JP5198704B2 - エオタキシンに対するヒト抗体及びそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明はエオタキシン−1に対する特異的結合メンバー、とりわけヒト・エオタキシン−1に対するヒト抗体、及び特にエオタキシン−1活性を中和するものに関する。本発明の好ましい態様は、本明細書中でCAT−212と呼ばれるscFv断片の、並びに本明細書中でCAT−213と呼ばれるIgG4抗体の抗体VH及びVLドメインを利用する。より好ましい態様は、CAT−212/−213 VH及び/又はVLドメインの1以上の相補性決定領域(CDRs)、特に他の抗体のフレームワーク領域内のVH CDR3を利用する。本発明のさらなる側面は、本発明の特異的結合メンバーを含む組成物、及び治療によるヒト又は動物の体の処置法を含む、エオタキシンの阻害又は中和方法におけるそれらの使用のために提供される。
【0002】
エオタキシン−1は、主に好酸球に発現される特異的レセプター、CCR3に結合する化学走性誘因タンパク質である。抗エオタキシン−1抗体は好酸球増加症及び炎症部位への好酸球の動員の阻害に使用される。1の態様において、本発明は、scFvファージ・ディスプレイ・ライブラリーに由来した、CAT−212と呼ばれるヒト抗体断片を提供する。CAT−212は機能に関連した(走化作用)バイオ・アッセイにおいて650pMのIC50でヒト・エオタキシンを強力に中和する。CAT−212は15pMのKD を持つ高い親和性を持つ。さらなる態様において、ここで前記CAT−212 scFvをヒトIgG4として再編成し、その抗体をCAT−213と呼ぶ。CAT−213はCAT−212と同様の能力を持ち、そして走化作用アッセイにおいて700pMのIC50でヒト・エオタキシンを中和する。CAT−213もオブアルブミン感作マウスにおける単核細胞走化作用を妨げる。CAT−212及びCAT−213は共にアレルギー性炎症のインビボ・モデルにおいて好酸球の増加を強力に妨げる。
【0003】
好酸球は通常、総末梢血白血球の1〜3%の割合を占める。好酸球の著しい集積は好酸球増加症として知られる症状であり、多くの病気、例えばアレルギー性疾患、寄生生物による感染症、及び癌において引き起こされうる(Rothenburg 1998 )。好酸球増加症は血液1ミリ四方当たり350超の好酸球を有する場合に分類され、そしていくつかの症例においてそのレベルは1ミリ四方当たり5000細胞超まで上昇する。罹患した個人の末梢血における集積と同様に、好酸球は体のあらゆる組織に選択的に集積しうる。前述の好酸球増加症は好酸球の炎症誘発性作用により有害である。好酸球増加の状態、例えば喘息において、浸潤している好酸球の数と疾患の重度の間にしばしば相関関係が存在する。
【0004】
それらが延長された期間生き延びることができる炎症部位での好酸球の集積はそれらが直に接する環境において産生されるサイトカインの組合せに依存している。好酸球は多くの毒性の炎症メディエータを含有し、それらメディエータは顆粒の中に貯蔵されている。多数のサイトカインの1以上による活性化により、好酸球は脱顆粒してカチオン性タンパク質、例えば主要な塩基タンパク質、好酸球由来の神経毒、及び好酸球性ペルオキシダーゼを含むこれらの毒素を放出する。さらに、活性化好酸球は化学走性誘因物質、脂質メディエータ、例えばロイコトリエン、及び幅広い炎症性サイトカインをも放出する。これらの物質の大部分は組織、例えば喘息における気道上皮において重大な細胞障害性作用を有する(Rothenberg, 1998 )。
【0005】
ケモカインは相同性の8〜10kDa のタンパク質のグループであり(Luster, 1998)そのグループは保存されたシステイン残基の相対位置に基づいてファミリーに細分される。ケモカインは、それらが通常の発達及び恒常性、そして重要なことには炎症の間に白血球の移動のための指向性シグナルを提供するといった、血液から組織への白血球の血管外遊走の仲介に重要な役割を担う。さまざまな走化性物質、例えばロイコトリエンB4 、インターロイキン、及び細菌性産物が存在し、それらは組織に好酸球を動員しうるが、ケモカイン、エオタキシン−1だけが特異的に好酸球の動員を示している。
【0006】
ヒト・エオタキシンはケモカインのβ又はCC(Cys−Cys)サブファミリーの急速に拡大しているグループのメンバーである。このグループの分子は、4つの保存されたシステインの最初の2つが隣接し、かつ20〜75%の配列の同一性を共有することを特徴とする。このファミリーのメンバーはエオタキシン−2(Forssmann et al., 1997; White et al, 1997 )、エオタキシン−3(Shinkai et al, 1999 )、単球化学走性誘因タンパク質(MCP)−1,MCP−2,MCP−3,MCP−4,MCP−5(Van coillie et al, 1999 )、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)−1,MIP−1β,TARC,LARC,I309、及びRANTESを含む。
【0007】
エオタキシン−1は8.4kDa 、74アミノ酸のタンパク質であり、アレルゲン免疫感作モルモットからの気管支肺胞洗浄液中に最初に検出された(Griffiths-Johnson et al, 1993; Jose et al, 1994a)。前記分子は、その皮下注入部位で好酸球の十分な集積を誘導する強力な化学走性誘因物質として最初に同定された。モルモットの遺伝子が最初にクローニングされ(Jose et al, 1994b, Rothenberg et al, 1995a)、続いてマウスの遺伝子がクローニングされた(Rothenberg et al, 1995b )。ヒト・エオタキシン遺伝子が続いて同定され(Kitaura et al, 1996; Garcia-Zepeda et al, 1996; Ponath et al, 1996)、そしてラットの相同体はつい最近、クローニングされた(Williams et al, 1998)。ヒト・エオタキシンはマウス及びモルモット・エオタキシンと61%の同一性を有し、そしてラット・エオタキシンと62%の同一性を有する。そのヒト遺伝子はクロモソーム17上に位置し、そして3のエクソンと2のイントロンを含む。前記遺伝子の5′フランキング領域は、AP−1,NFBに対する結合部位、インターフェロン・ガンマ応答エレメント、及びグルココルチコイド・レセプターを含む多数のコンセンサス調節エレメントを含み、遺伝子発現がサイトカイン並びにグルココルチコステロイドにより調節されていることを示唆している。
【0008】
エオタキシンは、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、T−リンパ球、単球、及びマクロファージを含むさまざまな正常の細胞型により産生される(Cook et al, 1998; Ponath et al, 1996a; Li et al, 1997 )。好酸球はエオタキシンに関して主要な効果細胞であるが、好酸球は自身でエオタキシンを生産もし、そしてそれを細胞内顆粒内に貯蔵する(Nakajima et al, 1998)。好酸球からのエオタキシンの放出は、炎症状態における好酸球の局所集積に寄与する。エオタキシン発現は多くの炎症誘発性メディエータ、例えば腫瘍壊死因子−アルファ、インターフェロン、及びインターロイキン−1により異なる細胞型から誘発される。
【0009】
エオタキシン−2は最近クローニングされた(Forssmann et al, 1997; White et al, 1997)。それはエオタキシンと近い配列相同性を示さず、39%のアミン酸同一性しか共有しない。しかしながら、エオタキシンと同様に、10分の1の効果にもかかわらず好酸球及び好塩基球に対する化学走性誘因物質である。エオタキシン−3も最近同定されたが(Shinkai et al, 1999 )、その効果はエオタキシンで観察されたそれの10分の1と思われる。したがって、エオタキシン−3は比較的高濃度において好酸球及び好塩基球に対して走化作用を持つ(Kitaura et al, 1999 )。
【0010】
一般的に、ケモカイン・レセプターへのケモカインの結合において相当な冗長が存在する。典型的には、いくつかの異なるCCケモカインが1種類のケモカイン・レセプターに結合でき、またその逆に、1種類のCCケモカインがいくつかの異なるケモカイン・レセプターに結合できる。ケモカイン・レセプター、CCR3は、エオタキシン、MCP−2,MCP−3,MCP−4,RANTES、エオタキシン−2、及び3を含む多くのリガンドを有する。エオタキシンがこれらのうちで最も重要であると思われる。リガンドの大部分、例えばMCP−2,MCP−3、及びRANTESはCCR3に対して親和性が比較的低く、そのためCCR3仲介事件の誘発において特に効果的ではない。それに比べ、エオタキシンはCCケモカイン・レセプター3(CCR3)に比較的高い親和性、Kd=0.52nMで結合する(Ponath et al, 1996a )。さらに、エオタキシンは、CCR3だけに結合し、そしてあらゆる他のケモカイン・レセプターに結合しない。すなわちエオタキシンはCCR3に特異的であるところでCCケモカインの間では独特である。
【0011】
ヒトCCR3はクローニングされ(Combadiere et al, 1995; Daugherty et al, 1996 )、そしてそれは355アミノ酸の、41kDa の、7の膜貫通ドメインを持つタンパク質である。それはその細胞外ドメインに4のシステインを含み、そしてG−タンパク質を介したリン酸化の潜在的部位である細胞質内テール中に8のセリン/スレオニン残基を含む。CCR3はN−連結グリコシル化の潜在的部位を持たない。ヒト・レセプターはマウス及びヒト・エオタキシンの両方を同じ親和性で結合する(Daugherty et al, 1996 )。マウス(Gao et al, 1996 )及びモルモット(Sabroe et al, 1998)CCR3が続いてクローニングされ、そしてヒトCCR−3とそれぞれ69及び67%のアミノ酸同一性を共有する。
【0012】
ヒトCCR−3は好酸球(Ponath et al, 1996b )及び好塩基球(Uguccioni et al, 1997; Yamada et al, 1997 )において主に発現される。それはTH 2型T細胞(Sallusto et al, 1997)、中枢神経系のミクログリア細胞(He et al, 1997)、及び樹状細胞(Rubbert et al, 1998 )でも見られる。エオタキシンは化学走性誘因物質であり、そしてCCR3発現細胞の活性化物質である。好酸球上のCCR3への結合により、エオタキシンは細胞内カルシウム動員、細胞内アクチン重合化の開始、インテグリン発現の上方調節、及び酸素ラジカル産生の誘発を引き起こす(Tenscher et al, 1996; Elsner et al, 1996)。CCR3は、1細胞当たり40,000(Daugherty et al, 1996)〜400,000(Ponath et al, 1996b)のレセプターを持つ好酸球において特に高レベルで発現される。多くのCCR3リガンド、例えばMCP−2,MCP−3,MCP−4、及びRANTESもCCR3以外のケモカイン・レセプターに結合し、それによって多種多様な細胞型の化学走性誘因を仲介する。それに比べ、CCR3に対するその高い選択性のため、エオタキシンは特に化学遊走を誘発することができ、そしてCCR3発現細胞、例えば好酸球を活性化することができる。
【0013】
エオタキシンの効果の阻止が治療的に使用されうる一連の証拠が増えている。ウサギ又はヤギ抗体を用いたインビボにおけるいくつかの研究が存在する。その一例の研究は静中(iv)投与した抗エオタキシン抗体の効果を調べた。Gonzalo et al (1996)は20μgの抗エオタキシン・ウサギ・ポリクローナル抗血清ivをオブアルブミン免疫マウスに注射した。免疫に先立つ抗体投与は、気管支肺胞洗浄液中の好酸球集積の数により計算した場合、56%まで好酸球増加を減少させた。
【0014】
局所的に投与された抗エオタキシン抗体の効果の多くの報告も存在する。Humbles et al (1997)は、前もって 111In標識好酸球の注入を受けた実験未使用のモルモット(naive guinea pig)の皮内へのモルモット・エオタキシン(10ng)とウサギ・ポリクローナル抗エオタキシン抗血清(10μl)の同時注入について記載した。前記ポリクローナル抗体は局所的な好酸球集積を完全に阻止することができた。同様に、Teixeira et al (1997)は、好酸球増加症のマウス・モデルを使用し、そのマウスの4〜8時間の能動性皮内アナフィラキシー反応部位に皮内的にマウス・エオタキシン(1〜30pmol)をウサギ・ポリクローナル抗エオタキシン抗血清と同時注入した。抗血清の5%及び20%希釈物は、好酸球の動員をそれぞれ45%及び95%まで阻止した。加えて、Sanz et al (1998)は、皮内IL−4注入により内生的に産生されたエオタキシンによる好酸球集積において調べた。抗エオタキシン・ポリクローナル抗血清は、IL−4に対する応答の後期(24〜28時間)に54%の阻害を示したが、しかし早期(0〜4時間)には示さなかった。
【0015】
健康な状態及び好酸球が仲介する疾患の状態におけるエオタキシンの役割をさらに理解するために、標的遺伝子の破壊を使用してエオタキシンを欠くマウスを生み出した(Rothenberg et al 1997 )。それらのマウスを感作し、そしてオブアルブミンにより免疫した場合、好酸球の数を、野生型マウスに比べエオタキシン無発現マウスの肺からのBAL中で70%まで減少させた(免疫後18時間)。これは、エオタキシンが喘息モデルにおいて抗原免疫後、好酸球の動員の程度を高めることを証明している。Nakamura et al. (Am. J. Resp. & Crit. Care Med. (1999) 160 : 1952-1956)はエオタキシン・レベルと喘息の関連、及び肺機能との反比例を証明した。
【0016】
エオタキシンmRNAは多くの組織により恒常的に産生され、そこで好酸球のホーミングによる役割を担うことが示唆されている(Rothenberg et al 1995 )。エオタキシン無発現マウスにおいて、ひどい組織学的異常はエオタキシンの発現が知られている臓器を含めた全ての臓器で検出されなかった。同様に、白血球の表現型における変化も検出されなかった。しかしながら、総好酸球カウントは、野生型に比べて上記無発現マウスにおいて3分の1まで減少し、エオタキシンが末梢循環における好酸球の基準の数を決定する役割を担っていることも示唆された(Rothenberg et al 1997 )。
【0017】
本発明による特異的結合メンバーは、エオタキシンが一因となるさまざまな疾患及び病気における治療的な可能性を伴う、エオタキシンへの結合及び中和に有用である。代表的な疾患及び病気をこれ以降で明確にする。
【0018】
1の側面において、本発明はヒト・エオタキシンに結合し、かつCAT−212 VHドメイン(配列番号2)、及び/又はCAT−212 VLドメイン(配列番号4)を含む特異的結合メンバーを提供する。
【0019】
一般的に、VHドメインはVLドメインと組合わされて抗体の抗原結合部位を提供するが、これ以降で明確にするとおりVHドメイン単独で抗原の結合に使用されうる。1の好ましい態様において、抗体の抗原結合部位をCAT−212 VH及びVLドメインの両方を含んで形成するために、CAT−212 VHドメイン(配列番号2)をCAT−212 VLドメイン(配列番号4)と組合わせる。他の態様において、CAT−212 VHドメインをCAT−212 VLを除いたVLドメインと組合わせる。L鎖の乱交雑は本技術分野で十分に確立されている。
【0020】
1以上のCDRsがCAT−212 VH又はVLドメインから選ばれ、そして好適な構造に組込まれる。これはこれ以降で明確にする。CAT−212 VH CDR1,2、及び3をそれぞれ配列番号5,6、及び7に示す。CAT−212 VL CDR1,2、及び3をそれぞれ配列番号8,9、及び10に示す。VH及びVLドメイン、並びにCDRの変異体の配列を本明細書中に示し、そしてそれを配列代替法又は変異及び配列決定により得られる、エオタキシンに対する特異的結合メンバーに利用する。上述の方法は本発明により提供されもする。
【0021】
その配列が特に本明細書中に開示されるVH及びVLドメインのいずれかの可変ドメイン・アミノ酸配列変異体を明確にされるとおり、本発明により利用しうる。特定の変異体は、1以上のアミノ酸配列の変更(アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び/又は挿入)を、おそらく約20未満、約15未満、約10未満又は約5未満、4,3,2又は1含む。変更は、1以上の構造領域、及び/又は1以上のCDR中に作られる。
【0022】
本発明による特異的結合メンバーは抗原への結合に関していずれかの特異的結合メンバーと競合するものであり、この両者は上記抗原に結合し、かつ特異的結合メンバー、本明細書中に開示されるVH及び/又はVLドメイン、又は本明細書中に開示されるVH CDR3、あるいはそれらいずれかの変異体を含む。結合要素間の競合は、例えばELISAの使用及び/又は1の結合要素への特定のリポーター分子のタギングによりインビトロにおいて容易にアッセイされ、それらのアッセイは不タギング結合要素の存在を検出させ、同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。
【0023】
よって、本発明のさらなる側面は、エオタキシンへの結合に関してCAT−212又はCAT−213と競合するヒト・抗体の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。
【0024】
エオタキシンに対する抗体であり、かつエオタキシンへの結合に関してCAT−212又はCAT−213と競合しうる抗体を得るためにさまざまな方法が本技術分野で利用可能である。
【0025】
さらなる側面において、本発明は前記抗原に結合しうる1以上の特異的結合メンバーを得る方法を提供し、その方法は本発明による特異的結合メンバーのライブラリーを上記抗原と接触させ、そして上記抗原と結合しうる1以上の上記ライブラリーの特異的結合メンバーを選択することを含む。
【0026】
上記ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面に提示され、それぞれの粒子は、その表面に提示した抗体VH可変ドメインをコードする核酸を含み、あるいは、存在するならば提示されたVLドメインをコードする核酸をも含む。
【0027】
上記抗原を結合することができる特異的結合メンバーの選択、そしてそのバクテリオファージ粒子上への提示に続いて、上記選択された特異的結合メンバーを提示するバクテリオファージ粒子から核酸を採取する。上述の核酸は、この後に続く、上記選択された特異的結合メンバーを提示するバクテリオファージ粒子から得られた核酸配列を有する核酸からの発現による特異的結合メンバー又は抗体VH可変ドメイン(場合により抗体VL可変ドメイン)の製造に使用される。
【0028】
上記選択された特異的結合メンバーの抗体VH可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VH可変ドメインは、そのVHドメインを含む特異的結合メンバーとして単離された形で提供される。エオタキシンを結合する能力がさらに試験され、そしてエオタキシンへの結合に関してCAT−212又はCAT−213と競合する能力もさらに試験される。エオタキシンを中和する能力はこれ以降に明確にするとおり試験される。
【0029】
本発明による特異的結合メンバーはCAT−212又はCAT−213の親和性と同じにエオタキシンを結合する。
【0030】
本発明による特異的結合メンバーはCAT−212又はCAT−213の力価と同じにエオタキシンを中和する。
【0031】
さまざまな特異的結合メンバーの結合親和性及び中和力価は適当な条件下で比較される。
【0032】
抗体配列に加え、本発明による特異的結合メンバーは、例えばペプチド又はポリペプチド、例えば折り畳みドメインの形成、あるいは抗原結合能力に加えて他の機能的特徴を分子に与える他のアミノ酸を含む。本発明の特異的結合メンバーは検出可能な標識を担持するか又は毒素又は酵素に(例えばペプチジル結合又はリンカーを介して)結合する。
【0033】
さらなる側面において、本発明は、本発明による特異的結合メンバー、VH又はVLドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供し、さらに本発明の特異的結合メンバー、VHドメイン、及び/又はVLドメインの製造方法を提供する、ここで上記製造方法は上記特異的結合メンバー、VHドメイン、及び/又はVLドメインの産生を引き起こす条件下で上記核酸を発現させ、そしてそれを回収することを含む。
【0034】
本発明による特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の体の治療方法又は診断方法、例えばヒト患者の疾患又は病気の(予防的処置を含みうる)治療方法に使用され、その治療方法は上記患者への有効量の本発明の特異的結合メンバーの投与を含む。本発明により治療されうる症状は本明細書中の他のところで明確にされるものを含む。
【0035】
本発明のさらなる側面は、本明細書中に開示される、抗体VH可変ドメイン及び/又はVL可変ドメインをコードする、一般に単離された核酸を提供する。
【0036】
本発明の他の側面において、本明細書中に開示されたVH CDR又はVL CDR配列を、特に配列番号5,6及び7から選ばれるVH CDR又は配列番号8,9、及び10から選ばれるVL CDR、最も好ましくはCAT−212 VH CDR3(配列番号7)をコードする、一般に単離された核酸を提供する。
【0037】
さらなる側面は本発明の核酸により形質転換された宿主細胞を提供する。
【0038】
より一層さらなる側面は抗体VH可変ドメインの製造方法を提供し、上記製造方法はコード核酸から発現を引き起こすことを含む。上述の方法は上記抗体VH可変ドメイン産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【0039】
VL可変ドメイン、並びにVH及び/又はVLドメインを含む特異的結合メンバーの製造のための類似の方法を本発明のさらなる側面として提供する。
【0040】
製造方法は上記産物の単離及び/又は精製のステップを含む。
【0041】
製造方法は少なくとも1の付加成分、例えば医薬として許容される賦形剤を含む組成物への上記産物の配合を含む。
【0042】
本発明のこれらの、そして他の側面を以下により詳細に説明する。
【0043】
専門用語
特異的結合メンバー
これはお互いに対して結合特異性を有する分子の組合せメンバーを示す。特異的に結合する組合せメンバーは自然に誘導されるか又は完全に若しくは部分的に合成により製造される。分子の組合せの一方のメンバーは分子の組合せの他方のメンバーに特異的に結合するその表面の領域又は間隙を持ち、そしてそれ故に分子の組合せの他方のメンバーの特定の空間的及び極性の編成に相補的である。よって、対のメンバーは互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合の組合せの種類の例は抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン・レセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質である。本出願は抗原−抗体型の反応に関与する。
【0044】
抗体
これは天然にせよ、部分的若しくは完全に合成により製造されたにせよ免疫グロブリンを示す。前記用語は、抗体結合ドメインであるか又は抗体結合ドメインに対して実質的に相同体である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質にも及ぶ。抗体の例は、免疫グロブリン・アイソタイプ及びそれらのアイソタイプのサブクラス;抗原結合ドメイン、例えばFab,scFv,Fv,dAb,Fdを含む断片;並びにダイアボディーである。
【0045】
モノクローナル及び他の抗体を得、そして組換えDNA技術の手法を使用し、他の抗体又は元の抗体の特異性を維持するキメラ分子を製造することが可能である。上記手法は別の免疫グロブリンの定常部又は定常部プラス構造部への抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域(CDRs)をコードするDNAの導入を含む。例えば、EP−A−184187,GB 2188638A又はEP−A−239400を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は遺伝子変異又は他の変更の対象であり、その変異又は変更は産生される抗体の結合特異性を変化させるかどうか分からない。
【0046】
抗体が多くの手段により修飾されうる場合、用語「抗体」は所望の特異性を持つ結合ドメインを有するあらゆる特異的結合メンバー又は物質に及ぶと解釈されるべきである。よって、この用語は天然か又は完全若しくは部分的合成かにかかわらず免疫グロブリンの結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含めた、抗体断片、誘導体、機能的同等物及び抗体の相同体に及ぶ。それ故に、免疫グロブリン結合ドメイン又は他のポリペプチドに融合した同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はEP−A−0120694及びEP−A−0125023に記載されている。
【0047】
完全な抗体の断片が抗原結合の機能を果しうることは示されている。結合断片の例は(i)VL,VH,CL、及びCH1ドメインから成るFab断片;(ii)VH及びCH1ドメインから成るFd断片;(iii )単独の抗体のVL及びVHドメインから成るFv断片;(iv)VHドメインから成るdAb断片(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989));(v)単離されたCDR領域;(vi)2の連結したFab断片を含む二価の断片であるF(ab′)2断片;(vii )1本鎖Fv分子(scFv)であり、ここでVHドメイン及びVLドメインは、ペプチド・リンカーにより連結され、そのリンカーが抗原結合部位の形成に関係する2つのドメインをもたらす。(Bird et al, Science, 242, 423-426, 1998; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1998);(viii)二重特異性1本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965);並びに(ix)「ダイアボディー」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性(multispecific)断片(WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 )である。Fv,scFv又はダイアボディー分子はVH及びVLドメインを連結するジスルフィド結合の組み込みにより安定化されている(Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996)。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニボディー(minibodies)をも作製する(S.Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996)。
【0048】
ダイアボディーはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは免疫グロブリンL鎖の結合領域を含む第1ドメイン、及び免疫グロブリンH鎖の結合領域を含む第2ドメインを含み、この2つのドメインは(例えばペプチド・リンカーにより)連結されているが、抗原結合部位の形成に互いに関与することはできない:抗原結合部位は多量体中のあるポリペプチドの第1ドメインと多量体内の他のポリペプチドの第2ドメインの関連性により形成される(WO94/13804)。
【0049】
二重特異性抗体が使用されるべき場合、それらは従来の二重特異性抗体であり、さまざまな方法(Hollinger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechol. 4, 446-449 (1993))、例えば化学的又はハイブリッド・ハイブリドーマから製造されるか、あるいは先に触れた二重特異性抗体断片のいずれかである。ダイアボディー及びscFvはFc領域を伴わず、抗イディオタイプ反応の作用を大きく低下させた可変ドメインだけを用いて構築される。
【0050】
二重特異性の完全な抗体に対して二重特異性ダイアボディーは特に有用でもある、なぜならそれらは容易にE.コリ(E.coli)中で構築されそして発現されるからである。適当な結合特異性のダイアボディー(及び他のポリペプチド、例えば抗体断片の大部分)はライブラリーからのファージ・ディスプレイ(WO94/13804)を用いて容易に選ばれる。ダイアボディーの1のアームが、例えば抗原Xに対する特異性を持ち一定に保たれる場合、他のアームを変え、そして適当な特異性の抗体が選ばれるところのライブラリーが作られる。二重特異性完全抗体はknobs−into−holes工学により作られる(J.B.B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996)。
【0051】
抗原結合ドメイン
これは抗原に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全体に相補的である領域を含む抗体の一部を示す。抗原が巨大な場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し、その部分をエピトープと呼ぶ。抗原結合ドメインは1以上の抗体可変ドメインにより提供される(例えばVHドメインから成るいわゆるFd抗体断片)。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体L鎖可変領域(VL)及び抗体H鎖可変領域(VH)を含む。
【0052】
特異性
これは、特異的結合の組合せの一方のメンバーがその特異的結合相手以外の分子へのあらゆる有意な結合も示さないであろう状況に関して使用される。前記用語は、例えば抗原結合ドメインが多数の抗原に担持される特定のエピトープに対して特異的であり、この時、抗原結合ドメインを担持する特異的結合メンバーがそのエピトープを担持するさまざまな抗原に結合しうるであろう場合にも適用される。
【0053】
含む(comprise)
これは含める(include)の意味で一般的に使用される、すなわち、1以上の性質又は成分の存在を許すことである。
【0054】
分離された
これは本発明の特異的結合メンバー又はその結合メンバーをコードする核酸が本発明と合致しているであろう状態に関する。メンバー及び核酸は、それらが発見された自然環境、又はそれらが製造される(例えば細胞培養)環境、ここで上記製造がインビトロ又はインビボで実施される組換えDNA技術による場合において伴う自然に結び付けられる物質、例えば他のポリペプチド又は核酸を含まないか又は実質的に含まない。メンバー及び核酸は希釈剤又はアジュバントと一緒に配合され、そして事実上は単離されたままである−例えば上記メンバーは免疫アッセイに使用するためのマイクロタイター・プレートをコートするために使用されるゼラチン又は他の担体と普通に混合されるか、あるいは診断又は治療に使用される場合、医薬として許容される担体又は希釈剤と混合される。特異的結合メンバーは普通にか又は異種真核生物細胞(例えば、CHO若しくはNSO(ECACC 85/10503)細胞)の系によるかのいずれかでグリコシル化されるか、あるいはそれらは(例えば原核生物細胞における発現により製造された場合)グリコシル化されない。
【0055】
「詳述したような」により、本発明の関連CDR又はVH若しくはVLドメインがその配列が本明細書中で説明されている指定の領域と同一であるか又は非常に類似しているかのいずれかであろうことを意味する。「非常に類似した」により、1〜5、好ましくは1〜4、例えば1〜3又は1若しくは2、あるいは3又は4の置換がCDR及び/又はVH若しくはVLドメイン内で起こりうることが予期される。
【0056】
本発明のCDRを担持するための構造は一般的に抗体H鎖又はL鎖、あるいはその実質的なタンパク質であり、それらの中で上記CDRは再配列免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のVH及びVL抗体可変ドメインのCDRに対応する位置に配置される。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は(Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987 、及び現在インターネットで利用可能なその最新のもの(http://immno.bme.nwu.edu))を参照することにより決定される。
【0057】
好ましくは、本明細書中で詳述したようなCDRアミノ酸配列がヒト可変ドメイン又はその実質的なタンパク質中のCDRとして担持される。本明細書中で詳述したようなVH CDR3配列が本発明の好ましい態様を提供し、そしてこれらのそれぞれがヒトH鎖可変ドメイン又はその実質的なタンパク質中のVH CDR3として担持されることが好ましい。
【0058】
本明細書において利用される可変ドメインはいずれかの生殖細胞系列又は再配列ヒト可変ドメインから得られるか、あるいは既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づいた合成可変ドメインである。本発明のCDR配列(例えばCDR3)は組換えDNA技術を用いて、CDR(例えばCDR3)の欠いた可変ドメインのレパートリー内に導入される。
【0059】
例えば、Marks達(Bio/Technology, 1992, 10 : 779-783)は抗体可変ドメインのレパートリーの製造方法を記載し、上記方法は、上記可変ドメイン領域の5′末端か又はその付近に対するコンセンサス・プライマーをヒトVHコンセンサス・プライマーによる遺伝子の第3構造領域への結合に使用してCDR3を欠くVH可変ドメインのレパートリーを提供する。Marks達は、どうやってこのレパートリーが特定の抗体のCDR3と組合されるかをさらに記載している。類似の技術を用いて、本発明のCDR3誘導配列をCDR3を欠くVH又はVLドメインのレパートリーと混合し、そして上記の混合した完全なVH又はVLドメインを同起源のVL又はVHドメインと組合せて本発明の特異的結合メンバーを提供する。次に上記レパートリーを、好適な特異的結合メンバーを選択しうるように好適な宿主系、例えばWO92/01047のファージ・ディスプレイ系を用いて提示させる。レパートリーは104 を上回る個々のメンバーから、例えば106 〜108 又は1010メンバーのあらゆるメンバーから成る。
【0060】
類似の混合又は組合せ技術がStemmer(Nature, 1994, 370 : 389-391 )によっても開示され、上記Stemmerはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、上記方法が抗体産生に使用されうることを観察している。
【0061】
さらなる選択肢は、可変ドメイン全体に突然変異を引き起こすための1以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダムな突然変異誘発を用いた、本発明のCDR誘導配列を担持する新規VH又はVL領域の産生である。上述の技術はGramら(1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 : 3576-3580 )により記載されており、Gram達は変異性PCRを用いた。
【0062】
使用されうる他の方法はVH又はVL遺伝子のCDR領域に対する直接的な突然変異誘発である。上述の技術はBarbasら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 : 3809-3813 )及びSchierら(1996, J. Mol. Biol. 263 : 551-567)により開示されている。
【0063】
上記技術の全てはそういうものとして本技術分野において知られ、そしてそれら自体は本発明の一部を形成しない。当業者は、本技術分野における所定の方法論を用いた、本発明の特異的結合メンバーを提供するための上述の技術を使用できる。
【0064】
本発明のさらなる側面は、エオタキシン抗原に対して特異的な抗体の抗原結合ドメインを得るための方法を提供し、この方法は、本明細書中に示したVHドメインのアミノ酸配列中の1以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入の方法により上記VHドメインのアミノ酸配列変異体を準備し、場合により、そうして準備された上記VHドメインを1以上のVLドメインと組合せ、そして上記VHドメイン又はVH/VL組合せ物、並びに組合せ物を特異的結合メンバー又は抗体の抗原結合ドメインのエオタキシン抗原に対する特異性の確認のために、そして場合により好ましい特性の1以上、好ましくはエオタキシン活性中和能力について試験することを含む。上述のVLドメインは本明細書中で詳述したようなアミノ酸配列を有する。
【0065】
本明細書に開示のVLドメインの配列変異体の1以上を利用する類似の方法を1以上のVHドメインと組合せる。
【0066】
本発明のさらなる側面はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーの製造方法を提供し、上記方法は以下の:
(a)CDRコード領域を欠くか又は置き換えられるべきCDR3を含むかのいずれかであるVHドメインをコードする核酸の開始レパートリーを準備し;
(b)VHドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供するために、上記レパートリーを本明細書中に詳述したようなアミノ酸配列をコードする供与核酸と、上記供与核酸が上記レパートリー中にCDR3領域を挿入するようなVH CDR3のために組合せ;
(c)上記産物レパートリーの核酸を発現させ;
(d)エオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーを選択し;そして
(e)上記特異的結合メンバー又はそれをコードする核酸を回収する、
を含む。
【0067】
同様に、類似の方法が利用され、ここで、本発明のVL CDR3をCDRコード領域を欠くか又は置き換えられるべきCDR3を含むかのいずれかのVLドメインをコードする核酸のレパートリーと組合せる。同じように、1以上又は全ての3のCDRをVH又はVLドメインのレパートリー内に移植し、次にそれを特異的結合メンバーか又はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーかについて選別する。
【0068】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも3のCDR領域を、それらの介在性構造領域と一緒に含むであろう。好ましくは、上記部分は第1及び第4構造領域のいずれか又は両方の少なくとも約50%をも含み、上記の50%は第1構造領域のC末端50%及び第4構造領域のN末端50%である。さらなる可変ドメインの実質的な部分のN末端又はC末端の残基は天然の可変ドメイン領域に関連しないものである。例えば、組換えDNA技術により作り上げられる本発明の特異的結合メンバーの構築はクローニングを容易にするために導入されたリンカーによりコードされるNB又はC末端残基の導入、あるいは他の操作ステップによりもたらされる。他の操作ステップは、本発明の可変ドメインを、免疫グロブリンH鎖、他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディーの製造において)又は以下により詳細に明記したタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に連結するためのリンカーの導入を含む。
【0069】
本発明の好ましい側面において、VH及びVLドメインの1部を含む特異的結合メンバーが好ましいが、VH又はVLドメイン配列のいずれかに基づいた単独の結合ドメインが本発明のさらなる側面を形成する。単独の免疫グロブリン・ドメイン、特にVHドメインは特異的な様式により標的抗原の結合が可能であることが知られている。いずれかの1本鎖特異的結合ドメインの場合において、それらのドメインはエオタキシンを結合可能な2の特異的結合メンバーの形成が可能な相補的ドメインに関する選別に使用される。
【0070】
これはWO92/01047に開示されるいわゆる階層型二重組合せ法(hierarchical dual combinatorial approach)を用いたファージ・ディスプレイ選別法により達成され、上記方法において、H又はL鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを他方の鎖(L又はH)をコードするクローンの完全なライブラリーの感染に使用し、そして得られた2本鎖特異的結合メンバーを、例えばその参考文献中に記載されるものであるファージ・ディスプレイ技術により選別する。この技術も上記にMarksらにより開示されている。
【0071】
本発明の特異的結合メンバーは抗体定常部又はその一部をさらに含む。例えば、VLドメインはそのC末端でヒトCK 又はCλ鎖、好ましくはCλ鎖を含む抗体L鎖定常部に付着する。同じように、VHドメインに基づく特異的結合メンバーは、そのC末端でいずれかの抗体アイソタイプ、例えばIgG,IgA,IgE、及びIgM、並びにあらゆるアイソタイプのサブクラス、特にIgG1及びIgG4から誘導された免疫グロブリンH鎖の全体又は一部に付着する。IgG4が好ましい。本発明の特異的な結合メンバーは検出可能な又は機能的な標識によりラベルされる。検出可能な標識は放射性標識、例えば 131I又は99Tcを含み、これらを抗体画像化の技術分野で知られる慣例の化学反応を用いて本発明の抗体に付着させる。標識は酵素標識、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをも含む。標識は化学成分、例えばビオチンを含み、それらは特定の同系の検出可能な成分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出される。
【0072】
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の患者、好ましくはヒトの診断法又は治療法に使用されるべく設計される。
【0073】
したがって、本発明のさらなる側面は、提供される特異的結合メンバーの投与を含む治療方法、上記特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与のための薬剤の製造における、例えば上記特異的結合メンバーを医薬として許容される賦形剤と一緒に配合することを含む薬剤又は医薬組成物の作製方法における上述の特異的結合メンバーの使用を提供する。
【0074】
抗エオタキシン抗体が治療的利益を提供するために使用される臨床的な適応症は、喘息、湿疹(アトピー性皮膚炎)、及び他のアトピー性疾患、例えば鼻炎、結膜炎、食物アレルギー、好酸球仲介疾患として認識されるアレルギー性大腸炎を含む。実験的証拠がアトピー患者の最も大きな原因として好酸球を支持するので、抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに対しておそらく有効であろう。さらに高い末梢好酸球をカウントする、他のアレルギー性症状、例えばアレルギー性気管支肺アスペルギルス症及び熱帯性好酸球増加症が存在し、それらは抗エオタキシン療法の対象である。
【0075】
特に、本発明による抗エオタキシン療法は、喘息を患う多くの患者に対して明らかな利益を提供するために使用される(Mattoli et al, 1997; Ying et al, 1997; Brown et al, 1998)。英国国民の約10%が喘息を持ち、そして最新の治療は十分に満足ゆくものではない:英国では及びウェールズでは喘息のために年間約2000人が死亡し、そして毎年、喘息を患う人の約6%が(喘息の症状により)入院する。喘息の症状を予防、及びより重い喘息を治療の両方のための、かつて開発された治療の改良された治療に対する明らかな必要性が存在する。抗エオタキシン療法は経口的に、注入により(例えば皮下的又は緊急時は静中に)、吸入により(あらゆる望まれない効果と比較して有益な効果の概要を最適化するため)又は代わりの投与経路により与えられる。上記投与経路は、効果を最適化又は副作用を最小化するために、その疾患に対する特別の考慮により、治療の物理化学的特徴により決定される。
【0076】
皮膚の病気は抗エオタキシンを用いた局所治療により処置されるのに最良である。病気の皮膚は多くの場合高い吸収能力を持つため、局所治療は治療のための最良の経路をよく提供し、ここで体の他の部分に望まれない効果のないことを必要とする。上記の皮膚の病気が体のかなりを覆っている場合、又はその病気が重い(おそらく他の臓器、並びに皮膚に影響を及ぼしている)場合、注入によるか又は他の有効な手段による投与が局所経路より適切である。局所注入は特定の状況下で適切である(上記の項を参照のこと)。
【0077】
抗エオタキシン療法は病院内での使用に制限されないと考えられる。患者は上記治療を自ら施し、そして日々の投薬は複合服薬スケジュールにわたり好まれる。
【0078】
併用治療は、有効な相乗効果を提供するために使用され、特に抗エオタキシン特異的結合メンバーと1以上の抗インターロイキン−5(IL−5)製剤との組合せが使用される。本発明による特異的結合メンバーは1以上のコルチコステロイド、特に1以上の全身性コルチコステロイドとの組合せか又は添加の状態で提供される。1以上の他の抗喘息/抗アレルギー作用物質、特に他の予防薬、例えばクロモグリケート、ロイコトリエン(レセプター)アンタゴニスト、キサンチン、及び持続型気管支拡張薬との併用治療が喘息治療のために利用される。組合せ物の同様の考えが皮膚及び他のアトピー性症状のための抗エオタキシン療法の使用のために適用される。
【0079】
乾癬、じんましん(急性じんましん、慢性再発性じんましん、遅延型圧迫性じんましんを含む)、結節性痒疹、血疹状紅斑性発疹、天疱瘡、晩発性皮膚ポルフィリン症、持続性照射反応(persistent light reaction)、ウェルズ症候群、好酸球性蜂巣炎、薬疹、脈管炎(皮膚兆候)、紫斑病、及び他の皮膚の病気の全ての状態が本発明による抗エオタキシンにより治療されうる。これらの病気は体の大部分に及ぶ、皮膚以外の臓器を含むか、あるいは皮膚に増加した浸透性を与えない。作用部位で有効に局所的に適用されたとしても、その好ましい経路はアトピー性の適応症について示唆されたのと同じ考えから全身的(体じゅう)にである。関連した全身性徴候を伴う重度の皮膚病は、全身治療が局所治療又は局所注入よりも好ましい状況のよい例である。
【0080】
炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病)、並びに好酸球性の大腸炎/腸炎/胃腸炎/シャルマン症候群が抗エオタキシン療法により効果的に治療される。好酸球はこれらの疾患を特徴づける病変中に顕著な細胞型として現れる。
【0081】
脈管炎のいくつかの形態、特に特発性の、Hugues−Storin症候群、チャーグ・ストラウス症候群、気管支中心性肉芽腫症、好酸球性肺炎(レフラー症候群)、持続性肺好酸球増加症、オーメン症候群、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、家族性好酸球増加症、及び特発性過好酸球増加症が抗エオタキシンにより治療されうる。
【0082】
原因不明の好酸球増加症は合併症、例えば肺炎、脈管炎、大腸炎、腸炎、胃腸炎、レフラー心内膜炎、及び心臓弁線維症、並びに結合組織に影響を及ぼす症候群を生じうる。好酸球増加症は悪性疾患(特に、リンパ腫、白血病、及び胃腸の癌)、薬物療法(例えばサイトカイン注入)、並びに慢性疲労症候群にも関連する。抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに使用されうる。同様に、好酸球増加・筋痛症候群、毒性オイル症候群(toxic−oil syndrome)、好酸球増加症による広範性筋膜炎(好酸球性筋膜炎)、及び好酸球性筋炎が抗エオタキシンにより治療されうる。
【0083】
これらの症状において抗エオタキシンによる介入が利益をもたらすので、寄生虫を原因とする好酸球の誘引は害を及ぼす効果である。病原体による好酸球誘引を含む疾患は、原生動物感染症、並びに後生動物感染症、例えばヘルミス感染症及び特に線虫感染症(例えばフィラリア症、鉤虫、回旋糸状虫症、トクソカリアシス、回虫症、及び旋毛虫症、住血線虫症[好酸球性髄膜炎])を含む。無症状性寄生虫症は好酸球仲介疾患の固有の状態の大きな原因となる。
【0084】
抗エオタキシン療法は好酸球以外の細胞、例えば好塩基球のCCR−3発現に影響を及ぼす。
【0085】
本発明により、提供される組成物は個々に投与される。好ましくは、投与は「治療としての有効量」であり、これは患者に恩恵をもたらすのに十分である。上述の恩恵は、少なくとも1の症状の少なくとも1の改善である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間的経過は治療する症状の性質及び重さに依存する。治療の規定、例えば用量の決定等は一般的な開業医及び他の医師の責務である。抗体の適切な用量は当技術分野で周知である;Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Cancer 47 : 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 : 915-922を参照のこと。
【0086】
適確な用量は、上記抗体が診断のためであるか又は治療のためであるか、治療すべき範囲の大きさと位置、上記抗体の厳密な性質(例えば抗体全体、断片又はダイアボディー)、及び上記抗体に付着されたいずれかの検出可能な標識又は他の分子の性質を含む多くの要因に依存する。典型的な抗体の用量は、全身投与については0.5mg〜100gの範囲、局所投与については10μg〜1mgの範囲である。典型的には、上記抗体は抗体全体、好ましくはIgG4アイソタイプである。これは成人患者の単独の治療のための用量であり、上記用量は子供及び乳児に対して比例的に調整され、そして分子量に比例して他の抗体様式についても調整されうる。治療は医師の裁量で日、2週、週又は月間隔で繰り返される。
【0087】
本発明の特異的結合メンバーは通常医薬組成物の形で投与され、その医薬組成物は上記特異的結合メンバーに加えて少なくとも1の成分を含む。
【0088】
よって、本発明による、そして本発明により使用するための医薬組成物は、有効成分に加えて医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業者に周知の他の物質を含む。上述の物質は無毒であり、かつ有効成分の効果を妨害すべきではない。上記担体又は他の物質の正確な性質は投与経路に依存し、その投与経路は経口又は注入、例えば静中である。
【0089】
経口投与のための医薬組成物は錠剤、カプセル、散剤又は液剤の形である。錠剤は固形の担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含む。液状医薬組成物は一般的に液状の担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油又は合成潤滑油を含む。生理的食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例えばエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールが含まれる。
【0090】
静中注入又は患部への注入のために、上記有効成分はパイロジェンを含まず、かつ好適なpH、等張性、及び安定性を持つ、非経口で許容される水溶液の形である。当業者は、例えば等張溶媒、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び/又は他の添加剤が必要に応じて含まれる。
【0091】
組成物は、治療すべき症状に依存して単独で、あるいは他の処置との組合せで同時にか又は連続してかのいずれかで投与される。他の処置は、好適な用量の鎮痛剤、例えば非ステロイド系抗炎症剤(例えばアスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン若しくはケトプロフェン)又はオピエート、例えばモルヒネ、あるいは制吐剤の投与を含む。
【0092】
本発明は、本明細書中に提供される特異的結合メンバーのエオタキシンへの結合を引き起こす又は許すことを含む方法を提供する。記載のとおり、上述の結合は、例えば特異的結合メンバー若しくは特異的結合メンバーをコードする核酸の投与に続いてインビボで起こるか、あるいはそれは、例えばELISA、ウエスタン・ブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降又はアフィニティー・クロマトグラフィーにおいてインビトロで起こる。
【0093】
特異的結合メンバーのエオタキシン1の結合量を測定する。計量は試験サンプル中の抗原の量に関係し、それは診断上の関心である。
【0094】
サンプルに対する反応性はいずれか適切な手段により決定される。放射性免疫アッセイ(RIA)は1つの可能性である。放射性標識抗原を標識していない抗原(上記試験サンプル)と混合し、そして上記抗体に結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、そして上記抗体に結合した放射性抗体の量を測定する。さらなる抗原、つまり、上記試験サンプル中に存在するより少ない放射活性の抗原が上記抗体に結合する。競合結合アッセイをリポーター分子に連結された抗原又はアナログを用いた非放射性抗原を用いて使用することもできる。上記リポーター分子はスペクトル的に単離された吸収又は発光の特徴を伴う蛍光色素、燐光体又はレーザー色素である。好適な蛍光色素はフルオセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサス・レッドを含む。好適な発色体色素はジアミノベンジジンを含む。
【0095】
他のレポーターは、高分子コロイド粒子又は粒子状物質、例えば着色した磁性又は常磁性ラテックス・ビーズ、及び視覚的に観察されるか、電気的に測定されるか又は別の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生じうる生物学的又は化学的活性物質を含む。これらの分子は反応を触媒する酵素であり、その反応は、例えば色を生み出すか又は変化させ、あるいは電気的特性に変化を引き起こす。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトルの吸収又は放出を生じるような、分子的に興奮性である。それらは、バイオセンサーとの結合に使用される化学物質を含む。ビオチン/アビジン又はビオチン/ストレプトアビジン、及びアルカリ・ホスファターゼ検出系が利用される。
【0096】
個々の抗体−リポーター複合体により生じるシグナルは(正常及び試験)サンプル中の当該抗体結合の定量化できる絶対的又は相対的データを導くために使用されうる。
【0097】
本発明は競合アッセイによる抗原レベルの計測のために上記のとおりの特異的結合メンバーの使用、つまり競合アッセイにおいて本発明により提供される特異的結合メンバーを利用することによるサンプル中の抗原レベルの計測方法をも提供する。これは、結合していない抗原から結合した抗原の物理的分離を必要としない。物理的又は光学的変化を結合により起こすためにリポーター分子を上記特異的結合メンバーに連結することは1つの可能性である。上記リポーター分子は検出可能な、そして好ましくは計測可能なシグナルを直接的に又は間接的に発生する。リポーター分子の結合は直接的又は間接的に共有結合的、例えばペプチド結合によるか又は非共有結合的である。ペプチド結合を介した結合は、抗体とリポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え体の発現の結果として存在する。
【0098】
本発明は、例えばバイオセンサー・システムにおいて本発明による特異的結合メンバーを利用することにより抗原レベルを直接的に計測するためにも提供される。
【0099】
結合の測定様式は本発明の特色ではないので、当業者が彼らの選択及び一般知識により好適な様式を選ぶことができる。
【0100】
本発明はさらに特異的結合メンバーにまで及び、この特異的結合メンバーはエオタキシンに結合するために、上記抗原を結合し、かつ本明細書中に、詳細に示したアミノ酸を持つCDR又は本明細書中に詳細に示したアミノ酸を持つVドメインを含むいずれかの特異的結合メンバーと競合する。結合メンバー間の競合はインビトロにおいて容易にアッセイされる、例えば他の不タギング結合メンバーの存在中で検出されうる特定のリポーター分子を結合メンバーの1つにタギングすることにより、同じエピトープ又はオーバーラップするエピトープを結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。競合は例えば実施例1に記載のとおりELISAを用いて測定される。
【0101】
競合についての試験において、上記抗原のペプチド断片、特に着目のエピトープを含むペプチドが利用される。上記エピトープ配列、それに加え1以上のアミノ酸をいずれかの末端に持つペプチドを使用する。上述のペプチドは特定の配列から「原則的に構成される」と考えられる。本発明による特異的結合メンバーは、抗原に対するそれらの結合が与えられた上記配列を伴うか又は含むペプチドにより阻害されるようなものである。これに関する試験において、配列、それに加え1以上のアミノ酸を共に含むペプチドを使用する。
【0102】
特定のペプチドを結合する特異的結合メンバーは上記ペプチドとのパニングにより、例えばファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離される。
【0103】
本発明は本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸はDNA及びRNAを含む。好ましい態様において、本発明は上記のとおり本発明のCDR又はVH若しくはVLドメインをコードする核酸を提供する。
【0104】
本発明は少なくとも1の上記ポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写物又は発現カセットの形態の構築物をも提供する。
【0105】
本発明は1以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞をも提供する。そのためのコード核酸からの発現を含む、コードされた産物の製造方法を実行する場合、それ自身を提供するようにあらゆるCDR,VH若しくはVLドメイン又は特異的結合メンバーをコードする核酸は本発明の側面を形成する。発現は上記核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより都合よく達成される。発現による製造に続いて、VH若しくはVLドメイン又は特異的結合メンバーをいずれか好適な技術を用いて単離及び/又は精製し、その後必要に応じて使用する。
【0106】
本発明による特異的結合メンバー、VH及び/又はVLドメイン、並びにコード核酸分子及びベクターは、実質的に純粋な状態又は相同体の形態に、例えばそれらの天然環境から単離及び/又は精製されて提供されるか、あるいは核酸の場合には所望の機能を持つポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子起源を含まないか又は実質的に含まない状態に単離及び/又は精製されて提供される。本発明による核酸はDNA又はRNAを含み、そして全体的に又は部分的な合成物質である。本明細書中に示されるヌクレオチド配列への言及は指定配列を持つDNA分子を包含し、かつ文脈上他の意味に解すべき場合を除き、UをTの代わりにする指定の配列を持つRNA分子を包含する。
【0107】
さまざまに異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニング及び発現の系が周知である。好適な宿主細胞は細菌、哺乳動物細胞酵母、及びバキュロウイルスの系列を含む。非相同ポリペプチドの発現のために本技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、幼ハムスター腎臓細胞、NSOマウス・メラノーマ細胞、及び多数の他の細胞を含む。一般的に、好ましい細菌宿主はE.コリ(E.coli)である。
【0108】
原核生物細胞、例えばE.コリにおける抗体及び抗体断片の発現は本技術分野で十分に確立されている。参考のために、例えばPlueckthun, A. Bio/Technology 9 : 545-551 (1991)を参照のこと。培養による真核生物における発現が特異的結合メンバーの製造のための選択肢として当業者に利用可能でもある、最近の総説として、例えばRef, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 : 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6 : 553-560 を参照のこと。
【0109】
プロモーター配列、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適当な調節配列を含む好適なベクターが選択されるか又は構築される。ベクターは必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えば「ファージ」又はファージミドである。より詳細には、例えばMolecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。例えば核酸構築物の製造、突然変異誘導、配列決定、細胞へのDNAの導入及び遺伝子発現による核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの既知の技術及びプロトコールはCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。Sambrook et al. 及びAusubel et al.の開示を本明細書中に援用する。
【0110】
よって、本発明のさらなる側面は本明細書中に記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。よりさらなる側面は上述の核酸を宿主細胞内に導入することを含む方法を提供する。上記導入はいずれか利用可能な技術を利用する。真核生物細胞について、好適な技術は、リン酸カルシウム・トランスフェクション、DEAE−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくは昆虫細胞のためのバキュロウイルスを用いた形質導入を含む。細胞に対して、好適な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含む。
【0111】
上記導入は、例えば上記遺伝子の発現のための条件下、宿主細胞を培養することにより、上記核酸からの発現の引き起こすか又は生じることがその後に続く。
【0112】
1の態様において、本発明の核酸は上記宿主細胞のゲノム(例えばクロモソーム)の中に組み込まれる。組み込みは、標準技術による上記ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進される。
【0113】
本発明は、特異的結合メンバー又は上記ポリペプチドを発現するために発現系において上記構築物を用いることを含む方法をも提供する。
【0114】
本発明の側面及び態様を以下の実験について言及することにより実施例としてここで説明する。
【0115】
【化1】
【0116】
【化2】
【0117】
実験的実施例一覧
実施例1:抗ヒト・エオタキシンscFvの単離
実施例2:走化作用アッセイにおけるscFv 3G3の中和力価
実施例3:CAT−212の誘導及び配列決定
実施例4:CAT−212の特異性
実施例5:走化作用アッセイにおけるCAT−212の中和力価
実施例6:CAT−212に結合するエオタキシンに関するCAT−212競
合アッセイ
実施例7:エオタキシンに対するCAT−212アフィニティーの測定
実施例8:CAT−212への結合に関するマウス・エオタキシンの競合
実施例9:カルシウム流動アッセイにおけるCAT−212の中和力価
実施例10:ヒト鼻腔ポリープに対するCAT−212の免疫応答性
実施例11:IgG4様式(CAT−213)へのCAT−212の変換
実施例12:走化作用アッセイにおけるCAT−213の中和力価
実施例13:CAT−212に結合するエオタキシンに関するCAT−213
競合アッセイ
実施例14:アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるCAT−212及
びCAT−213の効果
実施例15:L1.2 CCR−3をトランスフェクトした細胞:アカゲザル
及びマウス・エオタキシンを用いたエオタキシン仲介走化作用ア
ッセイにおけるCAT−213の中和力価
実施例16:ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおける
CAT−213の中和力価
実施例17:エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるCAT−21
3の中和力価
実施例1
抗ヒト・エオタキシンscFvの単離
scFv抗体レパートリー
扁桃腺、骨髄、及び末梢血から単離されたB−リンパ球から誘導し、そしてファージミド・ベクター内にクローニングした巨大1本鎖Fvヒト抗体ライブラリー(Vaughan et al, 1996 )を選択に使用した。このscFvレパートリーを個々の組換え体が約1.3×1010持つように計算する。このレパートリーからの抗体は、固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー(IMAC)によるscFv精製を可能にするためのC末端範囲の6ヒスチジン、及びモノクローナル抗c−myc抗体、9E10を用いた一般的な検出システムを提供するためのc−mycから誘導された短い配列をも組み込む。
【0118】
scFvの選択
ヒト・エオタキシン(Cambridge BioSciences)を10μg/mlでイムノチューブ(Nunc;Maxisorb)上に直接的にか、あるいはMaxisorbマイクロタイター・プレート(Nunc)上にコートしたジサクシンイミド・スベレート活性化BSAに結合させてコートした。選択の第1段階のために、1012力価単位のライブラリー・ファージを使用した。上記scFvライブラリー選択の第3段階を標準的なパニング・プロトコール(Vaughan et al, 1996 )に引き続き実施した。選択の段階2及び3からの個々のクローンを取り出し、そしてファージELISAにより選別した。
【0119】
ELISAのためのファージの取り出し
選択の段階2及び3からの個々のコロニーを、100μg/mlのアンピシリン及び2%グルコースを追加した2TY培地(2TYAG)を1ウェル当たり100μl含む96ウェル・プレートに接種した。プレートを振とうしながら37℃で4時間培養した。10のMOIまでM13K07ヘルパー・ファージを各ウェルに加え、そしてそのプレートを37℃でさらに1時間インキュベートした。上記プレートをベンチトップ遠心分離機により2000rpm で10分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、100μg/mlのアンピシリン及び50μg/mlのカナマイシンを追加した2TY(2TYAK)100μl中に再懸濁し、そして振とうしながら30℃で一晩インキュベートした。プレートを2000rpm で10分間遠心分離し、各ウェルから100μlのファージを含有する上清を96ウェルプレートに回収した。上記のファージをブロックするために、20μlの18%マーベル・ブロッキング溶液含有6×PBS(6MPBS)を各ウェルに加え、そして室温で1時間インキュベートした。上記ファージはすぐにELISAに使用できる状態である。
【0120】
ファージELISA
可塑性96ウェル・プレート(Falcon)をPBS中0.5μg/mlヒト・エオタキシン又は対照としてPBSのみにより40℃で一晩コートした。コート後、上記溶液を各ウェルから除去し、そして上記プレートを3%マーベル含有PBS(MPBS)により室温で1時間ブロッキングした。そのプレートをPBSにより3回洗浄し、次に50μlの事前にブロックしたファージを各ウェルに加えた。上記プレートを室温で1時間静置したままインキュベートした。そのプレートを室温で0.1%(v/v)Tween 20含有PBS(PBST)の3回交換、続いてPBSの3回交換により洗浄した。
【0121】
各ウェルに、MPBS中に5000分の1希釈での抗遺伝子VIII−HRP複合体(Pharmacia)50μlを加え、そしてそのプレートを室温で1時間インキュベートした。各プレートをPBSTにより3回、続いてPBSにより3回洗浄した。次に50μlの3,3′,5,5′−テトラメチル・ベンジジン(TMB;Sigma)基質を各ウェルに加え、そして室温で30分間、あるいは発色するまでインキュベートした。上記反応を25μlの0.5M H2 SO4 の添加により停止させた。発生されたシグナルをマイクロタイター・プレート・リーダー(Bio−Rad 3550)を用いて450nmでの吸収(A450 )を読み取ることで計測した。
【0122】
抗エオタキシンscFv
たった4種類の異なるscFvがファージELISAにより同定されたことによりエオタキシン特異的scFvの単離が非常に困難であることがわかった。同じscFvライブラリーを他の抗原に対して選択した場合、より多くのscFvが典型的には同定される。さらなる特徴を示すことに関して同定されたコロニーを3G3と称し、そしてこのクローンはELISAにおいてPBSで見られたそれの5〜10倍超のヒト・エオタキシンでのシグナルを常に示した。
【0123】
実施例2
走化作用アッセイにおけるscFv 3G3の中和力価
背景
上記抗エオタキシンscFv 3G3の中和力価をインビトロ走化作用アッセイを用いて測定した。
【0124】
インビボにおいて阻害が望まれるCCR3発現細胞の化学遊走を誘発することがエオタキシンの能力であるため上記走化作用アッセイは特にインビトロにおける力価アッセイに関係する。上記アッセイはCCR3レセプターを発現する細胞が走化作用によりエオタキシン・グラジエントに向かって移動する原理に働きかける。ここに詳述した上記方法はPanath et al, 1996a による記載に基づく。簡単に言うと、エオタキシンを、適当なバッファー中の試験抗体と一緒にトランスウェル(Transwell)プレート(Costar)の下部ウェルに入れた。CCR3レセプターを発現するトランスフェクト細胞を上記トランスウェルの上部チャンバーに入れた。上記の2のチャンバーを3μMの孔径を持つポリエステル膜によって隔てた。CCR3リガンド、例えばエオタキシンに反応した細胞だけがその孔を通って遊走する。定められたインキュベーション期間の後、下部チャンバーまで遊走した細胞の数をカウントし、そしてこの数は上記上部チャンバーに入れたケモカインの化学遊走誘発活性の指標である。それ故に、この化学遊走誘発活性の阻害がこのアッセイにより評価されうる。
【0125】
CCR3細胞の維持
L1.2細胞をヒトCCR3レセプターによりトランスフェクトし、その表面にCCR3を発現する安定な細胞株を製造した。上記細胞を10%熱不活化FCS(Biowhittaker)、2% L−グルタミン(Sigma)、10Uペニシリン(Sigma)、100g/mlストレプトマイシン(Sigma)、250μg/mlカナマイシン(Sigma)、及び400μg/mlゲンタマイシン(Gibco)含有RPMI−1640(Sigma)中で維持した。上記アッセイで使用するために上記細胞を1〜2×106 /mlの間に保った。CCR3発現を上方調節するための上記細胞のNO刺激を上記走化作用アッセイのために必要とした。50ng/mlのエオタキシンに対する反応を慎重に観察した、なぜなら遊走細胞数は、おそらくCCR3発現レベルの変化により、細胞の維代数にともない減少するからである。典型的には下部チャンバーまで遊走した上記細胞の10%サンプルを続いてフローサイトメトリーにより計測した。50ng/mlのエオタキシンは典型的には8,000〜10,000細胞の走化作用を誘発することがわかった(これは上記10%値である;すなわち合計で80,000〜100,000細胞が下部チャンバーまで遊走した)。
【0126】
走化作用アッセイ
走化作用アッセイのバッファーは、1%エオタキシン不含BSA(Bayer Pentex)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン含有RPMI−1640(Sigma)を含む。(二重で)抗体の試験溶液をアッセイ・バッファー中に所望の濃度まで希釈した。IMAC−精製(次項を参照のこと)scFv 3G3について、典型的な希釈の範囲は100μg/ml〜1μg/mlであった。ヒト・エオタキシン(Alba Chem)を適当な試験scFvと混合する時に50ng/mlの終濃度まで加えた。全てのサンプルを室温で30分間インキュベートした。CCR3 L1.2細胞をHeraeus Sepatech 1.0ベンチトップ遠心機により1,200rpm で5分間遠心分離し、その培地を吸引により除去し、そしてその細胞を25mlのPBS中に再懸濁した。上記細胞を次に再び遠心分離し、そしてその細胞ペレットを107 細胞/mlにアッセイ・バッファー中に再懸濁した。試験溶液(ウェル当たり0.6ml)をトランスウェル・プレートの下部チャンバー内に入れた。トランスウェルを上記試験溶液上に入れ、そして100μlの細胞(合計106 細胞)を各トランスウェルの上部チャンバー内に入れた。インキュベーションを5% CO2 下、37℃で4時間行った。上記トランスウェルを取り除く前にそのプレートを軽くたたいて膜の下側に付着した全ての細胞を取り外した。下部チャンバーまで遊走した細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーターを用いてカウントした。サンプルを培地流速を用いて60秒間それぞれカウントした。上記試験抗体に起因する走化作用の阻害率を次に測定した。
【0127】
scFvの精製
走化作用アッセイにおいて3G3 scFvの力価を測定するために、scFvをIMACによりまず下処理した。2TYAG(5ml)に3G3のシングル・コロニーを接種し、そして振とうしながら30℃で一晩育成した。この一晩培養した物を次に100μg/mlアンピシリン及び0.1%グルコース含有2TY 500mlへの接種に使用し、そして1.0のA600 に達するまで振とうしながら30℃で育成した。イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を1mMまで加え、そして上記培養物を30℃でさらに3.5時間育成した。
【0128】
細胞を5,000rpm での遠心分離により採取し、そして10mlのTES(0.2M Tris−HCl、0.5mM EDTA、0.5Mショ糖;氷冷)中に再懸濁した。さらに15mlのTESの1:5希釈物(水による)を加え、そしてその細胞懸濁液を回転輪上、40℃で30分間インキュベートした。これは浸透圧衝撃を引き起こし、そして上記scFvを含むペリプラズム抽出物を生じた。残留細胞及び破片を、40℃で20分間9,000rpm での遠心分離によりペレット化した。その上清を新しい試験管に移し、そして50μlの1M MgCl2 を加えた。次に、バッファー(50mM リン酸ナトリウム、pH8、300mM NaCl)により事前に洗浄された2mlのNi−NTAスラリー(Qiagen)をプロテアーゼ阻害剤錠(Boehringer Mannheim)と一緒にペリプラズミック抽出物に加えた。上記配合物を回転させながら40℃で一晩インキュベートした。上記Ni−NTAを5分間2,000rpm での遠心分離によりペレット化し、そしてその上清を吸引した。アガロース・ビーズを50mlの洗浄バッファーにより3回洗浄し、各洗浄の間にはそのアガロース・ビーズを集めるために遠心分離した。10mlの洗浄バッファーを最後の洗浄の後に加え、そして上記スラリーをポリプレップ・カラム(BioRad)に添加した。2mlの溶出液(50mM NaPi、pH8、300mM NaCl、250mMイミダゾール)を排水したアガロースに加え、そしてその溶出液を集めた。IMAC精製scFvを製造者の指示によるNap5カラム(Pharmacia)の使用によりPBSにバッファーに変換した。A280 を読み取り、そしてそのタンパク質濃度を、1mg/mlタンパク質=A280 1.4の分子減衰係数を用いて測定した。精製scFvを−70℃で500μlアリコートの状態で保存した。
【0129】
結果
走化作用アッセイにおける精製scFv 3G3についての代表的なデータを図1に示す。scFv 3G3に関してIC50は800nMである。結果として、この抗体は低〜中程度の力価である。
【0130】
実施例3
CAT−212の誘導及び配列決定
scFv 3G3の低〜中程度の力価は、この抗体をあらゆる治療的適用に関して比較的不適当な候補物質にしている。
【0131】
CAT−212と呼ばれるさらなるscFv抗体をいろいろな技術を用いて得、そしてそのDNA配列を決定した。
【0132】
DNA配列決定
DNAを、ベクター特異的プライマー、pUC19逆及びfdtetseq(Vaughan et al, 1996 )を用いて2TYAGアガロース・プレート上の個々のコロニーからポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。増幅条件は30サイクルについては94℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で2分間、続いて72℃で最後の10分間伸長を含む。そのPCR産物をPCR Clean−upキット(Promega)を用いて50μl H2 Oの終量まで精製した。2〜5μlの各挿入調製物を、Taq色素−ターミネータ・サイクル・シークエンシング・システム(Applied Biosystems)を用いた配列決定のための鋳型として使用した。プライマー(Osbourn et al, 1996 )、gene3leader,PCRHLinkを上記scFvのVH の配列決定のために使用し、そしてPCRLLink及びmycseq10を上記scFvのVL の配列決定のために使用した。
【0133】
CAT−212 VH 及VL のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号1及び3に示す。CAT−212 VH 及びVL の誘導されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号2及び4に示す。
【0134】
抗体の個々のVH 及びVL セグメントをV−BASE(Tomlinson et al, 1995 )により既知のヒト生殖細胞系列の配列に整列し、そして最も近い生殖細胞系列を同定した。CAT−212のH鎖について最も近い生殖細胞系列をVH 3ファミリーの1つであるDP49と同定した。上記CAT−212 VH は上記DP49生殖細胞系列とたった6の変更しかなく、これらの2がCDR2内に存在する。CAT−212のL鎖について最も近い生殖細胞系列をVK 1ファミリーの1つであるDPK 5と同定した。上記CAT−212 VL は上記DPK 5生殖細胞系列とたった2の変更しかなく、両方ともCDR内に存在する。CAT−212の配列全体又はその誘導体(例えばCAT−213)は、生殖細胞系列と合計でたった8の変更しかなく、その4はCDR内に存在する。これは、これらのヒト抗体が患者の処置に使用される場合に免疫原性のあらゆる可能性のある危険をより最小化するはずである。
【0135】
実施例4
CAT−212の特異性
CAT−212の特異性を調べるために2種類の技術:ファージELISA及びウエスタン・ブロッティングを使用した。
【0136】
ファージELISA
CAT−212の特異性を測定するために、ファージELISAを、ヒト及びマウス・エオタキシン、並びに関連の及び関連のないヒト抗原のパネル;MIP−1α,MCP−1,MCP−2,MCP−3,MCP−4,IL−1α,IL−1β,IL−5,IL−18,IL−12,RANTES、トランスフォーミング成長因子(TGF)−β1,TGF−β2,TNFα、そしてPBSに対して実施した。
【0137】
CAT−212ファージミドを含む個々のE.コリ・コロニーを5mlの2YTAGに接種し、そして振とうしながら37℃で4時間インキュベートした。M13K07ヘルパー・ファージ(Pharmacia)を10のMOIまで各試験管に加え、そして37℃で最初の30分間は静置して、そして最後の30分間は緩やかに振とうして、1時間インキュベートした。細胞を3,500rpm で10分間遠心分離することでペレットにし、そしてその上清を捨てた。細胞を5mlの2TYAK中に再懸濁し、そして振とうしながら30℃で一晩インキュベートした。翌日、上記細胞を3,500rpm で10分間遠心分離することでペレットにした。そのファージ含有上清(5ml)を新しい試験管に丁寧に移し、1mlの6MPBSを加え、そして室温で1時間インキュベートしてELISAの前に上記ファージを前もってブロックした。
【0138】
さまざまな抗原のコート濃度及び供給者を表1に示す。ELISAを原則的に実施例1に記載のとおり実施した。その結果を図9に示す。CAT−212はヒト・エオタキシンに特異的であり、かつ試験したあらゆる関連のない又は関連のヒト抗原と交差反応しない。バックグラウンドを越えるごくわずかなシグナルがマウス・エオタキシンにおいて見られた。これはCAT−212がヒト・エオタキシンに比べて比較的弱いながらも、マウス・エオタキシンを認識することを示す。ヒト又はマウス以外のいずれかの種については市販のエオタキシンを入手できなかった。
【0139】
ウエスタン・ブロッティング
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(SDS−PAGE)をPHASTシステム及び10〜15%ゲル(Pharmacia)を用いて実施した。エオタキシン及びヒトMCP−1(400ng)のサンプルを分子量マーカーと同時に上記ゲル上で泳動した。電気泳動を実施し、次にタンパク質を拡散によりイモビロン−P(Millipore)膜に転写した。その膜をMPBSとの1時間のインキュベーションによりブロックし、次にMPBS中の10μg/ml IMAC精製CAT212 scFv又は関連性のないscFvにより振とうしながら室温で1時間プローブした。これに続き、上記の膜をPBST中で(3×2分間)洗浄し、次に1μg/mlのビオチン化抗mycタグ抗体(9E10)と一緒に1時間インキュベートした。洗浄を待ってから、最後の洗浄の前にそのブロットを1μg/mlのストレプトアビジン−HRP(Pierce)と一緒に1時間インキュベートした。そのブロットを製造業者の指示に従いECL基質(Amersham)中に入れ、そしてX線フィルム(Amersham Hyperfilm ECL)に焼き付けた。
【0140】
予測した分子量の明確なバンドが観察された一方で、上記MCP−1のレーンにはバンドが検出されなかったので、CAT−212 scFvはヒト・エオタキシンと特異的に反応した。対照である同濃度の関連性のないscFvはエオタキシン又はMCP−1のいずれとも反応しなかった。
【0141】
実施例5:エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるCAT−212の中和力価
CAT−212(及びCAT−213、実施例12を参照のこと)の力価を、実施例2に記載のとおり、走化作用アッセイにより試験した。試験に先立ち、単量体scFvをFPLCゲルろ過クロマトグラフィーにより調製した。
【0142】
単量体scFvの調製
単量体scFvをPharmacia FPLCシステムのセファデックス75カラムでのIMAC精製材料のゲルろ過により調製した。上記カラムを0.5ml/分でPBSを流し込み、そして500μlのサンプルを添加した。精製単量体scFvを含む画分を集めた。scFvの濃度を集めたピーク画分のA280 nmを読み取ることにより測定した。
【0143】
CAT−212 FPLC精製scFvに関して(アッセイ・バッファーによる)典型的な希釈の範囲は1μg/ml〜0.001μg/mlであった。
【0144】
結果
結果を図3に示す(3の測定の平均値)。CAT−212はCCR3トランスフェクトL1.2細胞のエオタキシン仲介走化作用を650±83pMのIC50で阻害した。したがって、3G3になされた修飾は、このscFv抗体の力価において1000倍超の向上をもたらした。CAT−212は高い力価の抗エオタキシン中和抗体である。
【0145】
実施例6
CAT−212に結合するエオタキシンに関するCAT−212競合アッセイ
序文
好適なポリスチレン・マイクロタイター・プレートに受動的に固定化された場合、CAT−212は、その解離定数(KD )により定められる濃度依存様式でのエオタキシンの結合を示した。 125ヨウ素標識エオタキシンからのβ放射は、それが燐光体浸透マイクロタイター・プレート(Flash Plate(商標))と相互作用する時に検出可能な光シグナル(シンチレーション)を生み出す。射程の短かいこの放射は上記の得られたシグナルがわずかな非結合物質からの寄与を伴う結合抗原に起因することを裏付ける。この技術をエオタキシン−CAT−212相互作用のKD 、及び競合阻害によるCAT−212とCAT−213(実施例13を参照のこと)超製物の相対親和性を測定するために使用した。
【0146】
アッセイ・プロトコール
Flash Plate(商標)(NEW SMP200;96ウェル)のウェルを0.05Mカーボネート−ビカーボネート・バッファー(Sigma)中に希釈した40nMのIMAC精製CAT−212(調製方法については第2項を参照のこと)100μlによりコートした。そのプレートをシールし、そして4℃で4時間インキュベートし、次にそれを逆さにすることで空にし、そして150μlの1%マーベル含有PBS(Sigma)により4℃で一晩ブロックした。使用直前に、前記プレートを逆さにすることで空にし、そしてPBSにより3回洗浄し、次に水気を取った。
【0147】
上記アッセイ・バッファーは0.5%ウシ血清アルブミン(Sigma)含有RPMI培地(Sigma)から成っていた。試験サンプルをバッファー中で3倍希釈し、二重の11の流度を得た。50μlの希釈した試験サンプルをウェルに加え、続いて50μlの30pM[ 125I]エオタキシン(Amersham)を加えた。そのプレートをシールし、そして室温で1〜2時間インキュベートした。そのプレートをPackard Topcountシンチレーション・カウンターによりカウントした(ウェルをそれぞれ2分間カウントした)。
【0148】
データをGraphPad Prism(GraphPad Inc)を使用して4−パラメーター・ロジスティック方程式を用いて明白なIC50値を得た。Y=下限+(上限−下限)/(1+10^((Log IC50−X)×丘の傾き))
X=濃度の対数、YはCPMである。
【0149】
結果
図4はアッセイの結果を示し、このアッセイにおいて非標識CAT−212を[ 125I]エオタキシンのflash plate(商標)にコートしたCAT−212への結合に対する競合のために使用した。CAT−212はこのアッセイ(4の測定の平均値)において42.5pMのIC50を示す。
【0150】
実施例7
エオタキシンに対するCAT−212親和性の測定
アッセイ・プロトコール
実施例6に記載のとおりFlash Plate(商標)をCAT−212によりコートし、そして試薬を調製した。アッセイ・バッファー中、[ 125I]エオタキシンの連続的な2倍希釈物+/−100倍超の非標識エオタキシンを調製し、そして二重で100μlのサンプルをそのコート・プレートに加えた。上記サンプルをシールし、室温で2時間インキュベートし、そしてカウントした。
【0151】
上記データを、式:Y=(BMAX ×[L])/(KD +[L])によるKELL for windowsソフトウェア・パッケージ(Biosoft)を用いて非線形曲線の当てはめにより分析した。
【0152】
上記の式において、[L]は遊離リガンド濃度であり、KD は親和性であり、かつBMAX は最大結合部位濃度である。
【0153】
次に上記データを、そのリガンドが相同体集団の結合部位に結合している時に傾き=−1/KD 及びBMAX のX断片を持つ直線を呈する、結合/遊離の比対結合のスキャッチャード・プロット(図5)の使用により視覚化する。
【0154】
結果
上記スキャッチャード・プロット(図5)より、CAT−212に結合するエオタキシンについての親和性を146pMと評価した。
【0155】
実施例8
CAT−212への結合に対するマウス・エオタキシン競合
序文
CAT−212/CAT−213のインビボ活性を扱うために、2種類の方法を利用した(実施例14を参照のこと):
(1)マウス・モデルにおける好酸球増加症に対するヒト・エオタキシンの注入による効果
(2)マウス・モデルにおける好酸球増加症に対する内生的エオタキシンの産生誘導による効果。
【0156】
第2の方法のために、CAT−212/CAT−213がマウス・エオタキシンを認識するかどうか決定することがまず必要であった。
【0157】
アッセイ・プロトコール
Flash Plate(商標)を実施例6に記載のとおり準備した。アッセイ・バッファー中、非標識ヒトエオタキシンとマウス・エオタキシンの11の連結的に3倍希釈し、そして30pMの評価濃度で調製された 125I−エオタキシンと混合し、そして100μlを二重でウェルに加えた。そのプレートをシールし、そして室温で2時間インキュベートして、カウントし、そしてそのデータを実施例6に記載のとおり処理した。
【0158】
結果
マウス・エオタキシンへ結合するCAT−212についてのIC50の評価は296nM(2の測定の平均値)である。そのデータを表6に示す。したがって、CAT−212はマウス・エオタキシンを認識する。
【0159】
実施例9
カルシウム流動アッセイにおけるCAT−212の中和力価
序文
この機能的アッセイは、レセプターがそのリガンドに結合され、そして活性化された時に引き起こされる細胞内Ca2+の上昇を計測するために設計される。この場合、CCR3によりトランスフェクトされた細胞にCa2+感受性蛍光色素(fluo−3AM)を加え、そして蛍光発光をFLIPRを用いて経時的に観察した。FLIPRにより、各ウェル中の蛍光発光の計測を計画した間隔(1又は5秒毎)で実施し、そして試薬を各ウェルに同様に加えた。上記CCR3レセプター結合エオタキシンにより誘導された細胞内Ca2+濃度の上昇が計測され、そしてそれは蛍光発光の増加に比例する。CAT−212のエオタキシンへの結合、そしてその中和を原因とするこの反応の阻害を定量化しうる。
【0160】
アッセイ・プロトコール
この実験に先立ち、24時間、0.5μg/ml酪酸ナトリウム(Sigma)を含む通常培地を添加することによりCCR3細胞を活性化し、CCR3発現を増加させることによりエオタキシンに対する応答の程度を増加させた。活性化CCR3細胞をPRMI 1640により2度洗浄し、次に新たに調製した2μM fluo−3AM(Molecular Probes)、0.03%プルロン酸(pluronic acid)(Molecular Probes)、及び0.1% FCSを含むRPMI 1640中に4×106 細胞/mlで再懸濁した。次にその細胞を37℃で45分間インキュベートした。これに続き、それらをRPMI 1640により1度洗浄し、そしてFLIPRバッファー(125mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム、1.5mM塩化カルシウム、25mM Hepes、5mMグルコース、及び0.1% FCS、pH7.4)により2度洗浄した。最終的にそれらを1×106 /mlでFLIPRバッファー中に再懸濁し、そして100μlを透明な底の96ウェルのブロックした壁を持つプレート(Corning)に移して1ウェル当たり1×105 細胞を得た。次にそのプレートを1000rpm で5分間遠心分離し、均一で、比較的密度の高い、単層の細胞を得た。
【0161】
CAT−212の希釈系列を終濃度の6倍で準備し(最終的に200nM〜1.6nM)、そして等量の60nMエオタキシン(Cambridge Bioscience)と一緒に室温で10分間プレ・インキュベートした。全ての処置物を少なくとも二重で、96ウェル・ポリスチレン・プレート(Corning)中にFLIPRバッファーを用いて100μlの終量に調製した。上記細胞に接触するエオタキシンの終濃度は10nMであった。
【0162】
上記fluo−3添加細胞を含むプレートをFLIPRに設置し、そして蛍光発光を最初の60秒間に関しては1秒毎、その後終了まで5秒間隔の様式で読み取った。上記実験を室温で実施した。この実験のために、50μlの各処置物を10秒の合間の後に全てのウェルに加えた。
【0163】
結果
この実験の結果を図7に示した。CAT−212が、エオタキシンがCCR3細胞上のそのレセプターに結合することにより生じるCa2+流動の用量依存的阻害を示すことが考えられうる。図8は、このデータに関して5nMの概算のIC50値を与える「上記曲線以下の面積」を示す。
【0164】
実施例10
ヒト鼻腔ポリープに対するCAT−212の免疫応答性
序文
ヒト鼻腔ポリープは好酸球の浸潤により特徴づけられる炎症性組織である。エオタキシン発現は、鼻腔ポリープ中で上方調節されているとして立証されており、そしてエオタキシン・タンパク質は抗エオタキシン抗体を用いた免疫細胞化学により検出される(Ponath et al., 1996a )。したがって、CAT−212をヒト鼻腔ポリープの切片を用いて免疫応答性について審査した。
【0165】
ICCのための組織の準備
ヒト鼻腔ポリープ組織サンプルを手術サンプルから得た。組織を5mm3 のぶつ切りに切断し、そして最適な切断組織化合物(OCT;Sakura)の滴下を用いてコルク片の上に取り付けた。上記組織を冷凍するために、20mlのイソプロパノールを液体窒素浴中で冷却し、そして上記の取り付けた組織を30秒間浸した。次に凍結組織をクライオチューブに移し、そしてさらに30秒間液体窒素中に浸した。組織ブロックを−70℃で冷凍保存した。切片を切断するために、OCT化合物をクライオスタット・チャック(cryostat chuck)に適用し、そして上記凍結組織をはめ込んだ。次に上記チャック及び組織を液体窒素中で30秒間急激に冷凍した。次にその組織をクライオスタット上に取り付け、そして各ヒト組織の5ミクロン凍結切片を顕微鏡用スライドの上に切断した。
【0166】
ICCのためのファージ抗体の準備
ファージ抗体クローンを実施例1に記載のとおり取り出した。ファージ含有上清をICCで使用する前に1% BSAにより前もってブロックした。
【0167】
プロトコール
ヒト組織切片を環境温度で15分間アセトン中に浸漬することにより固定し、風乾し、次にPBSTにより3回、(合計)10分間洗浄した。試験scFvをPBST中に希釈し、そして上記切片に室温で2時間適用した。スライドをPBSTにより3回洗浄し、そしてPBST中に1/100に希釈したマウス9E10抗体と一緒にインキュベートした。切片をPBSTにより3回洗浄し、そして供給されたEnVision抗マウス・ペルオキシダーゼ重合体(DAKO K4006)中で30分間インキュベートした。切片を再度PBST中で3回洗浄し、そして3−アミノ−9−エチル−カルバゾール・ペルオキシダーゼ基質(AEC;Sigma)を用いて染色した。AEC基質を、原液(ジメチルホルムアミド中に溶解された2.4mg/mlのAEC)を20mM酢酸ナトリウム・バッファー、pH5.2中に1:10に希釈し、そして0.15%(v/v)の過酸化水素を加えることにより調製した。100μlのAEC基質溶液を各切片に加え、そして5〜10分間インキュベートした、続いて0.1% Tween含有生水により洗浄して発色を止めた。その後上記スライドを<5秒間ヘマトキシリン(DAKO S2020)により対比染色し、次に水により3回洗浄した。次に洗浄した切断を水性マウントによりコートし、そしてガラス・カバー片を適用した。
【0168】
結果
ヒト鼻腔ポリープの30μg/mlでのCAT−212染色切片は、50μg/mlでの陽性対照抗エオタキシン抗体(Cambridge Bioscience)について見られたものと同等の様式である。同じ濃度でも対照だけか又は関連性のないscFvと一緒の上記基質による検出可能な染色は存在しなかった。CAT−212は、被覆する上皮組織、並びに鼻腔ポリープのストロマ中に位置する細長くなった単核細胞及び内皮細胞における特異的な細胞質染色を示した。これは、鼻腔ポリープにおいて抗エオタキシン抗体により得られた公表されたICC特徴(Ponath et al., 1996a)と一致する。その染色がエオタキシンに対して特異的であるか確認するために、競合ICCを行った、ここで40μg/mlのCAT−212を、上記鼻腔ポリープ切片に添加する前に133μg/ml、660μg/ml、及び1.33mg/mlエオタキシンに前もって結合させた。CAT−212単独では上記のとおり良好な染色が得られた。CAT−212をエオタキシンに前もって結合させた場合、それらは、1.33mg/mlエオタキシンでは全ての特異的染色が実質的に消滅する状態の鼻腔ポリープへの結合の用量依存阻害であった。
【0169】
実施例11
IgG4様式(CAT−213)へのCAT−212の変換
序文
上記scFv(CAT−212)の完全な抗体(IgG4;CAT−213)様式への変換に使用されるベクターは以下のとおりであった:pGamma4(VH 発現ベクター)及びpMR15.1(VL 発現ベクター)。これらのベクターの両方をLonza Biologicsから得た。
【0170】
プロトコール
使用した全てのプライマーを表3に配列番号について言及する。上記VH DNA及びVL DNAをそれぞれオリゴヌクレオチドp113/p132及びp109a/p110bを用いてまず増幅した。全ての上記PCR反応はその校正能力のためにPwoIポリメラーゼ(Roche)を使用し、PCR条件は94℃、30秒間;50℃、30秒間;72℃、60秒間の25サイクルとした。VH 及びVL の両方についてのシグナル配列をそれぞれp10/p132及びp11/p110bを用いて増幅することにより加えた。DNAのVH 及びVL 断片をそれらの受容ベクターと平行してそれぞれHindIII ,ApaI及びBstBI,BsiWIを用いて消化した。次に断片を一緒に連結し、よって個々のプラスミドを構築した。両プラスミドをBamHI及びNotIを用いて消化し、そして一緒に連結して最終構築物を形成した。全ての制限消化及び連結をNew England Biolabsからの酵素を使用し、その業者により推奨されるバッファーを用いて実施した。
【0171】
上記ベクターの形質転換のために、エレクトロコンピテントE.コリ細胞(DH5α)を使用した。エレクトロポレーションを0.2cmギャップ・エレクトロポレーション・キュベットで行ない、そのキュベットの中で5μlの連結DNAを100μlのE.コリに加えた。上記細胞に200Ωで2.5kVのシングル・パルスを与え、続いて振とうインキュベーターにより37℃で2TY中、20分間の回復期間を与えた。アリコートを2TYAGアガロース平板培地上に移し、そして37℃で一晩インキュベートした。翌日、そのコロニーを採取し、Taqポリメラーゼと適当なプライマーを用いたPCRにより選別した。
【0172】
正しいサイズの挿入物を有するクローンを100mlの2TY(100μg/mlアンピシリン含有)中、振とうインキュベーターにより37℃で一晩育成した。その細胞を3,000gで15分間の遠心分離により採取し、そしてQIAGEN maxi−prepキットを使用してそのプラスミドDNAを抽出した。そのDNA濃度を、A260 nmの1=50μg/mlと仮定し分光光度法で測定した。上記最終構築物をプライマーp24,p34、並びにp36及びp37を用いて配列決定し、正確な配列を確認した。
【0173】
36プレート・トランスフェクションをNSO細胞において、gsシステム(Lonza)を使用したエレクトロポレーション(250V)により、選択可能なマーカーとしてグルタミン合成酵素遺伝子を用いて実施した。野生型NSO細胞を2mMグルタミンを伴う10%透析FCS含有DMEM(Sigma)中で育成した。6×107 NSO細胞を、PvuIにより直鎖にした300μgのDNAによりトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、その細胞をグルタミンを含むDMEM中に再懸濁し、そして36×96ウェル・プレート(50μl/ウェル)に移し、そして5% CO2 中、37℃でインキュベートした。翌日、150μl/ウェルの選択培地(グルタミン不含DMEM)を加えた。約3週間後、そのコロニーを陰性対照として関連性のない抗体を用いたELISA(以下を参照のこと)により選別した。>20μg/ml生産する全てのコロニーを24ウェルプレートで増殖させ、次に二重でT25フラスコで増殖させた。一方のフラスコを飽和まで育成し、そして他方を冷凍した。4B7と称する第1の細胞株(クローンでない)を血清不含培地に適合させ、そしてプロテインAを用いた精製のために2Lの容量まで増殖させた。
【0174】
IgG発現を検出するための選別ELISAアッセイ
ELISAプレート(Immulon 4,Dynex technologies)の各ウェルを100μlの50mM重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム・バッファー、pH9.6中、1μg/mlヤギ抗ヒトIgG(Harlan)により4℃で一晩コートした。プレートを0.05%(v/v)Tween 20含有PBS(PBST/0.05)により3回洗浄した。CAT−213をPBST/0.05中で希釈し、2倍希釈系列をそのプレートの中に作り出した。そのプレートを室温で1時間インキュベートし、次にPBST/0.05により3回洗浄した。PBST/0.05中に希釈した1:5000 HRR結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(Harlan)100μlを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートした。そのプレートをPBST/0.05により3回洗浄した。これに続き、100μlの新たに調製したHRP基質バッファー(使用直前に加える5μl H2 O2 /50mlバッファーを含有する24mMクエン酸、52mMリン酸水素ナトリウム、pH5.2中、0.4mg/ml o−フェニレンジアミン)を各ウェルに加えた。5〜10分後、上記反応を50μlの12.5%硫酸の添加により止めた。A490 を計測した。
【0175】
最初に上記選別ELISAにおいて強いシグナルによって示された大量のIgGを発現する上記細胞株を増殖のために選んだ。これはその96ウェル・プレートからT75フラスコまでの増殖を伴った。次にこの細胞株を、時間ごとに血清を半分に減らす(血清の開始割合は10%である)連続的な希釈を含め無血清培地(Lonza NM2)に適合させた。一旦無血清培地に適合すれば、次に上記細胞株を150mlフラスコ中で飽和状態まで育成し、そして10%未満の細胞生存で採取した。その上清を遠心分離により清澄にし、次に0.22μmフィルターを通してろ過した。上記抗体をその上清からプロテインAアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて精製した。
【0176】
抗エオタキシン特異的なIgGを検出するための結合アッセイ
ELISAプレート(Immulon 4,Dynex technologies)の各ウェルを、100μlの50mM重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム・バッファー、pH9.6中、0.5μg/mlエオタキシン(Albachem)により4℃で一晩コートした。このプロトコールの残りの部分は選別アッセイと同じである(先の項を参照のこと)。関連性のない対照抗体を含めて結果を図9に示す。
【0177】
実施例12
エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるCAT−213の中和力価
アッセイ・プロトコール
CAT−213の力価を原則的に実施例2に記載のとおり走化作用アッセイで試験した。試験に先立ち、CAT−213をプロテインAアフィニティー・カラム(実施例11のとおり)を用いて上記上清から精製した。プロテインA精製CAT−213についての典型的な希釈範囲は、アッセイ・バッファー中、100nM〜0.03nMであった。
【0178】
結果
このアッセイの結果を図3に示す。CAT−213はCCR3トランスフェクトL1.2細胞のエオタキシン仲介走化作用を700+350pMのIC50で阻害した。この力価はこのアッセイにおいてCAT−212について見られたものに類似している。
【0179】
実施例13
CAT−212に結合するエオタキシンに関するCAT−213競合アッセイ
アッセイ・プロトコール
上記Flash Plate(商標)アッセイを原則的に実施例6に記載のとおり実施した。Flash Plate(商標)を40nMのCAT−212によりコートした。CAT−212,CAT−213、及びエオタキシンをアッセイ・バッファー中に希釈し、そして50μlをウェルに加え、続いて50μlの60pM[ 125I]エオタキシンを加えた。
【0180】
結果
このアッセイにおいてCAT−213のIC50は59.3pM(4の測定の平均、図4)である。これは上記CAT−212のscFvについて得られた値に類似している。
【0181】
実施例14
アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるCAT−212及びCAT−213の効果
アレルギー性炎症の空気嚢モデルを好酸球増加症を研究するために好都合なモデルとして選んだ。デキサメサゾン(ステロイド系抗炎症薬)はこのモデルにおいて空気嚢への好酸球の動員の阻止することが示されている(Das et al., 1997を参照のこと)。他の抗エオタキシン抗体は、(すでに先に議論された)インビボ・モデルの範囲で好酸球の動員を阻止することがすでに示されている、上記モデルにおいて、好酸球増加症をオブアルブミン感作動物におけるエオタキシンの局所投与により刺激したか、あるいはオブアルブミン(抗原)免疫により誘発した。
【0182】
CAT−212又はCAT−213の効果をオブアルブミン感作マウスにおける空気嚢モデルで調べた、ここで好酸球増加症を空気嚢内(i.po.)投与された組換えヒト・エオタキシン又はオブアルブミンのいずれかにより誘発した。
【0183】
方法
雌Balb/cマウス(17〜21g、Harlan U.K.又はCharles Riverにより供給された)をBabraham Institute(Cambridgeshire)で小動物柵ユニットの中に収容した。マウスを1ケージに3匹収容し、そのケージは12時間の昼/夜サイクル(午前7時に点灯)である。動物を実験前の少なくとも2週間その動物小屋に馴化させ、そして飼料と水を自由摂取させた。
【0184】
感作をDas et al., 1997により報告されたとおり実施した。簡単に言うと、マウスを1日目と8日目に100gの水酸化アルミニウム・ゲル中オブアルブミン(3.3mg水酸化アルミニウム含有0.4mlの生理食塩水;再水和ゲル)の皮下(s.c.)注入によりオブアルブミンに対して感作した。1の空気嚢をDas et al., 1997によりすでに報告されている方法で上記マウスの背中に形成した。9日目、マウスをイソルレンにより麻酔し、そして2.5mlの無菌空気(0.25μmろ過)を各マウスの背中に皮下注入した。12日目、マウスにさらに2.5mlの無菌空気を注入して上記空気嚢を再び膨らませた。15日目、マウスをエオタキシン又はオブアルブミンのいずれかにより免疫した。
【0185】
ヒト・エオタキシン免疫手順
実験に先立ち、i.po.投与されたヒト組換えエオタキシン(Albachem)がオブアルブミン感作マウスにおいて好酸球増加症を再現しうることを明らかにした。ヒト・エオタキシン投与の30分前、組換えマウスIL−5(IL−5;100pmol kg-1)を静中(i.v.)注入して好酸球の循環プールを増加させた(Collins et al., 1995を参照のこと)。6時間後、ヒト・エオタキシン(1μg、0.5ml i.po.)は生理食塩水(0.5ml i.po.)に比べ上記空気嚢への好酸球動員の明らかな増加を引き起こした(エオタキシン5.3±1.1、生理食塩水1.2±0.3好酸球×105 ;n=6、P<0.01マンホイットニー検定)。さらなる実験において、100pmol kg-1のIL−5(i.v.)、並びに1μgのヒト・エオタキシン(i.po.)を使用し、そしてエオタキシン投与後6時間に計測を行った。生理的食塩水によってのみ処理された対照群をも基礎細胞流入を得るために全ての実験の中に含んだ(シャム免疫群)。
【0186】
オブアルブミン免疫手順
オブアルブミンの免疫用量をオブアルブミン感作マウスにおける試験的な実験の系から決定した。最初の実験において、100μgでなく1及び10μgのオブアルブミン(0.5ml、i.po.)が24時間後に溶媒処理動物(0.5mlの生理食塩水、i.po.)に比べて顕著な好酸球動員を引き起こすことを示した。10μgのオブアルブミンが最も再現性のある応答を生じたので(オブアルブミン6.4±1.1、生理食塩水1.46±0.23好酸球×105 ;n=6、P<0.01、ダネット検定による分散分析)、この用量をこれ以降経時的実験に使用した。この実験において、マウスは生理的食塩水又は10μgのオブアルブミンのいずれかを受け(i.po.)、そして細胞流入を免疫後2〜72時間の間評価した。6時間の時点を、好酸球(並びに細胞合計)の上記空気嚢への流入がこの時に最大となったとして選んだ(オブアルブミン5.4±1.4、生理食塩水1.1±0.2好酸球×105 ;n=5〜6)。全てのこれに続く実験において、10μgのオブアルブミン(i.po.)を投与し、そして6時間で計測を行った。生理食塩水のみで免疫した対照群をも基礎細胞流入を得るために全ての実験に含んだ(シャム免疫群)。さらに、オブアルブミン感作動物において、オブアルブミン免疫(10μg i.po.)を受けてマウス・エオタキシン・レベルを高めることを示した(生理食塩水対照93±12、オブアルブミン免疫3539±372pg ml-1;n=8〜9、P<0.001、マンホイットニー検定)。
【0187】
薬剤投与
全身的なIgG抗体処理(CAT−213,CAT−001(無IgG処理)又は抗マウス・エオタキシンIgG1(R&D Systems))をヒト・エオタキシン又はオブアルブミンの投与30分前に静中により行った。CAT−212,CAT−171(無scFv対照)又はCAT−213により局所的な空気嚢内処理をヒト・エオタキシン又はオブアルブミンの投与と同時に行った。溶媒対照群を全ての抗体実験に含め、そしてこれらのマウスはPBSの投与を受けた。全ての静中注入を100μlの容量で尾静脈を介して行ない、そして全てのi.po.注入を0.5mlの総量で行った。
【0188】
結果の定量化
マウスを、CO2 窒息、あるいは血漿サンプルを必要とする場合には過剰量のペントバルビタール・ナトリウムに続けて心臓穿刺することにより洗浄前に屠殺した。その空気嚢を5Uml-1ヘパリン含有氷冷PBS(1ml;カルシウム又はマグネシウム不含;Sigma)により洗浄し、そして氷中に保存した。洗浄液のアリコート(10μl)を総細胞の評価(高速読み取り、使い捨て細胞カウンター、Immune Systems Ltd)のために取り出し、そして100,000細胞を含むさらなるサンプルをサイトスピン調製のために取り出した。残った洗浄液を1000gで5分間遠心分離し、次にその上清をアリコートにし、そして−70℃で保存した。上記の細胞ペレットを再懸濁し、そしてサイトスピンを調製し、風乾し、そして示差的に細胞をカウントするためにライト染色(Wrights stain)により染色した。ある場合に、上記洗浄上清をELISA(R&D Systems)によりエオタキシンについてアッセイした。
【0189】
示される全ての結果は平均±SEである。細胞流入データを空気嚢当たりの細胞数として表すか、あるいは薬剤処理について、好酸球流入の阻害%として表した。好酸球流入の阻害%を以下の方程式を用いて各処理群について細胞数データから計算した:
【0190】
【数1】
【0191】
次に各処理群について平均±SEを計算した。
【0192】
大部分の生データをダンネットによる分散分析により統計学的に分析した。ステューデントのt検定又はマンホイットニー検定をも使用した。全ての統計学的分析をInstatソフトウェアを用いて実施し、そしてP<0.05の時、平均値の間の差を有意と解釈した。
【0193】
結果
エオタキシンi.po.により処理したマウスにおけるCAT−212又はCAT−213の効果
CAT−212(0.0005,0.005、& 0.05mg kg-1 i.po.)は、IL−5処理オブアルブミン感作マウスにおいてヒト・エオタキシン(1g;i.po.)により引き起こされた好酸球増加症を有意して減じた(それぞれ32,79、及び95%阻害;n=8)(図10)。CAT−171効果をもたない対照scFv(0.05g kg-1 i.po.)は好酸球動員に効果がなかった(−5±15%阻害;n=8)。
【0194】
ヒト・エオタキシン(1μg、i.po.)と同時にi.po.投与したCAT−213(0.001,0.01,0.1,& 1mg kg-1、n=7〜8)は、好酸球増加症の用量相関阻害能力を生じた(図10)。
【0195】
全てのCAT−213用量が有効であり、そして94%の最大阻害を1μg kg-1でのCAT−213により観察した。CAT−001、1μg kg-1は細胞流入にわずかに効果があった(7±1%阻害、n=8)。
【0196】
ヒト・エオタキシン(1μg)のi.po.注入30分前にi.v.投与したCAT−213(0.01,0.1,1,& 10mg kg-1)は、IL−5処理オブアルブミン感作マウスにおいて好酸球動員の有意な用量依存的阻害(それぞれ、46,73,79,& 91%、n=8)を生じた(図10)。CAT−001対照IgG4(10mg kg-1)は好酸球動員に有意に影響しなかった(8±1%阻害、n=8)。
【0197】
よって、CAT−213の空気嚢内投与は、インビボにおいて好酸球増加を抑制するその能力においてCAT−212と等しい効力を持つ(CAT−213及びCAT−212の両者についてのED90は約1×10-9mols kg-1である)。CAT−213及びCAT−212はヒト・エオタキシンの中和によりインビボにおける好酸球増加を妨げる;これらの抗体は、インビトロにおける走化作用アッセイ(実施例12を参照のこと)において比較した時にヒト・エオタキシンに対して類似の中和力価を持つことがすでに示されている。CAT−213もi.v.投与の後に好酸球動員を抑制する(CAT−212はi.v.で試験しなかった)。しかしながら、CAT−213は、局所的に与えられた時に好酸球増加を減少させる、ヒト・エオタキシンのより強力な阻害剤である(i.po.投与のCAT−213はi.v.投与に比べて約10倍強力である;図10)。
【0198】
オブアルブミンi.po.処理動物におけるCAT−213の効果
CAT−213(0.01,0.1,1,& 10mg kg-1、n=7〜8)i.po.は用量依存的にオブアルブミンにより増加した好酸球動員を阻害した。CAT−213とオブアルブミンを同時に投与した。0.1mg kg-1及び10mg kg-1のCAT−213はそれぞれ60%及び97%阻害を生じた。CAT−213 i.po.はその空気嚢への単核細胞流入をも阻害したが、しかし好中球動員には顕著に影響しなかった(表2)。CAT−001、10mg kg-1 i.po.は細胞流入にわずかに効果があった(好酸球流入の阻害は−20±18%であった、n=8)。
【0199】
i.v.投与したCAT−213はオブアルブミン(i.po.)により誘発した好酸球動員を有意に阻害した。オブアルブミンの30分前に与えたCAT−213(0.01,0.1,1,& 10mg kg-1 i.v.、n=8)は6時間目で好酸球増加を阻止した。1及び10mg kg-1は、それぞれ56及び85%までの好酸球動員の有意な阻害を生じた。0.01及び0.1mg kg-1のCAT−213、並びに10mg kg-1のCAT−001(効果のない抗体対照)は不活性であった(図19;CAT−001阻害14±14%、n=8)。(CAT−001でなく)CAT−213 i.v.はその空気嚢へのオブアルブミン誘発好中球及び単核細胞動員の用量依存的阻害を生じた(表2)。
【0200】
同様に、上述のデータは、CAT−213を空気嚢に局所的に与えた時、好酸球増加のより強力な阻害物質であることの兆候を示している(i.v.投与よりも約10倍強力である;図19)。しかしながら、CAT−213の局所(i.po.)投与ではなく全身(i.v.)投与は好中球流入を阻止する能力を持つ。CAT−213の全身及び局所投与は共に単核細胞の走化作用を阻害しうる。
【0201】
別個の実験において、抗マウス・エオタキシンIgG2A(R&D Systems)の全身(i.v.)投与の効果をオブアルブミン(i.po.)免疫マウスにおいて調べ、比較データを提供した。抗マウス・エオタキシン(0.05、0.5,& 5mg kg-1、n=7〜8)は好酸球動員の用量依存的阻害を生じた(それぞれ、14,37,& 67%)。よって、CAT−213及び抗マウス・エオタキシンIgG2Aは、応答の程度及び力価の両方において好酸球走化作用に対して類似の阻害を生じた(図19)。
【0202】
まとめ
まとめれば、上記ヒト抗エオタキシン抗体、CAT−212(scFv)、及びCAT−213(IgG4)はアレルギー性炎症のインビボ・モデルにおいて好酸球増加を強力に阻止する。CAT−213は、局所的及び全身的のいずれで与えられた場合でも有効である。CAT−213の全身的投与は好中球、並びに単核細胞の走化作用を阻止する付加的な作用を持つ。これらのデータは、インビボでのエオタキシンへの生物学的応答の阻止におけるCAT−213及びCAT−212の作用と一致する。
【0203】
実施例15
L1.2 CCR−3トランスフェクト細胞を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるCAT−213の中和力価:アカゲザル及びマウス・エオタキシン
アカゲザル及びマウス・エオタキシンを中和するCAT−213の能力を原則的に実施例2に記載のとおりの走化作用アッセイにより評価した。
【0204】
アッセイ・プロトコール
従ったアッセイ・プロトコールは実施例2について記載されたものと原則的に同じであった。走化作用をアカゲザル・エオタキシン又はマウス・エオタキシンのいずれかにより高めた。アカゲザル(125ng/ml)又はマウス(50ng/ml)エオタキシンをトランスウェル培養システムの下部チャンバー中でインキュベートし、その後、それぞれ1×106 又は2×106 のL1.2−CCR3細胞を上記トランスウェルの上部チャンバーに加えた。遊走細胞をFACS分析により定量化し、そして1分間速い流速でカウントした。
【0205】
結果
CAT−213は、L1.2−CCR3細胞のアカゲザル、及びマウス・エオタキシン仲介走化作用を阻害し、それぞれ3.03×10-7M(1.01×10-7、9.01×10-7M)及び2.63×10-6M(1.30×10-6、5.34×10-6M)の幾何平均IC50及び95%信頼区間値を有する(図12)。上記データはそれぞれ三重及び二重で実施された少なくとも3の実験を表す。
【0206】
実施例16
ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるCAT−213の中和力価
走化作用アッセイは、エオタキシンのCCR3発現細胞の化学遊走を誘発する能力を評価するためインビトロ・アッセイ系と関連がある。この場合、上記CCR3発現細胞が血液から直接得られたヒト好酸球であるためこれらの実験では生理学的関連性が増加している。
【0207】
好酸球の調製
好酸球を、アレルギー性疾患の症状を持たないアトピーの、喘息を持たない患者のヘパリン化末梢血から単離した。血液を1/5量のデキストラン溶液(生理食塩水中、6%w/v)と混合し、そして赤血球を室温で45分間沈殿させた。上記赤血球除去血漿をLymphoprep(商標)上に重ね、そして800g、20℃で25分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離した。
【0208】
顆粒球ペレットの残留赤血球を2回の低張溶解により除去し、その後好中酸を抗CD16コート超常磁性マイクロビーズ(MACS,Miltenyi Biotec;3×106 顆粒球当たり2μlのビーズ)と一緒に0℃で30分間インキュベートすることにより標識した。次に上記細胞を強磁場中で10mlスチール・ウール・カラムに流し、そして標識されていない細胞をカラムの4倍量の氷冷標識バッファー(PBS、2×10-3M EDTA、0.5%w/vウシ血清アルブミン)により抽出した。その抽出細胞は常に>95%好酸球であった。
【0209】
アッセイ・プロトコール
好酸球を1×10-2M HEPES及び0.3%w/v BSAを添加したHBSS中に再懸濁し、そして走化作用アッセイに使用する前に37℃/5% CO2 で少なくとも45分間インキュベートした。サンプル(培地又は1×10-8Mヒト・エオタキシン、プラス又はマイナスCAT−213又はCAT−001(対照抗体))を48ウェル・マイクロ走化作用・チャンバーの下部ウェルに加えた。
【0210】
ポリビニルピロリドン(PVP)不含ポリカーボネート膜フィルター(8μmポアサイズ)を下部ウェルと上部ウェルの間に配置し、そしてそのチャンバーを37℃/5% CO2 で30分間インキュベートした。次に細胞をその上部ウェルに加え、そしてそのチャンバーを37℃/5% CO2 でさらに60分間インキュベートした。この期間終了後、遊走しなかった細胞を上記フィルターの上面からはがした;上記フィルターを乾燥させ、メタノールにより固定し、そしてMay−Gruenwald/Giemsaを用いて染色した。遊走細胞を各サンプルについて5倍の高倍率(×400)視野中でカウントした。
【0211】
結果
三重のポイントで実施した3の別個の実験の結果を図13(平均±SEM)に示す。CAT−213は、ヒト好酸球のエオタキシン仲介走化作用を1.53×10-9M(3.09×10-11 、7.54×10-8M)の幾何平均IC50及び95%信頼区間で阻害した。CAT−001(対照抗体)は走化作用に影響しなかった。したがって、CAT−213はヒト好酸球のエオタキシン誘発走化作用を中和する。
【0212】
実施例17
エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるCAT−213の中和力価 形状変化は走化作用において必須の過程であり、そして将来的な遊走応答の徴候と考えられる。好酸球がエオタキシン勾配への応答により血液循環から組織へ移動するために、細胞骨格成分の再組織化が起こらなくてはならない。この再組織化は細胞形態学における特有の変化を伴い、これは前方散乱(FSC)への変化としてフローサイトメーターにおいて可視化される。この実施例において使用したアッセイはSabroe et al (1999)により記載された方法を使用する。
【0213】
アッセイ・プロトコール
以下のとおりに得られた顆粒球調製物を用いて実験を実施した。末梢血をEDTA(10mlの血液当たり150μlの0.5M EDTA)を含むシリンジ内に採取し、そして10mlの血液当たり1mlの、0.9%生理食塩水中6%デキストラン−T500の追加により赤血球を沈殿させた。沈殿を室温で40分間起こした。次にその赤血球除去血漿を不連続70%〜80%パーコール勾酸上に重ね、そして1137g、室温で20分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離した。得られた顆粒球層をPBSにより洗浄し、次に306g、室温で5分間遠心分離してペレットにした。次にその細胞ペレットを形状変化バッファー(PBS、1×10-3M CaCl2 、1×10-3M MgCl2 、1×10-2M HEPES、1×10-2Mグルコース、0.1% BSA、pH7.3)中に再懸濁した。次に細胞を37℃で30分間インキュベートした。
【0214】
3×10-9Mエオタキシン又はバッファー、プラス又はマイナスCAT−213又はCAT−001(対照)を300μlの容量でポリプロピレン・フローサイトメーター用試験管に加えた。(100μlで)5×105 細胞を各試験管に加えた。次に試験管を37℃で7分間すみやかにインキュベートし、その後氷冷浴に移した。最後に25μlのCellfixバッファー(10×)を加え、そして個々の試験管をフローサイトメーターで読み取った。好酸球をFL2チャンネルを用いてそれらの自己蛍光により同定した。次にFSCを評価した。
【0215】
結果
このアッセイの結果を図14に示す。CAT−213はヒト・エオタキシンによりヒト好酸球に惹起した形状変化を阻害し、7.14×10-10 M(2.07×10-10 、2.44×10-9M)の幾何平均IC50及び95%信頼区間を持つ。データを、別個の提供者からの細胞を用いた二重のポイントにより実施した5の実験からの平均±SEMとして表す。
【0216】
【化3】
【0217】
【化4】
【0218】
【化5】
【0219】
【表1】
【0220】
【表2】
【0221】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】 上記エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるscFv 3G3の中和力価を示す。データは2の独立実験の標準誤差範囲を伴う平均を表す。最大走化作用は50ng/mlヒト・エオタキシンに対する応答において下部チャンバーへ遊走した細胞数である。scFv 3G3に関するIC50は800nMである。
【図2】 試験した他の関連する又は関連しない抗原のいずれについてもバックグラウンド(PBS)を越えるシグナルを持たないCAT−212の特異性ELISAを示す。弱いシグナルがマウス・エオタキシンに対して観察された。
【図3】 エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるCAT−212及びCAT−213の中和力価を示す。
【図4】 競合アッセイにおけるCAT−212のIC50を説明する。
【図5】 エオタキシンに対するCAT−212の親和性の決定に使用したCAT−212に結合するエオタキシンのスキャッチャード・プロットを示す。
【図6】 CAT−212への結合に対するマウス・エオタキシンの競合を説明する。
【図7】 エオタキシンにより誘発した細胞内Ca2+濃度の上昇のCAT−212による中和を示す。10nMエオタキシン+/− CAT−212(CAT−212の濃度は警告文中に示した)の追加に対する応答における蛍光発光の変化をFLIPRにより経時的に計測した。対照はバッファーのみの追加である。Abだけの追加では蛍光発光は有意に変化しない。エオタキシンについて三重のウェル、そして各抗体濃度について二重のウェルの平均を示す。
【図8】 12s〜100sまでのデータについて計算した、カルシウム流動アッセイにおけるCAT−212に関するデータの曲線下の面積を示す。Y軸上の孤立したポイントはエオタキシンのみである。エオタキシンについて三重のウェル、そして各抗体濃度について二重のウェルの平均及び標準偏差を示す。
【図9】 CAT−213のヒト・エオタキシンへの結合特異性を証明する。
【図10】 IL−5により処理したオブアルブミン感作マウスの空気嚢へのヒト・エオタキシン誘発好酸球動員に対するCAT−212及びCAT−213の効果を示す。CAT−212をi.po.投与したのに対してCAT−213を別々の実験においてi.po.及びi.v.の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的な細胞カウント・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施により統計的に評価した。 *P<0.05、**P<0.01はヒト・エオタキシン免疫PBS対照動物(=0%阻害;n=7〜8)との比較による。各ポイントは平均値を表し、そしてその垂直なバーはSEを示す。空気嚢に局所的に投与されたCAT−213又はCAT−212は好酸球増加の用量相関阻害を引き起こした。全身的に与えられたCAT−213は好酸球の走化作用をも有意に阻害した。
【図11】 オブアルブミン感作マウスの空気嚢へのオブアルブミン誘発好酸球動員に対するCAT−213の効果を説明する。別々の実験においてCAT−213をi.po.及びi.v.の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的な細胞カウント・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施により統計的に評価した。 *P<0.05、**P<0.01はオブアルブミン免疫PBS対照動物(=0%阻害;n=7〜8)との比較による。各ポイントは平均値を表し、そしてその垂直なバーはSEを示す。上記空気嚢に局所的に投与されたか又は全身的に与えられたCAT−213は好酸球増加の強力な用量相関阻害を引き起こした。好酸球動員に対する抗マウス。エオタキシンIgG2A(R&D Systems mAb)のi.v.投与の効果を比較のために示す。
【図12】 L1.2−CCR3細胞のアカゲザル・エオタキシン及びマウス・エオタキシン誘発走化作用に対するCAT−213の効果を説明する。データは、それぞれ三重又は二重で実験した少なくとも3の実験からの平均±SEMで表す。
【図13】 ヒト末梢好酸球のヒト・エオタキシン誘発走化作用のCAT−213による中和を示す。データは、三重のポイントで実施した3の実験からの平均±SEMで表す。
【図14】 CAT−213がヒト好酸球のエオタキシン仲介形状変化を阻害したことを示す。CAT−001(対照抗体)は不活性であった。データは、二重のポイントで実施した5の実験からの平均±SEMで表す。
【配列表】
Claims (19)
- ヒト・エオタキシン(eotaxin)に結合するヒト抗体であり、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含む抗体VHドメイン;および、さらにVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む抗体VLドメインを含み、ここで、前記VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は、それぞれ配列番号5、配列番号6、及び配列番号7のアミノ酸配列から成り、そして、前記VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は、それぞれ配列番号8、配列番号9、及び配列番号10のアミノ酸配列から成る上記ヒト抗体。
- CAT−212 VHドメイン(配列番号2)及びCAT−212 VLドメイン(配列番号4)を含む抗体のエオタキシン結合ドメインとエオタキシンへの結合のために競合する、請求項1に記載のヒト抗体。
- CAT−212 VHドメイン(配列番号2)を含む、請求項1又は2に記載のヒト抗体。
- CAT−212 VLドメイン(配列番号4)を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のヒト抗体。
- CAT−212 VHドメイン(配列番号2)およびCAT−212 VLドメイン(配列番号4)を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のヒト抗体。
- CAT−212 VHドメイン(配列番号2)及びCAT−212 VLドメイン(配列番号4)により形成されるエオタキシン抗原結合部位の親和性と同等か又はそれよりも高い親和性でエオタキシンを結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のヒト抗体であって、ここでヒト抗体の親和性、及び抗原結合部位の親和性は同じ条件下で測定される上記ヒト抗体。
- エオタキシンを中和する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒト抗体。
- 同じ条件下で測定されたCAT−212 VHドメイン(配列番号2)及びCAT−212 VLドメイン(配列番号4)により形成されるエオタキシン抗原結合部位の力価、ヒト抗体の力価、並びに抗原結合部位の力価と同等か又はそれよりも高い力価でエオタキシンを中和する、請求項7に記載のヒト抗体。
- ヒト抗体がscFv抗体分子である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト抗体。
- 抗体定常部を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト抗体。
- ヒト抗体が完全な抗体である、請求項10に記載のヒト抗体。
- IgG4定常部を含む、請求項10又は11に記載のヒト抗体。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のヒト抗体又は前記ヒト抗体の抗体VH若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
- 請求項13に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のヒト抗体又はその抗体VH若しくはVLドメインの製造方法であって、上記ヒト抗体又は抗体VH若しくはVLドメインの産生条件下で請求項14に記載の宿主細胞を培養することを含む上記方法。
- 前記ヒト抗体又は抗体VH若しくはVL可変ドメインの分離、及び/又は精製をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 医薬として許容される賦形剤、医薬として許容される担体、医薬として許容される緩衝剤、及び医薬として許容される安定化剤から成る群から選択される少なくとも1の追加成分を含む組成物への前記ヒト抗体又は抗体VH若しくはVL可変ドメインの配合をさらに含む、請求項15又は16に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のエオタキシンを結合するヒト抗体のエオタキシン又はエオタキシン断片への結合を含む方法であって、該方法がインビトロで行われる、方法。
- 配列番号1又は配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の単離された核酸。
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