体编码的多核苷酸或载体，可以将细胞遗传转化。如果采用所述遗传转化体，可以使用该技术领域的公知方法，制得本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体。遗传转化体，可以使其他的哺乳动物(例如，大鼠，小鼠，豚鼠，兔子，牛，猴子等)的细胞。作为哺乳动物细胞可以是，例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，猴子细胞COS-7等。或者，遗传转化体也可以使Escherichia属菌，酵母等。
将所述多核苷酸或载体向细胞中导入和抗体生产，可以根据该技术领域公知的方法进行。将多核苷酸或载体导入细胞的方法可以是：例如，使用磷酸钙法，脂质体转染法，电穿孔法，腺病毒法，逆转录病毒法，或显微注射法等(修订第4版新基因工程学手册,羊土社(2003)∶152-179.)。作为使用抗体细胞的生产方法可以是使用，例如，"蛋白质实验手册,羊土社(2003)∶128-142."中记载的方法。
抗体的纯化方法，例如，可以使用硫酸铵，乙醇沉淀，蛋白质A，蛋白质G，凝胶过滤层析，阴离子，阳离子交换色谱法，磷酸纤维素层析，疏水性互相作用色谱法，亲和色谱法，羟基磷灰石层析，或凝集素层析等方法(蛋白质实验手册,羊土社(2003)∶27-52.)。
在本说明书中所指的「结合」，意思是物质间的连接。连接可以是：共价键结合或非共价键结合的任意一种，例如，离子结合，氢结合，疏水性相互作用，或亲水性相互作用。本说明书中，抗原抗体反应的「识别」，意思可以是：抗体工程学领域中通常使用的意思，例如，包括特异结合这样的意思。
在本说明书中的「1种以上」指的是：可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或20种，可以是所述任意一个值以上，或其范围内。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体结合的整合素α8β1，其来源没有特别限定,不过优选为：人，小鼠，豚鼠，仓鼠，大鼠，老鼠，兔子，猪，羊，牛，马，猫，狗，狨猴，猴子，黑猩猩的任意1种以上。
其中，从抗整合素α8β1抗体作为治疗药使用的观点而言，优选人。或者，从作为在非临床试验使用的模型动物特别合适的观点而言，优选小鼠及大鼠。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体，可以是单克隆抗体。如果是单克隆抗体，和多克隆抗体相比，可以高效率地对整合素α8β1起作用。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体，可以是：有抗原结合活性的抗体片段(下文有时称其为「抗原结合性片段」)。此时，具有的效果是：稳定性提高，或抗体的生产效率提高等。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体，可以是：与整合素α8β1野生型或突变型结合的抗体。所谓突变型，包括：个体间DNA序列的差异造成的情况。但是，优选为：与整合素α8链的R120k突变体或S132A突变体没有结合性。野生型或突变型α链的氨基酸序列，优选为：相对于序列编号7所示的氨基酸序列，有80％以上的同源性，更优选为有90％以上的同源性，特别优选有95％以上的同源性。野生型或突变型β链的氨基酸序列，相对于序列编号8的氨基酸序列，优选为80％以上的同源性，更优选为90％以上的同源性，特别优选为有95％以上同源性。
本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体的种类(class)，没有特别限定,不过可以是，例如IgM，IgD，IgG，IgA，或IgE。
另外，本发明的一种实施方式为一种含抗整合素α8β1抗体的抗纤维化剂，所述含抗整合素α8β1抗体含有：重链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为1、2以及3的氨基酸序列；轻链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为4，5，和6的氨基酸序列。含有所述特定的氨基酸序列的抗整合素α8β1抗体，如下述实施例所证明，能抑制纤维化。因此，如果使用含有所述组成的抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式为一种含抗整合素α8β1抗体的抗纤维化剂，所述含抗整合素α8β1抗体含有：重链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为10，11，和12的氨基酸序列；轻链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为13，14，和15的氨基酸序列。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，本发明的一种实施方式为一种含抗整合素α8β1抗体的抗纤维化剂，所述含抗整合素α8β1抗体含有：重链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为16，17，和18的氨基酸序列；轻链CDR1、2以及3，分别含有序列编号为19，20，和21的氨基酸序列。如果使用所述抗纤维化剂，能抑制纤维化。
另外，为人所知的是：一般情况下，即使抗体的氨基酸序列中产生某种程度的缺失，置换，插入，加成(添加)等，抗体仍然保持某种程度的功能。因此，特定具有所述氨基酸序列的抗整合素α8β1抗体，可以产生某种程度的缺失，置换，添加。这种缺失，置换，添加等的抗体，可以根据例如，根据定点突变法，随机突变法，或用抗体噬菌体库的生物淘汰法(Biopanning)等制得。作为定点突变法，可以使用例如KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO CO.,LTD.)。从缺失，置换，添加等导入后的突变型抗体，选择与野生型具有同样活性的抗体的方法，可以是：以FACS分析或ELISA等各种表征方法。
另外，所述抗整合素α8β1抗体，只要具有阻碍整合素α8β1与其激动剂(Agonist)结合的功能，可以是：含有相对于野生型，有1个或1个以上的氨基酸缺少失，置换，插入，附加的氨基酸序列的抗体。或者，只要具有阻碍整合素α8β1及其激动剂结合的功能，可以是：含有与野生型有90％以上同源性的氨基酸序列的抗体。或者，只要具有阻碍整合素α8β1及其激动剂结合的功能，可以是含有如下序列的抗体，该序列是：相对于由与编码(code)野生型的氨基酸序列的碱基序列所互补的碱基序列组成的核酸，在严格的(Stringent)条件下进行杂化(Hybridized)的核酸的碱基序列所编码出的氨基酸序列。
所述的序列编号为1，5，10，14，16，或20的氨基酸序列，只要所述抗整合素α8β1抗体具有阻碍整合素α8β1与其激动剂结合的功能，可以是各个氨基酸序列中1或2个氨基酸缺失，置换，插入或附加。
另外，所述的序列编号为2，3，4，6，11，12，13，15，17，18，19，或21氨基酸序列，只要所述抗整合素α8β1抗体具有阻碍整合素α8β1与其激动剂结合的功能，可以是各个氨基酸序列中1、2或3个氨基酸缺失，置换，插入或附加。
如果所述抗整合素α8β1抗体中有1个或1个以上的氨基酸缺少失，置换，插入或附加时，「1个以上」可以是15，10，8，6，4，或2个，也可以是其中任意一个值以下。优选为：该数字小。其原因是：所述「1个以上」的数字越小，越接近原来的抗整合素α8β1抗体的特性。另外，一般情况下，1或1个以上体的氨基酸残基的缺失，添加，插入，或被其他氨基酸置换的多肽，保持其生物学活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci U SA.1984Sep；81(18)∶5662-5666.，Zoller et al.,Nucleic Acids Res.1982Oct25；10(20)∶6487-6500.，Wang et al.,Science.1984Jun 29；224(4656)∶1431-1433.)。
所述抗整合素α8β1抗体中，如果有1个或1个以上氨基酸被其他氨基酸置换，优选为：以保持氨基酸侧链性质的其他氨基酸进行置换。例如，就氨基酸侧链的性质而言，可以举出的例子有：疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，脂肪族侧链氨基酸(G，A，V，L，I，P)，含羟基侧链的氨基酸(S，T，Y)，含硫原子侧链的氨基酸(C，M)，含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D，N，E，Q)，含碱基侧链的氨基酸(R，K，H)，含芳香族侧链的氨基酸(H，F，Y，W)。(括号内均为氨基酸的单字母缩写)。上述各个小组内的氨基酸之间的置换被总称为「保存性置换」。
所述抗整合素α8β1抗体中，表示氨基酸序列同源性时用的「90％以上」，可以是例如90，95，98，99，或100％。可以是上述值的任意一个值以上，或在其范围内。优选为：所述数值大。其原因是所述「90％以上」的数值越大，其特性越接近原来的上述抗整合素α8β1抗体。
在本说明书中的同源性，可以是：根据本技术领域公知的方法，计算在2个或多个氨基酸序列中，同样的氨基酸数的比例。在计算比例之前，将待比较的氨基酸序列群的氨基酸序列排列对齐，为了得出最大同源性比例，必要时在氨基酸序列的一部分中导入间隙(间隔、缺口)。排列对齐的方法，比例的计算方法，比较方法，以及与之相关的电脑程序，是本技术领域中广为人知的(例如BLAST，GENETYX等)。在本说明书中的「同源性」，没有特别情况，可以根据NCBI(http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST测量值来表示。在BLAST中比较氨基酸序列时的Algorithm中，可以使用默认设置的Blastp。测量结果以Positives或Identities进行数值化。
在本说明书中的严格条件，例如可以使用以下的条件。(1)为了清洗，使用低离子强度及高温度(例如，以50℃，0.015M的氯化钠/0.0015M的柠檬酸钠/0.1％的十二烷基硫酸钠)(2)杂交(Hybridization)中使用霍尔姆酰胺等变性剂(例如，以42℃，50％(v/v)霍尔姆酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％的聚乙烯吡咯烷酮/50mM的pH6.5磷酸钠缓冲液体，以及750mM的氯化钠，75mM柠檬酸钠)，或(3)20％霍尔姆酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt溶液(Denhardt's solution)，10％硫酸葡聚糖，以及20mg/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中，以37℃培养1夜，然后在37-50℃以1×SSC洗涤过滤器。另外，霍尔姆酰胺浓度可以是50％以上。冲洗时间为5，15，30，60，或120分钟，或上述时间以上。影响杂交反应严格性的因素有：温度，盐浓度等2个以上因素，详细可参考Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience Publishers,(1995)。
所述抗整合素α8β1抗体，也可以含有保藏号为NITE BP-824，NITEBP-826，或NITE BP-828质粒编码出的的重链，VH，重链CDR1～3，或重链FR1～4。或者，也可以含有被保藏号NITE BP-825，NITE BP-827，或NITE BP-829质粒编码出的轻链，VL，轻链CDR1～3，或轻链FR1～4。
另外，所述抗整合素α8β1抗体可以是由下述细胞而得，该细胞含有：从保藏号为NITE BP-824，NITE BP-826，或NITE BP-828质粒。另外，所述细胞可以进一步可以含有保藏号NITE BP-825，NITE BP-827，或NITEBP-829质粒。
另外，所述抗整合素α8β1抗体可以是从下述细胞而得，该细胞含有：对应编码为保藏号NITE BP-824，NITE BP-826，或NITE BP-828质粒的抗整合素α8β1抗体的重链；或编码出VH的载体的。所述载体可以进一步编码出：对应编码为保藏号NITE BP-825，NITE BP-827，或NITE BP-829质粒的抗整合素α8β1抗体的轻链或VL。另外所述细胞可以进一步含有：对应编码为保藏号NITE BP-825，NITE BP-827，或NITE BP-829质粒的抗整合素α8β1抗体的轻链；或编码出VL的载体。
另外，所述保藏号NITE BP-824质粒的大小是约6.8kbp。在所述质粒中，编码抗整合素α8β1抗体重链的区域大小是约1.7kbp。在所述抗整合素α8β1抗体重链的编码区域的上游及下游，分别有Kpn I及PinA I限制性内切酶位点。因此，通过Kpn I及PinA I处理保藏号NITE BP-824质粒，可以分离出抗整合素α8β1抗体重链的编码区域的多核苷酸。另外，所述保藏号NITE BP-825质粒的大小是约6.5kbp。在所述质粒中，抗整合素α8β1抗体轻链的编码区域的大小是约1kbp。在所述抗整合素α8β1抗体轻链的编码区域的上游及下游，分别有Hind III及Xba I限制性内切酶位点。因此，通过Hind III及Xba I处理保藏号NITE BP-825质粒，可以分离出抗整合素α8β1抗体轻链的编码区域的多核苷酸离析。另外，就所述保藏号BP-826，NITE BP-828，NITE BP-827，NITE BP-829质粒而言，也可以使用公知技术,分离出抗体重链或抗体轻链的编码区域的多核苷酸。
在本说明书中的抗体，含有：可以特异结合抗原上特定的表位的分子或分子群。另外抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。另外，抗体可以以各种状态存在，例如，可以：Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、diabody，diabody，单链抗体(例如，scFv)，dsFv，多价特异性抗体(例如，二价特异性抗体)，具有抗原结合性的肽或多肽，嵌合抗体(例如，小鼠-人嵌合抗体等)，小鼠抗体，人源化抗体，人抗体，或它们的同等物(或等价物)组成的组中选出的一种以上的状态。另外抗体含有抗体修饰物或抗体非修饰物。抗体修饰物可以是：抗体和例如聚乙烯二醇等各种分子结合。抗体修饰物可以通过公知技术对抗体进行化学修饰而得。
多克隆抗体可以是：例如，为了诱导对抗原特异性的多克隆抗体的生成，向哺乳类(例如，大鼠，小鼠，豚鼠，兔子，牛，猴子等)，鸟类等中，通过将含有目的抗原的免疫原给药(Dosing)而生成。
免疫原的给药可以注入1个以上的免疫剂，以及(在需要的情况下)佐剂(Adjuvant)。佐剂可以是：为了增加免疫应答而使用的，可以含有着弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物质凝胶(氢氧化铝等)、或界面活性物质(溶血卵磷脂等)等。免疫方案，是该技术领域公知的，与选择的的宿主生物一起，根据引起免疫应答的任意方法而实施(蛋白质实验手册,羊土社(2003)∶86-91.)。
就单克隆抗体而言，组成群的各个抗体，除去含有少量自然产生的可能的突变之抗体，含有如下情况：其实质上为与单一表位相对应的抗体。或是，组成群的各个的抗体，除了少量自然产生的含有可能的突变之抗体，可以是实质上同样的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，与多克隆抗体不同，典型的多克隆抗体含有：对应于不同表位的不同抗体。除了所述特异性之外，单克隆抗体是从没有被其他免疫球蛋白污染的杂交瘤细胞培养、合成而来。“单克隆抗体”这个称呼，只不过显示了从具有实质均一的抗体群而来这一特征，并不意味着：必须是以特定方法生产而来的抗体。例如，在本说明书的单克隆抗体，也可以按照"Kohler G,Milstein C.,Nature.1975Aug 7；256(5517)∶495-497."中所述的杂交瘤细胞法制得。或者，本发明使用的单克隆抗体，也可以根据美国专利第4816567号记载的那种组重组法制得。或者，本说明书的单克隆抗体也可以按照"Clackson etal.,Nature.1991Aug 15；352(6336)∶624-628."或"Marks et al.,J MolBiol.1991Dec 5；222(3)∶581-597."中记载从噬菌体抗体库分离而得。或者，也可以按照"蛋白质实验手册,羊土社(2003)∶92-96."中记载的方法制得。
Fv，是含有抗原识别部位的抗体。所述区域含有：非共价键结合的1个重链可变域及1个轻链可变域的二聚物。在所述组成中，各可变域的3个CDR互相起作用，在VH-VL二聚物表面能形成抗原结合部位。
Fab是:例如，是一种抗体，其中，用含有具有Fab区域及Fc区域的抗体的水解蛋白的木瓜蛋白酶，处理得到的片段中，H链的N末端侧约有一半和L链的全部，通过部分的二硫键结合而结合。Fab可以按照如下方法而得：例如，本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体含有Fab区域及Fc区域，将该抗体用蛋白水解酶木瓜蛋白酶处理而得。
F(ab’)2，是一种抗体，其中，对于含有具有Fab区域及Fc区域的抗体，以水解蛋白的木瓜蛋白酶处理，得到的片段中，有2个是相当于Fab部位。F(ab’)2可以是按照如下方法制得：例如，本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体含有Fab区域及Fc区域，将该抗体用蛋白水解酶木瓜蛋白酶处理而得。另外，例如，可以通过使下述Fab’以硫醚基结合或二硫键结合，进行制备。
Fab’是，例如一种抗体，通过切断F(ab’)2铰链区域的二硫键结合而制得。例如，以还原剂二硫苏糖醇处理F(ab’)2而得。
scFv是：一种抗体，其中，VH和VL通过适肽接头(Peptide接头)连接。scFv可以用如下方法生产：例如，得到本发明的实施方式的抗整合素α8β1抗体的VH及VL对应编码的cDNA，构建编码VH-肽接头-VL的多核苷酸，将上述多核苷酸构建于载体中，再使用表达用细胞进行生产。
diabody是：有二价抗原结合活性的抗体。就二价抗原结合活性而言，可以是相同，也可以是相互不同的抗原结合活性。Diabody可以按照如下方法生产：例如，构建编码scFv的多核苷酸，使肽接头的氨基酸序列的长度为8个残基以下，将得到的多核苷酸构建于载体中，再使用表达用细胞进行生产。
dsFv是一种抗体，其中，多肽的VH及VL中导入了半胱氨酸残基，将上述多肽通过上述半胱氨酸残基件的二硫键而结合。就半胱氨酸残基导入的位置而言：按照Reiter等公开的方法(Reiter et al.,Protein Eng.1994May；7(5)∶697-704.)，根据抗体的立体结构的预测可以选择。
有抗原结合性的肽或多肽是一种抗体，其构成中含有：抗体的VH、VL、或它们的CDR1，2，或3。含有1个以上的CDR的肽，可以直接结合或通过适当的肽接头结合。
所述的Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFv、有抗原结合性的肽或多肽(下文中，有时称为「Fv等」)的生产方法，没有特别限定。例如，编码本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体中的Fv等区域的DNA，被构建于表达用细胞能进行生产。或者，也可以根据Fmoc法(Fluorenylmethyloxycarbonyl method)，tBOC法(t-butyloxycarbonyl method)等的化学合成法生产。另外本说明书中，抗原结合性片段也可以是一种以上的Fv。
典型的嵌合抗体是：将不同种类生物间的抗体的可变区和抗体的不变区连接而得，可以以基因重组技术容易地构建出来。生成嵌合抗体的方法，是该技术领域的公知技术。例如，小鼠-人嵌合抗体，可以按照"Roguska etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.1994Feb 1；91(3)∶969-973."中记载的方法制作。制备小鼠-人嵌合抗体的基本的方法是：例如，被克隆的cDNA中存在的小鼠前导序列以及可变序列，将小鼠前导序列以及可变序列与下述序列连接而得：编码哺乳类细胞的表达载体中已存在的人抗体不变区的序列。或者也可以是：将被克隆的cDNA中存在的小鼠前导序列以及可变序列和编码人抗体不变区的序列连接后，连接到哺乳动物表达载体中。人抗体不变区的片段，可以是任意的人抗体H链不变区及人抗体L链不变区的片段，例如，就人H链中的而言可以是例如Cγ1，Cγ2，Cγ3或Cγ4，就L链中的而言可以例如Cλ或Cκ。
人源化抗体，典型的是：与为希望的抗原结合的抗体，其具有来自非人的1个以上CDR、人免疫球蛋而来的框架区(FR)、以及人免疫球蛋白而来的不变区。人源化抗体可以根据该技术领域中已知的各种的技术制得(Almagro et al.,FRont Biosci.2008Jan 1；13:1619-1633.)。例如，CDR移植(Ozaki et al.,Blood.1999Jun 1；93(11)∶3922-3930.)，Re-surfacing(roguska etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.1994Feb 1；91(3)∶969-973.)，或FRshuffle(Damschroder et al.,Mol Immunol.2007Apr；44(11)∶3049-3060.Epub 2007Jan 22.)等。为了改变(优选的是：为了改善)抗原结合，可以将人FR区域的氨基酸残基，与来自CDR供体抗体(Donor antibody)的对应残基置换。就所述FR置换而言，可以以该技术领域公知的方法进行(Riechmann et al.,Nature.1988Mar 24；332(6162)∶323-327.)。例如，可以通过CDR和FR残基的互相作用的模拟(Modeling)，识别出抗原结合的重要FR残基。或者可以是，通过序列比较，识别出在特定的位置中的异常FR残基。
人抗体，典型的是：该抗体中，含有的组成抗体的重链的可变区域及不变区、轻链的可变区域及不变区的区域，来自编码人免疫球蛋白的基因。主要的制备方法有：制备人抗体的转基因小鼠法，噬菌体展示法等。
制备人抗体的转基因小鼠法中，向被定点敲除内源性Ig的小鼠中导入功能性人Ig基因的话，可以产生出各种具有抗原结合能力的人抗体，而非鼠抗体。并且使该小鼠免疫的话，可以用现有的杂交瘤细胞法获得人单克隆抗体。例如，可以按照"Lonberg et al.,Int Rev Immunol.1995；13(1)∶65-93."中记载的方法制备。噬菌体展示法，典型的是：使大肠杆菌病毒之一的M13或T7等纤维状噬菌体的外壳蛋白(g3p和g10p等)的N末端侧不失去噬菌体的感染性，将外来基因作为融合蛋白质表达的系统。例如，可以使用"Vaughan et al.,Nat Biotechnol.1996Mar；14(3)∶309-314."中记载的方法制备。
另外，抗体可以根据抗体CDR-grafting(Ozaki et al.,Blood.1999Jun1；93(11)∶3922-3930.)，在任意的抗体中，通过将本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体的重链CDR或轻链CDR移植(Grafting)而制备。或者也可以：将编码本发明实施方式的抗整合素α8β1抗体的重链CDR或轻链CDR的DNA，和编码公知的来自人或人以外生物的抗体中除了重链CDR或轻链CDR的区域的DNA，按照本技术领域公知的方法连接到载体上后，使用公知的细胞将其表达而制得。此时，为了提高向抗整合素α8β1抗体的靶抗原的作用效率，可以采用本领域公知方法(例如，将抗体的氨基酸残基随机突变，筛选反应性高的方法，或噬菌体展示法等)，将除了重链CDR或轻链CDR以外的区域进行最优化。另外也可以使用，例如，FRshuffle(Damschroder et al.,Mol Immunol.2007Apr；44(11)∶3049-3060.Epub2007Jan 22.)、或者将游标区(Vernier zone)氨基酸残基或包装残基(packaging residues)置换的方法(特开2006-241026，或Foote et al.,J MolBiol.1992Mar 20；224(2)∶487-499.)，将FR区域最优化。
重链(heavy chain):是全长抗体的主要构成要素。典型的是，与轻链(light chain)以二硫键结合及非共价键结合的方式结合在一起。重链的N末端侧的区域中，可以是同种的同一类(class)的抗体，也存在着氨基酸序列不固定的所谓“可变区域(VH)”，一般情况下，为人所知的是：VH对于抗原的特异性、亲和性有很大贡献。例如，"Reiter et al.,J Mol Biol.1999Jul16；290(3)∶685-98."记载了：在只制备VH分子时，其与抗原特异性、高亲和性地结合在一起。并且，"Wolfson W,Chem Biol.2006Dec；13(12)∶1243-1244."记载了：在骆驼的抗体中，存在没有轻链，只有重链的抗体。
CDR(互补性决定区域，complementarity determining region)是在抗体中的区域，形成于实际上和抗原直接接触的结合部位。一般情况下，CDR位于抗体的Fv(可变区域∶含有重链可变区域(VH)及轻链可变区域(VL))上。另外，一般情况下，CDR有：大约由5～25氨基酸残基组成的CDR1，CDR2，CDR3。并且为人所知的，特别是，重链的CDR对于抗体向抗原的结合有贡献。另外，CDR中，CDR3对于抗体向抗原的结合之贡献最大。例如，"Willy et al.,Biochemical and Biophysical Research CommunicationsVolume 356,Issue 1,27April 2007,Pages 124-128"中记载了：通过改变重链CDR3，使抗体结合能力上升。另外，因为CDR是决定抗体对抗原特异性的区域，在抗体间氨基酸序列有很大差异，也被称为超可变区域。CDR以外的Fv区域被称为框架区域(FR)，其由FR1，FR2，FR3及FR4组成，在抗体间相对地被很好保存下来(Kabat et al.,「Sequence of Proteins ofImmunological Interest」US Dept.Health and Human Services,1983.)。即，给与抗体反应性特征的主要原因是重链CDR3，其次也可以说是重链CDR。
关于CDR的定义及决定其位置的方法被多次报道。例如，Kabat的定义(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)，或Chothia的定义(Chothia et al.,J.Mol.Biol.1987；196:901-917)。在在本说明书中，使用Kabat的定义作为优选的例子,不过，不一定受其限定。另外，根据情况的不同，也可以同时考虑Kabat定义和Chothia的定义决定，例如，可以将依每种定义的CDR之定义的重复部分，或者将依每种定义的CDR之定义的两者均囊括的部分，作为CDR。这种方法的具体例子是：Kabat定义和Chothia定义的折中方案，即使用Oxford Molecular’s AbM antibodymodeling software的Martin等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989；86:9268-9272)。
本说明书中的抗纤维化剂，包括抑制纤维化用的治疗药。或者，包括治疗随着纤维化的进行产生的疾病的治疗药。或者，抗纤维化剂也可以是：用于再生医疗的抑制纤维化的药剂。另外，在本说明书中所说的“治疗”，意思是：针对被试验对象的疾病(包括纤维化)或者是伴随着疾病的1个以上的症状，发挥了改善症状的效果或者预防的效果。治疗药也包括预防药。
另外，抗纤维化剂是：含有药理学上允许的1个或更多个所述载体(Carrier)的医药组合物。就医药组合物而言，可以是：例如将有效成分和所述载体混合，在制剂学技术领域中为人所知的任意方法制备。另外，抗纤维化剂，可以单独使用有效成分，也可以和任意成分混合。另外，所述载体的形状没有特别限定。
给药路径，优选使用的是：治疗时，有效果的。例如，可以是静脉内，皮下，肌肉内，腹腔内，或口服给药。作为给药形态，例如，可以是注射剂，密封剂，药丸，颗粒剂。所给的药是抗体医药时，作为注射剂来使用是有效的。注射用的水溶液可以用：例如，小瓶(Vial)，或不锈钢容器来保存。另外注射用的水溶液可以是：例如，混合生理食盐水，糖(例如海藻糖，即Trehalose)，NaCl，或NaOH等。另外，抗纤维化剂可以是：例如，混合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液)，稳定剂等。
对于给药量没有特别限定,不过可以是：例如，一次0.25或0.5mg/个体(mg/body)很好地，可以是在上述数值的范围内。给药间隔没有特别限定,不过可以是：例如，每3天给药一次而持续2周，也可以每周给药2次而持续4周。给药量，给药间隔，给药方法，可以根据被试验对象的年龄、体重、症状、对象的内脏器官等，做出选择。另外，也可以与合适的化学疗法药物一起使用给药。另外，抗纤维化剂优选为；含有发挥疗的有效量的，或发挥出所期望的作用之有效量的有效成分。另外，所述胶原蛋白积累的抑制、胶原蛋白α1(I)及α-SMA的表达抑制剂、氨酸生成抑制剂，优选为：使用与抗纤维化剂同样的给药方法。
在本说明书中的“被试验对象”为：包括人或除了人以外的哺乳动物(例如，小鼠，豚鼠，仓鼠，大鼠，老鼠，兔子，猪只，羊，山羊，牛，马，猫，狗，狨猴，猴子，和黑猩猩等中的任意1种以上。
在本说明书中的「或是」，在使用文章中被列举的事项的「至少1个以上」可以被使用使，而被使用。「或」也一样。如果本说明书中写明「2个值的范围内」，则所述范围包含2个值本身。
以上，就本发明的实施方式进行了说明,不过，这些只是本发明的示例，也能采用所述以外各种各样的组成。另外也可以将上述实施方式中的记载中的组成组合起来使用。
【实施例】
以下，以实施例进一步说明本发明，不过，本发明不受它们的限定。
<实施例1>抗整合素α8β1抗体的制备
(1)免疫
将小鼠整合素α8链的cDNA克隆到哺乳动物表达载体中。其次，以电穿孔法(Electroporation method)将所述表达载体转染淋巴母细胞样细胞系后，添加药剂后进行表达细胞的选择。得到的小鼠整合素α8链表达细胞系在鸡中超免疫(Hyperimmune)。以流式细胞术(FACS)分析，来测量鸡血清中的抗体值。关于FACS分析，按照FACSCalibur(BD,USA)的一般的方法(Protocol)进行。
另外，整合素α8链与β1链形成异二聚体，在鸟类，哺乳类的任意一种中被确认(Bossy B,et al,EMBO J 10(9)∶2375-2385,1991；J Cell Sci108:537-544,1995)。但是，哺乳类的α链和鸟类的β链是不是能形成异二聚体，相关的具体实验数据没有被报道。因此，按照以下步骤，确认了：人的α9和鸡的β1形成了异二聚体，作为整合素分子被表达于细胞膜表面。首先，将人α9cDNA导入鸡细胞系中，通过药选择得到了稳定表达株。其次，以表面活性剂使所述导入了人α9的鸡细胞系溶解，以抗人α9抗体Y9A使其免疫沉淀(图1)。在电泳道(lane)1中出现2条带，可知：人α9链和其他分子形成了复合体。泳道2是表达整合素α9β1的α9-transfectedSW480(人大肠癌细胞系)的免疫沉淀，比较的话可知：泳道1的2个带是α9链和β1链。
并且，使用导入了人α9的鸡细胞系和抗人α9抗体Y9A2进行FACS分析(图2)。与无染色细胞的柱状图相比，在与抗体反应时柱状图向右移动，可知：人α9在膜表面被表达。因此可以认为：在所述整合素α8链表达细胞系中，同样地，α8链和β1链的异二聚体形成了。另外，所述的小鼠整合素α8链的氨基酸序列，是序列编号7所示的氨基酸序列。
(2)scFv噬菌体抗体库的制备
从进行了免疫的鸡摘出脾脏，之后分离淋巴球。从得到的淋巴球中提取RNA，进行cDNA的合成，制得scFv噬菌体抗体库。有关噬菌体抗体库的制法，按照"nakamura et al.,J Vet Med Sci.2004Jul；66(7)∶807-14"中记载的一般技术进行。
(3)淘汰(panning)选择
将scFv噬菌体抗体库添加到小鼠整合素α8链的非表达细胞系中，进行非特异噬菌体的吸附操作(Absorption operation)之后，使其与小鼠整合素α8链表达细胞系反应。用有机溶剂清洗后，将与小鼠整合素α8链表达细胞系特异结合的噬菌体回收，使其感染大肠杆菌。进行4次淘汰之后，以使用了小鼠整合素α8链表达细胞系的FACS分析，确认了库(Library)的反应性。因为3rd库的反应性高，从3rd库进行噬菌体的克隆，选择阳性克隆后，决定序列。有关细胞淘汰，是依据"Giordano et al.,Nat Med.2001Nov；7(11)∶1249-53."中记载的方法进行的。
(4)人整合素α8链交叉克隆的选择
为了取得与人整合素α8链有交叉反应的抗体，制备了表达人整合素α8链的鸡淋巴母细胞样细胞系。通过FACS分析，进行与人整合素α8链表达细胞系也有交叉反应的克隆的选择。
(5)对于重组IgY(rIgY)抗体的重组
通过以上实验得到scFv噬菌体，以编码该噬菌体的DNA链为模板，进行VH，VL的PCR放大后，与鸡抗体的前导序列、不变区进行overlapPCR，克隆rIgY表达载体。将制备的H链，L链构建子(construct)转染哺乳类培养细胞后，纯化表达的抗体。rIgY抗体的重组，是按照"Shimamotoet al.,Biologicals.2005Sep；33(3)∶169-74."中记载的方法进行的。根据以上步骤，制备出3种(#3抗体，#5抗体，#26抗体)抗整合素α8β1抗体(单克隆抗体)。
另外，含有编码#3抗体、#5抗体、或#26抗体重链的DNA序列的质粒，均于2009年10月16日寄存于日本独立行政法人制品评估技术基盘机构专利微生物寄存中心(日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。随后，日本寄存的所述质粒，于2010年10月12日各个保藏号为NITE BP-824、NITE BP-826、或NITE BP-828，基于布达佩斯条约被移送国际寄存。
另外，含有编码#3抗体、#5抗体、或#26抗体轻链的DNA序列的质粒，均于2009年10月16日寄存于日本独立行政法人制品评估技术基盘机构专利微生物寄存中心(日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。随后，日本寄存的所述质粒，于2010年10月12日以各个保藏号NITE BP-825，NITE BP-827，或NITE BP-829，基于布达佩斯条约被移送国际寄存。这些寄存的6个质粒，是在上述(5)中，使用表达载体而制得的。
另外，#3抗体的重链CDR1，2，3分别是SYDMV(序列编号为1)，IYSAGSGPQYAPAVKG(序列编号为2)，ADSTYCASGSCYAADSID(序列编号为3)。另外，#3抗体的轻链CDR1，2，3分别是SGGGSWYG(序列编号为4)，DNTNRPS(序列编号为5)，GSADSTDAV(序列编号为6)。CDR是与抗整合素α8β1抗体的抗原结合的特性相关的部位。#5抗体的重链CDR1，2，3分别是SYDMA(序列编号为10)，IDDDDSFTLYGAAVKG(序列编号为11)，VGDGYCGWSACGGSID(序列编号为12)。另外#5抗体的轻链CDR1，2，3分别是SGDESYYG(序列编号为13)，SNDKRPS(序列编号为14)，GXYDSSTYAGI(序列编号为15)。#26抗体的重链CDR1，2，3分别是GHDMA(序列编号为16)，IGSSGSNTNYGTAVKG(序列编号为17)，PGSCYGCTPDAGEID(序列编号为18)。
另外#26抗体的轻链CDR1，2，3分别是SGSSGSYYG(序列编号为19)，ESTKRPS(序列编号为20)，GNEDSSYVGI(序列编号为21)。另外，X在氨基酸分析表示:不能分析的氨基酸。
<实施例2>表位的评估
制备8种人α8链cDNA(R120，K125，S132，P161，Y199，A238，A260，S261)，使它们在CHO细胞中瞬时表达，与#3抗体反应。#3抗体对野生型和7种突变体(K125，S132，P161，Y199，A238，A260，S261)保持了反应性,不过对于R120突变而来的(R120突变体)没有反应。#3抗体与野生型、R120突变体，以及P161突变体反应，进行FACS分析后的结果如图3所示。接着，为了排除因瞬时表达法R120k突变体表达不充分的可能性，制备稳定表达株，同样地使其反应，仍然没有观察到反应。另外，确认了：R120k突变体与对照α8抗体很好地反应，充分地被表达(图4)。这些结果显示：#3抗体识别的表位是R120及其周边区域。
<实施例3>阻碍整合素α8β1活性的评估
在96-well(96-孔)基板上，小鼠骨桥蛋白(Mouse Osteopontin)(2.5mg/ml)固相化。接着，在所述基板上以1x10E5细胞/well加入表达α8的K562细胞，同时将#3抗体以图5中所示的浓度加入。图5中，A570nm检测粘着细胞。A570nm的值越低，表示：表达α8的K562细胞和骨桥蛋白结合的越少。
所述结果显示，#3抗体阻碍了：表达α8的K562细胞与骨桥蛋白的结合(图5)。即，#3抗体具有的功能是：整合素α8β1的拮抗剂。另外抗体浓度为0.05μg/ml，观察到60％以上的活性被阻碍(把抗体未加添时作为100)。另外，抗体浓度为0.10μg/m，观察到70％以上，抗体浓度为，0.25μg/ml，95％以上的阻碍活性被阻碍。
<实施例4>交叉反应性的评估
(1)与人及小鼠整合素α8β1的反应性评估
通过FACS分析研究：#3抗体与表达人整合素α8链的SW480细胞系，和表达小鼠整合素α8链表达的SW480细胞系的交叉反应性。图6显示了其结果使用。表达人整合素α8链的SW480细胞系、以及表达小鼠整合素α8链的SW480细胞系中的任何一个，与#3抗体反应，和不反应时相比，峰的位置明显右移。另外Mock时，峰没有变动。由此显示了：#3抗体可以与人及小鼠两方的整合素α8β1结合。
(2)与大鼠整合素α8β1的反应性评估
克隆大鼠整合素α8链的cDNA，使其在CHO细胞中瞬时表达，以FACS确认了其与#3抗体的反应性。作为阳性对照，使用人整合素α8亚基(subtunit)的瞬时表达细胞。如图7所示，#3抗体与大鼠整合素α8链反应了。其反应性，与人整合素α8链反应时的程度相同。
(3)与其他生物来源的整合素α8β1反应性的评估
根据上述实施例2的结果，#3抗体识别的表位是R120及其周边区域。在研究了上述部分的大鼠氨基酸序列后发现：其与小鼠以及人的完全相同。在此，从数据库也收集其他种的序列，进行比对(alignment)(图8)。其结果发现：牛，猪只，狗，仓鼠，狨猴，罗猴，长臂猿，黑猩猩，在R120以及N-末端6个残基、C-末端6个残基的共计13残基(TNNRKIRVNGTKE，序列编号为9)同源性为100％。因此，可以认为：#3抗体与仓鼠，牛，猪只，狗，狨猴，罗猴，长臂猿，黑猩猩的整合素α8β1也有反应性。
<实施例5>由于胆管结扎而纤维化的小鼠模型(Bile Duct Ligation(BDL)鼠)的治疗效果的评估
(1)向BDL小鼠的给药
如图9所示，在Day 0，制备了：为了诱导肝纤维化，将小鼠的胆管结扎，在肝内胆管周边产生了纤维化的所谓“BDL小鼠”。另外，将无内毒素的#3抗体以0.5mg/个体(mg/body)的量，于小鼠腹腔内每2周、3天给药。为了比较，准备了没有将抗整合素α8β1抗体给药的BDL小鼠。并且，按照如下方法测量的纤维化指标。
(2)Masson染色法染色
为了研究BDL小鼠肝组织的纤维化，进行Masson染色。图10是：由胆管，门静脉，肝动脉组成的三个一组(biliary triad)之周边组织图像。上面的图是没有将#3抗体给药的。在上面的图中，被蓝色染色的胶原蛋白纤维的量增加了，新产生了微胆管，即产生了胆管增生。另外，较大胆管中表皮增殖，另外，在胆管周边发现炎症细胞的浸润。红色是肝实质细胞。下面的图是：将#3抗体给药的。将下图与上图比较，虽然同样地产生了微胆管增生，但胶原蛋白纤维的增加程度显著减少。由此可知：通过胆管结扎，胆管内压上升，引起胆管增生,不过伴随其进行的纤维化，由于抗体给药被抑制了。
(3)Colα1(I)和α-SMA的基因表达的测量
在BDL小鼠的肝脏中，胶原蛋白α1(Colα1(I))和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达，以定量PCR法分析，比较#3抗体给药/不给药的小鼠。图11显示了：正常小鼠的为1时的相对表达量。
在BDL小鼠中，Colα1(I)的表达是正常小鼠的40倍以上。该值，由于#3抗体给药，减少到10倍以下的值。即，通过#3抗体给药，BDL小鼠的Colα1(I)的表达被阻碍了75％以上。另外，在BDL小鼠中，α-SMA的表达量增加至正常鼠的约9倍以上。该值，通过#3抗体给药，减少到5倍以下的值。即，通过#3抗体给药，BDL小鼠的Colα1(I)的表达被阻碍了约50％。
(4)羟脯氨酸的定量
羟脯氨酸反映组织中的胶原蛋白量，作为纤维化定量标准的方法被使用。就BDL小鼠肝脏中的羟脯氨酸量，在#3抗体给药/不给药小鼠之间进行比较。图12显示了所述结果。BDL小鼠的羟脯氨酸的量，通过#3抗体给药，从240μg/g肝脏组织减少至150μg/g肝脏组织。
另外，羟脯氨酸的测量按照以下步骤进行。首先，将小鼠肝组织于6NHCl中均质化(Homogenize)，为100mg/ml。其次在110℃下静置24小时，以800×g离心15分钟，回收上清。于上清20μl中添加14μl的8N NaOH中和后，加入266μl dH2O，使总量达到0.3ml。并且，与等量的异丙醇(异丙醇)混合后，添加如0.1ml氯胺-T(Chloramine-T)溶液。在室温下静置10分钟静置后，添加0.5ml的二甲氨基苯甲醛(Dimethyl aminobenzaldehyde)溶液，充分混合，旋转以甩下粘在壁上的样品液(Spindown)。以50℃进行90分钟的显色反应。此后，在室温下降温5分钟后，向基本中注入150μl，测量A590。接着，使用样品来制作标准曲线，进行定量。另外氯胺-T溶液是：含有0.336g氯胺-T(最终是0.84％)、3M NaOAc 0.56ml(最终是42mM)、柠檬酸溶液0.02g(最终是2.6mM)、异丙醇15.8ml(最终是39.5％)，以dH2O调整溶液，是总量为40ml。另外二甲苯甲醛溶液是：混合了p-dimethylaminobenzaldehyde(对-二甲氨基苯甲醛)0.248g、过氯酸(60％)0.27ml、异丙醇0.73ml。
<实施例6>四氯化碳诱导性纤维化小鼠模型(CCl4小鼠)的治疗效果的评估
(1)向CCl4小鼠给药
如图13所示，在Day 1时，为了诱导肝纤维化，在小鼠皮下将将橄榄油为溶剂的50％四氯化碳以2ml/kg个体给药，制备CCl4小鼠。另外，将无内毒素的(Endotoxin-free)#3抗体以0.25mg/个体的量于小鼠的腹膜内，每周给药2次进行4周。为了比较，制备不将抗整合素α8β1抗体给药的CCl4小鼠。并且，按照如下方法测量纤维化的指标。
(2)Masson染色
以Masson染色法对CCl4小鼠的肝切片进行染色。图14显示了所述结果。上图是#3抗体不给药的情况。上图中可以看出：与肝小叶周边的Grisson外壳(Grisson’s capsules)一致，胶原蛋白增加了。被染上蓝色的是胶原蛋白纤维，按照肝的小叶结构增生了6角形。下图是#3抗体给药的情况。下图中，几乎看不到上图中所见的肝小叶周边的Grisson膜的肥厚。
(3)α-SMA的表达量
正常小鼠和#3抗体给药/不给药的CCl4小鼠的肝脏中α-SMA的表达量，以Western blotting进行观察。
图15显示了上述结果。CCl4小鼠中，在#3抗体不给药时，与正常小鼠相比，α-SMA的表达量增加(抗体(-)，n＝3)。另一方面，通过将抗整合素α8β1抗体给药，α-SMA的表达量减少(抗体(+)，n＝3)。右端泳道表示：阳性控制组(LX2细胞的提取物)。
(4)羟脯氨酸的定量
就CCl4小鼠的肝脏中羟脯氨酸的量，在#3抗体给药/不给药的小鼠间进行比较。图16显示了所述结果。CCl4小鼠的羟脯氨酸的量，由于#3抗体给药，从220μg/g肝脏组织减少至177μg/g肝脏组织。
可以明确得知，通过上述实施例5以及6的结果，由于使用#3抗体，可以：1)改善所观察到的肝纤维小鼠模型的病理组织学的纤维化，2)抑制胶原蛋白α1(I)及α-SMA的基因表达量的增加，3)抑制羟脯氨酸量的增加。这样，在动物水平，清楚明白地观测到所见之病理组织的变化，这是让人吃惊的事情。不过，已经通过如下数值被证实：即伴随着纤维化而产生的分子的定量化之数值。
<实施例7>博莱霉素(Bleomycin)诱发性的肺纤维化症小鼠模型(肺纤维化症小鼠)的治疗效果的评估
(1)向肺纤维化症小鼠给药
如图17所示，在Day 0中，为了诱导肺纤维化，在鼠的气管内将博莱霉素(日本化药制造)以1.25U/kg个体给药，制备博莱霉素诱导的肺纤维化症小鼠模型。另外，将无内毒素的#3抗体以10mg/个体在鼠的腹腔内，每3天给一次药(持续2周)。作为对照，制备：将生理食盐水于腹腔中给药的博莱霉素诱导肺纤维化症小鼠模型。并且，按照如下方法测量纤维化的指标。
(2)病理图像
博莱霉素诱导的肺纤维化症小鼠，其博莱霉素给药21天后的病理图像(HE染色)，如图18所示。左面的对照组的小鼠产生了显著的纤维化，由于炎症性细胞的浸润和成纤维细胞的增生，由于纤维素的沉积等原因导致正常肺泡结构的丧失。另一方面，右边抗体给药组的小鼠中，与正常肺相比，虽然有肺泡间壁的肥厚或炎症细胞浸润,不过肺泡结构得以保持，与对照组相比，纤维化被强烈抑制。
(3)体重的推移
在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠中，发现：与纤维化相关的体重增加被抑制或体重减少。测量上述肺纤维化症小鼠的体重变化(图19)。所述结果显示：#3抗体不给药的小鼠，从将博莱霉素给药的3天后到7天后平均减少了1.8g(约10％)的体重。另一方面，#3抗体给药的小鼠，体重几乎不减少。即，可以认为：通过#3抗体给药，由于纤维化导致的体重减少被抑制了。
(4)Colα1(I)和α-SMA的基因表达的测量
用定量PCR法分析，就上述肺纤维化症小鼠的肺中Colα1(I)和α-SMA的基因表达，在#3抗体给药/不给药的小鼠间进行比较，以#3抗体给药小鼠中的表达量作为1，相对表达量如图20所示。
抗体不给药的小鼠中，与#3抗体给药组相比，α-SMA的表达量为4倍以上，Colα1(I)是8倍以上。通过#3抗体给药，博莱霉素模型中纤维化相关的基因在肺中的表达被抑制了。
(5)羟脯氨酸的定量
就上述肺纤维化症小鼠的肺中羟脯氨酸量，在#3抗体给药/不给药小鼠间进行比较。图21显示了所述结果。肺纤维化症小鼠的羟脯氨酸的量，通过#3抗体给药，从840.7μg/g肺组织减少至602.8μg/g肺组织。
<实施例8>阻碍整合素α8β1的#5抗体及#26抗体的阻碍活性评估
在96-well(96-孔)的基板中将Nephronectin(2.5mg/ml)固相化。其次，以0.05～5μg/ml的浓度，处理#3抗体，#5抗体，或#26抗体后，于上述基板中加入α8β1的K562细胞，达到1×10E5细胞/well，培养1小时后，染色附着的细胞，测量吸光强度。
所述结果如图22所示：#3抗体，#5抗体，和#26抗体，阻碍了表达α8β1的K562细胞和Nephronectin的结合(图22)。所述结果显示：#3抗体，#5抗体，和#26抗体，具有整合素α8β1拮抗剂的功能。另外，如图所述，可以认为：#5抗体及#26抗体，具有与#3抗体同样地抑制纤维化的性质。
<实施例9>#5抗体及#26抗体的交叉反应性的评估
表达整合素α8β1来自的来自人及小鼠的乳腺癌细胞系(分别为Hs578T，4T1)，通过FACS分析研究了#3抗体，#5抗体，和#26抗体的交叉反应性。所述结果为：使用人及小鼠来源的细胞中的任意一个，使其分别与#3抗体，#5抗体，和#26抗体反应，与不反应时比较，峰的位置明显右移(图23)。由此显示：#5抗体及#26抗体分别可以与来自人及小鼠两方的整合素α8β1结合。
<实施例10>#5抗体的表位的评估
具有阻碍α8β1作用的#5抗体，与#3抗体同样，是以鸡为宿主制备的，其应该识别与α8链序列中不同于鸡α8β1序列的部位。在此，人α8链序列中，向与鸡α8β1序列不同的氨基酸中加入突变，得到共计22种人α8链突变体cDNA。让该人α8链突变体于CHO细胞中瞬时表达，使其与#5抗体反应。#5抗体与S132突变体不反应，与野生型和其他的21种突变体保持了反应性。接着，为了排除瞬时表达法中S132突变体没有充分表达的可能性，制备稳定表达株，同样地使之反应,不过同样没有观察到反应。确认了如下之事：S132突变体与对照α8抗体很好地反应，充分表达(图24)。所述对象α8抗体，识别所述22种突变部位以外的部位。上述结果显示：#5抗体识别的表位是S132及其周边区域。
#5抗体所识别的α链的S132，和#3抗体所识别的R120，均位于α链的帽端亚结构域中。因此，显示了：作为阻碍整合素α8β1与骨桥蛋白结合的抗体，识别帽端亚结构域内的氨基酸是重要的。
以上实施例1～10的结果显示：通过使用整合素α8β1拮抗剂，可以抑制纤维化。另外，通过使用识别整合素α8链的R120及其周边区域、或S132及其周边区域的抗整合素α8β1抗体，可以抑制纤维化。
以上，以实施例说明了本发明。不过所述实施例是只是示例，可以有种种变形例，这些变形例也属于本发明的范围，这是本领域技术人员所理解的。

Claims (10)

1.一种抗纤维化剂，含有整合素α8β1的拮抗剂。
2.权利要求1中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
阻碍整合素α8β1和配体结合的抗整合素α8β1抗体。
3.权利要求1或2中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
与整合素α8链的帽端亚结构域中的至少1个氨基酸及其周边区域特异结合的抗整合素α8β1抗体。
4.权利要求1～3的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
与整合素α8链的R120及其周边区域，或S132及其周边区域特异结合的抗整合素α8β1抗体。
5.权利要求2～4的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
与来自人、小鼠、以及大鼠中的任意一个物种的整合素α8β1，可以结合的抗整合素α8β1抗体。
6.权利要求1～5的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
与整合素α8链的1个以上的帽端亚结构域突变体没有结合性，
而与整合素α8链的野生型具有结合性的抗整合素α8β1抗体。
7.权利要求1～6的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是：
与整合素α8链的R120k突变体或S132A突变体没有结合性，
而与整合素α8链的野生型有结合性的抗整合素α8β1抗体。
8.权利要求2～7的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述拮抗剂是单克隆抗体。
9.权利要求2～8的任意一项中所述的抗纤维化剂，其中，所述抗整合素α8β1抗体是：抗原结合性片段。
10.一种针对随着纤维化的进行而产生的疾病的治疗药，其中含有整合素α8β1的拮抗剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3031826T3 (pl) 2013-08-09 2019-03-29 Toray Industries, Inc. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia i/lub zapobiegania nowotworowi
US20190071504A1 (en) * 2016-03-15 2019-03-07 The Regents Of The University Of California Methods And Compositions For Treating And Preventing Disease Associated With Alpha 8 Beta 1 Integrin
KR102078775B1 (ko) 2017-11-29 2020-02-19 서울대학교산학협력단 항-ros1 항체 및 그의 용도
CN110872354B (zh) * 2018-09-04 2022-11-01 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 哺乳动物细胞重组抗人tk1的鸡源的单克隆抗体、单链抗体及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040037827A1 (en) * 1999-04-22 2004-02-26 Gotwals Philip J. Method for the treatment of fibrosis
TW201119678A (en) * 2009-10-21 2011-06-16 Univ Hiroshima Integrin α8β1 specific monoclonal antibody

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5462990A (en) * 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
UA73300C2 (en) * 1999-06-01 2005-07-15 Biogen Inc Use of composition containing homolog of antibody antagonizing interaction between integrin with alpha-4 subunit and its ligand for treating fibrosis
JP4452884B2 (ja) 2005-03-01 2010-04-21 国立大学法人広島大学 抗体およびその利用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040037827A1 (en) * 1999-04-22 2004-02-26 Gotwals Philip J. Method for the treatment of fibrosis
TW201119678A (en) * 2009-10-21 2011-06-16 Univ Hiroshima Integrin α8β1 specific monoclonal antibody

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. BOUZEGHRANE ET AL.: "α8β1 integrin is upregulated in myofibroblasts of fibrotic and scarring myocardium", 《JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY》 *
LEVINE,ET AL: "Expression of the Integrin α8β1 during Pulmonary and Hepatic Fibrosis", 《AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY》 *
MIN LU ET AL.: "Integrin α8β1 mediates adhesion to LAP-TGFβ1", 《JOURNAL OF CELL SCIENCE》 *

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