CN102459628A - 抗人cd52 免疫球蛋白 - Google Patents

抗人cd52 免疫球蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN102459628A
CN102459628A CN2010800312662A CN201080031266A CN102459628A CN 102459628 A CN102459628 A CN 102459628A CN 2010800312662 A CN2010800312662 A CN 2010800312662A CN 201080031266 A CN201080031266 A CN 201080031266A CN 102459628 A CN102459628 A CN 102459628A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
nos
heavy chain
light chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800312662A
Other languages
English (en)
Inventor
B.L.罗伯茨
S.尚卡拉
W.H.布龙迪克
W.M.西德尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43085579&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102459628(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Priority to CN201410379748.7A priority Critical patent/CN104231084B/zh
Priority to CN201910228216.6A priority patent/CN110016081A/zh
Publication of CN102459628A publication Critical patent/CN102459628A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

本发明涉及一种对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠单克隆抗体及嵌合抗体。本发明进一步涉及一种人源化免疫球蛋白轻链和人源化免疫球蛋白重链。本发明还涉及包含编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白轻链或重链的序列的分离核酸、重组载体及宿主细胞，并涉及人源化免疫球蛋白的制备方法。该人源化免疫球蛋白可用于治疗用途以治疗，例如，自体免疫疾病、癌症、非何杰金氏淋巴瘤、多发性硬化症及慢性淋巴细胞白血病。

Description

抗人CD52 免疫球蛋白
本申请要求于2009年5月13日申请的美国临时申请第61/177,837号的优先权。该申请的公开内容完整地引入本文以供参考。
背景技术
CD52是一种在各种正常和恶性淋巴样细胞(例如T和B细胞)上大量(500,000分子/细胞)发现的糖基化的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面蛋白。参考，例如，Hale等人，J Biol regul HomeostAgents 15：386-391(2001)；Huh等人，Blood 92：Abstract 4199(1998)；Elsner等人，Blood 88：4684-4693(1996)；Gilleece等人，Blood 82：807-812(1993)；Rodig等人，Clin Cancer Res 12：7174-7179(2006)；Ginaldi等人，Leuk Res 22：185-191(1998)。CD52在髓样细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上以较低水平表达，并且发现在成熟自然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和造血干细胞上几乎不表达。Id.CD52也由附睾及输精管中的上皮细胞产生，并由精子在通过生殖道期间获得(Hale等人，2001，上文；Domagala等人，Med Sci Monit 7：325-331(2001))。CD52的确切生物功能仍不清楚，但一些证据暗示其可能涉及T细胞迁移和共刺激(Rowan等人，Int Immunol 7：69-77(1995)；Masuyama等人，J Exp Med 189：979-989(1999)；Watanabe等人，Clin Immunol120：247-259(2006))。
Campath-1H
Figure BDA0000130072490000011
(阿仑单抗(alemtuzumab)，Campath
Figure BDA0000130072490000012
，MabCampath
Figure BDA0000130072490000013
)是一种人源化抗人CD52单克隆抗体，其显现有效力的体外细胞毒作用(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC))。Campath
Figure BDA0000130072490000014
识别由成熟CD52蛋白的羧基端四个氨基酸及带负电的GPI锚区的一部分所构成的表位。因为其显著的细胞毒作用，Campath
Figure BDA0000130072490000015
能够在体内消减CD52阳性细胞，并且其已被批准用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的一线及三线治疗。已对Campath
Figure BDA0000130072490000016
在治疗数种自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、血管炎、肌炎和Wegener′s疾病中的效用进行了评价。然而，Campath的最先进研究在于治疗复发缓解型多发性硬化症(MS)。相对于活性对照(Rebif
Figure BDA0000130072490000021
(即干扰素β-1a))，这些研究显示出对复发时间的显著改善。
存在对额外治疗剂和靶向CD52的途径的需求。
发明内容
人源化免疫球蛋白
本发明涉及一种对人类CD52(huCD52)具有结合特异性的人源化免疫球蛋白。其可包括鼠抗人CD52抗体的互补决定区(CDRs)。本发明的人源化免疫球蛋白具有与其它人源化免疫球蛋白不同，并且特别是与包括鼠抗人CD52抗体的CDRs的其它人源化免疫球蛋白不同的氨基酸序列。本发明的人源化免疫球蛋白与人源化免疫球蛋白Campath
Figure BDA0000130072490000022
不同。在一些实施方式中，它们提供超过含有Campath
Figure BDA0000130072490000023
的CDRs的人源化抗体的优点。
本文所述的人源化免疫球蛋白可包括人源化重链和人源化轻链。在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO：3的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：16的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ IDNO：4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：17的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：5的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：18的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：6的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：19的一个或多个CDRs的重链；含有SEQ ID NO：7的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：20的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：8的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：9的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：22的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：10的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：23的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：11的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ IDNO：24的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：25的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；或含有SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：26的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链序列。上述SEQ ID NOs中的CDRs由图2和图3指出并且在本文提供的表1-6中提及。
在另一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包括轻链，其含有一个或多个(例如，所有三个)选自SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47和SEQ ID NO：48的CDRs；以及重链，其含有一个或多个(例如，所有三个)选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：294的CDRs；或此种轻链和此种重链；其中该人源化免疫球蛋白不是Campath
Figure BDA0000130072490000031
在另一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包括轻链，其含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)；重链，其含有SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)；或此种轻链和此种重链；其中该人源化免疫球蛋白不是Campath
Figure BDA0000130072490000041
在一些实施方式中，该人源化免疫球蛋白的骨架区相对于免疫球蛋白(由其得到轻链CDRs和重链CDRs)的骨架区具有至少50％的同源性。例如，该人源化免疫球蛋白的骨架区可与生殖系人类免疫球蛋白序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或者甚至100％相同。在一个实施方式中，该人源化免疫球蛋白的骨架区可衍生自或从IgG人类抗体可变区得到。在另一个实施方式中，CD52为野生型人CD52。在又一实施方式中，该人源化免疫球蛋白可与阿仑单抗竞争以结合至人CD52，例如，其可结合至与阿仑单抗所要结合的表位相同的表位，或是与之重叠的表位。
本发明还涉及本发明的人源化免疫球蛋白的人源化轻链。在一个实施方式中，人源化轻链包括选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、和SEQ ID NO：48、或其组合的一个或多个CDRs，其中人源化轻链不是Campath的人源化轻链。
在另一个实施方式中，人源化轻链包括SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000043
的人源化轻链。
本发明还涉及本发明的人源化免疫球蛋白的人源化重链。在一个实施方式中，人源化重链包括选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、和SEQ ID NO：294、或其组合的Ig可变域的一个或多个CDRs，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000051
的人源化重链。
在其它实施方式中，该人源化重链包括SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000052
的人源化重链。
优选地，本发明的人源化免疫球蛋白包括本发明的人源化轻链和本发明的人源化重链二者。
在其它实施方式中，本发明提供一种人源化免疫球蛋白，该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的与小鼠单克隆抗体所结合表位相同的表位或与小鼠单克隆抗体竞争或与其交叉竞争，该小鼠单克隆抗体包括SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ IDNO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQ ID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，该表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52(例如，SEQID NO：104)上的表位的人源化免疫球蛋白，其包括至少成熟人类CD52序列的残基1(其中残基1是成熟人类CD52序列的N端，即，N端甘氨酸[G]残基；参见图4)。该人源化免疫球蛋白可结合至包括至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5的表位(这些残基分别是甘氨酸[G]、天冬酰胺[N]、天冬氨酸[D]、和苏氨酸[T])。该人源化免疫球蛋白可结合至包括至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5的表位(这些残基分别为甘氨酸[G]、谷氨酰胺[Q]、天冬酰胺[N]、天冬氨酸[D]、及苏氨酸[T])。在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52上的表位的人源化免疫球蛋白，该表位包括至少成熟人类CD52序列的残基7、8和9(这些残基分别为谷氨酰胺[Q]、苏氨酸[T]、和丝氨酸[S])。在一些实施方式中，表位包括至少成熟人类CD52序列的残基7(Q)、8(T)和11(P)。在一些实施方式中，表位包括至少成熟人类CD52序列的残基4(D)和11(P)。
在一些实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，其包括含有选自SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的轻链，或含有选自SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ IDNO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的重链，或此种轻链和此种重链二者。在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有选自SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ ID NO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的轻链，或含有选自SEQ ID NO：125、SEQID NO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的重链，或此种轻链和重链二者。在进一步的实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的轻链，或含有选自SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129、和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述CDRs)的重链，或此种轻链和此种重链二者。
在某些实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：121的CDRs的轻链，以及含有SEQID NO：124、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：130的CDRs的重链。在其它实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO：116、SEQID NO：119和SEQ ID NO：122的CDRs的轻链，以及含有SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131的CDRs的重链。在其它实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：123的CDRs的轻链，以及含有SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：132的CDRs的重链。
本发明的人源化免疫球蛋白与人源化免疫球蛋白Campath
Figure BDA0000130072490000071
不同。
上述SEQ ID NOs：115-132的氨基酸序列提供于下文，并且是基于本文他处提供的表1-6中所报告的氨基酸序列。在这些氨基酸序列中，“X”表示任意氨基酸，且符号“/”表示相邻该符号的氨基酸的其中一个(或任一个)可存在于所指出位置(例如，K/R表示赖氨酸或精氨酸残基存在于所指出位置，F/L/V指出苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基存在于所指出位置)。
轻链CDR-1序列
K/RSSQSLL/V/IXS/TN/DGXS/TYLX(SEQ ID NO：115)
K/RSSQSLL/V/IHS/TNGXS/TYLH(SEQ ID NO：116)
RSSQSLVHTNGNS/TYLH(SEQ ID NO：117)
轻链CDR-2序列
XVSXXXS(SEQ ID NO：118)
XVSXRXS(SEQ ID NO：119)
MVSXRFS(SEQ ID NO：120)
轻链CDR-3序列
XQXXH/R/KF/L/V/IXX(SEQ ID NO：121)
SQSXH/R/KF/L/V/IPX(SEQ ID NO：122)
SQSXHVPF/P(SEQ ID NO：123)
重链CDR-1序列
GFXFXXYW/YMX(SEQ ID NO：124)
GFTFXXYW/YMX (SEQ ID NO：125)
GFTFTDYW/YMS(SEQ ID NO：126)
重链CDR-2序列
XIRXKXBXYXTXYXXSVKG(SEQ ID NO：127)
XIRXKXNXYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO：128)
FIRNKANGYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO：129)
重链CDR-3序列
TXXXY/F/W(SEQ ID NO：130)
TRYXY/F/WFDY(SEQ ID NO：131)
TRYIF/WFDY(SEQ ID NO：132)
本发明还涉及一种人源化轻链，其含有选自SEQ ID NO：115、SEQID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；一种人源化轻链，其含有选自SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：119、和SEQ ID NO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；或一种人源化轻链，其含有选自SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)。
本发明还涉及一种人源化重链，其含有选自SEQ ID NO：124、SEQID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；一种人源化重链，其含有选自SEQ ID NO：125、SEQ IDNO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；或一种人源化重链，其含有选自SEQ ID NO：126、SEQ IDNO：129、和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)。
本发明的人源化轻链和人源化重链与人源化免疫球蛋白Campath
Figure BDA0000130072490000091
的人源化轻链和人源化重链不同。
在本发明的一些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白(不考虑它们可能被另外限定的方式，例如，不考虑它们是否也以其CDRs的一个或多个的序列的方式来限定和/或通过它们与小鼠单克隆抗体或另一人源化免疫球蛋白的交叉反应性来限定)：(1)显示出结合至糖基化和去糖基化CD52而无明显偏好；(2)显示出对糖基化CD52的特异性结合；(3)显示出对去糖基化CD52的特异性结合；或(4)相对于糖基化CD52显示出对去糖基化者的结合偏好。在某些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更高的结合亲和性。的确，在本发明的某些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白显示出对糖基化的人CD52的特异性结合。对非糖基化或去糖基化的人CD52的结合亲和性可使用已经用糖苷酶，例如使用内切糖苷酶PNGase-F去糖基化的成熟人类CD52来确定。在本发明的某些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白结合至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人类CD52上的表位。此碳水化合物部分是一种唾液酸化的、含聚乳糖胺的核心岩藻糖化的四天线型N-连接的低聚糖(Treumann，A.等人，(1995)J.Biol.Chem.270：6088-6099)。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3，至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5，或至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5。在一些实施方式中，本发明的鼠或嵌合抗体可具任意这些结合特征。
还提供如在本文他处所定义的编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链或人源化重链的分离的核酸分子。在一些实施方式中，本发明为一种(一个或多个)分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中人源化轻链包含SEQ ID NO：3的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)且重链包含SEQ ID NO：16的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)；包含SEQ ID NO：4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：17的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：5的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：18的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ IDNO：6的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：19的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：7的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：20的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：8的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：9的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：22的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：10的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：23的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：11的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ IDNO：24的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：25的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；或包含SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和包含SEQ ID NO：26的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链序列。
在一些实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ IDNO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQ ID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，此表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人CD52的残基1的表位；该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人CD52的残基1、3、4和5的表位；该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人CD52的残基1、2、3、4和5的表位；或者该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人CD52的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白包括：包含选自SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的轻链，和/或包含选自SEQID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的重链；包含选自SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ ID NO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的轻链，和/或包含选自SEQ ID NO：125、SEQ IDNO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的重链；或者，包含选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的轻链，和/或包含选自SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129、和SEQID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的重链。
在某些实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白包括，包含SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：121的CDRs的轻链，以及包含SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：130的CDRs的重链；包含SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119和SEQ IDNO：122的CDRs的轻链，以及包含SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131的CDRs的重链；或包含SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：123的CDRs的轻链，以及包含SEQID NO：126、SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：132的CDRs的重链。
本发明的该一个或多个核酸不编码人源化免疫球蛋白Campath
Figure BDA0000130072490000121
在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的结合亲和性，例如，显现出对糖基化的人CD52的特异性结合。人源化免疫球蛋白可结合至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3，至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5，或是至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化轻链，该人源化轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000131
的人源化轻链。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化重链，该人源化重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000132
的人源化重链。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化轻链，该人源化轻链包含选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、和SEQ ID NO：48或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000133
的人源化轻链。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化重链，该人源化重链包含选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、和SEQ ID NO：294、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000134
的人源化重链。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码包含选自SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；包含选自SEQID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ ID NO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；或包含选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链。
在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码包含选自SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；包含选自SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；或包含选自SEQID NO：126、SEQ ID NO：129、和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链。
本发明还涉及一种重组载体(例如，表达载体，包括哺乳动物细胞表达载体)，其包含编码本发明的人源化免疫球蛋白(例如，人源化轻链和人源化重链)、人源化轻链、或人源化重链的核酸。在一些实施方式中，本发明为一种重组载体，其包含编码人源化免疫球蛋白的核酸，该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：3的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：16的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：17的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ IDNO：5的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：18的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：6的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：19的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：7的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：20的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：8的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：9的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：22的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：10的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：23的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ IDNO：11的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：24的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：25的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；或含有SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：26的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链。
在其它实施方式中，重组载体包含编码人源化轻链的核酸，其中该人源化轻链包含选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、和SEQ ID NO：48、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000151
的人源化轻链。
在其它实施方式中，重组载体包含编码人源化重链的核酸，其中该人源化重链包含选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、和SEQ ID NO：294、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000152
的人源化轻链。
在一些实施方式中，本发明提供包含一个核酸分子的一个重组载体，或包含多个核酸分子的一对重组载体，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明提供包含一个核酸分子的一个重组载体，或包含多个核酸分子的一对重组载体，其编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，此表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人类CD52的残基1的表位；结合至包含至少成熟人类CD52的残基1、3、4和5的表位；结合至包含至少成熟人类CD52的残基1、2、3、4和5的表位；或结合至包含至少成熟人类CD52的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
在一些实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白包含含有选自SEQ ID NO：115、SEQ IDNO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种轻链，和/或含有选自SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种重链；含有选自SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ IDNO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种轻链，和/或含有选自SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种重链；或含有选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种轻链，和/或含有选自SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129、和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种重链。
在某些实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：121的CDRs的轻链，和含有SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：130的CDRs的重链；含有SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：122的CDRs的轻链，和含有SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131的CDRs的重链；或含有SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：123的CDRs的轻链，和含有SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129和SEQ IDNO：132的CDRs的重链。
在本发明的重组载体中的该一个或多个核酸不编码人源化免疫球蛋白Campath
Figure BDA0000130072490000171
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链(其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白)，其中该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的结合亲和性，例如，显现出特异于糖基化人CD52的结合。人源化免疫球蛋白可结合至包含其N-连接碳水化合物部分的成熟人类CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3，至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5，或至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5。
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000181
的人源化轻链。
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链，其中该人源化重链不是Campath的人源化重链。
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含选自SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；包含选自SEQID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ ID NO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；或包含选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000183
的人源化轻链。
在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含选自SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；包含选自SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；或包含选自SEQID NO：126、SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000184
的人源化重链。
在特定的实施方式中，本发明的重组载体为表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体。在某些实施方式中，该载体是一种质粒或是病毒载体(例如，腺病毒或AAV载体)。
本发明还涉及一种包含编码本发明的人源化免疫球蛋白(人源化轻链和人源化重链)、人源化轻链或人源化重链的(一个或多个)核酸(例如，重组)的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞包含一种本发明的重组载体(例如，表达载体，包括哺乳动物细胞表达载体)。
在特定的实施方式中，该宿主细胞包含一种编码人源化轻链和人源化重链的核酸(一个或多个核酸)，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，并且其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：3的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO：16的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ IDNO：17的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：5的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：18的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：6的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：19的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：7的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：20的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：8的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ IDNO：9的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：22的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：10的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：23的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：11的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：24的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：25的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；或含有SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链，和含有SEQ ID NO：26的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链序列。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQ ID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ IDNO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的与此种小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠的表位。
在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人类CD52的残基1的表位；结合至包含至少成熟人类CD52的残基1、3、4和5的表位；结合至包含至少成熟人类CD52的残基1、2、3、4和5的表位；或者结合至包含至少成熟人类CD52的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包含一种轻链，其含有选自SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、和SEQ ID NO：121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)，和/或一种重链，其含有选自SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127、和SEQ ID NO：130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；一种轻链，其含有选自SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：119、和SEQ IDNO：122的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)，和/或一种重链，其含有选自SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128、和SEQ ID NO：131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)；或一种轻链，其含有选自SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120、和SEQ ID NO：123的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)，和/或一种重链，其含有选自SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129、和SEQ ID NO：132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118和SEQ IDNO：121的CDRs的轻链和含有SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：130的CDRs的重链；含有SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：119、和SEQ ID NO：122的CDRs的轻链和含有SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131的CDRs的重链；或含有SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：123的CDRs的轻链和含有SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：132的CDRs的重链。
在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的结合亲和性，例如，显现出对糖基化的人CD52特异性结合。人源化免疫球蛋白可结合至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3，至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5，或至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化轻链的一种核酸分子，该人源化轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)。该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000221
的人源化轻链。
在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链的一种核酸分子，该人源化重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)。该人源化重链不是Campath的人源化重链。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化轻链的一种核酸，其中该人源化轻链包含选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、和SEQ ID NO：48或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000223
的人源化轻链。
在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链的一种核酸，其中该人源化重链包含选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、和SEQID NO：294或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000231
的人源化重链。
本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明人源化免疫球蛋白(例如，本发明的人源化轻链和人源化重链)的一个或多个重组核酸的宿主细胞)维持在适合人源化免疫球蛋白表达的条件下，借以表达人源化免疫球蛋白链并产生人源化免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法还包括纯化或分离人源化免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法还包括将纯化或分离的人源化免疫球蛋白与生理上可接受的媒介物或载体结合以制备药物组合物。
本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的人源化轻链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明人源化轻链的一个或多个重组核酸的宿主细胞)维持在适合人源化轻链表达的条件下，借以表达人源化轻链并产生人源化轻链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离人源化轻链。
本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的人源化重链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明人源化重链的一个或多个重组核酸的宿主细胞)维持在适合人源化重链表达的条件下，借以表达人源化重链并产生人源化重链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离人源化重链。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的人源化免疫球蛋白(例如，包含本发明的人源化轻链和/或本发明的人源化重链)和生理学上可接受的媒介物或载体。在一些实施方式中，该药物组合物包含一种单位剂量组合物。
本发明还涉及一种会分泌对人CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤的生产方法，其包括将人CD52转基因小鼠的淋巴细胞施用至品系与人CD52转基因小鼠相同或类似的(例如，CD1)的非转基因小鼠，由此得到免疫的非转基因小鼠。该免疫的非转基因小鼠的脾细胞与永生细胞融合，从而制得杂交瘤。将该杂交瘤保持在其会分泌对人CD52具有结合特异性的单克隆抗体的条件下。在一些实施方式中，使用FACS分析以检测会分泌对人CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤。在其它实施方式中，转基因小鼠的品系和非转基因小鼠的品系是相同的。在某些实施方式中，CD52是野生型人CD52。在一些实施方式中，CD52转基因小鼠和非转基因小鼠是CD1鼠。在一些实施方式中，用于免疫的淋巴细胞是从人CD52转基因小鼠的脾脏中得到的。在一些实施方式中，永生细胞选自SP2/0 Ag14细胞和NS1骨髓瘤细胞。本发明还涉及一种通过本发明的方法所生产的杂交瘤。选择性地，由杂交瘤所分泌的单克隆抗体被收集，并可被进一步纯化(例如，大体上纯化的，分离的)。在其它实施方式中，该方法进一步包括确定由杂交瘤所分泌的单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病(例如，多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)(参见例如，Nature ReviewsDrug Discovery 6：75-92(2007))、血管炎(参见例如，Rheumatology39：229-237(2000))、贝西氏病(Behcet′s disease)(BD)(参见例如，Rheumatology 42：1539-1544(2003))、狼疮及乳糜泻(Vivas，S.，等人，N.Engl.J.Med.，354(23)：2514-2515(2006))、血管炎、干癣、肌炎、硬皮病、再生障碍性贫血、及结肠炎)的方法，其包括对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
在另一方面，有效量的本发明的人源化免疫球蛋白可与一种或多种免疫抑制剂一起施用以使需要此种治疗的病人准备进行实体器官移植(Agarwal等人，Transplant Immunol.，20：6-11(2008))或CD34+干细胞移植(Burt等人，The Lancet，published online January 30，2009)。
本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的癌症的方法，其包括对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的多发性硬化症的方法，其包括对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的慢性淋巴细胞白血病的方法，其包括对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
本发明的人源化免疫球蛋白的给药可包括人源化免疫球蛋白本身的给药(例如，以药物组合物形式)，编码人源化免疫球蛋白的一个或多个重组载体的给药，或是包含编码人源化免疫球蛋白的一个或多个核酸(例如，一个或多个重组载体)和表达人源化免疫球蛋白的宿主细胞的给药。
本发明还涉及一种诊断选自自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)、癌症(例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、移植(例如实体器官移植(例如肾脏移植)和干细胞移植)的疾病的方法，其包括使用本发明的人源化免疫球蛋白在体外检定病人样品。
本发明还涉及一种本发明的人源化免疫球蛋白(例如，包含本发明的人源化轻链和/或本发明的人源化重链)、本发明的重组载体、或是本发明的宿主细胞，用于药物，例如用于疾病治疗和/或诊断，例如用于治疗本文所叙述的疾病或病症比如自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、类风湿性关节炎、和狼疮)、癌症、淋巴细胞过度增殖症状(例如T或B细胞恶性肿瘤，包括例如B细胞慢性淋巴细胞白血病的白血病和例如非何杰金氏淋巴瘤的淋巴瘤)。参见，例如，Lundin，J.，等人，Blood，101：4267-4272(2003)；Rodig，SJ.，等人，Clinical Cancer Research，12(23)：7174-7179(2006)。本发明还涉及本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链或人源化重链、本发明的重组载体、或本发明的宿主细胞用于制造用来治疗本文所述的疾病或病症(例如，自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)、癌症(例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、和移植(例如实体器官移植(例如肾脏移植)和干细胞移植))的药物中的用途。
本发明还提供一种人源化抗人CD52抗体，包括人轻链骨架区，其利用残基36(Y)和46(L)(Kabat编号)已被替代的人Vk2-A18b基因。在一些实施方式中，残基36为V或L且残基46为R。本发明还提供人源化抗人CD52抗体，包括人重链骨架区，其利用残基47(W)(Kabat编号)已被替代的人VH 3-23基因。在一些实施方式中，残基47(W)和49(S)(Kabat编号)均被替代。在一些实施方式中，残基47为L且残基49为S。在其它实施方式中，残基47为L且残基49为A。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体的EC50值，如在细胞结合检定(例如在实施例29中描述的检定)中所确定，两倍低于Campath-1H
Figure BDA0000130072490000261
抗体的EC50值。在多个实施方式中，人源化抗人CD52抗体的EC50值为11nM或更低。
在一些实施方式中，在来源于经Campath-1H
Figure BDA0000130072490000262
治疗的病人的血清的抗Campath-1H抗体的存在下，本发明的人源化抗人CD52抗体结合至细胞上的CD52。也就是说，在这样的抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490000264
抗体的存在下，本发明的人源化抗人CD52抗体在细胞上与CD52的结合相比于Campath-1H
Figure BDA0000130072490000265
与CD52的结合并未降低，或者其在这样的抗Campath-1H抗体的存在下相比于Campath-1H
Figure BDA0000130072490000267
与CD52的结合更少降低。
本发明还提供一种人源化抗人CD52抗体以及本文提供的人源化抗人CD52抗体的血液和/或脾脏中淋巴细胞消减概况。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体使受试者的血清中TNFα、IL-6和MCP-1中的一个或多个的循环水平增加。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体降低受试者中的淋巴细胞水平至少30天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、或80天以上。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体延迟疾病发病和/或降低疾病的严重度，如在小鼠EAE模型中通过临床评分所测定。
在一些实施方式中，在免疫原性检定例如在实施例69或70中所描述的检定中，本发明的人源化抗人CD52抗体的免疫原性比Campath-1H低。
小鼠单克隆免疫球蛋白
本发明还涉及对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体(小鼠单克隆免疫球蛋白)。在一个实施方式中，本发明涉及对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体，其包含含有SEQ ID NO：3的轻链和含有SEQ ID NO：16的重链；含有SEQ ID NO：4的轻链和含有SEQID NO：17的重链；含有SEQ ID NO：5的轻链和含有SEQ ID NO：18的重链；含有SEQ ID NO：6的轻链和含有SEQ ID NO：19的重链；含有SEQ ID NO：7的轻链和含有SEQ ID NO：20的重链；含有SEQID NO：8的轻链和含有SEQ ID NO：21的重链；含有SEQ ID NO：9的轻链和含有SEQ ID NO：22的重链；含有SEQ ID NO：10的轻链和含有SEQ ID NO：23的重链；含有SEQ ID NO：11的轻链和含有SEQID NO：24的重链；含有SEQ ID NO：12的轻链和含有SEQ ID NO：25的重链；或含有SEQ ID NO：13的轻链和含有SEQ ID NO：26的重链。
在一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的轻链可变区，或选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区，或者此种轻链可变区和此种重链可变区二者。
本发明还涉及一种小鼠免疫球蛋白轻链，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、或SEQ ID NO：13的可变区。
本发明还涉及一种小鼠免疫球蛋白重链，其包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26的可变区。
优选地，本发明的小鼠单克隆抗体包含本发明的鼠抗体轻链和本发明的鼠抗体重链。在一些实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合至与一种小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ IDNO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQ ID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ IDNO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合至人CD52上的表位，该表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
在其它实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合至人CD52上的包含至少成熟人类CD52序列的残基1的表位。该小鼠单克隆免疫球蛋白可结合至包含至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5的表位，可结合至包含至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5的表位，或者可结合至包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
本发明还涉及分离的核酸分子，其编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白轻链或小鼠免疫球蛋白重链。在一些实施方式中，本发明为一种分离的核酸分子，其编码小鼠免疫球蛋白重链和小鼠免疫球蛋白轻链，它们结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白，其中该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区，或者该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的可变区，或者此种轻链和此种重链二者。
在一些实施方式中，该分离的核酸编码小鼠免疫球蛋白轻链，其包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区。
在其它实施方式中，该分离的核酸编码小鼠免疫球蛋白重链，其包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的可变区。
本发明还涉及一种重组载体(例如，表达载体，包括哺乳动物细胞表达载体)，其包含编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白(例如，小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链)、小鼠免疫球蛋白轻链、或小鼠免疫球蛋白重链的核酸。在一些实施方式中，本发明为包含一个编码小鼠单克隆免疫球蛋白的核酸的一个重组载体，或包含多个编码小鼠单克隆免疫球蛋白的核酸的一对重组载体，该小鼠单克隆免疫球蛋白包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的轻链可变区，或选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区，或者此种轻链可变区和此种重链可变区二者。
在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白轻链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13。
在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26。
在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白。在一个实施方式中，该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区，且该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的可变区。
在特定的实施方式中，本发明的重组载体为一种表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体。在某些实施方式中，载体为一种质粒或是病毒载体(例如，腺病毒或AAV载体)。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白(小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链)、小鼠免疫球蛋白轻链或小鼠免疫球蛋白重链的核酸。例如，在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种本发明的重组载体(例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体)。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链和该小鼠免疫球蛋白重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白，并且其中该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区，且/或该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的可变区，或二者皆具。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白轻链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的轻链可变区。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区。
本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白(例如，小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链)的一个或多个重组核酸(例如，重组载体)的宿主细胞)维持在适合小鼠单克隆免疫球蛋白表达的条件下，借以表达小鼠单克隆免疫球蛋白链并制备小鼠单克隆免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离小鼠单克隆免疫球蛋白。
本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白轻链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(包含编码本发明的小鼠免疫球蛋白轻链的核酸)维持在适合该小鼠免疫球蛋白轻链表达的条件下，借以表达轻链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该轻链。
本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白重链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(包含编码本发明的小鼠免疫球蛋白重链的核酸)维持在适合该小鼠免疫球蛋白重链表达的条件下，借以表达小鼠免疫球蛋白重链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该小鼠免疫球蛋白重链。
本发明还涉及一种疾病(例如，自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)，癌症(例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))，移植(例如实体器官移植(例如肾脏移植)和干细胞移植))的诊断方法，其包括使用本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白在体外分析病人样品(例如，Lundin，J.等人，Blood，101：4267-4272(2003)；Rodig，SJ等人，Clin.Cancer res.，12(23)；7174-717179(2006))。
嵌合免疫球蛋白
本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白。此种嵌合免疫球蛋白可包含本发明的任何小鼠单克隆免疫球蛋白的可变区。在一个实施方式中，本发明的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。
本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的嵌合抗体，其包含选自：SEQ ID NO：3的轻链可变区、SEQ ID NO：4的轻链可变区、SEQ ID NO：5的轻链可变区、SEQ ID NO：6的轻链可变区、SEQ IDNO：7的轻链可变区、SEQ ID NO：8的轻链可变区、SEQ ID NO：9的轻链可变区、SEQ ID NO：10的轻链可变区、SEQ ID NO：11的轻链可变区、SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区的轻链可变区序列，和/或选自：SEQ ID NO：16的重链可变区、SEQ ID NO：17的重链可变区、SEQ ID NO：18的重链可变区、SEQ IDNO：19的重链可变区、SEQ ID NO：20的重链可变区、SEQ ID NO：21的重链可变区、SEQ ID NO：22的重链可变区、SEQ ID NO：23的重链可变区、SEQ ID NO：24的重链可变区、SEQ ID NO：25的重链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区的重链可变区序列。
本发明还涉及一种嵌合轻链，其包含选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区。
本发明还涉及一种嵌合重链，其包含选自SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、和SEQ ID NO：26的可变区。
优选地，本发明的嵌合免疫球蛋白包含本发明的嵌合轻链和本发明的嵌合重链二者。
在一些实施方式中，本发明提供一种结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位的嵌合免疫球蛋白，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ IDNO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQ ID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。在其它实施方式中，该嵌合免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，此表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
在其它实施方式中，本发明提供一种嵌合免疫球蛋白，其结合至人CD52上的表位，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基1。该嵌合免疫球蛋白可结合至包含至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5的表位，可结合至包含至少成熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5的表位，或者可结合至人CD52上的包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明的嵌合免疫球蛋白、嵌合轻链或嵌合重链。在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合重链和嵌合轻链的分离的核酸分子(一个或多个核酸分子)，嵌合重链和嵌合轻链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白，其中该嵌合轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区；且/或该嵌合重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的可变区。
在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合轻链的分离的核酸分子，该嵌合轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13的可变区。
在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合重链的分离的核酸分子，该嵌合重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26的可变区。
本发明还涉及一种重组载体(例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体)，其包含编码本发明的嵌合免疫球蛋白(嵌合轻链和嵌合重链)、嵌合轻链、或嵌合重链的核酸。在一些实施方式中，本发明为一种包含编码嵌合免疫球蛋白的核酸的重组载体(或包含多个核酸的一对重组载体)，该嵌合免疫球蛋白包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的轻链可变区；或选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区；或此种轻链和重链二者。
在其它实施方式中，该重组载体包含编码嵌合轻链的核酸，其中该嵌合轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13的可变区。
在其它实施方式中，该重组载体包含编码嵌合重链的核酸，其中该嵌合重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26的可变区。
在特定的实施方式中，本发明的重组载体为一种表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体。在某些实施方式中，载体为一种质粒或病毒载体(例如，腺病毒或AAV载体)。
本发明还涉及一种包含编码本发明的嵌合免疫球蛋白(嵌合轻链和嵌合重链)、嵌合轻链或嵌合重链的一个或多个核酸(例如，一个或多个重组载体)的宿主细胞。例如，在一些实施方式中，宿主细胞包含一种本发明的重组载体(例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体)。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合轻链和嵌合重链的一个重组核酸(或一对重组核酸)，其中该嵌合轻链和该嵌合重链结合在一起而形成对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白，并且其中该嵌合轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的可变区；且/或该嵌合重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的可变区。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合轻链的重组核酸，其中该嵌合轻链包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的轻链可变区。
在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合重链的重组核酸，其中该嵌合重链包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区。
本发明还涉及一种嵌合免疫球蛋白的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含一个或多个编码本发明的嵌合免疫球蛋白(例如，嵌合轻链和嵌合重链)的分离的核酸的宿主细胞)维持在适合嵌合免疫球蛋白表达的条件下，借以表达嵌合免疫球蛋白链并制备嵌合免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离嵌合免疫球蛋白。
本发明还涉及一种嵌合轻链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明的嵌合轻链的核酸的宿主细胞)维持在适合该嵌合轻链表达的条件下，借以表达嵌合轻链并制备嵌合轻链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该嵌合轻链。
本发明还涉及一种嵌合重链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞(例如，包含编码本发明的嵌合重链的核酸的宿主细胞)维持在适合该嵌合重链表达的条件下，借以表达嵌合重链并制备嵌合重链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该嵌合重链。
本发明还涉及一种选自自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)、癌症(例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、和移植(例如实体器官移植(例如肾脏移植)和干细胞移植)的疾病的诊断方法，其包括使用本发明的嵌合免疫球蛋白在体外分析病人样品。
本发明的进一步实施方式在以下描述。一方面，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的轻链和重链分别包含：在SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：16中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：17中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：18中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：19中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：20中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：22中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：23中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：24中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：25中找到的三个互补决定区(CDRs)；在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：137中找到的三个互补决定区(CDRs)；或在SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：26中找到的三个互补决定区(CDRs)。在一些实施方式中，本发明涉及一种结合至与上述单克隆抗体或抗原结合部分所结合的人CD52上的表位相同的表位的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述的单克隆抗体或抗原结合部分竞争的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述的单克隆抗体或抗原结合部分交叉竞争的抗体。
在一些实施方式中，任何上述抗体或抗原结合部分结合至包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列。在一些相关的实施方式中，该抗体或部分至SEQ ID NO：104的结合可通过在SEQ ID NO：104的残基4、7、8、或11中的一个或多个处的丙氨酸取代而减少。
在一些实施方式中，抗体为一种人源化抗体、小鼠抗体、或嵌合抗体。在某些实施方式中，该抗体重链的骨架区利用VH3-72或VH3-23人类生殖系序列，且该抗体轻链的骨架区利用VK2A18b人类生殖系序列。
在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含重链(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及轻链(L)-CDR1、L-CDR2、和L-CDR3，其氨基酸序列分别为SEQID NOs：51、59、69、29、36、和43；分别为SEQ ID NOs：50、60、69、29、37、和43；分别为SEQ ID NOs：50、61、68、29、38、和43；分别为SEQ ID NOs：50、61、69、29、36、和43；分别为SEQ IDNOs：50、62、69、29、39、和43；分别为SEQ ID NOs：52、61、70、30、40、和43；分别为SEQ ID NOs：53、63、71、31、36、和44；分别为SEQ ID NOs：54、64、71、31、36、和45；分别为SEQ ID NOs：55、63、72、31、36、和46；分别为SEQ ID NOs：56、65、73、32、41、和47；分别为SEQ ID NOs：56、65、294、32、41、和47；或分别为SEQ ID NOs：56、66、74、33、41、和48。
在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的轻链和重链分别包含SEQ ID NOs：3和16的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：4和17的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：5和18的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：6和19的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：7和20的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：8和21的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：9和22的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：10和23的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：11和24的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：12和25的氨基酸序列；或者分别包含SEQ ID NOs：13和26的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs：103和102的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：136和138的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：137和138的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：139和147的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：149和155的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：149和156的氨基酸序列；分别包含SEQID NOs：158和165的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：158和166的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：159和165的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：159和166的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs：161和166的氨基酸序列；或分别包含SEQ ID NOs：163和166的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明涉及一种结合至与上述单克隆抗体或其抗原结合部分所结合的人CD52上的表位相同的表位的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述单克隆抗体或抗原结合部分竞争的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述单克隆抗体或抗原结合部分交叉竞争的抗体。
在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆人源化抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ IDNOs：272和273的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs：274和275的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ IDNOs：276和278的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs：277和278的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ IDNOs：279和280的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs：281和282的氨基酸序列，且无信号序列。本发明还提供结合至与这些人源化抗体的其中之一所结合的CD52上的表位相同的表位的抗体，和与这些人源化抗体的其中之一竞争或交叉竞争的抗体。在相关的实施方式中，本发明提供包含一种这些人源化抗体的组合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的轻链包含选自SEQ ID NOs：102、138、145-148、153-157、和164-168的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的轻链包含选自SEQ ID NOs：273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种抗体轻链或其部分，其包含选自SEQ ID NOs：102、138、145-148、153-157、164-168、273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链包含选自SEQ ID NOs：103、136、137、139-144、149-152、和158-163的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链包含选自SEQ ID NOs：272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种抗体重链或其部分，其包含选自SEQ ID NOs：103、136、137、139-144、149-152、158-163、272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
在一些实施方式中，任何上述抗体可以为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子。在某些实施方式中，该IgG为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。
在一些实施方式中，任何上述抗原结合部分可为单链抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv分子(scFv)、双特异性单链Fv二聚体、双抗体(diabody)、区域缺失抗体或单域抗体(dAb)。
本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分，其中该抗体或抗原结合部分消减T或B淋巴细胞，或其二者；与B淋巴细胞相较，优先消减T淋巴细胞；增加TNF-α、IL-6、或MCP-1的循环血清水平(例如，以至少5％、至少10％、至少50％、至少100％、或至少200％的水平)；介导CD52表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；尽管在阿仑单抗的中和抗体存在于病人中的情况下，结合至人CD52；并且/或促进人类T和/或B细胞的细胞内信号传导(参见例如，Hederer等人，International Immunology 12：505-616(2000)；Watanabe等人，ClinicalImmunology 120：247-259(2006))。
本发明还涉及一种编码任何上述抗体的重链或其抗原结合部分或任何上述抗体的轻链或其抗原结合部分的分离的核酸。在一些实施方式中，该分离的核酸包含选自SEQ ID NOs：283、285、287、288、290、和292的重链核苷酸序列，或不具有编码信号肽的序列的该核苷酸序列；选自SEQ ID NOs：284、286、289、291、和293的轻链核苷酸序列，或是不具有编码信号肽的序列的该核苷酸序列；或该重链核苷酸序列和该轻链核苷酸序列皆包含。在某些实施方式中，该分离的核酸包含重链核苷酸序列与轻链核苷酸序列，其分别选自SEQ ID NO：283和SEQ ID NO：284，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQID NO：285和SEQ ID NO：286，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：289，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：288和SEQ ID NO：289，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：291，二者皆不具有编码信号肽的序列；以及分别选自SEQ ID NO：292和SEQ ID NO：293，二者皆不具有编码信号肽的序列。
本发明还涉及包含重链核苷酸序列的分离核酸以及包含轻链核苷酸序列的分离核酸用于制造治疗需要此种治疗的病人的药物中的用途，其中该重链核苷酸序列和该轻链核苷酸序列分别选自SEQ ID NO：283和SEQ ID NO：284，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：285和SEQ ID NO：286，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：289，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：288和SEQ ID NO：289，二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO：290和SEQ IDNO：291，二者皆不具有编码信号肽的序列；以及分别选自SEQ ID NO：292和SEQ ID NO：293，二者皆不具有编码信号肽的序列。
本发明还涉及一种重组载体，其包含(1)编码任何上述抗体的重链或其抗原结合部分的核酸序列，(2)编码任何上述抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸序列，或(3)二者。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码任何上述抗体的重链或其抗原结合部分的第一核酸序列，该第一核酸序列可操作地连接至表达控制元件，和编码该抗体的轻链或其抗原结合部分的第二核酸序列，该第二核酸序列可操作地连接至表达控制元件。本发明涉及一种抗人CD52抗体或其抗原结合部分的制造方法，其包括将该宿主细胞维持在适合该抗体或部分表达的条件下，并且还涉及进一步包括分离该抗体或部分的步骤的该方法。
本发明涉及一种组合物，其包含根据权利要求第1-24项中任一项的单克隆抗体或抗原结合部分以及药学上可接受的媒介物或载体。
在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要的病人进行治疗的方法，其包括对病人施用有效量的任何上述的抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某些实施方式中，该病人正接受移植。
在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要自体免疫疾病治疗的病人进行治疗的方法，其包括对病人施用有效量的任何上述的抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某些实施方式中，该自体免疫疾病为，例如，多发性硬化症、类风湿性关节炎、或系统性红斑狼疮。
在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要癌症治疗的病人进行治疗的方法，其包括对病人施用有效量的任何上述抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某些实施方式中，该癌症为，例如，淋巴瘤比如非何杰金氏淋巴瘤；白血病比如B细胞慢性淋巴细胞白血病；T细胞恶性肿瘤，其中与B细胞相较，该抗体或部分优先地消减T细胞；或实体肿瘤。
在一些实施方式中，任一种上述治疗方法进一步包括对病人施用嗜中性细胞刺激剂或NK细胞刺激剂。在某些实施方式中，该刺激剂为G-CSF或GM-CSF。在一些实施方式中，任一种上述治疗方法进一步包括对病人施用T调节细胞刺激剂。在某些实施方式中，该刺激剂为雷帕霉素(rapamycin)。
在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要的病人抑制血管生成的方法，其包括对病人施用有效量的任何上述抗体或抗原结合部分。在某些实施方式中，该病人有实体肿瘤。在某些实施方式中，该病人有新血管形成。在某些实施方式中，该新血管形成在眼睛中。
本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造用来治疗有需要病人中的自体免疫疾病的药物中的用途。而且，本发明涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造用来治疗有需要病人中的癌症的药物中的用途。本发明涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造用来治疗需要移植的病人的药物中的用途。本发明涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造在需要的病人中治疗新血管形成的药物中的用途。
本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分作为药物的用途。
附图说明
图1A-1B是一种新的抗CD52单克隆抗体的发展的示意表示。一般方案描述于图1A中，且鼠抗人CD52抗体克隆及其同种型(isotype)的名称显示于图1B中。
图2是多个鼠抗人CD52κ轻链序列(SEQ ID NOS：1-13)的氨基酸序列的排列。Campath-1G是一种大鼠单克隆抗体，由此得到人源化Campath-1H抗体。
图3是多个鼠抗人CD52重链序列(SEQ ID NOS：14-26)的氨基酸序列的排列。
图4是野生型CD52和10种突变的CD52蛋白(SEQ ID NOS：104-114，自上到下)的排列。
图5A说明抗体4B10和7F11在表达CD52丙氨酸扫描突变体的细胞上的基于FACS的N端结合概况。
图5B说明抗体CF1D12、3G7、9D9、5F7、4G7、和11C11在表达CD52丙氨酸扫描突变体的细胞上的基于FACS的中间区域结合概况。
图5C说明抗体Campath-1H
Figure BDA0000130072490000431
(“Campath 1H”)、2C3、12G6、和23E6在表达CD52丙氨酸扫描突变体的细胞上的基于FACS的结合概况。
图5D描述使用嵌合单克隆抗体组探查的CD52+/-N-连接糖基化的免疫印迹。“C1H”表示Campath-1H
图6是显示对于在CHO-K1CD52#67细胞上筛选的各种嵌合抗CD52抗体的1.5小时CDC检定结果的图。结果显示嵌合抗体4B10和7F11与Campath-1H
Figure BDA0000130072490000433
可比较或者优于Campath-1H
Figure BDA0000130072490000434
(“Campath 1H”)。
图7是显示对于在CHO-K1CD52#67细胞上筛选的针对CD52的各种嵌合IgG1抗体的14小时ADCC检定结果的图。结果显示嵌合抗体2C3和12G6与Campath-1H
Figure BDA0000130072490000435
可比较或者优于Campath-1H
Figure BDA0000130072490000436
(“Campath 1H”)。
图8A-8C说明各种抗CD52抗体与Campath-1H
Figure BDA0000130072490000437
(“C-1H”)抗体至规定的人类淋巴细胞群的比较结合。这些图显示通过FACS检定所筛选的嵌合抗体的结合能力的级别。向最右端的曲线显示最高结合能力，而向最左端的曲线则具有较低亲和性。
图9A-9C是说明在用嵌合抗体7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或5F7、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000438
(“Cam”)给药之后72小时在血液中的CD4T细胞(图9A)、CD8T细胞(图9B)和CD19B细胞(图9C)的水平的图。
图10A-10C是说明在用嵌合抗体7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或5F7、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000441
(“Cam”)给药之后72小时在脾脏中的CD4T细胞(图10A)、CD8T细胞(图10B)和CD19B细胞(图10C)的水平的图。
图11A-11C是显示在用嵌合抗体2C3、9D9、4B10、3G7、或11C11、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000442
(“Cam”)给药之后72小时在血液中的CD4T细胞(图11A)、CD8T细胞(图11B)和CD19B细胞(图11C)的水平的图。
图12是说明在使用7F11、4B10、或12G6嵌合单克隆抗体、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000443
(“Campath”)处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
图13是说明在使用2C3、8G3、或23E6嵌合单克隆抗体、或Campath-1H(“Campath”)处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
图14是说明在使用9D9或4B10嵌合单克隆抗体、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000445
(“Campath”)处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
图15是说明在使用2C3或11C11嵌合单克隆抗体、或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000446
(“Campath”)处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
图16是鼠抗人CD52抗体4B10重链可变区(SEQ ID NO：96)序列以及最接近匹配的人类生殖系序列(SEQ ID NO：97)和人源化重链可变区序列(SEQ ID NO：98)的排列。还示出鼠抗人CD52抗体4B10轻链可变区(SEQ ID NO：99)序列以及最接近匹配的人类生殖系序列(SEQ ID NO：100)和人源化轻链可变区序列(SEQ ID NO：101)的排列。
图17显示人源化4B10重链(SEQ ID NO：103)和轻链(SEQ IDNO：102)可变区的序列。
图18是显示人源化抗体4B10-H1/K1(“4B10-人源化”)和嵌合抗体4B10同等地结合至表达CD52的细胞的图。
图19是显示人源化抗体4B10-H1/K1(“4B10-人源化”)和嵌合抗体4B10对表达CD52的细胞介导同等的ADCC活性的图。
图20是显示人源化抗体4B10-H1/K1(“4B10-人源化”)和嵌合抗体4B10对表达CD52的细胞介导同等的CDC活性的图。
图21是说明嵌合抗CD52抗体(12G6、7F11和4B10)、Campath-1H
Figure BDA0000130072490000451
(“Campath”)、和人源化抗CD52抗体4B10-H1/K1(“4B10人源化(H1/K1)”)在杂合的huCD52转基因小鼠中的药物动力学特性的图。
图22A-22C是显示在使用嵌合抗体4B10或人源化抗体4B10-H1/K1(“4B10-Hu”)或Campath-1H
Figure BDA0000130072490000452
(“Campath”)给药之后72小时血液中的CD4T细胞(图22A)、CD8T细胞(图22B)及CD19B细胞(图22C)的水平的图。
图23是显示抗CD52单克隆抗体的相对结合亲和性的概括图。
图24显示人源化7F11重和轻(κ)链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
图25是显示嵌合和人源化7F11抗体同等地结合至表达CD52的细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
图26A显示人源化2C3重链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。图26B显示人源化2C3轻(κ)链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
图27A为显示人源化和嵌合2C3抗体结合至表达CD52的细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。图27B是显示嵌合2C3抗体和一部分(subset)人源化2C3抗体同等地结合至表达CD52的细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
图28A显示人源化12G6重链可变区序列。回复突变为小鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。图28B显示人源化12G6轻(κ)链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
图29是显示嵌合12G6抗体和一部分人源化12G6抗体同等地结合至表达CD52的细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
图30A显示人源化9D9重链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。图30B显示人源化9D9轻(κ)链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
图31是显示嵌合的9D9抗体和一部分人源化9D9抗体同等地结合至表达CD52的细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
图32A显示Campath-1H
Figure BDA0000130072490000461
(“C1H”)、嵌合2C3抗体、及人源化2C3-SFD1/K12抗体至初始人类T细胞和huCD52转基因小鼠T细胞的结合曲线。图32B显示Campath-1H
Figure BDA0000130072490000462
(“C1H”)、嵌合9D9抗体、及人源化9D9抗体至初始人类T细胞和huCD52转基因小鼠T细胞的结合曲线。图32C显示Campath-1H
Figure BDA0000130072490000463
(“C1H”)、嵌合12G6抗体、及人源化12G6抗体至初始人类T细胞和huCD52转基因小鼠T细胞的结合曲线。
图33是显示Campath-1H
Figure BDA0000130072490000464
嵌合2C3及12G6抗体、和人源化2C3及12G6抗体至huCD52表达的人类和转基因小鼠T细胞的相对结合效率的表。
图34通过流式细胞术说明人源化抗CD52Campath-1H
Figure BDA0000130072490000465
2C3、12G6、和9D9抗体至人类外周血单核细胞群的规定亚型的相对结合形式(pattern)。这些统计图显示，对于各种表达CD52的人PBMC亚型，人源化抗CD52抗体结合与Campath-1H
Figure BDA0000130072490000466
的结合相当。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
图35是显示嵌合及人源化7F11抗体对表达CD52的细胞介导同等的ADCC活性的图。
图36是显示嵌合及人源化7F11抗体对表达CD52的细胞介导CDC活性的图。
图37是显示嵌合及人源化2C3抗体对表达CD52的细胞介导ADCC活性的图。
图38是显示嵌合及人源化2C3抗体对表达CD52的细胞介导CDC活性的图。
图39是显示嵌合及人源化12G6抗体对表达CD52的细胞介导ADCC活性的图。
图40是显示嵌合及人源化12G6抗体对表达CD52的细胞介导CDC活性的图。
图41是显示嵌合及人源化9D9抗体对表达CD52的细胞介导ADCC活性的图。
图42是显示嵌合及人源化9D9抗体对表达CD52的细胞介导CDC活性的图。
图43是显示人源化抗CD52抗体在初始T细胞上的ADCC活性的图。
图44是显示人源化抗CD52抗体在初始T细胞上的CDC活性的图。
图45是显示Campath-1H而非其它抗CD52抗体的中和的图，其使用包含抗Campath-1H中和抗体的CAMMS223研究人类血清样品。血清样品在第12个月(M12)和第13个月(M13)取自代表性病人(MS-1)。
图46A-46E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000472
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图47A-47E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000473
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞的水平。
图48A-48E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000474
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
图49A和49B显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000475
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体(mg/kg)给药之后一段时期内的循环淋巴细胞的再增殖。
图50A-50E显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图51A-51E显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图52A-52F显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
图53A和53B显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药(mg/kg)之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
图54A和54B显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000481
(“Campath”)、7F11-嵌合抗体、和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。
图55显示给药之后血液中Campath-1H
Figure BDA0000130072490000482
(“Campath”)、7F11-嵌合抗体和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体在一段时间内的水平。
图56A-56E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图57A-57E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图58A-58F显示在使用2C3-SFD1/K12(“2C3”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
图59显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药(mg/kg)之后循环的淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
图60A-60E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、巨噬细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图61A-61E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、和骨髓样细胞的水平。
图62A-62F显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6hu”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
图63显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药(mg/kg)之后循环的淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
图64A-64C显示给药之后血液中2C3-嵌合、2C3-SFD1/K12、12G6-嵌合、12G6-SFD1/K11、9D9-嵌合、及9D9-H10/K12抗体在一段时间内的水平。
图65A-65E显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、巨噬细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
图66A-66E显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞的水平。
图67A-67F显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
图68显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体(mg/kg)给药之后循环的淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
图69A-69D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000491
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、12G6-SFD1/K11(“12G6”)、和9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时血液中的整体(bu1k)淋巴细胞群(CD4+T细胞、CD8+ T细胞、和B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+B细胞及NK细胞亚型的水平。
图70A-70D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000492
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、12G6-SFD1/K11(“12G6”)、及9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时脾脏中的整体淋巴细胞群(CD4+T细胞、CD8+ T细胞、及B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+B细胞及NK细胞亚型的水平。
图71A-71F显示在使用Campath-1H2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、和9D9-H10/K12抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
图72显示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK细胞的水平。
图73显示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK细胞的水平。
图74A-74D显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6K11”)和12G6-SFD1/K12(“12G6K12”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞的水平。
图75A-75D显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6K11”)和12G6-SFD1/K12(“12G6K12”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞的水平。
图76显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+T细胞、和B220+ B细胞)的水平。
图77A-77D显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞亚型的水平。
图78显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+T细胞、和B220+ B细胞)的水平。
图79A-79D显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞亚型的水平。
图80A-80F显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
图81A和81B显示给药之后血液中2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13和9D9-H18/K13抗体在一段时间内的水平。
图82A-82F显示在使用Campath-1H(“Campath”)、2C3-SFD1/K11、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13抗体给药之后血液中的细胞因子在48小时时间内的水平。
图83A-83E显示在使用Campath-1H(“Campath”)、2C3-SFD1/K11、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的整体淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞的水平。
图84A-84G显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000512
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后循环的CD4+和CD8+ T细胞、调节T细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞在一段时间内的再增殖。
图85显示FITC标记的Campath-1H
Figure BDA0000130072490000513
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3 K12”)、12G6-SFD1/K11(“12G6 K11”)、12G6-SFD1/K12(“12G6K12”)、9D9-H16/K13(“9D9 H16”)、及9D9-H18/K13(“9D9 H18”)抗体在脾脏中特异性地结合至huCD52淋巴细胞群的能力。
图86A-86E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000514
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和B220+ B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞及骨髓样细胞亚型的水平。
图87A-87E显示在使用Campath-1H(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和B220+ B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、NK细胞及骨髓样细胞亚型的水平。
图88A-88F显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000516
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
图89A-89D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000517
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
图90A-90D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000521
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
图91A-91D显示在使用Campath-1H(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时淋巴结中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
图92A显示huCD52-KI/KO和非转基因对照小鼠中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/骨髓样细胞亚型上的huCD52表达水平。图92B显示huCD52-KI/KO和huCD52 CD1转基因小鼠中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、及B细胞上的huCD52表达水平。
图93显示相对于Campath-1H对照组的来自各种制造来源(“小规模”和“大规模”)的12G6-SFD1/K12与2C3-SFD1/K12抗体对huCD52的结合。
图94显示在使用来自各种制造来源(“小规模”和“大规模”)的12G6-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞和NK细胞)的水平。
图95显示在给药之后血液中的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13和12G6-SFD1/K12抗体在一段时间内的水平。
图96显示在疾病进展时期内的2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12的EAE临床评分。
图97A和97B显示Campath1H
Figure BDA0000130072490000524
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、His435Ala 2C3-SFD1/K12(“H435A 2C3”)和His310Ala/His435Gln 2C3-SFD1/K12(“H310A/H435Q 2C3”)结合至小鼠FcRn分子和人类FcRn分子的能力。
图98显示在非转基因小鼠中2C3-SFD1/K12(“2C3未修饰”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-Fc突变体1”)和2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-Fc突变体2”)的体内清除。
图99显示在huCD52转基因小鼠中2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-Fc突变体1”)和2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-Fc突变体2”)的体内清除。
图100A和100B显示在使用2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-Fc突变体1”)、和2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-Fc突变体2”)抗体给药之后72小时血液和脾脏中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK细胞)的水平。
图101A和101B是Biacore T100检定的代表性传感图(sensorgrams)以确定人源化12G6-SFD1/K12抗体和通过丙氨酸扫描而产生的突变肽的表位特异性。图101A显示12G6-SFD1/K12与MUT8肽之间没有结合，而图101B显示12G6-SFD1/K12与MUT 9肽之间存在结合。
图102显示对供体BMS486的TCR Vβ分析。使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000531
肽组986-989驯化(educated)的CD4+ T细胞表现出单一Vβ(Vβ3)的优先增加。
图103显示对供体BMS928的TCR Vβ分析。使用12G6-SFD1/K12肽组1066-67-68和1083-84-85驯化的CD4+ T细胞表现出单一Vβ(Vβ20)的优先增加。
图104A-104J显示Campath-1H
Figure BDA0000130072490000532
免疫原性评估。对于单独供体A-J的增殖反应以CPM显示。X轴描述用于刺激自体CD4+ T细胞三次的肽组。各组T细胞使用以驯化抗原/肽组(特异性反应，左边条状物，白色)、不相关的DR结合肽(中间条状物，加条纹的)、或介质(右边条状物，黑色)脉冲的自体DCs重复检定三次。
图105A-105J显示12G6-SFD1/K12免疫原性评估。对于单独供体A-J的增殖反应以CPM显示。X轴描述用于刺激自体CD4+ T细胞三次的肽组。各组T细胞使用以驯化肽组(特异性反应，左边条状物，白色)、不相关的DR结合肽(中间条状物，加条纹的)、或介质(右边条状物，黑色)脉冲的自体DCs重复检定三次。在没有介质对照检定的小组中，左边条状物(白色)表示用驯化肽脉冲的DCs，右边条状物(加条纹的)表示用不相关肽脉冲的DCs。
图106显示2C3-SFD1(SEQ ID NO：272)的全长人源化重链氨基酸序列和2C3-K12(SEQ ID NO：273)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且CDRs下面划线。
图107显示7F11-SFD1(SEQ ID NO：274)的全长人源化重链氨基酸序列和7F11-K2(SEQ ID NO：275)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且CDRs下面划线。
图108显示9D9-H16(SEQ ID NO：276)和9D9-H18(SEQ ID NO：277)的全长人源化重链氨基酸序列，以及9D9-K13(SEQ ID NO：278)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且CDRs下面划线。
图109显示12G6-SFD1(SEQ ID NO：279)的全长人源化重链氨基酸序列和12G6-K12(SEQ ID NO：280)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且CDRs下面划线。
图110显示4B10-H1(SEQ ID NO：281)的全长人源化重链氨基酸序列和4B10-K1(SEQ ID NO：282)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且CDRs下面划线。
图111显示2C3-SFD1(SEQ ID NO：283)的全长人源化重链核酸序列和2C3-K12(SEQ ID NO：284)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
图112显示7F11-SFD1(SEQ ID NO：285)的全长人源化重链核酸序列和7F11-K2(SEQ ID NO：286)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
图113显示9D9-H16(SEQ ID NO：287)和9D9-H18(SEQ ID NO：288)的全长人源化重链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
图114显示9D9-K13(SEQ ID NO：289)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
图115显示12G6-SFD1(SEQ ID NO：290)的全长人源化重链核酸序列和12G6-K12(SEQ ID NO：291)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
图116显示4B10-H1(SEQ ID NO：292)的全长人源化重链核酸序列和4B10-K1(SEQ ID NO：293)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
具体实施方式
CD52是一种糖基化的、GPI锚定的细胞表面富含蛋白(每个细胞约5x 105个抗体结合部位)，其存在于至少95％的所有人类外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞(Hale G，等人“The CAMPATH-1 antigen(CD52)，”Tissue Antigens，35：178-327(1990))，但是不存在于造血干细胞。本发明涉及对人CD52或其部分具有结合特异性(例如，表位特异性)或者选择性地结合至人CD52或其部分的免疫球蛋白(抗CD52)。这些免疫球蛋白特异性地结合至CD52，并且不会特异性地结合至非CD52分子。抗CD52免疫球蛋白和CD52之间的特异性结合可通过，例如，使用流式细胞术测定免疫球蛋白结合至CD52+细胞的EC50而确定。特异性结合可通过EC50范围例如0.5-10μg/ml所表明。本文所叙述的免疫球蛋白可对所有或部分的人CD52具有结合特异性，其中人CD52是分离的和/或重组的人CD52，或是在表达人CD52的细胞表面上。此外，免疫球蛋白可对一种或多种形式的人CD52(例如，糖基化的人CD52；去糖基化的人CD52；非糖基化的人CD52；和等位基因变体(allelic variants))具有结合特异性。在一个实施方式中，免疫球蛋白对自然生成的、内源的或野生型的人CD52具有结合特异性。野生型人CD52的氨基酸序列说明于图4中(SEQ ID NO：104)。
本文所述的免疫球蛋白可使用已知技术纯化或分离。“纯化”或“分离”的免疫球蛋白已与其来源(例如，细胞上层清液；在混合物中，例如在文库的免疫球蛋白混合物中)的分子(例如，肽)分开，并且包含由本文所述方法或其它合适的方法所得到的免疫球蛋白。分离的免疫球蛋白包含大体上纯的(基本上纯的)免疫球蛋白，和通过化学合成、重组技术及其组合所制备的免疫球蛋白。
更具体而言，本发明涉及抗人CD52免疫球蛋白、免疫球蛋白的抗原结合片段(即，部分)、免疫球蛋白的轻链、免疫球蛋白的重链、和这些轻链或重链的片段。本发明还涉及成熟的免疫球蛋白或其链，例如糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及未成熟的或前体免疫球蛋白(蛋白)。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，载体)，涉及包含此种核酸的载体及宿主细胞，涉及未成熟和成熟蛋白的制备方法，并且涉及免疫球蛋白的使用方法。
本发明的免疫球蛋白可用于治疗需要的受试者(例如，病人)，以根据需要消减受试者的淋巴细胞和其它CD52+细胞(例如，CD52+癌细胞)。本文所用的“淋巴细胞消减”是一种通过减少循环的淋巴细胞群(例如，T细胞和/或B细胞)而造成淋巴细胞减少的免疫抑制类型。本发明的免疫球蛋白还可用于抑制血管生成，如下文进一步所叙述。本发明的免疫球蛋白还可用于，例如，在先体外后体内(ex vivo)应用中使造血干细胞增加(参见，例如，Lim等人，J Hematology &Oncology 1：19(2008))。
自然产生的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两个相同轻链(约24kD)和两个相同重链(约55或70kD)形成一个四聚物。已知每一个链的氨基端部分是可变(V)区，并可以区分于各个链其余部分的更保守的恒定(C)区。在轻链的可变区(也称为VL域)内是已知为J区的C端部分。在重链的可变区(也称为VH域)内，除了J区还有D区。免疫球蛋白中的大部分氨基酸序列变异限制在V区域中三个单独的位置，其称为高可变区或互补决定区(CDRs)，其直接涉及抗原结合。自氨基端开始，这些区域分别命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDRs由更保守的骨架区(FR)保持于所在处。自氨基端开始，这些区域分别命名为FR1、FR2、FR3和FR4。CDR和FR区的位置以及编号系统已由Kabat等人(Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，U.S.Government Printing Office(1991)，Chothia & Lesk，Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，J.Mol.Biol.，196，901-917(1987))，和IMGT
Figure BDA0000130072490000561
编号系统(The InternationalImMunoGeneTics Iinformation Ssystem
Figure BDA0000130072490000562
Lefranc，M.-P.，TheImmunologist 7，132-136(1999)定义。可进行视觉检查和序列分析以鉴定CDR边界(boundaries)。对于本发明，CDR序列通过使用Kabat系统和IMGT系统而定义；也就是说，当由该两个系统定义的CDRs没有完全重叠时，我们包括来自通过该两个系统所定义的序列的所有残基。
依据重链的同种型，人类免疫球蛋白可分为类(classes)及亚类(subclasses)。类包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其中重链分别为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)型。亚类包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，其中重链分别为γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2型。选择的类或亚类的人类免疫球蛋白分子可包含kappa(κ)或lambda(λ)轻链。参见例如Cellular and MolecularImmunology，Wonsiewicz，M.J.，Ed.，Chapter 45，pp.41-50，W.B.SaundersCo.，Philadelphia，PA 91991)；Nisonoff，A.，Introduction to MolecularImmunology，2nd Ed.，Chapter 4，pp.45-65，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1984)。
本文所用的术语“免疫球蛋白”和“抗体”，其可互换使用，表示整体抗体和抗原结合片段(即，“抗原结合部分”——除非另外指出，否则这两个术语在本文中可互换使用)。抗体的抗原结合片段可以是以，例如，单链抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、单链Fv分子(scFv)、双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09665)、双抗体、区域缺失抗体和单域抗体(dAbs)的形式。参见，例如，Nature Biotechnology 22(9)：1161-1165(2004)。包含VH和/或VL的抗原结合分子也在本发明之内。在VH的情况下，该分子还可包含一个或多个CH1、铰链(hinge)、CH2和CH3区。此种单链抗体也意在被包括在抗体的“抗原结合部分”该术语以内。
抗体部分或片段可通过酶催化裂解或通过重组技术而制备。例如，可使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解以分别产生Fab或F(ab’)2片段。也可使用在天然终止部位的上游已引入一个或多个终止密码子的抗体基因将抗体制备为各种截短形式。例如，可将编码F(ab’)2片段的重链的重组构建体设计为包含编码重链的CH1域和铰链区的DNA序列。优选的抗原结合片段对野生型人CD52具有结合特异性。
在另一方面，本发明提供一种本文所述的抗体或其部分的变体，其中该变体特异性地结合至人CD52，但以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代(例如，在CDR区、FR区、或恒定区中)而与参考抗体或其部分不同。例如，变体抗体在重链、重链可变区、轻链、或轻链可变区以至少90％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％与参考抗体相同。
多肽的序列相似性或一致性，其也称为序列一致性，通常使用序列分析软件来对其测定。蛋白分析软件使用分配为各种取代、缺失和其它修饰(包括保守型氨基酸取代)的相似性度量来匹配类似序列。举例而言，GCG包含诸如“Gap”及“Bestfit”的程序，其可以以预设参数使用，以确定紧密相关的多肽(例如来自不同生物体种类的同源多肽)之间或是野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG 6.1版。也可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)利用预设或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜寻序列之间最佳重叠区域的比对(alignment)和序列一致性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，另一种较佳的算法是计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，其使用预设参数。参见例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)；本文中将其引入作为参考。
根据本发明，可进行的一种类型的氨基酸取代是将抗体中的一个或多个半胱氨酸(其可为化学反应性的)变成另一种残基(例如，但不限于丙氨酸或丝氨酸)。在一个实施方式中，存在非经典(non-canonical)半胱氨酸的取代。取代可在抗体的可变区中的CDR或骨架区中，或在抗体的恒定域中进行。在一些实施方式中，半胱氨酸为经典的。可进行的另一种类型的氨基酸取代是将抗体中的潜在蛋白分解部位移除。此种部位可出现于抗体的可变区中的CDR或骨架区中或出现于抗体的恒定区中。半胱氨酸残基的取代和蛋白分解部位的移除会降低抗体产物中不均一性的风险，从而增加其均一性。另一种类型的氨基酸取代是通过改变残基的一个或其二者而消除天门冬酰胺-甘氨酸对，其形成潜在的去酰胺化部位。在本发明的另一方面，可使用叙述于例如PCT公开WO98/52976和WO00/34317中的技术将抗体去免疫化，以降低其免疫原性。
可在根据本发明的一个变型中进行的另一种类型的氨基酸取代为保守型氨基酸取代。“保守型氨基酸取代”是一种氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基的另一个氨基酸残基所取代的取代。一般而言，保守型氨基酸取代大体上不会改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守型取代而彼此不同的情况下，可向上调整序列一致性百分率或相似度，以修正取代的保守本质。进行此调整的方法是本领域内技术人员所公知的。参见，例如Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具有类似化学性质侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天门冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；6)酸性侧链：天门冬氨酸和谷氨酸；及7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守型氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天门冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守型置换是在于Science 256：1443-45(1992)(Gonnet等人)中所公开的PAM250对数似然矩阵(log-likelihood matrix)中具有正值的任何改变。“中度保守型”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合部分的氨基酸取代为以下那些：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)减少对氧化反应的敏感性，(3)改变对于形成蛋白复合物的结合亲和性，例如，以增强抗体的ADCC和CDC活性，(4)赋予或修饰此种类似物的其它物理化学或功能性质，但仍保留有对人CD52的特异性结合，(5)移除C端赖氨酸，以及(6)增加或移除糖基化部位。
在一方面，本发明提供一种新型和新颖多肽，其是本发明的抗体的重链或轻链，或者其是重链或轻链的含可变区的部分。此种多肽由于其可与相对(轻或重)抗体链配对以形成CD52-结合分子而是有用的。
人源化免疫球蛋白
本文所述的是包含新颖的鼠抗人CD52抗体的CDRs的人源化免疫球蛋白。在一个实施方式中，该人源化免疫球蛋白包含人源化轻链和人源化重链，其具有不同于抗CD52抗体的其它人源化类型(例如，Campath
Figure BDA0000130072490000601
)的氨基酸序列的CDR氨基酸序列。
本文所用的术语“人源化免疫球蛋白”表示一种免疫球蛋白，其包含含有非人类来源的抗CD52抗体(此处也称为供体抗体(例如，鼠的抗CD52抗体))的一个或多个轻链CDRs(CDR1、CDR2和CDR3)和一个或多个重链CDRs(CDR1、CDR2和CDR3)的链，以及至少一部分人类来源的免疫球蛋白(例如，来自人类来源的轻链和/或重链的骨架区，或骨架区与恒定区，例如具有或不具有骨架改变的CDR移植抗体)。本发明的人源化免疫球蛋白包含至少一个CDR，该CDR不同于Campath
Figure BDA0000130072490000602
中存在的至少一个CDR(例如，不同于相对应的CDR)。参见，例如，Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Cabilly等人，欧洲专利第0,125,023B1号；Boss等人，美国专利第4,816,397号；Boss等人，欧洲专利第0,120,694B1号；Neuberger，M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，欧洲专利第0,194,276B1号；Winter，美国专利第5,225,539号；Winter，欧洲专利第0,239,400B1号；Padlan，E.A.等人，欧洲专利申请第0,519,596 A1号。关于单链抗体，还可参见：Ladner等人，美国专利第4,946,778号；Huston，美国专利第5,476,786号；以及Bird，R.E.等人，Science，242：423-426(1988)。在一些实施方式中，人源化免疫球蛋白是一种去免疫化的抗体。参见，例如Carr等人，美国专利第7,264,806号，其关于已被修饰以减少潜在T细胞表位的数量的去免疫化免疫球蛋白，由此减少免疫球蛋白在对人施用时引发免疫反应的倾向。
在特定的实施方式中，该人源化免疫球蛋白包含一个或多个下列鼠单克隆抗体的一个或多个轻链CDRs和一个或多个重链CDRs：小鼠8G3.25.3.5、小鼠4G7.F3、小鼠9D9.A2、小鼠11C11.C5、小鼠3G7.E9、小鼠5F7.1.1.4、小鼠12G6.15.1.2、小鼠23E6.2.2.1、小鼠2C3.3.8.1、小鼠7F11.1.9.7、和小鼠4B10.1.2.4。
在另一实施方式中，该人源化免疫球蛋白以相似于或者优于Campath
Figure BDA0000130072490000603
的亲和性结合至人CD52。在一个特定的实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白具有本发明的鼠抗人CD52抗体的结合特异性(例如，具有对人CD52的特异性，具有相同或相似的表位特异性)，并且/或者其具有相同的抑制作用。人源化免疫球蛋白可具有本文所述的鼠抗人CD52抗体或人源化抗人CD52抗体的结合特异性和/或抑制活性，以及/或本文所述的鼠抗人CD52抗体或人源化抗人CD52抗体的表位特异性(例如，其可与鼠抗人CD52抗体竞争，或另一种人源化抗CD52抗体(例如，Campath
Figure BDA0000130072490000611
)竞争以结合至CD52，且/或其可具有鼠或人源化抗人CD52抗体的抑制作用)。在一个特定的实施方式中，人源化免疫球蛋白具有鼠抗体8G3、4G7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11、和4B10中任一个的结合特异性、表位特异性和/或抑制活性。
人类来源的人源化免疫球蛋白部分或免疫球蛋白链的部分(例如，骨架区；恒定区)可从任何合适的人免疫球蛋白或免疫球蛋白链获得。例如，在人源化或嵌合抗体中的人类恒定区或其部分可从人类κ或λ轻链基因获得，和/或从人类γ(例如，γ1、γ2、γ3、γ4)、μ、α(例如，α1、α2)、δ或ε重链基因获得，包括等位基因变体。特定的恒定区(例如，IgG1)，其变体或其部分可被选择以适合效应功能(effectorfunction)。例如，突变的恒定区(变体)可被引入免疫球蛋白或免疫球蛋白链中从而使得对Fc受体的结合和/或固定补体的能力最小化。(参见，例如，Winter等人，GB 2,209,757 B；Morrison等人，WO 89/07142；Morgan等人，WO 94/29351，December 22，1994)。在一个实施方式中，人类骨架区在其结构或序列中没有变异或突变。在一个特定的实施方式中，骨架区为一种其序列中不具有突变或变异的生殖系骨架序列。
本文所用的术语“生殖系”(germline)表示在抗体基因和基因片段经由生殖细胞从母代传至子代时抗体基因和基因片段的核苷酸序列和氨基酸序列。此生殖系序列与编码成熟B细胞中抗体的核苷酸序列不同，成熟B细胞中抗体的核苷酸序列在B细胞成熟期间已被重组和超突变事件改变。“利用”特定生殖系的抗体具有与该生殖系核苷酸序列或是与其指定的氨基酸序列最相配的核苷酸或氨基酸序列。与生殖系序列相比，此种抗体经常是突变的。
在其它实施方式中，人类骨架在其结构或序列上具有来自生殖系序列的最少变异或突变(例如，少于3、4、5、6、7、8、9、或10个受体骨架残基已被供体骨架残基取代，以改善结合亲和性，参见Queen等人，美国专利第5,530,101号)。在一个特定的实施方式中，人源化免疫球蛋白链的骨架中有限数量的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸)被选择为与供体序列中这些位置的氨基酸相同(即，“回复突变”)，而不是与受体序列相同，以增加包含人源化免疫球蛋白链的抗体对人类CD52的亲和力。
人类骨架区(例如，重链可变区和/或轻链可变区的)优选得自或衍生自与供体免疫球蛋白(鼠抗CD52抗体)的抗原结合区域的类似或相当区域(例如，重链可变区或轻链可变区)具有序列相似性的人类抗体可变区。人源化免疫球蛋白的人类来源部分的骨架区其它来源包括人类可变区一致性序列(参见例如，Kettleborough，C.A.等人，Protein Engineering 4：773-783(1991)；Carter等人WO 94/04679；Carter美国专利第6,407,213号))。例如，用于得到非人类部分的抗体供体序列的区域(例如，可变区的序列)可与人类序列相比较，如Kabat，E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government PrintingOffice(1991)中所述，以选择人源化免疫球蛋白的人类部分的特定来源，例如，骨架区来源。
在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白链的骨架区得自，或衍生自与非人类供体的可变区具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的总序列一致性的人类Ig可变区。在一个特定的实施方式中，人源化免疫球蛋白链的骨架区得自或衍生自与非人类供体免疫球蛋白可变区的骨架区具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的总序列一致性的人类可变区骨架区。
在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白的至少一个骨架区(FR)从人类来源抗体的一个或多个链获得或由其衍生。于是，FR可包含由人类来源的一个或多个抗体(例如，由人类免疫球蛋白链，由人类一致性序列)获得或衍生的FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4。
用于本发明的免疫球蛋白部分具有与它们的衍生来源免疫球蛋白或其变体相同或类似的序列。此种变体包含因一个或多个残基的加入、缺失或取代(例如，保守型取代)而不同的突变体，例如，通过一个或多个加入、缺失或取代而与亲本序列相差多至3、4、5、6、7、8、9、或10个残基。如上文所指出，本发明的人源化免疫球蛋白包含来自本文所述的一个或多个鼠抗CD52抗体(供体抗体)的一个或多个CDRs。可产生骨架区中的变化，例如用来自供体抗体相对应位置的残基来取代人类来源骨架区的残基的那些变化。可产生一个或多个突变，其包括骨架区中的一个或多个氨基酸的缺失、插入和取代。如果需要，可使用任何合适的方法(例如在WO 98/06248中所述，其整个教导并入本文做为参考)使人源化抗体或链中包含骨架突变，以及选择突变部位。
本领域的技术人员将会理解，在一些情况下，鼠抗CD52抗体的一个或多个CDRs侧面相接的残基可能起作用，在一些情况下，可能直接或间接地为功能(例如，结合)所需要。因此，在一些实施方式中，与鼠骨架的一个或多个CDRs侧面相接的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个侧翼氨基酸)也包含于人源化免疫球蛋白中。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的人类重链骨架区利用人类VH3-72或VH3-23生殖系序列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的人类轻链骨架区利用人类Vk2-A18b生殖系序列。可在这些FR区域中一个或多个残基处选择性地作出回复突变，如在下文工作实施例中所述，以改善人源化抗体的CD52结合亲和性。
“亲和性”是一种专业术语，其描述结合相互作用的强度，并且通常是指免疫球蛋白对人类CD52的结合整体强度。
在一个特定的实施方式中，免疫球蛋白具有测得EC50值为小于10μg/ml(例如，通过流式细胞术所确定)的结合活性。在另一实施方式中，免疫球蛋白具有测得EC50值小于5.0μg/ml，或小于1.0μg/ml(例如，通过流式细胞术所确定)的结合活性。
在一些实施方式中，免疫球蛋白以300nM至1pM(即，3x 10-7至1x 10-12M)，优选为50nM至1pM，更优选为5nM至1pM且最优选为1nM至1pM的亲和性(KD；KD＝Koff(kd)/Kon(ka))结合至人CD52，例如，1x 10-7M或更小、优选为1x 10-8M或更小、更优选为1x 10-9M或更小、有利地是1x 10-10M或更小且最优选为1x 10-11M或1x 10-12M或更小的KD；和/或5x 10-1s-1至1x 10-7s-1、优选为1x 10-2s-1至1x 10-6s-1、更优选为5x 10-3s-1至1x 10-5s-1的Koff速率常数，例如5x 10-1s-1或更小、优选为1x 10-2s-1或更小、有利地是1x 10-3s-1或更小、更优选为1x 10-4s-1或更小、更优选为1x 10-5s-1或更小，且最优选为1x 10-6s-1或更小，如通过表面等离子共振(surface plasmonresonance)所确定。
显然对于本领域的技术人员而言，可使用各种方法以确定根据本文所提供的和本领域内已知的方法所制备的免疫球蛋白具有必要的特异性(例如，结合特异性，表位特异性)。例如，对人CD52具有结合特异性的本发明的人源化抗CD52免疫球蛋白的结合功能可使用任何合适的方法检测，例如，监测人源化免疫球蛋白与人类CD52之间复合物的形成(例如，包含人类CD52的膜部分；携带人类CD52的细胞，例如人类T细胞、人类B细胞；包含并表达编码人类CD52的核酸的CHO细胞或重组宿主细胞；具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽)；包含人类CD52的实体支撑(support))的检定。
本发明的免疫球蛋白(例如，本发明的人源化免疫球蛋白)结合至与特定的鼠、嵌合或人源化单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，或是结合至与特定的鼠、嵌合、或人源化单克隆抗体所结合的人类CD52上的表位重叠的人类CD52上表位的能力，可使用本领域的技术人员所知的各种技术(包括，例如竞争性结合检定)而容易地确定。这些可能涉及使用该特定抗体的标记形式的使用，以及在本发明的免疫球蛋白存在和不存在的情况下对标记的抗体对于人CD52的结合的检测。
本文所用的“表位”包含能够特异性结合至免疫球蛋白的任何蛋白决定基。表位决定基一般由分子例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基(groupings)组成，并且一般具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象性的”。在线性表位中，在蛋白和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白的一级氨基酸序列线性地出现。在构象表位中，相互作用点跨越蛋白上彼此分开的氨基酸残基而出现。一旦确定了抗原上的期望表位，例如使用本发明所描述的技术，可以产生针对该表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生和特征化可说明关于期望表位的信息。由此信息，可以接着竞争性地筛选结合至相同表位的抗体。达到此目的的一个方法是，进行竞争性研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即，竞争结合至抗原的抗体。
在一个实施方式中，为确定测试抗体是否结合至本发明人源化抗体的相同或重叠表位，我们使得本发明的抗CD52抗体在饱和条件下结合至CD52，接着测定测试抗体结合至CD52的能力。如果测试抗体能够与参考抗CD52抗体在同时间结合至CD52，则测试抗体相对于参考抗CD52抗体结合至不同的表位。然而，如果测试抗体不能在同时间结合至CD52，则测试抗体结合至相同表位、重叠表位、或是紧邻由本发明抗CD52抗体所结合的表位的表位。此实验可使用ELISA、RIA、BIACORETM、或流式细胞术来进行。为测试抗CD52抗体是否与其它抗CD52抗体交叉竞争，我们可在两个方向使用上文所述的竞争方法，即，确定参考抗体是否阻碍测试抗体，以及反之。在某个实施方式中，实验使用BIACORETM进行。
表位分级(epitope binning)也可用于特征化本发明的抗体。术语“分级”是指基于抗体的抗原结合特征以将抗体分组的方法。一种基于其交叉竞争而“分级”抗体的高通量方法在国际专利申请第WO03/48731号中描述。可以通过允许未标记形式的抗CD52抗体“A”结合至对应于CD52序列的合成肽或CD52阳性细胞而对“表位分级”进行调查研究。接着加入标记的第二抗CD52抗体“B”，我们可评价相对于其中细胞或合成肽未预先暴露于抗CD52抗体“A”的对照样品的标记抗体量。或者，抗CD52抗体“A”和“B”均可标记有不同的荧光染料或能够检测的化学剂，我们可使用能够检测标记的设备来测定能够同时吸引CD52肽的两种标记抗体的量，或通过流式细胞术测定同时吸引CD52阳性细胞的两种抗体的量。Biacore和Octet技术使我们可以研究未标记形式抗体的竞争性结合。未标记抗体的这种利用是希望的，因为某些抗体的化学修饰可折中结合活性。还可参见，Jia等人，J Immunol Methods 288 91-98(2004)中所描述的技术，其在进行抗体分级中也有用。
本文还提供人源化免疫球蛋白的部分，例如轻链、重链以及轻和重链的部分。这些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通过还原和/或裂解)，或由编码具有期望性质(例如，结合人类CD52，序列相似性)的免疫球蛋白或其链的部分的核酸来制备或表达。它们可由，例如，相关部分的重新合成而制备。包含人类和非人类来源的期望部分(例如，抗原结合区、CDR、FR、C区)的人源化免疫球蛋白可使用合成和/或重组核酸来制备，以制得编码期望的人源化链的构建体(例如，cDNA)。例如，为制备一部分免疫球蛋白(例如，一部分链)，可在期望的位置引入一个或多个终止密码子。为人源化可变区编码的核酸(例如，DNA)序列可使用PCR突变诱发方法来构建，以改变现有的DNA序列(参见例如，Kamman，M.，等人，Nucl.Acids Res.17：5404(1989))。为新CDRs编码的PCR引物可杂交至先前人源化可变区的DNA模板，其基于相同的或非常相似的人类可变区(Sato，K.，等人，Cancer Research 53：851-856(1993))。如果没有相似的DNA序列用做模板，可由合成的寡核苷酸来构建包含编码可变区序列的序列的核酸(参见例如，Kolbinger，F.，Protein Engineering 8：971-980(1993))。编码信号肽的序列也可引入核酸(例如，在合成时，在插入载体时)。如果没有信号肽序列(例如，通常而言不存在)，可使用来自其它抗体的信号肽序列(参见例如，Kettleborough，C.A.，Protein Engineering4：773-783(1991))。使用这些方法、本文所述的方法或其它合适方法，变体可容易地被制造。
本发明涉及一种人源化免疫球蛋白，其对人类CD52具有结合特异性，且包含人源化轻链和人源化重链和/或其部分。在一个实施例中，人源化免疫球蛋白包含一种含有SEQ ID NO：3的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：16的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQID NO：17的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：5的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：18的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：6的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：19的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：7的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQID NO：20的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：8的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：9的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：22的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：10的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQID NO：23的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：11的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：24的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；一种含有SEQ ID NO：12的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：25的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；或一种含有SEQ ID NO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID NO：26的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链。
在一个实施例中，本发明的人源化免疫球蛋白包含重链(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，轻链(L)-CDR1、L-CDR2、和L-CDR3，其氨基酸序列：a)分别是SEQ ID NOs：51、59、69、29、36、和43；b)分别是SEQ ID NOs：50、60、69、29、37、和43；c)分别是SEQ ID NOs：50、61、68、29、38、和43；d)分别是SEQ ID NOs：50、61、69、29、36、和43；e)分别是SEQ ID NOs：50、62、69、29、39、和43；f)分别是SEQ ID NOs：52、61、70、30、40、和43；g)分别是SEQID NOs：53、63、71、31、36、和44；h)分别是SEQ ID NOs：54、64、71、31、36、和45；i)分别是SEQ ID NOs：55、63、72、31、36、和46；j)分别是SEQ ID NOs：56、65、73、32、41、和47；k)分别是SEQ ID NOs：56、65、294、32、41、和47，或1)分别是SEQID NOs：56、66、74、33、41、和48。
在另一实施例中，本发明的人源化免疫球蛋白包含H-CDR3和L-CDR3，其序列a)分别是SEQ ID NOs：69和43；b)分别是SEQ IDNOs：68和43；c)分别是SEQ ID NOs：70和43；d)分别是SEQ IDNOs：71和44；e)分别是SEQ ID NOs：71和45；f)分别是SEQ IDNOs：72和46；g)分别是SEQ ID NOs：73和47；h)分别是SEQ IDNOs：294和47；或i)分别是SEQ ID NOs：74和48。
在另一实施方式中，人源化免疫球蛋白对人类CD52具有结合特异性，且包含一种轻链，该轻链包含选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、和SEQ ID NO：48、或其组合的一个或多个CDRs；和一种重链，其包含选自SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74、和SEQ ID NO：294、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化免疫球蛋白不是Campath
Figure BDA0000130072490000681
在另一实施例中，对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包含一种轻链，该轻链包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)，和一种重链，该重链包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：137的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)，其中该人源化免疫球蛋白不是Campath
Figure BDA0000130072490000691
本发明还涉及一种本文所述的人源化免疫球蛋白的人源化免疫球蛋白轻链。在一个实施例中，该人源化免疫球蛋白轻链包含选自SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、和SEQ ID NO：48、和其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化免疫球蛋白轻链不是Campath
Figure BDA0000130072490000692
的轻链。例如，该人源化抗体具有L-CDR1、L-CDR2、和L-CDR3，其氨基酸序列：a)分别为SEQ IDNOs：29、36、和43；b)分别为SEQ ID NOs：29、37、和43；c)分别为SEQ ID NOs：29、38、和43；d)分别为SEQ ID NOs：29、36、和43；e)分别为SEQ ID NOs：29、39、和43；f)分别为SEQ ID NOs：30、40、和43；g)分别为SEQ ID NOs：31、36、和44；h)分别为SEQ ID NOs：31、36、和45；i)分别为SEQ ID NOs：31、36、和46；j)分别为SEQ ID NOs：32、41、和47；或k)分别为SEQ ID NOs：33、41、和48。
本发明还涉及一种人源化重链，其包含选自SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQID NO：74、和SEQ ID NO：294、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化免疫球蛋白重链不是Campath
Figure BDA0000130072490000693
的重链。例如，该人源化抗体具有H-CDR1、H-CDR2、和H-CDR3，其氨基酸序列：a)分别为SEQ ID NOs：51、59、和69；b)分别为SEQ ID NOs：50、60、和69；c)分别为SEQ ID NOs：50、61、和68；d)分别为SEQ ID NOs：50、61、和69；e)分别为SEQ ID NOs：50、62、和69；f)分别为SEQ IDNOs：52、61、和70；g)分别为SEQ ID NOs：53、63、和71；h)分别为SEQ ID NOs：54、64、和71；i)分别为SEQ ID NOs：55、63、和72；j)分别为SEQ ID NOs：56、65、和73；k)分别为SEQ ID NOs：56、65、和294；或1)分别为SEQ ID NOs：56、66、和74。
在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含一种轻链，其包含SEQ ID NOs：102、138、145-148、153-157、和164-168其中一个的可变区(VL)序列。在一个相关实施方式中，该人源化抗体包含一种轻链，其氨基酸序列包含SEQ ID NOs：273、275、278、280、和282其中之一或由其组成。
在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含一种重链，其包含SEQ ID NOs：103、136、137、139-144、149-152、和158-163其中一个的可变区(VH)序列。在一个相关实施方式中，该人源化抗体包含一种重链，其氨基酸序列包含SEQ ID NOs：272、274、276、277、279、和281其中一个或由其组成。
在一些实施方式中，本发明的人源化抗体包含VH和VL，其氨基酸序列包含或由下列组成
a)分别为SEQ ID NOs：103与102(4B10-H1/K1)；
b)分别为SEQ ID NOs：136与138(7F11-SFD1/K2)；
c)分别为SEQ ID NOs：137与138(7F11-SFD2/K2)；
d)分别为SEQ ID NO：139与SEQ ID NOs：145-148其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：139与146(2C3-SFD1/K11)；和分别为SEQID NOs：139与147(2C3-SFD1/K12))；
e)分别为SEQ ID NO：140与SEQ ID NOs：145-148其中一个；
f)分别为SEQ ID NO：141与SEQ ID NOs：145-148其中一个；
g)分别为SEQ ID NO：142与SEQ ID NOs：145-148其中一个；
h)分别为SEQ ID NO：143与SEQ ID NOs：145-148其中一个；
i)分别为SEQ ID NO：144与SEQ ID NOs：145-148其中一个；
j)分别为SEQ ID NO：149与SEQ ID NOs：153-157其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：149与155(12G6-SFD1/K11)；分别为SEQID NOs：149与156(12G6-SFD1/K12)；和分别为SEQ ID NOs：149与157(12G6-SFD1/K13))；
k)分别为SEQ ID NO：150与SEQ ID NOs：153-157其中一个；
l)分别为SEQ ID NO：151与SEQ ID NOs：153-157其中一个；
m)分别为SEQ ID NO：152与SEQ ID NOs：153-157其中一个；
n)分别为SEQ ID NO：158与SEQ ID NOs：164-168其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：158与165(9D9-H10/K12)；和分别为SEQID NOs：158与166(9D9-H10/K13))；
o)分别为SEQ ID NO：159与SEQ ID NOs：164-168其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：159与165(9D9-H11/K12)；和分别为SEQID NOs：159与166(9D9-H11/K13))；
p)分别为SEQ ID NO：160与SEQ ID NOs：164-168其中一个；
q)分别为SEQ ID NO：161与SEQ ID NOs：164-168其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：161与166(9D9-H16/K13))；
r)分别为SEQ ID NO：162与SEQ ID NOs：164-168其中一个；或
s)分别为SEQ ID NO：163与SEQ ID NOs：164-168其中一个(例如，分别为SEQ ID NOs：163与166(9D9-H18/K13))。
包含于括号的抗体在下列工作实施例中进一步叙述。
在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其氨基酸序列包含或由下列组成a)分别为SEQ ID NOs：273和272；b)分别为SEQ ID NOs：275和274；c)分别为SEQ ID NOs：278和276；d)分别为SEQ ID NOs：278和277；e)分别为SEQ ID NOs：280和279；或f)分别为SEQ ID NOs：282和281。
本发明还提供一种抗人CD52抗体(除了在现有技术中已知的那些(如果有))，其结合至与本文举例说明的抗体所结合的表位相同的表位，或与其竞争或交叉竞争。这些抗体可以是，例如，人源化的、嵌合的、或鼠抗体。例如，本发明提供一种抗人CD52抗体，其结合至与鼠抗体8G3、4F7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11和4B10以及这些鼠抗体的人源化和嵌合抗体的其中一个所结合的表位相同的表位，或与其中一个抗体竞争或交叉竞争。抗体结合至与参考抗体所结合的表位相同的表位的能力或与其竞争或交叉竞争的能力可如上文所述而确定。例如，我们发现由人源化抗体2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12所结合的CD52表位包含SEQ IDNO：104中的残基7、8、和11，且由人源化抗体9D9-H16/K13所结合的表位包含SEQ ID NO：104中的残基4和11。因此，在一些实施方式中，本发明提供一种抗CD52抗体，其结合至与那些人源化抗体所结合的表位相同的表位，或与其竞争或交叉竞争。
如果希望，例如，为诊断或检测目的(例如，成像以允许，比如治疗监测)，人源化免疫球蛋白(例如，其抗原结合片段)可包含可检测的标记。合适的可检测标记和人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段的标记方法为本领域所已知。合适的可检测标记包括，例如，放射性同位素(例如，铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子发射型标记(例如，氟-19)、顺磁离子(例如，钆(III)、锰(II))、表位标记(标签)、亲和性标记(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当未使用标记时，复合物形成(例如，在人源化免疫球蛋白和人类CD52之间)可通过表面等离子共振、ELISA、FACS、或其它合适方法来确定。
用于本发明的抗CD52抗体也可经由例如，化学反应或基因修饰而共轭至其它部分(moieties)(例如，聚乙二醇化部分)，上述部分改善抗体的药物动力学特性，例如半衰期。在一些实施方式中，用于本发明的抗CD52抗体可经由例如，化学共轭或基因修饰(例如，将框内细胞因子的编码序列附加至抗体编码序列，由此产生抗体：细胞因子融合蛋白)而连接至合适的细胞因子。
本发明还涉及一种免疫偶联，其中本发明的人源化免疫球蛋白(例如，其抗原结合片段)偶合至另一治疗剂，例如生物活性化合物(例如，细胞因子、超抗原、细胞毒性剂和毒素)。例如，对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白(例如，其抗原结合片段)可偶合至生物蛋白，植物或细菌来源的分子(或其衍生物)、白介素-2抗体或白喉毒素抗体。
小鼠单克隆免疫球蛋白
如本文所述，已制造出对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白。本发明的人源化和嵌合抗体可衍生自本发明的小鼠单克隆抗体。也就是说，在一些实施方式中，本发明的人源化和嵌合抗CD52抗体包含取自本发明小鼠单克隆抗体的序列，例如一个或多个CDR序列。本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白包含具有与已知的鼠抗CD52单克隆抗体的CDR氨基酸序列(例如，与CF1D12)不同的CDR氨基酸序列的轻链和重链。
本文所用的术语“小鼠单克隆免疫球蛋白”表示一种包含鼠抗人CD52抗体的轻链CDRs(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)和重链CDRs(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)以及鼠来源的骨架区和恒定区的免疫球蛋白。小鼠单克隆免疫球蛋白是一种例如通过使用杂交瘤技术或重组方法所制备的单一特异性的均质性(homogeneous)抗体。
本发明涉及一种本文所述的小鼠单克隆免疫球蛋白，其包含小鼠单克隆免疫球蛋白的抗原结合片段(即，部分)、小鼠单克隆免疫球蛋白的轻链、小鼠单克隆免疫球蛋白的重链、以及这些重链和轻链的片段。在一个特定的实施方式中，小鼠单克隆抗体是鼠8G3.25.3.5(也称为GENZ 8G3.25.3.5或8G3)、鼠GMA 4G7.F3(也称为4G7.F3或4G7)、鼠GMA 9D9.A2(也称为9D9.A2或9D9)、鼠GMA 11C11.C5(也称为11C11.C5或11C11)、鼠GMA3G7.E9(也称为3G7.E9或3G7)、鼠5F7.1.1.4(也称为GENZ 5F7.1.1.4或5F7)、鼠12G6.15.1.2(也称为GENZ 12G6.15.1.2或2G6)、鼠23E6.2.2.1(也称为GENZ 23E6.2.2.1或23E6)、鼠2C3.3.8.1(也称为GENZ 2C3.3.8.1或2C3)、鼠7F11.1.9.7(也称为GENZ 7F11.1.9.7或7F11)、或是鼠4B10.1.2.4(也称为GENZ4B10.1.2.4或4B10)。本发明涉及一种成熟小鼠单克隆免疫球蛋白，例如经过处理以移除重链和轻链信号肽之后的小鼠单克隆免疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及一种未成熟或前体蛋白，例如包含信号肽的小鼠免疫球蛋白轻链或小鼠免疫球蛋白重链。本发明还涉及一种编码这些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，载体)，涉及包含此种核酸的宿主细胞，并涉及这些未成熟和成熟蛋白的制造方法。
对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白的结合功能可使用任何合适方法检测，例如，使用监测小鼠单克隆免疫球蛋白与人类CD52(例如，包含人类CD52的膜部分，或携带人类CD52的细胞，例如人类T细胞、人类B细胞、包含编码人类CD52的核酸的CHO细胞或重组宿主细胞；具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽))之间复合物形成的检定。
本文还提供鼠免疫球蛋白的部分，其包含轻链、重链以及轻链和重链的部分。这些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通过还原和/或裂解)，或者编码具有期望性质(例如，结合人类CD52，序列相似性)的一部分免疫球蛋白或其链的核酸可被制备或表达。它们可通过，例如相关部分的重新合成所制备。包含鼠来源的期望部分(例如，抗原结合区域、CDR、FR、和/或C区)的小鼠单克隆免疫球蛋白可使用合成和/或重组的核酸来制备，以制得编码期望的单克隆免疫球蛋白链的构建体(例如，cDNA)。为制备一部分链，可在期望位置引入一个或多个终止密码子。也可将编码信号肽的序列引入核酸(例如，在合成时，在插入载体中时)。如果没有天然信号肽序列，可使用来自其它抗体的信号肽序列(参见例如，Kettleborough，C.A.，ProteinEngineering 4：773-783(1991))。使用这些方法、本文所述的方法或其它合适方法，可以很容易地制备出变体。
在一个实施方式中，本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：3的轻链和含有SEQ ID NO：16的重链；含有SEQ ID NO：4的轻链和含有SEQ ID NO：17的重链；含有SEQ ID NO：5的轻链和含有SEQ ID NO：18的重链；含有SEQ ID NO：6的轻链和含有SEQID NO：19的重链；含有SEQ ID NO：7的轻链和含有SEQ ID NO：20的重链；含有SEQ ID NO：8的轻链和含有SEQ ID NO：21的重链；含有SEQ ID NO：9的轻链和含有SEQ ID NO：22的重链；含有SEQID NO：10的轻链和含有SEQ ID NO：23的重链；含有SEQ ID NO：11的轻链和含有SEQ ID NO：24的重链；含有SEQ ID NO：12的轻链和含有SEQ ID NO：25的重链；或含有SEQ ID NO：13的轻链和含有SEQ ID NO：26的重链。
在另一实施方式中，本发明还涉及一种对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体，其包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13的轻链可变区；以及选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26的重链可变区。
如果希望，例如，为诊断或检定目的(例如，成像)，小鼠单克隆免疫球蛋白(例如，其抗原结合片段)可包含可检测标记。合适的可检测标记和小鼠单克隆免疫球蛋白的标记方法是本领域内所已知的。合适的可检测标记包括，例如，放射性同位素(例如，铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子放射型标记(例如，氟-19)、顺磁离子(例如，钆(III)、锰(II))、表位标记(标签)、亲和性标记(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当未使用标记时，复合物形成(例如，在小鼠单克隆免疫球蛋白和CD52之间)可通过表面等离子共振或其它合适的方法来确定。上述针对本发明的人源化抗体的所有合适方法和技术也可在本文中使用。
嵌合免疫球蛋白
如本文所叙述，已制造对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白。该嵌合免疫球蛋白包含嵌合轻链和/或嵌合重链，其氨基酸序列不同于对人类CD52具有结合特异性的已知嵌合抗体的氨基酸序列。
本文所用的术语“嵌合免疫球蛋白”是指一种重组蛋白，其包含含有衍生自一种物种的抗体的互补决定区(CDRs)的可变区，该抗体优选为鼠抗人CD52单克隆抗体，而抗体分子的恒定区衍生自不同物种的抗体，例如来自人类抗体。
本发明涉及本文所述的嵌合免疫球蛋白，其包含嵌合免疫球蛋白的抗原结合片段(即，部分)、嵌合免疫球蛋白的嵌合轻链和嵌合重链以及这些嵌合轻链和重链的片段。本发明涉及一种成熟嵌合免疫球蛋白，例如经过处理以移除重链和轻链信号肽之后的嵌合免疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及一种未成熟或前体蛋白质，例如包含信号肽的嵌合重链。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，载体)，涉及包含此种核酸的宿主细胞，并且涉及这些未成熟及成熟蛋白的制备方法。
对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白的结合功能可使用任何合适方法检测，例如使用监测嵌合免疫球蛋白与人类CD52(例如，包含人类CD52的膜部分，或在携带人类CD52的细胞上，例如人类T细胞、人类B细胞、包含编码人类CD52的核酸的CHO细胞或重组宿主细胞、具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽))之间复合物形成的检定。
本文还提供嵌合免疫球蛋白的部分，其包含轻链、重链以及轻链和重链的部分。这些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通过还原和/或裂解)，或者编码具有期望性质(例如，结合人类CD52，序列相似性)的一部分免疫球蛋白或其链的核酸可被制造或表达。它们可通过例如一部分的重新合成所制备。包含人类及非人类来源的期望部分(例如，抗原结合区、CDR、FR、和/或C区)的嵌合免疫球蛋白可使用合成和/或重组核酸来制备，以制得编码期望的嵌合链的构建体(例如，cDNA)。为制备一部分链，可在期望位置引入一个或多个终止密码子。也可将编码信号肽的序列引入核酸(例如，在合成时，在插入载体中时)。如果没有天然信号肽序列(例如，通常不存在)，可使用来自其它抗体的信号肽序列(参见例如，Kettleborough，C.A.，Protein Engineering 4：773-783(1991))。使用这些方法、本文所述的方法或其它合适方法，可以容易地制造出变体。
在一个实施方式中，本发明的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID NO：3的轻链可变区和SEQ ID NO：16的重链可变区；SEQ ID NO：4的轻链可变区和SEQ ID NO：17的重链可变区；SEQ ID NO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：18的重链可变区；SEQ ID NO：6的轻链可变区和SEQ ID NO：19的重链可变区；SEQ ID NO：7的轻链可变区和SEQID NO：20的重链可变区；SEQ ID NO：8的轻链可变区和SEQ ID NO：21的重链可变区；SEQ ID NO：9的轻链可变区和SEQ ID NO：22的重链可变区；SEQ ID NO：10的轻链可变区和SEQ ID NO：23的重链可变区；SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：24的重链可变区；SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：25的重链可变区；或是SEQ ID NO：13的轻链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。
本发明还涉及一种对人类CD52具有结合特异性的嵌合抗体，其包含选自以下部分的轻链可变区序列：SEQ ID NO：3的轻链可变区、SEQ ID NO：4的轻链可变区、SEQ ID NO：5的轻链可变区、SEQ IDNO：6的轻链可变区、SEQ ID NO：7的轻链可变区、SEQ ID NO：8的轻链可变区、SEQ ID NO：9的轻链可变区、SEQ ID NO：10的轻链可变区、SEQ ID NO：11的轻链可变区、SEQ ID NO：12的轻链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区，以及选自以下部分的重链可变区序列：SEQ ID NO：16的重链可变区、SEQ ID NO：17的重链可变区、SEQ ID NO：18的重链可变区、SEQ ID NO：19的重链可变区、SEQ IDNO：20的重链可变区、SEQ ID NO：21的重链可变区、SEQ ID NO：22的重链可变区、SEQ ID NO：23的重链可变区、SEQ ID NO：24的重链可变区、SEQ ID NO：25的重链可变区和SEQ ID NO：26的重链可变区。
本发明还涉及一种嵌合轻链，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13的可变区。
本发明还涉及一种嵌合重链，其包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的可变区。
如果希望，例如，为诊断或检定目的(例如，成像)，嵌合免疫球蛋白(例如，其抗原结合片段)可包含可检测的标记。合适的可检测标记和嵌合免疫球蛋白的标记方法是本领域内所已知的。合适的可检测标记包含，例如，放射性同位素(例如，铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子放射型标记(例如，氟-19)、顺磁离子(例如，钆(III)、锰(II))、表位标记(标签)、亲和性标记(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当未使用标记时，复合物形成(例如，在嵌合免疫球蛋白和人类CD52之间)可通过表面等离子共振或其它合适的方法而确定。上文针对本发明的人源化抗体所叙述的所有合适方法和技术可在本文中使用。
核酸和重组载体
本发明还涉及一种分离的和/或重组的(包含，例如，基本上纯的)核酸，其包含编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链、人源化重链、小鼠单克隆免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白轻链、小鼠免疫球蛋白重链、嵌合免疫球蛋白、嵌合轻链或嵌合重链的序列。
本文称为“分离”或“纯化”的核酸是已从其起源的基因组DNA或细胞RNA的核酸(例如，在它们存在于细胞中或存在于例如文库的核酸混合物中时)分离的核酸，并且包含通过本文所述的方法或其它合适方法所得到的核酸，包括大体上纯的核酸，通过化学合成、通过生物和化学方法的组合所制备的核酸，和分离的重组核酸(参见例如，Daugherty，B.L.等人，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；Lewis，A.P.and J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。
本文称为“重组”的核酸是通过重组DNA方法所制备的核酸，其包含通过依赖于人工重组方法的步骤而产生的那些核酸(例如聚合酶链反应(PCR)和/或使用限制性酶克隆至载体中)。“重组”核酸也为那些产生于在细胞自然机制过程中发生的重组事件，但在将设计的核酸引至细胞之后对其进行选择，以允许并使得期望的重组事件可发生。
本发明还更具体地涉及一种分离的和/或重组的核酸，其包含编码对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核苷酸序列(例如，本发明的人源化免疫球蛋白，其中非人类部分(例如，CDRs)衍生自鼠抗CD52单克隆抗体；本发明的小鼠免疫球蛋白；或本发明的嵌合免疫球蛋白，其中非人类部分(例如，VH和VL)衍生自鼠抗CD52单克隆抗体)或其(例如，其重链或轻链)部分(例如，抗原结合部分))。
本发明的核酸可用于制备对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、对人类CD52具有结合特异性的小鼠免疫球蛋白和对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白。例如，一种核酸(例如，DNA(例如cDNA)，或RNA)或一个或多个编码本发明的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核酸可引入合适的构建体(例如，重组载体)，以在合适的宿主细胞中进一步操作序列或制备所编码的免疫球蛋白。
本发明还提供适合用于表达对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、对人类CD52具有结合特异性的小鼠免疫球蛋白或对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白的构建体或载体(例如，表达载体)。多种载体为可得到的，其包括在宿主细胞中以单拷贝或多拷贝维持的载体，或整合至宿主细胞的染色体的载体。可将构建体或载体引入至合适的宿主细胞中，可制备出表达本发明的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的细胞并将其保持在培养物中。单个载体或多个载体可用于表达对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。
合适的表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体，也可包含数个组成部分，包括，但不限于下列的一种或多种：复制起点；选择性标记基因；一个或多个表达控制元件，例如转录控制元件(例如，启动子、增强子、终止子)、和/或一个或多个翻译信号；用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列。在一个构建体或载体中，信号肽序列可由构建体或载体或其它来源提供。例如，可使用免疫球蛋白的转录和/或翻译信号来指导表达。
可提供启动子用于在合适的宿主细胞中表达。启动子可以是组成型或是诱导型。例如，启动子可以可操作地连接至编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸，使得其指导所编码的多肽的表达。多种适合于原核生物宿主的启动子(例如，大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和多种适合于真核生物宿主的启动子(例如，酵母醇脱氢酶(ADH1)、SV40、CMV)是可得到的。本领域的技术人员能够选择适当的启动子以表达本发明的抗CD52抗体或其部分。
此外，载体(例如，表达载体)通常包含选择性标记，以选择携带载体的宿主细胞，并且在可复制载体的情况下，包含复制起点。编码赋予抗生素抗性或抗药性的产物的基因是通常的选择性标记并且可用于原核生物中(例如，β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、Tet基因(四环素抗性))和真核细胞中(例如，新霉素(neomycin)(G418或遗传霉素(geneticin))、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素、或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在多种宿主中的甲氨蝶呤选择。编码宿主的营养缺陷标记的基因产物的基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)常用作酵母菌中的选择性标记。还包含病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体、和能够整合至宿主细胞基因组的载体(例如反转录病毒载体)的使用。
因此，本发明涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链、人源化重链、小鼠免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白轻链、小鼠免疫球蛋白重链、嵌合免疫球蛋白、嵌合轻链或嵌合重链。本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码免疫球蛋白的抗原结合部分及其链。由本发明的核酸所编码的多肽序列在上文和以下工作实施例中描述。
在一些实施方式中，本发明的核酸和载体编码本发明的重链(或其抗原结合部分)或轻链(或其抗原结合部分)。可使用包含编码重链的核酸与编码轻链的核酸的宿主细胞以制备包含重链和轻链(或抗体的抗原结合部分)的抗体。可将编码重链的核酸与编码轻链的核酸置于单独的表达载体中。也可将它们置于单个表达载体，受相同或不同的表达控制。参见例如，Cabilly美国专利第6,331,415号；Fang美国专利第7,662,623号。
对人类CD52具有特异性的免疫球蛋白的制造方法
本发明的另一方面涉及一种本发明的抗人CD52抗体的制造方法。本发明的抗体可，例如通过在适合的宿主细胞中表达编码抗体的一个或多个重组核酸而制备。宿主细胞可使用任何合适的方法制造。例如，可将本文所叙述的表达构建体(例如，该一个或多个载体，例如，哺乳动物细胞表达载体)引入至合适的宿主细胞，并且可在适合构建体或载体表达的条件下维持所产生的细胞(例如，在培养物中，在动物中，在植物中)。合适的宿主细胞可以是原核生物的，包括细菌细胞例如大肠杆菌(例如，菌种DH5αTM(Invitrogen，Carlsbad，CA))，枯草杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核生物细胞，例如真菌或酵母菌细胞(例如，巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、曲霉菌(Aspergillussp.)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，或其它低级真核细胞，和高级真核细胞例如来自昆虫的那些细胞(例如，Drosophila Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞WO 94/26087(O’Connor)、TN5B1-4(HIGH 5)昆虫细胞(Invitrogen)，哺乳动物(例如，COS细胞，例如COS-1(ATCC Accession No.CRL-1650)和COS-7(ATCCAccession No.CRL-1651)、CHO(例如，ATCC Accession No.CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7)：4216-4220(1980))、293(ATCC Accession No.CRL-1573)、HeLa(ATCC Accession No.CCL-2)、CV1(ATCC Accession No.CCL-70)、WOP(Dailey，L.，等人，J.Virol.，54：739-749(1985))、3T3、293T(Pear，W.S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993))、NS0细胞、SP2/0细胞、HuT 78细胞和类似细胞))，或植物(例如，烟草、浮萍属(浮萍)(Lemna(duckweed))、和藻类)，(参见，例如，Ausubel，F.M.等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley &S ons Inc.(1993))。在一些实施方式中，该宿主细胞不是多细胞生物(例如，植物或动物)的一部分，例如，其是分离的宿主细胞或者是细胞培养物的一部分。
本发明还涉及包含本发明的核酸例如载体(例如，表达载体)的细胞。例如，可将编码人源化免疫球蛋白的重链和轻链、小鼠免疫球蛋白的重链和轻链、或嵌合免疫球蛋白的重链和轻链的核酸(即，一个或多个核酸)，或包含此种核酸的构建体(即，一个或多个构建体，例如，一个或多个载体)通过适合于所选择宿主细胞的方法(例如，转化、转染、电穿孔法、感染)引入至合适的宿主细胞中(其中所编码的免疫球蛋白对人类CD52具有结合特异性)，且核酸被或变为可操作地连接至一个或多个表达控制元件(例如，在载体中，在通过细胞中的处理所产生的构建体中，整合至宿主细胞基因组中)。可将宿主细胞维持在适合表达的条件下(例如，在诱导物、添加有适当盐类、生长因子、抗生素、营养补充物等的合适培养基的存在下)，由此制备所编码的多肽。如果希望，可将所编码的蛋白(例如，人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白)从，例如，宿主细胞、培养基、或乳液中分离。此方法包含在转基因动物或植物(例如，烟草)的宿主细胞(例如，乳腺细胞)中的表达(参见，例如，WO 92/03918)。
可制备融合蛋白，其中免疫球蛋白部分(例如，人源化免疫球蛋白；免疫球蛋白链)在N端位置、C端位置或融合蛋白内部连接至非免疫球蛋白部分(即，在自然界未发现存在于免疫球蛋白的部分)。例如，一些实施方式中，可通过将编码免疫球蛋白序列的核酸插入至合适的表达载体，例如pET载体(例如，pET-15b，Novagen)、噬菌体载体(例如，pCANTAB 5E，Pharmacia)、或其它载体(例如，pRIT2T蛋白A融合载体，Pharmacia)而制备。可将得到的构建体引入合适的宿主细胞中以表达。在表达时，可通过合适的亲和基质(affinity matrix)从细胞溶解产物分离或纯化一些融合蛋白(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.等人，Eds.，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8(1991))。
本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本文提供的免疫球蛋白(例如，本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链或人源化重链、小鼠免疫球蛋白、鼠轻链或鼠重链、嵌合免疫球蛋白、嵌合重链、或嵌合轻链)的重组核酸。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码免疫球蛋白的抗原结合部分或其链的重组核酸。在一些实施方式中，该宿主细胞包含本文所提及的本发明的重组载体(例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体)。
本发明还涉及一种本发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽链的制备方法。在一个实施方式中，该方法包括将本文所叙述的本发明的宿主细胞(例如，包含一个或多个编码免疫球蛋白或多肽链(例如，本发明的轻链和重链、仅轻链、或仅重链)的分离的核酸的宿主细胞)维持在适合免疫球蛋白或多肽链表达的条件下。例如，宿主细胞可培养于基质上或于悬浮液中。在一些实施方式中，该方法进一步包含纯化或分离免疫球蛋白或多肽链的步骤。
本发明还涉及一种通过噬菌体呈现法来制备免疫球蛋白的方法。例如，可淘选CD52抗原上的天然抗体噬菌体展示库。或者，可使用通过导向选择的免疫球蛋白制备方法(美国专利申请US 2006-0251658A1.)。可产生围绕例如已知的抗CD52抗体的固定重链(和/或轻链)CDR3区域建立的定制库(custom library)。重链和轻链的CDR1和CDR2区域可来源于天然集合(
Figure BDA0000130072490000831
repertoire)(Osburn等人，Methods，36：61-68(2005))。在一个实施方式中，抗CD52ScFvs可由ScFv天然抗体库产生，此抗体库用于获得具有期望的结合性质的鼠-人嵌合抗体。可对这些抗体库进行筛选以得到具有期望的结合性质的抗体。可使用ScFv噬菌体库。例如，如在Vaughan等人(1996)中所述，可基本上依循一系列的重组人类CD52上的重复选择循环而从scFv引导选择库分离出识别人类CD52的ScFvs。简而言之，在与抗体库培养之后，预先偶合至顺磁珠的固定化抗原，以及结合的噬菌体可通过磁分离而回收，而未结合的噬菌体则被冲掉。接着可将结合的噬菌体挽回，如在Vaughan等人(1996)中所述，并重复选择过程。
在一个特定的实施方式中，文库构建为，由以单链形式融合至天然人类轻链可变区集合的鼠抗CD52抗体的整个重链可变区所组成。在选择之后，鉴定出互补于小鼠重链可变区的人类轻链可变区池(pool)。接着构建文库，该文库由以上选择的人类轻链可变区集合所组成，该人类轻链可变区集合以单链形式融合至由天然人类CDR1和CDR2区域以及来自鼠抗CD52抗体重链可变区的固定CDR3区域所组成的嵌合重链可变区。在选择CD52结合物之后，选择最佳结合克隆。6个CDR区域中的五个可以是人类来源，而重链可变区的CDR-3可以与小鼠重链可变区的原先CDR3相同。
根据制造商建议，可使用偶合至DYNABEADS M-270胺(Dynal)的CD52进行选择。或者，使用生物素化CD52的选择可使用一级胺特定试剂琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基)己酸酯(succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate)依循制造商说明书(EZ linkNHS LC Biotin，Pierce)而制备。
来自选择的输出可基于竞争检定在高通量筛选中以细胞周质制备品进行测试，此竞争检定测量存在于细胞周质制备品中的scFvs竞争结合至CD52的能力。
可将能够在高通量筛选中竞争的样品进行DNA测序，如在Vaughan等人(1996)及Osburn等人(1996)所叙述。克隆接着将会被表达和纯化为scFvs或IgGs，并评估其结合CD52、中和CD52或其组合的能力，例如，使用检定如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检定和补体依赖性细胞毒性(CDC)检定。经纯化的scFv制备品可接着如WO 01/66754的实例3中所述来制备。纯化scFv制备品的蛋白浓度使用BCA方法(Pierce)来测定。可使用类似方法以筛选固定免疫球蛋白重链或轻链(或VH或VL)的最佳配对者(相对链)。
在一个特定的实施方式中，本发明涉及一种分泌对人类CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤的制造方法，其包括将CD52转基因小鼠的淋巴细胞施用至具有与人类CD52转基因小鼠相同的品系(例如，CD1)的非转基因小鼠，由此产生免疫型非转基因小鼠。该免疫型非转基因小鼠的脾细胞与永生细胞接触，由此产生融合细胞，并将该融合细胞维持在产生分泌对人类CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤的条件下，由此产生分泌对人类CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤。
包含毒素部分或毒素的免疫球蛋白
本发明还涉及包含毒素部分或毒素的免疫球蛋白。合适的毒素部分包含毒素(例如，表面活性毒素，细胞毒素)。毒素部分或毒素可使用任何合适的方法连接或结合至免疫球蛋白。例如，毒素部分或毒素可直接或经由合适的连接体(linker)共价地结合至免疫球蛋白。合适的连接体可包含不可裂解或可裂解的连接体，例如，pH可裂解的连接体或包含细胞酶(例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶例如组织蛋白酶B)裂解部位的连接体。此种可裂解连接体可用于制备在免疫球蛋白内化后能释出毒素部分或毒素的免疫球蛋白。
可使用多种方法以将毒素部分或毒素连接或结合至免疫球蛋白。所选择的特定方法将取决于毒素部分或毒素以及所要连接或结合的免疫球蛋白。如果需要，可使用包含末端官能团的连接体来连接免疫球蛋白与毒素部分或毒素。一般，结合是通过将包含反应官能团(或被修饰以包含反应官能团)的毒素部分或毒素与连接体或是直接与免疫球蛋白反应而完成。共价键通过使包含(或被修饰以包含)化学部分或官能团(其在适当的条件下可与第二化学基团反应由此形成共价键)反应而形成。如果需要，可使用任何合适的方法将适当的反应化学基团加至免疫球蛋白或至连接体。(参见，例如，Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996).)。许多合适的反应化学基团组合为本领域内所已知，例如胺基可与亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、及其类似物反应。硫醇可与马来酰亚胺、碘乙酰(iodoacetyl)、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫代-2-硝基苯甲酸硫醇(5-thiol-2-nitrobenzoic acid thio)(TNB-硫醇)、及其类似物反应。醛官能团可偶合至含胺或含酰肼分子，且叠氮基可与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。向分子中引入活化基团的合适方法为本领域内所已知(参见例如，Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。
合适毒素部分和毒素包括，例如，类美坦素(maytansinoid)(例如，美登素醇(maytansinol)，例如，DM1，DM4)、紫杉烷、加利车霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、或其衍生物。类美坦素可以为，例如，美登素醇或美登素醇类似物。美登素醇类似物的实例包含具有经修饰的芳香环(例如，C-19-去氯基(decloro)、C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基)的那些和在其它位置具有修饰(例如，C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-去甲基、4，5-脱氧基)的那些。美登素醇和美登素醇类似物叙述于，例如，美国专利第5,208,020号和第6,333,410号中，其内容并入本文做为参考。美登素醇可使用，例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(也已知为N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸酯(或SPP))、4-琥珀酰亚胺基-氧代羰基-a-(2-吡啶二硫基)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SDPB)、2亚氨基硫烷(2 iminothiolane)、或S-乙酰基丁二酸酐而偶合至抗体或抗体片段。紫杉烷可以是，例如，紫杉醇、泰索帝(taxotere)、或新颖紫杉烷(参见，例如，WO 01/38318)。加利车霉素可以是，例如，一种溴-复合加利车霉素(例如，α、β、或γ溴-复合)、一种碘-复合加利车霉素(例如，α、β、或γ碘-复合)，或是其类似物和模拟物。溴-复合加利车霉素包含I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR和K1-BR。碘-复合加利车霉素包含I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。加利车霉素及其变体、类似物、模拟物在，例如美国专利第4,970,198；5,264,586；5,550,246；5,712,374、和5,714,586号中描述，其各自内容均并入本文做为参考。倍癌霉素类似物(例如，KW-2189、DC88、DC89 CBI-TMI、及其衍生物)在，例如美国专利第5,070,092号、美国专利第5,187,186号、美国专利第5,641,780号、美国专利第5,641,780号、美国专利第4,923,990号、和美国专利第5,101,038号中描述，其各自内容均并入本文做为参考。
其它毒素的实例包含，但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))，烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、thioepa苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专利第5,475,092、5,585,499、5,846,545号)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、和顺式-二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(先前为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(先前为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素、丝裂霉素、嘌呤霉素氨茴霉素(puromycinanthramycin)(AMC))、倍癌霉素及其类似物或衍生物，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、紫杉醇、auristatins(例如，auristatin E)和类美坦素，及其类似物或同系物)。
毒素也可以是表面活性毒素，例如是自由基产生者(例如，含硒毒素部分)的毒素，或是含放射性核素部分的毒素。合适的含放射性核素部分包括，例如包含放射性碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)、或镓(67Ga)的部分。
毒素可以是来自细菌来源的蛋白、多肽或肽，例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)和植物蛋白，例如，蓖麻毒素A链(RTA)、核糖体失活蛋白(RIPs)白树毒素(gelonin)、商陆抗病毒蛋白、肥皂草素(saporin)、和dodecandron，考虑用作毒素。
设计以结合、使失去作用、促进负责产生特定的靶蛋白的mRNA的降解或是防止其生成的核酸反义化合物也可用作毒素。反义化合物包含单或双链的反义RNA或DNA、寡核苷酸、或是其类似物，其可特定地杂交至单独的mRNA种类，并防止该mRNA种类的转录和/或RNA加工和/或编码的多肽的翻译，由此造成各编码多肽的量减少。Ching，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder，等人，Ann.Int.Med.113：604-618(1990)；Loreau，等人.，FEBSLetters 274：53-56(1990)。有用的反义疗法包括例如：Veglin TM(VasGene)和OGX-011(Oncogenix)。
毒素也可以是一种光活性剂。合适的光活性剂包括卟啉类物质，例如卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、血卟啉衍生物本身、酞菁、初卟啉(etiopurpurins)、替沙林(texaphrin)、及其类似物。
毒素可以是一种结合细胞内目标的抗体或抗体片段。此种抗体或抗体片段可指向指定的亚细胞区室或目标。例如，抗体或抗体片段可结合一种细胞内目标，其选自erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、半胱天冬氨酸酶3、半胱天冬氨酸酶7、Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV型胶原酶、组织蛋白酶L以及其它叙述于Kontermann，R.E.，Methods，34：163-170(2004)中(其全文内容并入本文做为参考)的细胞内目标。
治疗方法和组合物
本发明的抗体有用于免疫抑制和免疫消融。抗体靶向CD52表达细胞(例如，T和B细胞)并减少(或如本文所用的“消减”)需要的受试者中它们的数量。淋巴细胞消减可用于治疗多种疾病和症状，例如发炎、自体免疫疾病和癌症(例如，淋巴细胞(B或T细胞)恶性肿瘤)。参见，例如，Reiff，A.，Hematology，10(2)：79-93(2005)。可使用本发明的抗体或抗原结合部分治疗的疾病和症状的实例包括但不限于，多发性硬化症、狼疮、类风湿性关节炎、移植体抗宿主疾病(GVHD)、炎性肠道疾病、血管炎、贝西氏病、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、修格兰氏症候群(Sjogren′s syndrome)、葡萄膜炎、干癣、硬皮病、多肌炎、I型(自体免疫类)糖尿病、自体免疫细胞减少症(例如，自体免疫嗜中性粒细胞减少症、输血依赖性难治型PRCA、白血病和淋巴瘤例如具有巨大肿瘤的非何杰金氏淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病。
据此，本发明的方面为通过对需要的受试者(例如，具有自体免疫疾病、血癌的病人，或是将要接受移植的病人)施用有效量的本发明的抗体，用于淋巴细胞消减的方法和用于治疗发炎、自体免疫疾病或癌症的方法。还可预防性地施用该抗体以防止发炎开始或是自体免疫疾病或癌症的复发。例如，可施用本发明的抗体作为调理疗法的一部分，以使病人准备进行移植(例如，干细胞移植、同种异体T细胞自体移植输注、或实体器官移植)。
本发明的一些抗CD52抗体优选靶向某些CD52+细胞群。一个可能的解释是，这些抗体所结合的表位包含CD52蛋白上的一个或多个碳水化合物基团，并且此种碳水化合物基团在一种细胞类型所表达的CD52上比在另一种类型所表达的CD52上更为普遍。例如，我们已经发现，相对于B细胞，抗体7F11、5F7、3G7、和11C11以更大的程度消减T细胞。因此，这些抗体的人源化和嵌合形式可用于治疗T细胞恶性肿瘤，且免疫抑制副作用比较温和。
因为本发明的抗体靶向CD52表达细胞，抗体也可用于消减T细胞和B细胞以外的CD52+细胞类型。例如，研究已显示，血管白细胞(VLC)和Tie2+单核细胞-表达高水平CD52的髓样细胞-促进肿瘤血管新生并且有助于针对抗VEGF疗法的肿瘤抗性。Pulaski等人，J.Translational Med.7：49(2009)。本发明的抗CD52抗体由此可通过靶向VLC和Tie2+单核细胞而用于抑制肿瘤血管新生。为此目的，抗CD52抗体可系统地或局部地在新血管形成部位，例如肿瘤部位给药。抗CD52抗体治疗可与标准癌症治疗例如化疗、手术、或放射共同使用，或与另一种靶向治疗例如抗VEGF抗体治疗共同使用。抗CD52抗体治疗可用于治疗，例如，乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、和任何其它抗VEGF抗体的症状。抗CD52抗体治疗也可用于其它新血管形成病症，包括非肿瘤血管新生症状。
本发明的抗体可单独施用至个体(例如，人类)或与另一种制剂(例如，免疫抑制剂)在联合治疗中共同施用。该抗体可在施用额外的制剂之前，一起或之后施用。在一些实施方式中，额外的制剂为，例如，消炎化合物例如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，另一种非类固醇消炎化合物，或类固醇消炎化合物。在一些实施方式中，该额外制剂为另一种淋巴消减抗体，例如另一种抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗BAFF抗体、抗BAFF-R抗体、和类似物。在一些实施方式中，该额外制剂为，例如，细胞因子(例如，IL-7)、抗细胞因子受体抗体，或可溶性受体，其扭转、操作、和/或加强在抗CD52抗体所介导的淋巴细胞消减之后发生的重建过程(参见，例如，Sportes等人，CytokineTherapies：Ann.N.Y.Acad.Sci.1182：28-38(2009))。在另一实施方式中，合成肽模拟物可与本发明的免疫球蛋白共同给药。
研究已显示，阿仑单抗引起的淋巴细胞消减由嗜中性粒细胞和NK细胞所介导(Hu等人，Immunology 128：260-270(2009)。因此，在联合治疗的实施方式中，可在抗CD52抗体疗法之前、期间或之后对病人施用刺激嗜中性粒细胞和NK细胞的制剂，以增强抗体治疗。刺激嗜中性粒细胞和/或NK细胞包括，但不限于，(1)增加其分裂速率，(2)增加对应于抗CD52抗体的同种型的Fc受体(例如，FcγRIIIa和FcγRIIIb、FcγRII、FcγRI、和FcαRI)的细胞表面表达，(3)调动并增加循环细胞的数量，(4)募集细胞至靶部位(例如，肿瘤、发炎、或组织损伤部位)，(5)以及增加其细胞毒性活性。刺激嗜中性粒细胞和/或NK细胞的制剂的实例包括，例如，粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，LEUKINE
Figure BDA0000130072490000891
或沙格司亭(sargramostim)和莫拉司亭(molgramostim))；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(例如，NEUPOGEN
Figure BDA0000130072490000892
或非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭、和来格司亭(lenograstim))；干扰素-γ(例如，ACTIMMUNE
Figure BDA0000130072490000893
)；CXC趋化因子受体4(CXCR4)拮抗剂(例如，MOZOBILTM或普乐沙福(plerixafor))；和CXC趋化因子受体2(CXCR2)拮抗剂。可定期监测病人的嗜中性粒细胞数以确保最佳的治疗效果。也可在抗CD52抗体治疗开始之前测量病人的嗜中性粒细胞数。可基于病人的嗜中性粒细胞数调整刺激物的量。如果病人的嗜中性粒细胞数较正常者较低，则可使用较高剂量的刺激物。在嗜中性粒细胞减少症(其可由使用抗CD52抗体治疗而引起)期间，也可使用较高剂量的嗜中性粒细胞刺激物以最大化抗CD52抗体的效果。
因为嗜中性粒细胞和/或NK刺激改善抗CD52抗体治疗的效力，联合治疗的此实施方式使得我们可对病人使用较少的抗体并维持相似的治疗效果。使用较少的抗CD52抗体同时维持治疗效果可帮助减少抗CD52抗体的副作用，其包括病人对施用的抗体的免疫反应以及二次自体免疫(在抗CD52抗体治疗期间或之后出现的自体免疫)的发展。联合治疗的此实施方式也可用于肿瘤环境，例如，在病人具有嗜中性粒细胞减少症时。
在联合治疗的另一实施方式中，我们可使用调节T细胞的刺激物来增强抗CD52抗体治疗。我们的数据显示，相较于其它CD4+T细胞，抗CD52抗体以更低的程度消减CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞。调节T细胞(也已知为“Treg”或抑制T细胞)是一种能够通过接触依赖性或接触非依赖性(例如，细胞因子产生)机制抑制其它淋巴细胞的增殖和/或功能的细胞。已叙述数种类型的调节T细胞，包括γδT细胞、自然杀手T(NKT)细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、和双阴性CD4-CD8-T细胞。参见，例如，Bach等人，Immunol.3：189-98(2003)。CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞曾称为“自然发生”调节T细胞；它们表达CD4、CD25和叉头(Forkhead)家族转录因子FoxP3(叉头盒p3)。因此，在联合治疗的此实施方式中，我们可在抗CD52抗体治疗之前、期间或之后施用刺激CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞的制剂，以在淋巴细胞消减之后扭转免疫系统的组成。制剂可，例如，活化那些T细胞，稳定和/或扩充细胞群，移动和增加细胞循环，和/或募集细胞至靶部位。此种制剂的实例为雷帕霉素、活性或潜伏性TGF-β(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、和TGF-β5)、IL-10、IL-4、IFN-α、维生素D3、地塞米松(dexamethasone)、和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)(参见，例如，Barrat等人，J.Exp.Med.195：603-616(2002)；Gregori等人，J Immunol.167：1945-1953(2001)；Battaglia等人，Blood 105：4743-4748(2005)；Battaglia等人，J.Immunol.177：8338-8347(2006))。
在本发明中，治疗疾病的抗CD52抗体的有效量为帮助治疗的受试者达到一个或多个期望临床终点的量。例如，对于狼疮(其表现包括系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肤红斑狼疮、CNS狼疮、心血管表现、肺表现、肝表现、血液表现、胃肠表现、肌肉骨骼表现、新生儿红斑狼疮、儿童全身性红斑狼疮、药物诱发性红斑狼疮、抗磷脂症候群、和引起狼疮症状的补体缺乏症候群；参见，例如，Robert G.Lahita，Editor，Systemic Lupus Erythematosus，4th Ed.，Elsevier Academic Press，2004)，临床终点可通过监测受影响的器官系统(例如，狼疮性肾炎的血尿及/或蛋白尿)和/或使用提供数个器官系统间的疾病严重性的综合分数的疾病活动指数(例如，BILAG、SLAM、SLEDAI、ECLAM)来测定。参见，例如，Mandl等人，“Monitoring patients with systemiclupus erythematosus”in Systemic Lupus Erythematosus，4th edition，pp.619-631，R.G.Lahita，Editor，Elsevier Academic Press，(2004)。
在自体免疫疾病、多发性硬化症(其包含复发缓解型、二次进展型、原发进展型、和进展复发型多发性硬化症((Lublin等人，Neurology46(4)，907-11(1996))的另一实施例中，诊断是通过，例如在检测例如核磁共振成像(MRI)、脊髓穿刺、诱发电位检测、和血液样品实验室分析的协助下通过征状史和神经检查而作出的。在MS中，治疗目标是降低复发的频率和严重性、预防因疾病进展而产生的障碍、和促进组织修复(Compston and Coles，2008)。因此，帮助达到与该目标一致的临床终点的抗CD52抗体量是用于治疗的抗体的有效量。
为了使免疫原性降至最低，优选通过本发明的治疗方法和组合物使用人源化抗体来治疗患者。在不需要重复给药的情况下，对患者施用本发明的鼠：人类嵌合抗体也是合适的。
可使用本发明的抗体来治疗先前已经用Campath-1H
Figure BDA0000130072490000911
治疗并且已经形成Campath-1H
Figure BDA0000130072490000912
的中和抗体的个体(例如，Campath-1H-难治疗的个体)。例如，人们可以治疗患有自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)和/或癌症(例如，白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病)、淋巴癌(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、先前已用Campath-1H治疗(例如，使用一个或多个Campath-1H
Figure BDA0000130072490000915
治疗疗程)和已经形成Campath-1H
Figure BDA0000130072490000916
中和抗体的个体，其中中和抗体会降低进一步的Campath-1H
Figure BDA0000130072490000917
治疗效力。我们已经显示，本发明的人源化抗体(例如，人源化2C3、12G6和9D9)尽管在阿仑单抗的中和抗体的存在下也可结合至人类CD52。在另一个实施方式中，人们可以用本文所述的特定的人源化抗体与一种本文所述的其它人源化抗体来治疗已经变得难以治疗的个体。
本发明的抗体可以以单一的单位剂量或多剂量在健康照顾提供者认为合适的任何时间点给药。剂量可通过本领域内已知的方法所决定，并可依据，例如个体年龄、敏感性、耐受度和整体健康情况而定。可使用各种给药路径，其包括，但不限于，肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、腹膜内、皮下注射)、口服(例如，饮食)、局部(locally)、表面(topical)、吸入(例如，支气管内、鼻内或口部吸入、鼻内滴剂)、或直肠，依据要治疗的疾病或病症而定。肠胃外给药可以是一种优选的给药模式。
在一个实施方式中，使用与Campath-1H
Figure BDA0000130072490000921
相同的给药方案对患者施用本发明的抗体(例如，针对慢性淋巴细胞白血病的Campath-1H
Figure BDA0000130072490000922
给药方案)。在另一个实施方式中，以一种方案对患有自体免疫疾病(例如，多发性硬化症(MS))的患者施用本发明的抗体，其中该方案包括第一周期的抗体给药，接着至少再一个抗体周期，其中各个治疗周期包括连续数天应用1-5个剂量，并且其中各个治疗周期与下一个周期分隔至少1-24个月(例如，12个月)。例如，在一个实施方式中，通过包括5个每日剂量抗体的第一周期抗体接着至少再一抗体治疗周期(其中该治疗在第一周期之后12个月发生，并且治疗包括连续数天施用的3个剂量的抗体)来治疗患有多发性硬化症的患者。在另一个实施方式中，患有MS的病人仅再治疗一次，已经观察到重新开始的(renewed)MS活动性的迹象(参见，例如WO 2008/031626，其教导整体地并入本文以作参考)。在一些实施方式中，如果患有更晚期形式的MS或更恶化形式的其它自体免疫疾病(例如血管炎；参见，例如，Walsh等人，Ann Rheum Dis 67 1322-1327(2008))的患者早在他们最后的疗程之后经历复发，可能需要进行更频繁的治疗疗程(例如，每四个月、每六个月)。可根据治疗临床医生的职业判断，使用这样的临床医生可获得的任何方法确定重新开始的MS活动性的迹象。对于临床医生，目前有多种技术来诊断重新开始的MS活动性，包括但不限于，通过临床方法(神经性障碍的复发或恶化)或通过大脑或脊髓的核磁共振成像(MRI)。如医学从业者所公知，通过MRI检测的疾病活动性可通过T1(加强或非加强的)或T2加权成像上新的脑或脊椎病变的出现，或通过这样的病变的体积增长而显示出。因为MS的诊断方法在不断发展，预期未来可能有另外的方法将检测到重新开始的MS活动性(例如，磁化传递率或MR-光谱)。用于检测重新开始的MS活动性的特定诊断方法不是对主张权利的本发明的限制。在某些实施方式中，为了确定任何给定患者是否需要再治疗和对该患者再治疗的最佳时间点，在治疗周期之后以固定的间隔重复进行MRIs。通常而言，在疾病临床地再次显现之前进行再治疗是有利的。
制剂可依据所选择的给药途径而不同(例如，溶液、乳液)。包含将施用的抗体的适当组合物可以生理上可接受的媒介物或载体而制备。组合物可包括多剂量或者可以是单一单位剂量的组合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括，例如，水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包含盐水或缓冲介质。肠胃外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)、葡萄糖与氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油(fixed oil)。静脉内媒介物可包括各种添加剂、防腐剂、或流体、营养或电解质补充剂(参见，通常而言，Remington′s PharmaceuticalSciences，17th Edition，Mack Publishing Co.，PA，1985)。对于吸入，化合物可以是溶解的或是装载至合适的给药用分配器(例如，雾化器(atomizer)、气雾器(nebulizer)或压力气雾剂分配器)。
诊断方法和组合物
本发明的免疫球蛋白也可用于研究和诊断应用的多种方法。例如，它们可用于检测、分离、和/或纯化人类CD52或其变体(例如，通过悬浮液中亲合纯化或其它合适方法例如流式细胞术，例如，用于细胞，例如淋巴细胞)，和研究人类CD52结构(例如，构象)和功能。对于体外应用，其中抗体的免疫原性不是考虑的重点，除了人源化抗体，本发明的鼠抗体和嵌合抗体将是有用的。
本发明的免疫球蛋白可用于诊断应用(例如，体外、先体外后体内)。例如，可使用本发明的人源化免疫球蛋白来检测和/或测量样品中(例如，在组织或体液(比如带有人类CD52的发炎渗出物、血液、血清、肠液、组织)中表达人类CD52的细胞上)人类CD52的水平。样品(例如，组织和/或体液)可从个体获得，且本文所述的免疫球蛋白可以以合适的免疫学方法使用以检测和/或测量人类CD52表达，包括方法比如流式细胞术(例如，用于悬浮液中的细胞，例如淋巴细胞)，酶联免疫吸附检定(ELISA)，包括化学发光检定、放射免疫检定、和免疫组织学方法。
在一个实施方式中，提供一种检测样品中人类CD52的方法，其包含在适合免疫球蛋白对人类CD52特异性结合的条件下将样品与本发明的免疫球蛋白接触并检测所形成的抗体-CD52复合物。在应用该方法时，本文所述的免疫球蛋白可用于分析正常组织相对于发炎组织(例如，来自人类)的人类CD52反应性和/或表达(例如，免疫组织学地)，以检测例如，炎性肠道疾病(IBD)、自体免疫疾病(例如多发性硬化症和狼疮)、癌症(例如非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病)、或其它症状与增加的人类CD52表达(例如，在受感染的组织中)之间的关联。因此，本发明的免疫球蛋白允许在正常组织和发炎组织中进行评估人类CD52的存在的免疫方法，通过该方法可评估疾病存在、疾病进程和/或抗人CD52治疗在疾病(例如，发炎性疾病)治疗中的效用。
此外，在通过消减性抗CD52治疗抗体的治疗之后，可使用免疫球蛋白来检查组织，以估计该消减多有效以及以确定CD52表达是否有任何的下调(Rawstrom等人.，Br.J.Heam.，107：148-153(1999))。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员所普遍理解的意义相同的意义。示例方法和物质在下文中叙述，尽管与本文所述的方法和物质相似或等同的方法和物质也可用于本发明的实践或测试中。本文所提及的所有出版物和其它参考文献整体地并入本文做为参考。在冲突情况下，本说明书包括定义为优先。虽然本文引用数个文件，此引用并不构成以下认可：任何这些文件构成为本领域内公知常识的一部分。本说明书和权利要求通篇中，词语“包含(comprise)”或变形例如“包含(comprises、comprising)”将被理解为包含所述整体或整体组但不排除任何其它整体或整体组。材料、方法、和实施例仅仅是说明性的而不意在限制。
示例
实施例1：鼠抗人CD52抗体的产生
下列工作实施例中的鼠抗人CD52抗体通过使用来自CD1背景的人类CD52转基因小鼠的脾细胞免疫CD1株小鼠而产生(图1A)，其中转基因小鼠的鼠B细胞和T细胞表面上的人类CD52呈现通过流式细胞术而证实。因为转基因小鼠具有与免疫小鼠相同的背景(CD1)，来自转基因小鼠的脾细胞在细胞表面上以天然形式呈现人类CD52为独特的、非己抗原，免疫的非转基因小鼠初始朝人类CD52发起抗体反应。
为收集人类CD52转基因小鼠的脾细胞，将小鼠安乐死，取出脾脏并经由通过注射器而制备单细胞悬浮液。接着通过腹膜内(i.p.)注射用收集的人类CD52阳性脾细胞以每只小鼠100μl中5x 106个与或者不与弗氏完全佐剂(Freund′s Complete Adjuvant)一起对CD1小鼠免疫。在使用弗氏不完全佐剂，腹膜内注射，用转基因小鼠人类CD52阳性脾细胞以每只鼠100μl中5x 106个第一次免疫之后，每两周对小鼠给予两次加强剂量(booster dose)。
对于所有小鼠，在免疫之前对每只小鼠收集眼出血100-200微升于黄色盖血清分离管中，以确定基础水平反应性，在每轮免疫之后一周收集以确定基础水平反应性，并在每轮免疫之后一周收集以确定抗人CD52特异性免疫反应。将对CHO K1细胞(被改造以表达人类CD52蛋白)，而不对亲代CHO K1细胞表现出高水平的抗人CD52反应性(通过FACS检测)的小鼠处死，在无菌条件下收集血液并收集脾脏以产生杂交瘤。通过在免疫之后3-4天使用非分泌性小鼠骨髓瘤细胞-系SP2/0 Ag14或NS1骨髓瘤细胞作为融合伴侣(fusion partner)而产生杂交瘤。将融合细胞放置于包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的完全生长培养基中以产生杂交瘤。对许多杂交瘤上清液筛选后，选择数个产生特异性抗人CD52抗体的克隆，并对其进一步亚克隆以得到克隆群体。按比例增加产生抗人CD52抗体的杂交瘤克隆以进行进一步发展。
实施例2：鼠抗人CD52抗体的重链和轻链的PCR分析
通过测试杂交瘤上清液其抗人CD52反应性的存在而鉴定数个鼠抗人CD52单克隆抗体(图1B)。选择单独的克隆并通过PCR克隆和测序来鉴定小鼠的重链可变序列和轻链可变序列。与YTH 34.5 HL(即，Campath IG κ(大鼠)和试剂抗体CF1D12(CF1D12κ)(Invitrogen LifeScience Technologies)相比较的轻链序列示于图2中。类似地，与YTH34.5HL和试剂抗体CF1D12相比较的重链序列示于图3中。
鉴定出总共10个独特的轻链可变序列和11个独特的重链可变序列。如果包括Campath
Figure BDA0000130072490000961
和CF1D12，则在抗人CD52抗体的轻链内，鉴定出7个独特的CDR-1区(表1)，8个独特的CDR-2区(表2)和7个独特的CDR-3区(表3)。
表1：轻链CDR-1序列
  轻链CDR-1   序列
  A   KASQNIDKYLN(SEQ ID NO：27)
  B   KSSQSLLESDGRTYLN(SEQ ID NO：28)
  C   KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO：29)
  D   KSSQSLLDSDGRTYLN(SEQ ID NO：30)
  E   KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO：31)
  F   RSSQSLVHTNGNSYLH(SEQ ID NO：32)
  G   RSSQSLVHTNGNTYLH(SEQ ID NO：33)
表2：轻链CDR-2序列
  轻链CDR-2   序列
  A   NTNNLQT(SEQ ID NO：34)
  B   LVSNLDS(SEQ ID NO：35)
  C   LVSKLDS(SEQ ID NO：36)
  D   LVSNLGS(SEQ ID NO：37)
  E   LVSALDS(SEQ ID NO：38)
  F   LVSNLNS(SEQ ID NO：39)
  G   LVSHLDS(SEQ ID NO：40)
  H   MVSNRFS(SEQ ID NO：41)
表3：轻链CDR-3序列
  轻链CDR-3   序列
  A   LQHISRPRT(SEQ ID NO：42)
  B   WQGTHFPWT(SEQ IDNO：43)
  C   VQGSHFHT(SEQ ID NO：44)
  D   VQGTRFHT(SEQ IDNO：45)
 E   VQGTHLHT(SEQ ID NO：46)
 F   SQSTHVPFT(SEQ ID NO：47)
 G   SQSAHVPPLT(SEQ ID NO：48)
如果包括Campath
Figure BDA0000130072490000971
和CF1D12，则在抗人CD52抗体的重链内已经鉴定出总共8个独特的CDR-1区(表4)，10个独特的CDR-2区(表5)和8个独特的CDR-3区(表6)。
表4：重链CDR-1序列
  重链CDR-1   序列
  A   GFTFTDFYMN(SEQ ID NO：49)
  B   GFTFSDAWMD(SEQ ID NO：50)
  C   RFTFSDAWMD(SEQ ID NO：51)
  D   GLTFSDAWMD(SEQ ID NO：52)
  E   GFPFSNYWMN(SEQ ID NO：53)
  F   GFTFNKYWMN(SEQ ID NO：54)
  G   GFTFNTYWMN(SEQ ID NO：55)
  H   GFTFTDYYMS(SEQ ID NO：56)
表5：重链CDR-2序列
  重链CDR-2   序列
  A   FIRDKAKGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO：57)
  B   EIRNKAKNHVAYYAESVKG(SEQ ID NO：58)
  C   EIRNKANNHATYYAESVKG(SEQ ID NO：59)
  D   EIRNKAKNHVKYYAESVKG(SEQ ID NO：60)
  E   EIRNKAKNHATYYAESVKG(SEQ ID NO：61)
  F   EIRKKVNNHATYYAESVKG(SEQ ID NO：62)
  G   QIRLKSNNYATHYAESVKG(SEQ ID NO：63)
  H   QIRLKSDNYATHYAESVKG(SEQ ID NO：64)
  I   FIRNKANGYTTEYNASVKG(SEQ ID NO：65)
  J   FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：66)
表6：重链CDR-3序列
  重链CDR-3   序列
  A   AREGHTAAPFDY(SEQ ID NO：67)
  B   TTLDS(SEQ ID NO：68)
  C   TSLDY(SEQ ID NO：69)
  D   TGLDY(SEQ ID NO：70)
  E   TPIDY(SEQ ID NO：71)
  F   TPVDF(SEQ ID NO：72)
  G   TRYIFFDY(SEQ ID NO：73)
  H   TRYIWFDY(SEQ ID NO：74)
13个不同的抗人CD52抗体内特定的轻链CDR区和重链CDR区的关系说明于表7。
表7：基于CDR组成的抗人CD52抗体的分类
Figure BDA0000130072490000981
克隆8G3.25.3.5、4G7.F3、9D9.A2、11C11.C5、3G7.E9、5F7.1.1.4、12G6.15.1.2、23E6.2.2.1、2C3.3.8.1、7F11.1.9.7和4B10.1.2.4在后文分别称为8G3、4G7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11和4B10。
表7.1：抗人CD52抗体的CDRs的SEQ ID NOs
Figure BDA0000130072490000982
Figure BDA0000130072490000991
实施例3：从小鼠杂交瘤细胞克隆鼠IgG可变区基因以产生鼠/人类嵌合IgG1抗体
依照制造商推荐的步骤流程，使用Trizol试剂(Gibco/BRL)用活跃增殖且分泌抗体的杂交瘤细胞来分离RNA。通过使用Nanodrop测量OD来对RNA定量，并且通过使其在凝胶上移动或通过使用生物分析仪来确定RNA的完整性。将总RNA反转录为cDNA，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增重链和轻链的可变区。依照制造商的步骤流程，使用BD Sprint PowerScript反转录酶(Clontech)和0.5μg/μl的Oligo(dT)引物(Invitrogen Cat# Y01212)及10μM的反向引物(位于重链和轻链的恒定区)(于下文以数字列出)来产生cDNA。具体而言，使用编号3(SEQ ID NO：77)、11(SEQ ID NO：85)、19(SEQ ID NO：93)、20(SEQ ID NO：94)和21(SEQ ID NO：95)的引物。使用如上所述产生的cDNA来进行重链和轻链可变区的PCR扩增。对于重链和轻链，将1μl cDNA与正向引物和反向引物(各10μM)混合，并在2μl 25mM的MgCl2的存在下与PCR super mix(Invitrogen)混合。PCR程序按照下列步骤运行：1)95℃进行2分钟；2)95℃进行30秒；3)56℃进行30秒；4)68℃进行45秒；5)重复步骤2至425次；6)68℃进行10分钟并维持于16℃。在2％凝胶上分析PCR产物，以检测大小约300-400bp的可变区序列产物的存在，并依照制造商说明书将适当的条带克隆至pCR2.1-TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)，并使用M13引物确认经克隆的序列。提供用于反转录和用于轻链和重链序列PCR扩增的引物：
轻链引物
1)Lead-MLκ＝5’ATGGGCWTCAARATGRARWCWCAT 3’(前导序列中的正向引物)(SEQ ID NO：75)
2)FR1-MLκ＝5’GAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：76)
3)MLκconst＝5’ACTGGATGGTGGGAAGATGGA  3’(恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：77)
4)VK-MK＝5’GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：78)
5)MKC-Const＝5’GGATACAGTTGGTGCAGCATC 3’(恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：79)
重链引物
6)MH-SP-ALT1＝5’ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTT 3’(前导序列中的正向引物)(SEQ ID NO：80)
7)MH-SP-ALT2＝5’ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCT 3’(前导序列中的正向引物)(SEQ ID NO：81)
8)MH-FR1＝5’SAGGTSMARCTGCAGSAGTCT 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：82)
9)MH-FR1-1＝5’SAGGTGMAGCTCSWRSARYCSGGG 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：83)
10)MH-J2＝5’TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC 3’(J区中的反向引物)(SEQ ID NO：84)
11)MH-γ-const＝5’AYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC 3’(恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：85)
12)VH MH1＝5’SARGTNMAGCTGSAGSAGTC 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：86)
13)VH MH2＝5’SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：87)
14)VH MH3＝5’CAGGTTACTCTGAAAGWGTSTG 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：88)
15)VH MH4＝5’GAGGTCCARCTGCAACARTC 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：89)
16)VH MH5＝5’CAGGTCCAACTVCAGCARCC 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：90)
17)VH MH6＝5’GAGGTGAASSTGGTGGAATC 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：91)
18)VH MH7＝5’GATGTGAACTTGGAAGTGTC 3’(骨架1中的正向引物)(SEQ ID NO：92)
19)IgG1＝5’ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC 3’(鼠IgG1 CH1恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：93)
20)IgG2A＝5’CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA 3’(鼠IgG2ACH1恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：94)
21)IgG2B＝5’AGGGGCCAGTGGATAGAGTGATGG 3’(鼠IgG2B CH1恒定区中的反向引物)(SEQ ID NO：95)
简并引物导致在重链和轻链的骨架1区域的5’端的一些简并性。使用来自数个独立重链可变区克隆和来自轻链可变区克隆的共有DNA序列以得到氨基酸序列。
通过将重链和轻链可变区分别结合至编码人类IgG1重链(序列与在Campath-1H
Figure BDA0000130072490001011
中发现的序列相同)和人类κ轻链恒定区(序列与在Campath-1H中发现的序列相同)的DNA来产生功能性嵌合抗CD52抗体。为产生编码CD52抗体轻链的pCEP4(Invitrogen)轻链载体，对轻链可变序列进行PCR扩增，并通过不依赖连接酶的克隆将其构建至pCEP4 LIC轻链载体，以使人类κ链信号序列在5’端并使轻链恒定区在3’端。类似地，为产生pCEP4重链载体，通过不依赖连接酶的克隆将重链序列的可变区构建至pCEP4 LIC重链载体，以使人类κ链信号序列在5’端，并使包含CH1区、铰链区、CH2区和CH3区的重链恒定区在3’端。重链和轻链的恒定区氨基酸序列与存在于Campath 1H抗体中存在的恒定区氨基酸序列相同。
简而言之，依照制造商建议在合适的缓冲液中用BfuA1(NewEngland Biolabs-NEB)消化pCEP4 LIC载体，在完全消化之后，使用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化载体。接着用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)处理线性质粒以产生单链末端并将其用来克隆可变区片段。将重链特定pCEP4 LIC载体用于克隆重链可变区，并且将轻链特定pCEP4 LIC载体用于克隆轻链可变区。使用包含pCR2.1-TOPO重链可变区的质粒或包含pCR2.1-TOPO轻链可变区的质粒作为模板和包含可变链特定序列及载体悬突(overhang)的引物，通过PCR产生可变区插入物。使用VENT DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)以对插入物进行PCR扩增。将PCR扩增的插入物凝胶纯化，并用T4DNA聚合酶处理以产生单链末端。将为重链和轻链制备的载体与各自的可变区插入片段合并并于室温培育10分钟，用于转化TOPO10细胞(Invitrogen)，挑选氨苄青霉素抗性的克隆并验证其序列。对具有框内插入(inserted in-frame)的正确重链和轻链序列的pCEP4重链和pCEP4轻链克隆进行扩增并用于蛋白制备。使用阳离子脂质LipofectamineTM 2000(Invitrogen)将重链构建体与对应的轻链构建体以1∶1的比例共转染至HEK293细胞(Invitrogen)。转染后三天收集条件培养基(conditioned medium)，并使用蛋白A层析来纯化嵌合抗体。为进行此层析方法，将培养基加至蛋白A，并以50管柱体积的PBS清洗。使用5管柱体积的12.5mM柠檬酸(pH 3.0)对嵌合抗体进行洗提。经过洗提的抗体的pH通过加入0.5M HEPES来中和。通过使用PD-10凝胶过滤柱将缓冲液交换为PBS。
实施例4：嵌合抗人CD52单克隆抗体的表位特异性分析
通过评估嵌合抗体结合至被改造以表达人类CD52突变体的一组细胞系的能力而确定克隆的表位特异性(图4)，其中该细胞系通过丙氨酸扫描突变技术产生。使用STRATAGENE QUIKCHANGE II XL定点诱变试剂盒，在pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)中人类CD52cDNA上进行CD52的12个氨基酸细胞外区域中的前10个氨基酸的抗体取代。编码野生型或突变型CD52序列的pcDNA3.1载体的序列被证实，并使用LipofectamineTM转染至CHO细胞，并通过在含有G418的培养基中选择以产生表达野生型或丙氨酸突变型CD52的CHO细胞系。使用FACS通过测量抗体对野生型和突变型CD52表达细胞的结合而确定抗人CD52嵌合抗体的表位特异性结合。使用结合有PE的羊抗人二级抗体(Jackson ImmunoResearch Labs)通过检测嵌合抗CD52抗体的结合而进行FACS分析。图5A-5C显示抗CD52单克隆抗体对野生型和突变型CD52表达细胞系的平均荧光强度(MFI)。即使CD52非常短的12个氨基酸的GPI锚定蛋白，FACS结果清楚地确定出存在三组抗体：(1)N-端结合组(例如4B10)；(2)中间结合组(例如4G7、9D9和11C1)与(3)C-端结合组(例如23E6、12G6、和2C3)。抗人CD52单克隆抗体(通过实施例2最后所叙述的简写名称识别)的表位特异性概括于表8中。
表8：11种鼠抗人CD52单克隆抗体的特征
  克隆   同种型   表位特异性
  大鼠YTH34.5HL   IgG2a   9-10-11-12
  小鼠CF1D12   IgG3   3-4-5-6-7
  8G3.25.3.5   IgG3   未确认
  4G7.F3   IgG3   3-4-5-6-7
  9D9.A2   IgG3   3-4-5-6-7
  11C11.C5   IgG3   1-3-4-5-6-7
  3G7.E9   IgG2b   1-3-4-5-6-7
  5F7.1.1.4   IgG3   1-3-4-5-6-7-10
  12G6.15.1.2   IgG3   7-8-9
  23E6.2.2.1   IgG3   7-8-9
  2C3.3.8.1   IgG3   7-8-9-10
  7F11.1.9.7   IgG1   1-2-3-4-5
  4B10.12.4   IgG2a   1-2-3-4-5
CD52为一种极小的抗原但拥有相当大的、亲水性N-连接聚糖部分以及疏水性GPI锚区。为探究糖可能构成所有或部分被抗CD52抗体所识别的表位的可能性，用内切糖苷酶、PNGase-F处理来自CHO-CD52细胞的经过亲合纯化的CD52样品，以从抗原中完全移除N-连接糖。接着将经过处理和模拟处理的对照样品用SDS-PAGE解析，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)，用3μg/ml最终的被指出的各个抗CD52嵌合单克隆抗体进行探测，接着根据标准蛋白质印迹(western blotting)步骤使用增强化学发光检测显影。使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001031
(C1H)和仅使用二级抗体(2°Alone)的印迹分别作为阳性和阴性对照来运行，并使用各个单克隆抗体检测(图5D)。结果显示抗体对糖基化CD52相对于对去糖基化CD52之间的不同结合偏好。此特性使得将十一种抗体分类为四种类型的结合组：
1.对糖基化CD52相对于对去糖基化CD52表现出没有明显偏好的结合的抗体(4G7、9D9)
2.表现出特异性结合至糖基化CD52的抗体(7F11、4B10)
3.表现出特异性结合至去糖基化CD52的抗体(8G3)
4.表现出对去糖基化CD52优先于糖基化CD52的结合的抗体(12G6、5F7、23E6、2C3、11C11、3G7)。
实施例5：嵌合抗CD52抗体的CDC活性
如下文所述进行补体依赖的细胞毒性(CDC)检定。简而言之，将被改造以表达CD52蛋白的CHO K1细胞(CHO-CD52)用作靶细胞，并用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)在37℃标记1-2小时。洗涤细胞，使用X-Vivo介质(medium)使其重悬，并与抗人CD52抗体混合至2.2μg/ml的最终浓度。向实验孔加入人类补体(Sigma)至10％的最终浓度。在1-5小时培养之后，自各孔中收集25μl无细胞的上层清液，并在MICROBETA TRILUX Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常少于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr总量，且裂解百分率如下计算：[(每分钟样品数(c.p.m.)-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。
在CHO-CD52细胞上使用人类补体在CDC检定中对十二种不同的嵌合抗CD52抗体(鼠可变区和人类IgG1恒定区)进行测试。将Campath-1H
Figure BDA0000130072490001041
人源化抗体用作阳性对照。阴性对照为Campath-1H
Figure BDA0000130072490001042
空白(null)(一种Campath-1H的非细胞结合的最少突变体——在H2环-重链CDR2区域中两点突变(K52bD和K53D；Gilliland LK等人，Journal of Immunology，162：3663-3671(1999))。结果表明嵌合抗体能够对CD52表达细胞介导CDC杀伤。一些嵌合抗体介导相当于或优于Campath
Figure BDA0000130072490001044
的强力杀伤(图6)。
实例6：嵌合抗CD52抗体的ADCC活性
如下文所述进行抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)检定。简而言之，将被改造以表达CD52蛋白的CHO K1细胞(CHO-CD52)用作靶细胞，并用Na2 51CrO4(New EnglandNuclear，Boston，MA)在37℃标记1-2小时。洗涤细胞，使用X-Vivo介质重悬，并与抗人CD52抗体混合至1.1μg/ml的最终浓度。人类PBMC用作效应细胞，并以1∶100的靶细胞比效应细胞的比例加入。在6小时过夜培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MICROBETA TRILUX Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr总量，且裂解百分率如下计算：[(样品c.p.m.-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。
使用人类PBMC作为效应细胞，在ADCC检定中对十二种不同的嵌合抗CD52抗体(鼠可变区和人类IgG1恒定区)进行检测。将Campath-1H人源化抗体用作阳性对照。用作阴性对照的是Campath-1H
Figure BDA0000130072490001052
空白(一种非细胞结合的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001053
最少突变体——在H2环-重链CDR2区域中两点突变(K52bD和K53D；Gilliland，1999，上文)。结果表明嵌合抗体能够对CD52表达细胞介导ADCC杀伤。一些嵌合抗体介导相当于或优于Campath的强力杀伤(图7)。
实施例7：嵌合抗CD52抗体至限定的淋巴细胞群的结合评估
使用下列结合有荧光染剂的抗体用于流式细胞分析：抗-CD3-FITC、抗-CD27-PE、抗-CD62L-PE Cy5、抗-CD56-PE Cy7、抗-CD 16-APC Cy7(BD Biosciences，San Diego，CA)、抗-CD45RA-ECD(Beckman Coulter)、抗-CD19-Pacific Blue、抗-CD4-APC Cy5.5和抗-CD8 pacific orange(Invitrogen，CA)。所有小鼠嵌合抗人CD52抗体以及人源化Campath-1H
Figure BDA0000130072490001055
都结合至Alexa fluor 647(BD Pharmingen)。健康人类外周血单核细胞从冷藏保存的淡黄色层(buffy coats)获得或从自商业供应商(Bioreclamation，NY，USA)得到的正常捐赠者的血液中分离的单核细胞获得。为了富集单核细胞，使用无菌的磷酸缓冲盐水(PBS)以1∶1稀释人类外围血，并小心地将其叠加于Ficoll-hypaque(GE Healthcare Bio-Sciences，Uppsala，Sweden)上，于室温离心30分钟。取出单核细胞的相间层，并于包含5％胎牛血清(FACS缓冲液)的PBS中洗涤。污染的红血球细胞(RBCs)用RBC裂解液(Sigma，St.Louis，MO，USA)裂解。使细胞在冷FACS缓冲液中重悬，并使用40微米过滤器移除碎屑。进行十色流式细胞术以评估9种嵌合抗人CD52抗体(4B10、7F11、9D9、5F7、2C3、4G7、23E6、8G3、3G7)相较于Campath-1H
Figure BDA0000130072490001061
的结合能力。
简而言之，将1x 106PBMC’s于FACS缓冲液的重复物(replicates)与针对CD3、CD27、CD45RA、CD62L、CD56、CD19、CD8、CD4、CD16的抗体连同9种嵌合抗人CD52抗体(4B10、7F11、9D9、5F7、2C3、4G7、23E6、8G3、3G7)的其中一种的预滴定稀释液的混合物于4℃培养30分钟。洗涤细胞并在包含1％多聚甲醛的PBS中固定。在BD LSR-II(BD Biosciences，San Jose，CA)上得到100,000个染色细胞，并使用FlowJo 7.2版软件(Tree Star，Inc，Oregan，USA)对数据进行分析。具有明显的表型特征的多个亚型已在B淋巴细胞和T淋巴细胞之间限定，并且已经显示CD52在所有人类淋巴细胞上表达。进行十色流式细胞分析以鉴定淋巴细胞亚型，和评估抗CD52抗体对所限定亚型上的细胞表面CD52的结合特征方面的相似点和不同点。使用标记组合，对应于B、T和NK细胞系的11个表型不同的细胞群先从淋巴细胞门(lymphocyte gate)中确定出。接着对染色强度进行评估，其对应于抗CD52抗体检测CD52表达的能力。统计图(图8A-8C)显示使用各种抗体在单独淋巴细胞群上的CD52检测水平的比较。数据显示抗体在结合至CD52方面展现出显著差异。4B10、9D9、7F11和Campath-1H的检测水平是可比较的，尽管在几乎所有检查的细胞亚群上，相对于包括Campath-1H
Figure BDA0000130072490001063
的其它抗体，4B10始终显示最高的检测水平。另一方面，使用3G7、4G7、8G3和23E6抗体的CD52检测水平显著较低。结果显示抗体对于识别不同细胞群上CD52的能力的层次，其中4B10为最高，且3G7为最低。令人有兴趣的是，在CD4效应细胞上，这些差别比较不明显，并且在CD52显示出以相对较低的水平表达的NK细胞亚群上更明显。结合特征的差异显示嵌合抗体的性质不仅与Campath-1H显著不同，而且也反映出抗体之间性质的差别。
实施例8：人类CD52转基因小鼠中嵌合抗CD52抗体的分析(7F11、8G3、23E6、12G6、4B10和5F7)
对人类CD52转基因小鼠施用Campath或嵌合抗CD52抗体(7F11、8G3、23E6、12G6、4B10和5F7)，以检查淋巴细胞消减的水平。将100微升体积的Campath或嵌合抗CD52抗体以1mg/kg的剂量腹膜内注射至小鼠。三天之后处死小鼠，并收集血液和脾脏以确定B细胞和T细胞消减的水平。利用流式细胞术以评估存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞、细胞毒性T细胞、和B细胞的绝对数量。这些淋巴细胞群由下列蛋白抗原的细胞表面表达而定义：CD4表达鉴定T辅助细胞群，CD8表达鉴定细胞毒性T细胞群且CD19表达鉴定所有的成熟B细胞群。对于12G6和4B10抗体均观察到显著水平的T细胞和B细胞消减，其可与使用Campath
Figure BDA0000130072490001074
所观察到的消减相比较。使用Campath
Figure BDA0000130072490001075
、嵌合12G6或嵌合4B10抗体的处理使得以此剂量水平处理的小鼠血液和脾脏中的T细胞和B细胞显著降低。7F11和5F7嵌合抗体导致血液和脾脏中显著水平的T细胞消减水平，但在血液和脾脏中对于消减B细胞没那么有效。使用23E6抗体处理在此剂量下产生中等水平的消减，而使用较低亲合8G3抗体则观察到略微甚至没有消减。
图9A-9C显示在使用嵌合抗体给药之后72小时的血液中CD4 T细胞、CD8 T细胞和CD19 B细胞的水平。图10A-10C显示在给药之后72小时脾脏中CD4 T细胞、CD8 T细胞和CD19 B细胞的水平。
实施例9：人类CD52转基因小鼠中嵌合抗CD52抗体的分析(2C3、3G7、4B10、9D9、和11C11)
对人类CD52转基因小鼠施用Campath
Figure BDA0000130072490001076
或嵌合抗CD52抗体(2C3、3G7、4B10、9D9和11C11)，以检查淋巴细胞消减的水平。将100微升体积的Campath
Figure BDA0000130072490001077
或嵌合抗CD52抗体以1mg/kg的剂量静脉注射至小鼠。三天之后处死小鼠，并收集血液和脾脏以确定B细胞和T细胞消减的水平。利用流式细胞术以评估存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血中的全部T辅助细胞、细胞毒性T细胞、和B细胞的绝对数量。这些淋巴细胞群通过下列蛋白抗原的细胞表面表达而定义：CD4表达鉴定T辅助细胞群，CD8表达鉴定细胞毒性T细胞群，且CD19表达鉴定所有的成熟B细胞群。对于多种抗体，在血液和脾脏中均观察到显著水平的T细胞和B细胞消减。对于2C3和9D9的消减活性与使用Campath
Figure BDA0000130072490001081
所观察到的消减活性是可比较的，显著水平的CD4和CD8 T细胞以及CD19 B细胞减少。使用嵌合4B10的处理也使得转基因小鼠的血液中淋巴细胞的数目显著降低。尽管使用嵌合抗体3G7或11C11抗体的处理显著消减血液中T细胞，但存在的B细胞的水平在此剂量下并未受显著影响。
图11A-11C显示在使用嵌合抗体给药之后72小时血液中的CD4 T细胞、CD8 T细胞和CD19 B细胞的水平。
实施例10：抗CD52抗体的效力分析(7F11、4B10和12G6)
将100微升体积的1x 106个B104肿瘤细胞注射至四十只SCID小鼠(每组n＝8)的右侧肋腹。肿瘤细胞注射后第11天，开始使用Campath、7F11、4B10或12G6嵌合抗体处理。在剩余实验全程以10mg/kg每周一次通过腹膜内注射来施用抗体。未处理组的所有小鼠逐渐形成成长的肿瘤需要处死，中位生存期29天。相对于未处理组，使用Campath
Figure BDA0000130072490001083
的处理引起统计上显著增加的存活(中位生存期(MS)50天，p＜0.0001)。相对于未处理的小鼠，使用嵌合抗CD52抗体的处理也产生统计上显著增加的存活(对于7F11和4B10，p＜0.0001，且对于12G6，p＝0.0020)。基于存活率，7F11与4B10抗体的活性显得均大于Campath
Figure BDA0000130072490001084
(相较于Campath的50％存活，7F11为63％存活和4B10为75％存活)。图12显示处理后小鼠的存活百分比。
实施例11：抗CD52抗体的效力分析(2C3、8G3和23E6)
将100微升体积的1x 106个B104肿瘤细胞注射至四十只SCID小鼠(每组n＝8)的右侧腹。肿瘤细胞注射后第11天，开始使用Campath
Figure BDA0000130072490001086
2C3、8G3或23E6嵌合抗体处理。在剩余实验全程以10mg/kg每周一次腹膜内注射来施用抗体。未处理组的所有小鼠逐渐形成成长的肿瘤需要处死，中位生存期26天。使用Campath
Figure BDA0000130072490001091
、23E6、和2C3抗体的处理产生统计上显著增加的存活(分别为p＝0.0025、p＝0.0007、和p＝0.0002)。图13显示处理后小鼠的存活百分率。
实施例12：异种移植肿瘤模型中嵌合抗CD52抗体的效力分析(9D9和4B10)
将100微升体积的1x 106个B104肿瘤细胞注射至四十只SCID小鼠(每组n＝8)的右侧腹。肿瘤细胞注射后第11天，开始使用Campath
Figure BDA0000130072490001092
、9D9或4B10嵌合抗体处理。在剩余实验全程以10mg/kg每周一次通过腹膜内注射来施用抗体。未处理组的所有小鼠逐渐形成成长的肿瘤需要处死，中位生存期27天。相对于未处理组，使用Campath
Figure BDA0000130072490001093
处理产生统计上显著增加的存活(中位生存期未达到，且p＜0.0001)。相对于未处理的小鼠，使用嵌合抗CD52抗体处理也产生统计上显著增加的存活(对于9D9和4B10，p＜0.0001)。存活曲线的统计分析显示，9D9嵌合抗体在此实验中显示出可与Campath
Figure BDA0000130072490001094
相比较的活性(p＝0.0675)。图14显示处理后小鼠的存活百分率。
实施例13：异种移植肿瘤模型中嵌合抗CD52抗体的效力分析(2C3和11C11)
将100微升体积的1x106个B104肿瘤细胞注射至四十只SCID小鼠(每组n＝8)的右侧腹。肿瘤细胞注射后第11天，开始使用Campath
Figure BDA0000130072490001095
、2C3或11C11嵌合抗体处理。在剩余实验全程以10mg/kg每周一次通过腹膜内注射来施用抗体。未处理组的所有小鼠逐渐形成成长的肿瘤需要处死，中位生存期32天。相对于未处理组，使用Campath
Figure BDA0000130072490001096
的处理产生统计上显著增加的存活(中位生存期未达到，且p＜0.0001)。相对于未处理的小鼠，使用嵌合抗CD52抗体的处理也产生统计上显著增加的存活(对于2C3，p＜0.0001；对于11C11，p＝0.0004)。存活曲线的统计分析显示2C3和11C11嵌合抗体均显示出可与Campath
Figure BDA0000130072490001097
相比较的活性(对于2C3，p＝0.3173，且对于11C11，p＝0.9703)。图15显示使用Campath
Figure BDA0000130072490001101
2C3嵌合抗体或11C11嵌合抗体处理后小鼠的存活百分率。
实施例14：人源化抗CD52抗体4B10的产生和分析
通过将CDR区从小鼠4B10抗体移植至人类抗体可变区骨架而产生人源化抗人CD52抗体4B10。为了鉴定可用作CDR移植物的合适受体的人类生殖系重链和轻链骨架序列，通过基于网络的序列比对来评估小鼠4B10重链和轻链序列(图16)。将根据Kabat和IMGT
Figure BDA0000130072490001102
定义CDR区域的残基置于附加至高度序列一致性的人类骨架区中，以产生人源化重链和轻链序列。对添加的4B10重链和轻链序列进行视觉检查和序列分析以鉴定最合适的受体序列。在具有高度相似性的所有生殖系序列中，用于重链的VH3-72生殖系序列和用于轻链的VK2-A18b(人类生殖系序列可在Tomlinson，IM，等人，EMBO J.，14(18)：4628-4638(1995)；Cook，GP.，等人Nature Genetics，7：162-168(1994))出版物中叙述的网站找到)从其与小鼠骨架区的高度同源性和序列相似度，并因其最少的CDR环结构破坏而被选择为CDR受体序列。用于4B10重链和轻链的CDR1、2、和3序列被分别移植至VH3-72和VK2-A18b人类骨架区，以产生4B10的人源化重链和轻链序列(说明于图17；图110)。
实施例15：嵌合和人源化4B10单克隆抗体的结合活性评估
如在实施例3中所述制备和纯化嵌合和人源化4B10抗体，并分析其结合至B细胞系B104的能力，根据FACS，B细胞系B104内源地表达CD52。简而言之，在包含5％胎牛血清和5％羊血清的PBS中将2x 105个B104细胞系和抗体(0.02μg/ml至16.7μg/ml)一起培养。结合的抗体用FITC标记的羊抗人二级抗体(其检测嵌合或人源化抗CD52抗体)检测。被标记的细胞使用FACSCalibur系统(BectonDickinson)分析。图18显示各个样品归一化(除以)至仅2°样品的几何平均荧光强度倍数增加。用于该检定的人源化和嵌合抗体的11个不同浓度(X轴上的第12个点为仅二级(secondary))示于X轴，且平均荧光的几何平均倍数增加示于Y轴。结果显示相对于嵌合4B10抗体，人源化4B10抗体同样地结合或者略微更好地结合至CD52表达细胞。
实施例16：嵌合和人源化4B10单克隆抗体的ADCC活性评估
对人源化和嵌合4B10抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。如上文实施例6所述进行ADCC检定。简而言之，将改造为表达CD52蛋白的CHO K1细胞(CHO-CD52)用作靶细胞，并用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)在37℃标记1-2小时。洗涤细胞，在具有10％FCS的RPMI 1640介质中重悬，并与嵌合或人源化4B10抗体以范围为从10μg/ml至0.01μg/ml的各种浓度混合。将人类PBMC用作效应细胞，并以1∶50靶细胞比效应细胞的比例加入。在6小时过夜培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MICROBETA TRILUX Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr总量，且裂解百分率如下计算：[(样品c.p.m.-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。
图19说明用于检定中的对照、嵌合和人源化4B10抗体的浓度(X轴)，Y轴显示特定杀伤百分比。该结果显示相对于嵌合4B10抗体，人源化4B10抗体介导相当的或略好的ADCC杀伤。IgG1同种型对照在所测试浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例17：嵌合和人源化4B10单克隆抗体的CDC活性评估
在人类补体的存在下，对人源化和嵌合4B10抗体介导内源表达CD52的B104细胞的细胞毒作用的能力进行评估。使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)确定检定中剩余的活细胞。简而言之，将B104细胞(靶细胞)以2.5x104个细胞/孔置于96孔板中，并与嵌合或人源化4B10抗体以范围为从1μg/ml至25μg/ml的不同浓度混合，以及人类补体至10％的最终浓度。仅补体而无抗体以及仅抗体而无补体用作对照以确定背景。在37℃培养三小时之后，将培养板以1500rpm离心3分钟，使用CellTiter Glo检定来检测团块(pellet)中存在的活细胞。用Envision机器读取培养板。图20显示使用CellTiter Glo检定所测量的在检定中存在的活细胞。再次，随着增加浓度的人源化和嵌合4B10抗体，活细胞数目减少。这些结果表明在CDC介导的B104细胞杀伤中，人源化抗体相对于嵌合4B10抗体表现一样好或者略好。
实施例18：在CD52转基因小鼠中嵌合和人源化抗CD52抗体的药物动力学特性分析(12G6、7F11、嵌合和人源化4B10)
对人类CD52转基因小鼠施用Campath
Figure BDA0000130072490001121
12G6、7F11、和嵌合及人源化4B10抗CD52抗体的其中一个，以检查淋巴细胞消减水平。用这些抗体之一以100微升体积、以1mg/kg的剂量静脉内注射至小鼠。为分析抗-抗体反应，在抗体注射后2小时、1、2、4、7、和10天后通过后眼窝丛穿刺收集100微升血液至血清分离管。使用ELISA分析确定各个血清样本中循环人类IgG1的水平。基于抗体的循环水平，Campath
Figure BDA0000130072490001122
7F11、和嵌合及人源化形式的4B10之间显得存在很少或没有差异。注射后12G6抗体显现出较低的cmax值，表明此抗体可能很快降解。图21显示Campath
Figure BDA0000130072490001123
12G6(嵌合)、7F11(嵌合)、4B10(嵌合)和4B10(人源化)抗体的药物动力学特性。
实施例19：在CD52转基因小鼠中嵌合和人源化抗CD52抗体的消减活性分析(嵌合和人源化4B10)
对人类CD52转基因小鼠施用Campath
Figure BDA0000130072490001124
或嵌合或人源化4B10抗人CD52抗体，以检查淋巴细胞消减水平。将Campath
Figure BDA0000130072490001125
或嵌合或人源化4B10抗人CD52抗体以100微升体积以0.1mg/kg的剂量静脉内注射至小鼠。三天之后处死小鼠并收集血液和脾脏，以确定B细胞和T细胞的消减水平。利用流式细胞术评估存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血中的全部T辅助细胞、细胞毒性T细胞、和B细胞的绝对数量。这些淋巴细胞群由下列蛋白抗原的细胞表面表达而定义：CD4表达鉴定T辅助细胞群，CD8表达鉴定细胞毒性T细胞群，且CD19表达鉴定所有的成熟B细胞群。脾脏中消减活性的比较显示，在施用Campath
Figure BDA0000130072490001126
或嵌合或人源化形式的4B10之后消减的T细胞水平没有差别。因为所使用的低剂量，在脾脏中观察到仅有中度水平的B细胞消减。于每个动物基准，看起来人源化4B10抗体相对于Campath
Figure BDA0000130072490001131
在介导淋巴细胞消减方面一样好或略好。图22A-22C显示在使用嵌合和人源化抗体给药之后72小时血液中的CD4 T细胞、CD8 T细胞和CD19 B细胞的水平。
实施例20：抗人CD52抗体的相对结合效率
使用改造为表达CD52的CHO细胞来评估所选择的抗CD52抗体的EC50值。在0.25％胰蛋白酶中使CHO-CD52细胞胰蛋白化，将其收集，并使用PBS/5％FBS漂洗。接着将细胞以每孔1E5细胞沉积至圆底96孔培养板中。使用各个抗CD52嵌合抗体的12点连续稀释(1∶2)以50μg/ml为起始而完成初级抗体染色。使用于10μg/mL(Jackson109-096-098)二级的抗人Fcγ的FITC-结合羊FAB2片段。在每次培养之前和之后将细胞于冰-冷PBS/5％FBS中洗涤3次。使用含有2％的无甲醇多聚甲醛的PBS固定细胞，并通过流式细胞计数法对其评估。流式细胞术的数据使用Graph pad Prizm软件分析以确定95％置信区间的EC50值。
结合数据(图23)显示该新的CD52抗体不仅具有如先前所述的不同的表位特异性，还具有不同的结合特征，如以下给出的表格所示。Campath-1H
Figure BDA0000130072490001132
7F11、4B10、2C3和12G6嵌合抗体显示出在0.5至2.5μg/ml之间的相对类似的EC50值。9D9嵌合抗体显示出略微不同的结合特征，其EC50值在约5至7μg/ml。4B10人源化抗体显示出与嵌合4B10抗体相似的结合特征，表明人源化抗体保留有与嵌合4B10抗体相似的结合特征。
表9：EC50(μg/ml)
Figure BDA0000130072490001133
Figure BDA0000130072490001141
*C1H表示Campath-1H
Figure BDA0000130072490001142
实施例21：抗CD52抗体克隆7F11的人源化
通过将CDR区从小鼠7F11抗体移植至人类抗体可变区骨架(如在实施例14中对4B10抗体人源化所叙述)而进行抗人CD52抗体克隆7F11的人源化。将7F11重链和轻链的CDR-1、CDR-2、和CDR-3序列分别移植至VH3-72和VK2A18b人类骨架区。人类JH6(WGQGTTVTVSS：SEQ ID NO：133)和JK2(FGQGTKLEIK：SEQID NO：134)序列分别选择为人源化重链和轻链的C端肽，以产生7F11的人源化重链(7F11-SFD1和7F11-SFD2)和人源化轻链(7F11-VK2)可变区序列(图24)。这两个人源化重链可变区序列(7F11-SFD1和7F11-SFD2)不同在于CDR-3区域的一个氨基酸残基。7F11-SFD1版本在93位是苏氨酸(由Kabat编号系统表示)，而7F11-SFD2版本于此位置是丙氨酸。在图24中7F11-SFD1和7F11-SFD2的93位下面均划线。
7F11-SFD1(SEQ ID NO：274)的全长重链氨基酸序列和7F11-K2(SEQ ID NO：275)的全长轻链氨基酸序列示于图107中。
实施例22：嵌合和人源化7F11单克隆抗体的结合活性评估
使用在实施例3中所述的方法制备并纯化嵌合和人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)，并通过流式细胞术分析其结合至CHO-CD52细胞(CHO细胞被改造为表达人类CD52)表面上表达的CD52的能力。简而言之，在含有5％胎牛血清和5％羊血清的PBS中将2x 105个CHO-CD52细胞与10μg/ml的抗体一起培养。使用FITC标记的羊抗人二级抗体(其检测嵌合或人源化抗CD52抗体)来检测结合的抗体。使用FACSCalibur系统(Becton Dickinson)分析被标记的细胞，并使用FlowJo version 7.2软件(Tree Star，Inc，Oregon，USA)分析数据。图25的统计图比较了使用嵌合和人源化7F11抗体所检测的CD52水平。结果表明相对于嵌合7F11抗体，人源化7F11抗体同样地结合或者略微更好地结合至CD52表达细胞。
实施例23：抗CD52抗体克隆2C3的人源化
通过将CDR区从鼠2C3抗体移植至人类抗体可变区骨架(如在实施例14中对克隆4B10抗体人源化所叙述)而进行抗人CD52抗体克隆2C3的人源化。将2C3重链和轻链的CDR-1、CDR-2、和CDR-3序列分别移植至VH3-72和VK2 A18b人类骨架区。人类JH6(WGQGTTVTVSS：SEQ ID NO：133)和JK5(FGQGTRLEIK：SEQID NO：135)序列分别选择为人源化重链和轻链的C端肽，以产生2C3的人源化重链(2C3-SFD1)和轻链(2C3-VK1)可变区序列(图26A和B)。不像人源化克隆4B10和7F11，移植了CDR的人源化2C3抗体的结合亲合性大为降低。结合亲合性通过对移植了CDR的结构引入回复突变而得到恢复，以将回复突变的数目限制为最小作为目的，以保持重新成型的抗体尽可能地像“人类”，由此降低免疫原性的可能性。对人源化重链可变区和轻链可变区序列均引入单个或多个回复突变。回复突变的位置(如由Kabat编号系统所表示)描述于下表10和表11。对通过这些回复突变所产生的抗体其恢复的结合亲合性进行评估。使用标准分子生物技术产生三个轻链变体(2C3-VK1(L46R)，也称为2C3-VK11；2C3-VK1(Y36L-L46R)，也称为2C3-VK12；和2C3-VK1(M4I-A19V-Y36L-Q45K-L46R)，也称为2C3-VK13)以及5个重链变体(2C3-SFD1(L78V)，也称为2C3-VH12；2C3-SFD1(G49A)，也称为2C3-VH15；2C3-SFD1(G49A-L78V)，也称为2C3-VH16；2C3-SFD1(L18M-G49A-L78V)，也称为2C3-VH17；和2C3-SFD1(L18M-G42E-G49A-L78V)，也称为2C3-VH19)。移植了CDR的重链可变区序列2C3-SFD1和回复突变体2C3-VH12、2C3-VH15、2C3-VH16、2C3-VH17、和2C3-VH19的氨基酸序列示于图26A，且回复突变的氨基酸下面划线并且CDRs为粗体。类似地，对于轻链序列，移植了CDR的可变区序列2C3-VK1和回复突变体2C3-VK11、2C3-VK12、和2C3-VK13示于图26B，且回复突变的氨基酸下面划线并且CDRs为粗体。
2C3-SFD1(SEQ ID NO：272)的全长重链氨基酸序列和2C3-K12(SEQ ID NO：273)的全长轻链氨基酸序列示于图106中。
表10：2C3克隆重链回复突变
Figure BDA0000130072490001161
表11：2C3克隆轻(κ)链回复突变
Figure BDA0000130072490001162
实施例24：嵌合和人源化2C3单克隆抗体的结合活性评估
使用在实施例3中所述的方法制造和纯化嵌合和人源化2C3抗体。使用实施例22中所述的方法，通过流式细胞术分析数种通过将重链变体和轻链变体配对而产生的人源化抗体、和对应的嵌合抗体结合至CHO-CD52细胞表面上所表达的CD52的能力。结合数据表明通过配对重链变体与轻链变体2C3-VK1或2C3-VK11所产生的克隆具有降低的结合能力，而通过配对重链变体与2C3-VK12或2C3-VK13所产生的克隆则显示出与嵌合2C3抗体相当或更好的结合。所选择克隆的代表性统计图(图27A)比较了通过嵌合和人源化2C3抗体所检测的CD52水平。相对于对应的嵌合抗体的结合，2C3-SFD1/K1的结合显著降低。在轻链的位置46引入单一小鼠残基(亮氨酸到精氨酸)(产生2C3-VK11)，当其与重链2C3-SFD1配对以制造抗体2C3-SFD1/K11时没有恢复结合。而且，通过在重链引入三个回复突变(产生2C3-VH17)以制造抗体2C3-H17/K11，结合并未得到恢复。然而，当2C3-SFD1重链与具有两个回复突变的2C3-VK12配对以制造抗体2C3-SFD1/K12时，结合完全恢复，表明需要引入特定的回复突变以恢复结合亲合力。图27B显示所选择的人源化克隆的统计图，其显示出与嵌合2C3抗体相当的结合。这些结果表明2C3-VK12轻链中两个氨基酸残基的回复突变足以完全恢复抗体亲和力。当与几乎任何重链变体配对时，在残基36(Y到L)和46(L到R)的变化能够恢复结合。这样，具有最少的衍生自原来的小鼠抗体的骨架残基且显示出结合恢复的人源化2C3克隆为2C3-SFD1/K12。
实施例25：抗CD52抗体克隆12G6的人源化
通过将CDR区从小鼠12G6抗体移植至人类抗体可变区骨架(如在实施例14中对克隆4B10抗体人源化所叙述)而进行抗人CD52抗体克隆12G6的人源化。将12G6重链和轻链的CDR-1、CDR-2、和CDR-3序列分别移植至VH3-72和VK2 A18b人类骨架区。人类JH6(WGQGTTVTVSS：SEQ ID NO：133)和JK2(FGQGTKLEIK：SEQID NO：134)序列分别被选择为人源化重链和轻链的C端肽，以产生12G6的人源化重链(12G6-SFD1)和轻链(12G6-VK1)可变区序列(图28A和28B)。当12G6-SFD1重链可变区和12G6-VK1轻链可变区合并于人源化12G6-SFD1/K1抗体时，对CD52的结合亲合性大为降低。结合亲合性通过对移植了CDR的结构引入回复突变而得到恢复。将单个或多个回复突变引入人源化重链可变区序列和轻链可变区序列。这些回复突变的位置(如由Kabat编号系统所表示)描述于下表12和表13中。对通过这些回复突变所产生的抗体其恢复的结合亲合性进行评估。使用标准分子生物技术产生四个轻链变体(12G6-VK1(Y36V)，也称为12G6-VK10；12G6-VK1(Y36V-Q45K-L46R)，也称为12G6-VK11；12G6-VK1(Y36V-L46R)，也称为12G6-VK12；和12G6-VK1(L46R)，也称为12G6-VK13)，以及三个重链变体(12G6-SFD1(L78V)，也称为12G6-VH10；12G6-SFD1(G49A)，也称为12G6-VH11；和12G6-SFD1(G49A-L78V)，也称为12G6-VH12)。移植了CDR的重链可变区序列12G6-SFD1和回复突变体12G6-VH10、12G6-VH11、和12G6-VH12的氨基酸序列示于图28A，且回复突变的氨基酸下面划线，并且CDRs为粗体。类似地，对于轻链序列，移植了CDR的可变区序列12G6-VK1和回复突变体12G6-VH10、12G6-VH11、12G6-VK12、和12G6-VK13示于图28B，且回复突变的氨基酸下面划线并且CDRs为粗体。
12G6-SFD1(SEQ ID NO：279)的全长重链氨基酸序列和12G6-K12(SEQ ID NO：280)的全长轻链氨基酸序列示于图109。
表12：12G6克隆重链回复突变
  克隆ID   突变(Kabat编号位置)
  12G6-VH10   L到V(78)
  12G6-VH11   G到A(49)
  12G6-VH12   G到A(49)和L到V(78)
表13：12G6克隆轻(κ)链回复突变
Figure BDA0000130072490001181
实施例26：嵌合和人源化12G6单克隆抗体的结合活性评估
使用在实施例3中所述的方法制造和纯化嵌合和人源化12G6抗体。使用实施例22中所述的方法，通过流式细胞术分析数种通过配对重链变体和轻链变体而产生的人源化抗体、和对应的嵌合抗体结合至CHO-CD52细胞表面上所表达的CD52的能力。结合数据表明通过配对重链变体与轻链变体12G6-VK1、12G6-VK10、或12G6-VK13所产生的克隆具有降低的结合能力，而通过配对重链变体与12G6-VK11或12G6-VK12所产生的克隆则显示出与对应的嵌合12G6抗体相当或更好的结合。所选择克隆的代表性统计图(图29)比较了通过嵌合和人源化12G6抗体所检测的CD52水平。这些结果表明，12G6轻链可变区中两个氨基酸残基的回复突变(克隆12G6-VK12)足以完全恢复抗体特异性。当与几乎任何重链变体配对时，在Kabat编号残基36(Y到V)和46(L到R)的变化能够恢复结合。这样，具有最少的衍生自原来的小鼠抗体的骨架残基且显示出恢复的结合的人源化12G6克隆为12G6-SFD1/K12。
实施例27：抗CD52抗体克隆9D9的人源化
通过将CDR区从小鼠9D9抗体移植至人类抗体可变区骨架(如在实施例14中对克隆4B10抗体人源化所叙述)而进行抗人CD52抗体克隆9D9的人源化。将9D9重链和轻链的CDR-1、CDR-2、和CDR-3序列分别移植至VH3-23和VK2A18b人类骨架区。人类JH6(WGQGTTVTVSS：SEQ ID NO：133)和JK2(FGQGTKLEIK：SEQID NO：134)序列分别被选择为人源化重链和轻链的C端肽，以产生人源化重链(9D9-VH10)和轻链(9D9-VK2)可变区序列(图30A和30B)。当9D9-VH10重链和9D9-VK2轻链合并于人源化9D9-H10/K2抗体时，对CD52的结合亲合性大为降低。通过对移植了CDR的结构引入回复突变，结合亲合性得到恢复。将单个或多个回复突变引入人源化重链可变区序列和轻链可变区序列。这些回复突变的位置(如由Kabat编号系统表示)描述于下表14和表15中。对通过这些回复突变所产生的抗体其恢复的结合亲合性进行评估。使用标准分子生物技术产生四个轻链变体(9D9-VK2(Y36L-Q45K-L46R)，也称为9D9-VK12；9D9-VK2(Y36L-L46R)，也称为9D9-VK13；9D9-VK2(L46R)，也称为9D9-VK14；和9D9-VK2(Q45K-L46R)，也称为9D9-VK15)以及五个重链变体(9D9-VH10(W47L-V48T-S49A-N76S-L78V)，也称为9D9-VH11；9D9-VH10(W47L-V48T-S49A)，也称为9D9-VH15；9D9-VH10(W47L)，也称为9D9-VH16；9D9-VH10(W47L-V48T)，也称为9D9-VH17；和9D9-VH10(W47L-S49A)，也称为9D9-VH18)。移植了CDR的重链可变区序列9D9-VH10和回复突变体9D9-VH11、9D9-VH15、9D9-VH16、9D9-VH17、和9D9-VH18的氨基酸序列示于图30A，且回复突变的氨基酸下面划线并且CDRs为粗体。类似地，对于轻链序列，移植了CDR的可变区序列9D9-VK2和回复突变体9D9-VK12、9D9-VK13、9D9-VK14、和9D9-VK15示于图30B，且回复突变的氨基酸下面划线并且CDRs为粗体。
9D9-H16(SEQ ID NO：276)和9D9-H18(SEQ ID NO：277)的全长重链氨基酸序列和9D9-K13(SEQ ID NO：278)的全长轻链氨基酸序列示于图108。
表14：9D9重链回复突变
  克隆ID   突变(Kabat编号位置)
  9D9-VH11   WVS到LTA(47-49)、N到S(76)，L到V(78)
  9D9-VH15   WVS到LTA(47-49)
  9D9-VH16   W到L(47)
  9D9-VH17   WV到LT(47，48)
  9D9-VH18   W到L(47)和S到A(49)
表15：9D9轻(κ)链回复突变
  克隆ID   突变(Kabat编号位置)
  9D9-VK12   Y到L(36)和QL到KR(45，46)
  9D9-VK13   Y到L(36)和L到R(46)
  9D9-VK14   L到R(46)
  9D9-VK15   QL到KR(45，46)
实施例28：嵌合和人源化9D9单克隆抗体的结合活性评估
使用在实施例3中所述的方法制造并纯化嵌合9D9抗体和人源化9D9抗体。使用实施例22中所述的方法，通过流式细胞术分析数种通过配对重链变体和轻链变体而产生的人源化抗体、和对应的嵌合抗体其结合至CHO-CD52细胞(被改造为表达人类CD52的CHO细胞)表面上所表达的CD52的能力。结合数据表明，通过配对重链变体与轻链变体9D9-VK2、9D9-VK14、或9D9-VK15所产生的克隆具有降低的结合能力，而通过配对9D9-VK12或9D9-VK13轻链变体与回复突变的重链变体9D9-VH11、9D9-VH15、9D9-VH16、和9D9-VH18所产生的克隆则显示出与对应的嵌合9D9抗体相当或更好的结合。当轻链变体9D9-VK12和9D9-VK13与亲本CDR移植的重链9D9-VH10或回复突变的9D9-VH17序列配对时，结合显著降低，表明对于人源化9D9克隆，重链和轻链序列均需要被改造为具有回复突变以恢复结合能力。所选择克隆的代表性统计图(图31)比较了通过嵌合和人源化9D9抗体所检测的CD52水平。这些结果表明，当与在一个位置突变(例如，W到L，47位处)或在两个位置突变(例如，47位处W到L以及49位处S到A)的重链配对时，9D9轻链可变区中的两个氨基酸残基的回复突变(例如，位置36处Y到L，和位置46处L到R)(克隆9D9-VK13)对于恢复抗体特异性是必须的。这样，具有最少的衍生自原来的小鼠抗体的骨架残基并且显示出恢复的结合的人源化9D9克隆为9D9-VH18/K13。
实施例29：人源化抗人CD52抗体的相对结合效率的确定
使用从由商业来源(Bioreclamation，NY，USA)获得的健康捐赠者PBMCs所分离的CD4+ T细胞来评估嵌合和人源化抗CD52抗体的EC50值。使用EasySep试剂盒(Stem Cell Technologies)通过负筛而分离CD4+ T细胞。根据在实施例20中对CHO-CD52细胞所叙述的方法也使用(Stem Cell Technologies)由huCD52转基因CD1小鼠脾脏组织所分离的CD4+T细胞。简而言之，从来自健康捐赠者(Bioreclamation)的50毫升外周血分离人类CD4+ T细胞，从脾脏组织分离huCD52转基因小鼠CD4+ T细胞。将细胞以PBS/5％FBS漂洗，并以每孔1x 105个细胞沉积至圆底96孔培养板。使用各个抗CD52嵌合和人源化抗体的8点连续稀释(1∶3)以起始浓度100μg/ml而进行初级抗体染色。使用于10μg/ml(Jackson 109-096-098)二级抗体的抗人Fcγ的FITC-结合羊F(ab’)2片段。在每一次培养之前和之后将细胞在冰-冷PBS/5％FBS中洗涤3次。使用含有2％的无甲醇多聚甲醛的PBS固定细胞，并用流式细胞计数法对其评估。流式细胞数据使用Graph pad Prizm软件分析，以确定95％置信区间的EC50值。基于抗CD52抗体对由人类PBMCs所分离的CD4+ T细胞以及对由人类CD52转基因小鼠的脾脏组织所分离的CD4+ T细胞的结合，得到结合曲线(图32A、32B、32C)并对EC50值进行评估，示于图33。所有抗体对人类CD4+ T细胞和对由人类CD52转基因小鼠所分离的CD4+ T细胞显示出相似的结合特性。结合数据显示人源化抗体具有与其亲本嵌合抗体相当或更好的结合亲合性，表明在人源化时结合亲合性被保留或改进。人源化2C3和12G6抗体相对于Campath-1H
Figure BDA0000130072490001211
抗体具有低至少两倍的EC50值(如通过此细胞结合检定所检测)。
实施例30：人源化抗CD52抗体结合至限定的淋巴细胞群的评估
使用在以上实施例7中针对嵌合抗CD52抗体所叙述的方法，对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001221
(C1H)和人源化2C3(2C3-SFD1/K12)、9D9(9D9-H16/K13和9D9-H18/K13)、和12G6(12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12)抗体结合至正常提供者PBMCs中的各种PBMC亚型进行评估。使用多种荧光染剂结合抗体来进行流式细胞分析。抗-CD27-PE、抗-CD19和抗-CD11c-PE Cy5、抗-CD56和抗-CD123-PECy7、抗-CD 16-APC Cy7、和CD4-APC从BD Biosciences(San Diego，CA)获得，而抗-CD54RA-ECD以及抗-HLA-DR-ECD则从BeckmanCoulter获得。抗-CD3-Pacific Blue、抗-CD8及抗-CD14-Pacific Orange、以及抗-CD4-APC cy5.5从Invitrogen(CA)获得。所有的人源化抗人CD52抗体(9D9-H18/K13、9D9-H16/K13、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、及2C3-SFD1/K12)以及Campath-1H都结合至FITC。健康人类外周血单核细胞或是从冷藏保存的淡黄色层(buffy coats)获得，或是来自于由从商业供应商(Bioreclamation，NY，USA)获得的正常捐赠者的血液所分离的单核细胞，如在以上实施例7中所叙述。为了富集单核细胞，使用无菌的磷酸缓冲盐水(PBS)以1∶1稀释人类外围血，并小心地将其叠加于聚蔗糖-泛影葡胺(GE HealthcareBio-Sciences，Uppsala，Sweden)之上，并于室温离心30分钟。取出单核细胞的相间层，并在含有5％胎牛血清(FACS缓冲液)的PBS中洗涤。污染的红血球细胞(RBCs)使用RBC裂解溶液(Sigma，St.Louis，MO，USA)裂解。使细胞在冷FACS缓冲液中重悬，并使用40微米过滤器移除碎屑。进行多色流式细胞术，以对人源化抗人CD52抗体2C3(2C3-SFD1/K12)、9D9(9D9-H16/K13和9D9-H18/K13)和12G6(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12)相较于Campath-1H
Figure BDA0000130072490001223
的结合能力进行评估。
简而言之，将1x 106个PBMCs于FACS缓冲液的重复物与抗体的预先滴定稀释液的混合物一起培养，以检查淋巴细胞或骨髓样的衍生细胞。淋巴细胞混合物包含针对CD3、CD27、CD45RA、CD56、CD19、CD8、CD4、和CD16的抗体。定义髓样细胞群的抗体混合物，包含针对HLA-DR、CD11c、CD123、CD4、和CD14的抗体。在每一个混合物中，抗CD52抗体中的一种以10μg/ml的浓度包含。在4℃下对细胞染色30分钟，将其洗涤，并在含有1％多聚甲醛的PBS中固定。在BDLSR II流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)上得到100,000个染色细胞，并使用FlowJo 7.2版软件(Tree Star，Inc，Oregan，USA)对数据进行分析。具有明显的表型特征的多个亚型已在B和T淋巴细胞之间限定，并且已经显示CD52在所有人类淋巴细胞上表达。进行多色流式细胞分析以鉴定淋巴细胞亚型，和评估人源化抗CD52抗体在对所限定亚型上的细胞表面CD52的结合特征方面的相似点和不同点。使用标记组合，先确定出对应于B、T、NK及抗原呈递细胞系的表型明显的细胞群。对染色强度进行评估，其对应于人源化抗CD52抗体检测各种确定的细胞群上CD52表达的能力，并将其与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001231
的染色强度相比较。统计图(图34)比较了通过各种抗体在各个类群上所检测的CD52水平。结果显示，所有的人源化抗CD52抗体以相似程度结合至细胞表面CD52。而且，对于细胞表面CD52的检测水平，在Campath-1H与人源化抗CD52抗体之间没有观察到差别。在六种不同供体上进行分析。使用衍生自一种供体的细胞所得到的代表性数据示于图34。使用来自其它供体的细胞观察到类似的结合形式。
实施例31：嵌合和人源化7F11单克隆抗体的ADCC活性评估
对人源化和嵌合7F11抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。使用如在上文实施例6中所叙述的方法进行ADCC检定。简而言之，将改造为表达CD52蛋白的CHO K1细胞(CHO-CD52)用来作为靶细胞。使用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)于37℃对该靶细胞标记2-3小时。洗涤该细胞，将其在具有10％FCS的RPMI 1640介质中重悬，并与IgG对照抗体、嵌合7F11抗体、或人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2或7F11-SFD2/K2)以范围为从5μg/ml至0.01μg/ml的各种浓度混合。将使用NK细胞分离试剂盒(Stem CellTechnologies)从PBMCs中分离的人类NK细胞用来做为效应细胞，并以1∶5的靶细胞比效应细胞的比例加入。在2-6小时培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MicroBeta Trilux ScintillationCounter(Wallac，Gaithersburg，MD)中对其计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr总量，且裂解百分率如下计算：[(样品c.p.m.-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。图35说明用于该检定中的对照IgG、嵌合7F11抗体、和人源化7F11抗体的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，相对于嵌合7F11抗体，人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)介导与之相当的或者略好的ADCC杀伤。对照IgG1同种型在所测试浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例32：嵌合和人源化7F11单克隆抗体的CDC活性评估
对人源化和嵌合7F11抗体介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力进行评估。使用如在上文实施例5中对于嵌合抗CD52抗体所叙述的方法来进行CDC检定。简而言之，将改造为表达CD52蛋白的CHO K1细胞(CHO-CD52)用来作为靶细胞，并用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)于37℃对其标记2-3小时。洗涤该细胞，将其在RPMI 1640介质中重悬，并与IgG对照抗体、嵌合7F11抗体、或人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2或7F11-SFD2/K2)以范围为从20μg/ml至500ng/ml的各种浓度混合。加入人类补体(Sigma)至实验孔中至达到10％的最终浓度。在1-5小时培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MicroBetaTrilux Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中对其计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr总量，且裂解百分率如下计算：[(每分钟样品数(c.p.m.)-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。图36说明用于该检定中的对照IgG、嵌合7F11抗体、和人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，嵌合7F11抗体与人源化抗体7F11-SFD1/K2介导同等的杀伤，而相对于嵌合7F11抗体，人源化抗体7F11-SFD2/K2介导显著更好的CDC杀伤。对照IgG1同种型抗体在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例33：嵌合和人源化2C3单克隆抗体的ADCC活性评估
对人源化和嵌合2C3抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。使用如在上文实施例6中所叙述的方法加以略微修改而进行ADCC检定。简而言之，将使用CD4+T细胞分离试剂盒(Stem CellTechnologies)从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞用来作为靶细胞。用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)于37℃对该靶细胞标记过夜。洗涤该细胞，将其在具有10％FCS的RPMI 1640介质中重悬，并与IgG对照抗体、嵌合2C3抗体、或人源化2C3抗体(2C3-SFD1/K12)以范围为从10μg/ml至100pg/ml的不同浓度混合。将从PBMCs分离的人类NK细胞(使用来自Stem Cell Technologies的NK细胞分离试剂盒)用来作为效应细胞，并以1∶5的靶细胞比效应细胞的比例加入。在2-6小时培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MicroBeta Trilux Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中对其计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr的总量，且裂解百分比如下计算：[样品c.p.m.-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。图37说明用于该检定中的对照IgG、嵌合2C3抗体、及人源化2C3抗体(2C3-SFD1/K12)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，人源化2C3抗体2C3-SFD1/K12介导与2C3嵌合抗体相当的ADCC杀伤。IgG1同种型对照在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例34：嵌合和人源化2C3单克隆抗体的CDC活性评估
对人源化和嵌合2C3抗体介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力进行评价。使用如在上文实施例5中所叙述的方法加以略微修改而进行CDC检定。简而言之，将从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞用来作为靶细胞，并用Na2 51CrO4(New England Nuclear，Boston，MA)在37℃对其过夜标记。过夜标记之后，洗涤该细胞，将其在含有10％FCS的RPMI 1640介质中重悬，并与IgG对照抗体、嵌合2C3抗体、或人源化2C3抗体(2C3-SFD1/K12)以范围为从10μg/ml至10ng/ml的不同浓度混合。向实验孔中加入人类补体(Sigma)至达到10％的最终浓度。在1-5小时培养之后，从各孔收集25微升无细胞的上层清液，并在MicroBeta Trilux Scintillation Counter(Wallac，Gaithersburg，MD)中对其计数。通过单独在介质中培养靶细胞而得到自发释出的51Cr的量。来自靶细胞的自发释出通常小于20％。通过加入1％Triton X-100至蒸馏水中而确定引入的51Cr的总量，且裂解百分率如下计算：[(每分钟样品数(c.p.m.)-自发的c.p.m.)/(总c.p.m.-自发的c.p.m.)]X 100。图38说明用于该检定中的对照IgG、嵌合2C3抗体、及人源化2C3抗体(2C3-SFD1/K12)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，嵌合2C3抗体和人源化2C3抗体(2C3-SFD1/K12)介导同等的裂解。对照IgG1同种型抗体在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例35：嵌合和人源化12G6单克隆抗体的ADCC活性评估
对人源化和嵌合12G6抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。如在上文实施例31中所述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞，并通过铬释出试验而进行ADCC检定。图39说明用于此检定中的对照IgG、嵌合12G6抗体、及人源化12G6抗体(12G6-SFD1/K11或12G6-SFD1/K12)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，相对于12G6嵌合抗体，人源化12G6抗体12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12介导与之相当的ADCC杀伤。IgG1同种型对照在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例36：嵌合和人源化12G6单克隆抗体的CDC活性评估
对人源化和嵌合12G6抗体介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力进行评估。如在上文实施例32中所叙述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞，并通过铬释出试验而进行CDC检定。图40说明用于此检定中的对照IgG、嵌合12G6抗体、及人源化12G6抗体(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，嵌合12G6抗体介导与人源化12G6抗体(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12)相当的裂解。对照IgG1同种型抗体在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例37：嵌合和人源化9D9单克隆抗体的ADCC活性评估
对人源化和嵌合9D9抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。如在上文实施例31中所叙述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞，并通过铬释出试验而进行ADCC检定。图41说明用于此检定中的对照IgG、嵌合9D9抗体、和人源化9D9抗体(9D9-H10/K13、9D9-H11/K13、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，嵌合与人源化9D9抗体(9D9-H10/K13为例外)介导相当的ADCC杀伤。IgG1同种型对照在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例38：嵌合和人源化9D9单克隆抗体的CDC活性评估
对人源化和嵌合9D9抗体介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力进行评价。如在上文实施例32中所叙述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞，并通过铬释出试验而进行CDC检定。图42说明用于此检定中的对照IgG、嵌合9D9抗体、和人源化9D9抗体(9D9-H10/K13、9D9-H11/K13、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13)的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，嵌合9D9抗体介导与人源化9D9抗体(9D9-H10/K13为例外)相当的裂解。对照IgG1同种型抗体在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例39：Campath-1H
Figure BDA0000130072490001271
和人源化抗CD52抗体对于初始T细胞的ADCC活性评估
对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001272
和人源化抗CD52抗体介导CD52表达细胞的ADCC杀伤的能力进行评估。如在上文实施例31中所叙述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞并通过铬释出试验而进行ADCC检定。图43说明用于此检定中的对照IgG、Campath-1H和人源化2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13、9D9-H18/K13、12G6-SFD1/K11、及12G6-SFD1/K12抗体的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，上述人源化2C3、9D9和12G6抗体在超过10ng/ml的浓度下介导与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001281
相当的ADCC杀伤。IgG1同种型对照在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例40：Campath-1H
Figure BDA0000130072490001282
和人源化抗CD52抗体对于初始T细胞的CDC活性的评估
对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001283
和人源化抗CD52抗体介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力进行评估。如在上文实施例32中所叙述，使用从健康捐赠者PBMCs分离的T细胞作为靶细胞并通过铬释出试验而进行CDC检定。图44说明用于此检定中的对照IgG、Campath-1H
Figure BDA0000130072490001284
和人源化2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13、9D9-H18/K13、12G6-SFD1/K11、和12G6-SFD1/K12抗体的浓度(X轴)相对于特定裂解百分比(Y轴)。结果显示，人源化2C3和12G6抗体介导与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001285
相当的CDC杀伤，而人源化9D9抗体显示出显著降低的CDC活性，与其对应的嵌合抗体相似。IgG1同种型对照在所测试的浓度下显示仅低水平的背景杀伤。
实施例41：含有抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001286
中和抗体的血清样品阻碍人源化2C3、12G6、和9D9抗CD52抗体活性的中和能力的评估
为评估在针对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001287
的中和抗体的存在下人源化抗体结合至CD52表达细胞的能力，将抗CD52抗体(Campath-1H
Figure BDA0000130072490001288
2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13和12G6-SFD1/K12)与含有抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001289
抗体反应性的人类血清反应，并评估其对于CD52表达的Raji细胞的结合。从加入CAMMS223研究(The CAMMS223 TrialInvestigators，“Alemtuzumab vs.interferon Beta-1a in early multiplesclerosis，”N Engl J Med 359：1786-1801(2008))的复发缓解型多发性硬化症病人所得到的血清样品被用于此检定中。在大多数病人中，Campath-1H
Figure BDA00001300724900012810
抗体的重复给药引起抗Campath-1H抗体反应的产生。在大多数病人中，抗Campath-1H
Figure BDA00001300724900012812
抗体滴度在第12个月非常低，并在第二周期的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001291
给药时显著增加，在第13个月于血清中产生高滴度抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001292
反应。使用从五个不同的MS病人(MS-1至MS-5)(该五个病人已经按照CAMMS223步骤流程使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001293
治疗)获得的第12个月和第13个月的血清样品进行抗CD52抗体中和试验。在不存在或存在一系列的从已使用Campath-1H治疗的病人获得的血清稀释液的条件下，使用结合有FITC的抗CD52抗体Campath-1H
Figure BDA0000130072490001294
2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K12、和9D9-H16/K13(用于实施例30中，并且已经显示其结合至CD52表达细胞)对表达人类CD52的Raji细胞进行染色。简而言之，将MS病人血清样品(第12个月和第13个月)制成6倍连续稀释物，并与10μg/ml的结合有FITC的抗CD52抗体(Campath-1H
Figure BDA0000130072490001295
2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K12、和9D9-H16/K13)于37℃一起培养1小时。将Raii细胞用包含HBSS、5％FBS、和0.1％叠氮化物的染色缓冲液进行漂洗，接着以每孔1x 105个细胞使其沉积至圆底96孔培养板。使用10μg/ml的人类IgG Fc片段在染色缓冲液中在冰上封闭(block)细胞30分钟。接着用染色缓冲液洗涤细胞，并且如上所述，在100微升的抗体-血清混合物中重新悬浮。在冰上30分钟之后，洗涤细胞并用BD Cytofix固定细胞，并使用FACSCalibur系统(Becton Dickinson)对经FITC标记的抗体覆盖的细胞进行分析，之后使用FlowJo version 7.2软件(Tree Star，Inc，Oregon，USA)分析数据。在血清中在抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001296
中和抗体的存在下结合有FITC的抗CD52抗体的结合通过流式细胞计数法来评估，作为对抑制的检测，相对于对照的结合百分比计算为(具有血清的MFI/MFI对照组(无血清))乘以100。来自于提供者(MS-1)其中一个的代表性数据示于图45。X轴表示血清稀释因子，且Y轴表示对照结合百分比作为抗体中和活性的检测。数据清楚地显示第12个月的血清样品对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001297
或其它抗CD52抗体不具有抑制作用，表明血清中存在较低或不存在抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001298
阻断抗体。第13个月的血清样品即使在血清的1∶1000稀释下仍然介导对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001299
结合的完全抑制，但即使在所测试的最高浓度(1∶24稀释)下也不介导对2C3、12G6、和9D9人源化抗CD52抗体的抑制。五个病人中的两个发展出大于1∶1000的抗Campath-1H
Figure BDA00001300724900012910
中和抗体滴度，而三个其它病人具有约1∶100的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001301
中和抗体滴度。即使这些病人中的两个的第13个月的血清对于Campath-1H具有大于1∶1000的相对高的中和抗体滴度，这些血清并不抑制人源化2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K12、和9D9-H16/K13抗体的结合，表明在使用Campath-1H治疗的病人中抗Campath-1H
Figure BDA0000130072490001304
抗体反应性不会阻断这些人源化抗体对存在于细胞上的CD52的结合。
实施例42：huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖分析(4B10-H1/K1)
在huCD52转基因小鼠中检视Campath-1H和人源化抗CD52抗体(4B10-H1/K1)在不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1、0.5、1.0或5.0mg/kg的各种抗体。给药之后两小时，收集血清以检查循环细胞因子的水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠中的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)和骨髓样的细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以测定总体消减效果。保持小鼠(N＝5)部分活着以监测再增殖动力。消减在T细胞部分最多，且CD4+ T细胞被消减最多，接着为CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞、及其它髓样细胞。在CD4+ T细胞部分内，幼稚
Figure BDA0000130072490001306
CD4+T细胞消减最多，接着为CD4+中枢记忆性(CM)、CD4+效应记忆性(EM)、及CD4+调节T细胞(Treg)。对于CD8+ T细胞(幼稚性的＞CM＞EM)也观察到相似的方式。相反地，成熟B细胞相较于未成熟B细胞以更高的程度消减。经Campath-1H治疗的小鼠与经4B10-H1/K1治疗的小鼠的比较在各个所测试的剂量下在血液和脾脏中显示出相似的细胞式样(pattern)。
血清细胞因子分析显示出TNFα、IL-6及MCP-1的剂量依赖性增长。相较于未经治疗的小鼠，在0.5mg/kg的剂量下这些细胞因子的循环水平维持升高，并且在0.1mg/kg下也如此。在三个最高剂量下在Campath-1H治疗组中也观察到IL-10有略微增加，但对于人源化4B10-H1/K1治疗组仅在最高剂量观察到略微增加。在循环IL-12或IFNg(未示出)水平方面没有注意到显著增加。给药之后50-60天，除了1.0mg/kg组，在所有Campath-1H
Figure BDA0000130072490001311
给药组中淋巴细胞水平回到未经治疗的小鼠的水平。在1.0mg/kg组，给药之后80天淋巴细胞回到正常水平。对于经人源化4B10-H1/K1抗体治疗的小鼠，也观察到类似的再增殖动力学。在所有经4B10-H1/K1治疗组中在给药之后50天，除了0.5mg/kg水平以外，淋巴细胞回到对照水平。0.5mg/kg组中的循环淋巴细胞水平在监测期间的过程中自始至终保持减少。监测血液中的整体淋巴细胞的再增殖。
图46A-46E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001312
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图47A-47E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001313
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图48A-48E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001314
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子水平。图49A-49B显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001315
(“Campath”)和人源化4B10-H1/K1(“4B10”)抗体给药之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
实施例43：在huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖分析(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)
在huCD52转基因小鼠中检视人源化抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)在不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1、0.5、1.0或5.0mg/kg的各种抗体。给药之后两小时，收集血清以检查循环细胞因子水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)和骨髓样的细胞亚群的相对数目。此外，进行T和B细胞亚型分析以测定整体消减效果。保持部分小鼠(N＝5)活着以监测再增殖动力学。所有剂量下各种人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)的给药引起血液中显著数目的T细胞和B细胞消减。这些数据也显示各种T和B细胞亚型依据所使用的抗体剂量以不同程度消减。幼稚性
Figure BDA0000130072490001321
T细胞(CD4与CD8二者)显示出最多的消减，且其它细胞群(包括记忆性和T调节细胞)较少程度地消减。在B细胞部分，成熟B细胞相较于未成熟B细胞消减更快。在脾脏中，观察到剂量依赖性的消减，在5和1mg/kg剂量水平下观察到显著的淋巴细胞消减。与在血液中的情况相似，幼稚性T细胞相较于记忆细胞消减更快。使用人源化7F11克隆(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)的各个，B细胞相较于T细胞以较低程度消减。在注射的任意剂量下，在血液或脾脏中对于NK细胞或嗜中性粒细胞没有观察到消减。血清细胞因子分析显示出对于TNFα和IL-6二者的剂量依赖性增长。相较于未经治疗的小鼠，在0.5mg/kg以及在0.1mg/kg剂量下这些细胞因子的水平也保持升高。也观察到循环MCP-1水平的剂量依赖性增加。
给药之后30天，在0.5和0.1mg/kg给药组中淋巴细胞水平回到未经治疗小鼠的水平。在1.0和5.0mg/kg组，对于克隆7F11-SFD1/K2，淋巴细胞分别经过给药之后50和80天回到正常水平，并且对于克隆7F11-SFD2/K2的1.0和5.0mg/kg组，淋巴细胞均经过给药之后80天回到正常水平。对整体淋巴细胞监测其在血液中的再增殖。
图50A-50E显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图51A-51E显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11 SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图52A-52F显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后2小时的循环细胞因子水平。图53A-53B显示在使用人源化7F11-SFD1/K2(“7F11SFD1”)和7F11-SFD2/K2(“7F11 SFD2”)抗体给药之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
实施例44：在CD52转基因小鼠中7F11人源化抗CD52抗体的分析(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)
在huCD52转基因小鼠中检视嵌合7F11抗体和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001331
相较的消减活性。对小鼠静脉内注射1.0mg/kg的各种抗体。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)和骨髓样的细胞亚群的相对数目。施用Campath-1H引起血液和脾脏中显著数目的T细胞和B细胞消减。虽然对于嵌合和人源化7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)，在血液中均观察到可比较的水平的T细胞消减，但B细胞较少程度地消减。此观察在脾脏中亦为明显，在这里使用7F11抗体(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)，注意到显著的T细胞消减，但仅达到中度水平的B细胞消减。
图54A-54B显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001333
(“Campath”)、7F11-嵌合抗体、和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。
实施例45：在CD52转基因小鼠中抗CD52抗体的PK特性分析(7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2)
为确保人源化过程不会改变抗体的清除速率，在huCD52转基因小鼠中对嵌合7F11抗CD52抗体和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗CD52抗体的药物动力学特性进行测定。对小鼠静脉内注射5mg/kg的抗体，并在开始于给药之后两小时的多个时间点收集血液。使用抗人IgG ELISA评估各种抗体的循环水平。对于各个人源化克隆，在给药之后两小时观察到Cmax中存在些微差别。在实验进行期间，嵌合7F11抗体和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体的清除速率彼此相似，并与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001334
类似，表明人源化过程不会显著改变抗体的药物动力学特性。
图55显示在给药之后血液中的Campath-1H(“Campath”)、7F11-嵌合抗体及人源化7F11-SFD1/K2和7F11-SFD2/K2抗体在一段时间内的水平。
实施例46：在huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖的分析(2C3-SFD1/K12)
在huCD52转基因小鼠中检视2C3-SFD1/K12克隆在不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1、0.5、1.0或5.0mg/kg抗体。给药之后两小时，收集血清以潜在地检测循环细胞因子的水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及骨髓样的细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以确定整体消减效果。保持部分小鼠(N＝5)活着以监测再增殖动力学。以5、1、和0.5mg/kg剂量施用2C3-SFD1/K12引起血液中显著数目的T细胞和B细胞消减。在0.1mg/kg剂量下在血液中观察到不同水平的淋巴细胞消减，且CD4+ T细胞和B细胞相较于CD8+ T细胞更大程度地消减。这些数据也证实各种T和B细胞亚型根据所使用的抗体剂量有不同程度的消减。幼稚性T细胞(CD4与CD8两者)相比于其它细胞群(包括记忆性和T调节细胞)显示出最大消减，其它细胞群较少程度地消减。在B细胞部分中，成熟B细胞相较于未成熟B细胞消减更快。在脾脏中，观察到剂量依赖性的消减，在5和1mg/kg剂量水平下观察到显著的淋巴细胞消减。与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001341
相似，幼稚性T细胞比记忆细胞消减更快。在注射的任意剂量下，在血液中观察到NK细胞和嗜中性粒细胞消减，但是在脾脏中观察到些微或没有消减。血清细胞因子分析显示出TNFα和IL-6的剂量依赖性增加，且5mg/kg剂量诱发各细胞因子的最高水平。对于TNFα，在0.5和0.1mg/kg剂量水平下观察到可与未经治疗的小鼠相比较的水平，对于IL-6则在0.1mg/kg剂量水平下观察到可与未经治疗的小鼠相比较的水平。也观察到循环MCP-1水平的剂量依赖性增加。
给药之后30天，对于0.1和0.5mg/kg组，淋巴细胞水平回到未经治疗小鼠的水平。在1.0和5.0mg/kg组中，给药之后80天淋巴细胞回到正常水平。对整体淋巴细胞监测其在血液中的再增殖。
图56A-56E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图57A-57E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图58A-58F显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。图59显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
实施例47：在huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖分析(12G6-SFD1/K11)
在huCD52转基因小鼠中检视12G6-SFD1/K11克隆在不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1、0.5、1.0或5.0mg/kg的抗体。给药之后两小时，收集血清以潜在地检查循环细胞因子的水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及骨髓样的细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以测定整体消减效果。保持部分小鼠(N＝5)活着以监测再增殖动力学。以5、1、和0.5mg/kg剂量施用12G6-SFD1/K11引起血液中显著数目的T细胞和B细胞消减。在0.1mg/kg剂量下，在血液中观察到不同水平的淋巴细胞消减，且CD4+T细胞和B细胞相较于CD8+T细胞以较大程度消减。这些数据也显示各种T细胞和B细胞亚型根据所使用的抗体剂量而不同程度地消减。幼稚性T细胞(CD4与CD8二者)相比于其它细胞群(包括记忆和T调节细胞)显示出最大消减，其它细胞群较少程度地消减。在B细胞部分中，成熟B细胞相较于未成熟B细胞消减更快。在脾脏中，观察到剂量依赖性的消减，在5mg/kg和1mg/kg剂量水平下观察到显著的淋巴细胞消减。与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001351
相似，幼稚性T细胞相较于记忆细胞消减更快。在任意注射的剂量下，在血液中观察到NK细胞和嗜中性粒细胞消减，但是在脾脏中观察到些微或没有消减。血清细胞因子分析显示出对于TNFα和IL-6两者的剂量依赖性增加，且5mg/kg剂量诱发各细胞因子的最高水平。对于TNFα，在0.5和0.1mg/kg剂量水平下观察到可与未经治疗的小鼠相较的水平，对于IL-6则在0.1的mg/kg剂量水平下观察到可与未经治疗的小鼠相较的水平。也观察到循环MCP-1水平的剂量依赖性增加。
给药之后30天，淋巴细胞水平回到未经治疗小鼠的水平。在1.0和5.0mg/kg组中，给药之后80天淋巴细胞回到正常水平。对整体淋巴细胞监测其在血液中的再增殖。
图60A-60E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及B220+ B细胞的水平。图61A-61E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图62A-62F显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6hu”)抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。图63显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
实施例48：在CD52转基因小鼠中抗CD52抗体的PK特性分析(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11及9D9-H10/K12)
在huCD52转基因小鼠中测定抗CD52抗体的药物动力学特性。此实验比较人源化和嵌合形式的抗体，以确保人源化过程不会改变抗体的清除速率。该比较包括嵌合2C3、12G6、和9D9抗体及人源化2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、和9D9-H10/K12抗体。对小鼠静脉内注射5mg/kg的抗体，并在开始于给药之后两小时的多个时间点收集血液。使用抗人IgG ELISA来评估各抗体的循环水平。对所分析的各个嵌合/人源化抗体对，在给药之后两小时注意到Cmax中有些微差别。对于2C3和12G6抗体，人源化抗体(即，2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K11)的Cmax略高，而对于9D9对而言，嵌合抗体略高。在实验进行期间抗体对的清除速率相似，表明人源化过程不会显著改变抗体的药物动力学特性。
图64A-64C显示给药之后血液中2C3-嵌合、2C3-SFD1/K12、12G6-嵌合、12G6-SFD1/K11、9D9-嵌合、及9D9-H10/K12抗体在一段时间内的水平。
实施例49：在huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖分析(9D9-H10/K12)
在huCD52转基因小鼠中检视9D9-H10/K12克隆于不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1、0.5、1.0或5.0mg/kg的抗体。给药之后两小时，收集血清以潜在地检查循环细胞因子的水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠(N＝5)收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来测定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及骨髓样的亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以确定整体消减效果。保持部分小鼠(N＝5)活着以监测再增殖动力学。以5、1、和0.5mg/kg剂量施用9D9-H10/K12引起血液中显著数目的T细胞和B细胞消减。在0.1mg/kg剂量下在血液中仅观察到中度水平的淋巴细胞消减。这些数据也表明各种T和B细胞亚型根据所使用的抗体剂量以不同程度消减。幼稚性T细胞(CD4与CD8两者)相比于其它细胞群(包括记忆性和T调节细胞)显示出最大消减，其它细胞群较少程度地消减。在B细胞部分中，成熟B细胞相较于未成熟B细胞消减更快。在脾脏中，仅仅在5和1mg/kg剂量水平下观察到这些细胞的显著消减。与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001371
相似，幼稚性T细胞比记忆细胞消减更快。在注射的任意剂量下，在血液中观察到NK细胞和嗜中性粒细胞消减，但是在脾脏中观察到些微或没有消减。血清细胞因子分析显示TNFα或IL-6在所分析的任意剂量水平下没有显著增加。然而，观察到循环MCP-1水平的剂量依赖性增加。
此实验的再增殖部分早在淋巴细胞50％至80％再增殖(依据剂量而定)时结束。基于总淋巴细胞数目而非以T细胞和B细胞为基准对淋巴细胞再增殖进行监测。
图65A-65E显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图66A-66E显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞的水平。图67A-67F显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。图68显示在使用9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
实施例50：在huCD52转基因小鼠中抗CD52抗体的消减和再增殖分析(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11和9D9-H10/K12)
在huCD52转基因小鼠中检视Campath-1H
Figure BDA0000130072490001381
和人源化2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11及9D9-H10/K12克隆于不同剂量水平下的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1或1.0mg/kg的抗体。给药之后两小时，收集血清以潜在地检查循环细胞因子水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来确定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及骨髓样细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以确定整体消减效果。当与经PBS处理的动物相比较时，所有人源化抗体(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11及9D9-H10/K12)在脾脏和血液内介导淋巴细胞消减。对于所有抗体而言，血液中的消减比在脾脏中的消减更为稳健，并且在两种组织中消减均是剂量依赖性的。对于CD4和CD8+ T细胞的消减最为显著，且在B细胞部分具有较少的消减。各种T细胞和B细胞亚型不同程度地消减。幼稚性T细胞(CD4与CD8二者)相比于其它细胞群(包括记忆性和T调节细胞)显示出最大消减，该其它细胞群较少程度地消减。在B细胞部分中，成熟B细胞比未成熟B细胞消减更快。血清细胞因子分析显示在给药之后2小时IL-6、MCP-1及TNF α水平的显著增加。对于所有抗体(包括Campath-1H
Figure BDA0000130072490001382
)均观察到增加，并且该增加是剂量依赖性的(即相对于0.1mg/kg剂量下观察的细胞因子水平，对于1.0mg/kg剂量水平观察到较高的细胞因子水平)。与Campath-1H相比，2C3-SFD1/K12与12G6-SFD1/K11引发相似的IL-6水平，而9D9-H10/K12以显著较低的水平引发IL-6。对于MCP-1而言，12G6-SFD1/K11抗体诱发较低水平，与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001384
相较而言，12G6-SFD1/K11与9D9-H10/K12均降低TNF α水平。
图69A-69D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001385
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、12G6-SFD1/K11(“12G6”)、及9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时的血液中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞)及CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+B/NK细胞子型的水平。图70A-70D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001391
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、12G6-SFD1/K11(“12G6”)、及9D9-H10/K12(“9D9”)抗体给药之后72小时的脾脏中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞)及CD4+ T细胞、CD8+T细胞和B220+ B/NK细胞亚型的水平。图71A-71F显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001392
2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、和9D9-H10/K12抗体给药之后2小时的循环细胞因子水平。
实施例51：在huCD52转基因小鼠中抗huCD52的人源化9D9克隆的直接比较(9D9 H10/K12和9D9 H11/K12)
在huCD52转基因小鼠中检视两种人源化抗CD52的9D9克隆(9D9-H10/K12和9D9-H11/K12)的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1或1.0mg/kg抗体。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来确定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及NK细胞亚群的相对数目。使用任一种抗体的处理在血液和脾脏中引起类似的淋巴细胞消减，且淋巴细胞消减在血液中更为稳健。而且，在两种组织中CD4和CD8+T细胞比B细胞和NK细胞更强烈地消减。虽然使用9D9-H10/K12克隆的消减相对于使用9D9-H11/K12克隆的消减看起来较不稳健，但此差别并非统计上显著的。
图72显示在使用9D9-H10/K12和9D9-H11/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK细胞的水平。图73显示在使用9D9-H10/K12和9D9-H11/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK细胞的水平。
实施例52：在huCD52转基因小鼠中抗huCD52的人源化12G6克隆的直接比较(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1-K12)
在huCD52转基因小鼠中检视两种人源化抗CD52的12G6克隆(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12)的消减活性。对小鼠静脉内注射0.1或1.0mg/kg的抗体。给药之后两小时，收集血清以潜在地检查循环细胞因子水平。给药之后三天，处死小鼠，并从每一只小鼠收集血液和脾脏，以使用流式细胞术分析来确定细胞消减水平。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及髓样细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以确定整体消减效果。施用12G6-SFD1/K11抗体或12G6-SFD1/K12抗体导致血液内显著水平的淋巴细胞消减。该两株克隆的淋巴细胞消减活性看起来存在些微或是没有差异。淋巴细胞消减的方式为，幼稚性CD4和CD8+ T细胞相比于记忆T细胞或T调节细胞以更高程度消减。不论克隆(12G6-SFD1/K11或12G6-SFD1/K12)或是剂量，髓样细胞群较少程度地消减。此实验未进行血清细胞因子分析。
图74A-74D显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6 K11”)和12G6-SFD1/K12(“12G6 K12”)抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、和髓样细胞的水平。图75A-75D显示在使用12G6-SFD1/K11(“12G6 K11”)和12G6-SFD1/K12(“12G6K12”)抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、及髓样细胞的水平。
实施例53：在huCD52转基因小鼠中抗huCD52人源化9D9克隆的直接比较(9D9 H11/K12、9D9 H16/K13、和9D9 H18/K13)
在huCD52转基因小鼠中比较三种人源化9D9抗体(9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)的消减活性。人类CD52转基因小鼠以PBS处理作为媒介物对照组，或者用1mg/kg或0.1mg/kg的各种抗体对其注射。给药之后两小时，收集血清以测定循环细胞因子水平。给药之后三天，处死小鼠，并收集和处理外周血和脾脏，以进行流式细胞术分析。对样品进行评价，以测定存在于huCD52转基因小鼠的循环外周血或脾脏中的全部T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(CD8+)、B细胞(B220+)及髓样细胞亚群的相对数目。此外，进行T细胞和B细胞亚型分析以确定整体消减效果。所有9D9(9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)抗体以相似的程度介导血液和脾脏中的淋巴细胞和髓样细胞群的细胞消减。在血液中观察到比在脾脏中观察到的更为稳健的淋巴细胞和髓样细胞消减。9D9克隆(9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)的消减活性比较显示，9D9-H16/K13引起最稳健的消减，接着为9D9-H18/K13和9D9-H11/K12。此结果在1mg/kg剂量下对于脾脏中淋巴细胞最为明显，其中9D9-H16/K13处理相对于任何其它克隆(9D9-H18/K13和9D9-H11/K12)引起更高程度的消减。而且，消减方式为，幼稚性CD4和CD8+ T细胞比记忆T细胞或T调节细胞更高程度地消减，并且使用9D9-H16/K13时B细胞群以更高水平消减。髓样细胞群受抗CD52处理的影响较小，无论抗体克隆(9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、或9D9-H18/K13)或剂量。所分析的细胞因子中，观察到IL-6、TNFα和MCP-1上升。注射后，对于所有的9D9克隆(9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)在0.1和1.0mg/kg的剂量水平下均观察到相似循环水平的IL6和MCP-1。对于循环TNFα水平观察到些微差别，其中以1.0mg/kg剂量注射9D9-H16/K13克隆引起中度的增加。
图76显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+T细胞和B220+ B细胞)的水平。图77A-77D显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、及髓样细胞亚型的水平。图78显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞)的水平。图79A-79D显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、和髓样细胞亚型的水平。图80A-80F显示在使用9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、和9D9-H18/K13抗体给药之后2小时的循环细胞因子水平。
实施例54：在CD52转基因小鼠中来自2C3、12G6、和9D9家族的抗CD52抗体的PK特性分析
在huCD52转基因小鼠中测定人源化2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13及9D9-H18/K13的药物动力学特性。对小鼠静脉内注射1mg/kg的抗体，并在开始于给药之后两小时的多个时间点收集血液。使用抗人Ig ELISA评估各种抗体的循环水平。计算的半衰期为：2C3-SFD1/K1279.0±23.9小时，12G6-SFD1/K1149.0±14.4小时，12G6-SFD1/K1275.1±28.5小时，9D9-H16/K1359.8+26.6小时以及9D9-H18/K1342.2+15.7小时。
整体而言，在这些研究中存在显著的动物间暴露差异性。2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12的末端消除半衰期相似，而12G6-SFD1/K11的半衰期较短但没有显著不同。2C3-SFD1/K12的清除作用为最快速的，接着为12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12。对大部分所测量的时间点而言，该两种12G6处理彼此反映，而2C3-SFD1/K12显示出较少的暴露和较快的清除。对于所有所测量的PK参数，9D9-H16/K13和9D9-H18/K13是非常相似的。
图81A-81B显示给药之后血液中2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13和9D9-H18/K13抗体在一段时间内的水平。
表16
Figure BDA0000130072490001421
实施例55：对响应于使用抗CD52抗体处理的细胞因子风暴(storm)的评估
在huCD52转基因小鼠中对使用抗CD52抗体处理之后血清细胞因子的释出进行评估。对动物使用1mg/kg的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001431
12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13进行处理。鉴于先前的结果显示使用2C3-SFD1/K12注射相比于其它抗体可引起较低的消减水平，对一组动物使用5mg/kg的2C3-SFD1/K12处理，从而基于达到相似的消减水平所需的剂量来使该组动物正常化(normalizing)。在处理后12、4、24、和48小时，对所有组放血并对炎性细胞因子进行CBA分析。在处理后3天处死所有组，并通过流式细胞术对脾脏针对脾脏中的淋巴细胞消减进行评估。使用各种抗体的处理引起各种靶标的消减与使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001432
所观察到的相似。此结果对于2C3-SFD1/K12也成立，其中使用5mg/kg剂量以引起类似的消减作用。使用12G6-SFD1/K12和9D9-H16/K13观察到消减中的一些变化，其大部分可能是因为动物的重复取血以得到血清用于细胞因子分析。然而，对于来自12G6(12G6-SFD1/K11和12G6-SFD1/K12)及9D9(9D9-H16/K13和9D9-H18/K13)家族成员的抗体而言，细胞因子表达减少。此结果在早期1小时和2小时时间点对于IL-6、MCP-1和TNFα的释出为最显著的。
图82A-82F显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001433
(“Campath”)、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13抗体给药之后在48小时期间内血液中的细胞因子水平。图83A-83E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001434
(“Campath”)、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13抗体给药之后72小时在脾脏中的总体淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、和髓样细胞的水平。
实施例56：使用抗CD52抗体处理之后的CD52转基因小鼠血液中的再增殖动力评估
在施用人源化抗CD52的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体之后对血液中数种细胞类型的再增殖动力学进行评估。对小鼠静脉内注射2mg/kg的各种抗体，以确保稳健的消减水平。在注射后的多个时间点，收集血液以进行流式细胞分析，以测定血液中的循环淋巴细胞水平，包括CD4+和CD8+T细胞、调节T细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞。对于各种抗体在初始消减活性方面未观察到差别，该结果在注射后第三天被证实。在第一个月对小鼠每周抽血并在之后每两周对其抽血，以监测再增殖动力。与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001441
相较，对于任一种抗CD52(2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12)抗体的淋巴细胞再增殖动力学相似。到第57天，B细胞回到血液中的基线，而T细胞到第84天接近基线水平。到第116天，CD8+ T细胞尚未回到对照水平，但是使用抗CD52(2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12)抗体和Campath-1H中的每一个，对于所有被监测的其它细胞类型均观察到类似的再增殖动力学。
图84A-84G显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001443
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后，循环CD4+和CD8+ T细胞、调节T细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞在一段时间内的再增殖。
实施例57：使用抗CD52抗体对CD52转基因小鼠中CD52表达的评估
使用人源化抗CD52抗体评估huCD52的表达，以确定在huCD52转基因小鼠中对成熟和发展中的细胞群是否会观察到类似的染色模式。2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体结合有FITC以用于流式细胞染色。收集来自huCD52转基因小鼠的组织并对其处理以染色。与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001444
相似，2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体使来自转基因小鼠脾脏的表达huCD52的淋巴细胞被染色。该染色模式于其它淋巴器官(例如胸腺和骨髓)中发现的淋巴细胞群和亚群是有代表性的。
图85显示FITC标记的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001445
2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体在脾脏中特异性地结合至huCD52淋巴细胞群的能力。
实施例58：在huCD52转基因小鼠中使用抗huCD52单剂量处理的直接比较
在huCD52转基因小鼠中比较数种人源化抗CD52抗体(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)的消减活性。对小鼠静脉内注射1mg/kg的抗体。给药之后两小时，收集血清以进行细胞因子分析。三天后，处死小鼠并收集血液和脾脏以比较淋巴细胞消减水平。对于所有的抗CD52抗体(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)都观察到显著水平的B细胞和T细胞消减，并且该消减与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001451
给药之后所观察到的那些是可相比的。亚型分析也显示在血液或脾脏中对于各种抗体(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)的消减水平没有显著差别。在注射Campath-1H
Figure BDA0000130072490001452
之后，IL-6和TNFα二者的循环水平有显著增加。虽然相对于Campath-1H
Figure BDA0000130072490001453
各种抗CD52抗体(2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13)的注射引起TNFα的水平显著减少，但IL-6的水平相似。
图86A-86E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001454
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和B220+ B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、及髓样细胞亚型的水平。图87A-87E显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001455
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时脾脏中的总体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B220+ B细胞)和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B/NK细胞、及髓样细胞亚型的水平。图88A-88C显示在使用Campath-1H(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
实施例59：使用抗huCD52抗体单剂量处理之后huCD52转基因小鼠中淋巴细胞的深度消减(In Depth Depletion)
使用抗CD52的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体在huCD52转基因小鼠中进行广泛消减(extensive depletion)分析。对小鼠(N＝4)以1mg/kg静脉内注射单剂量的各种抗体。三天后，处死小鼠，并收集血液、脾脏、淋巴结及胸腺，以使用多色流式细胞分析来比较淋巴细胞消减水平。对于所有抗CD52的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体，都观察到显著水平的B细胞和T细胞消减，并且该消减与在检查的各组织中经Campath-1H
Figure BDA0000130072490001461
给药之后所观察到的那些是可比较的。亚型分析也显示在血液或脾脏中各种抗体的消减水平没有显著差别。在小鼠的淋巴结中也观察到显著水平的淋巴细胞消减。然而，在抗体活性方面显示出有一些差异度，特别是在注意到中枢和效应记忆性T细胞亚型时。因为关于LSR-II和CD8染色的技术问题，不能对胸腺进行评估。
图89A-89D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001462
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/髓样细胞亚型的水平。图90A-90D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001463
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/髓样细胞亚型的水平。图91A-91D显示在使用Campath-1H
Figure BDA0000130072490001464
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时淋巴结中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK/髓样细胞亚型的水平。
实施例60：基于C57BL/6背景的huCD52敲入/剔除(KI/KO)型转基因小鼠的产生和评估
基于C57B1/6背景产生一种新的人类CD52敲入/剔除的小鼠模型。为产生此小鼠，将小鼠CD52基因序列用人类CD52基因序列取代。该用靶向策略允许使用人类序列取代小鼠序列同时保持外显子-内含子结构。使用选择标记以鉴别含有新基因序列的后代。通过移除该选择标记仅留下人类CD52基因序列而产生最终的等位基因。
huCD52 KI/KO小鼠模型的基本特征化涉及测定淋巴细胞上人类CD52表达的水平。针对hCD52表达，对来自huCD52-KI/KO转基因小鼠(N＝4)和C57BL/6小鼠(N＝2)的血液染色，并使用Bang’s labsSimply Cellular抗人类抗体检定来计算CD52分子/细胞的数目。来自huCD52-KI/KO转基因小鼠的外周血细胞的染色证实，huCD52的表达在来自这些动物的大多数淋巴细胞中是非常高的。表达水平与在人类CD4、CD8、和B细胞群中所观察到的水平相似。在NK细胞和巨噬细胞上的表达水平比对于T细胞和B细胞所观察到的水平低。在这些小鼠的嗜中性粒细胞上检测到水平增加的huCD52表达，这与在人类嗜中性粒细胞或是在来自CD-1背景的原始转基因小鼠系的类似细胞中降低的表达水平相反。在来自原始的huCD52 CD1转基因小鼠和huCD52 KI/KI小鼠的T和B细胞上观察到相似水平的CD52表达。
图92A显示在huCD52-KI/KO和非转基因对照小鼠中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、和NK/髓样细胞亚型上的huCD52表达水平。图92B显示在huCD52-KI/KO和huCD52 CD1转基因小鼠中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和B细胞的huCD52表达水平。
实施例61：12G6和2C3的小规模和大规模批次(lots)之间消减特性的直接比较
对huCD52KI/KO转基因小鼠用12G6-SFD1/K12或2C3-SFD1/K12给药以测定消减活性。此外，使用由Genzyme两个不同来源(小规模和大规模批次)所产生的抗体来检查活性。以1mg/kg对小鼠静脉内注射各种抗体。注射之后三天，处死小鼠，并收集血液以进行流式细胞分析，以测定循环CD4+和CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞的水平。在小规模和大规模批次获得的抗体之间，在CD4 T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、和NK细胞的消减中未观察到有显著差别。
还通过流式细胞计数法来评估不同批次的12G6-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12抗体，以比较对来自huCD52-KI/KO转基因小鼠的脾细胞上的染色强度。12G6-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12抗体在分离的脾细胞上似乎都以与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001481
相同的程度识别人类CD52。此外，对于识别水平，在两个来源(小规模和大规模批次)的抗体之间没有差别。
图93A-93B显示与Campath-1H
Figure BDA0000130072490001482
对照相较的12G6-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12抗体(来自不同制造来源)至huCD52的结合。图94显示在使用来自不同制造来源的12G6-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的整体淋巴细胞群(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和B220+ B细胞)的水平。
实施例62：在huCD52-KI/KO转基因小鼠中抗CD52抗体的PK特性分析
在huCD52 KI/KO转基因小鼠中测定人源化2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13和12G6-SFD1/K12抗体的药物动力学特性。对小鼠静脉内注射1mg/kg的抗体，并在开始于给药之后两小时的多个时间点收集血液。使用抗人类Ig ELISA评估各种抗体的循环水平。对于人源化抗CD52的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13和12G6-SFD1/K12抗体的各个而言，整体清除速率相似，且2C3-SFD1/K12显现出潜在较快的动力，而12G6-SFD1/K12在血清中存在最长的时间。
图95A-95B显示在给药之后血液中的2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13及12G6-SFD1/K12抗体在一段时间内的水平。
实施例63：在huCD52-KI/KO转基因小鼠中12G6和2C3预处理对于EAE的评估
在huCD52KI/KO小鼠中，对抗CD52抗体处理对于降低实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的整体发病率和严重度的效力进行评估。对huCD52-KI/KO小鼠用一程(course)的2C3-SFD1/K12或12G6-SFD1/K12在第5至1天的期间处理。通过使用在CFA中乳化的MOG35-55肽免疫化，并使用百日咳毒素在第0和2天处理而引发EAE(一种多发性硬化症的模型)。经媒介物处理的小鼠在注射后第10天开始显现瘫痪症状，其发展成严重的进展型疾病。对比之下，使用2C3-SFD1/K12或12G6-SFD1/K12抗体预处理的小鼠发病延缓，并且整体疾病严重度降低。
图96说明在疾病进展期间内的2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12的EAE临床评分。
实施例64：抗体的Fc修饰以改变抗CD52抗体的药物动力学特性
抗体的Fc区中的改变1)通过改变与Fc受体的相互作用而影响抗体的生物活性，和/或2)通过改变与FcRn新生儿受体的相互作用而改变抗体的药物动力学特性。FcRn分子表达于血管内皮上，并且据信其是IgG再循环的主要部位。FcRn结合至抗体Fc部分，其接着变得内化于细胞中。与FcRn具有高亲和力相互作用的抗体会再循环回到细胞表面，并会被释出而回到循环中。具有较低亲和力相互作用的抗体在细胞内分离并最终降解。定点诱变(以提高与FcRn的相互作用)产生与未经修饰的抗体相比可维持在循环中较长时间的抗体。相反地，抗体的Fc区域内的降低FcRn结合的突变使得抗体的循环半衰期缩短。已被叙述为降低对FcRn的结合产生较短的循环半衰期的突变包括，His435Ala单突变和His310Ala/His435Gln双突变(参见，例如，Kim等人，“Mapping the site on human IgG for binding of the MHC classI-related receptor，FcRn，”Eur.J.Immunol.，29：2819-2825(1999)和Kenanova等人，“Tailoring the Pharmacokinetics and Positron EmissionTomography Imaging Properties of Anti-Carcinoembryonic AntigenSingle-Chain Fv-Fc Antibody Fragments，”Cancer.Res.65(2)：622-631(2005))。
使2C3-SFD1/K12抗体突变以产生具有改变的PK特性的His435Ala 2C3-SFD1/K12(“2C3-SFD1/K12-修饰1”)和His310Ala/His435Gln 2C3-SFD1/K12(“2C3-SFD1/K12-修饰2”)抗体。进行Biacore分析以证实对小鼠和人类FcRn分子的结合降低。Campath-1H
Figure BDA0000130072490001491
和2C3-SFD1/K12抗体二者以相似的动力学结合至各小鼠和人类FcRn分子。对比之下，His435Ala 2C3-SFD1/K12抗体以低水平结合至小鼠FcRn但不结合至人类FcRn。His310Ala/His435Gln2C3-SFD1/K12抗体并不结合至小鼠或人类FcRn分子，表明引入单突变或双突变至2C3-SFD1/K12Fc区显著地影响对小鼠和人类FcRn的结合。
图97A-97B说明Campath1H
Figure BDA0000130072490001501
(“Campath”)、2C3-SFD1/K12(“2C3”)、His435Ala 2C3-SFD1/K12(“H435A 2C3”)和His310Ala/His435Gln 2C3-SFD1/K12(“H310A/H435Q 2C3”)结合至小鼠和人类FcRn分子的能力。
实施例65：在C57B1/6小鼠中静脉内给药之后Fc修饰的抗CD52抗体的半衰期评估
对2C3-SFD1/K12主链(backbone)引入Fc修饰以产生2C3-SFD1/K12-修饰1和2C3-SFD1/K12-修饰2抗体，该抗体对负责将抗体维持于循环中的FcRn受体显示出降低的结合。对2C3-SFD1/K12抗体和具有降低的FcRn结合的2C3-SFD1/K12-修饰1及2C3-SFD1/K12-修饰2抗体测定其药物动力学特性。在没有靶抗原(2C3-SFD1/K12结合至人类CD52但不与小鼠CD52交互反应)的情况下使用C57BL/6小鼠来评估PK特性。对小鼠静脉内注射1mg/kg的抗体，在多个时间点收集血液以通过ELISA分析小鼠血清中的循环人类IgG1水平。2C3-SFD1/K12-修饰1和2C3-SFD1/K12-修饰2抗体均比2C3-SFD1/K12抗体更快地从血液中清除。2C3-SFD1/K12的半衰期为403小时，而2C3-SFD1/K12-修饰1的半衰期为51小时且2C3-SFD1/K12-修饰2的半衰期为8小时。2C3-SFD1/K12和2C3-SFD1/K12-修饰-1的PK特性与一室模型一致，仅有单相消除。相比之下，2C3-SFD1/K12-修饰-2的特性与二室模型一致，具有2个不同的消除相(在表中指定为α和β)。第一相持续直到给药之后48小时(α)，且第二相(β，也称为末端消除相)于给药之后48小时开始。
图98显示在非转基因小鼠中2C3-SFD1/K12(“2C3未修饰的”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-Fc突变体1”)及2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-Fc突变体2”)的体内清除。
表17-组间药物动力学数据概括
Figure BDA0000130072490001502
Figure BDA0000130072490001511
表18-个体动物数据
Figure BDA0000130072490001512
Figure BDA0000130072490001513
Figure BDA0000130072490001521
Figure BDA0000130072490001522
#-测试组为2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-M1”)及2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-M2”)
*动物4.1无βt1/2，Vz异常
**-动物4.5 & 4.6，无足够数据进行PK分析。
***动物4.7不完全注射
实施例66：在杂合huCD52转基因小鼠中静脉内给药之后Fc修饰的抗CD52抗体的半衰期评估
体外对2C3-SFD1/K12抗体与具有降低的FcRn结合的2C3-SFD1/K12-修饰1和2C3-SFD1/K12-修饰2抗体测定其药物动力学特性。在2C3-SFD1/K12抗体靶抗原的存在下使用huCD52转基因小鼠评估PK特性。对小鼠静脉内注射1mg/kg的抗体。在多个时间点收集血液以通过ELISA测定小鼠血清中的循环人类IgG1水平。2C3-SFD1/K12-修饰1和2C3-SFD1/K12-修饰2抗体均比2C3-SFD1/K12抗体更快地从血液中清除。2C3-SFD1/K12的半衰期为64小时，而2C3-SFD1/K12-修饰1的半衰期为32小时，且2C3-SFD1/K12-修饰2的半衰期为6.5小时。
图99显示在huCD52转基因小鼠中2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12修饰1(“2C3-Fc突变体1”)及2C3-SFD1/K12修饰2(“2C3-Fc突变体2”)的体内清除。
表19-组间药物动力学数据概括
Figure BDA0000130072490001531
表20-个体动物数据
Figure BDA0000130072490001532
Figure BDA0000130072490001542
因为数据不足，未获得4.11、4.5、4.6、4.7、4.8、和4.9的PK参数。
#-测试组为2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12-修饰1(“2C3-M1”)及2C3-SFD1/K12-修饰2(“2C3-M2”)
实施例67：在杂合huCD52转基因小鼠中静脉内施用Fc修饰的抗CD52抗体之后的体内消减评估
在huCD52转基因小鼠中对2C3-SFD1/K12、2C3-SFD1/K12-修饰1、及2C3-SFD1/K12-修饰2抗体的消减活性进行测定。对小鼠以1mg/kg的2C3-SFD1/K12、2C3-SFD1/K12-修饰1、或2C3-SFD1/K12-修饰2抗体处理，并在72小时之后评估CD4 T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、及NK细胞的存在。与施用2C3-SFD1/K12抗体相比较，施用2C3-SFD1/K12-修饰1或2C3-SFD1/K12-修饰2抗体引起血液和脾脏中的消减水平降低。而且，在血液和脾脏中，相对于2C3-SFD1/K12-修饰2，2C3-SFD1/K12-修饰1引起更大的消减。
图100A-100B显示在使用2C3-SFD1/K12(“2C3”)、2C3-SFD1/K12修饰1(“2C3 Fc突变体-1”)及2C3-SFD1/K12修饰2(“2C3 Fc突变体-2”)抗体给药之后72小时血液和脾脏中的整体淋巴细胞群(CD4+T细胞、CD8+ T细胞、B220+ B细胞、及NK细胞)的水平。
实施例68：人源化抗CD52抗体的详细的表位特异性
使用Biacore T100仪器测定人源化12G6-SFD1/K12、2C3-SFD1/K12、及9D9-H16/K13抗体的详细表位特异性。作为对照，使用相同方法来评估克隆097(纯化的抗人CD52抗体，Biolegend)的表位特异性。使用肽ELISA方法先前已将克隆097的表位特异性特征化(Hale G，“Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1(CD52)antigen，a small glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein，”Immunotechnology，1：175-187(1995))。在此Biacore T100检定中，使用氨基偶联将抗体直接固定在Biacore CM5 Series S羧甲基葡聚糖传感芯片(GE #BR-1006-68)上。羧甲基葡聚糖表面使用0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4M的N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的1∶1混合物活化，使该表面可结合抗体上的反应性氨基。因为与IgGs相比，IgM抗体容易具有较高水平的非特异性结合，因此也研究了小鼠IgMκ(mIgMκ)同种型对照(Biolegend克隆#MM-30)的结合。抗体固定化之后，反应传感芯片表面使用1M乙醇胺盐酸盐/NaOH(pH 8.5)淬灭。在每一个芯片上的一个流动室为空白参考表面，后续流动室用10,000RU的抗体固定。
合成一系列包含人类CD52序列的丙氨酸扫描突变肽(MUT 1-MUT 12(分别为SEQ ID NOS：169-180)，表21)(参见，例如，HaleG，“Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1(CD52)antigen，asmall glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein，”Immunotechnology，1：175-187(1995))。在500nM、100nM、50nM、和0nM的浓度下，对抗体结合至这些突变CD52肽和结合至野生型人类CD52肽进行测试。将肽稀释至检定运行缓冲液，HBS-EP+(10mMHEPES、150mM NaCl、0.05％P20表面活化剂、3mM EDTA，pH 7.4)。包含100nM样品的重复物。还包含轻(κ)链特异性大鼠抗-小鼠IgM抗体(Southern Biotech Clone #1B4B1)作为IgM对照。T100仪器样品室和检定温度分别设定为4℃和25℃。以50μl/min的流速注入人类CD52肽样品五分钟以测量结合，并在HBS-EP+中以50μl/min的流速洗涤五分钟以测量解离。对抗体表面以50μl/min流速使用10mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)的六十秒注射来剥除任何残留的结合肽。使用BiacoreT100 Kinetics Evaluation软件v2.0(GE Healthcare)进行分析。通过参考流动室和0nM浓度差减(双参考差减(double-reference substraction))将数据拟合至1∶1模型。12G6-SFD1/K12抗体阴性((-)，MUT 8)和阳性((+)，MUT 9)肽表位识别的代表性传感图分别示于图101A和图101B中。收编的肽结合数据概括于表21中。
通过使用含有人类CD52的C端部分六个残基的肽涂布ELISA板，接着测量抗体至固定肽的结合，来测定克隆097的先前特征化的结合特异性(Hale G，“Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1(CD52)antigen，a small glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein，”Immunotechnology，1：175-187(1995))。各个残基由所有20个氨基酸所取代。因为在此ELISA中这些肽接附于固体表面，所以该检定比本文所述的Biacore T100检定(其使用固定于表面的抗体，这些肽在该表面上流动)可能更受亲和性作用的影响。在ELISA研究中，发现在成熟类型的人类CD52的11和12位(野生型残基分别为脯氨酸和丝氨酸)的丙氨酸取代使得克隆097至肽的强力结合降低。在该Biacore T100研究中，发现11和12位(以及7、8、9、和10位)的丙氨酸取代会取消克隆097的结合。假定的ELISA检定的亲和力作用有可能是为什么通过ELISA方法所测定的克隆097的图谱化(mapped)表位比通过所述Biacore T100检定所测得的小的原因。
2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12人源化抗体至人类CD52肽序列的结合均对7、8、和11位的丙氨酸取代敏感，且人源化9D9-H16/K13的结合对4和11位的丙氨酸取代敏感。这些被定义的表位特异性与在实施例4中所观察的结果(概括于表8中)重叠。结果之间的些微差异并不是意料之外的，因为在本案例中用于测定结合的Biacore T100方法与在实施例4中所使用的方法显著不同。对比于本案例，在实施例4中，改造的CHO细胞用于表达野生型或丙氨酸取代突变型的人类CD52。在这些哺乳动物细胞中表达的人类CD52可以被糖基化而影响结合。这并不是用于Biacore T100检定中的人类CD52的情况。
表21：对丙氨酸扫描突变hCD52肽的结合
Figure BDA0000130072490001571
(+)检测到结合：对于500nM肽注射，最大响应(Rmax)＞2RUs
(-)没有检测到结合：对于500nM肽注射，最大响应(Rmax)＜2RUs
实施例69：Campath-1H或12G6-SFD1/K12所引发的CD4+ T细胞响应评估
在使用预先载入一组重叠的15-mer肽(包含来自Campath-1H
Figure BDA0000130072490001581
或人源化12G6-SFD1/K12抗体的可变区的序列)的自体树突状细胞(DC)重复体外刺激之后，对CD4+ T细胞增殖反应进行评估。这些实验利用正常人类供体T细胞和DCs。通过对响应于经自体肽脉冲的抗原呈递细胞(APC)而增殖的人类CD4+T细胞的氚标记胸腺嘧啶引入定量来测定结果。
细胞制备：从由BioMed Supplies(Carlsbad，CA)获得的正常人类供体血浆分离(apheresis)产品分离PBMCs。通过Key Biologics，LLC(Memphis，TN)进行供体血液的HLA单倍型筛选(表22)。使用Ficoll-Paque PLUS密度梯度(GE Healthcare)并通过一系列使用磷酸缓冲盐水(PBS，Invitrogen，Carlsbad，CA)的洗涤而分离PBMCs。依循制造商的推荐方案，使用Dynal CD4+珠基阳性分离试剂盒(Invitrogen)将CD4+ T细胞从PBMC中分离。将分离的CD4+ T细胞冷冻于Recovery Cell Culture Freezing Media(Invitrogen)并储存于液氮中。通过使用GM-CSF(Leukine，Bayer，Leverkusin，Germany)和IL-4(Peprotech，Rocky Hill，NJ)铺开附着的细胞六天而从PBMCs诱导树突状细胞(DC)。在第4天更换补充有GM-CSF和IL-4的介质。接着将DCs从瓶中分离并冷冻于Freezing Media，随后转移至液态氮储罐。
表22：供体血液的HLA单倍型
肽：在CLEAR树脂(Peptides International，Louisville，KY)上使用标准Fmoc-chemistry，利用Rainin Symphony自动化肽合成器来合成包含Campath-1H
Figure BDA0000130072490001592
和12G6-SFD1/K12的重链可变区和轻链可变区的肽。通过叔丁氧羰基(BOC)、叔丁基(tBu)、2，2，4，6，7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、或三苯甲基(Trt)基团正交保护氨基酸(EMDBiosciences，San Diego，CA或Anaspec，San Jose，Ca)。使用摩尔比为6∶6∶3∶12∶1的氨基酸/HCTU/HOBt/DIEA/树脂进行偶联。在各个循环期间，使用20％哌啶和2.5％1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)于DMF中的溶液将Fmoc从氨基端移除。使用2.5％水/2.5％TIS/5％苯甲醚/90％TFA体积比的0.1mM树脂的15mls混合物进行去保护/从树脂切割3小时。在二乙醚(-80℃)中使上层清液沉淀并以3000rpm制粒10分钟。轻轻倒出乙醚并再次洗涤颗粒。接着将粗肽冻干。使用分析型HPLC(XBridge C18 4.5x 100mm，Waters Corp.，Milford，MA)和MALDI-TOF质谱仪(Synapt，Waters Corp.，Milford，MA)验证序列并评估纯度。所有试剂均为HPLC级(EMD Biosciences，San Diego，Ca或Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。将冻干的肽再次悬浮于100％DMSO(Sigma)中。将四十三个Campath-1H
Figure BDA0000130072490001593
肽合并至11个线性组，每组各包含3或4个肽(表23：从上到下，轻链肽以SEQ ID NOs：187-206表示，并且重链肽以SEQ ID NOs：207-229表示)。42个12G6-SFD1/K12肽合并至8个线性组，每组各包含五或六个肽(表24：从上到下，轻链肽以SEQ ID NOs：230-250表示，并且重链肽以SEQ ID NOs：251-271表示)。
表23：43个Campath-1H
Figure BDA0000130072490001611
15-mer轻链和重链肽，各重叠10个氨基酸
Campath-1H
Figure BDA0000130072490001612
肽
Figure BDA0000130072490001613
表24：42个12G6-SFD1/K12 15-mer轻链和重链肽，各重叠10个氨基酸
12G6-SFD1/K12肽
Figure BDA0000130072490001621
体外刺激
DC抗原脉冲和成熟：在用肽处理之前，将DCs解冻，洗涤并置于添加有5％人血清(HS，Sigma，St.Louis，MO)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100ng/ml GM-CSF、和20ng/ml IL-4的RPMI(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在6孔组织培养板中以2x 105细胞/毫升将DCs置于4毫升介质中，并使其在37℃贴壁1小时。在细胞贴壁之后，将10μg/ml(总共40μg)的各个肽加至含有DCs的孔中，涉及120μg或160μg的总肽加至各个孔中(Campath-1H
Figure BDA0000130072490001622
3肽组或4肽组)，或者200μg或240μg的总肽加至各个孔中(12G6-SFD1/K125肽组或6肽组)。将40μg的泛DR结合表位(PADRE)加至DCs的一个孔中并用作阳性对照，因为其可结合至大多数HLA-DR分子(Alexander J，等人，“Development of high potency universalDR-restricted helper epitopes by modification of high affinity DR-blockingpeptides，”Immunity，1：751-761(1994))。同样地，将40μg的三种HLA-DR结合破伤风类毒素肽(DTIMMEPPYCKGLDIYYKA(SEQ IDNO：183)、SAMLTNLIIFGPGPVLNKNEV(SEQ ID NO：184)、和NNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO：185))的各种加至DCs的一个孔。类似地，使用热灭活的腺病毒作为阳性抗原来源，并将其以1μg/ml加至DCs的一个孔。最后，DCs的一组维持不用抗原脉冲并用来做为‘空白’培育组。用各种抗原脉冲的DCs在37℃培养至少三小时。接着对DCs使用含有50ng/ml TNF-α、10ng/ml IL-6、25ng/mlIL-1β(Peprotech，Rocky Hill，NJ)和500ng/ml PGE-2(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的“成熟细胞因子混合物”处理。然后使抗原脉冲DCs于37℃成熟过夜。
共培养的建立：在肽装载和成熟化之后，使用PBS洗涤DCs两次，并再补充添加有10％HS的4ml RPMI。将自体CD4+ T细胞解冻并将其以2x 106细胞/毫升在添加有10％HS、青霉素、和链霉素的RPMI中重悬。接着将DCs与幼稚性
Figure BDA0000130072490001631
CD4+T细胞以T细胞：DC为10∶1的比值(8x 106T细胞：8x 105DCs)在8毫升介质中一起培养。接着将共培养物在37℃培育7天。在共培养开始后约72小时，对细胞补充25IU重组IL-2(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，并且之后每3-4天进一步补充于新介质中的25IU重组IL-2。
共培养的再刺激：在第7天(Stim #2)和第14天(Stim #3)，依循下列步骤再刺激共培养物。
增殖检定：如上所述，在24孔低结合板上，将DCs以5x 105细胞/毫升铺布于1ml介质中，对其抗原脉冲并使其成熟，以便于细胞向U型底检定板的后续转移。将一种不相关的HLA DR结合肽，CS378-398(肽序列DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(SEQ ID NO：186))，用作阴性对照(Alexander J，等人，“Development of high potencyuniversal DR-restricted helper epitopes by modification of high affinityDR-blocking peptides，”Immunity，1：751-761(1994))。在24小时DC成熟之后，使用冰冷PBS洗液使细胞从培养板脱离。将DCs与经抗原刺激的T细胞以1∶1的T细胞：DC比值(2.5x 104DC/孔)一起铺于U型底96孔培养板中。使用经驯化肽(特异性反应)脉冲的DC和经不相关肽(非特异性反应)脉冲的DC、以及仅T细胞和仅DC对照对各个T细胞组进行试验，重复三次。在每孔加入1μCi氚标记胸腺嘧啶(Perkin Elmer，Waltham，MA)之前进行检定72小时。在96孔培养板收集器(Perkin Elmer)上收集细胞，并通过在Wallac MicrobetaTrilux计数器(Perkin Elmer)上测量CPM而对引入的氚标记胸腺嘧啶的量定量。通过由将特异性CPM除以非特异性CPM而计算刺激指数。
T细胞受体(TCR)Vβ用途：将增殖检定建立之后所留下的任何CD4+T细胞冷冻以进行T细胞受体Vβ链表达的最后测定。将细胞解冻并依照制造商说明书在IOTest Beta Mark试剂盒(BeckmanCoulter，France)中用识别24种结合的Vβ家族成员的抗体染色30分钟。在使用PBS洗涤和在1％甲醛中重悬之后，在FACScalibur(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)上分析细胞。计算表达各个被检测的V-β链的细胞的百分比，如在图102和图103中所概括。
Campath-1H
Figure BDA0000130072490001641
免疫原性评估
如上文所述，使用来自BioMedSupply(BMS)的十个正常供体的PBMCs来进行Campath-1H
Figure BDA0000130072490001642
肽的免疫原性评估。由刺激指数所显示的反应概况描述于表25A中。每一个供体列于一列，且每一排列出用于刺激CD4+ T细胞的肽组。通过将对于驯化肽组的特异性免疫反应除以不相关反应来测定刺激指数(SI)。SI值＜2.0则未列出。表25A中所概括的十个供体中各个的增殖数据报告于图104A-J中。六个供体显现出大于2.0的刺激指数，因而被称为‘Campath-1H反应者’。当使用两个不同肽组进行检定时，来自反应者其中之一BMS352的驯化过的CD4+T细胞展现出特异性免疫反应。第七个供体，BMS486，也被分类为‘反应者’。在此供体中，使用轻链肽组986-989记录到为背景的1.7倍的刺激指数。当评估此供体内经驯化的T细胞培养物中的Vβ上调时，其显示经986-989驯化的T细胞显现出单一Vβ(Vβ3)的高度上调(图102)。单一Vβ的上调和特异性增殖反应表明BMS486为Campath-1H
Figure BDA0000130072490001651
反应者。三个未反应的供体，BMS200、BMS154、及BMS167，未显示出增殖数据或Vβ上调，此显示肽特异性免疫反应未发生。Campath-1H
Figure BDA0000130072490001652
数据被定量为70％(7/10)反应者比率。引发免疫反应的肽组总数为八。这八个免疫原性肽组中的三个引发个别供体中的强烈反应，刺激指数为3.0或更高(表26)。
表25：刺激指数数据概括
表25A.Campath-1H
Figure BDA0000130072490001653
刺激指数
Figure BDA0000130072490001654
表25B：12G6-SFD1/K12刺激指数
Figure BDA0000130072490001655
实施例70：由12G6-SFD1/K12所引发的CD4+T细胞反应之评估
如在实施例69中针对Campath-1H
Figure BDA0000130072490001661
所叙述，进行12G6-SFD1/K12可变区的免疫原性评估和Vβ分析，使用来自十个正常供体的细胞。概括于表25B中的该十个供体中各个的增殖数据报告于图105A-J中。这十个供体中的两个也用于上文所述的Campath-1H
Figure BDA0000130072490001662
评估(BMS486和BMS484)，而其余八个供体仅用12G6-SFD1/K12肽进行测试。一个供体，BMS484，对三个肽组反应并被分类为‘12G6-SFD1/K12反应者’(表25B)。两个供体，BMS927和BMS928，各对一个肽组反应，因此也被分类为反应者。供体BMS928对包含重链肽1066、1067、1068、1083、1084、和1085的小组显示出2.0的弱刺激指数。此反应通过对增殖T细胞分析Vβ用途得到证实。反应的BMS928T细胞表现出单一Vβ(Vβ20)的上调(图103)。供体BMS927在使用一组轻链肽驯化的T细胞中显示2.5的刺激指数。反应的BMS927T细胞的Vβ分析并未显示出相对于背景的单一Vβ上调。然而，此供体保留在‘反应者’类别，因为Vβ试剂盒表现所有可能的Vβ用途的仅70％。这10个供体中的12G6-SFD1/K12免疫原性比率为30％(3/10)，少于Campath-1H反应者比率(70％)的一半。总共五个肽组引发反应，然而五组中没有一组引起大于3.0的刺激指数(表26)。
表26：Campath-1H和12G6-SFD1/K12免疫反应的概括
Figure BDA0000130072490001665
概述
相比于来自Campath-1H
Figure BDA0000130072490001666
的重链可变区和轻链可变区的肽(70％)，与人源化抗CD52单克隆抗体12G6-SFD1/K12的重链可变区和轻链可变区相关的肽从十个供体中引发较少的免疫反应(30％)。使使用12G6-SFD1/K12所产生的基于CD4+ T细胞的免疫反应也比Campath-1H所引发的反应具有更小的程度。
下表列出本文中所使用的序列识别号码。
表26：SEQ ID NOs列表
Figure BDA0000130072490001681
Figure BDA0000130072490001691
Figure BDA0000130072490001701
Figure BDA0000130072490001711
Figure BDA0000130072490001721
Figure BDA0000130072490001741
Figure BDA0000130072490001751
Figure BDA0000130072490001771
Figure BDA0000130072490001781
本文所引用的所有专利、公开申请和参考文献的教导以其整体并入本文作为参考。
尽管本发明已经参考其示例实施方式而具体地示出和描述，但本领域的技术人员将理解，可以在不偏离由所附权利要求包括的本发明的范围的情况下做出形式和细节上的各种改变。

Claims (54)

1.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链和重链包括在以下中找到的三个互补决定区(CDRs)：
a)分别在SEQ ID NOs：3和16中；
b)分别在SEQ ID NOs：4和17中；
c)分别在SEQ ID NOs：5和18中；
d)分别在SEQ ID NOs：6和19中；
e)分别在SEQ ID NOs：7和20中；
f)分别在SEQ ID NOs：8和21中；
g)分别在SEQ ID NOs：9和22中；
h)分别在SEQ ID NOs：10和23中；
i)分别在SEQ ID NOs：11和24中；
j)分别在SEQ ID NOs：12和25中；
k)分别在SEQ ID NOs：12和137中；或
l)分别在SEQ ID NOs：13和26中。
2.一种单克隆抗人CD52抗体，或其抗原结合部分，其结合至与权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分所结合的人类CD52上的表位相同的表位。
3.一种单克隆抗人CD52抗体，或其抗原结合部分，其与权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分竞争或交叉竞争。
4.如权利要求1、2、或3所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体、鼠抗体、或嵌合抗体。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述重链的骨架区利用VH3-72或VH3-23人类生殖系序列，并且其中所述轻链的骨架区利用VK2 A18b人类生殖系序列。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包括重链(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，和轻链(L)-CDR1、L-CDR2、和L-CDR3，其氨基酸序列为：
a)分别为SEQ ID NOs：51、59、69、29、36、和43；
b)分别为SEQ ID NOs：50、60、69、29、37、和43；
c)分别为SEQ ID NOs：50、61、68、29、38、和43；
d)分别为SEQ ID NOs：50、61、69、29、36、和43；
e)分别为SEQ ID NOs：50、62、69、29、39、和43；
f)分别为SEQ ID NOs：52、61、70、30、40、和43；
g)分别为SEQ ID NOs：53、63、71、31、36、和44；
h)分别为SEQ ID NOs：54、64、71、31、36、和45；
i)分别为SEQ ID NOs：55、63、72、31、36、和46；
j)分别为SEQ ID NOs：56、65、73、32、41、和47；
k)分别为SEQ ID NOs：56、65、294、32、41、和47；或
l)分别为SEQ ID NOs：56、66、74、33、41、和48。
7.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体的轻链和重链：
a)分别包括SEQ ID NOs：3和16的氨基酸序列；
b)分别包括SEQ ID NOs：4和17的氨基酸序列；
c)分别包括SEQ ID NOs：5和18的氨基酸序列；
d)分别包括SEQ ID NOs：6和19的氨基酸序列；
e)分别包括SEQ ID NOs：7和20的氨基酸序列；
f)分别包括SEQ ID NOs：8和21的氨基酸序列；
g)分别包括SEQ ID NOs：9和22的氨基酸序列；
h)分别包括SEQ ID NOs：10和23的氨基酸序列；
i)分别包括SEQ ID NOs：11和24的氨基酸序列；
j)分别包括SEQ ID NOs：12和25的氨基酸序列；或
k)分别包括SEQ ID NOs：13和26的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述重链和所述轻链：
a)分别包括SEQ ID NOs：103和102的氨基酸序列；
b)分别包括SEQ ID NOs：136和138的氨基酸序列；
c)分别包括SEQ ID NOs：137和138的氨基酸序列；
d)分别包括SEQ ID NOs：139和147的氨基酸序列；
e)分别包括SEQ ID NOs：149和155的氨基酸序列；
f)分别包括SEQ ID NOs：149和156的氨基酸序列；
g)分别包括SEQ ID NOs：158和165的氨基酸序列；
h)分别包括SEQ ID NOs：158和166的氨基酸序列；
i)分别包括SEQ ID NOs：159和165的氨基酸序列；
j)分别包括SEQ ID NOs：159和166的氨基酸序列；
k)分别包括SEQ ID NOs：161和166的氨基酸序列；或
l)分别包括SEQ ID NOs：163和166的氨基酸序列。
9.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：272和273的氨基酸序列，且无信号序列。
10.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：274和275的氨基酸序列，且无信号序列。
11.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：276和278的氨基酸序列，且无信号序列。
12.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：277和278的氨基酸序列，且无信号序列。
13.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：279和280的氨基酸序列，且无信号序列。
14.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包括SEQ ID NOs：281和282的氨基酸序列，且无信号序列。
15.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链包括选自SEQ ID NOs：102、138、145-148、153-157、和164-168的氨基酸序列。
16.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链包括选自SEQ ID NOs：273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列。
17.一种抗体轻链或其部分，包括选自SEQ ID NOs：102、138、145-148、153-157、164-168、273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
18.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链包括选自SEQ ID NOs：103、136、137、139-144、149-152、和158-163的氨基酸序列。
19.一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链包括选自SEQ ID NOs：272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列。
20.一种抗体重链或其部分，包括选自SEQ ID NOs：103、136、137、139-144、149-152、158-163、272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
21.如权利要求1-8、15、16、和18中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4分子。
22.如权利要求1-16、18和19中任一项所述的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是单链抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv分子(scFv)、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、区域缺失抗体或单域抗体(dAb)。
23.如权利要求1、2或3所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分结合至包括SEQ ID NO：104的氨基酸序列，并且任选地，所述抗体或抗原结合部分至SEQ ID NO：104的结合通过在SEQ ID NO：104的残基4、7、8、和11中的一个或多个处的丙氨酸取代而减少。
24.如权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分具有选自以下的一个或多个性质：
a)消减T或B淋巴细胞，或二者；
b)与B淋巴细胞相比，优先地消减T淋巴细胞；
c)增加TNF-α、IL-6、或MCP-1的循环血清水平；
d)介导CD52表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；
e)介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；
f)在阿仑单抗的中和抗体的存在下结合至人CD52；和
g)促进人类T或B淋巴细胞中的细胞内信号传导，或促进二者中的细胞内信号传导。
25.一种分离的核酸，其编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的抗体的重链或其抗原结合部分，或所述抗体的轻链或其抗原结合部分。
26.如权利要求25所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括：
a)选自SEQ ID NOs：283、285、287、288、290、和292的重链核苷酸序列，或不具有编码信号肽的序列的所述核苷酸序列；
b)选自SEQ ID NOs：284、286、289、291、和293的轻链核苷酸序列，或不具有编码信号肽的序列的所述核苷酸序列；或
c)a)和b)二者的核苷酸序列。
27.如权利要求26所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括选自以下的重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列：
a)分别选自SEQ ID NO：283和SEQ ID NO：284，二者均不具有编码信号肽的序列；
b)分别选自SEQ ID NO：285和SEQ ID NO：286，二者均不具有编码信号肽的序列；
c)分别选自SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：289，二者均不具有编码信号肽的序列；
d)分别选自SEQ ID NO：288和SEQ ID NO：289，二者均不具有编码信号肽的序列；
e)分别选自SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：291，二者均不具有编码信号肽的序列；和
f)分别选自SEQ ID NO：292和SEQ ID NO：293，二者均不具有编码信号肽的序列。
28.一种包含重链核苷酸序列的分离的核酸和一种包含轻链核苷酸序列的分离的核酸用于制备药物中的用途，所述药物用来治疗需要治疗的病人，其中所述重链核苷酸序列和所述轻链核苷酸序列：
a)分别选自SEQ ID NO：283和SEQ ID NO：284，二者均不具有编码信号肽的序列；
b)分别选自SEQ ID NO：285和SEQ ID NO：286，二者均不具有编码信号肽的序列；
c)分别选自SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：289，二者均不具有编码信号肽的序列；
d)分别选自SEQ ID NO：288和SEQ ID NO：289，二者均不具有编码信号肽的序列；
e)分别选自SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：291，二者均不具有编码信号肽的序列；和
f)分别选自SEQ ID NO：292和SEQ ID NO：293，二者均不具有编码信号肽的序列。
29.一种重组载体，其包括(1)编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体的重链或其抗原结合部分的核酸序列、(2)编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸序列、或(3)二者。
30.一种宿主细胞，其包括编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体的重链或其抗原结合部分的第一核酸序列，所述第一核酸序列可操作地连接至表达控制元件，和编码所述单克隆抗体的轻链或其抗原结合部分的第二核酸序列，所述第二核酸序列可操作地连接至表达控制元件。
31.一种制造抗人CD52抗体或其抗原结合部分的方法，包括将权利要求30所述的宿主细胞维持在适合所述抗体或其抗原结合部分表达的条件下。
32.如权利要求31所述的方法，进一步包括分离所述抗体或其抗原结合部分。
33.一种组合物，包括权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分，以及药学上可接受的媒介物或载体。
34.一种用于治疗需要治疗的病人的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分、或权利要求33所述的组合物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述病人正接受移植。
36.一种用于治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分、或权利要求33所述的组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述自体免疫疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、或血管炎。
38.一种用于治疗需要治疗的病人中的癌症的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分、或权利要求33所述的组合物。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为白血病。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为T细胞恶性肿瘤，并且相较于B细胞，所述抗体或抗原结合部分优先地消减T细胞。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为实体肿瘤。
43.如权利要求34、36、或38所述的方法，进一步包括对所述病人施用嗜中性粒细胞或NK细胞刺激剂。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述刺激剂为G-CSF或GM-CSF。
45.如权利要求34、36、或38所述的方法，进一步包括对所述病人施用T调节细胞刺激剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述刺激剂为雷帕霉素。
47.一种在需要的病人中抑制血管生成的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述病人有实体肿瘤。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述病人有新血管形成。
50.如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分用于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病。
51.如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的癌症。
52.如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要移植的病人。
53.如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的新血管形成。
54.如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用作药物的用途。
CN2010800312662A 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52 免疫球蛋白 Pending CN102459628A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410379748.7A CN104231084B (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白
CN201910228216.6A CN110016081A (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17783709P 2009-05-13 2009-05-13
US61/177,837 2009-05-13
PCT/US2010/034704 WO2010132659A2 (en) 2009-05-13 2010-05-13 Anti-human cd52 immunoglobulins

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910228216.6A Division CN110016081A (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白
CN201410379748.7A Division CN104231084B (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102459628A true CN102459628A (zh) 2012-05-16

Family

ID=43085579

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410379748.7A Active CN104231084B (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白
CN2010800312662A Pending CN102459628A (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52 免疫球蛋白
CN201910228216.6A Pending CN110016081A (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410379748.7A Active CN104231084B (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910228216.6A Pending CN110016081A (zh) 2009-05-13 2010-05-13 抗人cd52免疫球蛋白

Country Status (19)

Country Link
US (5) US8617554B2 (zh)
EP (3) EP2998405B1 (zh)
JP (4) JP5894912B2 (zh)
KR (5) KR20160103160A (zh)
CN (3) CN104231084B (zh)
AR (1) AR076770A1 (zh)
AU (1) AU2010249003B2 (zh)
BR (1) BRPI1013085A2 (zh)
CA (2) CA2939492C (zh)
HK (2) HK1222682A1 (zh)
IL (2) IL216141B (zh)
MX (1) MX2011012047A (zh)
MY (1) MY160126A (zh)
NZ (2) NZ596384A (zh)
RU (2) RU2603743C2 (zh)
SG (2) SG176060A1 (zh)
TW (3) TWI614267B (zh)
WO (1) WO2010132659A2 (zh)
ZA (1) ZA201108077B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI644923B (zh) * 2013-03-15 2018-12-21 健臻公司 抗ｃｄ５２之抗體
CN109929835A (zh) * 2019-03-27 2019-06-25 中国人民解放军第四军医大学 一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9669057B2 (en) 2008-04-25 2017-06-06 Duke University Regulatory B cells and their uses
AU2010249003B2 (en) 2009-05-13 2015-08-20 Genzyme Corporation Anti-human CD52 immunoglobulins
CN102438654A (zh) 2009-05-13 2012-05-02 基酶有限公司 治疗狼疮的方法和组合物
US9814740B2 (en) * 2010-12-21 2017-11-14 Duke University Methods and compositions combining immunotherapy with monocyte activation
EP2700652B1 (en) * 2011-04-18 2018-12-19 The University of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
GB201109238D0 (en) 2011-06-01 2011-07-13 Antitope Ltd Antibodies
WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
WO2013185165A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Cd-52 antibodies and their use in determining and enhancing an immune response in a subject
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
US20150299315A1 (en) * 2012-10-22 2015-10-22 Becton, Dickinson And Company Non-b-lineage cells capable of producing antibody
US10365275B2 (en) 2013-03-12 2019-07-30 Institute of Arthritis Reasearch, LLC Immunologically active polypeptide
CA2902026C (en) 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
KR102042174B1 (ko) 2013-03-29 2019-11-08 삼성전자주식회사 인간화 및 친화도 성숙된 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
KR102060540B1 (ko) * 2013-04-03 2019-12-31 삼성전자주식회사 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
CN106211758B (zh) 2013-04-09 2021-03-23 北京强新生物科技有限公司 2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮用于治疗癌症的用途
KR102186363B1 (ko) * 2013-09-06 2020-12-04 삼성전자주식회사 c-Met 저해제 및 베타-카테닌 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
KR102192591B1 (ko) * 2013-09-09 2020-12-18 삼성전자주식회사 c-Met 저해제 및 c-Myc 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
US20180140572A1 (en) 2015-06-03 2018-05-24 Boston Biomedical, Inc. Compositions comprising a cancer stemness inhibitor and an immunotherapeutic agent for use in treating cancer
US10906964B2 (en) 2016-05-02 2021-02-02 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
CN109219615B (zh) 2016-05-02 2022-12-09 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
HUE060258T2 (hu) 2016-05-02 2023-02-28 Prothena Biosciences Ltd Tau immunterápia
WO2018102427A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
EP3554515A4 (en) 2016-12-15 2020-08-26 Duke University B10 REGULATORY CELL DEPLETION ANTIBODIES AND METHODS AND THEIR USE IN COMBINATION WITH IMMUNITY CHECKPOINT INHIBITORS
US20200299399A1 (en) * 2017-04-21 2020-09-24 Genzyme Corporation Treatment of Multiple Sclerosis with Anti-CD52 Antibodies
CU24636B1 (es) * 2017-05-02 2022-12-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau en los residuos 257-271 o 320-334 de la seq id no: 1
US10646464B2 (en) 2017-05-17 2020-05-12 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
GB201710836D0 (en) * 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
AU2018392717A1 (en) 2017-12-20 2020-07-09 Albert Einstein College Of Medicine Antibodies to Centrin-1, methods of making, and uses thereof
SG11202106483WA (en) * 2018-12-19 2021-07-29 Humabs Biomed Sa Antibodies that neutralize hepatitis b virus and uses thereof
JP2022524588A (ja) 2019-03-03 2022-05-09 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
WO2021223719A1 (zh) * 2020-05-08 2021-11-11 亘喜生物科技（上海）有限公司 一种抗cd19抗体的抗体及其制备和应用
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0616537B1 (en) * 1991-12-04 1999-03-03 British Technology Group Limited CDw52-SPECIFIC ANTIBODY FOR TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS
US20060204496A1 (en) * 2003-11-28 2006-09-14 Tetsuo Kojima Agonist antibody against heteroreceptor
US20070178098A1 (en) * 2005-12-30 2007-08-02 Merck Patent Gmbh Interleukin-6 antagonists
CN101052653A (zh) * 2004-09-02 2007-10-10 健泰科生物技术公司 抗FcγRⅡB受体抗体及其用途

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0271581B1 (en) 1986-04-17 1993-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
DE68909441T2 (de) 1988-02-12 1994-02-10 British Tech Group Modifizierte Antikörper.
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9022547D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Purified immunoglobulin
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
GB9108056D0 (en) * 1991-04-16 1991-06-05 Hale Geoffrey Synthetic antigen
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5269388A (en) 1991-11-12 1993-12-14 Stress-Tek, Inc. Weighing bed
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
WO1994026087A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 Connor Kim C O Recombinant protein production and insect cell culture and process
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US7119248B1 (en) 1994-04-12 2006-10-10 Miltenyi Biotec Gmbh Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof
DE69533277T2 (de) 1994-04-22 2005-07-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-89 derivat
US5550246A (en) 1994-09-07 1996-08-27 The Scripps Research Institute Calicheamicin mimics
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603507D0 (en) 1996-02-20 1996-04-17 Isis Innovation Antibody variants
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
NZ517772A (en) 1999-11-24 2004-03-26 Immunogen Inc Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
CA2401342C (en) 2000-03-03 2010-08-03 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies against eotaxin and their use
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
US20020132983A1 (en) * 2000-11-30 2002-09-19 Junghans Richard P. Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
WO2003074679A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
WO2004042032A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Ohio State University Research Foundation Cytogenetic abnormalities that are predictive of response to therapy for chronic lymphocytic leukemia
CN1225480C (zh) * 2002-12-18 2005-11-02 马菁 抗cd52单克隆抗体、其编码序列及应用
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
CA2520830A1 (en) 2003-03-31 2004-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for inducing differentiation and/or proliferating regulatory t cells using anti-cd52 antibodies and pharmaceutical composition therefor
CA2526120A1 (en) 2003-06-03 2005-02-24 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site
CA2544365A1 (en) * 2003-11-01 2005-05-12 Biovation, Ltd. Modified anti-cd52 antibody
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
US7655229B2 (en) 2004-09-02 2010-02-02 Chan Andrew C Anti-FC-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor
PL3520815T3 (pl) 2005-02-08 2022-04-11 Genzyme Corporation Przeciwciała przeciwko TGFBETA
CN101238150A (zh) * 2005-05-24 2008-08-06 阿维斯塔金格兰技术有限公司 用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的抗cd52单克隆抗体的重组生产方法
NZ564092A (en) 2005-05-27 2010-05-28 Biogen Idec Inc TWEAK binding antibodies
PL2380585T3 (pl) * 2006-04-12 2015-11-30 Genzyme Corp Sposoby leczenia chorób autoimmunologicznych
KR101583587B1 (ko) 2006-09-13 2016-01-08 젠자임 코포레이션 캠패스-1ｈ에 의한 다발성 경화증 (ｍｓ)의 치료
CN103933573A (zh) 2007-02-28 2014-07-23 默沙东公司 用于治疗免疫病症的联合治疗
WO2009000406A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Bayer Healthcare Ag Use of antibodies against the cd52 antigen for the treatment of neurological disorders, particularly transmissible spongiform encephalopathy and alzheimer's disease
CN102438654A (zh) 2009-05-13 2012-05-02 基酶有限公司 治疗狼疮的方法和组合物
EP2429584A4 (en) 2009-05-13 2013-02-20 Genzyme Corp TREATMENT PROCEDURE AND COMPOSITIONS
AU2010249003B2 (en) 2009-05-13 2015-08-20 Genzyme Corporation Anti-human CD52 immunoglobulins
NZ598063A (en) 2009-07-15 2014-07-25 Genentech Inc Aimm Therapeutics B V Gram-positive bacteria specific binding compounds
EP2593594B1 (en) 2010-07-16 2017-09-27 Adimab, LLC Antibody libraries
ITMI20110376A1 (it) 2011-03-10 2012-09-11 Wilic Sarl Aerogeneratore raffreddato a fluido
GB201109238D0 (en) 2011-06-01 2011-07-13 Antitope Ltd Antibodies
AR095199A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Genzyme Corp Anticuerpos anti-cd52
AU2015330869B2 (en) 2014-10-09 2021-07-08 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
US20200299399A1 (en) 2017-04-21 2020-09-24 Genzyme Corporation Treatment of Multiple Sclerosis with Anti-CD52 Antibodies

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0616537B1 (en) * 1991-12-04 1999-03-03 British Technology Group Limited CDw52-SPECIFIC ANTIBODY FOR TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS
US20060204496A1 (en) * 2003-11-28 2006-09-14 Tetsuo Kojima Agonist antibody against heteroreceptor
CN101052653A (zh) * 2004-09-02 2007-10-10 健泰科生物技术公司 抗FcγRⅡB受体抗体及其用途
US20070178098A1 (en) * 2005-12-30 2007-08-02 Merck Patent Gmbh Interleukin-6 antagonists

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEATHER L PULASKI, ET AL.: "Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer", 《JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI644923B (zh) * 2013-03-15 2018-12-21 健臻公司 抗ｃｄ５２之抗體
CN109929835A (zh) * 2019-03-27 2019-06-25 中国人民解放军第四军医大学 一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL216141B (en) 2018-11-29
RU2011150516A (ru) 2013-06-20
TW201636367A (zh) 2016-10-16
JP5894912B2 (ja) 2016-03-30
CA2761800C (en) 2016-09-27
AU2010249003B2 (en) 2015-08-20
US11945874B2 (en) 2024-04-02
US20220010024A1 (en) 2022-01-13
EP3683317A2 (en) 2020-07-22
KR20160103160A (ko) 2016-08-31
NZ596384A (en) 2014-03-28
EP2429582A2 (en) 2012-03-21
BRPI1013085A2 (pt) 2020-11-03
CA2939492C (en) 2019-03-19
US20160208010A1 (en) 2016-07-21
TW201043694A (en) 2010-12-16
AU2010249003A1 (en) 2011-11-03
US20200040091A1 (en) 2020-02-06
JP2012526558A (ja) 2012-11-01
AR076770A1 (es) 2011-07-06
ZA201108077B (en) 2013-01-30
EP2998405A1 (en) 2016-03-23
SG10201608169QA (en) 2016-11-29
TWI529247B (zh) 2016-04-11
IL262639A (en) 2018-12-31
JP2016093194A (ja) 2016-05-26
CA2939492A1 (en) 2010-11-18
HK1222682A1 (zh) 2017-07-07
US20140341910A1 (en) 2014-11-20
HK1205152A1 (zh) 2015-12-11
KR20120111932A (ko) 2012-10-11
RU2603743C2 (ru) 2016-11-27
CN104231084A (zh) 2014-12-24
KR101537840B1 (ko) 2015-07-22
RU2016142225A (ru) 2018-12-18
CA2761800A1 (en) 2010-11-18
CN104231084B (zh) 2019-04-23
KR20160005143A (ko) 2016-01-13
KR20170113704A (ko) 2017-10-12
WO2010132659A3 (en) 2011-01-06
US20120100152A1 (en) 2012-04-26
NZ621170A (en) 2015-08-28
EP3683317A3 (en) 2020-09-30
TWI614267B (zh) 2018-02-11
MX2011012047A (es) 2011-12-14
IL216141A0 (en) 2012-01-31
MY160126A (en) 2017-02-28
WO2010132659A2 (en) 2010-11-18
EP2998405B1 (en) 2019-12-11
EP2429582A4 (en) 2013-01-23
KR20140102764A (ko) 2014-08-22
TW201825115A (zh) 2018-07-16
US8617554B2 (en) 2013-12-31
SG176060A1 (en) 2011-12-29
JP2014195474A (ja) 2014-10-16
JP2018029624A (ja) 2018-03-01
CN110016081A (zh) 2019-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102459628A (zh) 抗人cd52 免疫球蛋白
CN101815725A (zh) 抗cd37抗体
CN110891971A (zh) 仅有重链的抗bcma抗体
CN101622275A (zh) 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
AU2017202364B2 (en) Anti-human CD52 immunoglobulins

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120516