MX2013005532A - Anticuerpos anti-ligando de quimiocina cc 20 (ccl20) neutralizantes. - Google Patents

Anticuerpos anti-ligando de quimiocina cc 20 (ccl20) neutralizantes.

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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados, quiméricos y de murino novedosos que tienen especificidad de unión por el ligando de quimiocina CC 20 de humano (CCL20). La presente invención se refiere además a cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados, vectores recombinantes y células hospedantes que comprenden una secuencia la cual codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de los anticuerpos y a un método para preparar los anticuerpos. Los anticuerpos anti-CCL20 de la invención se puede utilizar en aplicaciones terapéuticas para tratar, por ejemplo, trastornos inflamatorios y autoinmunes y el cáncer.

Description

ANTICUERPOS ANTI -LIGANDO DE QUIMIOCINA CC 20 (CCL20) NEUTRALIZANTES Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados, quiméricos y de murino novedosos que se dirigen específicamente contra el ligando de quimiocina CC 20 j de humano (CCL20, por sus siglas en inglés) . Los anticuerpos humanizados de la invención son particularmente bastante adecuados como agentes terapéuticos para el tratamiento ¡ de enfermedades inflamatorias y autoinmunes .
Antecedentes de la Invención El sistema inmune es un bio-circuito sumamente sofisticado que es utilizado por el cuerpo para discriminar lo que no es propio (por ejemplo, sustancias u organismos i I extraños) de lo propio. La detección de lo que no es propio en el cuerpo puede dar por resultado la inflamación, en¡ la cual varios componentes celulares y moleculares se coordinan ¡ para responder a eventos potencialmente perjudiciales que son causados por la sustancia u organismo no propio. Aunque: el proceso inflamatorio ayuda a proteger al cuerpo de un ataque del exterior, la desregulación del sistema inmune puede conducir a consecuencias negativas tal como un auto-ataque, por ejemplo, una enfermedad autoinmune . Al alterar la función de moléculas inflamatorias tales como quimiocinas, puede ser REF: 241211 i posible reducir el inicio y el progreso de los trastornos relacionados con respuestas inmunes/inflamatorias .
Las quimiocinas son una familia de proteínas pequeñas (8-10 kDa) que desempeñan un papel fundamental en la inflamación. Durante el proceso inflamatorio, las quimiocinas se producen localmente en el sitio del estímulo nocivo1 y funcionan como participantes centrales para reclutar células inmunes que expresan sus receptores cognados, siete receptores acoplados a la proteína G transmembrana (GPCRs, por sus siglas en inglés) . El CCL20, nombrado alternativamente quimiocina hepática y regulada por la activación (LARC, por sus siglas en inglés) , proteína-3 alfa inflamatoria derivada de macrófagos ( ??-3 , por sus siglas en inglés) o Exodus-1, es una quimiocina soluble que ¡ es expresada por células epiteliales. Se sabe que !los queratinocitos epiteliales y las células del recubrimiento sinovial producen grandes cantidades de CCL20 durante las condiciones homeostáticas así como también inflamatorias y patológicas tales como cáncer, psoriasis y artritis reumatoide . El receptor cognado para CCL20 es el receptor de quimiocina CC6 (CCR6) ; el CCL20 es la única quimiocina conocida que interactúa con el CCR6. En respuesta a la séñal de CCL20, las células inmunes que poseen el CCR6 , tal como las células dendríticas inmaduras (DC, por sus siglas en inglés) , las células T efectoras/de memoria y las células B, i i emigran e infiltran los tejidos circundantes, activando ide esta manera la cascada inflamatoria. 1 Debido a que la expresión de CCL20 es aumentada significativamente en la inflamación inducida por citocinas inflamatorias tal como la interleucina 1ß (IL-?ß) y el factor I de necrosis tumoral a (TNF-a) , se piensa que la interacción i de CCL20-CCR6 desempeña un papel en los procesos inflamatorios patológicos. ' La artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) es una de las enfermedades autoinmunes más comunes. El primer signo de RA es frecuentemente la sinovitis, la cual se manifiesta como una articulación dolorosa, hinchada. Aunque los factores específicos que inician la sinovitis permanecen siendo desconocidos, se piensa que las células epiteliales de recubrimiento sinovial y los fibroblasjtos sinoviales son inductores primordiales de la reacción inflamatoria. El fluido sinovial de pacientes con RA quimio-atrae de manera efectiva monocitos humanos y células auxiliares T17 (Thl7) pro- inflamatorias , los cuales luego inducen y exacerban el proceso inflamatorio de la RA. Debido a que las células sinoviales reactivas son capaces I de producir grandes cantidades de CCL20 (particularmente bajo la influencia de IL-?ß y TNF-cc) , mientras que el CCR6 es el receptor principal de células Thl7, se piensa que la interacción de CCL20-CCR6 desempeña un papel clave en el proceso inflamatorio.
La interacción CCL20-CCR6 también puede desempeñar un papel importante en ciertos tipos de dermatitis. La psoriasis, por ejemplo, inicia con un evento psoriático nocivo en la piel (inducido por factores ambientales y/o genéticos) seguido por la infiltración de células Thl7. Debido a que el CCR6 es expresado en la superficie de células Thl7, células B, células dendríticas y células T efectoras que dañan tejidos, el CCL20 puede representar el quimioatrayente más importante para esos tipos de células en la psoriasis. Evidencia adicional para la importancia de la interacción de CCL20-CCR6 se puede encontrar en estudios que utilizan un modelo de psoriasis en ratones inducida por interleucina 23 (IL-23) (Hedrick y colaboradores, J. Clin. Invest . 119:2317-2329 (2009)). En este modelo, la inyección de IL-23 causa la inflamación psoriática dependiente de interleucina 22 (IL-22) . Sin embargo, los ratones ZcrS'1' no exhibieron síntomas similares a la psoriasis cuando fueron inyectados con la IL-23, lo que indica que se requiere el CCR6 para el desarrollo de la psoriasis.
Los queratinocitos humanos pueden producir grandes cantidades de CCL20, especialmente bajo la influencia de las citocinas derivadas de Thl7 interleucina 17 (IL-17), IL-22 y TNF-CC. Mientras que los CCL20 y el CCR6 se detectan raramente en la piel normal, ambos exhiben niveles de expresión incrementados en la dermatitis atópica y la psoriasis pustulosa. La fuerte inducción de CCL20 y la acumulación de células CCR6+ se pueden observar en el análisis inmunohistoquímico microscópico de lesiones de dermatitis en humanos. Estas observaciones proporcionan evidencia adicional para el papel de CCL20 y CCR6 en el proceso inflamatorio 1 de la dermatitis.
Los productos biológicos de MAb actualmente disponibles para tratar trastornos inmunes se pueden clasificar por así decirlo en tres grupos: inhibidores de citocinas inmunoestimuladoras (por ejemplo, Abs anti-TNF-CC) , eliminadores de células inmunes (por ejemplo, MAbs anti-CD20) y bloqueadores de moléculas suplementarias (por ejemplo, Abatacept) . Estos productos biológicos pueden ser útiles, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias; sin embargo, debido a la falta de sensibilidad primordial o un descenso gradual de la tasa de respuesta a esos tratamientos, existe la necesidad urgente de productos biológicos alternativos con mecanismos de acción novedosos para satisfacer las necesidades médicas de pacientes con, por ejemplo, trastornos mediados por CCL20/CCR6. Los anticuerpos de la presente invención representan estos productos biológicos alternativos .
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a la neutralización de anticuerpos anti-CCL20, o porciones que se unen a antígenos de los mismos. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 es un anticuerpo humanizado anti-CCL20 de humano, el cual puede comprender las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de anticuerpos de ratón anti-CCL20 de humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 es un anticuerpo de ratón o quimérico anti-CCL20 de humano o na porción de unión a antígenos del mismo.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo se une al CCL20 de humano. En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción no se une al CCL16 de humano.
Los anticuerpos de la invención se unen específicamente al CCL20. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo se une al CCL20 de mono cynomolgus y/o mono rhesus así como también al CCL20 de humano. En algunas modalidades; el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo no se une al CCL20 de ratón y/o rata. En una modalidad, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos se une al CCL20 de humano, mono cynomolgus y mono rhesus, pero no al CCL20 de ratón y rata.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene una afinidad I de unión (KD) por el CCL20 de humano menor que: I 1 nM, 500 pM, 100 pM, 90 pM, 80 M, 70 pM, ]60 pM o 50 pM utilizando un ensayo de resonancia de plasmon I superficial monovalente o 1 nM, 500 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, ¡20 pM, 15 pM, 14 pM, 13 pM, 12 pM, 11 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 6 pM o 5 pM utilizando un ensayo de resonancia de p superficial bivalente.
En ciertas modalidades, el anticuerpo o una porción tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano mayor que aquella del CC 6 de humano.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2Ó o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valorl Ka por el CCL20 de humano menor que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 (xlO5 M"1 seg"1) , determinado por medio de la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valor ¾ por el CCL20 de humano menor que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 (xl0~5 seg"1), determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2Ó o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valo Ka por el CCL20 de mono rhesus menor que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 (xlO5 M"1 seg"1), determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas 1 modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión I a antígenos del mismo tiene un valor KD por el CCL20 de mono rhesus menor que 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o1 2 (xl0~5 seg"1) , determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valor KD por el CCL20 de mono rhesus menor que 100, 90, f 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 pM, determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. ' En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valor Ka por el CCL20 de mono cynomolgus menor que 500, 400, 300, 200, i 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 (xlO5 M"1 seg"1), determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valor ¾ por el CCL20 de mono cynomolgus menor que 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 (xlO"5 seg"1), determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene un valor KD por el CCL20 de mono cynomolgus menor que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16 o 15 pM, determinado mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2Ó o una porción de unión a antígenos del mismo se une al CCL20 de humano con un valor EC50 menor que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 39, 38, 37, 36, 35 o 34 pM. En algunas modalidades, !el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo se une al CCL20 de mono rhesus con un valor EC50 menor que 500, 400, 300, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 o 50 pM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo se une al CCL20 de mono cynomolgus con un valor EC50 menor que 500, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103 o 102 pM.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo tiene una selectividad por el CCL20 de humano sobre otras quimiocinas humanas, que incluyen pero no están limitadas a CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL12 , CXCL13, CXCL16, CCL1, CCL2, CCL3 , CCL4 , CCL5 , CCL7, CCL11, CCI.13, CCL16, CCL17 , CCL19, CCL21, CCL22, CCL24, CCL25 , CCL27, CCL28 y/o XCL1. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos tiene una selectividad por el CCL20 de humano sobre todas las quimiocinas.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón con un valor IC5o menor que 20, 19, 18, 17, 1*6, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 o 1.1 nM. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón con un valor IC50 menor que 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 o 1.1 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ ' de humano o ratón con ! un valor IC90 menor que 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 4.9, 4.8, 4.7 o 4.6 nM. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón con un valor IC90 menor que 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 4.9, 4.8, 4.7 o 4.6 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón con un valor IC95 menor que 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8 o 7 nM. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón con un valor IC95 menor que 10, 9.9, 9.8, 9.7, 9.6, 9.5, 9.4, 9.3, 9/2, 9.1 o 9 n .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ de humano o ratón in vitro.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20j o una porción de unión a antígenos del mismo reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ ¡de humano o ratón in vivo.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20¡ o una porción de unión a antígenos del mismo reduce el progreso de síntomas de artritis (tales como lesiones articulares 'de las extremidades distales al codo o la rodilla y el grado de i eritema e hinchamiento) en un sujeto, por ejemplo, en ¡un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA, por sus siglas en inglés) y/o un modelo de ratón de artritis inducida por glucosa-6-fosfato isomerasa (G6PI) . En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción de unión a antígenos del mismo reduce las lesiones óseas en un sujeto, que incluyen la osteoporosis , erosión ósea y/o formación de nuevos huesós, por ejemplo en un modelo de CIA. En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción de unión a antígenos reduce los niveles en suero de la proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (COMP, por sus siglas en inglés) en un sujeto, por ejemplo, en un modelo de CIA. En algunas modalidades ,, ' el anticuerpo o una porción de unión a antígenos del mismo I reduce los niveles de AR m del receptor activador para ¡el ligando del factor nuclear ? (RANKL, por sus siglas en inglés) , receptor activador para el factor nuclear KB (RANK, por sus siglas en inglés) , fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP, por sus siglas en inglés) y/o catepsina K en un sujeto, por ejemplo, en las patas de ratón en un modelo ¡de CIA. En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción 'de unión a antígenos del mismo reduce los síntomas de dermatitis atópica (por ejemplo, resequedad, escama, eritema, exudación/enconstramiento y/o excoriación) en un sujeto, por ejemplo, síntomas de dermatitis atópica inducida por oxazolona en ratones de la cepa NC/Nga. En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción de unión a antígenos i reduce los síntomas de dermatitis de contacto alérgica en> un sujeto, por ejemplo, los síntomas de dermatitis de contacto alérgica inducida por dinitrofluorobenceno (DNFB) en un modelo de ratón.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena pesada su CDR3 (H-CDR3) comprende la secuencia de! la SEC ID NO: 67 o 68.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena ligera su CDR3 (L-CDR3) comprende la secuencia dé la SEC ID NO. 75.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una H-CDR3 su secuencia comprende la SEC ID NO: 67 y una L-CDR3 su secuencia comprende la SEC ID NO: 75; o una H-CDR3 su secuencia comprende la SEC ID NO: 68 y una L-CDR3 su secuencia comprende la SEC ID NO: 75.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20^ o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena pesada su CDR1 (H-CDR1) , CDR2 (H-CDR2) y CDR3 (H-CDR3) comprenden respectivamente las secuencias de: - SEC ID NOS: 60, 63 y 67; - SEC ID NOS: 60, 64 y 67; ' - SEC ID NOS: 61, 65 y 68; - SEC ID NOS: 77, 79 y 67; o - SEC ID NOS: 78, 80 y 68.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena ligera su CDR1 (L-CDR1) , CDR2 (L-CDR2) y CDR3 (L-CDR3) comprenden respectivamente las secuencias de: - SEC ID NOS: 70, 73 y 75; o - SEC ID NOS: 71, 73 y 75.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2Ó o una porción de unión a antígenos del mismo comprende: - una H-CDR1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS : 60-62, 77 y 78; una H-CDR2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 63-66 y 79-81; una H-CDR3 que comprende la secuencia de la SEC ID Np: 67 o 68; una L-CDR1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 70-72; j una L-CDR2 que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73 o 74; o - una L-CDR3 que comprende la SEC ID NO: 75; o cualquier combinación de las mismas. i En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20í o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una ¡H- I CDR1, H-CDR2 , H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 que comprenden i respectivamente las secuencias de: 1 - SEC ID NOS : 60, 63, 67, 70, 73 y 75; - SEC ID NOS : 60, 64, 67, 70, 73 y 75; - SEC ID NOS: 61, 65, 68, 70, 73 y 75; - SEC ID NOS : 77, 79, 67, 70, 73 y 75; - SEC ID NOS : 78, 80, 68, 70, 73 y 75; - SEC ID NOS : 60, 63, 67, 71, 73 y 75; SEC ID NOS : 60, 64, 67, 71, 73 y 75; - SEC ID NOS : 61, 65, 68, 71, 73 y 75; - SEC ID NOS : 77, 79, 67, 71, 73 y 75; - SEC ID NOS: 78, 80, 68, 71, 73 y 75.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o I una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 9-14. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio I variable de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 39, 41 y 43.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20¡ o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 15 o 16. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 40, 42 y 44.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden respectivamente las secuencias de: - SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 15; - SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 15; - SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 9 : y SEC : ED NO: 16; SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: : 16; o SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 16.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden respectivamente las secuencias de: - SEC ID NO: 39 y SEC ID NO: 40; - SEC ID NO: 39 y SEC ID NO: 42; - SEC ID NO: 39 y SEC ID NO: 44; - SEC ID NO: 41 y SEC ID NO: 40; - SEC ID NO: 41 y SEC ID NO: 42; - SEC ID NO: 41 y SEC ID NO: 44; - SEC ID NO: 43 y SEC ID NO: 40; - SEC ID NO: 43 y SEC ID NO: 42; - SEC ID NO: 43 y SEC ID NO: 44.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo i que consiste de las SEC ID NOS: 1-6 y 108 sin la secuencia ¡de señal (si está presente) y opcionalmente sin la lisina ;C-terminal . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20¡ o una porción de unión a antígenos del mismo comprende uina cadena ligera que consiste secuencia de modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen respectivamente las secuencia .s de : - SEC ID NO: 1 Y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 7; - SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO : 5 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 8; - SEC ID NO: 108 y SEC : ID NO: - SEC ID NO: 108 Y 112; ambas secuencias sin la secuencia de señal, las SEC ID NOS: 1-6 y 108 opcionalmente sin la lisina C-terminal.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada codificado por una secuencia seleccionada del grupo qúe consiste de las SEC ID NOS: 25-30. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada codificado por una secuencia seleccionada del. grupo que consiste de las SEC ID NOS: 51, 53 y 55.
Además, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo que comprende un dominio variable de cadena ligera codificado por la secuencia de la SEC ID NO: 31 o 32. En i algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 52, 54 y 56.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable jde cadena ligera codificados respectivamente por las secuencias de: - SEC ID NO: 25 y SEC ID NO : 31; - SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 31; - SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 31; - SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 31; - SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 31; - SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31; - SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 32; - SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 32; - SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 32; - SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 32; - SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 32; o - SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 32.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera codificados respectivamente por las secuencias de: - SEC ID NO: 51 y SEC ID NO: 52; - SEC ID NO: 51 y SEC ID NO: 54; - SEC ID NO: 51 y SEC ID NO: 56; - SEC ID NO: 53 y SEC ID NO: 52; - SEC ID NO: 53 y SEC ID NO: 54; - SEC ID NO: 53 y SEC ID NO: 56; - SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 52; - SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 54; o - SEC ID NO: 55 y SEC ID NO: 56.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena pesada codificada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 17-22 y 109, la secuencia carece de la secuencia que codifica una secuencia de señal (si está presente) y opcionalmente carece de la secuencia que codifica la lisina C-terminal. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo comprende una cadena ligera codificada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 23, 24, 111 y 113, la secuencia carece de la secuencia que codifica una secuencia de señal (si está presente). En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CClL20 comprende una cadena pesada y una cadena ligera codificadas respectivamente por las secuencias - SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 23; SEC ID NO: 18 Y SEC ID NO: 23; - SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 23; SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 23; - SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 23; - SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 23; - SEC ID NO: 17 y SEC ID NO : 24; - SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 24; - SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 24; - SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 24; - SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 24; - SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 24; - SEC ID NO: 109 y SEC ID NO: 111; o - SEC ID NO: 109 y SEC ID NO: 113; ambas secuencias carecen de la secuencia que codifica una secuencia de señal (si está presente), las SEC ID NOS: 17-22 ) y 109 carecen opcionalmente de la secuencia que codifica la lisina C-terminal.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20;o una porción de unión a antígenos del mismo es humanizado o quimérico. En algunas modalidades, las regiones de estructura de la cadena pesada del anticuerpo anti-CCL20 humanizado o una porción utilizan un gen de línea germinal de humano IGHVl-46*03 (Véase, por ejemplo, Altschul y colaboradores, "Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs" , Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) . En ciertas modalidades, las regiones de estructura de cadena pesada tienen por lo menos 50% de homología con las regiones de estructura del gen de línea germinal de humano IGHVl-46*03. Por ejemplo, las regiones de estructura de cadena pesada pueden ser por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por ¡lo menos 95%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o incluso 100% idénticas a las regiones de estructura del gen de línea germinal de humano IGHVl-46*03. En algunas modalidades, i¡as regiones de estructura de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-CCL20 o una porción utilizan un gen de línea germinal de humano IGKV1D-39*01 (véase Altschul y colaboradores, supra) . En ciertas modalidades, las regiones de estructura de cadena ligera tienen por lo menos 50% de homología con las regiones de estructura del gen de lincea germinal de humano IGKV1D-39*01. Por ejemplo, las regiones de estructura de cadena ligera pueden ser por lo menos 50%, p:or lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o por lo menos 100% idénticas a las regiones |de estructura del gen de línea germinal de humano 1010/10-39*01,.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20( o una porción de unión a antígenos del mismo (al grado que ¡la porción comprende por lo menos parte de una región constante de cadena pesada) es una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo es del subtipo IgGl , IgG2 , IgG3 o IgG4.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 es un anticuerpo monoclonal .
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo que se une a un epítopo del CCL20 de humano localizada en la región de bucle N y/u horquilla ß2-ß3 de la molécula.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o una porción se une al mismo epítopo en el CCL20 de humano como un anticuerpo o una porción como se describe en este documento. Además, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo que compite o compite de manera cruzada por la unión al CCL20 de humano con un anticuerpo o una porción descrita en este documento .
En algunas modalidades, el epítopo de CCL20 ¡de humano unido por el anticuerpo o una porción de unión' a i antígenos del mismo de la invención comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: ¡ los residuos 7-9 de la SEC ID NO: 84; los residuos 10-19 de la SEC ID NO: 84; los residuos 20-21 de la SEC ID NO: 84 ,- y los residuos 20-22 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84.
En algunas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende además una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: los residuos 39-55 de la SEC ID NO: 84; los residuos 39-57 de la SEC ID NO: 84; los residuos 56-67 de la SEC ID NO: 84; y los residuos 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84.
En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende cualquier combinación de las secuencias de aminoácidos que consisten de los residuos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-57 y 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos djel CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84.
En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende los residuos 7-9, 10-19 y 20-22 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84. En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende los residuos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-57 y 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84. En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende los residuos 7-9, 10-19, 20-22, 39-57 y 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84.
En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende los residuos 7-9, 10-19 y 20-21 de la SEC ¡ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84. En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprenjde los residuos 7-9, 10-19, 20-21, 39-55, 56-67 y 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84. En ciertas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano comprende los residuos 7-9, 10-19, 20-21, 39-57 y 61-70 de la SEC ID NO: 84, o los residuos del CCL20 de humano de tipo I silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84.
En algunas modalidades, el epítopo de CCL20 de humano unido por el anticuerpo o una porción de unión , a antígenos del mismo comprende uno o más residuos <de aminoácidos de la SEC ID NO: 84 (o los residuos del CCL20 de humano de tipo silvestre que corresponden a los residuos de la SEC ID NO: 84) seleccionados de los residuos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 y 701 o cualquier combinación de los mismos.
La presente invención también proporciona una porción de unión a antígenos de cualquiera de los anticuerpos anti-CCL20 descritos en este documento. La porción de unión, a antígenos puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de cadena individual, Fv, Fab, Fab' , F(ab' )2, Fd, molécula de Fv de cadena individual (scFv) ( dímero de Fv de cadena individual biespecíficos , raultímero de Fv de cadena individual polivalente, diacuerpo, anticuerpo de dominio suprimido o anticuerpo de dominio individual (dAb) .
La presente invención también proporciona una variante de un anticuerpo o una porción de unión a antígenos como se describe en este documento, en donde la variante difiere del anticuerpo o porción por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, i 9 o 10 sustituciones de aminoácidos. 1 En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo dirigido contra el CCL20 de humano, en donde , el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo comprenden respectivamente las secuencias de: - SEC ID NOS: 9 y 15; - SEC ID NOS: 9 y 16; - SEC ID NOS: 10 y 16; - SEC ID NOS: 11 y 15; - SEC ID NOS: 11 y 16; - SEC ID NOS: 12 y 16; - SEC ID NOS: 13 y 16; O - SEC ID NOS : 14 y 16.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 1 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 7, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal. i En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 1 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 7, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En un aspecto, la presente invención proporciona ¡un i anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 1 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO : 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 1 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID í NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal. ! En un aspecto, la presente invención proporciona ,un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 2 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO : 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO : 2 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En un aspecto, la presente invención proporciona un ii anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 3 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 7, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 3 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC NO: 7, en donde las secuencias de aminoácidos carecen secuencias de señal.
En un aspecto, la presente invención proporciona un I anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 3 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 3 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 4 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 4 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 5 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 5 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 6 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 6 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 8, en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal .
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 110.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO; 108 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 110.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 112.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 112.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas aisladas de ácido nucleico, que codifican una cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma o una cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma, en ! donde la cadena pesada y la cadena ligera o las porciones ¡ de unión a antígenos de las mismas pueden asociarse para formar un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC, ID NOS: 17-22, 25-30 y 109 o la secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si está presente. Las secuencias de nucleótidos de las SEC ID NOS: 17-22 y 109 también pueden carecer opcionalmente de la secuencia que codifica la lisina C-terminal, si está presente. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 23, 24, 31, 32, 111 y 113 o la secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si está presente. En algunas modalidades, una o más de las moléculás de ácido nucleico codifican la cadena pesada o una porción cié unión a antígenos de la misma y la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpoj o una porción como se describe en este documento. En ciertas modalidades, una molécula de ácido nucleico codifica tanto la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma como la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma.
En una modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma, o molécula (s) de ácido nucleico que codifica (n) la cadena pesada y la cadena ligera o porciones de unión a antígenos íde I las mismas, se utilizan para tratar a un sujeto necesitado ¡de las mismas.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende secuencia (s) de ácido nucleico que codifica (n) la cadena pesada o una porción de unión antígenos de la misma, la cadena ligera o una porción unión a antígenos de la misma, o ambas, de un anticuerpo o una porción como se describe en este documento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que expresa la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma, o ambas, de un anticuerpo o una porción como se describe en este documento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para hacer un anticuerpo o una porción como se describe en este documento, que comprende mantener una célula como se describe en este documento bajo condiciones que son i apropiadas para la expresión del anticuerpo o la porción. En i algunas modalidades, el método comprende el paso que consiste en aislar el anticuerpo o la porción.
La presente invención también proporciona un método para producir un hibridoma que secreta un anticuerpo anti-CCL20. En ciertas modalidades, el hibridoma produce ún anticuerpo que se une al CCL20 de humano de tipo silvestre. La invención también proporciona un hibridoma producido por medio de los métodos de la invención. Opcionalmente , el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma se recolecta y se puede purificar adicionalmente (por ejemplo, se purifica sustancialmente , se aisla) . En otras modalidades, el método comprende además determinar la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo o una porción como se describe en este documento y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, el anticuerpo o porción como se describe en este documento se utiliza como un medicamento. En i ciertas modalidades, el anticuerpo o porción como se describe I en este documento se utiliza para tratar a un sujeto necesitado del mismo. En modalidades particulares, ¡el anticuerpo o porción se utiliza para tratar una condición asociada con el CCR6 , una condición asociada con el CCL20j o ambas. Estas condiciones incluyen pero no están limitadasl a enfermedades inflamatorias y autoinmunes, particularmente artritis, especialmente artritis reumatoide, dermatitis atópica o alérgica y psoriasis. En otra modalidad particular, el anticuerpo o porción se utiliza para tratar el cáncer. El anticuerpo o porción se puede utilizar para tratar, por ejemplo. La enfermedad de Grave, vitíligo, hipertiroidismo, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, malignidades de células B, adenocarcinoma de mama, hepatitis crónica, dermatitis de contacto, glioblastom , carcinoma hepatocelular, infección por virus de papiloma humano de la cerviz, micosis fungoide, adenocarcinoma pancreático, enfermedad periodontal, carcinoma papilar de tiroides, pustulosis palmo-plantar, condiciones asociadas con exantema maculopapular , epidermólisis hulosa, alopecia areata, esclerosis múltiple, polimiositis , dermatomiositis , enfermedad de Behcet , pustulosis exantematosa generalizada aguda, vasculitis, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, asma bronquial, rinitiis alérgica, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo de aloinjerto hepático, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, i glomerulonefritis, infección por virus respiratorio sincitial, mieloma múltiple y/o histiocitosis de células ¡de Langerhans .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 o I una porción se utiliza para reducir la quimiotaxis mediada por CCL20 de células CCR6+ en un sujeto necesitado del mismo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona : 1. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, en donde i el anticuerpo comprende una cadena pesada su región determinante I de la complementariedad 3 (CDR3) comprende la SEC ID NO: 67 o 68. 2. El anticuerpo monoclonal o una porción ; de unión a antígenos de la modalidad 1, en donde región I determinante de la complementariedad 1 (CDR1) , la región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: ; a) SEC ID NOS: 60, 64 y 67; í b) SEC ID NOS: 60, 63 y 67; c) SEC ID NOS: 61, 65 y 68; ! d) SEC ID NOS: 77, 79 y 67; y : c) SEC ID NOS: 78, 80 y 68. 3. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera su región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) comprende la SEC ID NO: 75 i 4. El anticuerpo monoclonal o una porción lie unión a antígenos de la modalidad 3, en donde la región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) , la región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidjos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS: 70, 73 y 75; y b) SEC ID NOS: 71, 73 y 75. : 5. El anticuerpo o una porción de unión ' a antígenos de la modalidad 1 o 3, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende una CDR3 que comprende la SEC ID NO: 67 o 68 y la cadena ligera del anticuerpo comprende una CDR3 que comprende la SEC ID NO: 75. 6. El anticuerpo o una porción de unión a antígenos de acuerdo con la modalidad 2 o 4, en donde la CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y la CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: ! a) SEC ID NOS: 60, 64, 67, 70, 73 y 75; b) SEC ID NOS : 60, 64, 67, 71, 73 y 75 ; c) SEC ID NOS : 60, 63, 67, 70, 73 y 75, 1 d) SEC ID NOS: 60, 63, 67, 71, 73 y 75, c) SEC ID NOS: 61,' 65, 68, 70, 73 y 75, 1 f) SEC ID NOS : 61, 65, 68, 71, 73 y 75, g) SEC ID NOS : 77, 79, 67, 70, 73 y 75, h) SEC ID NOS : 77, 79, 67, 71, 73 y 75, i) SEC ID NOS: 78, 80, 68, 70, 73 y 75, y j) SEC ID NOS : 78, 80, 68, 71, 73 y 75 7. Un anticuerpo monoclonal anti - CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada cuyo dominio variable comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID NOS : 9-14. 8. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera cuyo dominio variable comprende la SEC ID NO: 15 o 16. 9. El anticuerpo o una porción de unión a antígenos de acuerdo con la modalidad 7 u 8, en donde el domino variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste: a) SEC ID NOS: 9 Y 15; b) SEC ID NOS: 9 Y 16; c) SEC ID NOS: 10 y 16 d) SEC ID NOS : 11 y 15 c) SEC ID NOS: 11 y 16 i 1 f) SEC ID NOS: 12 y 16 g) SEC ID NOS: 13 y 16 ; y h) SEC ID NOS : 14 y 16 10. Un anticuerpo monoclonal anti -CCL20 de humano su cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-6 sin la secuencia de señal y la SEC ID NO: 108. 11. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano su cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-6 sin la secuencia de señal y la SEC ID NO: 108, en donde la secuencia de aminoácidos carece de la lisina C-terminal. ? 12. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano su cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 7 y; 8 sin la secuencia de señal y las SEC ID NOS: 110 y 112. 13. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las modalidades 10-12, en donde la cadena pesada y la cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS: 1 y 7, b) SEC ID NOS : 1 y 8, c) SEC ID NOS : 2 y 8, d) SEC ID NOS : 3 y 7 1 j e) SEC ID NOS: 3 y 8 f) SEC ID NOS: 4 y 8 g) SEC ID NOS : 5 y 8 ¡ h) SEC ID NOS : 6 y 8 i) SEC ID NOS : 108 y 110; y j) SEC ID NOS: 108 y 112; en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal, si están presentes, y en donde las SEC ID NOS: 1-6 carecen opcionalmente de la lisina C-terminal. 14. Un anticuerpo monoclonal su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO : 110. 15. Un anticuerpo monoclonal su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 sin la lisina C-terminal y cadena ligera comprende la SEC ID NO: 110. 16. Un anticuerpo monoclonal, su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 112. 17. Un anticuerpo monoclonal su cadena pesada comprende la SEC ID NO: 108 sin la lisina C-terminal y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 112. 18. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humanó, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se une ál mismo epítopo del CCL20 de humano que el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-17. 19. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que compite por la unión al CCL20 de humano con el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-17. 20. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que compite de manera cruzada por la unión al CCL20 de humano con el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos :de cualquiera de las modalidades 1-17. 21. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-12, en donde el anticuerpo es anticuerpo humanizado. 22. Un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-6, en I donde las regiones de estructura de la cadena pesada utilizan una secuencia de línea germinal de humano de IGHVl-46*03, y en donde las regiones de estructura de la cadena ligera utilizan una secuencia de línea germinal de humano de IGKV1D- 39*01. 23. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las modalidades 1-9 y 18-22, en donde el anticuerpo comprende un dominio constante de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 de humano. 24. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, su cadena pesada comprende un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 39, 41 y 43. , 25. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, su cadena ligera comprende un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 40, 42 y 44. 26. El anticuerpo o una porción de unión; a antígenos de la modalidad 24 o 25, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 39, 41 y 43 y en donde la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 40, 42 y 44. 27. El anticuerpo de la modalidad 26, caracterizado porque la cadena pesada y la cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS: 39 y 40; b) SEC ID NOS: 41 y 42; y , c) SEC ID NOS : 43 y 4 . 28. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEC ID NO : 39 y una cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 40. 29. El anticuerpo monoclonal o una porción de ? unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 24-28, en donde el anticuerpo es anticuerpo quimérico. 30. La porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-9, 18-22 y 24-28, en donde la porción es un anticuerpo de cadena individual, Fv, Fab, Fab' , F(ab')'2, Fd, molécula de Fv de cadena individual (scFv) , dímero de Fv de cadena individual biespecíf ico, diacuerpo, anticuerpo ¡de dominio suprimido o anticuerpo de dominio individual (dAb) . 31. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-30, en donde el anticuerpo o porción de unión ¡ a antígenos tiene una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: a) no se une al CCL16 de humano; b) se une al CCL20 de mono cynomolgus o mono rhesus, pero no al CCL20 de ratón o rata; c) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano de 70 pM o menos utilizando un ensayo de resonancia de plasmen superficial monovalente; j d) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano de Í2 pM o menos utilizando un ensayo de resonancia de plasmen superficial bivalente; e) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano mayor que aquella del CCR6 de humano; j f) tiene una selectividad por el CCL20 de humano sobre la CX3CL1 , CXCL1, CXCL2 , CXCL4 , CXCL8 , CXCL9 , CXCL10, CXCL12, CXCL13 , CXCL16 , CCL1 , CCL2 , CCL3 , CCL4 , CCL5 , CCL7 , CCL11 , CCL13 , CCL16 , CCL17, CCL19, CCL21, CCL22 , CCL24 , CCL25, CCL27, CCL28 o XCL1 de humano; g) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ con un valor IC50 de 1.7 nM o menos; h) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ in vivo; i) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ in vitro; j) reduce el progreso de síntomas de artritis en un sujeto; k) reduce la osteoporosis , erosión ósea o formación de huesos nuevos en un sujeto; 1) reduce los niveles en suero de proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (CO P) en un sujeto; m) reduce los niveles de ARNm de RA KL, RANK, TRAP , o catepsina K en un sujeto; n) reduce el proceso de dermatitis atópica en un sujeto; y o) reduce el progreso de dermatitis de contacto alérgica en un sujeto. 32. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se une a 'un epítopo del CCL20 de humano que comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) los residuos 7-9 de la SEC ID NO: 84; , b) los residuos 10-19 de la SEC ID NO: 84; y c) los residuos 20-22 de la SEC ID NO: 84. 33. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de la modalidad 32, en donde el epítópo comprende los residuos 7-9, 10-19 y 20-22 de la SEC ID NO: 84. 34. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de la modalidad 32, en donde el epítopo comprende además una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) los residuos 39-55 de la SEC ID NO: 84; b) los residuos 56-67 de la SEC ID NO: 84; y c) los residuos 61-70 de la SEC ID NO: 84. 35. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de la modalidad 34, en donde el epítopo comprende los residuos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-67 y 61-70 de la SEC ID NO: 84. 36. Una molécula de ácido nucleico aislada q¡ue codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenbs de la misma de un anticuerpo o una porción de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35. 37. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo o una porción de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35. 38. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, y la cadena ligera o una porción de unió a antígenos de la misma, de un anticuerpo o una porción de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35. 39. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 17-22, 25-30 y 109 o la secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si está presente. 40. Una molécula de ácido nucleico aislada que i codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenós de la misma de un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humanó, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una ? secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS : 23, 24, 31, 32, 111 y 113, o la secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si está presente. 41. La molécula de ácido nucleico aislada de la modalidad 39 o 40, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del que consiste de las SEC ID NOS: 17-22, 25-30 y 109 secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si está presente; y en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC iID NOS: 23, 24, 31, 32, 111 y 113, o la secuencia de nucleótidos sin la secuencia que codifica una secuencia de señal, si esítá presente. 42. El uso de (1) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, (2) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma o (3) ambas, de un anticuerpo o una porción de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35, como un medicamento. 43. Un vector recombinante que comprende (1) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, (2) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma o (3) ambas, de un anticuerpo o una' orción de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-35. 44. Una célula hospedante que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma de anticuerpo o una porción de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-35, la primera secuencia de ácidos nucleicos está vinculada de manera operable a un elemento de control de expresión y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma del anticuerpo o una porción, la segunda secuencia de ácidos nucleicos está vinculada de manera operable a un elemento de control de expresión. 45. Un método para hacer un anticuerpo anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, que i comprende mantener la célula hospedante de la modalidad 44 bajo condiciones que son apropiadas para la expresión dél anticuerpo o una porción. 46. El método de la modalidad 45, que comprende además aislar el anticuerpo o una porción. ¡ 47. Una composición que comprende el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. 48. Un método para tratar a un sujeto necesitado del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad j efectiva del anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de jla modalidad 47. 49. Un método para tratar' una condición en 'un sujeto necesitado del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47. 50. El método de la modalidad 49, en donde :1a condición es una condición asociada con el CCR6. 51. El método de la modalidad 49, en donde la condición es una condición autoinmune o inflamatoria. 52. El método de la modalidad 49, en donde la condición es artritis reumatoide , psoriasis , dermatitis atópica, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Grave, vitíligo, hipertiroidismo, hepatitis crónica, infección por virus de papiloma humano de la cerviz, micosis fungoide, osteoporosis o enfermedad periodontal . 53. Un método para tratar el cáncer, que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47. 54. El método de la modalidad 53, en donde el cáncer es una malignidad de células B, adenocarcinoma de mama, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma pancreático o carcinoma papilar tiroideo. 55. Un método para reducir la quimiotaxis mediada por CCL20 de células CCR6+ en un sujeto necesitado del mismo, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47. 56. Un método para reducir la quimiotaxis mediada por CCL20 de células CCR6+ in vitro, utilizando el anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47. 57. Un método para tratar una condición en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47, én donde la condición se selecciona del grupo que consiste de: i a) lesiones articulares de extremidades distales al codo o la rodilla; b) eritema; c) .linchamiento ; d) niveles en suero incrementados de proteína de matriz i oligomérica cartilaginosa (COMP, por sus siglas en inglés) ; j c) niveles incrementados de AR m del receptor activador para el ligando del factor nuclear ?? (RANKL, por sus siglas en inglés) , receptor activador para el factor nuclear KB (RA K, por sus siglas en inglés) , fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP, por sus siglas en inglés) o catepsina K; i f) dermatitis atópica; y ! g) dermatitis de contacto alérgica. 58. El uso del anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47 para la manufactura de ün medicamento. j 59. El uso del anticuerpo o una porción de unión a antígenos de cualquiera de las modalidades 1-35 o la composición de la modalidad 47 como un medicamento.
Breve Descripción de las Figuras La FIGURA 1 es una gráfica que muestra que los ratones deficientes de CCR6 son menos sensibles a la artritis inducida por colágeno que los ratones de tipo silvestre, ratones CCR6+ + de tipo silvestre; ratones Het, CCR6+/"; ratones CCR6_/" genéticamente deficientes. Véase el Ejemplo 1.
La FIGURA 2 es una gráfica que muestra que los ratones deficientes de CCR6 exhiben una infiltración deteriorada de células T (como es indicado por los niveles de CD3) en lesiones artríticas inducidas por colágeno en comparación con los ratones de tipo silvestre (cuyo título ¡es "CD3") . Los datos mostrados son medias ± SEM de un experimento (n=7 ratones por grupo). *P<0.05, **p <0.0,1. Véase el Ejemplo 1.
La FIGURA 3 es una gráfica que muestra que los ratones deficientes de CCR6 exhiben una infiltración deteriorada de macrófagos (como es indicado por los niveles i de F4/80) en lesiones artríticas inducidas por colágeno en í comparación con los ratones de tipo silvestre (cuyo título es "F4/80") . Los datos mostrados son medias ± SEM de un experimento (n=7 ratones por grupo). **P <0.01. Véase el Ejemplo 1.
La FIGURA 4 es una gráfica que muestra que en comparación con los ratones de tipo silvestre, los ratones deficientes de CCR6 son resistentes a un espesor incrementado de la oreja en un modelo de dermatitis de contacto alérgica inducida por dinitrofluorobenceno (DNFB) . Ratones de tipo silvestre, WT; ratones deficientes de CCR6 , KO . Véase i el Ejemplo 1.
La FIGURA 5 es una gráfica que muestra que el MÁb 2F5-5 inhibe la quimiotaxis inducida por CCL20. Véase él Ejemplo 2.
Las FIGURAS 6A-6C representan alineamientos de secuencia de dominios variables de anticuerpos de la invención (SEC ID NOS : 9-16) con aquellos de los anticuerpos anti -humano de ratón 36F7C10 (VH: SEC ID NO: 39; VL: SEC ID NO: 40) y 42G5B10 (VH: SEC ID NO: 43) y con las secuencias de línea germinal IGHVl-46*03 (SEC ID NO: 57), JH4 (SEC ID NO: 58) y IGKV1D-39*01 (SEC ID NO: 59) . Se indican las definiciones de Kabat y Chothia de cada CDR. ABM67212 (SEC ID NO: 82) y BAH04867.1 (SEC ID NO: 83) son anticuerpos humanos de los cuales se derivan las regiones de estructura de las cadenas mostradas de anticuerpo humanizado. éase el Ejemplo i 3.
Las FIGURAS 7A-7C son tablas que representan la inhibición de la quimiotaxis in vitro por diferentes combinaciones de cadenas de anticuerpos humanizados anti-CCL20 de humano. Los datos representan tres ensayos, excepto donde se indica. Véase el Ejemplo 4.
Las FIGURAS 8A-8C representan tres ensayos independientes realizados para evaluar el efecto inhibitorio del anticuerpo humanizado anti-CCL20 de humano HC2/LK3 (cuyos títulos son Figura 8A "1er HC2LK3 " , Figura 8B "2o HC2LK3 " y Figura 8C "3o HC2LK3"). Se muestra que el anticuerpo HC2/LK3 inhibe la quimiotaxis inducida por CCL20. Los valores paira IC50, IC90 e IC95 se muestran para cada experimento. Véase él Ejemplo 4.
Las FIGURAS 9A-9C representan una serie de gráficas que muestran que los anticuerpos humanizados FIGURA 9B) HC2/LK3 y FIGURA 9C) HC2/LC3 demuestran una inhibición dependiente de la dosis de la migración de células comparable a aquella del anticuerpo de ratón FIGURA 9A) 36F7C10 en un ensayo de migración endotelial. Véase el Ejemplo 4 (cuyos títulos son Figura 9A "36F7C10", Figura 9B "HC2LK3" y Figura 9C "HC2LC3" ) .
Las FIGURAS 10A y 10B representan sensogramas BiacoreMR que demuestran que los anticuerpos humanizados FIGURA 10A) HC2/LC3) y FIGURA 10B) HC2/LK3 se unen al CCL20 . i de humano de una manera dependiente de la concentración. Véase el Ejemplo 5.
Las FIGURAS 11A-11D demuestran que los anticuerpos anti-CCL20 de humano se unen específicamente al CCL20 de humano (cuyos títulos son Figura 11A "36F7C10" y "Quimera" y Figura 11B "HC2LK3 Humanizado" y "HC2LC3 Humanizado"). Un ensayo ELISA con el CCL20 unido a una placa y otras quimiocinas (a 1 µg/ml) se utilizó para detectar la unión de FIGURA 11A) el anticuerpo 36F7C10 y anticuerpos quiméricos y FIGURA 11B) los anticuerpos humanizados HC2LK3 y HC2LC3. i FIGURA 11C) Un ensayo ELISA de CCL20 fijada firmemente a una etiqueta de His se utilizó para detectar la unión. FIGURA 11D) los experimentos BiacoreMR confirman que los anticuerpos anti-CCL20 de humano se unen al CCL20 de humano y exhiben una unión insignificante a CXCL4. Véase el Ejemplo 6.
La FIGURA 12 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos entre una porción de traslapo de 56 residuos i de CCL20 (SEC ID NO: 114) y CCL16 (SEC ID NO: 115) . Véase el Ejemplo 6.
Las FIGURAS 13A y 13B son una serie de gráficas que muestran que FIGURA 13A) los anticuerpos quiméricos anti-CCL20 de humano y FIGURA 13B) los anticuerpos humanizadjos anti-CCL20 de humano reaccionan específicamente con el CCL20 y no reaccionan con el CCL16. Véase el Ejemplo 6.
La FIGURA 14 muestra alineamientos de secuencias ele aminoácidos entre ortólogos de CCL20 de humano (la primera descripción es la SEC ID NO: 85 y la segunda descripción es los residuos 2-96 de la SEC ID NO: 85) , de mono rhesus (SEC ID NO: 86), de mono cynomolgus (SEC ID NO: 87) y de ratón (SEC ID NO: 88). Véase el Ejemplo 7.
La FIGURA 15 es una representación esquemática de la detección de anticuerpos anti-CCL20 de humano en ensayos ELISA. Véase el Ejemplo 7.
Las FIGURAS 16A-16C representan una serie de gráficas que demuestran que FIGURA 16A) los anticuerpos I quiméricos anti-CCL20 de humano y FIGURA 16B) , FIGURA 16C) los anticuerpos humanizados anti-CCL20 de humano se unen de manera efectiva al CCL20 de humano, mono rhesus y mono cynomolgus, pero no al CCL20 de ratón. Véase el Ejemplo 7.
Las FIGURAS 17A y 17B representan gráficas qµe demuestran que los anticuerpos humanizados y quiméricos ant'i- j CCL20 de humano se unen de manera efectiva al CCL20 de humano, mono rhesus y mono cynomolgus, pero no al CCL20 'de í rata o ratón (cuyos títulos son Figura 17A "36F7C10" ( y "Quimera de Fe de humano de 36F7C10" y Figura 17B "HC2¿K3 I Humanizado" y "HC2LC3 Humanizado"). Los anticuerpos FIGURA 17B) humanizados y FIGURA 17A) quiméricos retienen 'la especificidad de unión del A) anticuerpo de ratón del cual se derivan. Véase el Ejemplo 7. i Las FIGURAS 18A y 18B muestran los resultados de(la cartografía de epítopos del CCL20 de humano mediante ' el intercambio de hidrógeno/deuterio . Este experimento utilizó una variante del CCL20 de humano (SEC ID NO: 84) de R&D Systems en la cual del segundo al último residuo es una D en lugar del N mostrado en la secuencia de tipo silvestre. FIGURA 18A) El nivel de deuteración de cada residuo de CCL20 se indica en cuatro puntos de tiempo (desde arriba: 150' s, 500 s, 1500 s y 5000 s) . FIGURA 18B) La estructura del CCL20 de humano, que indica un epítopo unido por anticuerpos de la invención. Véase el Ejemplo 9.
La FIGURA 19 es un par de gráficas que demuestran que las células de ratón B300 transducidas con CCR6 emigran hacia el CCL20 tanto de ratón como de humano. Véase el Ejemplo 10.
La FIGURA 20 es una gráfica que muestra que los anticuerpos de ratón, quiméricos y humanizados anti-CCL20 de i humano inhiben la migración de células T de ratón hacia el CCL20 de humano in vivo en una forma dependiente de la dosis. Véase el Ejemplo 10.
La FIGURA 21 es una gráfica que muestra que el MAb de hámster anti-CCL20 de ratón 2F5-5 reduce los síntomas de artritis inducida por colágeno en ratones (cuyo título es "Clasificación de artritis"). Véase el Ejemplo 11.
La FIGURA 22 es una tabla de clasificaciones clínicas de animales individuales que demuestran que el MÁb 2F5-5 reduce el progreso de los síntomas de artritis inducida por colágeno. Véase el Ejemplo 11.
La FIGURA 23 es una gráfica que representa la graduación de las patas de ratón mediante la clasificación de rayos X (cuyo título es "Clasificación/cabeza" ) . Se muestra que el MAb 2F5-5 reduce la patología ósea en ratones con artritis inducida por colágeno. Cont : IgG de control. Véase el Ejemplo 11.
La FIGURA 24 representa ejemplos de rayos X registrados que indican la patología ósea en las patas de ratones con artritis inducida por colágeno. 0: osteoporosis , E: erosión ósea, N: formación de huesos nuevos. Véase el Ejemplo 11.
Las FIGURAS 25A-25C muestran mediciones de un marcador de destrucción de cartílago, proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (COMP) en suero, en un modelo de ratón artrítico inducido por colágeno. FIGURA 25A) Datos de calibrador con un estándar de COMP. Eje X, unidades/litró; eje Y, densidad óptica a 450 nm. FIGURA 25B) Plantilla de s placa y datos sin procesar para ratones tratados con IgG de control de hámster o el MAb 2F5-5. FIGURA 25C) Los datos de animales individuales demuestran niveles reducidos de COMP én animales tratados con el MAb 2F5-5 en comparación con i animales tratados con anticuerpos de IgG de control. Véase él Ejemplo 11.
La FIGURA 26 es una gráfica que muestra que el MÁb 2F5-5 reduce los niveles en suero de COMP en ratones. IgG de control: anticuerpo de isotipo coincidente ; MAb para CCL2Ó: MAb 2F5-5. Véase el Ejemplo 11.
Las FIGURAS 27A y 27B son gráficas que muestran que el MAb 2F5-5 reduce la expresión de AR m de marcadores de osteoclastos FIGURA 27A) RA KL y RANK y FIGURA 27B) TRAP 'y Catepsina K. IgG de control: anticuerpo de isotipo coincidente; MAb para CCL20: MAb 2F5-5; eje Y: unidades de PCR cuantitativa (cuyos títulos son Figura 27A "RANKL" y "RA K" y Figura 27B "TRAP" y "Catepsina K" ) . Véase el Ejemplo 11.
La FIGURA 28 es una gráfica que muestra que el MAb 2F5-5 tiene un efecto profiláctico sobre la artritis inducida por glucosa-6-fosfato isomerasa en ratones. Véase el Ejemplo 12.
La FIGURA 29 es una gráfica que muestra que el MAb I 2F5-5 suprime el progreso de la dermatitis atópica inducida por oxazolona en ratones. Véase el Ejemplo 13. ! La FIGURA 30 es una gráfica que muestra que el MAb 2F5-5 inhibe la dermatitis de contacto alérgica inducida por dinitrofluorobenceno (medida por el espesor de la oreja) en ratones. Véase el Ejemplo 14.
Descripción Detallada de la Invención Esta invención se dirige a anticuerpos que se unen específicamente al CCL20 o una porción del mismo (£>or ejemplo, una porción antigénica del mismo) . La invención también se dirige a porciones de unión a antígenos de los anticuerpos. En una modalidad, los anticuerpos neutralizan una o más actividades del CCL20. Se dice que un anticuerpo i se une específicamente al CCL20 si no se une sustancialmente a moléculas diferentes de CCL20. La unión sustancial es, por ejemplo, la unión con un valor Kd de < 100 nM, preferiblemente i < que 10 nM, 1 nM, 100 M, 50 M, 40 pM o 35 pM como se determina por BiacoreMR (en un formato bivalente) . En una modalidad, los anticuerpos o porciones se unen específicamente al CCL20 de humano o una porción del mismo, a algunas variantes de secuencia del CCL20 de humano tal como variantes alélicas y también pueden reaccionar de manera cruzada con el CCL20 de otras especies. En una modalidad, los anticuerpos o porciones tienen especificidad de unión por una CCL20 de humano de tipo silvestre (también referida como de origen natural o endógeno) . A menos que se indique de otra manera, la "CCL20 de humano" se refiere al CCL20 de humano de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos de una CCL20 de humano de tipo silvestre con la secuencia de señal se muestra en la FIGURA 14 (SEC ID NO: 85) . La secuencia de aminoácidos de una CCL20 de humano de tipo silvestre sin la secuencia de señal (residuos 1-26 de la SEC ID NO: 85) se encuentra en la SEC ID NO: 99 (véase la Tabla 18) . La FIGURA 18 representa una variante del CCL20 de humano sin la secuencia de señ'al (SEC ID NO: 84) en donde del siguiente al último residuo es un D en lugar del N como en la secuencia de tipo silvestre (SEC ID NO: 85) . En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones se unen al CCL20 de humano de tipo silvestre o el CCL20 de humano en donde del siguiente al último residuo íes un D en lugar del N mostrado en la secuencia de tipo silvestre, cualquier secuencia con o sin la secuencia de señal (por ejemplo, SEC ID NO: 84, 85 o 99) . En una modalidad particular, los anticuerpos o porciones se unen específicamente al CCL20 de humano, mono rhesus y mono cynomolgus pero no se unen al CCL20 de ratón o rata.
Los anticuerpos y porciones de unión a antígenos de los mismos que se describen en este documento se puede purificar y/o aislar utilizando técnicas conocidas. Los anticuerpos o porciones que se "purifican" o se "aislan" han sido separados lejos de las moléculas (por ejemplo, péptidos) de su fuente de origen (por ejemplo, el sobrenadante de células; en una mezcla tal como en una mezcla de anticuerpos en una colección; etcétera) e incluyen anticuerpos obtenidos por medio de métodos descritos en este documento u otros métodos adecuados. Los anticuerpos aislados incluyen anticuerpos sustancialmente puros (por ejemplo, esencialmente puro) , así como también anticuerpos producidos mediante la síntesis química, técnicas recombinantes y una combinación de las mismas.
Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-CCL20 de humano, porciones de unión a antígenos (es decir, porciones) de los anticuerpos, las cadenas ligeras de los anticuerpos, las cadenas pesadas de los anticuerpos y porciones de esas cadenas ligeras o cadenas pesadas. La invención también se refiere a anticuerpos que carecen de las secuencias de señal de cadena pesada y/o ligera y anticuerpos glicosilados . La invención también se refiere a anticuerpos precursores, anticuerpos no glicosilados y anticuerpos sus cadenas pesadas y/o ligeras comprenden secuencias de señal . La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpos, o porciones de las mismas descritas en este documento; a vectores y a células hospedantes que comprenden estos ácidos nucleicos; a métodos para producir cualquiera las cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos o porciones las mismas descritas en este documento; y a métodos para utilizar los anticuerpos, cadenas de anticuerpos o porciones?.
Los anticuerpos y porciones de unión a antígenos de los mismos de esta invención se pueden utilizar para tratarj a I un sujeto necesitado del mismo (por ejemplo, un paciente humano) para reducir la unión de CCL20 a CCR6 , inflamación mediada por CCL20 y/o quimiotaxis mediada por CCL20 de células CCR6+ como sea necesario. j Los anticuerpos de la invención incluyéjn anticuerpos tradicionales que comprenden dos cadenas pesad'as y dos cadenas ligeras. En algunas modalidades, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras comprenden un dominio variable (también referido en este documento como una "región variable") y un dominio constante (también referido documento como una "región constante" ) . Los variables completos, donde estén presentes, comprenden cuatpjro regiones de estructura (FRs) y tres regiones determinantes' de la complementariedad (CDRs) , dispuestas, procedentes de la terminación amino, en el orden FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. La inspección visual y el análisis de secuencias se pueden llevar a cabo para identificar los límites de CDR.
I Para esta invención, las secuencias de CDR se definen mediante el uso del sistema de Kabat (Kabat, E.A. ¡ y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunologic'al Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)) y/o el sistema de Chothia (Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol . i 196:901-917 (1987)), como se indica en, por ejemplo, FIGURA 6.
Las modalidades de la presente invención que comprenden una región constante de cadena pesada de humano pueden comprender una región constante de humano de cualquier isotipo, que incluye IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, en los cuales las cadenas pesadas son del tipo gamma (?) , mu (µ) , alfa (a) , delta (d) o épsilon (e) , respectivamente, y cualquier subclase i que incluyen IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2 , en las cuales las cadenas pesadas son del tipo ??, ?2, ?3 , ?4 , al' y a2, respectivamente. Las modalidades que comprenden cadenas ligeras de humano pueden comprender un cadena ligera kappa ( ) de humano o una cadena ligera lambda (?) de humano. ¡ Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo (que comprende dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa) . El término "fragmento de unión a antígenos" se utiliza de manera intercambiable en este documento con el término "porción de unión a antígenos" a menos que se indique de otra manera. Las porciones de unión a antígenos de anticuerpos pueden estar en el formato de, por ejemplo, anticuerpos de cadena individual, fragmentos Fv, i fragmentos Fab, fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' )¡2/ í fragmentos Fd, moléculas de Fv de cadena individual (scFv) , dímeros Fv de cadena individual biespecíficos (documento PCT/US92/09665) , diacuerpos, anticuerpos de dominio suprimido y anticuerpos de dominio individual (dAbs) . Véase, por ejemplo, Jespers y colaboradores, IVature Biotechnology 22(9): 1161-1155 (2004)). También dentro de la invención se encuentran las moléculas de unión a antígenos que comprenden una VH y/o una VL. En caso de una VH, la molécula también puede comprender una o más de una región CH1 , rótula, CH2 y CH3.
Las porciones de anticuerpos se pueden producir mediante la escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes . Por ejemplo, la escisión con papaína o pepsina se puede utilizar para generar los fragmentos Fab o F(ab')2/ respectivamente. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los cuales uno o más codones de detención han sido introducidos en dirección 5' del sitio de detención natural. Por ejemplo, un construcción recombinante que codifica la cadena pesada de un fragmento F(ab' ) 2 se puede diseñar para que incluya secuencias de ADN que codifican el dominio CHi y la región de rótula de la cadena pesada.
En otra modalidad, se puede hacer un anticuerpo de fusión o una inmunoadhesina que comprenda la totalidad o una porción de un anticuerpo anti-CCL20 de la invención vinculado a otro polipéptido. En una modalidad, solo los dominios variables del anticuerpo anti-CCL20 se vinculan con el polipéptido. En otra modalidad, el dominio VH de un anticuerpo anti-CCL20 se vincula con un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-CCL20 se vincula con un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de manera tal que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión a antígenos. En todavía otra modalidad, el dominio VH es separado del dominio VL por un conector de tal manera que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí (véase posteriormente bajo Anticuerpos de Cadena Individual) . El anticuerpo VH-conector-VL luego se vincula con el polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena individual se vinculan entre sí, para crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptido individual o para crear un anticuerpo biespecíf ico .
Para crear un anticuerpo de cadena individual de la invención, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se vinculan de manera operativa con otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, (SEC ID NO: 116) de tal manera que las secuencias VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena individual continua, con los dominios VL y VH unidos por un conector flexible. Véase, por ejemplo, Bijrd y colaboradores, Science 242:423-426 (1988) ; Huston y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA. 85:5879-5883 (1988) ; McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-554 (1990) ; etcétera. En algunas modalidades, el anticuerpo de cadena individual es monovalente (solo se utiliza un VH y VL i individual) , bivalente (se utilizan dos VH y VL) o polivalente (se utilizan más de dos VH y VL) . La invención también contempla los anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente al CCL20 de humano y a otra molécula.
En otras modalidades, otros anticuerpos modificados se pueden preparar utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CCL20. Por ejemplo, los "cuerpos Kappa" (111 y colaboradores, Protein Eng. 10:949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin y colaboradores, EMBO J. 13:5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger y colaboradores, Proc. Nati.
Acad Sci. EUA 90:6444-6448 (1993)) o "Janusinas" (Traunecker y colaboradores, EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker ; y colaboradores, Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) se pueden preparar utilizando técnicas estándar de biología molecular siguiendo las enseñanzas de la descripción.
En otro aspecto, la invención proporciona una variante de un anticuerpo ejemplificado en este documento, j o una porción de unión a antígenos del anticuerpo variante, en donde el anticuerpo variante se une específicamente al CCL20 de humano pero difiere en la secuencia del anticuerpo ejemplificado por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, en una región CDR, una región FR y/o un dominio constante) . De acuerdo con la invención, el anticuerpo variante puede ser por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntico al anticuerpo de referencia en la cadena pesada, el dominio variable de cadena pesada, la cadena ligera, el dominio variable de cadena ligera, las seis CDRs o las ocho FRs .
Como se utiliza en este documento, la similitud de secuencias para polipéptidos , la cual también es referida como la identidad de secuencias, se mide típicamente i utilizando un software de análisis de secuencias, el cual empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el Paquete de Análisis de I Secuencias Genetics Computer Group (GCG) contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" los cuales se pueden utilizar j con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidós estrechamente relacionados, tales como polipéptidós homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una mutenía de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también óe pueden comparar con FASTA, un programa en GCG Versión 6.1, utilizando parámetros por defecto o recomendados. FASTA (p r ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencias de las regiones del mejor traslapo entre las 'secuencias desconocidas y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol : 183:63-98 (1990) ; Pearson, Methods Mol. Biol . 132:185-219 (2000)) . Otro algoritmo utilizado cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa de computadora BLAST, especialmente blastp o tblastn, utilizando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410 ? (1990) ; Altschul y colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997) ; incorporado en este documento a manera de referencia .
De acuerdo con la invención, una o más cisteínas en el anticuerpo, las cuales pueden ser reactivas químicament , se pueden cambiar por otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina . En una modalidad, una cisteína no canónipa se sustituye. La sustitución se puede hacer en una CDR o una región de estructura de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la cisteína es canónica. En algunas modalidades, los sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo se retiran. Estos sitios pueden ocurrir en una CDR o una región de estructura de un dominio variable o en el dominio constante de |un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteína y la j remoción de sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo e incrementa de esta manera su homogeneidad. En algunas modalidades, los pares de asparagina-glicina, los cuales forman sitios ¡de desamidación potenciales, se eliminan al alterar uno o ambos residuos. En algunas modalidades, el anticuerpo es desinmunizado para reducir su inmunogenicidad. Las técnicas para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo son bien conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, las Publicaciones del PCT Nos. WO 98/52976 y WO 00/34317.
En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con un anticuerpo ejemplificado de la invención. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena individual) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) . En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias o el grado de similitud se pueden ajustar en dirección 5' pata corregir el carácter conservador de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellas personas de experiencia en el campo. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol . 243:307-31 (1994).
Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas : ácido aspártico y ácido glutámico y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustitución conservadora de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato- i aspartato y asparagina-glutamina . Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tiene un valpr positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 dada a conocer en Gonnet y colaboradores, Science 256:1443-45 í (1992) . Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos para un anticuerpo o porción de unión a antígenbs de la invención son aquellas las cuales: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, por ejemplo, para aumentar la actividad de ADCC y CDC del anticuerpo, (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas ; o funcionales de estos análogos, pero aún retienen la unión específica al CCL20 de humano, (5) retiran la lisina C-terminal y (6) agregan o retiran sitios de glicosilación .
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido nuevo y novedoso que es la cadena pesada o ligera de un anticuerpo de esta invención o que es una porción que I contiene dominios variables de la cadena pesada o ligera. Este polipéptido es útil debido a que puede asociarse con una cadena ligera o pesada de anticuerpo, respectivamente, para formar un anticuerpo anti-CCL20.
En este documento se describen anticuerpos anti-CCL20, neutralizantes, humanizados, novedosos que comprenden las CDRs de anticuerpos de ratón anti-CCL20 de humano novedosos y porciones de unión a antígenos de los anticuerpos humanizados. El término "anticuerpo anti-CCL20 humanizado" utilizado en este documento se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDRs (CDR1, CDR2 y CDR3) de un anticuerpo anti-CCL20 de origen no humano, también referido en este documento como el anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo de ratón anti-CCL20) y por lo menos una porción de una secuencia de humano. La porción de anticuerpo de humano puede ser una o más regiones de estructura (por ejemplo, todas las regiones de estructura) y/o toda o una parte de una región constante. En algunas modalidades, la región de estructura de secuencia de humano comprende una secuencia de línea germinal, pero puede incluir mutaciones que no son.de línea germinal. Un anticuerpo anti-CCL20 injertado con CDR en el cual las seis CDRs de un anticuerpo no humano anti-CCL20 se injertan en una estructura de humano es un ejemplo de ?? anticuerpo humanizado anti-CCL20 de la invención. Véase, por ejemplo, Cabilly y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Cabilly y colaboradores, Patente Europea No. 0,125,023 Bl; Boss y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397; Boss y colaboradores, Patente Europea No. 0,120,694 Bl; Neuberger, M.S. y colaboradores, documento WO 86/01533; Neuberger, M.S. y colaboradores, Patente Europea No. 0,194,276 Bl; Winter, Patente de los Estados Unidos No. 5,225,539; Winter, Patente Europea No. 0,239,400 Bl; Padlan, E.A. y colaboradores, Solicitud de Patente Europea No. 0,519,596 Al. Véase también, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Huston, Patente de los Estados Unidos No. 5,476,786; y Bird y colaboradores, Science 242:423-426 (1988)). En algunas modalidades, los anticuerpos humanizadas son anticuerpos desinmunizados. Véase, por ejemplo, Carr y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 7,264,806, con respecto a anticuerpos desinmunizados que han sido i modificados para reducir el número de epítopos potenciales de células T, reduciendo de ese modo la propensión del anticuerpo para producir una respuesta inmune con la administración a un humano.
En modalidades particulares, el anticuerpo humanizado comprende una o más CDRs de cadena ligera y/o una o más CDR de cadena pesada de uno o más de los siguientes anticuerpos monoclonales de murino anti-CCL20 de humano: 36F7C10, 42G5B10 y 40-1C10B9, en donde las CDRs son identificadas de acuerdo con el sistema de Kabat, el sistema de Chothia o cualquier combinación de los mismos. En algunas I modalidades, el anticuerpo humanizado comprende las tres CDRs de cadena pesada y las tres CDRs de cadena ligera de un anticuerpo 36F7C10, 42G5B10 o 40-1C10B9.
En otra modalidad, los anticuerpos humanizados tienen la especificidad de unión de un anticuerpo de murino I' anti-CCL20 de humano de la invención (por ejemplo, la especificidad por CCL20 de humano, la especificidad epitópica igual o similar) y/o tienen una actividad neutralizante. Los i anticuerpos humanizados pueden tener la especificidad de unión, especificidad epitópica y/o actividad neutralizante de un anticuerpo de murino, quimérico o humanizado anti-CCL20 de humano descrito en este documento. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado de la invención puede competir con el anticuerpo de murino, quimérico o humanizado anti-CCL20 de humano por la unión al CCL20 de humano y/o puede tener la función neutralizante del anticuerpo de murino, quimérico o humanizado anti-CCL20 de humano. En una modalidad particular, el anticuerpo humanizado tiene la especificidad de unión, especificidad epitópica y/o actividad neutralizante de cualquiera de los anticuerpos de ratón 36F7C10, 42G5B10 y 40-1C10B9.
La porción de secuencia de humano del anticuerpo I humanizado (por ejemplo, la región de estructura; regipn constante) puede ser de cualquier anticuerpo de humano adecuado. Por ejemplo, una región constante de humano o una porción de la misma en un anticuerpo humanizado o quimérico puede ser codificada por un gen de cadena ligera ? o ? de humano y/o por un gen de cadena pesada ? (por ejemplo, yl , ?2 , ?3 , ?4) , µ, a (por ejemplo, al, a2) , d o e de humano, inclusive variantes alélicas. Un isotipo de región constante de humano particular (por ejemplo, IgGl ,- IgG2) , una variante o una porción del mismo se pueden seleccionar para adaptar una función efectora. Por ejemplo, una región constante mutajia (es decir, una variante) se puede incorporar en el anticuerpo para reducir la unión a un receptor Fe y/o la capacidad para fijar un complemento. (Véase, por ejemplo Winter ¡y colaboradores, GB 2,209,757 B; Morrison y colaboradores, i documento WO 89/07142; Morgan y colaboradores, documento WO 94/29351) .
Como se utiliza en este documento, el término "línea germinal" se refiere a las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de los genes de anticuerpos ¡y segmentos de genes como son pasadas de los padres a su descendencia por vía de las células germinales. Esta secuencia de línea germinal se distingue de las secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo particular en una célula B, la cual ha sido alterada mediante eventos de recombinación e hipermutación durante el curso de la maduración de afinidad. Un anticuerpo que "utiliza" una línea germinal particular tiene una secuencia de nucleótidos aminoácidos que se alinea muy estrechamente con la secuencjia de nucleótidos de línea germinal o con la secuencia de aminoácidos que especifica en comparación con otras secuencias de línea germinal. Estos anticuerpos pueden ser codificados por o pueden comprender una secuencia que es mutada en comparación con la secuencia de línea germinal.
En algunas modalidades, la estructura de humano tiene una variación mínima de la secuencia de línea germinal, por ejemplo, menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de estructura aceptadores han sido reemplazados para mejorar una o más propiedades del anticuerpo. En algunas modalidades, los residuos de estructura aceptadores son remplazados por residuos de estructura donadores, por ejemplo, para mejor|ar la afinidad de unión (véase, por ej mplo, Queen y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,530,101). En una modalidad particular, un número limitado de aminoácidos en la estructura de una cadena de anticuerpo humanizado (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) se seleccionan para que sean los mismos que lbs aminoácidos en aquellas posiciones en la secuencia donadora (es decir, "con mutación restauradora"), preferiblemente que en la secuencia aceptadora, para incrementar la afinidad de 7 un anticuerpo que comprende la cadena de anticuerpo humanizado para el CCL20 de humano. ! Las regiones de estructura de humano (por ejemplo, de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera) se obtienen o se derivan preferiblemente de una secuencia de línea germinal de humano que tiene similitud de secuencia con i la región análoga o equivalente {por ejemplo, regiones variables de cadena pesada o ligera) de la región de unión¡ a I antígenos del anticuerpo donador (por ejemplo, anticuerpo de murino anti-CCL20) . Otras fuentes de regiones de estructura para porciones de secuencia de humano de un anticuerpo I humanizado incluyen secuencias consensúales de regiones variables de humano (Véase, por ejemplo, Kettleborough¦ y I colaboradores, Protein Engineering 4:773-783 (1991); Cárter y colaboradores, documento O 94/04679; Cárter Patente de los Estados Unidos No. 6,407,213)). Por ejemplo, la región de la secuencia donadora del anticuerpo {por ejemplo, la secuencia de la región variable) utilizada para obtener la porción ¡no humana se puede comparar con secuencias de humano como se describe en Kabat, E.A. y colaboradores Sequences of Proteins of Immunologicol Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991) para seleccionar una fuente particular de porciones de humano del anticuerpo humanizado, por ejemplo, una fuente de las regiones de estructura.
I En una modalidad, las regiones de estructura de las cadenas de anticuerpo humanizado se obtienen, o se derivan, i de una región variable de Ig de humano que tiene por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%¡ o por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencias global, con la región variable del donador no humano. En una modalidad particular, las regiones de estructura de las cadenas de anticuerpo humanizado se obtienen o se derivan de regiones de estructura de región variable de humano q e i tienen por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos ¦ i aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencias global con las regiones de estructura de la región variable del anticuerpo donador no humano .
En una modalidad, por lo menos una de las regiones de estructura (FR) del anticuerpo humanizado se obtiene o se deriva de una o más cadenas de una secuencia de humano. De i esta manera, la FR puede incluir una FR1 y/o FR2 y/o FR3 y/o FR4 obtenida o derivada de uno o más anticuerpos de secuencjia de humano (por ejemplo, de una cadena de anticuerpo de I humano, de una secuencia consensual de humano) .
Una persona de experiencia en el campo apreciará que en algunos casos los residuos que están situados en 'el flanco de una o más de las CDRs del (los) anticuerpo (s) de murino anti-CCL20 pueden contribuir, y en algunos casos, i pueden ser esenciales, ya sea directa o indirectamente, a la función (por ejemplo, unión) . Por consiguiente, en algun'as modalidades, uno o más aminoácidos que están colocados en el flanco de una o más CDRs (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, i 8, 9, 10 o más aminoácidos flanqueadores) de la estructura de murino también están incluidos en el anticuerpo humanizado. ' En algunas modalidades, las regiones de estructura de cadena pesada de humano de los anticuerpos humanizados de esta invención utilizan la secuencia de línea germinal IGHV1-46*03 de humano. En algunas modalidades, las regiones de estructura de cadena ligera de humano de los anticuerpos humanizados de esta invención utilizan la secuencia de línea germinal IGKV1D-39*01 de humano. Las mutaciones (por ejemplo, mutaciones restauradoras) se pueden hacer opcionalmente en esas regiones FR, por ejemplo, en uno o más de los residuos descritos en los Ejemplos posteriores para mejorar la afinidad de unión a CCL20 del anticuerpo humanizado.
"Afinidad" es un término de la técnica que describe i la fuerza de una interacción de unión y típicamente se refiere a la fuerza global de unión del anticuerpo al antígeno. La afinidad del anticuerpo por el antígeno se expresa típicamente como la constante de equilibrio de afinidad de unión (KD) de una interacción particular de anticuerpo-antígeno .
En algunas modalidades, el anticuerpo se une al CCL20 de humano con una afinidad (KD; KD=Koff (kd) /Kon (ka)) de 500 pM o menos, 400 pM o menos, 300 pM o menos, 200 pM ¡ o menos, 100 pM o menos, 90 pM o menos, 80 pM o menos, 70 pMj o menos, 60 pM o menos, 50 pM o menos o 45 pM o menos ' t determinado mediante la resonancia de plasmón superficial I monovalente; o 12 pM o menos, 10 pM o menos, 8 pM o menos, 6 pM o menos o 5 pM o menos determinada mediante la resonancia de plasmón superficial bivalente. En algunas modalidades, el anticuerpo se une al CCL20 de humano con un valor ka de 1000 x 105 M"1 seg"1 o menos, 900 x 105 "1 seg"1 o menos, 800 x 105 NT1 seg"1 o menos, 700 x 105 M"1 seg"1 o menos, 600 x 105 M"1 seg"1 o menos, 500 x 105 M"1 seg"1 o menos, 400 x 105 M"1 seg"1) o menos, 300 x 105 M"1 seg"1 o menos, 240 x 105 M"1 seg"1 o menos, 200 x 105 M"1 seg"1 o menos, 190 x 105 M"1 seg"1 o menos, 180 x 105 M"1 seg"1 o menos, 170 x 105 "1 seg"1 o menos, 160 x 105 M"1 seg"1 o menos o 150 x 105 M"1 seg"1 o menos, determinado mediante la resonancia de plasmón superficial monovalente (BiacoreMR) . En algunas modalidades, el anticuerpo se une al CCL20 de humano con un kd de 1000 x 10"5 seg"1 o menos, 9001 x 10"5 seg"1 o menos, 800 x 10"5 seg"1 o menos, 700 x 10"5 seg"1 o menos, 600 x 10"5 seg"1 o menos, 500 x 10"5 seg"1 o menos, 400 x 10"5 seg"1 o menos, 300 x 10"5 seg"1 o menos, 240 x 10"5 seg"1! o menos, 200 x 10"5 seg"1 o menos, 190 x 10"5 seg"1 o menos, 180! x 10"5 seg"1 o menos, 170 x 10"5 seg-1 o menos, 160 x 10"5 seg"1! o menos, 150 x 10"5 seg"1 o menos, 140 x 10"5 seg"1 o menos, 130¡ x 10"5 seg"1 o menos, 120 x 10"5 seg"1 o menos, 100 x 10"5 seg"1! o menos, 90 x 10"5 seg"1 o menos, 80 x 10~5 seg-1 o menos, 70 | x 10"5 seg"1 o menos o 65 x 10"5 seg"1 o menos determinado mediante la resonancia de plasmón superficial monovalente (BiacoreMR) .
Como es aparente para una persona de experiencia en el campo, se puede utilizar una variedad de métodos para confirmar que los anticuerpos y porciones de unión ¡ a antígenos de los mismos que son producidos de acuerdo con métodos proporcionados en este documento y conocidos en el campo tienen la especificidad necesaria (por ejemplo, especificidad de unión, especificidad epitópica) . Por ejemplo, la función de unión de un anticuerpo humanizado anti-CCL20 o una porción de la invención que tiene i especificidad de unión por el CCL20 de humano se puede detectar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, ensayos los cuales supervisan la formación de un complejo entre el anticuerpo humanizado o una porción y el CCL20 ¡de humano (o, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos del CCL20 o un soporte sólido que comprende el CCL20 de humano) .
La capacidad de un anticuerpo o una porción :de unión a antígenos del mismo de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o una porción de la invención) para unirse al mismo epítopo en el CCL20 de humano como ¡un anticuerpo monoclonal de murino, quimérico o humanizado particular dado a conocer en este documento o para unirse; a un epítopo en el CCL20 de humano el cual se traslapa con ;el epítopo en el CCL20 de humano al cual se une un anticuerpo monoclonal de murino, quimérico o humanizado particular que se da a conocer en este documento, se puede determinar fácilmente utilizando una variedad de técnicas conocidas para aquellas personas de experiencia en el campo que incluyen ppr ejemplo ensayos de unión competitiva. Estos pueden involucrar el uso de una forma etiquetada del anticuerpo particular y una medición de la unión de ese anticuerpo etiquetado al CCL20 de humano en presencia y en ausencia de un anticuerpo de la invención.
Un "epítopo" como se utiliza en este documento incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los métodos para caracterizar el epítopo al cual se une un anticuerpo son conocidos en el campo. Un método para caracterizar un epítopo I unido por un anticuerpo anti-CCL20 de la invención se describe en el Ejemplo 9. Una vez que se determina un epítopo í deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en la presente invención. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede esclarecer información acerca de epítopos deseables. A partir de esta información, entonces es posib,le seleccionar competitivamente anticuerpos para la unión al mismo epítopo. Por ejemplo, el trabajador experto puede conducir estudios de competencia para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente entre sí, es decir, anticuerpos que compiten por la unión al antígeno.
En una modalidad, para determinar si un anticuerpo de prueba o una porción de unión a antígenos del mismo se une al mismo epítopo o epítopo traslapante como un anticuerpo humanizado de esta invención, uno permite que el anticuerpo anti-CCL20 de la invención se una al CCL20 bajo condiciones de saturación y luego mide la capacidad del anticuerpo : ¡de prueba para unirse al CCL20. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse al CCL20 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-CCL20 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-CCL20 de referencia. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse al CCL20, al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo, un epítopo traslapante o un epítopo que está en proximidad estrecha con el epítopo unido por el anticuerpo anti-CCL20 de la invención. Este experimento se puede realizar utilizando, por ejemplo, un ensayo ELISA, RIA, BiacoreMR o la citometría de flujo. Para someter a prueba si un anticuerpo anti-CCL20 compite de manera cruzada con otro anticuerpo anti-CCL20, uno puede utilizar el método de competencia descrito anteriormente en dos direcciones es decir, determinar si el anticuerpo de referencia bloquea el anticuerpo de prueba y viceversa. En algunas modalidades, el experimento se realiza utilizando BiacoreMR.
La preclasificación de epítopos también puede ser j útil para caracterizar los anticuerpos de esta invención. El término "preclasificación" se refiere a un método para agrupar anticuerpos con base en sus características de unión a antígenos. Un proceso de alto rendimiento para "preclasificar" anticuerpos con base en su competencia cruzada se describe en la Solicitud de Patente Internacional NO. WO 03/48731. La "preclasificación de epítopo" puede ser investigada al permitir que una forma no etiquetada de un anticuerpo anti-CCL20 "A" se una a un péptido sintético que I corresponde a la secuencia de CCL20 o a las células positivas en CCL20. Subsecuentemente, un segundo anticuerpo anti-CCL20 etiquetado "B" se agrega y uno puede evaluar la cantidad 'de anticuerpo etiquetado que se puede unir en relación con una muestra de control donde las células o péptido sintético !no han sido expuestos previamente al anticuerpo anti-CCL20 "A". Alternativamente, los anticuerpos anti-CCL20 "A" y "B" pueden ser etiquetados ambos con diferentes fluorocromos o productos químicos que hacen posible la detección y uno puede medir ljas cantidades de ambos anticuerpos etiquetados que pueden acoplarse al péptido de CCL20 al mismo tiempo utilizando un dispositivo capaz de detectar la etiqueta o de medir las cantidades de ambos anticuerpos que se acoplan simultáneamente a las células positivas en CCL20 mediante la citometría de flujo. Las tecnologías BiacoreMR y Octet hacen posible que uno investigue la unión competitiva de formas no etiquetadas de anticuerpos. Este uso de formas no etiquetadas de anticuerpos se desea ya que la modificación química de algunos anticuerpos puede comprometer la actividad de unión. Véase también la tecnología descrita en Jia y colaboradores, J. Immunol . Methods 288:91-98 (2004), la cual también es útil en la realización de la preclasificación de epítopos.
También se proporcionan en este documento porciones de los anticuerpos anti-CCL20 de la invención, tales como cadenas ligeras, cadenas pesadas y porciones de cadenas ligeras y pesadas. Estas porciones de anticuerpos se pueden obtener o derivar de anticuerpos (por ejemplo, mediante la reducción y/o escisión) o pueden ser producidas o expresadas por ácidos nucleicos que codifican una porción de un anticuerpo o una cadena del mismo que tiene la propiedad deseada (por ejemplo, se une al CCL20 de humano, similitud de secuencias) . También se pueden preparar por ejemplo mediante la síntesis de novo de la porción relevante. Los anticuerpos humanizados que comprenden las porciones deseadas (por ejemplo, región de unión a antígenos, CDR, FR, región C) de origen humano y no humano se pueden producir utilizando ácidos nucleicos sintéticos y/o recombinantes para preparar construcciones (por ejemplo, ADNc) que codifican la cadena humanizada deseada. Por ejemplo, para preparar una porción de I un anticuerpo (por ejemplo, una porción de una cadena) , uno o i más codones de detención se pueden introducir en la posición deseada en la secuencia de ácidos nucleicos. Las secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que codifican lias regiones variables humanizadas se pueden construir utilizan'do métodos de mutagénesis de PCR para alterar las secuencias de ADN existentes (véase, por ejemplo, Kamman y colaboradores, Nucí. Acids Res. 17:5404 (1989)). Los cebadores de PCR que codifican las nuevas CDRs pueden hibridarse con una plantilla í de ADN de una región variable humanizada previamente la cual se basa en la misma región variable humana, o una región muy similar) (Sato y colaboradores, Cáncer Research 53:851-856 (1993)). Si una secuencia de ADN similar no está disponible para el uso como una plantilla, un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una secuencia de región i variable se puede construir a partir de oligonucleótidos sintéticos (véase por ejemplo, Kolbinger, Protein Engineering 8:971-980 (1993)). Una secuencia que codifica un péptido de señal ("secuencia de señal") también se puede incorporar en el ácido nucleico (por ejemplo, en la síntesis, con la inserción en un vector) . Si una secuencia de péptidos 'de señal no está disponible (por ejemplo, no está presente típicamente) , se puede utilizar una secuencia de péptidos de señal de otro anticuerpo (véase, por ejemplo, Kettleborough, Protein Engineering 4:773-783 (1991)) . Utilizando estíos métodos, métodos descritos en este documento u otros métodos adecuados, las variantes se pueden producir fácilmente.
Como se utiliza en este documento, las siglas "mAb" (o "MAb") se refieren a un anticuerpo monoclonal, el cual puede ser, por ejemplo, un anticuerpo sintetizado por úna población clonal de células o un anticuerpo humanizado. Una población clonal que produce un anticuerpo monoclonal puede ser una población clonal de células inmortalizadas. En algunas modalidades, las células inmortalizadas en la población clonal son células híbridas - hibridomas producidas típicamente por la fusión de linfocitos B individuales de un animal inmunizado con células individuales de un tumor linfocítico.
La invención se refiere en parte a un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígenos del mismo que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano y comprende una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada y/o porciones de las mismas. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que i comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO : 7 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 1; una cadena i ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 7 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID N : 2; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO : 7 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 3; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 7, y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 4; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 7 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 5; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 7 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 6; una cadena ligera que comprende una o más CDRs [por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 1; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, I las tres CDRs) de la SEC ID NO: 2; una cadena ligera que i comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de ¡la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 3; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID 4; una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 5; o una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 8 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por i ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO : 6.
En una modalidad, un anticuerpo humanizado de la invención comprende una (H)-CDRl, H-CDR2, H-CDR3 de cadena pesada, una (L)-CDRl, L-CDR2 y L-CDR3 de cadena ligera sus secuencias de aminoácidos son: a) SEC ID NOS : 60, 64, 67, 70, 73 y 75, respectivamen e; b) SEC ID NOS: 60, 64, 67, 71, 73 y 75, respectivamente ; i O SEC ID NOS: 60, 63, 67, 70, 73 y 75, respectivamente ; d) SEC ID NOS: 60, 63 , 67, 71, 73 y 75, respectivamente ; e) SEC ID NOS : 61, 65, 68, 70, 73 y 75, respectivamente ; f ) SEC ID NOS : 61, 65, 68, 71, 73 y 75, respectivamente ; g) SEC ID NOS : 77, 79, 67, 70, 73 y 75, respectivamente ; h) SEC ID NOS : 77, 79, 67, 71, 73 y 75, respectivamente ; i) SEC ID NOS: 78, 80, 68, 70, 73 y 75, respectivamente; y j) SEC ID NOS : 78, 80, 68, 71, 73 y 75, respectivamente .
En otra modalidad, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende una H-CDR3 su secuencia es la SEC ID NO: 67 o 68. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende H-CDR3 y L-CDR3 sus secuencias son las SEC ID NOS: 67 y 75, respectivamente; o SEC ID NOS: 68 y 75, respectivamente.
En otra modalidad, el anticuerpo humanizado tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano y comprende una cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 70 o 71; 73; y 75, o una combinación de las mismas; y una cadena pesada que comprende una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 60, 61, 77 O 78; 63, 64, 65, 79 u 80; y 67 o 68; o una combinación de las mismas.
En otra modalidad, el anticuerpo humanizado que tiene una especificidad de unión por el CCL20 de humano i comprende una cadena ligera que comprende una o más CDRs (por ejemplo, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 7, 8, 110 o 1121 y una cadena pesada que comprende una o más CDRs (por e empl'o, las tres CDRs) de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 108.
La invención también se refiere a una cadena ligera de anticuerpo humanizado del anticuerpo humanizado descrito en este documento. En una modalidad, la cadena ligera Ide anticuerpo humanizado comprende una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste de 70 o 71; 73; y 75, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado tiene L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 sus secuencias de aminoácidos son 70, 73 y 75, respectivamente; o 71, 73 y 715, respectivamente.
La invención también se refiere a una cadena pesada i de anticuerpo humanizado del anticuerpo humanizado descrito en este documento. En una modalidad, la cadena pesada de anticuerpo humanizado comprende una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste de 60, 61, 77 o 78; 63, 64, 65, 79 u 80; y 67 o 68; o una combinación de las mismas. Por ejemplo, i el anticuerpo humanizado tiene H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3 sus secuencias de aminoácidos son: a) SEC ID NOS: 60, 63 y 67; b) SEC ID NOS: 60, 64 y 67; c) SEC ID NOS : 61, 65 y 68; d) SEC ID NOS: 77, 79 y 67; o e) SEC ID NOS: 78, 80 y 68. i En una modalidad, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de dominio variable (VL) de la SEC ID NO: 15 o 16. En una modalidad relacionada, el anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera su secuencia de aminoácidos comprende o consiste de una de las SEC ID NOS: 7, 8, 110 y 112. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende u ina cadena ligera su secuencia de aminoácidos comprende : o consiste de la SEC ID NO : 7 u 8 sin la secuencia de señal.
En una modalidad, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de dominio variable (VH) de una de las SEC ID No's : 9-14. En una modalidad relacionada, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada su secuencia de aminoácidos comprende o consiste de las SEC ID NOS: 1-6 y 108. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada su secuencia de aminoácidos comprende o consiste de una de las SEC ID NOS: 1-6 sin la secuencia de señal y opcionalmente sin la lisina C-terminal. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada su secuencia de aminoácidos comprende o consiste de la SEC ID NO: 108 sin la lisina C-terminal.
En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende una VH y una VL sus secuencias de aminoácidos comprenden o consisten de a) SEC ID NO: 9 : / SEC ID NO: 15; b) SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 15; c) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 15; d) SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 15; c) SEC ID NO : 13 y SEC ID NO: 15; f) SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 15; g) SEC ID NO: 9 : Y SEC : ID NO: 16; h) SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: : 16; i) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: : 16; j) SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: : 16; k) SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: : 16; 1) SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: : 16.
En una modalidad, un anticuerpo humanizado de esta invención comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC) sus secuencias de aminoácidos comprenden . o consisten de a) SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 7; b) SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 7; c) SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 7; d) SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 7; e) SEC ID NO : 5 y SEC ID NO : 7; f) SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 7; g) SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 8; h) SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 8; i) SEC ID NO: 3 y SEC ID NO : 8; 1 j) SEC ID NO: 4 y SEC ID NO : 8; k) SEC ID NO: 5 y SEC ID NO : 8; 1) SEC ID NO: 6 y SEC ID NO : 8; m) SEC ID NO: 108 y SEC ID NO: 110; y n) SEC ID NO: 108 y SEC ID NO: 112; en donde las secuencias de aminoácidos carecen de la secuencia de señal, si está presente, en donde las SEC :ID NOS : 1-6 y las SEC ID NO: 108 carecen opcionalmente de la lisina C-terminal.
La presente invención proporciona cualquier combinación que comprende una cadena pesada humanizada, ejemplificada y una porción de unión a antígenos de la misma y una cadena ligera humanizada, ejemplificada o una porción de unión a antígenos de la misma, de la invención; en otras palabras, las cadenas pesadas y ligeras se pueden "mezclar; y emparejar" . Se entiende que es probable que cualquier combinación de ese tipo retenga la unión a una CCL20 de humano así como también la actividad neutralizante de quimiotaxis. Estas propiedades funcionales se pueden someter a prueba fácilmente utilizando métodos descritos en este documento. En realidad, la FIGURA 7 demuestra la actividad ' í neutralizante de varias combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanizadas, ejemplificadas de la invención. i Esta invención también proporciona anticuerpos anti-CCL20 de humano o porciones de unión a antígenos de los mismos que se unen al mismo epítopo que y/o compiten; o compiten de manera cruzada con, un anticuerpo ejemplificado en este documento. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanizados, quiméricos o de ratón. Por ejemplo, la invención proporciona anticuerpos anti-CCL20 de humano y porciones que se unen al mismo epítopo que, y/o compiten o compiten de manera cruzada con, uno de los anticuerpos de ratón anti-CCL20 36F7C10, 40-1C10B9 y 42G5B10, o versiones humanizadas o quiméricas de esos anticuerpos de ratón. La capacidad de un anticuerpo para unirse al mismo epítopo que, o competir o competir de manera cruzada con, un anticuerpo de referencia, se puede determinar como se describe en este documento. A manera de ejemplo no limitante, cualquier anticuerpo o porción que comprenda las tres CDRs de cadena pesada y las tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo 'de ratón 36F7C10 se esperaría que se unieran al mismo epítopo que, compitieran con y compitieran de manera cruzada con el anticuerpo de ratón 36F7C10. Estos anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos su cadena pesada comprende cualquiera de las SEC ID NOS: 9-11 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 15 o 16. En algunas modalidades, estos anticuerpos pueden incluir además, por ejemplo, anticuerpos su cadena pesada comprende cualquiera de las SEC ID NOS: 12-14 y su cadena ligera comprende la SEC ID NO: 15 o 16. j Si se desea, por ejemplo, para fines de diagnóstico o ensayo (por ejemplo, imagenología para permitir, pror ejemplo, la supervisión de terapias) , el anticuerpo humanizado (o una porción de unión a antígenos del mismo) puede comprender una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables adecuadas y los métodos para etiquetar un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígenos del ¡ mismo son bien conocidos en el campo. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisótopo (por ejemplo, como Indio-111, Tecnecio-99m o Yodo-131) , etiquetas emisores de positrones (por ejemplo, Flúor-19) , i iones paramagnéticos (por ejemplo, Gadlinio (III) , Manganeso (II) ) , una etiqueta de epítopo (etiqueta) , una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina) , una etiqueta giratoria, una enzima, un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente . Cuando no se emplean etiquetas, la formación de complejos (por ejemplo, entre un anticuerpo humanizado y CCL20 de humano) se puede determinar mediante la resonancia de plasmón superficial, ELISA, FACS u otros métodos adecuados. 1 Los anticuerpos anti-CCL20 o porciones de unióni a antígenos de los mismos que se utilizan en esta invención también se pueden conjugar, por ejemplo, por vía de reacciones químicas o modificaciones genéticas, a otras porciones (por ejemplo, porciones de conjugación con PEG) que mejoran la farmacocinética de los anticuerpos tal como la vida media. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CCL20 que se utilizan en esta invención se pueden vincular con una citocina adecuada, por ejemplo, por vía de la conjugación química o modificaciones genéticas (por ejemplo, la adjunción de la secuencia de codificación de la citocina en estructura a una secuencia de codificación de anticuerpo, creando de ese modo una proteína de fusión de anticuerpo : citocina) .
La invención también se refiere a inmunoconjugados en los cuales el anticuerpo humanizado (o una porción de unión a antígenos del mismo) de la invención se acopla a otro agente terapéutico, tal como un compuesto bioactivo (por ejemplo, una citocina, un superantígeno, un agente citotóxico o una toxina) . Por ejemplo, el anticuerpo humanizado que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano (o una porción de unión a antígenos del mismo) se puede acoplar a una proteína biológica, una molécula de origen vegetal o bacteriano (o un derivado de la misma) , un anticuerpo de interleucina-2 o anticuerpos para toxinas de difteria.
Como se describe en este documento, se han producido anticuerpos monoclonales de ratón que tienen especificidad de unión por el CCL20 de humano. Los anticuerpos humanizados y quiméricos de esta invención se pueden derivar de los anticuerpos monoclonales de ratón de esta invención. Es decir, en algunas modalidades, los anticuerpos humanizados y quiméricos anti-CCL20 de la invención comprenden secuencias tomadas de un anticuerpo monoclonal de ratón de la invención, tal como una o más secuencias de CDR (por ejemplo, las seis secuencias de CDR) o uno o más dominios variables (por ejemplo, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena i ligera) . I Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo monoclonal de ratón" se refiere a un anticuerpo que contiene CDRs de cadena ligera (L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3) y CDRs de cadena pesada (H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3) de un anticuerpo de murino, y regiones de estructura y constantes i de origen murino. ¡ La invención se refiere a los anticuerpos ¡ monoclonales de ratón descritos en este documento, así como también porciones de unión a antígenos de los anticuerpos monoclonales de ratón, las cadenas ligeras de los anticuerpos monoclonales de ratón, las cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales de ratón y porciones de estas cadenas pesadas y ligeras. En una modalidad particular, el anticuerpo monoclonal de ratón es 36F7C10, 40-1C10B9 o 42G5B10. La invención se refiere a anticuerpos monoclonales de ratón que carecen de las secuencias de señal de cadena pesada y ligera y anticuerpos monoclonales de ratón que son glicosilados . iLa i invención también se refiere a anticuerpos precursores, anticuerpos no glicosilados y anticuerpos sus cadenas pesada y/o ligeras comprenden secuencias de señal. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las anteriores cadenas pesadas, i cadenas ligeras o porciones de las mismas de anticuerpos de ratón; a vectores y células hospedantes que comprenden estos ácidos nucleicos; a métodos para producir cualquiera de las anteriores cadenas pesadas o ligeras de ratón o porciones ¡de las mismas; y a métodos para utilizar los anticuerpos de ratón o porciones de unión a antígenos de los mismos.
La función de unión de un anticuerpo monoclonal de ratón o una porción de unión a antígenos del mismo que tiene \ especificidad de unión por el CCL20 de humano se puede detectar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo utilizando ensayos los cuales supervisan la formación de un complejo entre un anticuerpo monoclonal de ratón o una porción y el CCL20 de humano (o, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de CCL20 o un soporte sólido que comprende el CCL20 de humano) .
También se proporcionan en este documento porciones de los anticuerpos de murino los cuales incluyen cadenas ligeras, cadenas pesadas y porciones de cadenas ligeras y pesadas. Las porciones de anticuerpo se pueden obtener , o 8 derivar, por ejemplo, por medios descritos en este documento para porciones de anticuerpo humanizado.
En una modalidad, un anticuerpo monoclonal de ratón de esta invención comprende una cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 40, 42 o 44 y comprende además una cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 39, 41 o 43. En una cierta modalidad, el anticuerpo monoclonal de ratón comprende una cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 40 y una cadena i pesada que comprende la SEC ID NO: 39; una cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 42 y una cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 41; o una cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 44 y una cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 43.
En otra modalidad, la invención también se refiere i a un anticuerpo monoclonal de ratón que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano, que comprende la región variable de cadena ligera en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 40, 42 y 44; y una región variable de cadena pesada en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 39, 41 y 43.
La invención también se refiere a un anticuerpo i monoclonal de ratón su cadena ligera comprende la región variable en la SEC ID NO : 40 , 42 o 44.
La invención también se refiere a un anticuerpo monoclonal de ratón su cadena pesada comprende la región variable en la SEC ID NO: 39, 41 o 43.
Si se desea, por ejemplo, para fines de diagnóstico o ensayo (por ejemplo, imagenología) , el anticuerpo monoclonal de ratón o una porción de unión a antígenos del mismo puede comprender una etiqueta detectable por ejemplo como se describe en este documento para anticuerpos humanizados. Todos los métodos y técnicas adecuados que se describen en este documento para anticuerpos humanizados de esta invención también se pueden utilizar para anticuerpos monoclonales de ratón de la invención.
Como se describe en este documento, los anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión por el CCL20 de humano han sido producidos. Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a una proteína recombinante que contiene los dominios variables de un anticuerpo derivado de una especie mientras que los dominios constantes del anticuerpo se derivan de una especie diferente. En una modalidad, el anticuerpo quimérico cbn especificidad de unión por el CCL20 de humano comprende dominios variables de un anticuerpo monoclonal de ratón anti- CCL20 de humano. En una modalidad, el anticuerpo quimérico i con especificidad de unión por el CCL20 de humano comprende dominios constantes de un anticuerpo de humano. En una modalidad particular, el anticuerpo quimérico comprende dominios variables de un anticuerpo monoclonal de ratón anti- CCL20 de humano y dominios constantes de un anticuerpo de humano .
La invención se refiere a los anticuerpos quiméricos que se describen en este documento, así cómo también porciones de unión a antigenos de los anticuerpos quiméricos, las cadenas ligeras y cadenas pesadas de los anticuerpos quiméricos y porciones de estas cadenas ligeras y pesadas. La invención se refiere a anticuerpos quiméricos que i carecen de las secuencias de señal de cadenas pesadas y ligeras y anticuerpos quiméricos que son glicosilados . La invención también se refiere a anticuerpos precursores, anticuerpos no glicosilados y anticuerpos sus cadenas pesadas y/o ligeras comprenden secuencias de señal. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las cadenas pesadas, cadenas ligeras o porciones de las mismas de los anticuerpos quiméricos anteriores; a vectores y células hospedantes que comprenden estos ácidos nucleicos; a métodos para producir cualquiera de las cadenas pesadas o ligeras o porciones de las mismas de los anticuerpos quiméricos anteriores; y a métodos para utilizar los anticuerpos quiméricos.
La función de unión de un anticuerpo quimérico que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano se puede detectar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo utilizando ensayos los cuales supervisan la formación de un i complejo entre un anticuerpo quimérico y una CCL20 de humano (o, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de CCL20 o un soporte sólido que comprende 'el CCL20 de humano) .
También se proporcionan en este documento porciones de anticuerpos quiméricos las cuales incluyen cadenas i ligeras, cadenas pesadas y porciones de cadenas ligeras , y pesadas. Estas porciones de anticuerpos se pueden obtener o I derivar, por ejemplo, por medios descritos en este documento i para porciones de anticuerpos humanizados.
En una modalidad, un anticuerpo quimérico de esta i invención comprende la región variable de cadena ligera de ,1a SEC ID NO: 40 y la región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 39; la región variable de cadena ligera de la SEC ¡ID NO: 42 y la región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 41; o la región variable de cadena ligera de la SEC ID NO: 44 y la región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 43.
La invención también se refiere a un anticuerpo quimérico que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano, que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: ía región variable de cadena ligera en la SEC ID NO: 40, 42 ; o 44; y que comprende además una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: la región variable de cadena pesada en la SEC ID NO: 39, 41 o 43.
La invención también se refiere a una cadena ligera quimérica que comprende la región variable en la SEC ID NO: 40, 42 o 44.
La invención también se refiere a una cadena pesada quimérica que comprende la región variable en la SEC ID NO: 39, 41 o 43.
Si se desea, por ejemplo, para fines de diagnóstico o ensayo (por ejemplo, imagenología) , el anticuerpo quimérico o una porción de unión a antígenos del mismo puede comprender una etiqueta detectable, por ejemplo, como se describe en este documento para anticuerpos humanizados. Todos l,os métodos y técnicas adecuados que se describen en es'te I documento para los anticuerpos humanizados de esta invención también se pueden utilizar para anticuerpos quiméricos de la invención .
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL20 de la invención es un anticuerpo completamente humano. Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo de humano" significa cualquier anticuerpo en el cual las secuencias de dominio variable y constante son secuencias de humano. Él término comprende anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos, pero las cuales han sido cambiadas, por ejemplo para disminuir una posible inmunogenicidad, para incrementar la afinidad, para eliminar cisteínas que podrían causar un plegamiento indeseable, etcétera. El término i también comprende estos anticuerpos producidos de manera recombinante en células que no son de humano, lo cual podría conferir una glicosilación que no es típica de células de humano. Los métodos para preparar anticuerpos completamente humanos son conocidos en el campo. Por ejemplo, los anticuerpos de humano anti-CCL20 se pueden identifica a través de procesos in vitro, tal como la expresión en fagos, expresión en ribosoma (CAT) , expresión en levadura , y similares, o se pueden producir a partir de una célula B 'de humano o una célula de hibridoma de humano. Alternativamente, los anticuerpos de humano se pueden producir mediante la inmunización con un antígeno de CCL20 de cualquiera de una variedad de animales transgénicos no humanos que comprenden dentro de sus genomas algunos o todos los sitios de cadena r pesada y cadena ligera de inmunoglobulina de humano. En algunas modalidades, el animal no humano que comprende genes de inmunoglobulina de humano es un animal que tiene un "minisitio" de inmunoglobulina de humano (por ejemplo, GenPharm International, Inc.). En algunas modalidades, los anticuerpos de humano anti-CCL20 se producen utilizando XENOMOUSEMR (Abgenix, Inc., Fremont , CA) , HuMAb-MouseMR (Mcdarex, Inc.), Veloclmmune mouseMR (Regenerpn Pharmaceuticals , Inc.), un ratón AlivaMabMR (Ablexis, LLC) , ratón KMMR raouse (Kirin Pharma EUA, Inc.) o similares.
I I La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden i secuencias las cuales codifican un anticuerpo humanizado; o una cadena ligera o cadena pesada del mismo, un anticuerpo í monoclonal de ratón o una cadena ligera o cadena pesada del mismo, un anticuerpo quimérico o una cadena ligera o cadena pesada del mismo o porciones de unión a antígenos 'de i cualquiera de los anteriores, de la presente invención. En algunas modalidades, la presente invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 17-32, 51-56, 109, 111 y 113.
En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan bajo condiciones sumamente i rigurosas o que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90¡%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas, a una o más de las secuencias i de ácidos nucleicos que se citan en este documento o a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias VH o VL proporcionadas.
Los ácidos nucleicos referidos en este documento como "aislado" o "purificado" son ácidos nucleicos los cuales han sido separados de los ácidos nucleicos del ADN genómico o ARN celular lejos de su fuente de origen (por ejemplo, ya que existen en células o en una mezcla de ácidos nucleicos tal como una colección) e incluyen ácidos nucleicos que se obtienen por medio de métodos descritos en este documentó u otros métodos adecuados. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos aislados son ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por medio de la síntesis química, ácidos nucleicos producidos por medio de combinaciones de métodos biológicos y químicos o ácidos nucleicos recombinantes los cuales se aislan (véase, por ejemplo, Daugherty y colaboradores, Nucleic Acids Res. 19 (9) : 2471-2476 (1991); Lewis y Crowe, Gene 101:297-302 (1991)) .
Una referencia a. una secuencia de nucleótidos comprende su complemento a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular se debe entender que comprende su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. El término "polinucleótido" referido en este documento significa una forma polimérica, posiblemente aislada, de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena individual y doble.
Los ácidos nucleicos referidos en este documento como "recombinantes" son ácidos nucleicos los cuales han sido producidos por medio de la metodología de ADN recombinanté , incluyendo aquellos ácidos nucleicos que son generados pór medio de procedimientos los cuales se basan en un método de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y/o clonación en un vector utilizando enzimas de restricción. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos recombinantes resultan de eventos de recombinación que ocurren a través de los mecanismos naturales de células, pero se seleccionan después de la introducción en las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir y hacer probable un evento ,de recombinación deseado.
La presente invención también se refiere más específicamente a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos la cual codifica un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de ratón o iin anticuerpo quimérico, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón de la presente invención, un anticuerpo humanizado de la presente invención en el cual la(s) porción (es) que no es (son) de humano se deriva (n) de un anticuerpo monoclonal de murino anti-CCL20; o un anticuerpo quimérico de la presente invención en el cual la(s) porción (es) que no es (son) de humano se deriva (n) de un anticuerpo monoclonal de murino anti-CCL20.
En algunas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención se utilizan para producir anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión por el CCL20 de humano, anticuerpos de ratón que tienen especificidad de unión por el CCL20 de humano y anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión por el CCL20 de humano. Por ejemplo, un ácido nucleico (por ejemplo, ADN (tal como ADNc) o A N) o uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de ratón o un anticuerpo quimérico de la presente invención se pueden incorporar en una construcción adecuada (por ejemplo, un vector recombinante) para la manipulación adicional de secuencias o para la producción de los anticuerpos codificados en células hospedantes adecuadas .
Las construcciones o vectores que son adecuados para la expresión de un anticuerpo humanizado que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano, un anticuerpo de ratón que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano o un anticuerpo quimérico que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano también se proporcionan. Está disponible una variedad de vectores, que incluyen vectores los cuales se mantienen en una copia individual o en múltiples copias en una célula hospedante o los cuales se integran en el (los) cromosoma (s) de una célula hospedante.
Las construcciones o vectores se pueden introducir en una célula hospedante adecuada y las células las cuales expresan 1 un anticuerpo humanizado, anticuerpo de ratón o anticuerpo quimérico de la presente invención, se pueden producir1 y mantener en cultivo. Un vector individual o múltiples vectores se pueden utilizar para la expresión de un anticuerpo humanizado, anticuerpo de ratón o anticuerpo quimérico que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano .
Los vectores de expresión adecuados, por ejemplo vectores de expresión de células de mamífero, también pueden contener una variedad de componentes que incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: un origen 'de replicación; un gen marcador seleccionable ; uno o más elementos de control de expresión tal como un elemento Ide control transcripcional (por ejemplo, un promotor, ^n intensificador, un terminador) , una o más señales de traducción; y/o una secuencia de señal o secuencia líder (que codifica un "péptido de señal") para la fijación como objetivo de la membrana o la secreción. En una construcción.; o vector, una secuencia de señal puede ser proporcionada por la construcción o vector u otra fuente. Por ejemplo, las señales de transcripción y/o traducción se pueden utilizar para dirigir la expresión.
En algunas modalidades, se proporciona un promotor para la expresión de un anticuerpo o una cadena de anticuerpo de la invención en una célula hospedante adecuada. En algunas i I modalidades, el promotor es constitutivo. En algunas modalidades, el promotor es inducible. El promotor puede ser vinculado de manera operable a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o una cadena de anticuerpo, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo o cadena, de tal manera que S dirige la expresión del polipéptido codificado. Una variedad i de promotores adecuados para hospedantes procarióticos (por ejemplo, los promotores lac, tac, T3 , T7 para E. coli) y eucarióticos (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH1) , SV40, CMV) están disponibles. Aquellas personas .de experiencia en el campo serán capaces de seleccionar el promotor apropiado para la expresión de un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo de la invención.
En algunas modalidades, el vector que codifica 'un anticuerpo o una cadena de anticuerpo de la invención comprende un marcador seleccionable para la selección ¦ de células hospedantes que llevan el vector. En algunas modalidades, el marcador seleccionable es un gen que codifica un producto que confiere resistencia a antibióticos o fármacos que se puede utilizar en células procarióticas [por ejemplo, gen de ß-lactamasa (resistencia a ampicilina) , gen Tet (resistencia a tetraciclina) , etcétera) y células eucarióticas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina) , gpt (ácido micofenólico) , ampicilina o higromicina) . En algunas modalidades, el marcador seleccionable es dihidrofolato reductasa, que permite la selección con metotrexato en una variedad de hospedantes, en algunas modalidades, el marcador seleccionable es un gen que codifica un marcador auxotrófico del hospedante (por ejemplo, LEU2, URA3 , HIS3) , por ejemplo, para el uso en levadura. En algunas modalidades, el vector es un vector viral (por ejemplo, baculovirus) o de fagos. En una modalidad, el vector es capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedante (por ejemplo, un vector retroviral) . En algunas modalidades, el vector es un vector replicable y comprende un origen de replicación.
La invención se refiere de esta manera a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo humanizado, cadena ligera humanizada, cadena pesada humanizada, anticuerpo de ratón, cadena ligera de anticuerpo de ratón, cadena pesada de anticuerpo de ratón, anticuerpo quimérico, cadena ligera quimérica o cadena pesada quimérica de esta invención. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una porción de unión a antígenos de cualquiera de estos anticuerpos o sus cadenas. Las secuencias de polipéptidos que son codificadas por los ácidos nucleicos de esta invención se describen anteriormente y en los siguientes Ejemplos.
En algunas modalidades, un ácido nucleico o un vector de esta invención codifica una cadena pesada (o una porción de unión a antígenos de la misma) o una cadena ligera (o una porción de unión a antígenos de la misma) de la invención. Una célula hospedante que contiene tanto el ácido nucleico que codifica una cadena pesada como el ácido nucleico que codifica una cadena ligera, o ácidos nucleicos que codifican porciones de unión a antígenos de la cadena pesada y la cadena ligera, se puede utilizar para hacer un i anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera (o una porción de unión a antígenos del anticuerpo) . El ácido nucleico que codifica una cadena pesada y el ácido nucleico que codifica una cadena ligera se pueden colocar ¡en vectores de expresión separados. También se pueden colocar en un vector de expresión individual bajo el mismo o diferente control de expresión. Véase, por ejemplo, las Patentes de lps Estados Unidos Nos. 6,331,415 y 7,662,623. ; Otro aspecto de la invención se refiere a un método para hacer un anticuerpo anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo de la invención. El anticuerpo o la porción se pueden producir, por ejemplo, por medio de la expresión de uno o más ácidos nucleicos recombinantes que codifican el anticuerpo o una porción en una célula hospedante adecuada. La célula hospedante se puede producir utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, una o más construcciones de expresión descritas en este documento se pueden introducir en una célula hospedante adecuada y la célula resultante se puede mantener bajo condiciones que son adecuadas para la expresión de la(s) construcción (es ) ' o del(los) vector(es) ) . En algunas modalidades, la célula resultante se mantiene en cultivo, en un animal o en una planta. Las células hospedantes adecuadas pueden ser procarióticas , que incluye células bacterianas tales como ?. coli {por ejemplo, cepa DH5aM (Invitrogen, Carlsbad, CA)i) , B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; células eucarióticas , tales como células fúngicas o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp . , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) , u otras células eucarióticas inferiores y células de eucariotes superiores tales como aquellos de insectos (por ejemplo, células Drosophila Schneider S2, células de insecto Sf9 (documento WO 94/26087 (O'Connor) , células de insecto TN5B1-4 (HIGH 5) (Invitrogen) , mamíferos (por ejemplo, células COS, tales como COS-1 (No. de Acceso de ATCC CRL-1650) y COS-7 (No. de Acceso de- ATCC CRL-1651) , CHO (por ejemplo, No. de Acceso de ATCC CRL-9096) , CHO DG44 (Urlaub y Chasin. , Proc. Nati. Acac. Sel. EUA 77(71 :4216-4220 (1980)) , 293 (No. de Acceso de ATCC CRL-1573) , HeLa (No. de Acceso de ATCC CCL-2) , CV1 (No. de Acceso de ATCC CCL-70) , OP (Dailey y colaboradores, J. Virol . 54:739-749 (1985)) , 3T3 , 293T (Pear y colaboradores, Proc. Nati. Acad Sci. E.U.A. 90:8392-8396 (1993)) , células NSO, células SP2/0, células HuT 78 y similares)) o plantas (por ejemplo, tabaco, lemna (lenteja ¡de agua) y algas) . (Véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, i eds . Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John iley & Sons Inc. (1993)) . En algunas modalidades, la célula hospedante no es parte de un organismo multicelular (por ejemplo, una planta o un animal) . En ciertas modalidades, la célula hospedante es una célula hospedante aislada o es parte de un cultivo de células.
La presente invención también se refiere a células que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. En algunas modalidades, el vector es un vector de expresión. En algunas modalidades, uno o más ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígenos del mismo, las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de ratón o una porción de unión a antígenos del mismo o las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo quimérico o una porción de unión a antígenos del mismo, el anticuerpo o la porción tienen una especificidad de unión por el CCL20 de humano o una o más construcciones que comprenden este (estos) ácido (s) nucleico(s) , se pueden introducir en una célula hospedante adecuada por medio de un método apropiado para la célula hospedante seleccionada. En algunas modalidades, el método de introducción es, por ejemplo, la transformación, transfección, electroporación o infección. En algunas modalidades, el(los) ácido(s) nucleico(s) se vinculan ¡de manera operativa a uno o más elementos de control de expresión. En ciertas modalidades, el (los) ácido (s) nucleico (s) se encuentran en un vector, en una construcción creada mediante procesos en la célula o están integrados en el genoma de la célula hospedante. Las células hospedantes se pueden mantener bajo condiciones que son adecuadas para ,1a expresión. En algunas modalidades, estas condiciones ¡ comprenden la presencia de un inductor o de medios adecuados (complementados con, por ejemplo, sales, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricional'es apropiados, etcétera), por lo cual el(los) polipéptido (s) codificado (s) se producen. Estos procesos comprenden la expresión en una célula hospedante (por ejemplo, una célula i glandular de mamífero) de un animal o planta transgénico (por ejemplo, tabaco) (véase por ejemplo el documento WO 92/03918) . En algunas modalidades, los anticuerpos 1 o porciones se aislan de las células hospedantes, el medio de cultivo o la leche.
La invención también se refiere a proteínas de fusión en las cuales un anticuerpo o una porción de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o una porción) se vincula a otra porción (por ejemplo, una porción la cual no ocurre en anticuerpos como se encuentran en la naturaleza) en una ubicación N-terminal, una ubicación 1 C-terminal o dentro de la proteína de fusión. En algunas modalidades, la proteína de fusión se puede producir mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica una(s) secuencia (s) de anticuerpo en un vector de expresión adecuado, tal como un vector pET (por ejemplo, pET-15b, Novagen) , un vector de fagos (por ejemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia) u otro vector (por ejemplo, vector de fusión 'de Proteína A pRIT2T, Pharmacia) . La construcción resultante se puede introducir en una célula hospedante adecuada para la expresión. En algunas modalidades, las proteínas de fusión expresadas se aislan o se purifican de un lisado de células por medio de una matriz de afinidad adecuada (véase, por ejemplo, Current Protocole in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, Eds . , Volumen 2, Sup l . 26, páginas 16.4.1-16.7.8 (1991) ) ) .
La invención se refiere a una célula hospedante que comprende ácido (s) nucleico (s) recombinante (s) que codific (n) un anticuerpo o una porción o cadenas pesadas y/o ligeras del mismo, proporcionados en este documento (por ejemplo, un anticuerpo humanizado, una cadena ligera humanizada o una cadena pesada humanizada, un anticuerpo de ratón, una cadena ligera de ratón o una cadena pesada de ratón, un anticuerpo quimérico o una cadena pesada quimérica o una cadena ligera quimérica, de la invención) . La invención también se refiere a una célula hospedante que comprende ácido (s) nucleico (s) recombinante (s) que codifica una porción de unión a antígenos del anticuerpo o sus cadenas. En algunas modalidades, la célula hospedante comprende un vector recombinante de la invención como es referido en eéte documento. En algunas modalidades, el vector recombinante es un vector de expresión. En ciertas modalidades, el vector recombinante es un vector de expresión de células de mamífero .
La invención también se refiere a un método para preparar un anticuerpo o una porción, o una cadena pesada o ligera del mismo, de esta invención. En una modalidad, ,el método comprende mantener una célula hospedante de la invención como se describe en este documento bajo condiciones apropiadas para la expresión del anticuerpo o porción o una cadena pesada y/o ligera del mismo. En algunas modalidades, la célula hospedante contiene uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican el anticuerpo o una porción, o una cadena pesada y/o ligera del mismo, de la invención. En algunas modalidades, la célula hospedante se cultiva sobre un substrato o en suspensión. En algunas modalidades, el método comprende además el paso que consiste en purificar o aislar el anticuerpo o una cadena de anticuerpo.
La invención se refiere además a un método para preparar anticuerpos o porciones de unión a antígenos de los mismos a través de la expresión en fagos. En algunas modalidades, una colección de expresión en fagos i de anticuerpos Cándidos en un antígeno de CCL20 se inmunopurif ica . En algunas modalidades, se utiliza un método para preparar anticuerpos a través de la selección guiada (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. US 2006-0251658 Al) . En ciertas modalidades, se crea una colección hecha a propósito que se construye alrededor de, por ejemplo, una región CDR3 de cadena pesada fija (y/o cadena ligera) de un anticuerpo anti-CCL20 conocido. Las regiones CDR1 y CDR2 de las cadenas pesadas1 y ligeras se pueden derivar de un repertorio candido (Osburn y colaboradores, Methods 36:61-68 (2005)) . En una modalidad, los scFvs anti-CCL20 se generan a partir de colecciones de I anticuerpos Cándidos scFv las cuales se utilizan para obtener anticuerpos quiméricos de ratón-humano con las propiedades tde unión deseadas. Estas colecciones se pueden seleccionar para anticuerpos con las propiedades de unión deseadas. En algunas modalidades, se utilizan colecciones de fagos scFv. En ciertas modalidades, los scFv las cuales reconocen el CCL20 de humano se aislan de las colecciones de selección guiadas por scFv siguiendo una serie de ciclos de selección repetidos en CCL20 de humano recombinante esencialmente como se describe en Vaughan y colaboradores Nature Biotech. 14:309-314 (1996) . En resumen, después de la incubación con la colección, el antígeno inmovilizado, el cual se acopla previamente a perlas paramagnéticas , y un fago unido se pueden recuperar mediante la separación magnética mientras I que un fago no unido se quita con lavado. El fago unido luego se puede rescatar como se describe por Vaughan y colaboradores (1996; supra) y el proceso de selección 'se repite .
En una modalidad particular, se construye una i colección que consiste del dominio variable completo de lia i cadena pesada de un anticuerpo de ratón anti-CCL20 fusionado en un formato de cadena individual a un repertorio 'de regiones variables de cadena ligera de humano Cándidas. i Después de la selección, las regiones variables de cadena I ligera de humano que complementan las regiones variables de I. cadena pesada de ratón se identifican. Luego se construye una colección que consiste del repertorio de regiones variables de cadena ligera de humano seleccionadas como se describiera anteriormente fusionadas en un formato de cadena individual a una región variable de cadena pesada quimérica que consiste de las regiones CDR1 y CDR2 de humano Cándidas y una región CDR3 fija del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de ratón anti-CCL20. Después de la selección para sustancias aglutinantes de CCL20, se seleccionan los mejores clones de unión. Cinco de las seis regiones CDR pueden ser de origen humano mientras que la CDR3 de la región variable de cadena pesada puede ser idéntica a la CDR3 original del dominio variable de cadena pesada de ratón.
En algunas modalidades, las selecciones se realizan utilizando CCL20 acoplada a amina DYNABEADS M-270MR (Dynal) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En algunas modalidades, las selecciones utilizando CCL20 biotinilada se pueden preparar utilizando el reactivo específico de amina i primaria hexanoato de succinimidil-6- (biotinamido) siguiendo las instrucciones del fabricante (EZ-Link NHS LC Biotin, Pierce) .
En algunas modalidades, los resultados de selecciones se someten a prueba como preparaciones periplásmicas en selecciones de alto rendimiento basadas :en ensayos de competencia los cuales miden la capacidad de los i scFvs presentes en la preparación periplásmica para competir por la unión al CCL20.
Las muestras que son capaces de competir en selecciones de alto rendimiento se pueden sujetar a la secuenciación de ADN como se describe en Vaughan y colaboradores (1996; supra) y Osburn y colaboradores (2005; supra) . Los clones luego se pueden expresar y purificar como scFvs o IgGs y se pueden evaluar por su capacidad para unirse a CCL20, neutralizar CCL20 o una combinación de los mismos, por ejemplo, utilizando ensayos tal como el ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpós (ADCC, por sus siglas en inglés) y el ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Las preparaciones de scFv purificadas luego se pueden preparar como se describe en el Ejemplo 3 del documento 1 WO 01/66754. Las concentraciones de proteínas de las preparaciones de scFv purificadas se determinaron utilizando el método BCA (Pierce) . Se pueden utilizar planteamientos similares para seleccionar un socio óptimo (la cadena opuesta) de una cadena pesada o ligera de anticuerpo de longitud completa fija o un dominio variable de cadena pesada o ligera.
En otra modalidad, un anticuerpo anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, como se describe en este documento, se utiliza primero para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera que tienen una actividad de unión similar hacia el CCL20, utilizando los métodos de impresión de epítopos descritos en la Publicación del PCT No. WO 93/06213, incorporada en este documento a manera de referencia. En ciertas modalidades, las colecciones de anticuerpos utilizadas en este método son colecciones de scFv preparadas y seleccionadas como se describe en la Publicación del PCT No. WO 92/01047, McCafferty >y colaboradores, Nature 348:552-554 (1990) ; y Griffiths y colaboradores, EMBO J. 12:725-734 (1993) , todos incorporados en este documento a manera de referencia. En ciertás i modalidades, las colecciones de anticuerpos scFv ¡ se seleccionan utilizando el CCL20 de humano como el antígeno.
Una vez que se seleccionan los dominios VL y VH iniciales, los experimentos de "mezcla y apareamiento" se pueden realizar, en los cuales diferentes pares de segmentos de VL y VH seleccionados inicialmente se seleccionan para , la unión a CCL20 para seleccionar las combinaciones de pares ' de VL/VH preferidas. Adicionalmente , para mejorar además 'la calidad del anticuerpo, los segmentos de VL y VH del (los) par (es) de VL/VH preferidos se pueden mutar aleatoriamente ¡en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de la afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. En algunas modalidades, las mutaciones aleatorias ocurren dentro de la región CDR3 ,de VH y/o VL. En ciertas modalidades, esta maduración de la afinidad in vifcro se realiza, por ejemplo, mediante la amplificación de dominios de VH y VL utilizando cebadores de PCR complementarios para la CDR3 de VH o la CDR3 de VL, respectivamente, en donde los cebadores han sido "añadidos" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones de tal manera que los productos de PCR resultantes codifican segmentos de VH y VL en los cuales se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos de VH y VL mutados aleatoriamente pueden seleccionarse de nuevo para la unión al CCL20.
Después de la selección y el aislamiento de 1 un I anticuerpo anti-CCL20 de la invención de una colección ; de expresión de anticuerpos recombinantes , los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del paquete de expresión (por ejemplo, del genoma del fago) y se pueden subclonar en otros vectores de expresión por medio de técnicas estándar de ADN recombinante . En algunas modalidades, el ácido nucleico se manipula adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, cómo se describe en este documento. En ciertas modalidades, para expresar un anticuerpo humano recombinante que es aislado mediante la selección de una colección combinatoria, el ÁDN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospedantes .de mamífero, como se describe en este documento.
En una modalidad particular, la invención proporciona un método para producir un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano, que comprende administrar linfocitos de un ratón transgénico de CCL20 a un ratón no transgénico que tiene la misma cepa (por ejemplo, COI) que el ratón transgénico de CCL20 de humano, produciendo de ese modo un ratón no transgénico, inmunizado. Los esplenocitos del ratón no transgénico, inmunizado se ponen en contacto con células inmortalizadas, produciendo de ese modo células fusionadas . y las células fusionadas se mantienen bajo condiciones en í ias cuales se producen hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano, produciendo de ese modo un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad de unión por el CCL20 de humano.
La presente invención también proporciona métodos para preparar formas mutadas de los anticuerpos anti-CCL20 y porciones de unión a antígenos de los mismos de la invención. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones son mutados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras. En ciertas modalidades, la mutación altera una o más propiedades de unión del anticuerpo o porción. En modalidades particulares, una mutación se hace en una o más de las regiones CDR para incrementar o disminuir el valor KD del anticuerpo anti-CCL20 o una porción, para incrementar 1 o disminuir el valor Koff o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo o una porción. Las técnicas en la mutagénesis dirigida a un sitio son bien conocidas en el campo. Véase por ejemplo Sambrook y colaboradores y Ausubel y colaboradores, supra. En otra modalidad, una o más mutaciones se hacen en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado en comparación con la línea germinal en un anticuerpo monoclonal de la invención. En ciertas modalidades, las mutaciones se hacen en una región CDR o una región de estructura de un dominio variable o en un dominio constante. En una modalidad particular, las mutaciones se hacen en un dominio variable. En algunas modalidades, una o más mutaciones se hacen en un residuo de aminoácido que 1 se sabe que está cambiado en comparación con la línea germinal en una región CDR o una región de estructura de un dominio variable de un anticuerpo o una porción de la invención.
En otra modalidad, la región de estructura es mutada de modo que la(s) región (es) de estructura resultante (s) tiene (n) la secuencia de aminoácidos del gen | de línea germinal correspondiente. En ciertas modalidades, una o más mutaciones se hacen en una región de estructura o 'un dominio constante para incrementar la vida media del anticuerpo anti-CCL20 o una porción. Véase por ejemplo la Publicación del PCT WO 00/09560. En ciertas modalidades, una mutación en una región de estructura o un dominio constante se hace para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo o para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula. De acuerdo con la invención, un anticuerpo individual o una porción pueden tener mutaciones en una o más de cualquiera de las CDRs o regiones de estructura del dominio variable o en el dominio constante.
Los anticuerpos anti-CCL20 o porciones de unión a antígenos de los mismos de la invención también se pueden producir de manera transgénica a través de la generación de un mamífero o una planta que es transgénica para las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo de interés o la producción del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CCL20 o porciones se producen en, y se recuperan de, la leche de cabras, vacas u otros animales. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741,957. En algurtas modalidades, los animales transgénicos no humanos que comprenden sitios de anticuerpos humanos son inmunizados con CCL20 de humano o una porción inmunógena de la misma, como se describiera anteriormente. Los métodos para hacer anticuerpos en plantas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,046,037 y 5,959,177.
En algunas modalidades, los animales no humanos, o plantas transgénicos se producen al introducir una o mas moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-CCL20 o una porción de la invención en el animal o planta por medio de técnicas transgénicas estándar. Véase Hogan y la Patente de los Estados Unidos No. 6,417,429, supra. En ciertas modalidades, las células transgénicas utilizadas para hacer el animal transgénico pueden ser células madre embriónicas o células somáticas o un huevo fertilizado. En algunas modalidades, los animales no humanos o plantas transgénicos son quiméricos, heterocigotos no quiméricos ,u homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo, Hogan y colaboradores, Manipulating the Mouse Embryo: A Laborat'ory Manual 2a ed. , Cold Spring Harbor Press (1999); Jacksori y colaboradores, Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000) ; y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) . En algunas modalidades, los animales no humanos o plantas transgénicos tienen una alteración fijada cómo objetivo y un reemplazo por una construcción de fijación como objetivo que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. En ciertas modalidades, los animales o plantas transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras que se unen específicamente al CCL20 de humano. Los anticuerpos ant'i-CCL20 o porciones se pueden hacer en cualquier animal no humano o planta transgénicos. En modalidades particulares, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano puede expresar los polipéptidos codificados en la sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, mocos y otros fluidos corporales.
Los anticuerpos y porciones de unión a antígenos de los mismos de la invención son útiles en la neutralización de la quimioatracción inducida por CCL20 de, por ejemplo, células CCR6+ tales como las células dendríticas inmaduras i (DC, por sus siglas en inglés) , células T efectoras/con memoria y células B. Los anticuerpos y porciones pueden ser útiles de esta manera en el tratamiento de una variedad de enfermedades y condiciones tales como la inflamación, enfermedades autoinmunes y cáncer. Los ejemplos de enfermedades y condiciones que pueden ser tratadas con los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de esta invención incluyen, sin limitación, la enfermedad de Grave, i vitíligo, hipertiroidismo, artritis reumatoide, psoriasis, I dermatitis atópica, dermatitis de contacto, enfermedad ¡de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, malignidades de células B, adenocarcinoma de mama, hepatitis crónica, dermatitis de contacto, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, infección por virus de papiloma humano de la cerviz, micosis fungoide, adenocarcinoma pancreático, enfermedad periodontal, carcinoma papilar de tiroides, pustuíosis palmo-plantar, condiciones asociadas con exantema maculopapular, epidermólisis bulosa, alopecia areata, esclerosis múltiple, polimiositis , dermatomiositis , enfermedad de Behcet, pustuíosis exantematosa generalizada aguda, vasculitis, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, asma bronquial, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo de aloinjerto hepático, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, glomerulonefritis , infección por virus ? respiratorio sincitial, mieloma múltiple e histiocitosis ¡ de células de Langerhans. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar cualquier condición asociada con CCR6.
Por consiguiente, la invención proporciona métodos para tratar la inflamación, una enfermedad autoinmune o cáncer mediante la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo o una porción de la invención a un sujeto necesitado de los mismos. En algunas modalidades, el sujeto es un paciente humano que tiene o que está en riesgo de tener una enfermedad autoinmune, un cáncer y/o inflamación. En algunas modalidades, el anticuerpo o una porción se administra profilácticamente para prevenir el comienzo o recaída de la inflamación, enfermedad autoinmune o cáncer. , Los anticuerpos y las porciones de unión a antígenos de los mismos de esta invención se pueden administrar a un individuo (por ejemplo, un humano) solos o en conjunción con otro agente en una terapia de combinación. Los anticuerpos o porciones se pueden administrar antes, como una mezcla con, por separado pero concurrentemente con o subsecuentes a la administración del agente adicional . En algunas modalidades, el agente adicional se selecciona del grupo que incluye, pero no está limitado a: inhibidores de citocinas inmuno-estimuladoras (por ejemplo, MAbs anti-TNF-a) , eliminadores de células inmunes (por ejemplo, MAbs anti- CD20), bloqueadores de moléculas suplementarias (por ejemplo, Abatacept) , agentes modificadores de enfermedades para enfermedades reumáticas (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAIDs, por sus siglas en inglés) , metotrexato, ácidos retinóicos y análogos de vitamina D3) e inmunosupresores (por ejemplo inhibidores de calcineurina) . En algunas modalidades, el agente adicional , se selecciona del grupo que incluye, pero no está limitado (a: agentes esteroidales, agentes mmunomoduladores , agentes somatostáticos , agentes inmunoterapéuticos convencionales, citocinas o antagonistas de citocinas y/o factores de crecimiento o antagonistas de factores de crecimiento. En algunas modalidades, la terapia con anticuerpos anti-CCL20 jse puede utilizar en combinación con un tratamiento de cáncer 'de estándar de atención médica tal como una quimioterapia, cirugía o radiación, o con otra terapia fijada como objetivo tal como la terapia con anticuerpos anti-VEGF. En algunas modalidades, la terapia con anticuerpos anti-CCL20 se puede utilizar en conjunción con un régimen profiláctico. En una modalidad, un mimético peptídico sintético se puede administrar en conjunción con un anticuerpo de la presente invención. En otra modalidad, la terapia hormonal se puede administrar en conjunción con un anticuerpo o una porción de la presente invención.
En una modalidad, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran solos o en combinación con un agente anti - inflamatorio . Los agentes anti -inflamatorios que se pueden administrar con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, corticosteroides (por ejemplo betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona) , fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, balsalazida, i celecoxib, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, i floctafenina, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, quetoprofeno, meclofenamato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, salsalato, sulindaco, tenoxicam, ácido tiaprofénico y tolmetina) , así como también acetaminofeno, antihistaminas , derivados de ácido aminoarilcarboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílieos , derivados de ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido í salicílico (por ejemplo sulfasalazona y mesalamina) , tiazincarboxamidas , ácido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3 -amino-4 -hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, bencidamina, bucoloma, difenpiramida , ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, ' oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoximá, proquazona, proxazol y tenidap.
Los agentes inmunosupresores , no específicos, convencionales que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, esteroides, ciclosporina , análogos de ciclosporina, metilprednisona de ciclofosfamida , prednisofta, azatioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina, natalizumab y otros agentes inmunosupresores que actúan al suprimir la función de las células T respondedoras. , En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con inmunosupresores. Las preparaciones inmunosupresoras que se pueden administrar con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, 0RTH0CL0NEMR (OKT3) , SANDIMMU EMR/NE0RALMR/SANGDYAMR (ciclosporina) , PROGRAFMR (tacrolimus) , CELLCEPTMR (micofenolato) , Azatioprina, glucorticosteroides , AVONE MR i (interferón-beta 1A) y RAPAMUNEMR (sirolimus) . En üna modalidad, los inmunosupresores se pueden utilizar para impedir el rechazo de órganos o trasplante de médula ósea. , En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con un agente quimioterapéutico . Los agentes quimioterapéuticos que se pueden administrar con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, derivados de antibióticos (por ejemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorrubicina y dactinomicina) antiestróge os (por ejemplo, tamoxifeno) ; antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo , 5-FU, floxuridina, interferón alfa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina) ; agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinosida de citosina, ciclofosfamida, estramustina , hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfano, cisplatina y sulfato de vincristina) ; hormonas I (por ejemplo, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina-sodio, etinil estradiol, estradiol, epinefrina, acetato de megestrol, metiltestosterona , difosfato de dietilestilbestrol , clorotrianiseno y testolactona) ; i derivados de mostanza nitrogenada (por ejemplo, mefaleno, corambucilo, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa) ; esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sódico ¡de betametasona) ; y otros (por ejemplo, dic rbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina, rituximab y etopósido) .
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con un antagonista de TNF. Los antagonistas de TNF que se pueden administrar con los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención incluyen, pero no están limitados a, infliximab (REMICADEM ) , adalimumab (HUMIRAMRi) , certolizumab pegol (CIMZIAMR) , golimumab (SIMP0NIMR!) , etanercept (ENBRELMR) , derivados de xantina (por ejemplo pentoxifilina) y bupropión (WELLBURTINMR, ZYBANMR) .
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran solos o en combinación con una o más preparaciones de globulina inmunes, intravenosas. Las preparaciones de globulina inmunes, intravenosas que se pueden administrar con los anticuerpos o porciones de la invención incluyen, pero ¡no están limitadas a, GA MARMR, IVEEGAMMR, SANDOGLOBULI MR, GAMMAGARD S/DMR y GAMIMUNEMR . En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con preparaciones de globulina inmunes, intravenosas en la terapia de trasplante (por ejemplo, el trasplante de médula ósea) . 1 En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con citocinas o antagonistas de citocinas. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se pueden administrar con cualquier citocina o antagonista de citocina que incluye, pero no está limitado a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-? y TNF-ct o cualquier antagonista de los mismos. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se pueden administrar con cualquier interleucina o antagonista de interleucina que incluye, pero no está limitada a, IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 e IL-21 o cualquier antagonista de las mismas.
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con una o más quimiocinas o antagonistas < de quimiocinas. En modalidades específicas, los anticuerposi o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con una quimiocina a(CxC) seleccionada del grupo que consiste de proteína-10 inducible con gamraa-interferón (???-10) , interleucina-8 (IL-8) , factor 'de plaquetas-4 (PF4), proteína activadora de neutrófilos (NAP-2) , GRO-a, GRO-ß, GRO-?, péptido activador de neutrófilos (ENA-78) , proteína quimioatrayente de granulocitos-2 (GCP-2) y el factor derivado de células estromales-1 (SDF-1 o factor estimulador de células pre-B (PBSF) ) y/o una quimiocina1 ß (CC) seleccionada del grupo que consiste de: RANTES (reguladas al activarse, expresadas y secretadas por células T normales) , proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa (MIP-lcc) , proteína inflamatoria de macrófagos-1 beta (???-1ß) , proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1) , proteina quimiotáctica de monocitos-2 (MCP-2) , proteína quimiotáctica de monocitos-3 (MCP-3), proteína quimiotáctica de monocitos-4 (MCP-4) , proteína inflamatoria de macrófagos-1 gamma (???-??, proteína inflamatoria de macrófagos-3 alfa (MlP-3oc) , proteína inflamatoria de macrófagos-3 beta (?1?-3ß) , proteína inflamatoria de macrófagos-4 (MIP-4/DC-CK- l/PARC) , eotaxina, Éxodo e 1-309; y la quimiocina y(C) , linfotactina; o cualquier antagonista de los mismos.
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran con la quimiocina beta-8, quimiocina beta-1 y/o proteína inflamatoria de macrófagos-4, o cualquier antagonista de las mismas. En una modalidad preferida, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran con quimiocina beta-8 o un antagonista de la misma.
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con un antagonista de IL-4. Los antagonistas de IL-4 que se pueden administrar con el anticuerpo > o composiciones de anticuerpo de la invención incluyen, pero 'no están limitados a: polipéptidos de receptores de IL-4 solubles, formas multiméricas de polipéptidos de receptores de IL-4 solubles, anticuerpos anti-receptores de IL-4 que se unen al receptor de IL-4 sin transducir la señal biológioa producida por IL-4, anticuerpos anti-IL-4 que bloquean la unión de IL-4 a uno o más receptores de IL-4 y muteínas <ie IL-4 que se unen a los receptores de IL-4 pero que no transducen la señal biológica producida por IL-4.
Preferiblemente, los anticuerpos anti-IL4 que se emplean de acuerdo con este método son anticuerpos monoclonales ; las porciones de unión a antígenos de los mismos también se pueden emplear.
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con miembros de la familia de TNF, o antagonistas de los mismos. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de la invención se administran en combinación con agentes que incluyen, pero no están limitados a, formas solubles de TNF-a, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocida como TNF-beta) , LT-beta (encontrada en el complejo heterotrímero LT-alfa2-beta) , OPGL, FasL, CD27L, i CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3 , OX40L, TNF-gamma (Publicación Internacional No. WO 96/14328) , AIM-1 (Publicación Internacional No. WO 97/33899) , endocina-alfa (Publicación Internacional No. WO 98/07880) , OPG, neutrocina-aífa (Publicación Internacional No. WO 98/18921) , OX40, factor de crecimiento de nervios (NGF, por sus siglas en inglés) , formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD404-IBB, TR2 (Publicación Internacional No. WO 96/34095), DR3 (Publicación Internacional NO. WO 97/33904) , DR4 (Publicación Internacional No. WO 98/32856) , TR5 (Publicación Inte nacional No . WO 98/30693) , TR6 (Publicación Internacional No. O 98/30694) , TR7 (Publicación Internacional No. WO 98/41629) , TRANK, TR9 (Publicación Internacional No. WO 98/56892), TRIO (Publicación Internacional No. WO 98/54202) , 312C2 (Publicación Internacional No. WO 98/06842), TR12 y formas solubles CD154, CD70 y CD153; o cualquier antagonista de los mismos.
Como se utiliza en este documento, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad del agente terapéutico administrado que aliviará o prevendrá en algún grado uno o más de los síntomas del trastorno que es tratado. Una cantidad efectiva de anticuerpo anti-CCL20 o una porción de unión a antígenos del mismo para tratar una enfermedad es una cantidad que ayuda al sujeto tratado a alcanzar uno o más criterios de valoración clínicos, deseados.
En algunas modalidades, para minimizar ¡la inmunogenicidad, un anticuerpo humanizado o una porción se utiliza para tratar a un paciente humano en métodos terapéuticos y composiciones de esta invención. En casos donde no es necesaria la administración repetida, en algunas modalidades, también puede ser apropiado administrar Un anticuerpo de ratón o quimérico o una porción de la invención a un paciente humano.
En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de los mismos de la invención se pueden utilizar para tratar a un individuo quien ha sido tratado previamente con, por ejemplo, inhibidores de citocinas inmunoestimuladoras (por ejemplo, MAbs anti-TNF-a) , eliminadores de células inmunes (por ejemplo, MAbs anti-CD20) y/o bloqueadores de moléculas suplementarias (por ejemplo, Abatacept) . En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones se utilizan para tratar a un paciente quien ha desarrollado una falta de sensibilidad primaria o un descenso gradual en la tasa de respuesta a esos otros tratamientos.
Un anticuerpo o una porción de unión a antígerios del mismo de esta invención se puede administrar en úna dosis unitaria individual o múltiples dosis en cualquier punto de tiempo que un profesional sanitario considera que es apropiado. La dosificación puede ser determinada por i medio de métodos conocidos en el campo y puede ser dependiente, por ejemplo, de la edad, sensibilidad, tolerancia y bienestar global del individuo. Cualquier método de administración aceptado en el campo se puede emplear adecuadamente para los anticuerpos o porciones de la invención, que incluye, pero no está limitado necesariamente a, la administración parenteral (por ejemplo, la inyección intravenosa, intraarterial , intramuscular, intratecal, intraperitoneal , subcutánea), oral (por ejemplo, dietética), local, tópica, mediante inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial , intranasal u oral, gotas intranasales ) o rectal, dependiendo de la enfermedad o condición que es tratada. En una modalidad, el anticuerpo o una porción se administran por la ruta parenteral.
La formulación variará de acuerdo con la ruta de administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsión) . Una composición apropiada que comprende el anticuerpo o una porción que se administra se puede preparar en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. La composición puede comprender múltiples dosis o puede ser una composición de dosis unitaria individual. Para soluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen la solución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales pueden incluir una solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro ,de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir varios aditivos, conservadores o reabastecedores de fluidos, nutrientes o electrolitos (Véase, generalmente, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, Mack Publishing Co . , PA, 19S5) . Para la inhalación, el compuesto puede ser solubilizado y cargado en un dispensador adecuado para la administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado) .
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada, óptima. En ciertas modalidades, se puede administrar un bolo individual, varias dosis divididas se pueden administrar a través del tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para la facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se utiliza en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosificaciones unitarias para pacientes/sujetos que son tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La descripción para las formas unitarias de dosificación de la invención es dictada generalmente por y dependiente directamente de (a) las características únicas del agente terapéutico y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se logra y (b) las limitaciones inherentes en el campo de la combinación tal como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
De esta manera, el artífice experto apreciaría, con base en la descripción proporcionada en este documento, que la dosis y el régimen de dosificación se ajusta de acuerdo con métodos bien conocidos en el campo terapéutico. Es decir, la dosis máxima tolerable se puede establecer fácilmente y la cantidad efectiva que proporciona un beneficio terapéutico detectable a un paciente también se puede determinar, como se pueden determinar los requerimientos temporales para administrar cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente. Por consiguiente, mientras que ciertos regímenes de dosis y administración se ejemplifican en este documento, estos ejemplos no limitan de alguna manera el régimen de dosis y administración que puede ser proporcionado a un paciente en la práctica de la presente invención.
Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la condición que es aliviada y pueden incluir dosis individuales o múltiples. Se debe entender además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar: a través del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional' de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los rangos de dosificación expuestos en este documento son ejemplares únicamente y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reclamada. Además, el régimen de dosificación con las composiciones de esta invención se puede basar en una variedad de factores, que incluyen el tipo: de enfermedad, la edad, peso, sexo, condición médica del paciente, la gravedad de la condición, la ruta de administración y el anticuerpo particular que se emplea. De esta manera, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar rutinariamente utilizando métodos estándar. Por ejemplo, las dosis se pueden ajustar con base en parámetros farmacocinéticos ¦ o farmacodinámicos , los cuales pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. La presente invención comprende de esta manera un escalamiento de dosis intra-paciente como es determinado por el artífice experto. Los métodos para determinar las dosificaciones' y regímenes apropiados son bien conocidos en el campo relevante y se entendería que son comprendidos por el artífice experto una vez proporcionados con las enseñanzas dadas a conocer 'en este documento.
En algunas modalidades, para la administración! a sujetos humanos, la dosis mensual total de los anticuerpos' o porción de anticuerpo de la invención está en el rango de 0.5-1200 mg por paciente, dependiendo, naturalmente, del modo de administración. En ciertas modalidades, una dosis intravenosa mensual requiere aproximadamente 1-1000 mg/paciente. La dosis mensual total se puede administrar én dosis individuales o divididas y, a discreción del médico, puede encontrarse fuera del rango típico que se proporciona en este documento. ' En ciertas modalidades, un rango para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 1-1000 mg/kg/paciente/mes . En una modalidad, el anticuerpo o una porción del mismo de la invención se puede administrar a aproximadamente 1-200 o 1-150 mg/paciente/mes . En ciertas modalidades, el anticuerpo o una porción se administra en una toma de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg/paciente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces al mes. En una modalidad particular, el anticuerpo o una porción se administra en úna toma de 1 a 5 mg/kg/paciente 1 o 2 veces al mes.
Los anticuerpos y porciones de unión a antígenos de los mismos de la presente invención también son útiles en una variedad de procesos con aplicaciones en la investigación y ] la diagnosis. En algunas modalidades, los anticuerpos y porciones ' se utilizan para detectar, aislar y/o purificar el CCL20 de humano o variantes de la misma (por ejemplo mediante la purificación por afinidad u otros métodos adecuados tal como la citometría de flujo, por ejemplo, para células, tales como linfocitos, en suspensión) y para estudiar la estructura (por ejemplo, conformación) y la función del CCL20 de humano. Para las aplicaciones in vifcro, en donde la inmunogenicidad del anticuerpo no es un problema, los anticuerpos de ratón y quiméricos y las porciones de unión a antígenos de los mismos de esta invención serán útiles además de los anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos o porciones de unión a antígenos de los mismos de la presente invención se pueden utilizar¦ en aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, in vitro, ex vivo) . En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados o porciones de la presente invención se utilizan para detectar y/o medir' el nivel de CCL20 de humano en una muestra. En ciertas modalidades, la muestra comprende, por ejemplo, células . o tejidos que expresan el CCL20 de humano y/o fluidos corporales tales como un exudado inflamatorio, sangre, suero, y/o fluido intestinal que lleva el CCL20 de humano. Una muestra se puede obtener de un individuo y un anticuerpo o una porción descritos en este documento se puede utilizar en un método inmunológico adecuado para detectar y/o medir la expresión de CCL20 de humano, que incluye métodos tales como la citometría de flujo (por ejemplo, para células en suspensión tales como linfocitos) , ensayos inmunoabsorbentes vinculados con enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) , que incluyen ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistología .
En una modalidad, un método para detectar el CCL20 de humano en una muestra comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o una porción de la presente invención bajo condiciones que son adecuadas para la unión específica del anticuerpo o una porción al CCL20 de humano y detectar los complejos de anticuerpo-CCL20 los cuales se forman. En una modalidad, los anticuerpos o porciones descritos en este documento se puede utilizar para analizar tejidos normales contra tejidos inflamados (por ejemplo, de un humano) para la reactividad y/o expresión del CCL20 ¡ de humano (por ejemplo, de manera inmunohistológica) para detectar asociaciones entre la expresión incrementada de CCL20 de humano (por ejemplo, en tejidos afectados) y uno o más trastornos seleccionados de, pero no limitados a, enfermedad de Grave, vitíligo, hipertiroidismo, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, malignidades de células B, adenocarcinoma ¡de mama, hepatitis crónica, dermatitis de contacto, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, infección por virus de papiloma humano de la cerviz, micosis fungoide, adenocarcinoma pancreático, enfermedad periodontal, carcinoma papilar de tiroides, pustulosis palmo-plantar, condiciones asociadas con exantema maculopapula , epidermólisis hulosa, alopecia areata, esclerosis múltiple, polimiositis , dermatomiositis , enfermedad de Behcet, pustulosis exantematosa generalizada aguda, vasculitis, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, asma bronquial, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo de aloinjerto hepático, enfermedad 14 pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, glomerulonefritis , infección por virus respiratorio sincitial, mieloma múltiple, histiocitosis de células , de Langerhans, u otras condiciones. De esta manera, los anticuerpos de la presente invención permiten métodos inmunológicos de evaluación de la presencia de CCL20 de humano en tejidos normales e inflamados, a través de los cuales se puede evaluar la presencia de una enfermedad, , el progreso de una enfermedad y/o la eficacia de la terapia anti-CCL20 de humano en el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, la enfermedad inflamatoria y/o inmune.
Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales que son bien conocidos en el campo y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y planteadas por toda la presente descripción a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000) ; Ausubel y colaboradores, Short Protocole in Molecular Biology. A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lañe Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998) ; y Coligan y colaboradores, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan1 de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como ' se realiza comúnmente en el campo o como se describe en este documento. La nomenclatura utilizada en relación con, y los i procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento es aquella bien conocida y utilizada comúnmente en el campo. i A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que aquel entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en ,el campo al cual pertenece esta invención. Los métodos \ y materiales ejemplares se describen a continuación, aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquelljos descritos en este documento también se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en este documento se incorporan a manera de referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones, dominará. Aunque se cita una variedad de documentos en la presente, esta citación no constituye una admisión de que alguno de esos documentos forma parte del conocimiento general común en el campo. Pór toda esta descripción y reivindicaciones, se entenderá que< la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un número entero establecido o un grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes.
Con el propósito de que esta invención pueda ser entendida mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para fines de ilustración únicamente y ,de ninguna manera de deben interpretar como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1: Implicación del CCL20 en trastornos autoinmunes/inflamatorios Para obtener evidencia de la implicación del CCL20 en condiciones autoinmunes e inflamatorias, se estudiaron los efectos de la desactivación genética del receptor de CCL¡20 CCR6 en un modelo de artritis reumatoide (RA) en ratones de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) . Los ratones de tipo silvestre CCR6 , los ratones CCR6+/ (heterocigóticos ) y los ratones genéticamente deficientes CCRe^' (homocigóticos) (cada n=10) se inmunizaron en la base de la cola con colágeno tipo II de bovino (150 µg/ratón) emulsionado en adyuvante completo de Freund (Chondrex, #7001). Tres semanas después, una inyección de refuerzo de la misma cantidad de emulsión de i colágeno tipo II de bovino en adyuvante incompleto se administró en la base de la cola. Se graduó la gravedad, de los síntomas artríticos en las patas de cada ratón como ¡ se describe en Griswold y colaboradores, Arthritis & Rheumatism 31(11) : 1406-1412 (1988). En resumen, se graduó las lesiones articulares de las extremidades distales al codo o la rodilla en una escala de 0 a 4 con base en el número 1 de i articulaciones involucradas y el grado de eritema e .linchamiento. Las clasificaciones de artritis se calcularon como la suma de las clasificaciones de todas las cuatro patas de cada animal. Los animales tipo silvestre CGR6 I desarrollaron artritis, mientras que los animales CCR6"^~ I mostraron una fuerte resistencia a la enfermedad (FIGURA 1) . Interesantemente, los animales CCR6+/" también exhibieron algunos niveles de resistencia, lo que indica que la anulación total de la función de CCL20 no se requiere para contrarrestar el fenotipo artrítico.
Además, las patas posteriores de los ratones se analizaron de manera inmunohistoquímica por la presencia de células T positivas en CD3 o macrófagos positivos en F4/8O. En el día 43, los ratones se recolectaron y sus patas posteriores se fijaron en formalina. Las patas luego se seccionaron y se colocaron en portaobjetos. Después de la descalcificación de las muestras de patas, los portaobjetos se tiñeron de manera inmunohistoquímica con anticuerpos anti- CD3 (#N1580, DAKO) y F4/80 (Clon CI:A3-1, AbD Serotec) . La intensidad de la tinción fue registrada por dos observadores independientes mediante la exploración de las muestras con un instrumento Aperio (Aperio Technologies) . La escala 1 de clasificación fue de la siguiente manera: 0, normal; ' 1, tinción ligera por toda la pata o tinción intensa en un dígito; 2, tinción moderada en múltiples dígitos; 3, tinción intensa en múltiples dígitos o moderada por toda la pata; 4, tinción intensa por todos los dígitos y la pata. El número de células T (FIGURA 2) y macrófagos (FIGURA 3) que infiltraron las lesiones inducidas por CIA se redujo fuertemente en los ratones tanto CCR6+/" como CCR6"7".
También se estudiaron los efectos de la desactivación genética de CCR6 en un modelo en ratones de dermatitis de contacto alérgica inducida por dinitrofluorobenceno (DNFB) . Dos grupos de seis ratones cada uno (un grupo de ratones de tipo silvestre para CCR6 y un grupo deficiente de CCR6) se sensibilizaron mediante el cepillado de 25 µ? de solución de DNFB al 0.4% (en acetona : aceite de olivo 4:1) en el abdomen afeitado durante dos días sucesivos (días 0 y 1) . En el día 5, los ratones se desafiaron de nuevo mediante la aplicación de 20 µ? de DNFB al 0.1% (en acetona : aceite de olivo 4:1) a un lado de cada oreja. Como un indicador de edema, el espesor de las orejas se midió antes del desafío con DNFB y 24 horas después dél último desafío en el Día 5 mediante el uso de un calibrador de espesores. Los ratones deficientes de CCR6 casi no demostraron un espesor incrementado de las orejas después del tratamiento con DNFB, lo que indica resistencia contra la hipersensibilidad de contacto inducida por DNFB (FIGURA 4) .
Estos datos soportan un papel para CCR6 y CCL20, en trastornos autoinmunes/ inflamatorios .
Ejemplo 2: Inhibición de q imio axis inducida por CCL20 mediante un MAb de hámster anti-CCL20 de ratón 2F5-5 Para explorar adicionalmente el papel del CCL20 como un objetivo terapéutico potencial, se realizaron experimentos utilizando un anticuerpo de hámster anti-CCL20 de ratón (2F5-5) . Se caracterizó primero la capacidad del MAb 2F5-5 para unirse al CCL20 de ratón, humano o mono rhesüs . Los antígenos de fosfatasa alcalina (SEAP) secretada por CCL20 solubles de cada especie se prepararon de la siguiente manera. Los ADNc que codificaban las CCL20s de humano, mono cynomolgus, mono rhesus, rata y ratón se amplificaron y se subclonaron en un vector pcDNA3.1 (+) dSalI SEAP, el cual contiene ADNc de SEAP y tiene su sitio Salí suprimido (pcDÍNA 3.1 ( + ) adquirido de Invitrogen; ADNc de SEAP derivado de un vector Intensificador de pSEAP, Clontech) . Los vectores de expresión se transíectaron en la línea de células de riñon embrionario de humano HEK293EBNA (HEK293E, Invitrogen) . Las células HEK293E se inocularon con DMEM (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10% en el día antes de la transíección . En el día de la transfección, el medio de cultivo se reemplazó por medio libre de suero OPTI-MEM1 II (Invitrogen) . Los vectores de expresión se transfectaron utilizando TransIT LT1 (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japón) < de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días1 de incubación en C02 al 5% y a 37°C, los sobrenadantes ' de cultivo se recolectaron. La concentración de CCL20-SEAP ; en cada cultivo se midió mediante el uso del Kit de Quimioluminiscencia Great EscAPe SEAP 2.0 (Clontech) .
Luego se realizaron estudios de unión de resonancia de plasmón superficial (BiacoreMR) para medir la unión del 1 Ab 2F5-5 a antígenos de CCL20-SEAP de ratón, humano, mono rhesus y mono cynomolgus . El anticuerpo anti-SEAP (anti - fosfatasa alcalina placentaria de ratón monoclonal, Thermo Scientific, # de Cat. MAI-19354, # de Lote KL12748M) se inmovilizó en 'un chip sensor CM5 (GE Healthcare) utilizando un procedimiento de acoplamiento de amina NHS/EDC estándar. El CCL20 de ratón etiquetado con SEAP (100 nM en sobrenadante, ID735, # de Lote 091130) se diluyó a 5 nM con TBS-P que contenía Tween-20 al 0.005% y se capturó en el chip sensor C 5. Las diluciones de 0.2 nM a 80 nM del anticuerpo de hámster anti-CCL20 de ratón (2F5-5, # de Lote 060215, 2 mg/ml) en TBS-P se inyectaron sobre el chip sensor a un caudal de 30 µ?/minuto. La asociación y disociación del anticuerpo de hámster anti-CCL20 de ratón con CCL20 de ratón se supervisaron durante 4 minutos y 16 minutos, respectivamente. La superficie del chip se regeneró entre las inyecciones utilizando glicina 10 mM, pH 2.25. Los sensogramas fueron doblemente referenciados 1 al substraer inyecciones de anticuerpo de hámster anti -CCL20 ' de ratón en una célula de referencia sin CCL20 de ratón capturada y una inyección de TBS-P sobre CCL20 de ratón capturada. Los sensogramas se analizaron utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 en un software de evaluación BIA (GE Healthcare, versión 3.2). En este ensayo, el MAb 2F5-5 se une al CCL20 de ratón con una afinidad de 32 pM, pero no se úne al CCL20 de humano, mono rhesus o mono cynomolgus (Tabla 1)(.
Tabla 1: Afinidad de unión de MAb 2F5-5 a ortólogos de CCL20 Para someter a prueba el efecto del MAb 2F5-5 sobre la función de CCL20, se evaluó su actividad neutralizante contra el CCL20 de ratón utilizando un ensayo de quimiotaxis in vitro. Las células B300.Í9 transducidas con CCR6 y el CCL20 de ratón recombinante (1 nM) se agregaron a placas de cultivo 'TranswellM?. Cuatro horas después, las células que emigraron dentro de la cámara inferior se contaron mediante , la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) . El MAb 2F5-5 inhibió completamente la quimiotaxis a 1 µg/ml con un valor IC50 estimado de 0.04 µ9/p\1 (0.27 nM) (FIGURA 5) . En contraste, un anticuerpo de hámster de control (10 µ9/p\1) no inhibió la quimiotaxis (100% de control; los datos no se muestran) .
Ejemplo 3: Humanización de MAbs de ratón anti-CCL20 Para obtener anticuerpos monoclonales contra el CCL20 de humano, se generó un panel de anticuerpos de ratón anti-CCL20 de humano. El CCL20 de humano recombinante (R&D , #360 - P- 025 /CF , 17.5 g/cabeza) emulsionado con adyuvante completo de Freünd (Mitsubishi-Kagaku Yatron, RM606-1) se inyectó por ,1a ruta subcutánea en las almohadillas de las patas de los ratones . Luego se administraron dos inyecciones consecutivas cada tres días. Tres días después de la inmunización final, los animales se sacrificaron y las células de nodulo linfático inguinal se fusionaron con células de mieloma P3U1 en una relación de 2:1 a 10:1 en presencia de poliet ilenglicol al 50%. Las células luego se cultivaron en placas de plástico de 96 pocilios .
Un ensayo ELISA de tipo emparedado se utilizó para la selección primaria. Una placa de 96 pocilios se revistió con un anticuerpo policlonal anti-IgG , de humano (Jackson, #709-005-149, 2 µ9/?1 en PBS (-) ) . Después de la incubación durante toda la noche a 4°C, los pocilios se bloquearon con 1 x Block-AceMR (Dainippon Sumitomo Pharma, UK-B80) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocilios luego se lavaron con Tween 20 al 0.02%/PBS (-) , después de lo cual una proteína quimera de CCL20 de humano-hlgG Fe 1 nM en Tween 20 al 0.02%/PBS (-) se agregó a los pocilios (50 µ?/pocillo) . Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, se realizaron tres lavados adicionales como se describiera anteriormente. Los sobrenadantes de cultivo de cada hibridoma luego se diluyeron dos veces con FBS al 20% y 200 µ9/??1 de IgG de humano (Mitsubishi Welpharma) en Tween 20 al 0.02%/PBS (-) , se agregaron a los pocilios y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, los pocilios se incubaron con un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson, #715-035-150, dilución de 5000 veces con Tween 20 al 0.02%/PBS (-) ) durante una hora a temperatura ambiente. Los pocilios luego se lavaron tres veces y se incubaron en una solución de TMBZ (3,30', 5 , 5 ' - tetramet ilbencidina) durante 15-30 minutos. Luego se agregó un volumen igual de H2S04 2 M para detener la reacción y la densidad óptica se leyó a 450 nm mediante ARVO ( PerkinElme ) . El ensayo ELISA de tipo emparedado identificó 24 pocilios positivos .
Luego se realizó un ensayo de quimiotaxis como una selección secundaria. El ensayo de quimiotaxis se realizó en placas de cultivo TranswellMR (Mult iScreen poro 5 µp?, Millipore, #MAMIC 5S10) . Primero, '50 µ?/pocillo de CCL20 de humano recombinante 300 ng/ml (R&D, #360-MP-025/CF) en amortiguador de quimiotaxis (BSA al 0.5%, FBS al 0.5%, HEPES 20 mM (pH 7.4), 2-mercaptoetanol 50 µ? en RPMI1640 ( Invitrogen) ) se pre-incubaron con 100 µ?/pocillo de sobrenadantes ¦ de cultivo de los hibridomas a temperatura ambiente durante 30 minutos (para una concentración final de CCL20 de 100 ng/ml) en los pocilios inferiores de las placas. Después de 30 minutos, las células B300.19 transfectadas con CCR6 de humano (SEC ID NO: 104) (2xl05 células/75 µ?) se aplicaron a los pocilios superiores , y se calentaron en una incubadora con C02 al 5% a 37°C durante 4 horas. Después de la incubación, 150 µ? de 7 los pocilios inferiores se recolectaron y se fijaron con 50 µ? de PFA al 4%/PBS (-). 30 µ? de cada muestra! se aplicaron al analizador de células FACSCantol IMR ^BD Biosciences) para contar las células emigradas. La actividad neutralizante se encontró en cuatro pocilios.
Luego se utilizó la dilución limitante estándar para obtener clones de hibridoma de los cuaéro pocilios positivos. Se confirmó la actividad neutralizante de sobrenadante de cada clon utilizando el ensayo de quimiotaxis in vitro. Tres de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CCL20 de humano producidos por estos clones (anticuerpos 36F7C10 (Tabla 2), 42G5B10 (Tabla 3) y 40-1C10B9 (Tabla 4)) demostraron actividad neutralizante contra el CCL20 |de humano .
Tabla 2 : Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 36F7Cl;0 Tabla 3 : Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 42G5B10 Tabla 4: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 40-1C1OB9 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTT CACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTG† CACCATCACATGTGGAGCAAGTGAGAA Secuencia de Nucleótidos de Dominio TATTTACGGTGCTTTAAATTGGTATCAGi CGG AAAC AGGGA AAATCTCCTC AGCTC Variable de Cadena Ligera CTGATCTATGGTGCAACCAACTTGGCAG ATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCA (SEC ID NO: 54) GTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAA GATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTT GCAACGTATTACTGTCAAAATGTGTTAA GTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCA CCAAGCTGGAAATCAAA Los anticuerpos de ratón 36F7C10, 42G5B10 y 40-1C10B9 luego se utilizaron para producir cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo humanizado. El método de humanización involucró el injerto de regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de ratón, identificas por medio métodos de definición de Kabat y/o Cho.thia de acuerdo con la numeración de Kabat, en secuencias de línea germinal de cadenas pesadas y ligeras de humano que representan las mejores parejas de estructura con las secuencias de ratón originales de las cuales se derivaron las CDRs (FIGURAS 6A-6C; la letra negrita indica residuos que difieren entre el anticuerpo de ratón y la secuencia de línea germinal de humano; las letras subrayadas y en negrita indican CDRs 'de ratón injertadas; las letras en cursiva y negrita indican residuos de estructura sustituidos por residuos de anticuerpo de ratón correspondientes; y las letras subrayadas, en cursiva y negrita indican residuos de CDR 1 sustituidos por residuos de línea germinal de humano correspondientes) . Las parejas de estructura ¡ se identificaron utilizando la base de datos IgBlast, de acuerdo con los métodos descritos en Altschul y colaboradores, Nucí. Acids Res. 25:3389-3402 (1997) . Para derivar versiones alternativas de cadenas humanizadas, se utilizaron dos métodos: 1) técnicas de modelado 3D para predecir residuos de murino cruciales dentro de la estructura que interactúan con los residuos de CDR, y 2) alineamientos de secuencias para identificar residuos de murino inmediatamente adyacentes a las secuencias de CDR canónicas .
Las secuencias humanizadas se construyeron en vectores de expresión y se transíectaron en líneas de células de mamífero (por ejemplo, células HEK293E ( Invi trogen) ) para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos obtenidos por medio de este proceso entonces se caracterizaron en ensayos funcionales y físicoquímicos .
Ejemplo 4: Ensayos de quimiotaxis in vifcro que demuestran la actividad de neutralización de Abs humanizados anti-CCL20 de humano Se identificaron anticuerpos humanizados que neutralizan activamente el ligando de CCL20 de humano al realizar ensayos de quimiotaxis in vitro utilizando las 1 células B300.19 transducidas con CCR6. Con la determinación de los valores IC50, IC90 e IC95 (FIGURAS 7A-7C) , se consideró que los anticuerpos que demostraban un valor reducido en la tabla de IC95 poseen una actividad neutralizante significativa (FIGURA 7C) . De las 14 cadenas pesa'das humanizadas y las 26 cadenas ligeras humanizadas producidas, se sometieron a prueba 41 combinaciones. Se mostró que ocho de estas combinaciones neutralizan significativamente 1 la quimiotaxis. Estos ocho anticuerpos humanizados se listan a continuación: • 36LK3/36HKK3 • 36LK3/42HKK1 • 36LK3/42HKK2 • 36LK3/42HKK3 • 36LK3/36HC2 • 36LK3/36HC3 • 36LC3/36HKK3 • 36LC3/36HC2 Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas pesadas humanizadas HC2 , HC3 , 36HKK3, 42HKK1, 42HK 2 y 42HKK3 y las cadenas ligeras humanizadas LC3 y LK3 , se muestran en las Tablas 5-12. Las secuencias de aminoácidos codificadas por los genes de linea germinal de humáho utilizados por estas cadenas pesadas y ligeras se muestran en la Tabla 13.
Tabla 5 : Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la1 cadena pesada de anticuerpo humanizado anti-CCL20 de humano 36HC2 ( "HC2" ) Secuencia de Aminoácidos de Dominio QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGVI Variable de Cadena Pesada DPSDSYTTYAQKFQGRVTMTVDTSTST (SEC ID NO: 9) VYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGVDY AMDYWGQGTLVTVSS : ATGGGCTGGTCCTGCATCATTCTGTTCC TGGTGGCCACTGCTACCGGAGTGCACA GCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGCG GCTGAGGTGAAGAAACCCGGTGCAÍA GTGTGAAGGTGTCATGTAAAGCATCC GGCTATACATTCACTAACTACTGGAT GCATTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGA CAGGGACTGGAATGGATGGGCGTG!A TCGACCCTTCAGATTCCTACACCACA TATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGGGT GACCATGACAGTGGACACTAGCACGT CTACAGTGTACATGGAGCTGTCCAGC CTGAGAAGTGAAGATACAGCAGTGTA CTATTGCGCCCGCGGCAATTACGGÁG TGGACTATGCCATGGATTACTGGGGG CAGGGTACTCTGGTGACCGTGTCTÁG TGCTTCTACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT Secuencia de Nucleótidos de Cadena Pesada GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT con la secuencia de señal GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC (SEC ID NO: 17) TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA^ ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGG CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC Secuencia de Aminoácidos de Dominio QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYW HWVRQAPGQGLEWMG^I Variable de Cadena Pesada DPSDSYTTYNQKFKGKATLTVDTSTST (SEC ID NO: 1 1 ) AYMELSSLRSEDTAVYYCTRGNYGVDY AMDYWGQCTLVTVSS ATGGACTGGACATGGAGAATCCTGTTCC TGGTGGCCGCTGCAACCGGAGCACACA GCCACGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGA GCAGAGGTCAAGAAACCCGGTGCTA GTGTG A AAGTGTCATGCAAGGCCTCC GGGT ATACTTTCACC AACTACTC GAT GCATTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGA CAGGGACTGGAATGGATGGGCGTGA TTGACCCTTCAGATTCCTACACCACA, TATAATCAGAAGTTTAAAGCAAAGGG AACACTGACTGTGGACACCAGCACAT CTACTGCCTACATGGAGCTGTCCAGC CTGAGGTCCGAAGATACTGCCGTGTj CTATTGTACCCGGGGCAACTACGGAG TGGACTATGCAATGGATTACTGGGGG C AGGGTACCCTG G TG ACAGTG TCTAG TGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCG TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT G ACGGTGTCGTG G A ACTC AG GCGCCCT Secuencia de Nucleótidos de Cadena Pesada GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC (SEC ID NO: 19) TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG'¡ GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG ' GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTQ AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG , GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT, ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC , TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC, CTG ACCTGCCTGGTC A A AGGCTTCTATC , CCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAGA < GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA Secuencia de Aminoácidos de Domi QVQLVQSGAEV KPGASVKVSC ASG YTFTSYW HWVRQAPGQGLE MGLI Variable de Cadena Pesada DPSD YTNYNQKFKGRVTMTRDTSTSÍT VYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGVDV (SEC ID O: 12) GMDYWGQGTLVTVSS ATGGACTGGACCTGGCGAATCCTGTTCC TGGTGGCCGCTGCAACAGGAGCACACT CACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGG GCAGAGGTGAAGAAACCCGGTGCCA; GCGTGAAGGTGTCTTGCAAAGCTAGT GGCTATACCTTCACAAGCTACTGGAT GCATTGGGTGCGGCAGGCACCAGGA CAGGGACTGGAATGGATGGGCCTGAT TG ACCCTTCTGATAACTAC ACTA ACT ¡ ACAACCAGAAGTTTAAAGGAAGGGTG ACTATGACCCCGGACACATCAACTTC CACCGTGTACATGGAGCTGTCCAGCC TGAGATCCGAAGATACCGCCGTGTAC TATTGTGCTCGCGGCAACTACGGAGT, GGACTATGGCATGGATTACTGGGGGC AGGGTACACTGGTGACCGTGTCCAGT GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT ! GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT , GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT Secuencia de Nucleótidos de Cadena Pesada GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC (SEC ID NO: 20) TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG; ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA I Secuencia de Aminoácidos de Dominio QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTSYWMHWVRQAPCQGLEWMGLI Variable de Cadena Pesada DPSDKYTNYNQKFKGRVTLTVDTSTST VYMELSSLRSEDTAVYYCTRCNYGVDY (SEC ID NO: 13) GMDYWGQGTLVTVSS ATGGACTGGACTTGGAGGATCCTGTTCC TGGTGGCCGCTGCAACCGGAGCTCACTC ACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGA GCAGAGGTGAAGAAACCCGGTGCCTC CGTGAAGGTGTCTTGCAAAGCAAGTb GCTATACCTTCACAAGCTACTGGATG CATTCGGTGAGACAGGCACCAGGACA GGGACTGGAATGGATGGGCCTGATTjG ACCCTTCTGATAAGTACACCAACTAG AACCAGAAGTTTAAAGGACGCGTGAC TCTGACCGTGCACACATCAACTTCCÁ CCGTGTACATGGAGCTGTCCACCCTG AGGTCCGAAGATACCGCAGTGTACTA TTGTACACGGGGCAACTACCGAGTGG ACTATGGCATGGATTACTGGGGGCAG GGTACACTGGTGACCGTGTCCAGTGG TAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG AC ¡ Secuencia de Nucleótidos de Cadena Pesada CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTG CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA (SEC ID NO: 21 ) GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATG TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGG ACTGGCTGAATGGCAAGG AGTAC , AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG AGG AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCG CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG ! Tabla 12: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena ligera de anticuerpo humanizado anti-CCL20 de humano LK3 i Tabla 13: Secuencias de aminoácidos codificadas por genes <e líneas germinales de humano Con base en los resultados de la evaluación, se seleccionaron los anticuerpos 36LK3/36HC2 ( "HC2/LK3" ) y 36LC3/36HC2 ("HC2/LC3") para estudios adicionales. Para estos dos anticuerpos, los ensayos de quimiotaxis in vitro se realizaron en paralelo con el clon de ratón parental 36F7C10 y su forma quimérica (que comprende una porción Fe 1 de humano) . En este ensayo, se emplearon placas de cultivo TranswellMR con células B300.19 CCR6+ sembradas en la capa superior y el ligando de CCL20 de humano recombinante en la capa inferior. El CCL20 de humano recombinante (10 nM final, R&D Systems) se pre-incubó con anticuerpos humanizados anti-CCL20 a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, las células pre-B de murino transducidas con CCR6 de humano B300.19, proporcionadas por el Doctor H. Kawasaki en la Universidad de Tokio) se aplicaron a la capa superior y la quimiotaxis se desarrolló a 37°C durante 4 horas. Al final' de la incubación, se utilizó FACS para medir las células emigradas. Las concentraciones inhibitorias del 50%, 903> y 95% (valores IC50, IC90 e IC95, respectivamente) para HC2/LK3 y HC2/LC3 entonces se calcularon (Tabla 14) . Ninguno de los anticuerpos humanizados perdió actividad de neutralización ; en comparación con el MAb de ratón parental y los valores IC50 se calcularon alrededor de 1 nM.
Tabla 14: Actividad de neutralización de HC2/LK3 y HC2/LC3 contra al CCL20 de humano en un ensayo de quimiotaxis (en nM) Las respuestas a la dosis para un ensayo representativo con el anticuerpo HC2/LK3 se muestran en las FIGURAS 8A-8C. Se representan tres experimentos independientes.
Se confirmó además la actividad neutralizante ! de HC2/LK3 y. HC2/LC3 utilizando un ensayo de migración transendotelial (TEM) en el cual las células mononucleares de sangre periférica de humano aisladas recientemente se utilizaron en lugar de las células artificiales transducidas con CCR6. Debido a que es bien sabido que las células T con memoria CD3+CD4+CD45RO+ y las células B CD19+ son enriquecidas con células positivas en CCR6, se midieron los números de células emigradas de estas poblaciones en presencia o ausencia de los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3, así como también el anticuerpo de ratón parental 36F7C10. Ambos anticuerpos humanizados (FIGURAS 9B y 9C) demostraron una inhibición dependiente de la dosis de la migración de células comparable a aquella del 36F7C10 (FIGURA 9A) , proporcionando evidencia adicional de su actividad neutralizante .
Ejemplo 5: Unión de Abs humanizados anti-CCL20 de humano al CCL20 de humano Para medir la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados HC2/LC3 y HC2/LK3 mediante la resonancia de plasmón superficial (BiacoreMR) , los anticuerpos se expresaron y se purificaron de medios acondicionados de las células HEK293F transíectadas de manera transitoria y los anticuerpos se capturaron en un chip CM5 revestido con anticuerpos monoclonales anti-Fc de humano utilizando HBS-EP como el amortiguador de conducción. Luego se inyectaron varias diluciones (100, 20, 4, 0.8, 0.16 y 0 nM) de la proteína de CCL20 de humano (R&D Systems) sobre la superficie revestida del chip y se observó la disociación del CCL20 unido durante hasta 20 minutos (FIGURAS 10A y 10B) . Los datos de unión se ajustaron globalmente a un modelo de Langmuir 1:1. Los resultados se muestran en la Tabla 15 y representan el promedio de dos experimentos independientes. La afinidad entre el CCL20 y su receptor, CCR6 , ha sido reportada como 500 pM en células primarias de humano (Liao y colaboradores , J. Immunol 168 (10) : 4871-4880 (2002)); estos datos demuestran que las afinidades de los anticuerpos HC2/LC3 y HC2/LK3 por el CCL20 son aproximadamente 10 veces más altas que la afinidad del CCR6 por el CCL20.
Tabla 15: Resultados de SPR de anticuerpos humanizados anti- CCL20 de la invención Ejemplo 6: Reactividad cruzada de MAbs humanizados anti-CCL20 de humano a parálogos de quimiocina Se examinaron los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3 'por su especificidad por el CCL20 de humano mediante el análisis de su reactividad cruzada contra un panel de quimiocina (Tabla 16) utilizando un ensayo inmunoabsorbente vinculado con enzimas (ELISA) .
Tabla 16: Quimiocinas humanas recombinantes utilizadas en el ensayo ELISA Los pocilios de una placa de 96 pocilios se revistieron con 1 µ9/??1 de las quimiocinas recombinantes de humano en PBS (-) . Después de la incubación durante toda la noche a 4°C, los pocilios se bloquearon con 1 x Block-Áce (Dainippon Sumitomo Pharma, UK-B80) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado dos veces con Tween 20 al 0.02%/PBS (-) , se agregaron 50 µ? de 36F7C10 purificado 10 mg/ml, 36F710 quimérico, HC2/LK3 o HC2/LC3 en Tween 20 al 0.02%/PBS (-) a cada pocilio. Los pocilios se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron tres veces como se describiera en el Ejemplo 3. El anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson, #715-035-150, para 36F7C10) o el fragmento Fcy anti-IgG de humano conjugado con HRP (Jackson, #109-035-098, para mAbs quiméricos y humanizados) luego se agregó (en una dilución de 5000 veces con Tween 20 al 0.02%/PBS (-)) y los pocilios se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado cinco veces, una solución de TMBZ (3,3', 5 , 5 ' -tetrametilbencidina) (1%, en N, N-dimetilformamida) \ se agregó a los pocilios y se incubó durante 15-30 minutos. , La reacción se detuvo mediante la adición de un volumen igual, de una solución de detención de H2S04 2 M y la densidad óptica ¡se leyó a 450 nm por medio de ARVO (PerkinElmer) . Como : -se demuestra en la FIGURA 11B, los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3 se unen específicamente al CCL20 de humano sobre las otras quimiocinas en el panel.
En estos ensayos, aunque el anticuerpo HC2/LK3 fue reactivo contra el CCL20 de humano unida a la placa, pareció menos potente que los anticuerpos 36F7C10 de ratón o 36F7C10-hFc quimérico (FIGURA 11A) . Sin embargo, el anticuerpo HC2/LK3 mostró una unión clara y fuerte contra el CCL20 fijada firmemente por vía de una etiqueta de His en ensayos ELISA (FIGURA 11C) , lo cual permitió la exposición de tddas las porciones de CCL20 al solvente. Esto puede indicar 1 que el (los) epítopo(s) de CCL20 para el anticuerpo HC2/LK3 se ocultan u ocluyen en el procedimiento utilizado para unir el CCL20 a la superficie de la placa en el primer formato de ensayo. Para evitar este posible artefacto, se empleó el análisis Biacore™ en el cual el CCL20 libre se aplicó sobre MAbs capturados en un chip sensor. En los ensayos BiacoreMR, los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3 mostraron una fuerte unión al CCL20 comparable con aquella del anticuerpo quimérico 36F7C10-hFc (FIGURA 11D) . Además, se descubrió que la pequeña reacción contra CXCL4 observada en la FIGURA 11B era insignificante en los ensayos BiacoreMR (FIGURA 11D) .
El análisis filogenético de Dereeper y colaboradores, (Nucleic Acids Res. 1 (36) : 465-469 (2008)) indica que el CCL16 es la quimiocina más cercana respecto a la secuencia al CCL20, aunque el porcentaje de identidad entre el CCL20 y el CCL16 es menor que 37.5% (homología en solo 56 de los 70 aminoácidos que comprenden el péptido de CCL20 maduro (SIM - Alignment Tool for protein sequences, Swiss Institute of Bioinformatics) ) (FIGURA 12) . Se utilizó el análisis BiacoreMR para someter a prueba si los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3 reaccionan de manera cruzada con el CCLlé. El anticuerpo de ratón monoclonal anti-Fc de humano se inmovilizó en las cuatro células de flujo del chip CM5 en un caudal de 25 µ?/minuto con amortiguador de HBS-EP que contenía BSA 0.2 mg/mL. Subsecuentemente, 50 µ? de una solución 1 g/ml del anticuerpo quimérico, HC2/LC3 o HC2/LK3 en amortiguador de HBS-EP con BSA 0.2 mg/ml se inyectaron sobre las células de flujo 2, 3 y 4, respectivamente. 150 µ? de una solución 100 nM de CCL20 o CCL16 en amortiguador de HBS-EP (o amortiguador solo) con BSA 0.2 mg/ml luego , se inyectaron sobre las cuatro células de flujo en un caudal, de 40 µ?/minuto. La disociación siguió durante 20 minutos. La celda de flujo 1 (anticuerpo anti-Fc de humano solo) se utilizó como referencia para todas las células de flujo.
Bajo esas condiciones, el CCL20 de humano unido 1 al anticuerpo quimérico (FIGURA 13A) , HC2/LC3 (FIGURA 13B) y HC2/LK3 (FIGURA 13B) se capturaron en el chip con una fuerza similar. En contraste, no se detectó una unión significativa cuando el CCL16 de humano se condujo a través del chip, lo que indica que aunque el CCL16 es la quimiocina más cerca'na respecto a la secuencia al CCL20, el CCL20 y el CCL16 no poseen homología suficiente (<37%, como se planteara anteriormente) para permitir que los anticuerpos humanizados anti-CCL20 reaccionaran de manera cruzada con el CCL16.
Estos datos indican que los anticuerpos HC2/LK3 y HC2/LC3 son específicos para el CCL20 de humano sobre otras quimiocinas .
Ejemplo 7: Reactividad cruzada de MAb humanizados anti-CCL20 de humano hacia ortólogos de especies Luego se determinó la reactividad cruzada de los MAbs HC2/LC3 y HC2/LK3 hacia el CCL20 de otras especies. Los alineamientos de secuencias de aminoácidos entre los ortólogos de CCL20 (obtenidos utilizando SIM - alignment tool for protein sequences (Swiss Institute of Bioinformatics) ) indican que la identidad entre las CCL20 de mono cynomolgus/rhesus y de humano es 86%, mientras que la homología entre el CCL20 de ratón y de humano es 64% (FIGURA 14; CCL20 de humano - SEC ID NO: 85; CCL20 de mono rhesuá -SEC ID NO: 86; CCL20 de mono cynomolgus - SEC ID NO: 87; CCL20 de ratón parcial - SEC ID NO: 88 (la secuencia de aminoácidos completa de CCL20 de ratón se puede encontrar ' en la SEC ID NO: 102; los residuos 1-27 constituyen la secuencia de señal; véase la Tabla 18) ) .
Para someter a prueba si los anticuerpos quiméricos y humanizados pueden unirse a ortólogos de CCL20 de ratón, mono cynomolgus o macaco rhesus, que utilizaron ensayos ELPSA como se ilustra en la FIGURA 15. Las proteínas de fusión de fosfatasa alcalina (SEAP) -quimiocina secretadas, recombinantes se diseñaron como se describe en el Ejemplo 2, se expresaron y se purificaron para la totalidad de los ortólogos de CCL20 sometidos a prueba. Las placas negras de fondo plano Nunc MaxisorbMR se revistieron con 1 µg/ml de anticuerpo de ratón anti-fosfatasa alcalina placentaria (Pierce, # de cat . MA1-19354) en bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.4, durante toda la noche a 4°C. Las placas luego se bloquearon utilizando solución salina amortiguada con fosfato IX con Tween-20 (PBST) con albúmina de suero bovino al 5% (BSA, por sus siglas en inglés) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las proteínas de fusión de SEAP-CCL20 20 nM" se diluyeron en serie 5 veces en medio Opti-MEM (Invitrogen) . Los anticuerpos quiméricos y humanizados (HC2/LC3 y HC2/LK3) se diluyeron a 1 µg/ml en PBST IX con BSA al 5%, se agregaron a placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas luego se lavaron con PBST IX con BSA al 5% tres veces. El conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG + IgM de humano (H+L) HRP (Jackson ImmunoResearch # de cat. 109-035-127) se diluyó a 80 ng/ml, se agregó a la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. El substrato de HRP fluorescente QuantaBlu (Pierce # de cat. 15169) se agregó para la detección de anticuerpo unido al medir ', la fluorescencia en un lector de placas Molecular Devices M'5MR (Excitación 325 nm/Emisión 420 nm) .
Mientras que el anticuerpo de hámster anti-CCL20 de ratón MAb 2F5-5 se unió al CCL20 de ratón con una dosis efectiva de 50% (EC50) de 64 pM (los datos no se muestran) , ninguno de los anticuerpos quiméricos ni humanizados anti-CCL20 de humano se unieron de manera detectable al CCL20 de ratón o el CCL20 de rata bajo las condiciones descritas anteriormente. En contraste, ambos anticuerpos quiméricos y humanizados se unieron de manera efectiva al CCL20 de humano, de mono rhesus y de mono cynomolgus (FIGURAS 16A-16C, 17A y 17B) . Mientras que el valor EC50 para el CCL20 de humano y de mono rhesus pareció similar (por ejemplo, 62 y 101 pM para HC2/LC3) , el valor EC50 para el CCL20 de mono cynomolgus ¡fue 340 pM para el anticuerpo HC2/LC3 , una diferencia de 5.4 veces contra el CCL20 de humano. Se observaron resultados similares para HC2/LK3. Esto sugiere que se requirió una concentración mucho mayor de anticuerpo para lograr la misma cantidad de unión al CCL20 de mono cynomolgus que al CCL20 de humano o de mono rhesus .
Ejemplo 8: Ensayos de resonancia de plasmón superficial para la reactividad cruzada de MAbs humanizados anti-CCL20 hacia ortólogos de especies de CCL20 También se utilizó el análisis de resonancia de plasmón superficial (BiacoreMR) para someter a prueba si los anticuerpos HC2/LC3 y HC2/LK3 se pueden unir a los ortólogos de CCL20 de ratón, mono cynomolgus o macaco rhesus. La fosfatasa alcalina placentaria de ratón monoclonal antihumano se inmovilizó en las cuatro células de flujo de un chip CM5 en un caudal de 25 µ?/minuto. 25 µ? de una solución 2 nM de CCL20 de humano, mono rhesus, mono cynomolgus ' o ratón-SEAP en amortiguador de HBS-EP se inyectaron sobre la celda de flujo 2, 3 o 4. Para la unión del anticuerpo, 240 µ? de diluciones 0-80 nM de MAb HC2/LC3 , HC2/LK3 o 2F5-5 en amortiguador de HBS-EP (o amortiguador solo) se inyectaron sobre las cuatro células de flujo en un caudal de 50 µ?/minuto. La disociación siguió durante 45 minutos. La celda de flujo 1 (anti-SEAP solo) se utilizó como referencia para todas las células de flujo. La regeneración de las células de flujo se realizó con glicina 10 mM a pH 2.25. Debido a los efectos de regeneración en la capacidad de captura de ,los chips, las inyecciones de anticuerpos se realizaron secuencialmente de una concentración baja a una concentración alta. Los ajustes de datos se realizaron utilizando un modelo de Langmuir 1:1.
Bajo las condiciones anteriores, el anticuerpo de hámster anti-CCL20 de ratón 2F5-5 se unió al CCL20 de ratón con un valor KD (bivalente) de 4.9 pM, pero no se unió significativamente al CCL20 de humano, mono rhesus o mono cynomolgus . En contraste, los anticuerpos quiméricos, HC2/LC3 y HC2/LK3 se unieron de manera efectiva al CCL20 de humano, mono rhesus, y mono cynomolgus (Tabla 17) .
Los valores de afinidad aparentes que se midieron fueron más altos en este ensayo que aquellos detectados previamente en el Ejemplo 5 (por ejemplo 4.7 pM para el anticuerpo HC2/LC3 en el presente ensayo contra 44 pM en la Tabla 3) debido al carácter bivalente (afinidad más alta) del formato de ensayo empleado (contra el formato monovalente empleado para los datos mostrados en la Tabla 15) . Los valores KD para el CCL20 de mono rhesus y mono cynomolgus fueron generalmente más altos (3 veces) que para el CCL20 de humano, lo que indica que los anticuerpos se unieron más específicamente al CCL20 de humano. En contraste a los datos del ensayo ELISA del Ejemplo 7, sin embargo, no se observó una diferencia significativa entre la afinidad de unión para el CCL20 de mono rhesus y mono cynomolgus.
Tabla 17: Evaluación de anticuerpo monoclonal humanizado anti- CCL20 que se une a los ortólogos de CCL20 mnediante Biacore No se mostró previamente que se uniera al mCCL20 b: Datos del anticuerpo anti-ratón de hámster del chip inicial Ejemplo 9: Cartografía de Epítopos para el Clon de Ratón Anti-CCL20 de Humano 36F7C10 Para determinar el (los) epítopo (s) de CCL20 de humano al cual se une el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CCL20 de humano 36F7C10, se utilizó un método de intercambio de hidrógeno/deuterio en el cual la unión del anticuerpo protege y conserva de esta manera la deuteracion del epítopo. Como se muestra en la FIGURA 18A, se observaron alteraciones muy fuertes cerca de la terminación N del CCL20 de humano en los residuos 7-9, 10-19 y 20-22, posiblemente representando el(los) epítopo(s). También se observó protección marginal cerca del C-terminal en los residuos 39-55, 56-67 y 61-70. Estos segmentos pueden ser periféricos para el epítopo, o sus movimientos de respiración se pueden conjugar con el epítopo. El nivel de deuteracion de cada aminoácido indicado se muestra en cuatro puntos de tiempo: de arriba hacia abajio, 150, 500, 1, 500 y 5, 000 s.
Las regiones identificadas como el epítopo para 36F7C10 se encuentran dentro de las regiones N-terminales y de bucle del CCL20, las cuales se sabe que son cruciales para la unión y señalización de CCR6 ( alik y colaboradores , Acta Cryst P62-631:634 (2006 )) (FIGURA 18B) . Los anticuerpos quiméricos y humanizados que se derivan de 36F7C1Ó, especialmente los anticuerpos con las mismas secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera que el 36F7C10, o secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera similares como el 36F7C10 (por ejemplo, con menos de 3 , 2 o 1 sustituciones de aminoácidos en comparación con las CDRs del 36F7C10) se espera que1 se unan al mismo epítopo. La identificación de este epítopo puede explicar de esta manera la capacidad del MAb 36F7C1O y anticuerpos quiméricos y humanizados que se derivan del mismo para neutralizar la actividad de CCL20.
Ejemplo 10: Ensayo de quimiotaxis in vivo para anticuerpos humanizados anti-CCL20 de humano Para someter a prueba si los anticuerpos HC2/LC3 y HC2/LK3 pueden inhibir la quimiotaxis inducida por CCL20 in vivo, se tomó ventaja del hecho de que el CCL20 de humano puede interactuar con el CCR6 de ratón (SEC ID NO: 106) para inducir la quimiotaxis de células T de ratón (FIGURA 19) . Se utilizó un sistema híbrido in vivo que mide la migración de células T de ratón hacia el CCL20 de humano inyectando intradérmicamente (FIGURA 20) .
El CCL20 de humano recombinante (10 ng/cabeza) y el vehículo se inyectaron intradérmicamente en la piel afeitada en los lados izquierdo y derecho, respectivamente, de las espaldas de los ratones de prueba (grupos de n=3) . Las células T esplénicas de ratón etiquetadas con calceína-AM (5 x 106 células/ratón) luego se transfirieron por vía intravenosa a la vena de la cola, con una inyección simultánea de los anticuerpos indicados en la vena de la cola en las dosificaciones descritas en la FIGURA 20. Después de una hora, las células positivas, fluorescentes se contaron utilizando un microscopio estereoscópico en el sitio de las inyecciones intradérmicas .
Tanto el HC2/LK3 como el HC2/LC3 inhibieron significativamente la migración de células a los sitios inyectados con CCL20 a un nivel comparable a aquel del anticuerpo de ratón parental 36F7C10 y su forma quimérica. Debido a que la quimiotaxis de células T es un paso clave en la cascada inflamatoria, la prevención de esta migración tiene implicaciones clínicas para el tratamiento , de condiciones autoinmunes e inflamatorias.
Ejemplo 11: Efecto del MAb 2F5-5 sobre la artritis inducida por colágeno tipo II Para evaluar adicionalmente el uso de anticuerpos anti-CCL20 para indicaciones terapéuticas, se realizaron estudios in vivo adicionales en ratones utilizando el MAb de hámster anti-2F5-5 de ratón. Primero, se evaluó la capacidad del 2F5-5 para neutralizar la quimiotaxis mediada por CCL20 en ratones CIA (un modelo animal de artritis reumatoide) . La CIA se indujo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Después del desarrollo de artritis (clasificación de artritis 1-3) , los ratones se aleatorizaron y se trataron con 500 µg/ratón de ya sea el MAb 2F5-5 o un anticuerpo de IgG de control. En ambos casos, el anticuerpo se administró por vía intravenosa cada día alterno. En comparación con la IgG de control, el MAb 2F5-5 inhibió el desarrollo adicional de síntomas de artritis (FIGURAS 21, 22) .
También se utilizó la clasificación de rayos X para determinar los efectos del MAb 2F5-5 sobre las lesiones óseas, las cuales se observan frecuentemente en la artritis reumatoide. La clasificación se realizó como se describe* en Inoue y colaboradores, Agents Actions 39:187-194 (1993). En resumen, cada pata de un ratón con CIA se graduó en una escala de 0 a 3 con base en la gravedad de la osteoporosis (0) , erosión ósea (E) y formación de huesos nuevos (N) ¡ de acuerdo con las imágenes de rayos X. La escala utilizada fue: 0, sin cambios; 1, cambio ligero; 2, cambio moderado; y 3, cambio grave. Las clasificaciones para cada factor se agregaron para desarrollar una clasificación de rayos, X acumulativa para las lesiones óseas. Los ratones tratados con el MAb 2F5-5 demostraron clasificaciones de rayos X notablemente menos graves en el día 39, en comparación con los ratones tratados con una IgG de control (FIGURAS 23, 24).
Se confirmó el efecto del tratamiento con el MAb 2F5-5 sobre la patología ósea mediante el análisis de varios biomarcadores utilizando un ensayo ELISA. Los ratones con CIA fueron inmunizados y tratados con 500 µg de anticuerpo 2F5-5 o de IgG de control como se describiera ante iormente. Las muestras de plasma se prepararon a partir de los ratones en el día 11 o 12 después de la segunda inmunización. Un marcador de la destrucción de cartílago, la proteína de matriz oligomérica cartilaginosa del suero (COMP)', se cuantificó utilizando el kit de inmunoensayo de Enzimas Animal COMP ELISAMR (AnaMar Medical) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (incorporadas en este documento a manera de referencia) , excepto que las muestras de plasma de animales se diluyeron 1:20. Debido a que la COMP es pre-revestida sobre la placa, este es un ensayo ELISA de competencia, por lo cual la adición del estándar de COMP y plasma que contiene COMP da por resultado una disminución en el valor OD450 (FIGURA 25A) . Los datos sin procesar de un ensayo de muestra se exhiben en las FIGURAS 25B y 25C. Los niveles en suero de COMP en ratones con CIA se redujeron casi a niveles normales mediante el tratamiento con el MAb 2F5-5 (FIGURA 26), demostrando la capacidad del 2F5-5 para inhibir la destrucción del cartílago.
Debido a que la formación y diferenciación de osteoclastos es responsable de la osteoporosis y erosión relacionada con RA, se midieron los niveles de receptor activador de molécula de inducción de osteoclastos para el ligando del factor nuclear B (RANKL) y los marcadores de osteoclastos tal como el receptor activador para el factor nuclear ?? (RA K) , fosfatasa ácida resistente a tartrato (T AP) y catepsina K, como indicadores para la terapia artrítica. Se evaluaron los niveles de expresión de AR m de esos marcadores mediante la PCR cuantitativa utilizando ARN total aislado de las patas de ratón homogenizadas . Las patas se homogenizaron primero con un homogenizador después de ser remojadas en un amortiguador de lisado de tejido que contenía reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EUA) . Después de agregar cloroformo, las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante 15 minutos a 4°C para separar la solución en fase acuosa y fase orgánica. La fase acuosa se retiró y se agrégó isopropanol a la misma, seguido por la centrifugación a 14,000 rpm durante 15 minutos a 4°C para obtener pelotillas de ARN. Las pelotillas de ARN disueltas en agua libre de R asa 1 se utilizaron en un mini-kit RNAeasy1""* (QIAGEN, Valencia, GA, EUA) para aislar el ARN y se trató con DNasa para retirar cualquier ADN. El ADN complementario (ADNc) se generó a partir del ARN con un kit de reacción RTMR (Kit de PCR de ARN, TAKÁRA Bio, Inc., Shiga, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real para cada una de las especies de ADNc se realizó y se comparó con el nivel de un gen constitutivo, hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HPRT) . Los siguientes conjuntos de cebadores directos e inversos se utilizaron en las reacciones de PCR: RA KL, 5' -CATTTGCACACCTCACCATC-3' (SEC ID NO: 89) y 5 ' -TCCGTTGCTTAACGTCATGT-3 ' (SEC ID NO: 90); RANK, 5 ' -CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3 ' (SEC ID NO: 91) y 5' -TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-3' (SEC ID NO: 92); TRAP, 5 ' -GCTGGAAACCATGATCACCT-3 ' (SEC ID NO: 93) y 5' -GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG- 3' (SEC ID NO: 94); Catepsina K, 5 ' -CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT-3 ' (SEC ID NO: 95) y ' 5 ' -CCGAGCCAAGAGAGCATATC-3 ' (SEC ID NO: 96); y HPRT, 5 ' -CAGGCCAGACTTTGTTGGAT-3 ' (SEC ID NO: 97) y 5' -TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3' (SEC ID NO: 98).
Todos los cebadores se diseñaron utilizando el software basado en la web Primer 3 ( hitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, EUA) para evitar la amplificación no específica de ARN. Las mezclas de reacción con platilla de ADNc, cebadores, uracil ADN glicosilasa (Invitrogen, CA, EUA) y QuantiTect SYBR Green PCR Master MixMR (QIAGEN, Valencia, CA, EUA) se utilizaron en la reacción de amplificación en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7700MR (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA) . Los niveles de expresión se cuantificaron automáticamente por medio del Software de Detección de Secuencias ABI PRISM 7700MR.
Después del tratamiento con el MAb 2F5-5, los niveles de ARNm se suprimieron para todos los marcadores en el tejido de articulación (FIGURAS 27A y 27B; muestran el número de veces de cambio en el nivel de expresión en comparación con el gen constitutivo HPRT) , proporcionando evidencia adicional de que el 2F5-5 inhibe la patología ósea in vivo.
Ejemplo 12: Efectos del MAb 2F5-5 sobre la artritis inducida por glucosa- 6 - fosfato isomerasa Se sometieron a prueba los efectos anti-artríticos del tratamiento con el MAb 2F5-5 en ratones con artritis inducida por glucosa-6-fosfato isomerasa (G6PI) , otro modelo de ratón para RA. La artritis fue inducida mediante la sensibilización intradérmica con GST-G6PI recombinante (300 µg/ratón) emulsionada en adyuvante completo de Freund y se inyectó en la base de la cola de ratones DBA/l. Seis días después de la inmunización con G6PI y justo antes del comienzo del hinchamiento de las articulaciones, los ratones se aleatorizaron y se trataron con 500 g/ratón de ya sea el anticuerpo de isotipo coincidente o el MAb 2F5-5. La gravedad de los síntomas artríticos en las patas de cada ratón se graduó como se describiera previamente en el Ejemplo 1. Los ratones tratados con el MAb 2F5-5 exhibieron clasificaciones artríticas significativamente más bajas que los ratones tratados con anticuerpos de isotipo coincidente, lo que muestra que el 2F5-5 suprime fuertemente el desarrollo de artritis en comparación con el control (FIGURA 28) .
Estos datos demuestran la eficacia del tratamiento con anticuerpo anti-CCL20 en modelos de artritis in vivo y sugiere que el uso de anticuerpos anti-CCL20 puede ser benéfico en el tratamiento de la artritis reumatoide .
Ejemplo 13: Efecto del MAb 2F5-5 sobre la dermatitis atópica inducida por oxazolona Luego se evaluó el efecto del tratamiento con! el MAb 2F5-5 en modelos de ratón de dermatitis. En un modelo, la oxazolona se utilizó para inducir la dermatitis atópica en ratones propensos a la enfermedad (cepa NC/Nga) . La piel abdominal de los ratones se afeitó y se expuso a oxazolona en los días 0, 5 y 8. En el día 13, los ratones que mostraban signos de dermatitis (clasificación 2) se seleccionaron y - se inmunizaron nuevamente con oxazolona. Los ratones 1 se aleatorizaron después en grupos de seis para el tratamiento con ya sea el MAb 2F5-5 o un anticuerpo de IgG de control de isotipo coincidente (500 g/ratón, administrado por vía intravenosa cada día alterno) . Se sometieron a ensayo las clasificaciones de dermatitis en un estudio ciego de la siguiente manera: cada síntoma de dermatitis tal como resequedad, escala, eritema, exudación/encostramiento y excoriación se clasificó en una escala de 0 a 3 (0 = ninguno, 1 = ligero, 2 = moderado, 3 = grave) ; estas clasificaciones luego se agregaron para una clasificación acumulativa de dermatitis (como se describe en Leung y colaboradores J. Allergy Clin Immunol 85 (5) : 927-933 (1990)) . Se comparó la magnitud de supresión de la enfermedad entre los dos grupos mediante la cuantificación del área bajo la curva ( "AUC" , por sus siglas en inglés) del día 13 al día 18. En este modelo de dermatitis, el MAb 2F5-5 indujo una supresión estadísticamente significativa (p<0.05) del progreso de la enfermedad en comparación con la IgG de control (FIGURA 29) . Ejemplo 14: Efecto del MAb 2F5-5 sobre la dermatitis alérgica de contacto inducida por DNFB Se sometió a prueba el efecto del tratamiento con el MAb 2F5-5 en la dermatitis alérgica de contacto inducida por dinitrofluorobenceno (DNFB) , un segundo modelo de ratón , de dermatitis. Los ratones se dividieron en grupos de 6 y se sensibilizaron mediante el cepillado de 25 µ? de solución de DNFB (DNFB al 0.4% en una solución 4:1 de acetona: aceite, de olivo) sobre el abdomen afeitado durante dos días sucesivos (días 0 y 1) . Un grupo se trató con el MAb 2F5-5, mientras que el otro grupo se trató con un anticuerpo de control de isotipo coincidente (500 µg/ratón por vía intravenosa en los días 0,, 2 y 5) . En el día 5, los ratones se desafiaron de nuevo mediante la aplicación de 20 µ? de solución de DNFB al 0.2% (en acetona : aceite de olivo 4:1) a un lado de una oreja. El espesor de la oreja se midió como un indicador de edema en el día1 6 utilizando un calibrador de espesor. El tratamiento con el' MAb 2F5-5 redujo el espesor de la oreja, lo que indica la prevención exitosa del desarrollo de dermatitis (FIGURA 30) .
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta descripción se incorporan en este documento a manera de referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo con fines de claridad en el entendimiento, será fácilmente aparente para aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo en vista de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la presente sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.
Tabla 18: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos para CCL20 y CCR6 de humano y ratón Tabla 19: Números de Identificación de Secuencias 5 15 Tabla 20: Secuencias de Anticuerpos Humanizados y de Ratón 15 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque el anticuerpo comprende por lo menos uno de: a) una cadena pesada cuya región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) comprende la SEC . ID NO: 67 o 68 y b) una cadena ligera cuya región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) comprende la SEC ID NO: 75.
2. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada y la CDRl , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, respectivamente, comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS : 60, 64, 67, 70, 73 y 75; b) SEC ID NOS : 60, 64, 67, vi, 73 y 75; c) SEC ID NOS : 60, 63, 67, 70, 73 y 75; d) SEC ID NOS : 60, 63, 67, 71, 73 y 75; e) SEC ID NOS : 61, 65, 68 , 70, 73 y 75; f) SEC ID NOS : 61, 65, 68, 71, 73 y 75; g) SEC ID NOS: 77, 79, 67, 70, 73 y 75; h) SEC ID NOS: 77, 79, 67, 71, 73 y 75; i) SEC ID NOS: 78, 80, 68, 70, 73 y 75; y j) SEC ID NOS: 78, 80, 68, 71, 73 y 75.
3. El anticuerpo o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación , 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende por lo menos uno de: a) una cadena pesada cuyo dominio variable comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID NOS: 9-14; y b) una cadena ligera cuyo dominio variable comprende la SEC ID NO: 15 o 16.
4. El anticuerpo o una porción de unión ', a i antígenos de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada; y el dominio variable de cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS : 9 y 15 ; b) SEC ID NOS: 9 y 16; C) SEC ID NOS: 10 y 16; d) SEC ID NOS: 11 y 15; e) SEC ID NOS: 11 y 16; f ) SEC ID NOS: 12 y 16; g) SEC ID NOS: 13 y 16; y h) SEC ID NOS: 14 y 16.
5. El anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-6 sin la secuencia de señal y la SEC ID NO: 108 o; b) la cadena pesada comprende una secuencia1 de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-6 sin la secuencia de señal y la SEC ID NO: 108,' en donde la secuencia de aminoácidos carece de la lisina C-terminal ; o c) la cadena ligera comprende una secuencia : de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC¡ ID NOS: 7 y 8 sin la secuencia de señal y las SEC ID NOS: 110 y 112.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la cadena pesada y >la cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS : 1 y 7 ; b) SEC ID NOS: 1 y 8 ; c) SEC ID NOS: 2 y 8 ; d) SEC ID NOS: 3 y 7 ; e) SEC ID NOS: 3 y 8; f) SEC ID NOS: 4 y 8 ; g) SEC ID NOS: 5 y 8 ; h) SEC ID NOS: 6 y 8; i) SEC ID NOS: 108 y 110; y j) SEC ID NOS: 108 y 112; en donde las secuencias de aminoácidos carecen de secuencias de señal, si están presentes, y en donde las SEC ID NOS: 1-6 carecen opcionalmente de la lisina C-terminal.
7. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se une al mismo epítopo del CCL20 de humano que el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación 6; b) un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que compite por la unión al CCL20 de humano con el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación 6; y c) un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, que compite de manera cruzada por la unión al CCL20 de humano con él anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación 6.
8. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
9. El anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio constante de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 de humano .
10. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque el anticuerpo comprende por lo menos uno de: a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 39, 41 y 43; y ; b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 40, 42 y 44.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la cadena pesada y la cadena ligera comprenden respectivamente secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NOS: 39 y 40; b) SEC ID NOS: 41 y 42; y c) SEC ID NOS: 43 y 44.
12. La porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la porción de unión a antígenos es un anticuerpo de cadena individual, Fv, Fab, Fab' , F(ab')2, Fd, molécula de Fv de cadena individual (scFv) , dímero de Fv de cadena individual biespecífico , diacuerpo, anticuerpo de dominio suprimido o anticuerpo de dominio individual (dAb) .
13. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígenos tiene una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: a) no se une al CCL16 de humano; b) se une al CCL20 de mono cynomolgus o mono rhesüs, pero no al CCL20 de ratón o rata; c) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano de 70 pM o menos utilizando un ensayo de resonancia . de plasmón superficial monovalente; d) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano de 12 pM o menos utilizando un ensayo de resonancia de plasmón superficial bivalente; e) tiene una afinidad de unión por el CCL20 de humano mayor que aquella del CCR6 de humano,- f) tiene una selectividad por el CCL20 de humano sobre el CX3CL1, CXCL1, CXCL2 , CXCL4 , CXCL8 , CXCL9, CXCL10, CXCLÍ2 , CXCL13 , CXCL16 , CCL1, CCL2 , CCL3 , CCL4 , CCL5 , CCL7 , CCL11 , CCL13 , CCL16 , CCL17 , CCL1 , CCL21 , CCL22 , CCL24, CCL25, CCL27 , CCL28 o XCL1 de humano; g) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ con un valor IC50 de 1.7 nM o menos; h) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ in vivo; i) reduce la quimiotaxis inducida por CCL20 de humano de células CCR6+ in vitro; j) reduce el progreso de síntomas de artritis en un suj eto ; k) reduce la osteoporosis , erosión ósea o formación de huesos nuevos en un sujeto; 1) reduce los niveles en suero de proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (COMP) en un sujeto; m) reduce los niveles de ARNm de RANKL, RA K, TRAE o catepsina K en un sujeto; n) reduce el progreso de dermatitis atópica en un sujeto; y o) reduce el progreso de dermatitis de contacto alérgica en un sujeto.
14. Un anticuerpo monoclonal anti-CCL20 de humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque se une a un epítopo del CCL20 de humano que comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) los residuos 7-9 de la SEC ID NO: 84; b) los residuos 10-19 de la SEC ID NO: 84; y c) los residuos 20-22 de la SEC ID NO: 84.
15. El anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el epítopo comprende los residuos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-67 y 61-70 de la SEC ID NO: 84.
16. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica: a) la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo o una porción ' de conformidad con la reivindicación 1 o 14; b) la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo o una porción de conformidad con la reivindicación 1 o 14; o c) la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma y la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo o una porción de conformidad con la reivindicación 1 o 14.
17. El uso de (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma o (c) ambas, de un anticuerpo o una porción de conformidad con la reivindicación 1 o 14, -como un medicamento.
18. Un vector recombinante , caracterizado porque comprende (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma, (b) una secuencia ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma o (c) ambas, de un anticuerpo o una porción de conformidad con la reivindicación 1 o 1 .
19. Una célula hospedante, caracterizada porque comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos 'que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígenos de la misma de un anticuerpo o una porción de conformidad con la reivindicación 1 o 14, la primera secuencia de ácidos nucleicos está vinculada de manera operable a un elemento; de control de expresión y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que, codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígenos de la misma del anticuerpo o una porción, la segunda secuencia de ácidos nucleicos está vinculada de manera operable a un elemento de control de expresión.
20. Un método para hacer un anticuerpo anti-CCL20 de humano o una porción de unión a antígenos del mismo, caracterizado porque comprende mantener la célula hospedante de conformidad con la reivindicación 19 bajo condiciones que son apropiadas para la expresión del anticuerpo o uña porción.
21. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo monoclonal o una porción de unión antígenos de conformidad con la reivindicación 1 o 14 y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.
22. El uso de un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 12, 14 o 15 o la composición de conformidad con la reivindicación 21 como un medicamento.
23. El uso de un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 12, 14 o 15 o la composición; de conformidad con la reivindicación 21 para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo que consiste de: una condición asociada con el CCR6 , una condición autoinmune o inflamatoria, cáncer, malignidad de células B, adenocarcinoma de mama, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma pancreático, carcinoma papilar de tiroides, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Grave, vitíligo, hipertiroidismo, hepatitis crónica, infección por virus de papiloma humano de la cerviz, micosis fungoide, osteoporosis , o enfermedad periodontal, lesiones articulares de extremidades distales al codo o la rodilla, eritema, hinchamíento, niveles en suero incrementados de proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (COMP) , niveles incrementados de ARNm del receptor activador para el ligando del factor nuclear kB (RA KL) , niveles incrementados de ARNm del receptor activador para el factor nuclear kB (RÁÑK) , niveles incrementados de ARNm de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) , niveles incrementados de ARNm de catepsina K, dermatitis atópica y dermatitis de contacto alérgica.
24. El uso de un anticuerpo monoclonal o ¡una porción de unión a antígenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 12, 14 o 15 o la composición^ de conformidad con la reivindicación 21 para un propósito seleccionado del grupo que consiste en: i a) reducir la quimiotaxis mediada por CCL20 de células CCR6+ en un sujeto; b) reducir la quimiotaxis mediada por CCL20: de células CCR6+ in vitro; c) disminuir los niveles en suero de proteína de matriz oligomérica cartilaginosa (COMP) en un paciente con artritis; d) disminuir los niveles de ARNm del receptor activador para el ligando del factor nuclear kB (RANKL) en el te ido de articulación de un paciente con artritis; e) disminuir los niveles de ARNm del receptor activador para el ligando del factor nuclear kB (RANKL) en el tejido de articulación de un paciente con artritis; f) disminuir los niveles de ARNm del receptor activador para el factor nuclear kB (RANK) en el tejido de articulación de un paciente con artritis; g) disminuir los niveles de ARNm de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) en el tejido de articulación de un paciente con artritis; y H) disminuir los niveles de ARNm de catepsina K en el tejido de articulación de un paciente con artritis.
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