JP2003528598A - エオタキシンに対するヒト抗体及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 エオタキシン−１に対する特異的結合メンバー、特にヒト・エオタキシン−１に対するヒト抗体及び抗体断片、そして特にエオタキシン−１活性を中和するもの。本明細書中でＣＡＴ−２１２と称されるｓｃＦｖ断片の抗体ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、並びに本明細書中でＣＡＴ−２１３と称されるそのＩｇＧ４抗体。上記ＣＡＴ−２１２／−２１３ ＶＨ及び／又はＶＬドメインの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、特に他の抗体骨格領域内のＶＨ ＣＲＤ３。特異的結合メンバーを含む組成物、及び治療によるヒト又は動物の体の処置方法を含むエオタキシンの阻害又は中和方法への使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はエオタキシン−１に対する特異的結合メンバー、とりわけヒト・エオ
タキシン−１に対するヒト抗体、及び特にエオタキシン−１活性を中和するもの
に関する。本発明の好ましい態様は、本明細書中でＣＡＴ−２１２と呼ばれるｓ
ｃＦｖ断片の、並びに本明細書中でＣＡＴ−２１３と呼ばれるＩｇＧ４抗体の抗
体ＶＨ及びＶＬドメインを利用する。より好ましい態様は、ＣＡＴ−２１２／−
２１３ ＶＨ及び／又はＶＬドメインの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、
特に他の抗体のフレームワーク領域内のＶＨ ＣＤＲ３を利用する。本発明のさ
らなる側面は、本発明の特異的結合メンバーを含む組成物、及び治療によるヒト
又は動物の体の処置法を含む、エオタキシンの阻害又は中和方法におけるそれら
の使用のために提供される。

【０００２】 エオタキシン−１は、主に好酸球に発現される特異的レセプター、ＣＣＲ３に
結合する化学走性誘因タンパク質である。抗エオタキシン−１抗体は好酸球増加
症及び炎症部位への好酸球の動員の阻害に使用される。１の態様において、本発
明は、ｓｃＦｖファージ・ディスプレイ・ライブラリーに由来した、ＣＡＴ−２
１２と呼ばれるヒト抗体断片を提供する。ＣＡＴ−２１２は機能に関連した（走
化作用）バイオ・アッセイにおいて６５０pMのＩＣ₅₀でヒト・エオタキシンを強
力に中和する。ＣＡＴ−２１２は１５pMのＫ_D を持つ高い親和性を持つ。さらな
る態様において、ここで前記ＣＡＴ−２１２ ｓｃＦｖをヒトＩｇＧ４として再
編成し、その抗体をＣＡＴ−２１３と呼ぶ。ＣＡＴ−２１３はＣＡＴ−２１２と
同様の能力を持ち、そして走化作用アッセイにおいて７００pMのＩＣ₅₀でヒト・
エオタキシンを中和する。ＣＡＴ−２１３もオブアルブミン感作マウスにおける
単核細胞走化作用を妨げる。ＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３は共にアレルギ
ー性炎症のインビボ・モデルにおいて好酸球の増加を強力に妨げる。

【０００３】 好酸球は通常、総末梢血白血球の１〜３％の割合を占める。好酸球の著しい集
積は好酸球増加症として知られる症状であり、多くの病気、例えばアレルギー性
疾患、寄生生物による感染症、及び癌において引き起こされうる（Rothenburg 1
998 ）。好酸球増加症は血液１ミリ四方当たり３５０超の好酸球を有する場合に
分類され、そしていくつかの症例においてそのレベルは１ミリ四方当たり５００
０細胞超まで上昇する。罹患した個人の末梢血における集積と同様に、好酸球は
体のあらゆる組織に選択的に集積しうる。前述の好酸球増加症は好酸球の炎症誘
発性作用により有害である。好酸球増加の状態、例えば喘息において、浸潤して
いる好酸球の数と疾患の重度の間にしばしば相関関係が存在する。

【０００４】 それらが延長された期間生き延びることができる炎症部位での好酸球の集積は
それらが直に接する環境において産生されるサイトカインの組合せに依存してい
る。好酸球は多くの毒性の炎症メディエータを含有し、それらメディエータは顆
粒の中に貯蔵されている。多数のサイトカインの１以上による活性化により、好
酸球は脱顆粒してカチオン性タンパク質、例えば主要な塩基タンパク質、好酸球
由来の神経毒、及び好酸球性ペルオキシダーゼを含むこれらの毒素を放出する。
さらに、活性化好酸球は化学走性誘因物質、脂質メディエータ、例えばロイコト
リエン、及び幅広い炎症性サイトカインをも放出する。これらの物質の大部分は
組織、例えば喘息における気道上皮において重大な細胞障害性作用を有する（Ro
thenberg, 1998 ）。

【０００５】 ケモカインは相同性の８〜１０kDa のタンパク質のグループであり（Luster,
1998）そのグループは保存されたシステイン残基の相対位置に基づいてファミリ
ーに細分される。ケモカインは、それらが通常の発達及び恒常性、そして重要な
ことには炎症の間に白血球の移動のための指向性シグナルを提供するといった、
血液から組織への白血球の血管外遊走の仲介に重要な役割を担う。さまざまな走
化性物質、例えばロイコトリエンＢ₄ 、インターロイキン、及び細菌性産物が存
在し、それらは組織に好酸球を動員しうるが、ケモカイン、エオタキシン−１だ
けが特異的に好酸球の動員を示している。

【０００６】 ヒト・エオタキシンはケモカインのβ又はＣＣ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）サブファミ
リーの急速に拡大しているグループのメンバーである。このグループの分子は、
４つの保存されたシステインの最初の２つが隣接し、かつ２０〜７５％の配列の
同一性を共有することを特徴とする。このファミリーのメンバーはエオタキシン
−２（Forssmann et al., 1997; White et al, 1997 ）、エオタキシン−３（Sh
inkai et al, 1999 ）、単球化学走性誘因タンパク質（ＭＣＰ）−１，ＭＣＰ−
２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＭＣＰ−５（Van coillie et al, 1999 ）、マク
ロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１，ＭＩＰ−１β，ＴＡＲＣ，ＬＡＲ
Ｃ，Ｉ３０９、及びＲＡＮＴＥＳを含む。

【０００７】 エオタキシン−１は８．４kDa 、７４アミノ酸のタンパク質であり、アレルゲ
ン免疫感作モルモットからの気管支肺胞洗浄液中に最初に検出された（Griffith
s-Johnson et al, 1993; Jose et al, 1994a）。前記分子は、その皮下注入部位
で好酸球の十分な集積を誘導する強力な化学走性誘因物質として最初に同定され
た。モルモットの遺伝子が最初にクローニングされ（Jose et al, 1994b, Rothe
nberg et al, 1995a）、続いてマウスの遺伝子がクローニングされた（Rothenbe
rg et al, 1995b ）。ヒト・エオタキシン遺伝子が続いて同定され（Kitaura et
al, 1996; Garcia-Zepeda et al, 1996; Ponath et al, 1996）、そしてラット
の相同体はつい最近、クローニングされた（Williams et al, 1998）。ヒト・エ
オタキシンはマウス及びモルモット・エオタキシンと６１％の同一性を有し、そ
してラット・エオタキシンと６２％の同一性を有する。そのヒト遺伝子はクロモ
ソーム１７上に位置し、そして３のエクソンと２のイントロンを含む。前記遺伝
子の５′フランキング領域は、ＡＰ−１，ＮＦＢに対する結合部位、インターフ
ェロン・ガンマ応答エレメント、及びグルココルチコイド・レセプターを含む多
数のコンセンサス調節エレメントを含み、遺伝子発現がサイトカイン並びにグル
ココルチコステロイドにより調節されていることを示唆している。

【０００８】 エオタキシンは、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、Ｔ−リンパ球、単球、及
びマクロファージを含むさまざまな正常の細胞型により産生される（Cook et al
, 1998; Ponath et al, 1996a; Li et al, 1997 ）。好酸球はエオタキシンに関
して主要な効果細胞であるが、好酸球は自身でエオタキシンを生産もし、そして
それを細胞内顆粒内に貯蔵する（Nakajima et al, 1998）。好酸球からのエオタ
キシンの放出は、炎症状態における好酸球の局所集積に寄与する。エオタキシン
発現は多くの炎症誘発性メディエータ、例えば腫瘍壊死因子−アルファ、インタ
ーフェロン、及びインターロイキン−１により異なる細胞型から誘発される。

【０００９】 エオタキシン−２は最近クローニングされた（Forssmann et al, 1997; White
et al, 1997）。それはエオタキシンと近い配列相同性を示さず、３９％のアミ
ン酸同一性しか共有しない。しかしながら、エオタキシンと同様に、１０分の１
の効果にもかかわらず好酸球及び好塩基球に対する化学走性誘因物質である。エ
オタキシン−３も最近同定されたが（Shinkai et al, 1999 ）、その効果はエオ
タキシンで観察されたそれの１０分の１と思われる。したがって、エオタキシン
−３は比較的高濃度において好酸球及び好塩基球に対して走化作用を持つ（Kita
ura et al, 1999 ）。

【００１０】 一般的に、ケモカイン・レセプターへのケモカインの結合において相当な冗長
が存在する。典型的には、いくつかの異なるＣＣケモカインが１種類のケモカイ
ン・レセプターに結合でき、またその逆に、１種類のＣＣケモカインがいくつか
の異なるケモカイン・レセプターに結合できる。ケモカイン・レセプター、ＣＣ
Ｒ３は、エオタキシン、ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＲＡＮＴＥＳ、
エオタキシン−２、及び３を含む多くのリガンドを有する。エオタキシンがこれ
らのうちで最も重要であると思われる。リガンドの大部分、例えばＭＣＰ−２，
ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ３に対して親和性が比較的低く、そのた
めＣＣＲ３仲介事件の誘発において特に効果的ではない。それに比べ、エオタキ
シンはＣＣケモカイン・レセプター３（ＣＣＲ３）に比較的高い親和性、Ｋｄ＝
０．５２nMで結合する（Ponath et al, 1996a ）。さらに、エオタキシンは、Ｃ
ＣＲ３だけに結合し、そしてあらゆる他のケモカイン・レセプターに結合しない
。すなわちエオタキシンはＣＣＲ３に特異的であるところでＣＣケモカインの間
では独特である。

【００１１】 ヒトＣＣＲ３はクローニングされ（Combadiere et al, 1995; Daugherty et a
l, 1996 ）、そしてそれは３５５アミノ酸の、４１kDa の、７の膜貫通ドメイン
を持つタンパク質である。それはその細胞外ドメインに４のシステインを含み、
そしてＧ−タンパク質を介したリン酸化の潜在的部位である細胞質内テール中に
８のセリン／スレオニン残基を含む。ＣＣＲ３はＮ−連結グリコシル化の潜在的
部位を持たない。ヒト・レセプターはマウス及びヒト・エオタキシンの両方を同
じ親和性で結合する（Daugherty et al, 1996 ）。マウス（Gao et al, 1996 ）
及びモルモット（Sabroe et al, 1998）ＣＣＲ３が続いてクローニングされ、そ
してヒトＣＣＲ−３とそれぞれ６９及び６７％のアミノ酸同一性を共有する。

【００１２】 ヒトＣＣＲ−３は好酸球（Ponath et al, 1996b ）及び好塩基球（Uguccioni
et al, 1997; Yamada et al, 1997 ）において主に発現される。それはＴ_H ２型
Ｔ細胞（Sallusto et al, 1997）、中枢神経系のミクログリア細胞（He et al,
1997）、及び樹状細胞（Rubbert et al, 1998 ）でも見られる。エオタキシンは
化学走性誘因物質であり、そしてＣＣＲ３発現細胞の活性化物質である。好酸球
上のＣＣＲ３への結合により、エオタキシンは細胞内カルシウム動員、細胞内ア
クチン重合化の開始、インテグリン発現の上方調節、及び酸素ラジカル産生の誘
発を引き起こす（Tenscher et al, 1996; Elsner et al, 1996）。ＣＣＲ３は、
１細胞当たり４０，０００（Daugherty et al, 1996）〜４００，０００（Ponat
h et al, 1996b）のレセプターを持つ好酸球において特に高レベルで発現される
。多くのＣＣＲ３リガンド、例えばＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４、及び
ＲＡＮＴＥＳもＣＣＲ３以外のケモカイン・レセプターに結合し、それによって
多種多様な細胞型の化学走性誘因を仲介する。それに比べ、ＣＣＲ３に対するそ
の高い選択性のため、エオタキシンは特に化学遊走を誘発することができ、そし
てＣＣＲ３発現細胞、例えば好酸球を活性化することができる。

【００１３】 エオタキシンの効果の阻止が治療的に使用されうる一連の証拠が増えている。
ウサギ又はヤギ抗体を用いたインビボにおけるいくつかの研究が存在する。その
一例の研究は静中（iv）投与した抗エオタキシン抗体の効果を調べた。Gonzalo
et al (1996)は２０μｇの抗エオタキシン・ウサギ・ポリクローナル抗血清ivを
オブアルブミン免疫マウスに注射した。免疫に先立つ抗体投与は、気管支肺胞洗
浄液中の好酸球集積の数により計算した場合、５６％まで好酸球増加を減少させ
た。

【００１４】 局所的に投与された抗エオタキシン抗体の効果の多くの報告も存在する。Humb
les et al (1997)は、前もって ¹¹¹Ｉｎ標識好酸球の注入を受けた実験未使用の
モルモット（naive guinea pig）の皮内へのモルモット・エオタキシン（１０ng
）とウサギ・ポリクローナル抗エオタキシン抗血清（１０μｌ）の同時注入につ
いて記載した。前記ポリクローナル抗体は局所的な好酸球集積を完全に阻止する
ことができた。同様に、Teixeira et al (1997）は、好酸球増加症のマウス・モ
デルを使用し、そのマウスの４〜８時間の能動性皮内アナフィラキシー反応部位
に皮内的にマウス・エオタキシン（１〜３０pmol）をウサギ・ポリクローナル抗
エオタキシン抗血清と同時注入した。抗血清の５％及び２０％希釈物は、好酸球
の動員をそれぞれ４５％及び９５％まで阻止した。加えて、Sanz et al (1998)
は、皮内ＩＬ−４注入により内生的に産生されたエオタキシンによる好酸球集積
において調べた。抗エオタキシン・ポリクローナル抗血清は、ＩＬ−４に対する
応答の後期（２４〜２８時間）に５４％の阻害を示したが、しかし早期（０〜４
時間）には示さなかった。

【００１５】 健康な状態及び好酸球が仲介する疾患の状態におけるエオタキシンの役割をさ
らに理解するために、標的遺伝子の破壊を使用してエオタキシンを欠くマウスを
生み出した（Rothenberg et al 1997 ）。それらのマウスを感作し、そしてオブ
アルブミンにより免疫した場合、好酸球の数を、野生型マウスに比べエオタキシ
ン無発現マウスの肺からのＢＡＬ中で７０％まで減少させた（免疫後１８時間）
。これは、エオタキシンが喘息モデルにおいて抗原免疫後、好酸球の動員の程度
を高めることを証明している。Nakamura et al. (Am. J. Resp. & Crit. Care M
ed. (1999) 160 : 1952-1956）はエオタキシン・レベルと喘息の関連、及び肺機
能との反比例を証明した。

【００１６】 エオタキシンｍＲＮＡは多くの組織により恒常的に産生され、そこで好酸球の
ホーミングによる役割を担うことが示唆されている（Rothenberg et al 1995 ）
。エオタキシン無発現マウスにおいて、ひどい組織学的異常はエオタキシンの発
現が知られている臓器を含めた全ての臓器で検出されなかった。同様に、白血球
の表現型における変化も検出されなかった。しかしながら、総好酸球カウントは
、野生型に比べて上記無発現マウスにおいて３分の１まで減少し、エオタキシン
が末梢循環における好酸球の基準の数を決定する役割を担っていることも示唆さ
れた（Rothenberg et al 1997 ）。

【００１７】 本発明による特異的結合メンバーは、エオタキシンが一因となるさまざまな疾
患及び病気における治療的な可能性を伴う、エオタキシンへの結合及び中和に有
用である。代表的な疾患及び病気をこれ以降で明確にする。

【００１８】 １の側面において、本発明はヒト・エオタキシンに結合し、かつＣＡＴ−２１
２ ＶＨドメイン（配列番号２）、及び／又はＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（
配列番号４）を含む特異的結合メンバーを提供する。

【００１９】 一般的に、ＶＨドメインはＶＬドメインと組合わされて抗体の抗原結合部位を
提供するが、これ以降で明確にするとおりＶＨドメイン単独で抗原の結合に使用
されうる。１の好ましい態様において、抗体の抗原結合部位をＣＡＴ−２１２
ＶＨ及びＶＬドメインの両方を含んで形成するために、ＣＡＴ−２１２ ＶＨド
メイン（配列番号２）をＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）と組合わ
せる。他の態様において、ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメインをＣＡＴ−２１２ Ｖ
Ｌを除いたＶＬドメインと組合わせる。Ｌ鎖の乱交雑は本技術分野で十分に確立
されている。

【００２０】 １以上のＣＤＲｓがＣＡＴ−２１２ ＶＨ又はＶＬドメインから選ばれ、そし
て好適な構造に組込まれる。これはこれ以降で明確にする。ＣＡＴ−２１２ Ｖ
Ｈ ＣＤＲ１，２、及び３をそれぞれ配列番号５，６、及び７に示す。ＣＡＴ−
２１２ ＶＬ ＣＤＲ１，２、及び３をそれぞれ配列番号８，９、及び１０に示
す。ＶＨ及びＶＬドメイン、並びにＣＤＲの変異体の配列を本明細書中に示し、
そしてそれを配列代替法又は変異及び配列決定により得られる、エオタキシンに
対する特異的結合メンバーに利用する。上述の方法は本発明により提供されもす
る。

【００２１】 その配列が特に本明細書中に開示されるＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可
変ドメイン・アミノ酸配列変異体を明確にされるとおり、本発明により利用しう
る。特定の変異体は、１以上のアミノ酸配列の変更（アミノ酸残基の付加、欠失
、置換、及び／又は挿入）を、おそらく約２０未満、約１５未満、約１０未満又
は約５未満、４，３，２又は１含む。変更は、１以上の構造領域、及び／又は１
以上のＣＤＲ中に作られる。

【００２２】 本発明による特異的結合メンバーは抗原への結合に関していずれかの特異的結
合メンバーと競合するものであり、この両者は上記抗原に結合し、かつ特異的結
合メンバー、本明細書中に開示されるＶＨ及び／又はＶＬドメイン、又は本明細
書中に開示されるＶＨ ＣＤＲ３、あるいはそれらいずれかの変異体を含む。結
合要素間の競合は、例えばＥＬＩＳＡの使用及び／又は１の結合要素への特定の
リポーター分子のタギングによりインビトロにおいて容易にアッセイされ、それ
らのアッセイは不タギング結合要素の存在を検出させ、同じエピトープ又は重複
するエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。

【００２３】 よって、本発明のさらなる側面は、エオタキシンへの結合に関してＣＡＴ−２
１２又はＣＡＴ−２１３と競合するヒト・抗体の抗原結合部位を含む特異的結合
メンバーを提供する。

【００２４】 エオタキシンに対する抗体であり、かつエオタキシンへの結合に関してＣＡＴ
−２１２又はＣＡＴ−２１３と競合しうる抗体を得るためにさまざまな方法が本
技術分野で利用可能である。

【００２５】 さらなる側面において、本発明は前記抗原に結合しうる１以上の特異的結合メ
ンバーを得る方法を提供し、その方法は本発明による特異的結合メンバーのライ
ブラリーを上記抗原と接触させ、そして上記抗原と結合しうる１以上の上記ライ
ブラリーの特異的結合メンバーを選択することを含む。

【００２６】 上記ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面に提示され、それぞれの粒
子は、その表面に提示した抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含み、ある
いは、存在するならば提示されたＶＬドメインをコードする核酸をも含む。

【００２７】 上記抗原を結合することができる特異的結合メンバーの選択、そしてそのバク
テリオファージ粒子上への提示に続いて、上記選択された特異的結合メンバーを
提示するバクテリオファージ粒子から核酸を採取する。上述の核酸は、この後に
続く、上記選択された特異的結合メンバーを提示するバクテリオファージ粒子か
ら得られた核酸配列を有する核酸からの発現による特異的結合メンバー又は抗体
ＶＨ可変ドメイン（場合により抗体ＶＬ可変ドメイン）の製造に使用される。

【００２８】 上記選択された特異的結合メンバーの抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を
有する抗体ＶＨ可変ドメインは、そのＶＨドメインを含む特異的結合メンバーと
して単離された形で提供される。エオタキシンを結合する能力がさらに試験され
、そしてエオタキシンへの結合に関してＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３と競
合する能力もさらに試験される。エオタキシンを中和する能力はこれ以降に明確
にするとおり試験される。

【００２９】 本発明による特異的結合メンバーはＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の親和
性と同じにエオタキシンを結合する。

【００３０】 本発明による特異的結合メンバーはＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の力価
と同じにエオタキシンを中和する。

【００３１】 さまざまな特異的結合メンバーの結合親和性及び中和力価は適当な条件下で比
較される。

【００３２】 抗体配列に加え、本発明による特異的結合メンバーは、例えばペプチド又はポ
リペプチド、例えば折り畳みドメインの形成、あるいは抗原結合能力に加えて他
の機能的特徴を分子に与える他のアミノ酸を含む。本発明の特異的結合メンバー
は検出可能な標識を担持するか又は毒素又は酵素に（例えばペプチジル結合又は
リンカーを介して）結合する。

【００３３】 さらなる側面において、本発明は、本発明による特異的結合メンバー、ＶＨ又
はＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供し、さらに本発明
の特異的結合メンバー、ＶＨドメイン、及び／又はＶＬドメインの製造方法を提
供する、ここで上記製造方法は上記特異的結合メンバー、ＶＨドメイン、及び／
又はＶＬドメインの産生を引き起こす条件下で上記核酸を発現させ、そしてそれ
を回収することを含む。

【００３４】 本発明による特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の体の治療方法又は診断方
法、例えばヒト患者の疾患又は病気の（予防的処置を含みうる）治療方法に使用
され、その治療方法は上記患者への有効量の本発明の特異的結合メンバーの投与
を含む。本発明により治療されうる症状は本明細書中の他のところで明確にされ
るものを含む。

【００３５】 本発明のさらなる側面は、本明細書中に開示される、抗体ＶＨ可変ドメイン及
び／又はＶＬ可変ドメインをコードする、一般に単離された核酸を提供する。

【００３６】 本発明の他の側面において、本明細書中に開示されたＶＨ ＣＤＲ又はＶＬ
ＣＤＲ配列を、特に配列番号５，６及び７から選ばれるＶＨ ＣＤＲ又は配列番
号８，９、及び１０から選ばれるＶＬ ＣＤＲ、最も好ましくはＣＡＴ−２１２
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号７）をコードする、一般に単離された核酸を提供す
る。

【００３７】 さらなる側面は本発明の核酸により形質転換された宿主細胞を提供する。

【００３８】 より一層さらなる側面は抗体ＶＨ可変ドメインの製造方法を提供し、上記製造
方法はコード核酸から発現を引き起こすことを含む。上述の方法は上記抗体ＶＨ
可変ドメイン産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含む。

【００３９】 ＶＬ可変ドメイン、並びにＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む特異的結合メン
バーの製造のための類似の方法を本発明のさらなる側面として提供する。

【００４０】 製造方法は上記産物の単離及び／又は精製のステップを含む。

【００４１】 製造方法は少なくとも１の付加成分、例えば医薬として許容される賦形剤を含
む組成物への上記産物の配合を含む。

【００４２】 本発明のこれらの、そして他の側面を以下により詳細に説明する。

【００４３】 専門用語 特異的結合メンバー これはお互いに対して結合特異性を有する分子の組合せメンバーを示す。特異
的に結合する組合せメンバーは自然に誘導されるか又は完全に若しくは部分的に
合成により製造される。分子の組合せの一方のメンバーは分子の組合せの他方の
メンバーに特異的に結合するその表面の領域又は間隙を持ち、そしてそれ故に分
子の組合せの他方のメンバーの特定の空間的及び極性の編成に相補的である。よ
って、対のメンバーは互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合の組合
せの種類の例は抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン・レセプ
ター、レセプター−リガンド、酵素−基質である。本出願は抗原−抗体型の反応
に関与する。

【００４４】 抗体 これは天然にせよ、部分的若しくは完全に合成により製造されたにせよ免疫グ
ロブリンを示す。前記用語は、抗体結合ドメインであるか又は抗体結合ドメイン
に対して実質的に相同体である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又は
タンパク質にも及ぶ。抗体の例は、免疫グロブリン・アイソタイプ及びそれらの
アイソタイプのサブクラス；抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ，ｓｃＦｖ，Ｆｖ
，ｄＡｂ，Ｆｄを含む断片；並びにダイアボディーである。

【００４５】 モノクローナル及び他の抗体を得、そして組換えＤＮＡ技術の手法を使用し、
他の抗体又は元の抗体の特異性を維持するキメラ分子を製造することが可能であ
る。上記手法は別の免疫グロブリンの定常部又は定常部プラス構造部への抗体の
免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡの
導入を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７，ＧＢ ２１８８６３８Ａ又はＥ
Ｐ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細
胞は遺伝子変異又は他の変更の対象であり、その変異又は変更は産生される抗体
の結合特異性を変化させるかどうか分からない。

【００４６】 抗体が多くの手段により修飾されうる場合、用語「抗体」は所望の特異性を持
つ結合ドメインを有するあらゆる特異的結合メンバー又は物質に及ぶと解釈され
るべきである。よって、この用語は天然か又は完全若しくは部分的合成かにかか
わらず免疫グロブリンの結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含めた、抗
体断片、誘導体、機能的同等物及び抗体の相同体に及ぶ。それ故に、免疫グロブ
リン結合ドメイン又は他のポリペプチドに融合した同等物を含むキメラ分子が含
まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥ
Ｐ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。

【００４７】 完全な抗体の断片が抗原結合の機能を果しうることは示されている。結合断片
の例は（ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；（ii
）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（iii ）単独の抗体のＶＬ及びＶ
Ｈドメインから成るＦｖ断片；（iv）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ward,
E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989))；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（
vi）２の連結したＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ′）２断片；（vi
i ）１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であり、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメイン
は、ペプチド・リンカーにより連結され、そのリンカーが抗原結合部位の形成に
関係する２つのドメインをもたらす。（Bird et al, Science, 242, 423-426, 1
998; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1998）；（viii）二重特異性１
本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）；並びに（ix）「ダイアボ
ディー」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ）断片（WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 6444-6448, 1993 ）である。Ｆｖ，ｓｃＦｖ又はダイアボディー分子は
ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド結合の組み込みにより安定化され
ている（Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996）。ＣＨ３ド
メインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）をも作
製する（S.Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996）。

【００４８】 ダイアボディーはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは免疫グロブ
リンＬ鎖の結合領域を含む第１ドメイン、及び免疫グロブリンＨ鎖の結合領域を
含む第２ドメインを含み、この２つのドメインは（例えばペプチド・リンカーに
より）連結されているが、抗原結合部位の形成に互いに関与することはできない
：抗原結合部位は多量体中のあるポリペプチドの第１ドメインと多量体内の他の
ポリペプチドの第２ドメインの関連性により形成される（ＷＯ９４／１３８０４
）。

【００４９】 二重特異性抗体が使用されるべき場合、それらは従来の二重特異性抗体であり
、さまざまな方法（Hollinger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechol.
4, 446-449 (1993)）、例えば化学的又はハイブリッド・ハイブリドーマから製
造されるか、あるいは先に触れた二重特異性抗体断片のいずれかである。ダイア
ボディー及びｓｃＦｖはＦｃ領域を伴わず、抗イディオタイプ反応の作用を大き
く低下させた可変ドメインだけを用いて構築される。

【００５０】 二重特異性の完全な抗体に対して二重特異性ダイアボディーは特に有用でもあ
る、なぜならそれらは容易にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で構築されそして発現
されるからである。適当な結合特異性のダイアボディー（及び他のポリペプチド
、例えば抗体断片の大部分）はライブラリーからのファージ・ディスプレイ（Ｗ
Ｏ９４／１３８０４）を用いて容易に選ばれる。ダイアボディーの１のアームが
、例えば抗原Ｘに対する特異性を持ち一定に保たれる場合、他のアームを変え、
そして適当な特異性の抗体が選ばれるところのライブラリーが作られる。二重特
異性完全抗体はｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ工学により作られる（J.B.B.
Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996）。

【００５１】 抗原結合ドメイン これは抗原に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全体に相補的である領域を
含む抗体の一部を示す。抗原が巨大な場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合
し、その部分をエピトープと呼ぶ。抗原結合ドメインは１以上の抗体可変ドメイ
ンにより提供される（例えばＶＨドメインから成るいわゆるＦｄ抗体断片）。好
ましくは、抗原結合ドメインは抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体Ｈ鎖可変領域
（ＶＨ）を含む。

【００５２】 特異性 これは、特異的結合の組合せの一方のメンバーがその特異的結合相手以外の分
子へのあらゆる有意な結合も示さないであろう状況に関して使用される。前記用
語は、例えば抗原結合ドメインが多数の抗原に担持される特定のエピトープに対
して特異的であり、この時、抗原結合ドメインを担持する特異的結合メンバーが
そのエピトープを担持するさまざまな抗原に結合しうるであろう場合にも適用さ
れる。

【００５３】 含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ） これは含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味で一般的に使用される、すなわち、１
以上の性質又は成分の存在を許すことである。

【００５４】 分離された これは本発明の特異的結合メンバー又はその結合メンバーをコードする核酸が
本発明と合致しているであろう状態に関する。メンバー及び核酸は、それらが発
見された自然環境、又はそれらが製造される（例えば細胞培養）環境、ここで上
記製造がインビトロ又はインビボで実施される組換えＤＮＡ技術による場合にお
いて伴う自然に結び付けられる物質、例えば他のポリペプチド又は核酸を含まな
いか又は実質的に含まない。メンバー及び核酸は希釈剤又はアジュバントと一緒
に配合され、そして事実上は単離されたままである−例えば上記メンバーは免疫
アッセイに使用するためのマイクロタイター・プレートをコートするために使用
されるゼラチン又は他の担体と普通に混合されるか、あるいは診断又は治療に使
用される場合、医薬として許容される担体又は希釈剤と混合される。特異的結合
メンバーは普通にか又は異種真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ若しくはＮＳＯ（Ｅ
ＣＡＣＣ ８５／１０５０３）細胞）の系によるかのいずれかでグリコシル化さ
れるか、あるいはそれらは（例えば原核生物細胞における発現により製造された
場合）グリコシル化されない。

【００５５】 「詳述したような」により、本発明の関連ＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメイ
ンがその配列が本明細書中で説明されている指定の領域と同一であるか又は非常
に類似しているかのいずれかであろうことを意味する。「非常に類似した」によ
り、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１若しくは２、あるいは３又
は４の置換がＣＤＲ及び／又はＶＨ若しくはＶＬドメイン内で起こりうることが
予期される。

【００５６】 本発明のＣＤＲを担持するための構造は一般的に抗体Ｈ鎖又はＬ鎖、あるいは
その実質的なタンパク質であり、それらの中で上記ＣＤＲは再配列免疫グロブリ
ン遺伝子によりコードされる天然のＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲに対
応する位置に配置される。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は（Kaba
t, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edit
ion. US Department of Health and Human Services. 1987 、及び現在インター
ネットで利用可能なその最新のもの（http://immno.bme.nwu.edu))を参照するこ
とにより決定される。

【００５７】 好ましくは、本明細書中で詳述したようなＣＤＲアミノ酸配列がヒト可変ドメ
イン又はその実質的なタンパク質中のＣＤＲとして担持される。本明細書中で詳
述したようなＶＨ ＣＤＲ３配列が本発明の好ましい態様を提供し、そしてこれ
らのそれぞれがヒトＨ鎖可変ドメイン又はその実質的なタンパク質中のＶＨ Ｃ
ＤＲ３として担持されることが好ましい。

【００５８】 本明細書において利用される可変ドメインはいずれかの生殖細胞系列又は再配
列ヒト可変ドメインから得られるか、あるいは既知のヒト可変ドメインのコンセ
ンサス配列に基づいた合成可変ドメインである。本発明のＣＤＲ配列（例えばＣ
ＤＲ３）は組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）の欠いた可変
ドメインのレパートリー内に導入される。

【００５９】 例えば、Ｍａｒｋｓ達（Bio/Technology, 1992, 10 : 779-783）は抗体可変ド
メインのレパートリーの製造方法を記載し、上記方法は、上記可変ドメイン領域
の５′末端か又はその付近に対するコンセンサス・プライマーをヒトＶＨコンセ
ンサス・プライマーによる遺伝子の第３構造領域への結合に使用してＣＤＲ３を
欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する。Ｍａｒｋｓ達は、どうやって
このレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ３と組合されるかをさらに記載している
。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３誘導配列をＣＤＲ３を欠くＶＨ又はＶ
Ｌドメインのレパートリーと混合し、そして上記の混合した完全なＶＨ又はＶＬ
ドメインを同起源のＶＬ又はＶＨドメインと組合せて本発明の特異的結合メンバ
ーを提供する。次に上記レパートリーを、好適な特異的結合メンバーを選択しう
るように好適な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７のファージ・ディスプレイ
系を用いて提示させる。レパートリーは１０⁴ を上回る個々のメンバーから、例
えば１０⁶ 〜１０⁸ 又は１０¹⁰メンバーのあらゆるメンバーから成る。

【００６０】 類似の混合又は組合せ技術がＳｔｅｍｍｅｒ（Nature, 1994, 370 : 389-391
）によっても開示され、上記Ｓｔｅｍｍｅｒはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関する
技術を記載しているが、上記方法が抗体産生に使用されうることを観察している
。

【００６１】 さらなる選択肢は、可変ドメイン全体に突然変異を引き起こすための１以上の
選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダムな突然変異誘発を用いた、本発
明のＣＤＲ誘導配列を担持する新規ＶＨ又はＶＬ領域の産生である。上述の技術
はＧｒａｍら（1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 : 3576-3580 ）により
記載されており、Ｇｒａｍ達は変異性ＰＣＲを用いた。

【００６２】 使用されうる他の方法はＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する直接的な突
然変異誘発である。上述の技術はＢａｒｂａｓら（1994, Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 91 : 3809-3813 ）及びＳｃｈｉｅｒら（1996, J. Mol. Biol. 263 :
551-567）により開示されている。

【００６３】 上記技術の全てはそういうものとして本技術分野において知られ、そしてそれ
ら自体は本発明の一部を形成しない。当業者は、本技術分野における所定の方法
論を用いた、本発明の特異的結合メンバーを提供するための上述の技術を使用で
きる。

【００６４】 本発明のさらなる側面は、エオタキシン抗原に対して特異的な抗体の抗原結合
ドメインを得るための方法を提供し、この方法は、本明細書中に示したＶＨドメ
インのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入の方法に
より上記ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体を準備し、場合により、そうして準
備された上記ＶＨドメインを１以上のＶＬドメインと組合せ、そして上記ＶＨド
メイン又はＶＨ／ＶＬ組合せ物、並びに組合せ物を特異的結合メンバー又は抗体
の抗原結合ドメインのエオタキシン抗原に対する特異性の確認のために、そして
場合により好ましい特性の１以上、好ましくはエオタキシン活性中和能力につい
て試験することを含む。上述のＶＬドメインは本明細書中で詳述したようなアミ
ノ酸配列を有する。

【００６５】 本明細書に開示のＶＬドメインの配列変異体の１以上を利用する類似の方法を
１以上のＶＨドメインと組合せる。

【００６６】 本発明のさらなる側面はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーの製
造方法を提供し、上記方法は以下の： （ａ）ＣＤＲコード領域を欠くか又は置き換えられるべきＣＤＲ３を含むかの
いずれかであるＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを準備し； （ｂ）ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供するために、
上記レパートリーを本明細書中に詳述したようなアミノ酸配列をコードする供与
核酸と、上記供与核酸が上記レパートリー中にＣＤＲ３領域を挿入するようなＶ
Ｈ ＣＤＲ３のために組合せ； （ｃ）上記産物レパートリーの核酸を発現させ； （ｄ）エオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーを選択し；そして （ｅ）上記特異的結合メンバー又はそれをコードする核酸を回収する、 を含む。

【００６７】 同様に、類似の方法が利用され、ここで、本発明のＶＬ ＣＤＲ３をＣＤＲコ
ード領域を欠くか又は置き換えられるべきＣＤＲ３を含むかのいずれかのＶＬド
メインをコードする核酸のレパートリーと組合せる。同じように、１以上又は全
ての３のＣＤＲをＶＨ又はＶＬドメインのレパートリー内に移植し、次にそれを
特異的結合メンバーか又はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーかに
ついて選別する。

【００６８】 免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３のＣＤＲ領域を
、それらの介在性構造領域と一緒に含むであろう。好ましくは、上記部分は第１
及び第４構造領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％をも含み、上記の５
０％は第１構造領域のＣ末端５０％及び第４構造領域のＮ末端５０％である。さ
らなる可変ドメインの実質的な部分のＮ末端又はＣ末端の残基は天然の可変ドメ
イン領域に関連しないものである。例えば、組換えＤＮＡ技術により作り上げら
れる本発明の特異的結合メンバーの構築はクローニングを容易にするために導入
されたリンカーによりコードされるＮＢ又はＣ末端残基の導入、あるいは他の操
作ステップによりもたらされる。他の操作ステップは、本発明の可変ドメインを
、免疫グロブリンＨ鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディーの製造にお
いて）又は以下により詳細に明記したタンパク質標識を含むさらなるタンパク質
配列に連結するためのリンカーの導入を含む。

【００６９】 本発明の好ましい側面において、ＶＨ及びＶＬドメインの１部を含む特異的結
合メンバーが好ましいが、ＶＨ又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づいた単独
の結合ドメインが本発明のさらなる側面を形成する。単独の免疫グロブリン・ド
メイン、特にＶＨドメインは特異的な様式により標的抗原の結合が可能であるこ
とが知られている。いずれかの１本鎖特異的結合ドメインの場合において、それ
らのドメインはエオタキシンを結合可能な２の特異的結合メンバーの形成が可能
な相補的ドメインに関する選別に使用される。

【００７０】 これはＷＯ９２／０１０４７に開示されるいわゆる階層型二重組合せ法（hier
archical dual combinatorial approach）を用いたファージ・ディスプレイ選別
法により達成され、上記方法において、Ｈ又はＬ鎖クローンのいずれかを含む個
々のコロニーを他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリ
ーの感染に使用し、そして得られた２本鎖特異的結合メンバーを、例えばその参
考文献中に記載されるものであるファージ・ディスプレイ技術により選別する。
この技術も上記にＭａｒｋｓらにより開示されている。

【００７１】 本発明の特異的結合メンバーは抗体定常部又はその一部をさらに含む。例えば
、ＶＬドメインはそのＣ末端でヒトＣ_K 又はＣ_λ鎖、好ましくはＣ_λ鎖を含む抗
体Ｌ鎖定常部に付着する。同じように、ＶＨドメインに基づく特異的結合メンバ
ーは、そのＣ末端でいずれかの抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ，ＩｇＡ，Ｉｇ
Ｅ、及びＩｇＭ、並びにあらゆるアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１及び
ＩｇＧ４から誘導された免疫グロブリンＨ鎖の全体又は一部に付着する。ＩｇＧ
４が好ましい。本発明の特異的な結合メンバーは検出可能な又は機能的な標識に
よりラベルされる。検出可能な標識は放射性標識、例えば ¹³¹Ｉ又は⁹⁹Ｔｃを含
み、これらを抗体画像化の技術分野で知られる慣例の化学反応を用いて本発明の
抗体に付着させる。標識は酵素標識、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダ
ーゼをも含む。標識は化学成分、例えばビオチンを含み、それらは特定の同系の
検出可能な成分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出される。

【００７２】 本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の患者、好ましくはヒトの診断
法又は治療法に使用されるべく設計される。

【００７３】 したがって、本発明のさらなる側面は、提供される特異的結合メンバーの投与
を含む治療方法、上記特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与のための
薬剤の製造における、例えば上記特異的結合メンバーを医薬として許容される賦
形剤と一緒に配合することを含む薬剤又は医薬組成物の作製方法における上述の
特異的結合メンバーの使用を提供する。

【００７４】 抗エオタキシン抗体が治療的利益を提供するために使用される臨床的な適応症
は、喘息、湿疹（アトピー性皮膚炎）、及び他のアトピー性疾患、例えば鼻炎、
結膜炎、食物アレルギー、好酸球仲介疾患として認識されるアレルギー性大腸炎
を含む。実験的証拠がアトピー患者の最も大きな原因として好酸球を支持するの
で、抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに対しておそらく有効であろう。
さらに高い末梢好酸球をカウントする、他のアレルギー性症状、例えばアレルギ
ー性気管支肺アスペルギルス症及び熱帯性好酸球増加症が存在し、それらは抗エ
オタキシン療法の対象である。

【００７５】 特に、本発明による抗エオタキシン療法は、喘息を患う多くの患者に対して明
らかな利益を提供するために使用される（Mattoli et al, 1997; Ying et al, 1
997; Brown et al, 1998）。英国国民の約１０％が喘息を持ち、そして最新の治
療は十分に満足ゆくものではない：英国では及びウェールズでは喘息のために年
間約２０００人が死亡し、そして毎年、喘息を患う人の約６％が（喘息の症状に
より）入院する。喘息の症状を予防、及びより重い喘息を治療の両方のための、
かつて開発された治療の改良された治療に対する明らかな必要性が存在する。抗
エオタキシン療法は経口的に、注入により（例えば皮下的又は緊急時は静中に）
、吸入により（あらゆる望まれない効果と比較して有益な効果の概要を最適化す
るため）又は代わりの投与経路により与えられる。上記投与経路は、効果を最適
化又は副作用を最小化するために、その疾患に対する特別の考慮により、治療の
物理化学的特徴により決定される。

【００７６】 皮膚の病気は抗エオタキシンを用いた局所治療により処置されるのに最良であ
る。病気の皮膚は多くの場合高い吸収能力を持つため、局所治療は治療のための
最良の経路をよく提供し、ここで体の他の部分に望まれない効果のないことを必
要とする。上記の皮膚の病気が体のかなりを覆っている場合、又はその病気が重
い（おそらく他の臓器、並びに皮膚に影響を及ぼしている）場合、注入によるか
又は他の有効な手段による投与が局所経路より適切である。局所注入は特定の状
況下で適切である（上記の項を参照のこと）。

【００７７】 抗エオタキシン療法は病院内での使用に制限されないと考えられる。患者は上
記治療を自ら施し、そして日々の投薬は複合服薬スケジュールにわたり好まれる
。

【００７８】 併用治療は、有効な相乗効果を提供するために使用され、特に抗エオタキシン
特異的結合メンバーと１以上の抗インターロイキン−５（ＩＬ−５）製剤との組
合せが使用される。本発明による特異的結合メンバーは１以上のコルチコステロ
イド、特に１以上の全身性コルチコステロイドとの組合せか又は添加の状態で提
供される。１以上の他の抗喘息／抗アレルギー作用物質、特に他の予防薬、例え
ばクロモグリケート、ロイコトリエン（レセプター）アンタゴニスト、キサンチ
ン、及び持続型気管支拡張薬との併用治療が喘息治療のために利用される。組合
せ物の同様の考えが皮膚及び他のアトピー性症状のための抗エオタキシン療法の
使用のために適用される。

【００７９】 乾癬、じんましん（急性じんましん、慢性再発性じんましん、遅延型圧迫性じ
んましんを含む）、結節性痒疹、血疹状紅斑性発疹、天疱瘡、晩発性皮膚ポルフ
ィリン症、持続性照射反応（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）、ウェルズ症候群、好酸球性蜂巣炎、薬疹、脈管炎（皮膚兆候）、紫斑病
、及び他の皮膚の病気の全ての状態が本発明による抗エオタキシンにより治療さ
れうる。これらの病気は体の大部分に及ぶ、皮膚以外の臓器を含むか、あるいは
皮膚に増加した浸透性を与えない。作用部位で有効に局所的に適用されたとして
も、その好ましい経路はアトピー性の適応症について示唆されたのと同じ考えか
ら全身的（体じゅう）にである。関連した全身性徴候を伴う重度の皮膚病は、全
身治療が局所治療又は局所注入よりも好ましい状況のよい例である。

【００８０】 炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、並びに好酸球性の大腸炎／腸
炎／胃腸炎／シャルマン症候群が抗エオタキシン療法により効果的に治療される
。好酸球はこれらの疾患を特徴づける病変中に顕著な細胞型として現れる。

【００８１】 脈管炎のいくつかの形態、特に特発性の、Ｈｕｇｕｅｓ−Ｓｔｏｒｉｎ症候群
、チャーグ・ストラウス症候群、気管支中心性肉芽腫症、好酸球性肺炎（レフラ
ー症候群）、持続性肺好酸球増加症、オーメン症候群、ヴィスコット−オールド
リッチ症候群、家族性好酸球増加症、及び特発性過好酸球増加症が抗エオタキシ
ンにより治療されうる。

【００８２】 原因不明の好酸球増加症は合併症、例えば肺炎、脈管炎、大腸炎、腸炎、胃腸
炎、レフラー心内膜炎、及び心臓弁線維症、並びに結合組織に影響を及ぼす症候
群を生じうる。好酸球増加症は悪性疾患（特に、リンパ腫、白血病、及び胃腸の
癌）、薬物療法（例えばサイトカイン注入）、並びに慢性疲労症候群にも関連す
る。抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに使用されうる。同様に、好酸球
増加・筋痛症候群、毒性オイル症候群（ｔｏｘｉｃ−ｏｉｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ
）、好酸球増加症による広範性筋膜炎（好酸球性筋膜炎）、及び好酸球性筋炎が
抗エオタキシンにより治療されうる。

【００８３】 これらの症状において抗エオタキシンによる介入が利益をもたらすので、寄生
虫を原因とする好酸球の誘引は害を及ぼす効果である。病原体による好酸球誘引
を含む疾患は、原生動物感染症、並びに後生動物感染症、例えばヘルミス感染症
及び特に線虫感染症（例えばフィラリア症、鉤虫、回旋糸状虫症、トクソカリア
シス、回虫症、及び旋毛虫症、住血線虫症［好酸球性髄膜炎］）を含む。無症状
性寄生虫症は好酸球仲介疾患の固有の状態の大きな原因となる。

【００８４】 抗エオタキシン療法は好酸球以外の細胞、例えば好塩基球のＣＣＲ−３発現に
影響を及ぼす。

【００８５】 本発明により、提供される組成物は個々に投与される。好ましくは、投与は「
治療としての有効量」であり、これは患者に恩恵をもたらすのに十分である。上
述の恩恵は、少なくとも１の症状の少なくとも１の改善である。投与される実際
の量、並びに投与の速度及び時間的経過は治療する症状の性質及び重さに依存す
る。治療の規定、例えば用量の決定等は一般的な開業医及び他の医師の責務であ
る。抗体の適切な用量は当技術分野で周知である；Ledermann J.A. et al. (199
1) Int J. Cancer 47 : 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Imm
unoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 : 915-922を参照のこと。

【００８６】 適確な用量は、上記抗体が診断のためであるか又は治療のためであるか、治療
すべき範囲の大きさと位置、上記抗体の厳密な性質（例えば抗体全体、断片又は
ダイアボディー）、及び上記抗体に付着されたいずれかの検出可能な標識又は他
の分子の性質を含む多くの要因に依存する。典型的な抗体の用量は、全身投与に
ついては０．５mg〜１００ｇの範囲、局所投与については１０μｇ〜１mgの範囲
である。典型的には、上記抗体は抗体全体、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプで
ある。これは成人患者の単独の治療のための用量であり、上記用量は子供及び乳
児に対して比例的に調整され、そして分子量に比例して他の抗体様式についても
調整されうる。治療は医師の裁量で日、２週、週又は月間隔で繰り返される。

【００８７】 本発明の特異的結合メンバーは通常医薬組成物の形で投与され、その医薬組成
物は上記特異的結合メンバーに加えて少なくとも１の成分を含む。

【００８８】 よって、本発明による、そして本発明により使用するための医薬組成物は、有
効成分に加えて医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業
者に周知の他の物質を含む。上述の物質は無毒であり、かつ有効成分の効果を妨
害すべきではない。上記担体又は他の物質の正確な性質は投与経路に依存し、そ
の投与経路は経口又は注入、例えば静中である。

【００８９】 経口投与のための医薬組成物は錠剤、カプセル、散剤又は液剤の形である。錠
剤は固形の担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含む。液状医薬組成物は一
般的に液状の担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油又は合成潤滑
油を含む。生理的食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例
えばエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール又はポリエチレン・グリコ
ールが含まれる。

【００９０】 静中注入又は患部への注入のために、上記有効成分はパイロジェンを含まず、
かつ好適なpH、等張性、及び安定性を持つ、非経口で許容される水溶液の形であ
る。当業者は、例えば等張溶媒、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液
、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。防
腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が必要に応じて含ま
れる。

【００９１】 組成物は、治療すべき症状に依存して単独で、あるいは他の処置との組合せで
同時にか又は連続してかのいずれかで投与される。他の処置は、好適な用量の鎮
痛剤、例えば非ステロイド系抗炎症剤（例えばアスピリン、アセトアミノフェン
、イブプロフェン若しくはケトプロフェン）又はオピエート、例えばモルヒネ、
あるいは制吐剤の投与を含む。

【００９２】 本発明は、本明細書中に提供される特異的結合メンバーのエオタキシンへの結
合を引き起こす又は許すことを含む方法を提供する。記載のとおり、上述の結合
は、例えば特異的結合メンバー若しくは特異的結合メンバーをコードする核酸の
投与に続いてインビボで起こるか、あるいはそれは、例えばＥＬＩＳＡ、ウエス
タン・ブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降又はアフィニティー・クロマト
グラフィーにおいてインビトロで起こる。

【００９３】 特異的結合メンバーのエオタキシン１の結合量を測定する。計量は試験サンプ
ル中の抗原の量に関係し、それは診断上の関心である。

【００９４】 サンプルに対する反応性はいずれか適切な手段により決定される。放射性免疫
アッセイ（ＲＩＡ）は１つの可能性である。放射性標識抗原を標識していない抗
原（上記試験サンプル）と混合し、そして上記抗体に結合させる。結合した抗原
を結合していない抗原から物理的に分離し、そして上記抗体に結合した放射性抗
体の量を測定する。さらなる抗原、つまり、上記試験サンプル中に存在するより
少ない放射活性の抗原が上記抗体に結合する。競合結合アッセイをリポーター分
子に連結された抗原又はアナログを用いた非放射性抗原を用いて使用することも
できる。上記リポーター分子はスペクトル的に単離された吸収又は発光の特徴を
伴う蛍光色素、燐光体又はレーザー色素である。好適な蛍光色素はフルオセイン
、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサス・レッドを含む。好適な発色体
色素はジアミノベンジジンを含む。

【００９５】 他のレポーターは、高分子コロイド粒子又は粒子状物質、例えば着色した磁性
又は常磁性ラテックス・ビーズ、及び視覚的に観察されるか、電気的に測定され
るか又は別の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生じう
る生物学的又は化学的活性物質を含む。これらの分子は反応を触媒する酵素であ
り、その反応は、例えば色を生み出すか又は変化させ、あるいは電気的特性に変
化を引き起こす。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル
の吸収又は放出を生じるような、分子的に興奮性である。それらは、バイオセン
サーとの結合に使用される化学物質を含む。ビオチン／アビジン又はビオチン／
ストレプトアビジン、及びアルカリ・ホスファターゼ検出系が利用される。

【００９６】 個々の抗体−リポーター複合体により生じるシグナルは（正常及び試験）サン
プル中の当該抗体結合の定量化できる絶対的又は相対的データを導くために使用
されうる。

【００９７】 本発明は競合アッセイによる抗原レベルの計測のために上記のとおりの特異的
結合メンバーの使用、つまり競合アッセイにおいて本発明により提供される特異
的結合メンバーを利用することによるサンプル中の抗原レベルの計測方法をも提
供する。これは、結合していない抗原から結合した抗原の物理的分離を必要とし
ない。物理的又は光学的変化を結合により起こすためにリポーター分子を上記特
異的結合メンバーに連結することは１つの可能性である。上記リポーター分子は
検出可能な、そして好ましくは計測可能なシグナルを直接的に又は間接的に発生
する。リポーター分子の結合は直接的又は間接的に共有結合的、例えばペプチド
結合によるか又は非共有結合的である。ペプチド結合を介した結合は、抗体とリ
ポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え体の発現の結果として存在する。

【００９８】 本発明は、例えばバイオセンサー・システムにおいて本発明による特異的結合
メンバーを利用することにより抗原レベルを直接的に計測するためにも提供され
る。

【００９９】 結合の測定様式は本発明の特色ではないので、当業者が彼らの選択及び一般知
識により好適な様式を選ぶことができる。

【０１００】 本発明はさらに特異的結合メンバーにまで及び、この特異的結合メンバーはエ
オタキシンに結合するために、上記抗原を結合し、かつ本明細書中に、詳細に示
したアミノ酸を持つＣＤＲ又は本明細書中に詳細に示したアミノ酸を持つＶドメ
インを含むいずれかの特異的結合メンバーと競合する。結合メンバー間の競合は
インビトロにおいて容易にアッセイされる、例えば他の不タギング結合メンバー
の存在中で検出されうる特定のリポーター分子を結合メンバーの１つにタギング
することにより、同じエピトープ又はオーバーラップするエピトープを結合する
特異的結合メンバーの同定を可能にする。競合は例えば実施例１に記載のとおり
ＥＬＩＳＡを用いて測定される。

【０１０１】 競合についての試験において、上記抗原のペプチド断片、特に着目のエピトー
プを含むペプチドが利用される。上記エピトープ配列、それに加え１以上のアミ
ノ酸をいずれかの末端に持つペプチドを使用する。上述のペプチドは特定の配列
から「原則的に構成される」と考えられる。本発明による特異的結合メンバーは
、抗原に対するそれらの結合が与えられた上記配列を伴うか又は含むペプチドに
より阻害されるようなものである。これに関する試験において、配列、それに加
え１以上のアミノ酸を共に含むペプチドを使用する。

【０１０２】 特定のペプチドを結合する特異的結合メンバーは上記ペプチドとのパニングに
より、例えばファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離される。

【０１０３】 本発明は本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸をさらに提
供する。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好ましい態様において、本発明は上記
のとおり本発明のＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメインをコードする核酸を提供
する。

【０１０４】 本発明は少なくとも１の上記ポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター
、転写物又は発現カセットの形態の構築物をも提供する。

【０１０５】 本発明は１以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞をも提供する。そのための
コード核酸からの発現を含む、コードされた産物の製造方法を実行する場合、そ
れ自身を提供するようにあらゆるＣＤＲ，ＶＨ若しくはＶＬドメイン又は特異的
結合メンバーをコードする核酸は本発明の側面を形成する。発現は上記核酸を含
む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより都合よく達成される。発
現による製造に続いて、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又は特異的結合メンバーをい
ずれか好適な技術を用いて単離及び／又は精製し、その後必要に応じて使用する
。

【０１０６】 本発明による特異的結合メンバー、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、並びにコー
ド核酸分子及びベクターは、実質的に純粋な状態又は相同体の形態に、例えばそ
れらの天然環境から単離及び／又は精製されて提供されるか、あるいは核酸の場
合には所望の機能を持つポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子起
源を含まないか又は実質的に含まない状態に単離及び／又は精製されて提供され
る。本発明による核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含み、そして全体的に又は部分的な
合成物質である。本明細書中に示されるヌクレオチド配列への言及は指定配列を
持つＤＮＡ分子を包含し、かつ文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ＵをＴの
代わりにする指定の配列を持つＲＮＡ分子を包含する。

【０１０７】 さまざまに異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニング及び発現の系が周
知である。好適な宿主細胞は細菌、哺乳動物細胞酵母、及びバキュロウイルスの
系列を含む。非相同ポリペプチドの発現のために本技術分野で利用可能な哺乳動
物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、幼ハムスター腎臓
細胞、ＮＳＯマウス・メラノーマ細胞、及び多数の他の細胞を含む。一般的に、
好ましい細菌宿主はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

【０１０８】 原核生物細胞、例えばＥ．コリにおける抗体及び抗体断片の発現は本技術分野
で十分に確立されている。参考のために、例えばPlueckthun, A. Bio/Technolog
y 9 : 545-551 (1991)を参照のこと。培養による真核生物における発現が特異的
結合メンバーの製造のための選択肢として当業者に利用可能でもある、最近の総
説として、例えばRef, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 : 573-576; Tri
ll J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6 : 553-560 を参照のこと。

【０１０９】 プロモーター配列、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マー
カー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適当な調節配列を含む好適なベク
ターが選択されるか又は構築される。ベクターは必要に応じてプラスミド、ウイ
ルス、例えば「ファージ」又はファージミドである。より詳細には、例えばMole
cular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al., 1989
, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。例えば核酸構築物の製
造、突然変異誘導、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現による核酸
の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの既知の技術及びプロトコールは
Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. e
ds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。Sambrook et al. 及び
Ausubel et al.の開示を本明細書中に援用する。

【０１１０】 よって、本発明のさらなる側面は本明細書中に記載の核酸を含む宿主細胞を提
供する。よりさらなる側面は上述の核酸を宿主細胞内に導入することを含む方法
を提供する。上記導入はいずれか利用可能な技術を利用する。真核生物細胞につ
いて、好適な技術は、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクション、
及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくは昆虫細胞のた
めのバキュロウイルスを用いた形質導入を含む。細胞に対して、好適な技術は、
塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを
用いたトランスフェクションを含む。

【０１１１】 上記導入は、例えば上記遺伝子の発現のための条件下、宿主細胞を培養するこ
とにより、上記核酸からの発現の引き起こすか又は生じることがその後に続く。

【０１１２】 １の態様において、本発明の核酸は上記宿主細胞のゲノム（例えばクロモソー
ム）の中に組み込まれる。組み込みは、標準技術による上記ゲノムとの組換えを
促進する配列の包含により促進される。

【０１１３】 本発明は、特異的結合メンバー又は上記ポリペプチドを発現するために発現系
において上記構築物を用いることを含む方法をも提供する。

【０１１４】 本発明の側面及び態様を以下の実験について言及することにより実施例として
ここで説明する。

【０１１５】

【化１】

【０１１６】

【化２】

【０１１７】 実験的実施例一覧 実施例１：抗ヒト・エオタキシンｓｃＦｖの単離 実施例２：走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ ３Ｇ３の中和力価 実施例３：ＣＡＴ−２１２の誘導及び配列決定 実施例４：ＣＡＴ−２１２の特異性 実施例５：走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価 実施例６：ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１２競 合アッセイ 実施例７：エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２アフィニティーの測定 実施例８：ＣＡＴ−２１２への結合に関するマウス・エオタキシンの競合 実施例９：カルシウム流動アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価 実施例１０：ヒト鼻腔ポリープに対するＣＡＴ−２１２の免疫応答性 実施例１１：ＩｇＧ４様式（ＣＡＴ−２１３）へのＣＡＴ−２１２の変換 実施例１２：走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価 実施例１３：ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１３ 競合アッセイ 実施例１４：アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるＣＡＴ−２１２及 びＣＡＴ−２１３の効果 実施例１５：Ｌ１．２ ＣＣＲ−３をトランスフェクトした細胞：アカゲザル 及びマウス・エオタキシンを用いたエオタキシン仲介走化作用ア ッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価 実施例１６：ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおける ＣＡＴ−２１３の中和力価 実施例１７：エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるＣＡＴ−２１ ３の中和力価 実施例１ 抗ヒト・エオタキシンｓｃＦｖの単離 ｓｃＦｖ抗体レパートリー 扁桃腺、骨髄、及び末梢血から単離されたＢ−リンパ球から誘導し、そしてフ
ァージミド・ベクター内にクローニングした巨大１本鎖Ｆｖヒト抗体ライブラリ
ー（Vaughan et al, 1996 ）を選択に使用した。このｓｃＦｖレパートリーを個
々の組換え体が約１．３×１０¹⁰持つように計算する。このレパートリーからの
抗体は、固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるｓ
ｃＦｖ精製を可能にするためのＣ末端範囲の６ヒスチジン、及びモノクローナル
抗ｃ−ｍｙｃ抗体、９Ｅ１０を用いた一般的な検出システムを提供するためのｃ
−ｍｙｃから誘導された短い配列をも組み込む。

【０１１８】 ｓｃＦｖの選択 ヒト・エオタキシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を１０
μｇ／mlでイムノチューブ（Ｎｕｎｃ；Ｍａｘｉｓｏｒｂ）上に直接的にか、あ
るいはＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイター・プレート（Ｎｕｎｃ）上にコートし
たジサクシンイミド・スベレート活性化ＢＳＡに結合させてコートした。選択の
第１段階のために、１０¹²力価単位のライブラリー・ファージを使用した。上記
ｓｃＦｖライブラリー選択の第３段階を標準的なパニング・プロトコール（Vaug
han et al, 1996 ）に引き続き実施した。選択の段階２及び３からの個々のクロ
ーンを取り出し、そしてファージＥＬＩＳＡにより選別した。

【０１１９】 ＥＬＩＳＡのためのファージの取り出し 選択の段階２及び３からの個々のコロニーを、１００μｇ／mlのアンピシリン
及び２％グルコースを追加した２ＴＹ培地（２ＴＹＡＧ）を１ウェル当たり１０
０μｌ含む９６ウェル・プレートに接種した。プレートを振とうしながら３７℃
で４時間培養した。１０のＭＯＩまでＭ１３Ｋ０７ヘルパー・ファージを各ウェ
ルに加え、そしてそのプレートを３７℃でさらに１時間インキュベートした。上
記プレートをベンチトップ遠心分離機により２０００rpm で１０分間遠心分離し
た。上清を除去し、細胞ペレットを、１００μｇ／mlのアンピシリン及び５０μ
ｇ／mlのカナマイシンを追加した２ＴＹ（２ＴＹＡＫ）１００μｌ中に再懸濁し
、そして振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。プレートを２０００
rpm で１０分間遠心分離し、各ウェルから１００μｌのファージを含有する上清
を９６ウェルプレートに回収した。上記のファージをブロックするために、２０
μｌの１８％マーベル・ブロッキング溶液含有６×ＰＢＳ（６ＭＰＢＳ）を各ウ
ェルに加え、そして室温で１時間インキュベートした。上記ファージはすぐにＥ
ＬＩＳＡに使用できる状態である。

【０１２０】 ファージＥＬＩＳＡ 可塑性９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ）をＰＢＳ中０．５μｇ／mlヒト
・エオタキシン又は対照としてＰＢＳのみにより４０℃で一晩コートした。コー
ト後、上記溶液を各ウェルから除去し、そして上記プレートを３％マーベル含有
ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）により室温で１時間ブロッキングした。そのプレートをＰＢ
Ｓにより３回洗浄し、次に５０μｌの事前にブロックしたファージを各ウェルに
加えた。上記プレートを室温で１時間静置したままインキュベートした。そのプ
レートを室温で０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）の
３回交換、続いてＰＢＳの３回交換により洗浄した。

【０１２１】 各ウェルに、ＭＰＢＳ中に５０００分の１希釈での抗遺伝子VIII−ＨＲＰ複合
体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５０μｌを加え、そしてそのプレートを室温で１時間
インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴにより３回、続いてＰＢＳにより３
回洗浄した。次に５０μｌの３，３′，５，５′−テトラメチル・ベンジジン（
ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）基質を各ウェルに加え、そして室温で３０分間、あるいは
発色するまでインキュベートした。上記反応を２５μｌの０．５Ｍ Ｈ₂ ＳＯ₄
の添加により停止させた。発生されたシグナルをマイクロタイター・プレート・
リーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ３５５０）を用いて４５０nmでの吸収（Ａ₄₅₀ ）を
読み取ることで計測した。

【０１２２】 抗エオタキシンｓｃＦｖ たった４種類の異なるｓｃＦｖがファージＥＬＩＳＡにより同定されたことに
よりエオタキシン特異的ｓｃＦｖの単離が非常に困難であることがわかった。同
じｓｃＦｖライブラリーを他の抗原に対して選択した場合、より多くのｓｃＦｖ
が典型的には同定される。さらなる特徴を示すことに関して同定されたコロニー
を３Ｇ３と称し、そしてこのクローンはＥＬＩＳＡにおいてＰＢＳで見られたそ
れの５〜１０倍超のヒト・エオタキシンでのシグナルを常に示した。

【０１２３】 実施例２ 走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ ３Ｇ３の中和力価 背景 上記抗エオタキシンｓｃＦｖ ３Ｇ３の中和力価をインビトロ走化作用アッセ
イを用いて測定した。

【０１２４】 インビボにおいて阻害が望まれるＣＣＲ３発現細胞の化学遊走を誘発すること
がエオタキシンの能力であるため上記走化作用アッセイは特にインビトロにおけ
る力価アッセイに関係する。上記アッセイはＣＣＲ３レセプターを発現する細胞
が走化作用によりエオタキシン・グラジエントに向かって移動する原理に働きか
ける。ここに詳述した上記方法はPanath et al, 1996a による記載に基づく。簡
単に言うと、エオタキシンを、適当なバッファー中の試験抗体と一緒にトランス
ウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の下部ウェルに入れた
。ＣＣＲ３レセプターを発現するトランスフェクト細胞を上記トランスウェルの
上部チャンバーに入れた。上記の２のチャンバーを３μＭの孔径を持つポリエス
テル膜によって隔てた。ＣＣＲ３リガンド、例えばエオタキシンに反応した細胞
だけがその孔を通って遊走する。定められたインキュベーション期間の後、下部
チャンバーまで遊走した細胞の数をカウントし、そしてこの数は上記上部チャン
バーに入れたケモカインの化学遊走誘発活性の指標である。それ故に、この化学
遊走誘発活性の阻害がこのアッセイにより評価されうる。

【０１２５】 ＣＣＲ３細胞の維持 Ｌ１．２細胞をヒトＣＣＲ３レセプターによりトランスフェクトし、その表面
にＣＣＲ３を発現する安定な細胞株を製造した。上記細胞を１０％熱不活化ＦＣ
Ｓ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２％ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１０
Ｕペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｇ／mlストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）
、２５０μｇ／mlカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）、及び４００μｇ／mlゲンタマイ
シン（Ｇｉｂｃｏ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）中で維持した。上記
アッセイで使用するために上記細胞を１〜２×１０⁶ ／mlの間に保った。ＣＣＲ
３発現を上方調節するための上記細胞のＮＯ刺激を上記走化作用アッセイのため
に必要とした。５０ng／mlのエオタキシンに対する反応を慎重に観察した、なぜ
なら遊走細胞数は、おそらくＣＣＲ３発現レベルの変化により、細胞の維代数に
ともない減少するからである。典型的には下部チャンバーまで遊走した上記細胞
の１０％サンプルを続いてフローサイトメトリーにより計測した。５０ng／mlの
エオタキシンは典型的には８，０００〜１０，０００細胞の走化作用を誘発する
ことがわかった（これは上記１０％値である；すなわち合計で８０，０００〜１
００，０００細胞が下部チャンバーまで遊走した）。

【０１２６】 走化作用アッセイ 走化作用アッセイのバッファーは、１％エオタキシン不含ＢＳＡ（Ｂａｙｅｒ
Ｐｅｎｔｅｘ）、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシ
ン含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）を含む。（二重で）抗体の試験溶液を
アッセイ・バッファー中に所望の濃度まで希釈した。ＩＭＡＣ−精製（次項を参
照のこと）ｓｃＦｖ ３Ｇ３について、典型的な希釈の範囲は１００μｇ／ml〜
１μｇ／mlであった。ヒト・エオタキシン（Ａｌｂａ Ｃｈｅｍ）を適当な試験
ｓｃＦｖと混合する時に５０ng／mlの終濃度まで加えた。全てのサンプルを室温
で３０分間インキュベートした。ＣＣＲ３ Ｌ１．２細胞をＨｅｒａｅｕｓ Ｓ
ｅｐａｔｅｃｈ １．０ベンチトップ遠心機により１，２００rpm で５分間遠心
分離し、その培地を吸引により除去し、そしてその細胞を２５mlのＰＢＳ中に再
懸濁した。上記細胞を次に再び遠心分離し、そしてその細胞ペレットを１０⁷ 細
胞／mlにアッセイ・バッファー中に再懸濁した。試験溶液（ウェル当たり０．６
ml）をトランスウェル・プレートの下部チャンバー内に入れた。トランスウェル
を上記試験溶液上に入れ、そして１００μｌの細胞（合計１０⁶ 細胞）を各トラ
ンスウェルの上部チャンバー内に入れた。インキュベーションを５％ ＣＯ₂ 下
、３７℃で４時間行った。上記トランスウェルを取り除く前にそのプレートを軽
くたたいて膜の下側に付着した全ての細胞を取り外した。下部チャンバーまで遊
走した細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーターを用いてカウントした。サ
ンプルを培地流速を用いて６０秒間それぞれカウントした。上記試験抗体に起因
する走化作用の阻害率を次に測定した。

【０１２７】 ｓｃＦｖの精製 走化作用アッセイにおいて３Ｇ３ ｓｃＦｖの力価を測定するために、ｓｃＦ
ｖをＩＭＡＣによりまず下処理した。２ＴＹＡＧ（５ml）に３Ｇ３のシングル・
コロニーを接種し、そして振とうしながら３０℃で一晩育成した。この一晩培養
した物を次に１００μｇ／mlアンピシリン及び０．１％グルコース含有２ＴＹ
５００mlへの接種に使用し、そして１．０のＡ₆₀₀ に達するまで振とうしながら
３０℃で育成した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を１mMまで加え、そして上記培養物を３０℃でさらに３．５時間育成した。

【０１２８】 細胞を５，０００rpm での遠心分離により採取し、そして１０mlのＴＥＳ（０
．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５mM ＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖；氷冷）中に
再懸濁した。さらに１５mlのＴＥＳの１：５希釈物（水による）を加え、そして
その細胞懸濁液を回転輪上、４０℃で３０分間インキュベートした。これは浸透
圧衝撃を引き起こし、そして上記ｓｃＦｖを含むペリプラズム抽出物を生じた。
残留細胞及び破片を、４０℃で２０分間９，０００rpm での遠心分離によりペレ
ット化した。その上清を新しい試験管に移し、そして５０μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ₂ を加えた。次に、バッファー（５０mM リン酸ナトリウム、pH８、３００mM
ＮａＣｌ）により事前に洗浄された２mlのＮｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ
）をプロテアーゼ阻害剤錠（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と一緒
にペリプラズミック抽出物に加えた。上記配合物を回転させながら４０℃で一晩
インキュベートした。上記Ｎｉ−ＮＴＡを５分間２，０００rpm での遠心分離に
よりペレット化し、そしてその上清を吸引した。アガロース・ビーズを５０mlの
洗浄バッファーにより３回洗浄し、各洗浄の間にはそのアガロース・ビーズを集
めるために遠心分離した。１０mlの洗浄バッファーを最後の洗浄の後に加え、そ
して上記スラリーをポリプレップ・カラム（ＢｉｏＲａｄ）に添加した。２mlの
溶出液（５０mM ＮａＰｉ、pH８、３００mM ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール
）を排水したアガロースに加え、そしてその溶出液を集めた。ＩＭＡＣ精製ｓｃ
Ｆｖを製造者の指示によるＮａｐ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用により
ＰＢＳにバッファーに変換した。Ａ₂₈₀ を読み取り、そしてそのタンパク質濃度
を、１mg／mlタンパク質＝Ａ₂₈₀ １．４の分子減衰係数を用いて測定した。精製
ｓｃＦｖを−７０℃で５００μｌアリコートの状態で保存した。

【０１２９】 結果 走化作用アッセイにおける精製ｓｃＦｖ ３Ｇ３についての代表的なデータを
図１に示す。ｓｃＦｖ ３Ｇ３に関してＩＣ₅₀は８００nMである。結果として、
この抗体は低〜中程度の力価である。

【０１３０】 実施例３ ＣＡＴ−２１２の誘導及び配列決定 ｓｃＦｖ ３Ｇ３の低〜中程度の力価は、この抗体をあらゆる治療的適用に関
して比較的不適当な候補物質にしている。

【０１３１】 ＣＡＴ−２１２と呼ばれるさらなるｓｃＦｖ抗体をいろいろな技術を用いて得
、そしてそのＤＮＡ配列を決定した。

【０１３２】 ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡを、ベクター特異的プライマー、ｐＵＣ１９逆及びｆｄｔｅｔｓｅｑ（
Vaughan et al, 1996 ）を用いて２ＴＹＡＧアガロース・プレート上の個々のコ
ロニーからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅条件は３０サ
イクルについては９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間、続い
て７２℃で最後の１０分間伸長を含む。そのＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−
ｕｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて５０μｌ Ｈ₂ Ｏの終量まで精製した。
２〜５μｌの各挿入調製物を、Ｔａｑ色素−ターミネータ・サイクル・シークエ
ンシング・システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた配列決
定のための鋳型として使用した。プライマー（Osbourn et al, 1996 ）、ｇｅｎ
ｅ３ｌｅａｄｅｒ，ＰＣＲＨＬｉｎｋを上記ｓｃＦｖのＶ_H の配列決定のために
使用し、そしてＰＣＲＬＬｉｎｋ及びｍｙｃｓｅｑ１０を上記ｓｃＦｖのＶ_L の
配列決定のために使用した。

【０１３３】 ＣＡＴ−２１２ Ｖ_H 及Ｖ_L のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１及び３
に示す。ＣＡＴ−２１２ Ｖ_H 及びＶ_L の誘導されたアミノ酸配列をそれぞれ配
列番号２及び４に示す。

【０１３４】 抗体の個々のＶ_H 及びＶ_L セグメントをＶ−ＢＡＳＥ（Tomlinson et al, 199
5 ）により既知のヒト生殖細胞系列の配列に整列し、そして最も近い生殖細胞系
列を同定した。ＣＡＴ−２１２のＨ鎖について最も近い生殖細胞系列をＶ_H ３フ
ァミリーの１つであるＤＰ４９と同定した。上記ＣＡＴ−２１２ Ｖ_H は上記Ｄ
Ｐ４９生殖細胞系列とたった６の変更しかなく、これらの２がＣＤＲ２内に存在
する。ＣＡＴ−２１２のＬ鎖について最も近い生殖細胞系列をＶ_K １ファミリー
の１つであるＤＰ_K ５と同定した。上記ＣＡＴ−２１２ Ｖ_L は上記ＤＰ_K ５生
殖細胞系列とたった２の変更しかなく、両方ともＣＤＲ内に存在する。ＣＡＴ−
２１２の配列全体又はその誘導体（例えばＣＡＴ−２１３）は、生殖細胞系列と
合計でたった８の変更しかなく、その４はＣＤＲ内に存在する。これは、これら
のヒト抗体が患者の処置に使用される場合に免疫原性のあらゆる可能性のある危
険をより最小化するはずである。

【０１３５】 実施例４ ＣＡＴ−２１２の特異性 ＣＡＴ−２１２の特異性を調べるために２種類の技術：ファージＥＬＩＳＡ及
びウエスタン・ブロッティングを使用した。

【０１３６】 ファージＥＬＩＳＡ ＣＡＴ−２１２の特異性を測定するために、ファージＥＬＩＳＡを、ヒト及び
マウス・エオタキシン、並びに関連の及び関連のないヒト抗原のパネル；ＭＩＰ
−１α，ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＩＬ−１α，ＩＬ
−１β，ＩＬ−５，ＩＬ−１８，ＩＬ−１２，ＲＡＮＴＥＳ、トランスフォーミ
ング成長因子（ＴＧＦ）−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＮＦα、そしてＰＢＳに対し
て実施した。

【０１３７】 ＣＡＴ−２１２ファージミドを含む個々のＥ．コリ・コロニーを５mlの２ＹＴ
ＡＧに接種し、そして振とうしながら３７℃で４時間インキュベートした。Ｍ１
３Ｋ０７ヘルパー・ファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０のＭＯＩまで各試験
管に加え、そして３７℃で最初の３０分間は静置して、そして最後の３０分間は
緩やかに振とうして、１時間インキュベートした。細胞を３，５００rpm で１０
分間遠心分離することでペレットにし、そしてその上清を捨てた。細胞を５mlの
２ＴＹＡＫ中に再懸濁し、そして振とうしながら３０℃で一晩インキュベートし
た。翌日、上記細胞を３，５００rpm で１０分間遠心分離することでペレットに
した。そのファージ含有上清（５ml）を新しい試験管に丁寧に移し、１mlの６Ｍ
ＰＢＳを加え、そして室温で１時間インキュベートしてＥＬＩＳＡの前に上記フ
ァージを前もってブロックした。

【０１３８】 さまざまな抗原のコート濃度及び供給者を表１に示す。ＥＬＩＳＡを原則的に
実施例１に記載のとおり実施した。その結果を図９に示す。ＣＡＴ−２１２はヒ
ト・エオタキシンに特異的であり、かつ試験したあらゆる関連のない又は関連の
ヒト抗原と交差反応しない。バックグラウンドを越えるごくわずかなシグナルが
マウス・エオタキシンにおいて見られた。これはＣＡＴ−２１２がヒト・エオタ
キシンに比べて比較的弱いながらも、マウス・エオタキシンを認識することを示
す。ヒト又はマウス以外のいずれかの種については市販のエオタキシンを入手で
きなかった。

【０１３９】 ウエスタン・ブロッティング ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）をＰＨＡＳＴシステム及び１０〜１５％ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用
いて実施した。エオタキシン及びヒトＭＣＰ−１（４００ng）のサンプルを分子
量マーカーと同時に上記ゲル上で泳動した。電気泳動を実施し、次にタンパク質
を拡散によりイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に転写した。その膜をＭ
ＰＢＳとの１時間のインキュベーションによりブロックし、次にＭＰＢＳ中の１
０μｇ／ml ＩＭＡＣ精製ＣＡＴ２１２ ｓｃＦｖ又は関連性のないｓｃＦｖに
より振とうしながら室温で１時間プローブした。これに続き、上記の膜をＰＢＳ
Ｔ中で（３×２分間）洗浄し、次に１μｇ／mlのビオチン化抗ｍｙｃタグ抗体（
９Ｅ１０）と一緒に１時間インキュベートした。洗浄を待ってから、最後の洗浄
の前にそのブロットを１μｇ／mlのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ
）と一緒に１時間インキュベートした。そのブロットを製造業者の指示に従いＥ
ＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中に入れ、そしてＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ）に焼き付けた。

【０１４０】 予測した分子量の明確なバンドが観察された一方で、上記ＭＣＰ−１のレーン
にはバンドが検出されなかったので、ＣＡＴ−２１２ ｓｃＦｖはヒト・エオタ
キシンと特異的に反応した。対照である同濃度の関連性のないｓｃＦｖはエオタ
キシン又はＭＣＰ−１のいずれとも反応しなかった。

【０１４１】 実施例５：エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和
力価 ＣＡＴ−２１２（及びＣＡＴ−２１３、実施例１２を参照のこと）の力価を、
実施例２に記載のとおり、走化作用アッセイにより試験した。試験に先立ち、単
量体ｓｃＦｖをＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーにより調製した。

【０１４２】 単量体ｓｃＦｖの調製 単量体ｓｃＦｖをＰｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムのセファデックス７
５カラムでのＩＭＡＣ精製材料のゲルろ過により調製した。上記カラムを０．５
ml／分でＰＢＳを流し込み、そして５００μｌのサンプルを添加した。精製単量
体ｓｃＦｖを含む画分を集めた。ｓｃＦｖの濃度を集めたピーク画分のＡ₂₈₀ nm
を読み取ることにより測定した。

【０１４３】 ＣＡＴ−２１２ ＦＰＬＣ精製ｓｃＦｖに関して（アッセイ・バッファーによ
る）典型的な希釈の範囲は１μｇ／ml〜０．００１μｇ／mlであった。

【０１４４】 結果 結果を図３に示す（３の測定の平均値）。ＣＡＴ−２１２はＣＣＲ３トランス
フェクトＬ１．２細胞のエオタキシン仲介走化作用を６５０±８３pMのＩＣ₅₀で
阻害した。したがって、３Ｇ３になされた修飾は、このｓｃＦｖ抗体の力価にお
いて１０００倍超の向上をもたらした。ＣＡＴ−２１２は高い力価の抗エオタキ
シン中和抗体である。

【０１４５】 実施例６ ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１２競合アッセイ 序文 好適なポリスチレン・マイクロタイター・プレートに受動的に固定化された場
合、ＣＡＴ−２１２は、その解離定数（Ｋ_D ）により定められる濃度依存様式で
のエオタキシンの結合を示した。 ¹²⁵ヨウ素標識エオタキシンからのβ放射は、
それが燐光体浸透マイクロタイター・プレート（Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標
））と相互作用する時に検出可能な光シグナル（シンチレーション）を生み出す
。射程の短かいこの放射は上記の得られたシグナルがわずかな非結合物質からの
寄与を伴う結合抗原に起因することを裏付ける。この技術をエオタキシン−ＣＡ
Ｔ−２１２相互作用のＫ_D 、及び競合阻害によるＣＡＴ−２１２とＣＡＴ−２１
３（実施例１３を参照のこと）超製物の相対親和性を測定するために使用した。

【０１４６】 アッセイ・プロトコール Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）（ＮＥＷ ＳＭＰ２００；９６ウェル）のウ
ェルを０．０５Ｍカーボネート−ビカーボネート・バッファー（Ｓｉｇｍａ）中
に希釈した４０nMのＩＭＡＣ精製ＣＡＴ−２１２（調製方法については第２項を
参照のこと）１００μｌによりコートした。そのプレートをシールし、そして４
℃で４時間インキュベートし、次にそれを逆さにすることで空にし、そして１５
０μｌの１％マーベル含有ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）により４℃で一晩ブロックした
。使用直前に、前記プレートを逆さにすることで空にし、そしてＰＢＳにより３
回洗浄し、次に水気を取った。

【０１４７】 上記アッセイ・バッファーは０．５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）含有
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）から成っていた。試験サンプルをバッファー中で３
倍希釈し、二重の１１の流度を得た。５０μｌの希釈した試験サンプルをウェル
に加え、続いて５０μｌの３０pM［ ¹²⁵Ｉ］エオタキシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
を加えた。そのプレートをシールし、そして室温で１〜２時間インキュベートし
た。そのプレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーション・カウ
ンターによりカウントした（ウェルをそれぞれ２分間カウントした）。

【０１４８】 データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ）を使用
して４−パラメーター・ロジスティック方程式を用いて明白なＩＣ₅₀値を得た。
Ｙ＝下限＋（上限−下限）／（１＋１０＾（（Ｌｏｇ ＩＣ５０−Ｘ）×丘の傾
き）） Ｘ＝濃度の対数、ＹはＣＰＭである。

【０１４９】 結果 図４はアッセイの結果を示し、このアッセイにおいて非標識ＣＡＴ−２１２を
［ ¹²⁵Ｉ］エオタキシンのｆｌａｓｈ ｐｌａｔｅ（商標）にコートしたＣＡＴ
−２１２への結合に対する競合のために使用した。ＣＡＴ−２１２はこのアッセ
イ（４の測定の平均値）において４２．５pMのＩＣ₅₀を示す。

【０１５０】 実施例７ エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２親和性の測定 アッセイ・プロトコール 実施例６に記載のとおりＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）をＣＡＴ−２１２に
よりコートし、そして試薬を調製した。アッセイ・バッファー中、［ ¹²⁵Ｉ］エ
オタキシンの連続的な２倍希釈物＋／−１００倍超の非標識エオタキシンを調製
し、そして二重で１００μｌのサンプルをそのコート・プレートに加えた。上記
サンプルをシールし、室温で２時間インキュベートし、そしてカウントした。

【０１５１】 上記データを、式：Ｙ＝（Ｂ_MAX ×［Ｌ］）／（Ｋ_D ＋［Ｌ］）によるＫＥＬ
Ｌ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ソフトウェア・パッケージ（Ｂｉｏｓ
ｏｆｔ）を用いて非線形曲線の当てはめにより分析した。

【０１５２】 上記の式において、［Ｌ］は遊離リガンド濃度であり、Ｋ_D は親和性であり、
かつＢ_MAX は最大結合部位濃度である。

【０１５３】 次に上記データを、そのリガンドが相同体集団の結合部位に結合している時に
傾き＝−１／Ｋ_D 及びＢ_MAX のＸ断片を持つ直線を呈する、結合／遊離の比対結
合のスキャッチャード・プロット（図５）の使用により視覚化する。

【０１５４】 結果 上記スキャッチャード・プロット（図５）より、ＣＡＴ−２１２に結合するエ
オタキシンについての親和性を１４６pMと評価した。

【０１５５】 実施例８ ＣＡＴ−２１２への結合に対するマウス・エオタキシン競合 序文 ＣＡＴ−２１２／ＣＡＴ−２１３のインビボ活性を扱うために、２種類の方法
を利用した（実施例１４を参照のこと）： （１）マウス・モデルにおける好酸球増加症に対するヒト・エオタキシンの注
入による効果 （２）マウス・モデルにおける好酸球増加症に対する内生的エオタキシンの産
生誘導による効果。

【０１５６】 第２の方法のために、ＣＡＴ−２１２／ＣＡＴ−２１３がマウス・エオタキシ
ンを認識するかどうか決定することがまず必要であった。

【０１５７】 アッセイ・プロトコール Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）を実施例６に記載のとおり準備した。アッセ
イ・バッファー中、非標識ヒトエオタキシンとマウス・エオタキシンの１１の連
結的に３倍希釈し、そして３０pMの評価濃度で調製された ¹²⁵Ｉ−エオタキシン
と混合し、そして１００μｌを二重でウェルに加えた。そのプレートをシールし
、そして室温で２時間インキュベートして、カウントし、そしてそのデータを実
施例６に記載のとおり処理した。

【０１５８】 結果 マウス・エオタキシンへ結合するＣＡＴ−２１２についてのＩＣ₅₀の評価は２
９６nM（２の測定の平均値）である。そのデータを表６に示す。したがって、Ｃ
ＡＴ−２１２はマウス・エオタキシンを認識する。

【０１５９】 実施例９ カルシウム流動アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価 序文 この機能的アッセイは、レセプターがそのリガンドに結合され、そして活性化
された時に引き起こされる細胞内Ｃａ²⁺の上昇を計測するために設計される。こ
の場合、ＣＣＲ３によりトランスフェクトされた細胞にＣａ²⁺感受性蛍光色素（
ｆｌｕｏ−３ＡＭ）を加え、そして蛍光発光をＦＬＩＰＲを用いて経時的に観察
した。ＦＬＩＰＲにより、各ウェル中の蛍光発光の計測を計画した間隔（１又は
５秒毎）で実施し、そして試薬を各ウェルに同様に加えた。上記ＣＣＲ３レセプ
ター結合エオタキシンにより誘導された細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇が計測され、そ
してそれは蛍光発光の増加に比例する。ＣＡＴ−２１２のエオタキシンへの結合
、そしてその中和を原因とするこの反応の阻害を定量化しうる。

【０１６０】 アッセイ・プロトコール この実験に先立ち、２４時間、０．５μｇ／ml酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
を含む通常培地を添加することによりＣＣＲ３細胞を活性化し、ＣＣＲ３発現を
増加させることによりエオタキシンに対する応答の程度を増加させた。活性化Ｃ
ＣＲ３細胞をＰＲＭＩ １６４０により２度洗浄し、次に新たに調製した２μＭ
ｆｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０３％プルロ
ン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、
及び０．１％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０中に４×１０⁶ 細胞／mlで再懸
濁した。次にその細胞を３７℃で４５分間インキュベートした。これに続き、そ
れらをＲＰＭＩ １６４０により１度洗浄し、そしてＦＬＩＰＲバッファー（１
２５mM塩化ナトリウム、５mM塩化カリウム、１mM塩化マグネシウム、１．５mM塩
化カルシウム、２５mM Ｈｅｐｅｓ、５mMグルコース、及び０．１％ ＦＣＳ、
pH７．４）により２度洗浄した。最終的にそれらを１×１０⁶ ／mlでＦＬＩＰＲ
バッファー中に再懸濁し、そして１００μｌを透明な底の９６ウェルのブロック
した壁を持つプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移して１ウェル当たり１×１０⁵ 細
胞を得た。次にそのプレートを１０００rpm で５分間遠心分離し、均一で、比較
的密度の高い、単層の細胞を得た。

【０１６１】 ＣＡＴ−２１２の希釈系列を終濃度の６倍で準備し（最終的に２００nM〜１．
６nM）、そして等量の６０nMエオタキシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ）と一緒に室温で１０分間プレ・インキュベートした。全ての処置物を
少なくとも二重で、９６ウェル・ポリスチレン・プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中
にＦＬＩＰＲバッファーを用いて１００μｌの終量に調製した。上記細胞に接触
するエオタキシンの終濃度は１０nMであった。

【０１６２】 上記ｆｌｕｏ−３添加細胞を含むプレートをＦＬＩＰＲに設置し、そして蛍光
発光を最初の６０秒間に関しては１秒毎、その後終了まで５秒間隔の様式で読み
取った。上記実験を室温で実施した。この実験のために、５０μｌの各処置物を
１０秒の合間の後に全てのウェルに加えた。

【０１６３】 結果 この実験の結果を図７に示した。ＣＡＴ−２１２が、エオタキシンがＣＣＲ３
細胞上のそのレセプターに結合することにより生じるＣａ²⁺流動の用量依存的阻
害を示すことが考えられうる。図８は、このデータに関して５nMの概算のＩＣ₅₀ 値を与える「上記曲線以下の面積」を示す。

【０１６４】 実施例１０ ヒト鼻腔ポリープに対するＣＡＴ−２１２の免疫応答性 序文 ヒト鼻腔ポリープは好酸球の浸潤により特徴づけられる炎症性組織である。エ
オタキシン発現は、鼻腔ポリープ中で上方調節されているとして立証されており
、そしてエオタキシン・タンパク質は抗エオタキシン抗体を用いた免疫細胞化学
により検出される（Ponath et al., 1996a )。したがって、ＣＡＴ−２１２をヒ
ト鼻腔ポリープの切片を用いて免疫応答性について審査した。

【０１６５】 ＩＣＣのための組織の準備 ヒト鼻腔ポリープ組織サンプルを手術サンプルから得た。組織を５mm³ のぶつ
切りに切断し、そして最適な切断組織化合物（ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ）の滴下を
用いてコルク片の上に取り付けた。上記組織を冷凍するために、２０mlのイソプ
ロパノールを液体窒素浴中で冷却し、そして上記の取り付けた組織を３０秒間浸
した。次に凍結組織をクライオチューブに移し、そしてさらに３０秒間液体窒素
中に浸した。組織ブロックを−７０℃で冷凍保存した。切片を切断するために、
ＯＣＴ化合物をクライオスタット・チャック（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｃｈｕｃｋ）
に適用し、そして上記凍結組織をはめ込んだ。次に上記チャック及び組織を液体
窒素中で３０秒間急激に冷凍した。次にその組織をクライオスタット上に取り付
け、そして各ヒト組織の５ミクロン凍結切片を顕微鏡用スライドの上に切断した
。

【０１６６】 ＩＣＣのためのファージ抗体の準備 ファージ抗体クローンを実施例１に記載のとおり取り出した。ファージ含有上
清をＩＣＣで使用する前に１％ ＢＳＡにより前もってブロックした。

【０１６７】 プロトコール ヒト組織切片を環境温度で１５分間アセトン中に浸漬することにより固定し、
風乾し、次にＰＢＳＴにより３回、（合計）１０分間洗浄した。試験ｓｃＦｖを
ＰＢＳＴ中に希釈し、そして上記切片に室温で２時間適用した。スライドをＰＢ
ＳＴにより３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ中に１／１００に希釈したマウス９Ｅ１
０抗体と一緒にインキュベートした。切片をＰＢＳＴにより３回洗浄し、そして
供給されたＥｎＶｉｓｉｏｎ抗マウス・ペルオキシダーゼ重合体（ＤＡＫＯ Ｋ
４００６）中で３０分間インキュベートした。切片を再度ＰＢＳＴ中で３回洗浄
し、そして３−アミノ−９−エチル−カルバゾール・ペルオキシダーゼ基質（Ａ
ＥＣ；Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。ＡＥＣ基質を、原液（ジメチルホルムア
ミド中に溶解された２．４mg／mlのＡＥＣ）を２０mM酢酸ナトリウム・バッファ
ー、pH５．２中に１：１０に希釈し、そして０．１５％（ｖ／ｖ）の過酸化水素
を加えることにより調製した。１００μｌのＡＥＣ基質溶液を各切片に加え、そ
して５〜１０分間インキュベートした、続いて０．１％ Ｔｗｅｅｎ含有生水に
より洗浄して発色を止めた。その後上記スライドを＜５秒間ヘマトキシリン（Ｄ
ＡＫＯ Ｓ２０２０）により対比染色し、次に水により３回洗浄した。次に洗浄
した切断を水性マウントによりコートし、そしてガラス・カバー片を適用した。

【０１６８】 結果 ヒト鼻腔ポリープの３０μｇ／mlでのＣＡＴ−２１２染色切片は、５０μｇ／
mlでの陽性対照抗エオタキシン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ）について見られたものと同等の様式である。同じ濃度でも対照だけか又は関
連性のないｓｃＦｖと一緒の上記基質による検出可能な染色は存在しなかった。
ＣＡＴ−２１２は、被覆する上皮組織、並びに鼻腔ポリープのストロマ中に位置
する細長くなった単核細胞及び内皮細胞における特異的な細胞質染色を示した。
これは、鼻腔ポリープにおいて抗エオタキシン抗体により得られた公表されたＩ
ＣＣ特徴（Ponath et al., 1996a）と一致する。その染色がエオタキシンに対し
て特異的であるか確認するために、競合ＩＣＣを行った、ここで４０μｇ／mlの
ＣＡＴ−２１２を、上記鼻腔ポリープ切片に添加する前に１３３μｇ／ml、６６
０μｇ／ml、及び１．３３mg／mlエオタキシンに前もって結合させた。ＣＡＴ−
２１２単独では上記のとおり良好な染色が得られた。ＣＡＴ−２１２をエオタキ
シンに前もって結合させた場合、それらは、１．３３mg／mlエオタキシンでは全
ての特異的染色が実質的に消滅する状態の鼻腔ポリープへの結合の用量依存阻害
であった。

【０１６９】 実施例１１ ＩｇＧ４様式（ＣＡＴ−２１３）へのＣＡＴ−２１２の変換 序文 上記ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−２１２）の完全な抗体（ＩｇＧ４；ＣＡＴ−２１３）
様式への変換に使用されるベクターは以下のとおりであった：ｐＧａｍｍａ４（
Ｖ_H 発現ベクター）及びｐＭＲ１５．１（Ｖ_L 発現ベクター）。これらのベクタ
ーの両方をＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得た。

【０１７０】 プロトコール 使用した全てのプライマーを表３に配列番号について言及する。上記Ｖ_H ＤＮ
Ａ及びＶ_L ＤＮＡをそれぞれオリゴヌクレオチドｐ１１３／ｐ１３２及びｐ１０
９ａ／ｐ１１０ｂを用いてまず増幅した。全ての上記ＰＣＲ反応はその校正能力
のためにＰｗｏＩポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＰＣＲ条件は９４℃、
３０秒間；５０℃、３０秒間；７２℃、６０秒間の２５サイクルとした。Ｖ_H 及
びＶ_L の両方についてのシグナル配列をそれぞれｐ１０／ｐ１３２及びｐ１１／
ｐ１１０ｂを用いて増幅することにより加えた。ＤＮＡのＶ_H 及びＶ_L 断片をそ
れらの受容ベクターと平行してそれぞれＨｉｎｄIII ，ＡｐａＩ及びＢｓｔＢＩ
，ＢｓｉＷＩを用いて消化した。次に断片を一緒に連結し、よって個々のプラス
ミドを構築した。両プラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、そし
て一緒に連結して最終構築物を形成した。全ての制限消化及び連結をＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからの酵素を使用し、その業者により推奨される
バッファーを用いて実施した。

【０１７１】 上記ベクターの形質転換のために、エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（Ｄ
Ｈ５α）を使用した。エレクトロポレーションを０．２cmギャップ・エレクトロ
ポレーション・キュベットで行ない、そのキュベットの中で５μｌの連結ＤＮＡ
を１００μｌのＥ．コリに加えた。上記細胞に２００Ωで２．５kVのシングル・
パルスを与え、続いて振とうインキュベーターにより３７℃で２ＴＹ中、２０分
間の回復期間を与えた。アリコートを２ＴＹＡＧアガロース平板培地上に移し、
そして３７℃で一晩インキュベートした。翌日、そのコロニーを採取し、Ｔａｑ
ポリメラーゼと適当なプライマーを用いたＰＣＲにより選別した。

【０１７２】 正しいサイズの挿入物を有するクローンを１００mlの２ＴＹ（１００μｇ／ml
アンピシリン含有）中、振とうインキュベーターにより３７℃で一晩育成した。
その細胞を３，０００ｇで１５分間の遠心分離により採取し、そしてＱＩＡＧＥ
Ｎ ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用してそのプラスミドＤＮＡを抽出した。そ
のＤＮＡ濃度を、Ａ₂₆₀ nmの１＝５０μｇ／mlと仮定し分光光度法で測定した。
上記最終構築物をプライマーｐ２４，ｐ３４、並びにｐ３６及びｐ３７を用いて
配列決定し、正確な配列を確認した。

【０１７３】 ３６プレート・トランスフェクションをＮＳＯ細胞において、ｇｓシステム（
Ｌｏｎｚａ）を使用したエレクトロポレーション（２５０Ｖ）により、選択可能
なマーカーとしてグルタミン合成酵素遺伝子を用いて実施した。野生型ＮＳＯ細
胞を２mMグルタミンを伴う１０％透析ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で育
成した。６×１０⁷ ＮＳＯ細胞を、ＰｖｕＩにより直鎖にした３００μｇのＤＮ
Ａによりトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、その細胞をグル
タミンを含むＤＭＥＭ中に再懸濁し、そして３６×９６ウェル・プレート（５０
μｌ／ウェル）に移し、そして５％ ＣＯ₂ 中、３７℃でインキュベートした。
翌日、１５０μｌ／ウェルの選択培地（グルタミン不含ＤＭＥＭ）を加えた。約
３週間後、そのコロニーを陰性対照として関連性のない抗体を用いたＥＬＩＳＡ
（以下を参照のこと）により選別した。＞２０μｇ／ml生産する全てのコロニー
を２４ウェルプレートで増殖させ、次に二重でＴ２５フラスコで増殖させた。一
方のフラスコを飽和まで育成し、そして他方を冷凍した。４Ｂ７と称する第１の
細胞株（クローンでない）を血清不含培地に適合させ、そしてプロテインＡを用
いた精製のために２Ｌの容量まで増殖させた。

【０１７４】 ＩｇＧ発現を検出するための選別ＥＬＩＳＡアッセイ ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４，Ｄｙｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）の各ウェルを１００μｌの５０mM重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム・
バッファー、pH９．６中、１μｇ／mlヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈａｒｌａｎ）により
４℃で一晩コートした。プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０含有
ＰＢＳ（ＰＢＳＴ／０．０５）により３回洗浄した。ＣＡＴ−２１３をＰＢＳＴ
／０．０５中で希釈し、２倍希釈系列をそのプレートの中に作り出した。そのプ
レートを室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴ／０．０５により３回洗
浄した。ＰＢＳＴ／０．０５中に希釈した１：５０００ ＨＲＲ結合ヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体（Ｈａｒｌａｎ）１００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分間イン
キュベートした。そのプレートをＰＢＳＴ／０．０５により３回洗浄した。これ
に続き、１００μｌの新たに調製したＨＲＰ基質バッファー（使用直前に加える
５μｌ Ｈ₂ Ｏ₂ ／５０mlバッファーを含有する２４mMクエン酸、５２mMリン酸
水素ナトリウム、pH５．２中、０．４mg／ml ｏ−フェニレンジアミン）を各ウ
ェルに加えた。５〜１０分後、上記反応を５０μｌの１２．５％硫酸の添加によ
り止めた。Ａ₄₉₀ を計測した。

【０１７５】 最初に上記選別ＥＬＩＳＡにおいて強いシグナルによって示された大量のＩｇ
Ｇを発現する上記細胞株を増殖のために選んだ。これはその９６ウェル・プレー
トからＴ７５フラスコまでの増殖を伴った。次にこの細胞株を、時間ごとに血清
を半分に減らす（血清の開始割合は１０％である）連続的な希釈を含め無血清培
地（Ｌｏｎｚａ ＮＭ２）に適合させた。一旦無血清培地に適合すれば、次に上
記細胞株を１５０mlフラスコ中で飽和状態まで育成し、そして１０％未満の細胞
生存で採取した。その上清を遠心分離により清澄にし、次に０．２２μｍフィル
ターを通してろ過した。上記抗体をその上清からプロテインＡアフィニティー・
クロマトグラフィーを用いて精製した。

【０１７６】 抗エオタキシン特異的なＩｇＧを検出するための結合アッセイ ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４，Ｄｙｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）の各ウェルを、１００μｌの５０mM重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム
・バッファー、pH９．６中、０．５μｇ／mlエオタキシン（Ａｌｂａｃｈｅｍ）
により４℃で一晩コートした。このプロトコールの残りの部分は選別アッセイと
同じである（先の項を参照のこと）。関連性のない対照抗体を含めて結果を図９
に示す。

【０１７７】 実施例１２ エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価 アッセイ・プロトコール ＣＡＴ−２１３の力価を原則的に実施例２に記載のとおり走化作用アッセイで
試験した。試験に先立ち、ＣＡＴ−２１３をプロテインＡアフィニティー・カラ
ム（実施例１１のとおり）を用いて上記上清から精製した。プロテインＡ精製Ｃ
ＡＴ−２１３についての典型的な希釈範囲は、アッセイ・バッファー中、１００
nM〜０．０３nMであった。

【０１７８】 結果 このアッセイの結果を図３に示す。ＣＡＴ−２１３はＣＣＲ３トランスフェク
トＬ１．２細胞のエオタキシン仲介走化作用を７００＋３５０pMのＩＣ₅₀で阻害
した。この力価はこのアッセイにおいてＣＡＴ−２１２について見られたものに
類似している。

【０１７９】 実施例１３ ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１３競合アッセイ アッセイ・プロトコール 上記Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）アッセイを原則的に実施例６に記載のと
おり実施した。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）を４０nMのＣＡＴ−２１２によ
りコートした。ＣＡＴ−２１２，ＣＡＴ−２１３、及びエオタキシンをアッセイ
・バッファー中に希釈し、そして５０μｌをウェルに加え、続いて５０μｌの６
０pM［ ¹²⁵Ｉ］エオタキシンを加えた。

【０１８０】 結果 このアッセイにおいてＣＡＴ−２１３のＩＣ₅₀は５９．３pM（４の測定の平均
、図４）である。これは上記ＣＡＴ−２１２のｓｃＦｖについて得られた値に類
似している。

【０１８１】 実施例１４ アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２
１３の効果 アレルギー性炎症の空気嚢モデルを好酸球増加症を研究するために好都合なモ
デルとして選んだ。デキサメサゾン（ステロイド系抗炎症薬）はこのモデルにお
いて空気嚢への好酸球の動員の阻止することが示されている（Das et al., 1997
を参照のこと）。他の抗エオタキシン抗体は、（すでに先に議論された）インビ
ボ・モデルの範囲で好酸球の動員を阻止することがすでに示されている、上記モ
デルにおいて、好酸球増加症をオブアルブミン感作動物におけるエオタキシンの
局所投与により刺激したか、あるいはオブアルブミン（抗原）免疫により誘発し
た。

【０１８２】 ＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の効果をオブアルブミン感作マウスにおけ
る空気嚢モデルで調べた、ここで好酸球増加症を空気嚢内（ｉ．ｐｏ．）投与さ
れた組換えヒト・エオタキシン又はオブアルブミンのいずれかにより誘発した。

【０１８３】 方法 雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１７〜２１ｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｕ．Ｋ．又はＣｈａｒ
ｌｅｓ Ｒｉｖｅｒにより供給された）をＢａｂｒａｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ）で小動物柵ユニットの中に収容した。マウ
スを１ケージに３匹収容し、そのケージは１２時間の昼／夜サイクル（午前７時
に点灯）である。動物を実験前の少なくとも２週間その動物小屋に馴化させ、そ
して飼料と水を自由摂取させた。

【０１８４】 感作をDas et al., 1997により報告されたとおり実施した。簡単に言うと、マ
ウスを１日目と８日目に１００ｇの水酸化アルミニウム・ゲル中オブアルブミン
（３．３mg水酸化アルミニウム含有０．４mlの生理食塩水；再水和ゲル）の皮下
（ｓ．ｃ．）注入によりオブアルブミンに対して感作した。１の空気嚢をDas et
al., 1997によりすでに報告されている方法で上記マウスの背中に形成した。９
日目、マウスをイソルレンにより麻酔し、そして２．５mlの無菌空気（０．２５
μｍろ過）を各マウスの背中に皮下注入した。１２日目、マウスにさらに２．５
mlの無菌空気を注入して上記空気嚢を再び膨らませた。１５日目、マウスをエオ
タキシン又はオブアルブミンのいずれかにより免疫した。

【０１８５】 ヒト・エオタキシン免疫手順 実験に先立ち、ｉ．ｐｏ．投与されたヒト組換えエオタキシン（Ａｌｂａｃｈ
ｅｍ）がオブアルブミン感作マウスにおいて好酸球増加症を再現しうることを明
らかにした。ヒト・エオタキシン投与の３０分前、組換えマウスＩＬ−５（ＩＬ
−５；１００pmol kg^-1）を静中（ｉ．ｖ．）注入して好酸球の循環プールを増
加させた（Collins et al., 1995を参照のこと）。６時間後、ヒト・エオタキシ
ン（１μｇ、０．５ml ｉ．ｐｏ．）は生理食塩水（０．５ml ｉ．ｐｏ．）に
比べ上記空気嚢への好酸球動員の明らかな増加を引き起こした（エオタキシン５
．３±１．１、生理食塩水１．２±０．３好酸球×１０⁵ ；ｎ＝６、Ｐ＜０．０
１マンホイットニー検定）。さらなる実験において、１００pmol kg^-1のＩＬ−
５（ｉ．ｖ．）、並びに１μｇのヒト・エオタキシン（ｉ．ｐｏ．）を使用し、
そしてエオタキシン投与後６時間に計測を行った。生理的食塩水によってのみ処
理された対照群をも基礎細胞流入を得るために全ての実験の中に含んだ（シャム
免疫群）。

【０１８６】 オブアルブミン免疫手順 オブアルブミンの免疫用量をオブアルブミン感作マウスにおける試験的な実験
の系から決定した。最初の実験において、１００μｇでなく１及び１０μｇのオ
ブアルブミン（０．５ml、ｉ．ｐｏ．）が２４時間後に溶媒処理動物（０．５ml
の生理食塩水、ｉ．ｐｏ．）に比べて顕著な好酸球動員を引き起こすことを示し
た。１０μｇのオブアルブミンが最も再現性のある応答を生じたので（オブアル
ブミン６．４±１．１、生理食塩水１．４６±０．２３好酸球×１０⁵ ；ｎ＝６
、Ｐ＜０．０１、ダネット検定による分散分析）、この用量をこれ以降経時的実
験に使用した。この実験において、マウスは生理的食塩水又は１０μｇのオブア
ルブミンのいずれかを受け（ｉ．ｐｏ．）、そして細胞流入を免疫後２〜７２時
間の間評価した。６時間の時点を、好酸球（並びに細胞合計）の上記空気嚢への
流入がこの時に最大となったとして選んだ（オブアルブミン５．４±１．４、生
理食塩水１．１±０．２好酸球×１０⁵ ；ｎ＝５〜６）。全てのこれに続く実験
において、１０μｇのオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）を投与し、そして６時間で
計測を行った。生理食塩水のみで免疫した対照群をも基礎細胞流入を得るために
全ての実験に含んだ（シャム免疫群）。さらに、オブアルブミン感作動物におい
て、オブアルブミン免疫（１０μｇ ｉ．ｐｏ．）を受けてマウス・エオタキシ
ン・レベルを高めることを示した（生理食塩水対照９３±１２、オブアルブミン
免疫３５３９±３７２pg ml^-1；ｎ＝８〜９、Ｐ＜０．００１、マンホイットニ
ー検定）。

【０１８７】 薬剤投与 全身的なＩｇＧ抗体処理（ＣＡＴ−２１３，ＣＡＴ−００１（無ＩｇＧ処理）
又は抗マウス・エオタキシンＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））をヒト・エ
オタキシン又はオブアルブミンの投与３０分前に静中により行った。ＣＡＴ−２
１２，ＣＡＴ−１７１（無ｓｃＦｖ対照）又はＣＡＴ−２１３により局所的な空
気嚢内処理をヒト・エオタキシン又はオブアルブミンの投与と同時に行った。溶
媒対照群を全ての抗体実験に含め、そしてこれらのマウスはＰＢＳの投与を受け
た。全ての静中注入を１００μｌの容量で尾静脈を介して行ない、そして全ての
ｉ．ｐｏ．注入を０．５mlの総量で行った。

【０１８８】 結果の定量化 マウスを、ＣＯ₂ 窒息、あるいは血漿サンプルを必要とする場合には過剰量の
ペントバルビタール・ナトリウムに続けて心臓穿刺することにより洗浄前に屠殺
した。その空気嚢を５Ｕml^-1ヘパリン含有氷冷ＰＢＳ（１ml；カルシウム又はマ
グネシウム不含；Ｓｉｇｍａ）により洗浄し、そして氷中に保存した。洗浄液の
アリコート（１０μｌ）を総細胞の評価（高速読み取り、使い捨て細胞カウンタ
ー、Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）のために取り出し、そして１００
，０００細胞を含むさらなるサンプルをサイトスピン調製のために取り出した。
残った洗浄液を１０００ｇで５分間遠心分離し、次にその上清をアリコートにし
、そして−７０℃で保存した。上記の細胞ペレットを再懸濁し、そしてサイトス
ピンを調製し、風乾し、そして示差的に細胞をカウントするためにライト染色（
Ｗｒｉｇｈｔｓ ｓｔａｉｎ）により染色した。ある場合に、上記洗浄上清をＥ
ＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりエオタキシンについてアッセイした
。

【０１８９】 示される全ての結果は平均±ＳＥである。細胞流入データを空気嚢当たりの細
胞数として表すか、あるいは薬剤処理について、好酸球流入の阻害％として表し
た。好酸球流入の阻害％を以下の方程式を用いて各処理群について細胞数データ
から計算した：

【０１９０】

【数１】

【０１９１】 次に各処理群について平均±ＳＥを計算した。

【０１９２】 大部分の生データをダンネットによる分散分析により統計学的に分析した。ス
テューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定をも使用した。全ての統計学的
分析をＩｎｓｔａｔソフトウェアを用いて実施し、そしてＰ＜０．０５の時、平
均値の間の差を有意と解釈した。

【０１９３】 結果 エオタキシンｉ．ｐｏ．により処理したマウスにおけるＣＡＴ−２１２又はＣ
ＡＴ−２１３の効果 ＣＡＴ−２１２（０．０００５，０．００５、＆ ０．０５mg kg^-1 ｉ．ｐ
ｏ．）は、ＩＬ−５処理オブアルブミン感作マウスにおいてヒト・エオタキシン
（１ｇ；ｉ．ｐｏ．）により引き起こされた好酸球増加症を有意して減じた（そ
れぞれ３２，７９、及び９５％阻害；ｎ＝８）（図１０）。ＣＡＴ−１７１効果
をもたない対照ｓｃＦｖ（０．０５ｇ kg^-1 ｉ．ｐｏ．）は好酸球動員に効果
がなかった（−５±１５％阻害；ｎ＝８）。

【０１９４】 ヒト・エオタキシン（１μｇ、ｉ．ｐｏ．）と同時にｉ．ｐｏ．投与したＣＡ
Ｔ−２１３（０．００１，０．０１，０．１，＆ １mg kg^-1、ｎ＝７〜８）は
、好酸球増加症の用量相関阻害能力を生じた（図１０）。

【０１９５】 全てのＣＡＴ−２１３用量が有効であり、そして９４％の最大阻害を１μｇ
kg^-1でのＣＡＴ−２１３により観察した。ＣＡＴ−００１、１μｇ kg^-1は細胞
流入にわずかに効果があった（７±１％阻害、ｎ＝８）。

【０１９６】 ヒト・エオタキシン（１μｇ）のｉ．ｐｏ．注入３０分前にｉ．ｖ．投与した
ＣＡＴ−２１３（０．０１，０．１，１，＆ １０mg kg^-1）は、ＩＬ−５処理
オブアルブミン感作マウスにおいて好酸球動員の有意な用量依存的阻害（それぞ
れ、４６，７３，７９，＆ ９１％、ｎ＝８）を生じた（図１０）。ＣＡＴ−０
０１対照ＩｇＧ４（１０mg kg^-1）は好酸球動員に有意に影響しなかった（８±
１％阻害、ｎ＝８）。

【０１９７】 よって、ＣＡＴ−２１３の空気嚢内投与は、インビボにおいて好酸球増加を抑
制するその能力においてＣＡＴ−２１２と等しい効力を持つ（ＣＡＴ−２１３及
びＣＡＴ−２１２の両者についてのＥＤ₉₀は約１×１０^-9mols kg^-1である）。
ＣＡＴ−２１３及びＣＡＴ−２１２はヒト・エオタキシンの中和によりインビボ
における好酸球増加を妨げる；これらの抗体は、インビトロにおける走化作用ア
ッセイ（実施例１２を参照のこと）において比較した時にヒト・エオタキシンに
対して類似の中和力価を持つことがすでに示されている。ＣＡＴ−２１３もｉ．
ｖ．投与の後に好酸球動員を抑制する（ＣＡＴ−２１２はｉ．ｖ．で試験しなか
った）。しかしながら、ＣＡＴ−２１３は、局所的に与えられた時に好酸球増加
を減少させる、ヒト・エオタキシンのより強力な阻害剤である（ｉ．ｐｏ．投与
のＣＡＴ−２１３はｉ．ｖ．投与に比べて約１０倍強力である；図１０）。

【０１９８】 オブアルブミンｉ．ｐｏ．処理動物におけるＣＡＴ−２１３の効果 ＣＡＴ−２１３（０．０１，０．１，１，＆ １０mg kg^-1、ｎ＝７〜８）ｉ
．ｐｏ．は用量依存的にオブアルブミンにより増加した好酸球動員を阻害した。
ＣＡＴ−２１３とオブアルブミンを同時に投与した。０．１mg kg^-1及び１０mg
kg^-1のＣＡＴ−２１３はそれぞれ６０％及び９７％阻害を生じた。ＣＡＴ−２
１３ ｉ．ｐｏ．はその空気嚢への単核細胞流入をも阻害したが、しかし好中球
動員には顕著に影響しなかった（表２）。ＣＡＴ−００１、１０mg kg^-1 ｉ．
ｐｏ．は細胞流入にわずかに効果があった（好酸球流入の阻害は−２０±１８％
であった、ｎ＝８）。

【０１９９】 ｉ．ｖ．投与したＣＡＴ−２１３はオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）により誘発
した好酸球動員を有意に阻害した。オブアルブミンの３０分前に与えたＣＡＴ−
２１３（０．０１，０．１，１，＆ １０mg kg^-1 ｉ．ｖ．、ｎ＝８）は６時
間目で好酸球増加を阻止した。１及び１０mg kg^-1は、それぞれ５６及び８５％
までの好酸球動員の有意な阻害を生じた。０．０１及び０．１mg kg^-1のＣＡＴ
−２１３、並びに１０mg kg^-1のＣＡＴ−００１（効果のない抗体対照）は不活
性であった（図１９；ＣＡＴ−００１阻害１４±１４％、ｎ＝８）。（ＣＡＴ−
００１でなく）ＣＡＴ−２１３ ｉ．ｖ．はその空気嚢へのオブアルブミン誘発
好中球及び単核細胞動員の用量依存的阻害を生じた（表２）。

【０２００】 同様に、上述のデータは、ＣＡＴ−２１３を空気嚢に局所的に与えた時、好酸
球増加のより強力な阻害物質であることの兆候を示している（ｉ．ｖ．投与より
も約１０倍強力である；図１９）。しかしながら、ＣＡＴ−２１３の局所（ｉ．
ｐｏ．）投与ではなく全身（ｉ．ｖ．）投与は好中球流入を阻止する能力を持つ
。ＣＡＴ−２１３の全身及び局所投与は共に単核細胞の走化作用を阻害しうる。

【０２０１】 別個の実験において、抗マウス・エオタキシンＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）の全身（ｉ．ｖ．）投与の効果をオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）免疫マ
ウスにおいて調べ、比較データを提供した。抗マウス・エオタキシン（０．０５
、０．５，＆ ５mg kg^-1、ｎ＝７〜８）は好酸球動員の用量依存的阻害を生じ
た（それぞれ、１４，３７，＆ ６７％）。よって、ＣＡＴ−２１３及び抗マウ
ス・エオタキシンＩｇＧ２Ａは、応答の程度及び力価の両方において好酸球走化
作用に対して類似の阻害を生じた（図１９）。

【０２０２】 まとめ まとめれば、上記ヒト抗エオタキシン抗体、ＣＡＴ−２１２（ｓｃＦｖ）、及
びＣＡＴ−２１３（ＩｇＧ４）はアレルギー性炎症のインビボ・モデルにおいて
好酸球増加を強力に阻止する。ＣＡＴ−２１３は、局所的及び全身的のいずれで
与えられた場合でも有効である。ＣＡＴ−２１３の全身的投与は好中球、並びに
単核細胞の走化作用を阻止する付加的な作用を持つ。これらのデータは、インビ
ボでのエオタキシンへの生物学的応答の阻止におけるＣＡＴ−２１３及びＣＡＴ
−２１２の作用と一致する。

【０２０３】 実施例１５ Ｌ１．２ ＣＣＲ−３トランスフェクト細胞を用いたエオタキシン仲介走化作
用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価：アカゲザル及びマウス・エオタ
キシン アカゲザル及びマウス・エオタキシンを中和するＣＡＴ−２１３の能力を原則
的に実施例２に記載のとおりの走化作用アッセイにより評価した。

【０２０４】 アッセイ・プロトコール 従ったアッセイ・プロトコールは実施例２について記載されたものと原則的に
同じであった。走化作用をアカゲザル・エオタキシン又はマウス・エオタキシン
のいずれかにより高めた。アカゲザル（１２５ng／ml）又はマウス（５０ng／ml
）エオタキシンをトランスウェル培養システムの下部チャンバー中でインキュベ
ートし、その後、それぞれ１×１０⁶ 又は２×１０⁶ のＬ１．２−ＣＣＲ３細胞
を上記トランスウェルの上部チャンバーに加えた。遊走細胞をＦＡＣＳ分析によ
り定量化し、そして１分間速い流速でカウントした。

【０２０５】 結果 ＣＡＴ−２１３は、Ｌ１．２−ＣＣＲ３細胞のアカゲザル、及びマウス・エオ
タキシン仲介走化作用を阻害し、それぞれ３．０３×１０^-7Ｍ（１．０１×１０^-7 、９．０１×１０^-7Ｍ）及び２．６３×１０^-6Ｍ（１．３０×１０^-6、５．３
４×１０^-6Ｍ）の幾何平均ＩＣ₅₀及び９５％信頼区間値を有する（図１２）。上
記データはそれぞれ三重及び二重で実施された少なくとも３の実験を表す。

【０２０６】 実施例１６ ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１
３の中和力価 走化作用アッセイは、エオタキシンのＣＣＲ３発現細胞の化学遊走を誘発する
能力を評価するためインビトロ・アッセイ系と関連がある。この場合、上記ＣＣ
Ｒ３発現細胞が血液から直接得られたヒト好酸球であるためこれらの実験では生
理学的関連性が増加している。

【０２０７】 好酸球の調製 好酸球を、アレルギー性疾患の症状を持たないアトピーの、喘息を持たない患
者のヘパリン化末梢血から単離した。血液を１／５量のデキストラン溶液（生理
食塩水中、６％ｗ／ｖ）と混合し、そして赤血球を室温で４５分間沈殿させた。
上記赤血球除去血漿をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）上に重ね、そして８００ｇ
、２０℃で２５分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離した。

【０２０８】 顆粒球ペレットの残留赤血球を２回の低張溶解により除去し、その後好中酸を
抗ＣＤ１６コート超常磁性マイクロビーズ（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉ
ｏｔｅｃ；３×１０⁶ 顆粒球当たり２μｌのビーズ）と一緒に０℃で３０分間イ
ンキュベートすることにより標識した。次に上記細胞を強磁場中で１０mlスチー
ル・ウール・カラムに流し、そして標識されていない細胞をカラムの４倍量の氷
冷標識バッファー（ＰＢＳ、２×１０^-3Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖウシ血清
アルブミン）により抽出した。その抽出細胞は常に＞９５％好酸球であった。

【０２０９】 アッセイ・プロトコール 好酸球を１×１０^-2Ｍ ＨＥＰＥＳ及び０．３％ｗ／ｖ ＢＳＡを添加したＨ
ＢＳＳ中に再懸濁し、そして走化作用アッセイに使用する前に３７℃／５％ Ｃ
Ｏ₂ で少なくとも４５分間インキュベートした。サンプル（培地又は１×１０^-8 Ｍヒト・エオタキシン、プラス又はマイナスＣＡＴ−２１３又はＣＡＴ−００１
（対照抗体））を４８ウェル・マイクロ走化作用・チャンバーの下部ウェルに加
えた。

【０２１０】 ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）不含ポリカーボネート膜フィルター（８μｍ
ポアサイズ）を下部ウェルと上部ウェルの間に配置し、そしてそのチャンバーを
３７℃／５％ ＣＯ₂ で３０分間インキュベートした。次に細胞をその上部ウェ
ルに加え、そしてそのチャンバーを３７℃／５％ ＣＯ₂ でさらに６０分間イン
キュベートした。この期間終了後、遊走しなかった細胞を上記フィルターの上面
からはがした；上記フィルターを乾燥させ、メタノールにより固定し、そしてＭ
ａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａを用いて染色した。遊走細胞を各サン
プルについて５倍の高倍率（×４００）視野中でカウントした。

【０２１１】 結果 三重のポイントで実施した３の別個の実験の結果を図１３（平均±ＳＥＭ）に
示す。ＣＡＴ−２１３は、ヒト好酸球のエオタキシン仲介走化作用を１．５３×
１０^-9Ｍ（３．０９×１０^-11 、７．５４×１０^-8Ｍ）の幾何平均ＩＣ₅₀及び９
５％信頼区間で阻害した。ＣＡＴ−００１（対照抗体）は走化作用に影響しなか
った。したがって、ＣＡＴ−２１３はヒト好酸球のエオタキシン誘発走化作用を
中和する。

【０２１２】 実施例１７ エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価 形状変化は走化作用において必須の過程であり、そして将来的な遊走応答の徴
候と考えられる。好酸球がエオタキシン勾配への応答により血液循環から組織へ
移動するために、細胞骨格成分の再組織化が起こらなくてはならない。この再組
織化は細胞形態学における特有の変化を伴い、これは前方散乱（ＦＳＣ）への変
化としてフローサイトメーターにおいて可視化される。この実施例において使用
したアッセイはSabroe et al (1999）により記載された方法を使用する。

【０２１３】 アッセイ・プロトコール 以下のとおりに得られた顆粒球調製物を用いて実験を実施した。末梢血をＥＤ
ＴＡ（１０mlの血液当たり１５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ）を含むシリンジ内
に採取し、そして１０mlの血液当たり１mlの、０．９％生理食塩水中６％デキス
トラン−Ｔ５００の追加により赤血球を沈殿させた。沈殿を室温で４０分間起こ
した。次にその赤血球除去血漿を不連続７０％〜８０％パーコール勾酸上に重ね
、そして１１３７ｇ、室温で２０分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離し
た。得られた顆粒球層をＰＢＳにより洗浄し、次に３０６ｇ、室温で５分間遠心
分離してペレットにした。次にその細胞ペレットを形状変化バッファー（ＰＢＳ
、１×１０^-3Ｍ ＣａＣｌ₂ 、１×１０^-3Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、１×１０^-2Ｍ ＨＥ
ＰＥＳ、１×１０^-2Ｍグルコース、０．１％ ＢＳＡ、pH７．３）中に再懸濁し
た。次に細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。

【０２１４】 ３×１０^-9Ｍエオタキシン又はバッファー、プラス又はマイナスＣＡＴ−２１
３又はＣＡＴ−００１（対照）を３００μｌの容量でポリプロピレン・フローサ
イトメーター用試験管に加えた。（１００μｌで）５×１０⁵ 細胞を各試験管に
加えた。次に試験管を３７℃で７分間すみやかにインキュベートし、その後氷冷
浴に移した。最後に２５μｌのＣｅｌｌｆｉｘバッファー（１０×）を加え、そ
して個々の試験管をフローサイトメーターで読み取った。好酸球をＦＬ２チャン
ネルを用いてそれらの自己蛍光により同定した。次にＦＳＣを評価した。

【０２１５】 結果 このアッセイの結果を図１４に示す。ＣＡＴ−２１３はヒト・エオタキシンに
よりヒト好酸球に惹起した形状変化を阻害し、７．１４×１０^-10 Ｍ（２．０７
×１０^-10 、２．４４×１０^-9Ｍ）の幾何平均ＩＣ₅₀及び９５％信頼区間を持つ
。データを、別個の提供者からの細胞を用いた二重のポイントにより実施した５
の実験からの平均±ＳＥＭとして表す。

【０２１６】

【化３】

【０２１７】

【化４】

【０２１８】

【化５】

【０２１９】

【表１】

【０２２０】

【表２】

【０２２１】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 上記エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ ３Ｇ３の中和力価
を示す。データは２の独立実験の標準誤差範囲を伴う平均を表す。最大走化作用
は５０ng／mlヒト・エオタキシンに対する応答において下部チャンバーへ遊走し
た細胞数である。ｓｃＦｖ ３Ｇ３に関するＩＣ₅₀は８００nMである。

【図２】 試験した他の関連する又は関連しない抗原のいずれについてもバックグラウン
ド（ＰＢＳ）を越えるシグナルを持たないＣＡＴ−２１２の特異性ＥＬＩＳＡを
示す。弱いシグナルがマウス・エオタキシンに対して観察された。

【図３】 エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１
３の中和力価を示す。

【図４】 競合アッセイにおけるＣＡＴ−２１２のＩＣ₅₀を説明する。

【図５】 エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２の親和性の決定に使用したＣＡＴ−２１
２に結合するエオタキシンのスキャッチャード・プロットを示す。

【図６】 ＣＡＴ−２１２への結合に対するマウス・エオタキシンの競合を説明する。

【図７】 エオタキシンにより誘発した細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇のＣＡＴ−２１２による
中和を示す。１０nMエオタキシン＋／− ＣＡＴ−２１２（ＣＡＴ−２１２の濃
度は警告文中に示した）の追加に対する応答における蛍光発光の変化をＦＬＩＰ
Ｒにより経時的に計測した。対照はバッファーのみの追加である。Ａｂだけの追
加では蛍光発光は有意に変化しない。エオタキシンについて三重のウェル、そし
て各抗体濃度について二重のウェルの平均を示す。

【図８】 １２ｓ〜１００ｓまでのデータについて計算した、カルシウム流動アッセイに
おけるＣＡＴ−２１２に関するデータの曲線下の面積を示す。Ｙ軸上の孤立した
ポイントはエオタキシンのみである。エオタキシンについて三重のウェル、そし
て各抗体濃度について二重のウェルの平均及び標準偏差を示す。

【図９】 ＣＡＴ−２１３のヒト・エオタキシンへの結合特異性を証明する。

【図１０】 ＩＬ−５により処理したオブアルブミン感作マウスの空気嚢へのヒト・エオタ
キシン誘発好酸球動員に対するＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３の効果を示す
。ＣＡＴ−２１２をｉ．ｐｏ．投与したのに対してＣＡＴ−２１３を別々の実験
においてｉ．ｐｏ．及びｉ．ｖ．の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的
な細胞カウント・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施
により統計的に評価した。 ^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１はヒト・エオタキシ
ン免疫ＰＢＳ対照動物（＝０％阻害；ｎ＝７〜８）との比較による。各ポイント
は平均値を表し、そしてその垂直なバーはＳＥを示す。空気嚢に局所的に投与さ
れたＣＡＴ−２１３又はＣＡＴ−２１２は好酸球増加の用量相関阻害を引き起こ
した。全身的に与えられたＣＡＴ−２１３は好酸球の走化作用をも有意に阻害し
た。

【図１１】 オブアルブミン感作マウスの空気嚢へのオブアルブミン誘発好酸球動員に対す
るＣＡＴ−２１３の効果を説明する。別々の実験においてＣＡＴ−２１３をｉ．
ｐｏ．及びｉ．ｖ．の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的な細胞カウン
ト・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施により統計的
に評価した。 ^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１はオブアルブミン免疫ＰＢＳ対照
動物（＝０％阻害；ｎ＝７〜８）との比較による。各ポイントは平均値を表し、
そしてその垂直なバーはＳＥを示す。上記空気嚢に局所的に投与されたか又は全
身的に与えられたＣＡＴ−２１３は好酸球増加の強力な用量相関阻害を引き起こ
した。好酸球動員に対する抗マウス。エオタキシンＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ ｍＡｂ）のｉ．ｖ．投与の効果を比較のために示す。

【図１２】 Ｌ１．２−ＣＣＲ３細胞のアカゲザル・エオタキシン及びマウス・エオタキシ
ン誘発走化作用に対するＣＡＴ−２１３の効果を説明する。データは、それぞれ
三重又は二重で実験した少なくとも３の実験からの平均±ＳＥＭで表す。

【図１３】 ヒト末梢好酸球のヒト・エオタキシン誘発走化作用のＣＡＴ−２１３による中
和を示す。データは、三重のポイントで実施した３の実験からの平均±ＳＥＭで
表す。

【図１４】 ＣＡＴ−２１３がヒト好酸球のエオタキシン仲介形状変化を阻害したことを示
す。ＣＡＴ−００１（対照抗体）は不活性であった。データは、二重のポイント
で実施した５の実験からの平均±ＳＥＭで表す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/02 Ａ６１Ｐ 11/06 11/06 17/02 17/02 27/02 27/02 37/08 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィルトン，アリソン ジェーン イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー３ ０エイチエイチ，ケンブリッジ，ハ ンティングドン ロード 46 (72)発明者 スミス，スティーブン イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー７ ５エックスティー，エリー ウィケ ン，チャーチ ロード 33 (72)発明者 メイン，サラ ヘレン イギリス国，ロイストン エスジー８ ５ エヌダブリュ，バッシングボーン，チャー チ クローズ ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA03 EA04 GA11 HA12 4B064 AG26 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA25 CA44 CA46 4C085 AA13 AA14 AA33 BB11 BB36 CC04 CC05 DD22 DD23 EE01 GG01 GG08 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA22 EA50 FA72 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト・エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）に結合する特異的結
   合メンバーであり、ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配列番号２）、並びに配列
   番号５、配列番号６、及び配列番号７から選ばれるアミノ酸配列を有する１以上
   のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインから成る群から選ばれる抗体ＶＨドメイン；
   そして／又はＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）、並びに配列番号８
   、配列番号９、及び配列番号１０から選ばれるアミノ酸配列を有する１以上のＶ
   Ｌ ＣＤＲを含むＶＬドメインから成る群から選ばれる抗体ＶＬドメインを含む
   上記特異的結合メンバー。
2. 【請求項２】 配列番号５、配列番号６、及び配列番号７のアミノ酸配列を
   有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含む、請求項１に記載の特異的結
   合メンバーであり、ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配列番号２）及びＣＡＴ−
   ２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）を含む抗体のエオタキシン結合ドメインと
   エオタキシンへの結合のために競合する上記特異的結合メンバー。
3. 【請求項３】 ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配列番号２）を含む、請求
   項１又は２に記載の特異的結合メンバー。
4. 【請求項４】 ＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、請求
   項３に記載の特異的結合メンバー。
5. 【請求項５】 ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配列番号２）及びＣＡＴ−
   ２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）により形成されるエオタキシン抗原結合部
   位の親和性と同等か又はそれよりも高い親和性でエオタキシンを結合する、請求
   項１〜３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーであって、ここで特異的結
   合メンバーの親和性、及び抗原結合部位の親和性は同じ条件下で測定される上記
   特異的結合要素メンバー。
6. 【請求項６】 エオタキシンを中和する、請求項１〜３のいずれか１項に記
   載の特異的結合メンバー。
7. 【請求項７】 同じ条件下で測定されたＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配
   列番号２）及びＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）により形成される
   エオタキシン抗原結合部位の力価、特異的結合メンバーの力価、並びに抗原結合
   部位の力価と同等か又はそれよりも高い力価でエオタキシンを中和する、請求項
   ６に記載の特異的結合メンバー。
8. 【請求項８】 ｓｃＦｖ抗体分子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記
   載の特異的結合メンバー。
9. 【請求項９】 抗体定常部を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の特
   異的結合メンバー。
10. 【請求項１０】 完全な抗体を含む、請求項９に記載の特異的結合メンバー
    。
11. 【請求項１１】 ＩｇＧ４定常部を含む、請求項９又は１０に記載の特異的
    結合メンバー。
12. 【請求項１２】 特異的結合メンバー又は請求項１〜１１のいずれか１項に
    記載の特異的結合メンバーの抗体ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチ
    ド配列を含む分離核酸。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。
14. 【請求項１４】 特異的結合メンバー又は抗体ＶＨ又はＶＬドメインの製造
    方法であって、上記特異的結合メンバー又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインの産
    生条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む上記方法。
15. 【請求項１５】 前記特異的結合メンバー又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ド
    メインの分離、及び／又は精製をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 少なくとも１の追加成分を含む組成物への前記特異的結合
    メンバー又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインの配合をさらに含む、請求項１
    ４又は１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 エオタキシンを結合する特異的結合メンバーの取得方法で
    あって、 ＣＡＴ−２１２ ＶＨドメイン（配列番号２）のアミノ酸配列中の１以上のア
    ミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入によりそのそれぞれがＣＡＴ−２１２ ＶＨ
    ドメインのアミノ酸配列変異体である１以上のＶＨドメインを準備し、場合によ
    り、１以上のＶＬドメインと一緒に提供されることにより１以上のＶＨ／ＶＬ結
    合体を提供する１以上のＶＨドメイン・アミノ酸配列変異体を組合せ；及び／又
    は ＣＡＴ−２１２ ＶＬドメイン（配列番号４）のアミノ酸配列中の１以上のア
    ミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、ＣＡＴ−２１２ ＶＬドメインの
    アミノ酸配列変異体であるＶＬドメインを準備し、そして一緒に提供されること
    により１以上のＶＨ／ＶＬ結合体を提供する１以上のＶＬドメイン・アミノ酸配
    列変異体を組合せ；そして エオタキシンを結合する特異的結合メンバーを同定するためのＶＨドメイン・
    アミノ酸配列変異体又はＶＨ／ＶＬ結合体を試験する、 ことを含む上記方法。
18. 【請求項１８】 エオタキシンを結合する特異的結合メンバーの取得方法で
    あって、 置き換えられるべきＣＤＲ３を含むか又はＣＤＲ３コード領域を欠く１以上の
    ＶＨドメインをコードする開始核酸を準備し、そしてＶＨドメインをコードする
    産物核酸を準備するためにその供与核酸が開始核酸内のＣＤＲ３領域の中に挿入
    されるように上記開始核酸を配列番号７のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列をコード
    する供与核酸と組合せるか；あるいは 置き換えられるべきＣＤＲ３を含むか又はＣＤＲ３コード領域を欠く１以上の
    ＶＬドメインをコードする開始核酸を準備し、そしてＶＬドメインをコードする
    産物核酸を準備するためにその供与核酸が開始核酸内のＣＤＲ３領域の中に挿入
    されるように上記開始核酸を配列番号１０のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列をコー
    ドする供与核酸と組合せ； ＶＨドメインをコードする上記産物核酸の核酸を発現させ、そして場合により
    、１以上のＶＬドメインと一緒に製造することによりＶＨドメインを組合せてＶ
    Ｈ／ＶＬ結合体を準備し、及び／又はＶＬドメインをコードする上記産物核酸の
    核酸を発現させ、そして場合により、１以上のＶＨドメインと一緒に製造するこ
    とによりＶＬドメインを組合せてＶＨ／ＶＬ結合体を準備し； エオタキシンを結合するＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬ結合体を含む特異的結合
    メンバーを選択し；そして エオタキシンを結合する上記特異的結合メンバー及び／又はエオタキシンを結
    合する特異的結合メンバーをコードする核酸を回収する、 ことを含む上記方法。
19. 【請求項１９】 エオタキシンを結合する特異的結合メンバーのエオタキシ
    ンを中和する能力に関する試験をさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法
    。
20. 【請求項２０】 結合及び中和する特異的結合メンバーを調達する、請求項
    １９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 エオタキシンを結合する特異的結合メンバーがＶＨドメイ
    ン及びＶＬドメインを含む抗体断片である、請求項１７〜２０のいずれか１項に
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記抗体断片がｓｃＦｖ抗体分子である、請求項２１に記
    載の方法。
23. 【請求項２３】 前記抗体断片がＦａｂ抗体分子である、請求項２１に記載
    の方法。
24. 【請求項２４】 完全な抗体中の抗体断片のＶＨドメイン及び／又はＶＬド
    メインの提供をさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 少なくとも１の追加成分を含む組成物へのエオタキシンを
    結合する特異的結合メンバー又はエオタキシンを結合する特異的結合メンバーの
    抗体ＶＨ又はＶＬ可変ドメインの配合をさらに含む、請求項１７〜２４のいずれ
    か１項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 エオタキシンを結合する特異的結合メンバーのエオタキシ
    ン又はエオタキシン断片への結合をさらに含む、請求項１４〜２４のいずれか１
    項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエオタキシンを結
    合する特異的結合メンバーのエオタキシン又はエオタキシン断片への結合を含む
    方法。
28. 【請求項２８】 前記結合をインビトロで実施する、請求項２６又は２７に
    記載の方法。
29. 【請求項２９】 特異的結合メンバーのエオタキシン又はエオタキシン断片
    への結合量の測定を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。