EA029419B1 - Нейтрализующие антитела против ccl20 - Google Patents

Нейтрализующие антитела против ccl20 Download PDF

Info

Publication number
EA029419B1
EA029419B1 EA201390738A EA201390738A EA029419B1 EA 029419 B1 EA029419 B1 EA 029419B1 EA 201390738 A EA201390738 A EA 201390738A EA 201390738 A EA201390738 A EA 201390738A EA 029419 B1 EA029419 B1 EA 029419B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
antigen
human
binding portion
ccb20
Prior art date
Application number
EA201390738A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390738A1 (ru
Inventor
Тосио Имаи
Джеймс Брэдфорд Клайн
Тецу Кавано
Луиджи Грассо
Йосимаса Сакамото
Джаред Спайдел
Миюки Нисимура
Кендзо Мурамото
Тацуо Хоридзое
Original Assignee
Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. filed Critical Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд.
Publication of EA201390738A1 publication Critical patent/EA201390738A1/ru
Publication of EA029419B1 publication Critical patent/EA029419B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/521—Chemokines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым гуманизированным, химерным антителам и антителам мыши, специфично направленным против лиганда 20 СС-хемокина человека 20 (CCL20). Кроме того, настоящее изобретение относится к тяжелым цепям и легким цепям указанных антител. Также изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, рекомбинантным векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат последовательность, которая кодирует тяжелую цепь и/или легкую цепь указанных антител, и к способу получения указанных антител. Антитела против CCL20 по изобретению можно использовать в терапевтических применениях для лечения, например, воспалительных и аутоиммунных нарушений и злокачественной опухоли.

Description

изобретение относится к новым гуманизированным, химерным антителам и антителам мыши, специфично направленным против лиганда 20 СС-хемокина человека 20 (ССЬ20). Кроме того, настоящее изобретение относится к тяжелым цепям и легким цепям указанных антител. Также изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, рекомбинантным векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат последовательность, которая кодирует тяжелую цепь и/или легкую цепь указанных антител, и к способу получения указанных антител. Антитела против ССЬ20 по изобретению можно использовать в терапевтических применениях для лечения, например, воспалительных и аутоиммунных нарушений и злокачественной опухоли.
029419
По настоящему изобретению испрашивается приоритет временной патентной заявки США № 61/415614, поданной 19 ноября 2010 г. Содержание указанной заявки включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новым гуманизированным, химерным антителам и антителам мыши, специфично направленным против лиганда 20 СС-хемокина человека 20 (ССЬ20). Гуманизированные антитела по изобретению особенно пригодны в качестве терапевтических средств для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний.
Уровень техники, к которому относится изобретение
Иммунная система представляет собой в высокой степени сложный биологический цикл, используемый организмом для различения не своего (например, чужеродные организмы или вещества) и своего. Выявление не своего в организме может приводить к воспалению, при котором различные клеточные и молекулярные механизмы координируются для ответа на потенциально вредоносные события, вызываемые не собственным организмом или веществом. Хотя воспалительный процесс помогает защитить организм от чужеродной атаки, нарушение регуляции иммунной системы может привести к отрицательным последствиям, таким как атака на свое, например, аутоиммунное заболевание. Путем изменения функции воспалительных молекул, таких как хемокины, возможно снизить возникновение и прогрессирование нарушений, связанных с иммунными/воспалительными ответами.
Хемокины представляют собой семейство небольших (8-10 кДа) белков, которые играют ключевую роль в воспалении. В процессе воспаления хемокины продуцируются локально в области вредоносного стимула и действуют в качестве основных участников, привлекая клетки иммунной системы, которые экспрессируют распознающие их рецепторы - семь раз проходящие через мембрану сопряженные с Сбелком рецепторы (СРСК). ССЬ20, альтернативно называемый регулируемым активацией хемокином печени (ЬАКС), воспалительным белком макрофагов-3 альфа (М1Р-3а или Ехоби8-1, представляет собой растворимый хемокин, который экспрессируется эпителиальными клетками. Известно, что эпителиальные кератиноциты и клетки синовиальной оболочки продуцируют большие количества ССЬ20 при гомеостатических, а также воспалительных и патологических состояниях, таких как злокачественная опухоль, псориаз и ревматоидный артрит. Распознающим ССЬ20 рецептором является рецептор ССхемокинов 6 (ССК6); ССЬ20 является единственным хемокином, о котором известно, что он взаимодействует с ССК6. В ответ на сигнал ССЬ20 иммунные клетки, обладающие ССК6, такие как незрелые дендритные клетки (ОС), эффекторные Т-клетки/Т-клетки памяти, и В-клетки, мигрируют и инфильтрируют окружающие ткани, таким образом, активируя каскад воспаления.
Поскольку экспрессия ССЬ20 значительно усиливается при воспалении, индуцируемом воспалительными цитокинами, такими как интерлейкин 1β (1Ь-1 β) и фактор некроза опухоли а (ΤΝΕ-α), полагают, что взаимодействие ССЬ20-ССК6 участвует в патологических воспалительных процессах.
Ревматоидный артрит (КА) является одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний. Первым признаком КА часто является синовит, который проявляется как опухшие болезненные составы. Хотя конкретные факторы, которые запускают синовит, остаются неизвестными, полагают, что эпителиальные клетки синовиальной оболочки и синовиальные фибробласты являются главными индукторами воспалительной реакции. Синовиальная жидкость пациентов с КА эффективно осуществляет хемоаттракцию моноцитов человека и провоспалительных Т-хелперных 17 (ТП17) клеток, которые затем индуцируют и усиливают воспалительный процесс КА. Поскольку реакционноспособные клетки синовиальной оболочки способны продуцировать большие количества ССЬ20 (в частности, под влиянием 1Ь-1 β и ΤΝΕ-α), полагают, что, хотя ССК6 является основным рецептором ТН 17-клеток, взаимодействие ССЬ20-ССК6 играет ключевую роль в воспалительном процессе.
Взаимодействие ССЬ20-ССК6 также может играть важную роль при определенных типах дерматита. Псориаз, например, начинается с вредоносного псориатического события в коже (индуцируемого факторами окружающей среды и/или генетическими факторами) с последующей инфильтрацией ТЫ7клеток. Поскольку ССК6 экспрессируется на поверхности ТЬ17-клеток, В-клеток, дендритных клеток и повреждающих ткани эффекторных Т-клеток, ССЬ20 может быть главным хемоаттрактантом для этих типов клеток при псориазе. Дальнейшие доказательства важности взаимодействия ССЬ20-ССК6 могут быть найдены в исследованиях с использованием индуцируемой интерлейкином 23 (1Ь-23) модели псориаза на мышах (Нсбпск с1 а1., 1. СПп. 1пус51. 119:2317-2329 (2009)). В этой модели инъекция 1Ь-23 вызывает зависимое от интерлейкина 22 (1Ь-22) псориатическое воспаление. Однако мыши Ссг6-/- не проявляют подобных псориазу симптомов при инъекции 1Ь-23, что указывает на то, что ССК6 требуется для развития псориаза.
Кератиноциты человека могут продуцировать большие количества ССЬ20, особенно под влиянием происходящих из ТП17 цитокинов интерлейкина 17 (1Ь-17), 1Ь-22 и ΤΝΕ-α. В то время как ССЬ20 и ССК6 редко выявляются в нормальной коже, оба из них проявляют увеличенные уровни экспрессии при атопическом дерматите и пустулезном псориазе. Мощную индукцию ССЬ20 и накопление ССК6+ клеток можно наблюдать при микроскопическом иммуногистохимическом анализе очагов повреждения при
- 1 029419
дерматите у человека. Эти наблюдения обеспечивают дополнительные доказательства роли ССЬ20 и ССР6 в воспалительном процессе при дерматите.
Доступные в настоящее время биологические препараты на основе МЛЬ для лечения иммунных нарушений можно ориентировочно подразделить на три группы: ингибиторы иммуностимулирующих цитокинов (например, МАЬ против ΤΝΡ-α), средства, устраняющие иммунные клетки (например, МАЬ против СЭ20). и блокаторы вспомогательных молекул (например, АЬа1асср1). Эти биологические препараты могут быть пригодными для лечения воспалительных заболеваний; однако вследствие первичного отсутствия способности отвечать или постепенного снижения уровня ответа на эти способы лечения, существует срочная потребность в альтернативных биологических препаратах с новыми механизмами действия, удовлетворяющими медицинским потребностям пациентов, например, с опосредуемыми ССЬ20/ССР6 нарушениями. Антитела по настоящему изобретению представляют собой такие альтернативные биологические средства.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к нейтрализующим антителам против ССЬ20 или их антигенсвязывающим частям. В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 представляет собой гуманизированное антитело против ССЬ20 человека, которое может содержать определяющие комплементарность области (СЭР) антител мыши против ССЬ20 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 представляет собой антитело мыши или химерное антитело против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающую часть.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть связываются с ССЬ20 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или его часть не связываются с ССЬ16 человека.
Антитела по изобретению специфично связывают ССЬ20. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть связывается с ССЬ20 яванского макака и/или макака-резус, а также с ССЬ20 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть не связываются с ССЬ20 мыши и/или крысы. В одном варианте осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть связывается с ССЬ20 человека, яванского макака и макака-резус, но не с ССЬ20 мыши и крысы.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет аффинность связывания (Кс) с ССЬ20 человека менее чем
1 нМ, 500 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 М, 70 пМ, 60 пМ или 50 пМ при использовании анализа на основе моновалентного поверхностного плазмонного резонанса, или
1 нМ, 500 пМ, 100 пМ, 75 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 14 пМ, 13 пМ, 12 пМ, 11 пМ, 10 пМ, 9 пМ, 8 пМ, 7 пМ, 6 пМ или 5 пМ при использовании анализа на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса.
В определенных вариантах осуществления антитело или его часть имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека, превышающую аффинность у ССР6 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет ка для ССЬ20 человека менее 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 или 30 (х105 М-1 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет к,| для ССЬ20 человека менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 (х10-5 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет ка для ССЬ20 макака-резус менее 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 или 30 (х105 М-1 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет к,| для ССЬ20 макака-резус менее 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 (х10-5 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет К для ССЬ20 макака-резус менее 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 пМ, при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет ка для ССЬ20 яванского макака менее 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 или 30 (х105 М-1 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет к,| для ССЬ20 яванского макака менее 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 или 6 (х10-5 с-1), при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть имеет Кс для ССЬ20 яванского макака менее 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16 или 15 пМ, при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть
- 2 029419
связывается с ССБ20 человека с ЕС50 менее 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 39, 38, 37, 36, 35 или 34 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть связывается с ССБ20 макака-резус с ЕС50 менее 500, 400, 300, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть связывается с ССБ20 яванского макака с ЕС50 менее 500, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103 или 102 пМ.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть имеет селективность в отношении ССБ20 человека относительно других хемокинов человека, включая, но не ограничиваясь ими, СХ3СБ1, СХСБ1, СХСБ2, СХСБ4, СХСБ8, СХСБ9, СХСБ10, СХСБ12, СХСБ13, СХСБ16, ССЬ1, ССЬ2, ССЬ3, ССЬ4, ССЬ5, ССЬ7, ССБ11, ССБ13, ССБ16, ССБ17, ССБ19, ССБ21, ССБ22, ССБ24, ССБ25, ССБ27, ССБ28 и/или ХСЬ1. В определенных вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть имеет селективность в отношении ССБ20 человека относительно всех из указанных хемокинов.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши с 1С50 менее 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 или 1,1 нМ. В определенных вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши с 1С50 менее 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 или 1,1 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши с 1С50 менее 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5,5, 5,4, 5.3, 5,2, 5,1, 4,9, 4,8, 4,7 или 4,6 нМ. В определенных вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши с 1С90 менее 6, 5,5, 5.4, 5,3, 5,2, 5,1, 4,9, 4,8, 4,7 или 4,6 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши с 1С95 менее 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8 или 7 нМ. В определенных вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека ССК6+ клеток человека или мыши с 1С95 менее 10, 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1 или 9 нМ.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши ίη νίίτο.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть снижает индуцируемый ССБ20 хемотаксис ССК6+ клеток человека или мыши ίη νίνο.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть уменьшает прогрессирование симптомов артрита (таких как повреждение суставов конечностей дистальнее локтя или колена, и степень эритемы и опухания) у индивидуума, например, в модели индуцированного коллагеном артрита (С1А) и/или индуцированного глюкозо-6-фосфатизомеразой (С6Р1) артрита. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть снижает повреждение костей у индивидуума, включая остеопороз, эрозию костей и/или разрастание костей, например, в модели С1А. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть снижает уровни олигомерного матриксного белка хряща (СОМР) в сыворотке у индивидуума, например, в модели С1А. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть снижает уровни мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (ΚΑΝΚΚ), активатора рецептора для ядерного фактора кВ (ΚΑΝΚ), устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТКАР) и/или катепсина К у индивидуума, например, в подушечках лап мыши в модели С1А. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть уменьшает симптомы атопического дерматита (например, сухость, чешуйки, эритема, наличие выделений/образование корки, и/или экскориация) у индивидуума, например, симптомы индуцируемого оксазолоном атопического дерматита у мышей линии ΝΕ/Ν§α. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть уменьшает симптомы аллергического контактного дерматита у индивидуума, например, симптомы индуцируемого динитрофторбензолом (ΌΝΡΒ) аллергического контактного дерматита в модели на мышах.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть содержит тяжелую цепь, СГОР3 которой (Н-СГОР3) содержит последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 67 или 68.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть содержит легкую цепь, СГОР3 которой (Ь-СОКЗ) содержит последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 75.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть содержит Н-СОК3, последовательность которой содержит 8ЕО ГО ΝΟ: 67, и Е-СГОВ3. последовательность которой содержит 8ЕО ГО ΝΟ: 75; или Н-СОК3, последовательность которой содержит 8ЕО ГО ΝΟ: 68, и Ь-СНК3, последовательность которой содержит 8ЕО ГО ΝΟ: 75.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССБ20 или его антигенсвязывающая часть содержит тяжелую цепь, в которой СГОР1 (Н-СНК1), СГОР2 (Н-СГОР2) и СГОР3 (Н-СГОР3) соответственно содержат последовательности
- 3 029419
8ЕО ΙΌ N0: 60, 63 и 67;
8ЕО ΙΌ N0: 60, 64 и 67;
8ЕО ΙΌ N0: 61, 65 и 68;
8ЕО ΙΌ N0: 77, 79 и 67 или
8ЕО ΙΌ N0: 78, 80 и 68.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит легкую цепь, в которой СГОВ1 (Ь-СПВ1), СЭВ2 (Е-СГОВ2) и СЭВ3 (Е-СГОВ3) соответственно содержат последовательности
8ЕО ГО N0: 70, 73 и 75 или
8ЕО ГО N0: 71, 73 и 75.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит
Н-СГОВЕ содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 60-62, 77 и 78;
Н-С0В2, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 63-66 и 79-81;
Н-СОВ.3, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 67 или 68;
Ь-СПВ.1, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 70-72;
Ь-СПВ2, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 73 или 74; или
Ь-СПВ.3, содержащую 8Е0 ГО N0: 75; или любую их комбинацию.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит Н-СГОВЕ Н-СОВ.2, Н-СОВ.3, Е-СГОВЕ Е-СГОВ2 и Е-СГОВ3 соответственно, содержащие последовательности
8ЕО ГО N0: 60, 63, 67, 70, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 60, 64, 67, 70, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 61, 65, 68, 70, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 77, 79, 67, 70, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 78, 80, 68, 70, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 60, 63, 67, 71, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 60, 64, 67, 71, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 61, 65, 68, 71, 73 и 75;
8ЕО ГО N0: 77, 7 9, 67, 71, 73 и 75 или
8ЕО ГО N0: 78, 80, 68, 71, 73 и 75.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 9-14. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 39, 41 и 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность 8Е0 ГО N0: 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 40, 42 и 44.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи соответственно, содержащие последовательности
8Ер ГО N0: 9 и 8ЕО ГО N0: : 5;
8Ер ГО N0: 10 и 8ЕС) ГО N0: 15;
8Ер го N0: 11 и 8ЕС) ГО N0: 15;
8Ер го N0: 12 и 8ЕС) ГО N0: 15;
8Ер го N0: 13 и 8ЕС) ГО N0: 15;
8Ер го N0: 14 и 8ЕС) ГО N0: 15;
8Ер го N0: 9 и 8ЕО ГО N0: : 6;
8Ер го N0: 10 и 8ЕС) ГО N0: 16;
8Ер го N0: 11 и 8ЕС) ГО N0: 16;
8Ер го N0: 12 и 8ЕС) ГО N0: 16;
8Ер го N0: 13 и 8ЕС) ГО N0: 16 или
8Ер го N0: 14 и 8ЕС) ГО N0: 16.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи соответственно, содержащие последовательности
- 4 029419
8ЕС) ГО N0: 39 и §ЕО ГО N0: 40;
8ЕС) ГО N0: 39 и §ЕО ГО N0: 42;
8ЕС) го N0: 39 и §ЕО го N0: 44;
8ЕС) го N0: 41 и §ЕО го N0: 40;
8ЕС) го N0: 41 и §ЕО го N0: 42;
8ЕС) го N0: 41 и §ЕО го N0: 44;
8ЕС) го N0: 43 и §ЕО го N0: 40;
8ЕС) го N0: 43 и §ЕО го N0: 42 или
8ЕС) го N0: 43 и §ЕО го N0: 44.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из §ЕО ГО N0: 1-6 и 108 без сигнальной последовательности (если она присутствует), и необязательно без Сконцевого остатка лизина. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит легкую цепь, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из §Е0 ГО N0: 7, 8, 110 и 112, без сигнальной последовательности (если она присутствует). В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, соответственно, имеющие последовательности
8ЕС) ГО N0: 1 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 2 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 3 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 4 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 5 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 6 и §ЕО ГО N0: 7;
8ЕС) ГО N0: 1 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 2 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 3 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 4 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 5 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 6 и §ЕО ГО N0: 8;
8ЕС) ГО N0: 108 и §ЕО ГО N 0: 110 или
8ЕС) ГО N0: 108 и 112;
причем обе из указанных по следовательностей - без сигнальной последовательности, §Е0 ГО N0: 1-
6 и 108 - необязательно без С-концевого остатка лизина.
Настоящее изобретение также относится к антителу против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи, кодируемый последовательностью, выбранной из группы, состоящей из §Е0 ГО N0: 25-30. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, кодируемый последовательностью, выбранной из группы, состоящей из §Е0 ГО N0: 51, 53 и 55.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части, которая содержит вариабельный домен легкой цепи, кодируемый последовательностью §Е0 ГО N0: 31 или 32. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, кодируемый последовательностью, выбранной из группы, состоящей из §Е0 ГО N0: 52, 54 и 56.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи соответственно, кодируемые последовательностями
8ЕС) ГО N0: 25 и §ЕО ГО N0: 31:
8ЕС) ГО N0: 26 и §ЕО ГО N0: 31;
8ЕС) го N0: 27 и §ЕО ГО N0: 31;
8ЕС) го N0: 28 и §ЕО го N0: 31;
8ЕС) го N0: 29 и §ЕО го N0: 31;
8ЕС) го N0: 30 и §ЕО го N0: 31;
8ЕС) го N0: 25 и §ЕО го N0: 32;
8ЕС) го N0: 26 и §ЕО го N0: 32;
8ЕС) го N0: 27 и §ЕО го N0: 32;
8ЕС) го N0: 28 и §ЕО го N0: 32;
8ЕС) го N0: 29 и §ЕО го N0: 32 или
8ЕС) го N0: 30 и §ЕО го N0: 32.
В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи соответственно, кодируемые последовательностями
8ЕО ГО N0: 51 и §ЕО ГО N0: 52;
- 5 029419
5ЕС ГО N0: 51 и 5ЕС ГО N0: 54
5ЕС ГО N0: 51 и 5ЕС ГО N0: 56
5ЕС го N0: 53 и 5ЕС ГО N0: 52
5ЕС го N0: 53 и 5ЕС го N0: 54
5ЕС го N0: 53 и 5ЕС го N0: 56
5ЕС го N0: 55 и 5ЕС го N0: 52
5ЕС го N0: 55 и 5ЕС го N0: 54 или
5ЕС го N0: 55 и 5ЕС го N0: 56.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит тяжелую цепь, кодируемую последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 17-22 и 109, причем указанная последовательность лишена последовательности, кодирующей сигнальную последовательность (если она присутствует) и необязательно лишена последовательности, кодирующей С-концевой лизин. В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть содержит легкую цепь, кодируемую последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 23, 24, 111 и 113, причем указанная последовательность лишена последовательности, кодирующей сигнальную последовательность (если она присутствует). В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 содержит тяжелую цепь и легкую цепь соответственно, кодируемые последовательностями
5ЕС ГО N0: 17 и 5ЕС ГО N0: 23
5ЕС ГО N0: 18 и 5ЕС ГО N0: 23
5ЕС го N0: 19 и 5ЕС ГО N0: 23
5ЕС го N0: 20 и 5ЕС го N0: 23
5ЕС го N0: 21 и 5ЕС го N0: 23
5ЕС го N0: 22 и 5ЕС го N0: 23
5ЕС го N0: 17 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС го N0: 18 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС го N0: 19 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС го N0: 20 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС го N0: 21 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС го N0: 22 и 5ЕС го N0: 24
5ЕС ГО N0: 109 и 5ЕС ГО N0: 111 или
5ЕС ГО N0: 109 и 5ЕС ГО N0: 113;
причем обе из указанных последовательностей лишены последовательности, кодирующей сигнальную последовательность (если она присутствует), 8ЕС ГО N0: 17-22 и 109 необязательно лишены последовательности, кодирующей С-концевой лизин.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть являются гуманизированными или химерными. В некоторых вариантах осуществления в каркасных областях тяжелой цепи гуманизированного антитела против ССЬ20 или его части используется ген эмбрионального типа 1ОНУ1-46х03 человека (см., например, АИксйШ с( а1., "Оарреб ВЬЛ8Т аиб Ρ8ΙВЬЛ8Т: а иеу деиегабои οί рго!ет баНЪаке кеагсй ргодгашк", №.1с1ею Аабк Кек. 25:3389-3402 (1997)). В определенных вариантах осуществления каркасные области тяжелой цепи имеют по меньшей мере 50% гомологию с каркасными областями гена эмбрионального типа 1ОНУ1-46х03 человека. Например, каркасные области тяжелой цепи могут быть по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентичны каркасным областям гена эмбрионального типа 1ОНУ1-46х03 человека. В некоторых вариантах осуществления в каркасных областях легкой цепи гуманизированного антитела против ССЬ20 или его части используется ген эмбрионального типа 1ОКУГО-39х01 человека (см. Л115с1ш1 е( а1., выше). В определенных вариантах осуществления каркасные области легкой цепи имеют по меньшей мере 50% гомологию с каркасными областями гена эмбрионального типа 1ОКУ1Э-39х01 человека. Например, каркасные области легкой цепи могут быть по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 8 0%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентичны каркасным областям гена эмбрионального типа 1ОКУ1Э-39х01 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть (в той степени, чтобы указанная часть содержала по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи) представляет собой молекулу 1дО, 1дМ, 1дЕ, 1дА или 1дЭ. В определенных вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его антигенсвязывающая часть представляет собой молекулу подтипа 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 представляет собой моноклональное антитело.
Настоящее изобретение также относится к антителу против ССЬ20 или его антигенсвязывающей
- 6 029419
части, которые связываются с эпитопом ССЬ20 человека, расположенным в Ν-петле и/или шпилечной области β2-β3 молекулы. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело против ССЬ20 или его часть связывается с тем же эпитопом на ССЬ20 человека, что и антитело или его часть, как описано в настоящем описании. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части, которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с ССЬ20 человека с антителом или его частью, описанными в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления эпитоп ССЬ20 человека, связываемый антителом или его антигенсвязывающей частью по изобретению, содержит одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из
остатков 7-9 8ЕО ГО N0: 84; остатков 10-19 8Е0 ГО N0: 84; остатков 20-21 8Е0 ГО N0: 84 и остатков 20-22 8Е0 ГО N0: 84,
или остатков ССЬ20 человека дикого типа, соответствующих указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84.
В некоторых вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека дополнительно содержит одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из
остатков 39-55 8Е0 ГО N0: 84; остатков 39-57 8Е0 ГО N0: 84; остатков 56-67 8Е0 ГО N0: 84 и остатков 61-70 8Е0 ГО N0: 84,
или остатков ССЬ20 человека дикого типа, соответствующих указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84.
В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит любую комбинацию аминокислотных последовательностей, состоящих из остатков 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 5657 и 61-70 8Е0 ГО N0: 84, или остатков ССЬ20 человека дикого типа, соответствующих указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84.
В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 79, 10-19 и 20-22 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84. В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-57 и 61-70 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84. В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 7-9, 10-19, 20-22, 39-57 и 61-70 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84.
В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 79, 10-19 и 20-21 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84. В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 7-9, 10-19, 20-21, 39-55, 56-67 и 61-70 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84. В определенных вариантах осуществления указанный эпитоп ССЬ20 человека содержит остатки 7-9, 10-19, 20-21, 39-57 и 61-70 8Е0 ГО N0: 84, или остатки ССЬ20 человека дикого типа, соответствующие указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84.
В некоторых вариантах осуществления эпитоп ССЬ20 человека, связываемый антителом или его антигенсвязывающей частью, содержит один или более аминокислотных остатков 8Е0 ГО N0: 84 (или остатков ССЬ20 человека дикого типа, соответствующих указанным остаткам 8Е0 ГО N0: 84), выбранных из остатков 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 и 70, или любой их комбинации.
Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающей части любого из антител против ССЬ20, описанных в настоящем описании. Указанная антигенсвязывающая часть может представлять собой, например, одноцепочечное антитело, Εν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Εά, одноцепочечную молекулу Εν (δοΕν), биспецифический одноцепочечный димер Εν, поливалентный одноцепочечный мультимер Εν, диантитело, антитело с делецией домена или однодоменное антитело (ЬАЬ).
Настоящее изобретение также относится к варианту антитела или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящем описании, где указанный вариант отличается от антитела или его части на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, направленному против ССЬ20 человека, где вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи указанного антитела соответственно содержит последовательности
8ЕО ГО N0: 9 и 15;
8ЕО ГО N0: 9 и 16;
8ЕО ГО N0: 10 и 16;
8ЕО ГО N0: 11 и 15;
8ЕО ГО N0: 11 и 16;
8ЕО ГО N0: 12 и 16;
8ЕО ГО N0: 13 и 16 или
- 7 029419
5ЕС) ΙΌ N0: 14 и 16.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 1 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 7, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 1 без С-концевого остатка лизина, и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 7, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 1 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 1 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 2 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 2 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 3 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 7, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 3 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 7, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 3 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 3 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 4 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 4 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 5 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 5 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 6 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 6 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 8, где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 108 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 110.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 108 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 110.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 108 и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 112.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, тяжелая цепь которого содержит 5>Е0 ГО N0: 108 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 5ЕЦ ГО N0: 112.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, например, выделенным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, где указанная тяжелая цепь и легкая цепь или их антигенсвязывающие части могут ассоциировать с образованием антитела против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части. В некоторых вариантах осуществления молекула
- 8 029419
нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 17-22, 25-30 и 109, или указанную нуклеотидную последовательность без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует. Нуклеотидные последовательности 8Е0 ГО N0: 17-22 и 109 также необязательно могут быть лишены последовательности, кодирующей С-концевой лизин, если она присутствует. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 23, 24, 31, 32, 111 и 113, или указанную нуклеотидную последовательность без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует. В некоторых вариантах осуществления одна или более молекул нуклеиновых кислот кодируют тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть и легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела или его части, как описано в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует как указанную тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, так и указанную легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть.
В одном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь и их антигенсвязывающие части, используют для лечения индивидуума, нуждающегося в этом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или обе из них, антитела или его части, как описано в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, экспрессирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или обе из них, антитела или его части, как описано в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела или его части, как описано в настоящем описании, включающему поддержание клетки, как описано в настоящем описании, в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его части. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию выделения антитела или его части.
Настоящее изобретение также относится к способу получения гибридомы, которая секретирует антитело против ССЬ20. В определенных вариантах осуществления гибридома продуцирует антитело, которое связывается с ССЬ20 человека дикого типа. Изобретение также относится к гибридоме, получаемой способами по изобретению. Необязательно, моноклональное антитело, секретируемое гибридомой, собирают, и его можно далее очищать (например, по существу очищать, выделять). В других вариантах осуществления способ дополнительно включает определение нуклеотидной последовательности моноклонального антитела, секретируемого гибридомой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело или его часть, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
В одном аспекте антитело или его часть, как описано в настоящем описании, используют в качестве лекарственного средства. В определенных вариантах осуществления антитело или его часть, как описано в настоящем описании, используют для лечения индивидуума, нуждающегося в этом. В конкретных вариантах осуществления антитело или его часть используют для лечения ассоциированного с ССК.6 состояния, ассоциированного с ССЬ20 состояния или обоих из них. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, воспалительные и аутоиммунные заболевания, в частности, артрит, особенно ревматоидный артрит, атопический или аллергический дерматит и псориаз. В другом конкретном варианте осуществления антитело или его часть используют для лечения злокачественной опухоли. Антитело или его часть можно использовать для лечения, например, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, В-клеточных злокачественных опухолей, аденокарциномы молочной железы, хронического гепатита, контактного дерматита, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, аденокарциномы поджелудочной железы, парадонтоза, папиллярной карциномы щитовидной железы, пустулеза ладоней и стоп, состояний, ассоциированных с макулопапиллярной экзантемой, буллезного эпидермоза, очаговой алопеции, рассеянного склероза, полимиозита, дерматомиозита, болезни Бехчета, острого генерализованного экзантематозного пустулеза, васкулита, ювенильного идиопатического артрита, саркоидоза, бронхиальной астмы, аллергического ринита, отторжения аллотрансплантата почки, реакции "трансплантат против хозяина", отторжения аллотрансплантата печени, хронического обструктивного заболевания легких, кистозного фиброза, гломерулонефрита, инфекции респираторно-синцитиальным вирусом, множественной миеломы и/или гистиоцитоза клеток Лангерганса.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 или его часть используют для снижения опосредуемого ССБ20 хемотаксиса ССК6+ клеток у индивидуума, нуждающегося в этом.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к
- 9 029419
1. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, определяющая комплементарность область 3 (СЭК3) которой содержит 8ЕО ГО N0: 67 или 68.
2. Моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 1, где определяющая комплементарность область 1 (СГОК1). определяющая комплементарность область 2 (СГОК2) и определяющая комплементарность область 3 (СГОК3) указанной тяжелой цепи, соответственно, содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕС) ГО N0: 60, 64 и 67;
b) 8ЕС) ГО N0: 60, 63 и 67;
c) 8ЕС) ГО N0: 61, 65 и 68; ά) 8ЕС) ΙΌ N0: 77, 79 и 67; и е) 8ЕС) ГО N0: 78, 80 и 68.
3. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело содержит легкую цепь, определяющая комплементарность область 3 (СГОК3) которой содержит 8ЕЦ ГО N0: 75.
4. Моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 3, где определяющая комплементарность область 1 (СОК1), определяющая комплементарность область 2 (СГОК2) и определяющая комплементарность область 3 (СГОК3) указанной легкой цепи, соответственно, содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕС) ГО N0: 70, 7 3 и 7 5; и
b) 8ЕС) ГО N0: 71, 73 и 75.
5. Антителу или его антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 1 или 3, где тяжелая цепь указанного антитела содержит СОК3, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 67 или 68, и легкая цепь указанного антитела содержит СОК3, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 75.
6. Антителу или антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 2 или 4, где указанные СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 тяжелой цепи и указанные СОК1, СГОК2 и СГОК3 легкой цепи, соответственно, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕС) ГО N0: 60, 64, 67, 70, 73 и 75;
b) 8ЕС) ГО N0: 60, 64, 67, 71, 73 и 75;
c) 8ЕС) ГО N0: 60, 63, 67, 70, 73 и 75; ά) 8ЕС) ΙΌ N0: 60, 63, 67, 71, 73 и 75; е) 8ЕС) ГО N0: 61, 65, 68, 70, 73 и 75;
1) 8ЕС) ГО N0: 61, 65, 68, 71, 73 и 75;
д) 8ЕС) ГО N0: 77, 79, 67, 70, 73 и 75;
Ь) 8ЕС) ГО N0: 77, 79, 67, 71, 73 и 75; ί) 8ЕС) ГО N0: 78, 80, 68, 70, 73 и 75; и Д 8ЕС) ГО N0: 78, 80, 68, 71, 73 и 75.
7. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, вариабельный домен которой содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 9-14.
8. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело содержит легкую цепь, вариабельный домен которой содержит 8ЕЦ ГО N0: 15 или 16.
9. Антителу или его антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 7 или 8, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи и указанный вариабельный домен легкой цепи, соответственно, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕС) ГО N0: 9 и 15;
b) 8ЕС) ГО N0: 9 и 16;
c) 8ЕС) ГО N0: 10 и 16; ά) 8ЕС) ΙΌ N0: 11 и 15;
е) 8ЕС) ГО N0: 11 и 16;
1) 8ЕС) ГО N0: 12 и 16; д) 8ЕС) ГО N0: 13 и 16; и Ь) 8ЕС) ГО N0: 14 и 16.
10. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека, тяжелая цепь которого содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1-6 без сигнальной последовательности и 8ЕЦ ГО N0: 108.
11. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека, тяжелая цепь которого содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1-6 без сигнальной последовательности и 8ЕЦ ГО N0: 108, где указанная аминокислотная последовательность лишена Сконцевого остатка лизина.
12. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека, легкая цепь которого содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 7 и 8 без сигнальной по- 10 029419
следовательности и 8ЕО ГО N0: 110 и 112.
13. Антителу согласно любому из вариантов осуществления 10-12, где указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь, соответственно, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕО ГО N0: 1 и 7;
b) 8ЕО ГО N0: 1 и 8;
c) 8ЕО ГО N0: 2 и 8; й) 8ЕО ГО N0: 3 и 7; е) 8ЕО ГО N0: 3 и 8;
1) 8ЕО ГО N0: 4 и 8; д) 8ЕО ГО N0: 5 и 8;
Ь) 8ЕО ГО N0: 6 и 8;
ί) 8ЕО ГО N0: 108 и 110; и р 8ЕО ГО N0: 108 и 112;
где указанные аминокислотные последовательности лишены сигнальных последовательностей, если они присутствуют, и где 8Е0 ГО N0: 1-6 необязательно лишена С-концевого остатка лизина.
14. Моноклональному антителу, тяжелая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 108 и легкая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 110.
15. Моноклональному антителу, тяжелая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 108 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 110.
16. Моноклональному антителу, тяжелая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 108 и легкая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 112.
17. Моноклональному антителу, тяжелая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 108 без С-концевого остатка лизина и легкая цепь которого содержит 8Е0 ГО N0: 112.
18. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, которые связываются с тем же эпитопом ССЬ20 человека, что и моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть согласно любому из вариантов осуществления 1-17.
19. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, которые конкурируют за связывание ССЬ20 человека с моноклональным антителом или антигенсвязывающей частью согласно любому из вариантов осуществления 1-17.
20. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, которые перекрестно конкурируют за связывание ССЬ20 человека с моноклональным антителом или антигенсвязывающей частью согласно любому из вариантов осуществления 1-17.
21. Моноклональному антителу или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-12, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
22. Моноклональному антителу или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где в каркасных областях указанной тяжелой цепи используется последовательность эмбрионального типа ЮНУ1-46х03 человека, и где в каркасных областях указанной легкой цепи используется последовательность эмбрионального типа ЮКУГО-39х01 человека.
23. Моноклональному антителу согласно любому из вариантов осуществления 1-9 и 18-22, где указанное антитело содержит константный домен 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека.
24. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, тяжелая цепь которых содержит вариабельный домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 39, 41 и 43.
25. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, легкая цепь которых содержит вариабельный домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 40, 42 и 44.
26. Антителу или его антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 24 или 25, где указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 39, 41 и 43, и где указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 40, 42 и 44.
27. Антителу согласно варианту осуществления 26, где указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь, соответственно, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
a) 8ЕО ГО N0: 39 и 40;
b) 8ЕО ГО N0: 41 и 42; и
c) 8ЕО ГО N0: 43 и 44.
28. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую 8Е0 ГО N0: 39, и легкую цепь, содержащую 8ЕО ГО N0: 40.
29. Моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части по любому из вариантов осу- 11 029419
ществления 24-28, где указанное антитело представляет собой химерное антитело.
30. Антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-9, 18-22 и 24-28, где указанная часть представляет собой одноцепочечное антитело, Ρν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, РЬ, одноцепочечную молекулу Ρν (δοΡν), биспецифический одноцепочечный димер Ρν, диантитело, антитело с делецией домена или однодоменное антитело (ЬАЬ).
31. Моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-30, где указанное антитело или его антигенсвязывающая часть имеет одно или более свойств, выбранных из группы, состоящей из:
a) не связывается с ССЬ16 человека;
b) связывается с ССЬ20 яванского макака или макака-резус, но не с ССЬ20 мыши или крысы;
c) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека 70 пМ или менее при использовании анализа на основе моновалентного поверхностного плазмонного резонанса;
Ь) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека 12 пМ или менее при использовании анализа на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса;
е) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека, превышающую аффинность связывания с ССК6 человека;
1) имеет селективность в отношении ССЬ20 человека относительно СХ3СЬ1, СХСЬ1, СХСЬ2, СХСЬ4, СХСЬ8, СХСЬ9, СХСЬ10, СХСЬ12, СХСЬ13, СХСЬ16, ССЬ1, ССЬ2, ССЬ3, ССЬ4, ССЬ5, ССЬ7, ССЬ11, ССЬ13, ССЬ16, ССЬ17, ССЬ19, ССЬ21, ССЬ22, ССЬ24, ССЬ25, ССЬ27, ССЬ28 или ХСЬ1 человека;
д) снижает индуцируемый ССЬ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток с 1С50 1,7 нМ или менее;
Ь) снижает индуцируемый ССЬ20 хемотаксис ССК6+ клеток ίη νίνο; ί) снижает индуцируемый ССЬ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток ίη νίίτο;
_() уменьшает прогрессирование симптомов артрита у индивидуума;
k) уменьшает остеопороз, эрозию костей или разрастание костей у индивидуума;
l) снижает уровни олигомерного матриксного белка хрящей (СОМР) в сыворотке у индивидуума; т) снижает уровни мРНК КАИКЬ, ΚΑΝΚ, ТКАР или катепсина К у индивидуума;
η) уменьшает прогрессирование атопического дерматита у индивидуума; и ο) уменьшает прогрессирование аллергического контактного дерматита у индивидуума.
32. Моноклональному антителу против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, которые связываются с эпитопом ССЬ20 человека, содержащим одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из:
a) остатков 7-9 8ЕЦ ГО N0: 84;
b) остатков 10-19 8ЕЦ ГО N0: 84; и
c) остатков 20-22 8ЕЦ ГО N0: 84.
33. Моноклональному антителу или антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 32, где указанный эпитоп содержит остатки 7-9, 10-19 и 20-22 8ЕЦ ГО N0: 84.
34. Моноклональному антителу или антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 32, где указанный эпитоп дополнительно содержит одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из:
a) остатков 39-55 8ЕЦ ГО N0: 84;
b) остатков 56-67 8ЕЦ ГО N0: 84; и
c) остатков 61-70 8ЕЦ ГО N0: 84.
35. Моноклональному антителу или антигенсвязывающей части согласно варианту осуществления 34, где указанный эпитоп содержит остатки 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-67 и 61-70 8ЕЦ ГО N0: 84.
36. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела или части согласно любому из вариантов осуществления 1-35.
37. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела или части согласно любому из вариантов осуществления 1-35.
38. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, и легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, антитела или части согласно любому из вариантов осуществления 1-35.
39. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть моноклонального антитела против ССЬ20 человека, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 17-22, 25-30 и 109, или указанную нуклеотидную последовательность без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует.
40. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть моноклонального антитела против ССЬ20 человека, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 23, 24, 31, 32, 111 и 113, или указанной нуклеотидной последовательности без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует.
- 12 029419
41. Выделенной молекуле нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 39 или 40, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 17-22, 25-30 и 109, или указанную нуклеотидную последовательность без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует; и где указанная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 23, 24, 31, 32, 111 и 113, или указанную нуклеотидную последовательность без последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, если она присутствует.
42. Применению (1) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, (2) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или (3) обеих из них, антитела или части согласно любому из вариантов осуществления 1-35, в качестве лекарственного средства.
43. Рекомбинантному вектору, содержащему (1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, (2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или (3) обе из них, антитела или его части согласно любому из вариантов осуществления 1-35.
44. Клетке-хозяину, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела или части согласно любому из вариантов осуществления 1-35, причем указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с элементом контроля экспрессии, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть указанного антитела или части, причем указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с элементом контроля экспрессии.
45. Способу получения антитела против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, включающему поддержание клетки-хозяина согласно варианту осуществления 44 в условиях, подходящих для экспрессии антитела или части.
46. Способу согласно варианту осуществления 45, дополнительно включающему выделение антитела или части.
47. Композиции, содержащей моноклональное антитело или антигенсвязывающую часть согласно любому из вариантов осуществления 1-35 и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
48. Способу лечения индивидуума, нуждающегося в этом, включающему введение индивидууму эффективного количества антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47.
49. Способу лечения состояния у индивидуума, нуждающегося в этом, включающему введение индивидууму эффективного количества антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47.
50. Способу согласно варианту осуществления 49, где указанное состояние представляет собой ассоциированное с ССК.6 состояние.
51. Способу согласно варианту осуществления 49, где указанное состояние представляет собой аутоиммунное или воспалительное состояние.
52. Способу согласно варианту осуществления 49, где указанное состояние представляет собой ревматоидный артрит, псориаз, атопический дерматит, контактный дерматит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизм, хронический гепатит, инфекцию шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидный микоз, остеопороз или пародонтоз.
53. Способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение индивидууму эффективного количества антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 135 или композиции согласно варианту осуществления 47.
54. Способу согласно варианту осуществления 53, где указанная злокачественная опухоль представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль, аденокарциному молочной железы, глиобластому, печеночно-клеточную карциному, аденокарциному поджелудочной железы или папиллярную карциному щитовидной железы.
55. Способу снижения опосредуемого ССЬ20 хемотаксиса ССК6+ клеток у индивидуума, нуждающегося в этом, включающему введение индивидууму антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47.
56. Способу снижения опосредуемого ССЬ20 хемотаксиса ССК6+ клеток ίη νίίτο с использованием антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47.
57. Способу лечения состояния у индивидуума, включающему введение индивидууму антитела или антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47, где указанное состояние выбрано из группы, состоящей из:
a) повреждений суставов конечностей дистальнее локтя или колена;
b) эритемы;
- 13 029419
с) опухания;
б) увеличения уровней олигомерного матриксного белка хрящей (СОМР) в сыворотке; е) увеличения уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (ΚΑΝΚΒ), активатора рецептора для ядерного фактора кВ (ΚΑΝΚ), устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТКАР) или катепсина Κ;
Г) атопического дерматита; и д) аллергического контактного дерматита.
58. Применению антитела или его антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47 для изготовления лекарственного средства.
59. Применению антитела или его антигенсвязывающей части согласно любому из вариантов осуществления 1-35 или композиции согласно варианту осуществления 47 в качестве лекарственного средства.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен график, на котором показано, что мыши с дефицитом ССК6 являются менее чувствительными к индуцируемому коллагеном артриту, чем мыши дикого типа. Дикий тип, ССК6+/+ мыши; гетерозигота, ССК6- мыши; нокаут, ССК6-/- мыши. См. пример 1.
На фиг. 2 представлен график, на котором показано, что мыши с дефицитом ССК.6 проявляют сниженную инфильтрацию Т-клеток (на что указывают уровни СГО3) в индуцированные коллагеном артритические очаги повреждения по сравнению с мышами дикого типа. Представленные данные представляют собой средние значения ±ЗЕМ из одного эксперимента (п=7 мышей на группу). *р<0,05, **р<0,01. См. пример 1.
На фиг. 3 представлен график, на котором показано, что мыши с дефицитом ССК6 проявляют сниженную инфильтрацию макрофагов (на что указывают уровни Р4/80) в индуцированных коллагеном артритических очагах повреждения по сравнению с мышами дикого типа. Представленные данные представляют собой средние значения ±ЗЕМ из одного эксперимента (п=7 мышей на группу). **р<0,01. См. пример 1.
На фиг. 4 представлен график, на котором показано, что по сравнению с мышами дикого типа мыши с дефицитом ССК6 являются устойчивыми к увеличению толщины уха в модели индуцированного динитрофторбензолом (ΌΝΕΒ) аллергического контактного дерматита. ^Т, мыши дикого типа; КО, мыши с дефицитом ССК6. См. пример 1.
На фиг. 5 представлен график, на котором показано, что 2Р5-5 МАЬ ингибирует индуцируемый ССЬ20 хемотаксис. См. пример 2.
На фиг. 6А-С представлено выравнивание последовательностей вариабельных доменов антител по изобретению (ЗЕЦ ГО N0: 9-16) с вариабельными доменами антител мыши против антител человека 36Р7С10 (УН: ЗЕЦ ГО N0: 39; УЪ: ЗЕЦ ГО N0: 40) и 42О5В10 (УН: ЗЕЦ ГО N0: 43) и с последовательностями эмбрионального типа ЮНУ1-46х03 (ЗЕЦ ГО N0: 57), .1114 (ЗЕЦ ГО N0: 58) и ЮКУГО-39х01 (ЗЕЦ ГО N0: 59). Указаны определения каждой СОК по КаЬа! и Скобна. АВМ67212 (ЗЕЦ ГО N0: 82) и ВАН04867.1 (ЗЕЦ ГО N0: 83) представляют собой антитела человека, из которых происходят каркасные области показанных цепей гуманизированных антител. См. пример 3.
На фиг. 7А-С показаны таблицы, в которых представлено ингибирование хемотаксиса ίη νίΐτο различными комбинациями цепей гуманизированных антител против ССЬ20 человека. Данные отражают три испытания, за исключением случаев, если указано иное. См. пример 4.
На фиг. 8А-С представлены три независимых испытания, проведенных для оценки ингибиторного эффекта гуманизированного антитела против ССЬ20 человека НС2/ЬК3. Показано, что антитело НС2/ЬК3 ингибирует индуцируемый ССЬ20 хемотаксис. Величины 1С50, 1С90 и 1С95 представлены для каждого эксперимента. См. пример 4.
На фиг. 9А-С представлена серия графиков, на которых показано, что гуманизированные антитела В) НС2/ЬК3 и С) НС2/ЬС3 демонстрируют дозозависимое ингибирование миграции клеток, сравнимое с ингибированием миграции А) антителом мыши 36Р7С10 в анализе трансэндотелиальной миграции. См. пример 4.
На фиг. 10А и В представлены сенсограммы В1асоге™, на которых показано, что гуманизированные антитела А) НС2/ЬС3 и В) НС2/ЬК3 связываются с ССЬ20 человека зависимым от концентрации образом. См. пример 5.
На фиг. 11А-Ό показано, что антитела против ССЬ20 человека специфично связываются с ССЬ20 человека. Анализ ЕЫЗА со связанным с планшетом ССЬ20 и другими хемокинами (в концентрации 1 мкг/мл) использовали для выявления связывания А) 36Р7С10 и химерных антител, и В) гуманизированных антител НС2ЬК3 и НС2ЬС3. С) Анализ ЕЬ13А с заякоренным с помощью Ηίδ-метки ССЬ20 использовали для выявления связывания. Ό) Эксперименты В1асоге™ подтверждают, что антитела против ССЬ20 человека связываются с ССЬ20 человека и проявляют незначительное связывание с СХСЬ4. См. пример 6.
- 14 029419
На фиг. 12 показано выравнивание аминокислотных последовательностей между перекрывающейся частью ССЬ20 из 56 остатков (§ЕЦ ГО N0: 114) и ССЬ16 (§ЕЦ ГО N0: 115). См. пример 6.
На фиг. 13А и В представлена серия графиков, демонстрирующая, что А) химерные и В) гуманизированные антитела против ССЬ20 человека специфично реагируют с ССЬ20 и не реагируют с ССЬ16. См. пример 6.
На фиг. 14 представлено выравнивание аминокислотной последовательности между ортологами ССЬ20 человека (в первом случае представлена §ЕЦ ГО N0: 85, а во втором случае представлены остатки 2-96 8ЕЦ ГО N0: 85), макака-резус (§ЕЦ ГО N0: 86), яванского макака (§ЕЦ ГО N0: 87) и мыши (§ЕЦ ГО N0: 8 8). См. пример 7.
На фиг. 15 изображено схематическое представление выявления антитела против ССЬ20 человека в анализах ЕЬ1§А. См. пример 7.
На фиг. 16А-С представлена серия графиков, на которых показано, что А) химерные и В), С) гуманизированные антитела против ССЬ20 человека эффективно связываются с ССЬ20 человека, макакарезус и яванского макака, но не с ССЬ20 мыши. См. пример 7.
На фиг. 17А и В представлены графики, демонстрирующие, что гуманизированные и химерные антитела против ССЬ20 человека эффективно связываются с ССЬ20 человека, макака-резус и яванского макака, но не с ССЬ20 крысы или мыши. В) Гуманизированные и А) химерные антитела сохраняют специфичность связывания А) антитела мыши 36Р7С10, из которого они происходят. См. пример 7.
На фиг. 18А и В показаны результаты картирования эпитопов ССЬ20 человека с помощью замены водород/дейтерий. В этом эксперименте использовали вариант ССЬ20 человека (§ЕЦ ГО N0: 84) от Κ&Ό 8у81еш8, в котором со второго до последнего остатка представляют собой Ό вместо N показанного в последовательности дикого типа. А) Уровень дейтерирования каждого остатка ССЬ20 указан в четыре момента времени (сверху вниз: 150 с, 500 с, 1500 с и 5000 с). В) Структура ССЬ20 человека, где указан эпитоп, связываемый антителам по изобретению. См. пример 9.
На фиг. 19 представлена пара графиков, демонстрирующих что клетки мыши с трансдуцированным ССК6 В300 мигрируют в направлении ССЬ20 как мыши, так и человека. См. пример 10.
На фиг. 20 представлен график, на котором показано, что антитела мыши, химерные и гуманизированные антитела против ССЬ20 человека ингибируют миграцию Т-клеток мыши в направлении ССЬ20 человека ίη νίνο дозозависимым образом. См. пример 10.
На фиг. 21 представлен график, на котором показано, что МАЬ хомячка против ССЬ20 мыши 2Р5-5 снижает симптомы индуцируемого коллагеном артрита у мышей. См. пример 11.
На фиг. 22 представлена таблица индивидуальных клинических показателей животных, демонстрирующая, что МАЬ 2Р5-5 снижает прогрессирование симптомов индуцируемого коллагеном артрита. См. пример 11.
На фиг. 23 представлен график, демонстрирующий распределение на категории конечностей мышей с помощью рентгеновской оценки. Показано, что МАЬ 2Р5-5 снижает патологию костей у мышей с индуцированным коллагеном артритом. Контроль: контрольный 1дС. См. пример 11.
На фиг. 24 представлены примеры оценочных рентгенограмм, указывающих на патологию костей в конечностях мышей с индуцированным коллагеном артритом. 0: остеопороз, Е: эрозия костей, N разрастание костей. См. пример 11.
На фиг. 25А-С представлено определение маркера разрушения хряща - олигомерного матриксного белка хрящей (СОМР) в сыворотке, в модели индуцируемого коллагеном артрита у мышей. А) Калибровочные данные со стандартом СОМР. Ось X, ед./л; ось Υ, оптическая плотность при 450 нм. В) Матрица планшета и исходные данные для мышей, которым вводили контрольный 1дС хомячка или МАЬ 2Р5-5. С) Данные от индивидуальных животных демонстрируют сниженные уровни СОМР у животных, которым вводили МАЬ 2Р5-5, по сравнению с животными, которым вводили контрольные 1дС-антитела. См. пример 11.
На фиг. 26 представлен график, на котором показано, что МАЬ 2Р5-5 снижает уровни СОМР в сыворотке мышей. Контрольный 1дС: совпадающее по изотипу антитело; тАЬ ССЬ20: МАЬ 2Р5-5. См. пример 11.
На фиг. 27А и В представлены графики, на которых показано, что МАЬ 2Р5-5 снижает экспрессию мРНК маркеров остеокластов А) КАПКЕ и ΚАNΚ, и В) ТКАР и катепсина К. Контрольный 1дС: совпадающее по изотипу антитело; тАЬ против ССЬ20: МАЬ 2Р5-5; Ось Υ: единицы количественной ПЦР. См. пример 11.
На фиг. 28 представлен график, на котором показано, что МАЬ 2Р5-5 имеет профилактический эффект на индуцируемый глюкозо-6-фосфатизомеразой артрит у мышей. См. пример 12.
На фиг. 29 представлен график, на котором показано, что МАЬ 2Р5-5 подавляет прогрессирование индуцированного оксазолоном атопического дерматита у мышей. См. пример 13.
На фиг. 30 представлен график, на котором показано, что МАЬ 2Р5-5 ингибирует индуцируемый динитрофторбензолом аллергический контактный дерматит (при измерении по толщине уха) у мышей. См. пример 14.
- 15 029419
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфично связываются с ССЬ20 или его частью (например, его антигенной частью). Также изобретение относится к антигенсвязывающим частям указанных антител. В одном варианте осуществления антитела нейтрализуют один или более видов активности ССЬ20. Антитело называют специфично связывающимся с ССЬ20, если оно по существу не связывается с молекулами, не являющимися ССЬ20. Существенное связывание представляет собой, например, связывание с К,® 100 нМ, предпочтительно <10 нМ, 1 нМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ или 35 пМ при определении с помощью В1аеоге™ (в бивалентном формате). В одном варианте осуществления антитела или их части специфично связываются с ССЬ20 человека или его частью, с некоторыми вариантами последовательности ССЬ20 человека, такими как аллельные варианты, и также могут перекрестно реагировать с ССЬ20 из других видов. В одном варианте осуществления антитела или их части обладают специфичностью связывания ССЬ20 человека дикого типа (также называемого встречающимся в природе или эндогенным). Если нет иных указаний, "ССЬ20 человека" относится к ССЬ20 человека дикого типа. Аминокислотная последовательность ССЬ20 человека дикого типа с сигнальной последовательностью представлена на фиг. 14 (5>ЕО ГО N0: 85). Аминокислотная последовательность ССЬ20 человека дикого типа без сигнальной последовательности (остатки 1-26 5>Е0 ГО N0: 85) представлена в 5>Е0 ГО N0: 99 (см. таблицу 18). На фиг. 18 представлен вариант ССЬ20 человека без сигнальной последовательности (5>Е0 ГО N0: 84), где рядом с последним остатком находится Ό вместо Ν, как в последовательности дикого типа (5>Е0 ГО N0: 85). В некоторых вариантах осуществления антитела или их части связываются с ССЬ20 человека дикого типа или ССЬ20 человека, где рядом с последним остатком находится Ό вместо N представленного в последовательности дикого типа, либо с сигнальной последовательностью, либо без нее (например, 5>Е0 ГО N0 : 84, 85 или 99). В конкретном варианте осуществления антитела или их части специфично связываются с ССЬ20 человека, макака-резус и яванского макака, но не связываются с ССЬ20 мыши или крысы.
Антитела и их антигенсвязывающие части, описанные в настоящем описании, можно очищать и/или выделять с использованием известных способов. Антитела или части, которые являются "очищенными" или "выделенными", отделены от молекул (например, пептидов) их источника происхождения (например, супернатант клеток; смесь, такая как смесь антител в библиотеке; и т.д.), и включают антитела, получаемые способами, описанными в настоящем описании, или другими подходящими способами. Выделенные антитела включают по существу чистые (например, в основном чистые) антитела, а также антитела, получаемые химическим синтезом, рекомбинантными способами и их комбинацией.
Более конкретно, изобретение относится к антителам против ССБ20 человека, антигенсвязывающим частям (т. е. частям) антител, легким цепям антител, тяжелым цепям антител и частям этих легких цепей или тяжелых цепей. Изобретение также относится к антителам, лишенным сигнальных последовательностей тяжелых и/или легких цепей и гликозилированным антителам. Изобретение также относится к антителам-предшественникам, негликозилированным антителам, и антителам, тяжелые и/или легкие цепи которых содержат сигнальные последовательности. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из тяжелых цепей и/или легких цепей антитела, или их частей, описанных в настоящем описании; к векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат такие нуклеиновые кислоты; к способам получения любых из тяжелых и/или легких цепей антитела или их частей, описанных в настоящем описании; и к способам применения антител, цепей антител или частей.
Антитела и их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно использовать для лечения индивидуума, нуждающегося в этом (например, пациента-человека) для снижения связывания ССБ20 с ССК6, опосредуемого ССБ20 воспаления и/или опосредуемого ССБ20 хемотаксиса ССК6+ клеток при необходимости.
Антитела по изобретению включают традиционные антитела, содержащие две тяжелых цепи и две легких цепи. В некоторых вариантах осуществления одна или более тяжелых и/или легких цепей содержат вариабельный домен (также называемый в настоящем описании "вариабельной областью") и константный домен (также называемый в настоящем описании "константной областью"). Полные вариабельные домены, когда они присутствуют, содержат четыре каркасных области (РК) и три определяющих комплементарность области (СГОК), расположенные, начиная с аминоконца, в порядке РК1, СГОКЕ РК2, СЭК2, РК3, СЭК3, РК4. Для определения границ СГОК можно проводить визуальное исследование и анализ последовательности. Для настоящего изобретения последовательности СГОК определяют с использованием системы КаЬа! (КаЬа! Е.А. е! а1., Бедиеисек оГ Рго1еш8 оГ 1ттиио1одюа1 1и1еге81, ΕίΓΐΗ Εάίΐίοη, и.8. Эерабтеи! оГ НеаЬй апб Нитаи §егуюе8, И.8. СоуеттеШ Ргшбид 0Гйсе (1991)) и/или системы СНобиа (СНобиа & Ьекк, Саиотса1 §1гисЩге8 Гог (Не НурегуапаЫе гедюик оГ 1ттииод1оЬи1т8, ΐ. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987)), как указано, например, на фиг. 6.
Варианты осуществления настоящего изобретения, которые включают константную область тяжелой цепи человека, могут включать константную область человека любого изотипа, включая 1дС, 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ, в которых тяжелые цепи представляют собой цепи типа гамма (γ), мю (μ), альфа (а), дельта (δ) или эпсилон (ε) соответственно, и любых подклассов, включая 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и
- 16 029419
1дА2, в которых тяжелые цепи представляют собой цепи типа γ1, γ2, γ3, γ4, α1 и α2 соответственно. Варианты осуществления, включающие легкие цепи человека, могут включать легкую цепь каппа (*+*) человека или лямбда (λ) человека.
Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" относится к полному антителу (содержащему две полноразмерных тяжелых цепи и две полноразмерных легких цепи). Термин "антигенсвязывающий фрагмент" используют в настоящем описании взаимозаменяемо с термином "антигенсвязывающая часть", если нет иных указаний. Антигенсвязывающие части антител могут быть любого формата, например, формата одноцепочечных антител, Ρν-фрагментов, РаЬ-фрагментов, РаЬ'-фрагментов, Р(аЬ')2фрагментов, Рй-фрагментов, одноцепочечных молекул Ρν (δεΡν), биспецифических одноцепочечных димеров Ρν (РСТ/υδ 92/09665), антител-димеров, антител с делецией домена и однодоменных антител (йАЬ). См., например, 1е5рег5 е! а1., Ыа1иге Вю!есйпо1оду 22(9): 1161-1165 (2004)). Также в объем изобретения входят антигенсвязывающие молекулы, содержащие УН и/или УЪ. В случае УН, молекула также может содержать одну или более из областей СН1, шарнирных областей, СН2 и СН3.
Части антител можно получать ферментативным расщеплением или рекомбинантными способами. Например, расщепление папаином или пепсином можно использовать для получения фрагментов РаЬ или Р(аЬ')2, соответственно. Антитела также можно получать в различных укороченных формах с использованием генов антител, в которых выше естественного стоп-кодона внесены один или более стопкодонов. Например, можно конструировать рекомбинантную конструкцию, кодирующую тяжелую цепь Р(аЬ')2-фрагмента, чтобы она включала последовательности ДНК, кодирующие СН1-домен и шарнирную область тяжелой цепи.
В другом варианте осуществления можно получать слитое антитело или иммуноадгезин, которые содержат все или часть антитела против ССЬ20 по изобретению, связанные с другим полипептидом. В одном варианте осуществления только вариабельные домены антитела против ССЬ20 связаны с полипептидом. В другом варианте осуществления УН-домен антитела против ССЬ20 связан с первым полипептидом, в то время как Уъ-домен антитела против ССЬ20 связан со вторым полипептидом, который ассоциирует с первым полипептидом так, чтобы УН- и Уъ-домены могли взаимодействовать друг с другом с образованием антигенсвязывающего центра. В другом варианте осуществления УН-домен отделен от Уъ-домена линкером, так что УН- и Уъ-домены могут взаимодействовать друг с другом (см. ниже в описании одноцепочечных антител). Затем антитело УН-линкер-Уъ связывают с представляющим интерес полипептидом. Кроме того, можно создавать слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны друг с другом, с получением двухвалентного или поливалентного антитела на одной полипептидной цепи, или с получением биспецифического антитела. Для получения одноцепочечного антитела по изобретению, фрагменты ДНК, кодирующие УН и Уъ, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (О1у4-8ег)3 (δΕΟ ГО N0:116) так чтобы последовательности УН и Уъ могли экспресироваться в качестве непрерывного одноцепочечного белка, где домены Уъ и УН связаны гибким линкером. См., например, Вий е! а1., 8с1епсе 242:423-426 (1988); НщЮп е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. υδΑ 85:5879-5883 (1988); МсСайейу е! а1., №1иге 348: 552-554 (1990); и т.д. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело является одновалентным (используется только одна УН и Уъ), двухвалентным (используются две УН и Уъ) или поливалентным (используется более двух УН и Уъ). Также изобретение охватывает биспецифические или поливалентные антитела, которые специфично связываются с ССЬ20 человека и с другой молекулой.
В других вариантах осуществления можно получать другие модифицированные антитела с использованием молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против ССЬ20. Например, можно получать "каппа-антитела" (111 е! а1., Рго!еш Епд. 10:949-57 (1997)), "миниантитела" (Магйп е! а1., ЕМВО ί. 13:5303-9 (1994)), "диантитела" (НоШдег е! а1., Ргос. №·ιΐ1. Асай δα. υδΑ 90:6444-6448 (1993)), или "янусины" (Тгаипескег е! а1., ЕМВО ί. 10:3655-3659 (1991) и Тгаипескег е! а1., 1п!. ί. Сапсег (δυρρ1.) 7: 51-52 (1992)) с использованием стандартных молекулярно-биологических способов в соответствии с указаниями в описании.
В другом аспекте изобретение относится к варианту антитела, проиллюстрированному в настоящем описании, или антигенсвязывающей части указанного варианта антитела, где указанный вариант антитела специфично связывается с ССЬ20, но отличается по последовательности от проиллюстрированного антитела на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных замен (например, в области СГОК области РК, и/или константном домене). В соответствии с изобретением вариант антитела может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере 99% идентичен эталонному антителу в тяжелой цепи, вариабельном домене тяжелой цепи, легкой цепи, вариабельном домене легкой цепи, шести СИК, или восьми РК.
Как используют в рамках изобретения, сходство последовательностей для полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, как правило, определяют с использованием про- 17 029419
граммного обеспечения для анализа последовательностей, которое сопоставляет сходные последовательности с использованием показателей сходства, присваиваемых различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, пакет программ Сепебск СотрШег Сгоир (ОСО) 8едиепсе Аиа1ук1к Раскаде содержит программы, такие как "Сар" и "Векйб", которые можно использовать с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близко родственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из различных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, ССС Уегкюп 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью РА8ТА, программы в ССС Уегкюп 6.1, с использованием параметров по умолчанию или рекомендованных параметров. РА8ТА (например, РА8ТА2 и РА8ТА3) предоставляет выравнивание и процентную идентичность последовательностей областей с наилучшим перекрыванием между последовательностями запроса и последовательности поиска (Реагкоп, Мебюбк Еп/ушо1. 183:63-98 (1990); Реагкоп, МеШобк Мо1. Вю1. 132:185-219 (2000)). Другим алгоритмом, используемым при сравнении последовательности по изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из различных организмов, является компьютерная программа ВЬА8Т, особенно Ь1ак1р или 1Ь1ак1п, с использованием параметров по умолчанием. См., например, Л115с1ш1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990); А11ксНи1 е! а1., ШСею Аабк Рек. 25:3389-402 (1997); включенные в настоящее описание в качестве ссылки.
В соответствии с изобретением, один или более остатков цистеина в антителе, которые могут быть химически реакционноспособными, можно заменять на другой остаток, такой как, но не ограничиваясь ими, аланин или серин. В одном варианте осуществления заменяют неканонический остаток цистеина. Замену можно проводить в СЭР или каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеин является каноническим. В некоторых вариантах осуществления удалены потенциальные участки протеолитического расщепления в антителе. Такие участки могут находиться в СЭР или каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. Замена остатков цистеина и удаление участков протеолитического расщепления могут снизить риск гетерогенности в антительном продукте и, таким образом, увеличить его гомогенность. В некоторых вариантах осуществления устраняют пары аспарагин-глицин, которые образуют потенциальные участки дезамидации, путем изменения одного или обоих из этих остатков. В некоторых вариантах осуществления антитело деиммунизируют для снижения его иммуногенности. Способы снижения иммуногенности антитела хорошо известны в данной области. См., например, публикации РСТ № ЭДО 98/52976 и ЭДО 00/34317.
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет одну или более консервативных аминокислотных замен по сравнению с проиллюстрированным антителом по изобретению. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим группу Р боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). Как правило, консервативная аминокислотная замена по существу не изменяет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процентную идентичность последовательностей или степень сходства могут быть скорректированы в сторону увеличения для поправки на консервативный характер замены. Средства для проведения этого корректирования хорошо известны специалистам в данной области. См. например, Реагкоп, МеШобк Мо1. Вю1. 243:307-31 (1994).
Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксилсодержащие боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и 7) содержащие серу боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительные группы консервативных аминокислотных замен представляют собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно консервативная замена представляет собой любую замену, имеющую величину в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, описанной в Соппе! е! а1., 8аепсе 256:1443-45 (1992). "Умеренно консервативная" замена представляет собой любую замену, имеющую неотрицательную величину в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены антитела или антигенсвязывающих частей по изобретению представляют собой замены, которые: (1) снижают подверженность протеолизу, (2) снижают подверженность окислению, (3) изменяют аффинность связывания для формирования комплексов белков, например, для повышения активности АОСС и СЭС антитела, (4) обеспечивают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов, но, тем не менее, сохраняют специфическое связывание с ССЬ20 человека, (5) удаляют С-концевой лизин, и (6) добавляют или удаляют участки гликозилирования.
В одном аспекте изобретение относится к новому и неизвестному полипептиду, который представляет собой тяжелую или легкую цепь антитела по настоящему изобретению, или который представляет
- 18 029419
собой содержащую вариабельный домен часть тяжелой или легкой цепи. Такой полипептид является полезным, поскольку он может быть партнером для легкой или тяжелой цепи антитела, соответственно, формируя антитело против ССЬ20.
В настоящем описании описаны новые гуманизированные нейтрализующие антитела против ССЬ20, содержащие СОК новых антител мыши против ССЬ20 человека, и антигенсвязывающие части указанных гуманизированных антител. Термин "гуманизированное антитело против ССЬ20", как используют в рамках изобретения, относится к антителу, которое содержит одну или более СОК (СЭК1. СЭК2 и ί'.ΌΡ3) антитела против ССЬ20, происходящих не из человека, также называемого в настоящем описании донорным антителом (например, антитело мыши против ССЬ20), и по меньшей мере часть из последовательности человека. Часть антитела человека может представлять собой одну или более каркасных областей (например, все из каркасных областей), и/или всю или часть константной области. В некоторых вариантах осуществления каркасная область последовательности человека содержит последовательность эмбрионального типа, но может включать мутации не эмбрионального типа. Антитело с пересаженным СОК против ССЬ20, в котором шесть СОК не являющегося человеческим антитела против ССЬ20 пересажены в каркасную область человека, является примером гуманизированного антитела против ССЬ20 по изобретению. См., например, СаЬШу е! а1., патент США № 4816567; СаЬШу е! а1., патент Европы № 0125023 В1; Во55 е! а1., патент США № 4816397; Во55 е! а1., ЕР № 0120694 В1; ХенЬегуег, М.8. е! а1., АО 86/01533; ЫеиЬегдег, М.8. е! а1., ЕР № 0194276 В1; Аш!ет, патент США № 5225539; Ат!ет, ЕР № 0239400 В1; Раб1ап, Е.А. е! а1., европейская патентная заявка № 0519596 А1. Также см. Ьабпет е! а1., патент США № 4946778; Ни§!оп, патент США № 5476786; и Виб е! а1., 8с1епсе 242:423-426 (1988)). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела представляют собой деиммунизированные антитела. См., например, Сагг е! а1., патент США № 7264806, касающийся деиммунизированных антител, которые модифицированы для снижения количества потенциальных Т-клеточных эпитопов, тем самым, снижая склонность антитела индуцировать иммунный ответ при введении человеку.
В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит одну или более СОК легкой цепи и/или одну или более СОК тяжелой цепи одного или нескольких из следующих моноклональных антител против ССЬ20 человека: 36Р7С10, 42С5В10 и 40-1С10В9, где СОК идентифицированы в соответствии с системой КаЬа!, системой СНобиа или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит все три СОК тяжелой цепи и все три СОК легкой цепи антитела 36Р7С10, 42С5В10 или 40-1С10В9.
В другом варианте осуществления гуманизированные антитела обладают специфичностью связывания антитела мыши против ССЬ20 человека по изобретению (например, специфичностью к ССЬ20 человека, такой же или сходной эпитопной специфичностью) и/или обладают нейтрализующей активностью. Гуманизированные антитела могут иметь специфичность связывания, эпитопную специфичность и/или нейтрализующую активность антитела мыши, химерного или гуманизированного антитела против ССЬ20 человека, описанного в настоящем описании. Например, гуманизированное антитело по изобретению может конкурировать с антителом мыши, химерным или гуманизированным антителом против ССЬ20 человека за связывание с ССЬ20 человека, и/или оно может иметь нейтрализующую функцию антитела мыши, химерного или гуманизированного антитела против ССЬ20 человека. В конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело имеет специфичность связывания, эпитопную специфичность и/или нейтрализующую активность любого из антител мыши 36Р7С10, 42С5В10 и 40-1С10В9.
Часть гуманизированного антитела, представляющая собой последовательность человека (например, каркасная область; константная область) может происходить из любого подходящего антитела человека. Например, константная область человека или ее часть в гуманизированном или химерном антителе может кодироваться геном легкой цепи к или А человека, и/или геном тяжелой цепи γ (например, γ1, γ2, γ3, γ4), μ, а (например, α1, α2), δ или ε человека, включая аллельные варианты. Конкретный изотип константной области человека (например, 1дС1; 1дС2), вариант или его часть можно выбирать для варьирования эффекторной функции. Например, в антитело можно включать мутантную константную область (т.е. вариант) для снижения связывания с Ре-рецептора и/или способности фиксировать комплемент (см. например. Ат!ет е! а1., СВ 2209757 В; Моткоп е! а1., АО 89/07142; Мотдап е! а1., АО 94/29351).
Как используют в рамках изобретения, термин "последовательность эмбрионального типа" относится к нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям генов и сегментов генов антител в том виде, как они передаются от родителей к потомкам через половые клетки. Эта последовательность эмбрионального типа отличается от нуклеотидных последовательностей, кодирующих конкретное антитело в В-клетке, которое изменено в процессах рекомбинации и гипермутации в ходе созревания аффинности. Антитело, в котором "используется" конкретная последовательность эмбрионального типа, имеет нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая наиболее близко выравнивается с нуклеотидной последовательностью эмбрионального типа или с аминокислотной последовательностью, которая определяется ей, по сравнению с другими последовательностями эмбрионального типа. Такие антитела могут кодироваться последовательностью или содержать последовательность, которая является мутантной по сравнению с последовательностью эмбрионального типа.
- 19 029419
В некоторых вариантах осуществления каркасная область человека имеет минимальное отличие от последовательности эмбрионального типа, например, менее 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков акцепторной каркасной области заменено для улучшения одного или нескольких свойств антитела. В некоторых вариантах осуществления остатки акцепторной каркасной области заменяют остатками донорной каркасной области, например, для повышения аффинности связывания (см., например, Онсеп с! а1., патент США № 5530101). В конкретном варианте осуществления ограниченное количество аминокислот в каркасной области цепи гуманизированного антитела (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) выбирают так, чтобы они были такими же, как и аминокислоты в этих положениях в донорной последовательности (т.е. подвергают "обратной мутации"), а не в акцепторной последовательности, для повышения аффинности антитела, содержащего цепь гуманизированного антитела, в отношении ССЬ20. Каркасные области человека (например, вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей) предпочтительно получают или они происходят из последовательности человека эмбрионального типа, имеющей сходство с аналогичной или эквивалентной областью (например, вариабельные области тяжелой или легкой цепи) антигенсвязывающей области донорного антитела (например, антитела мыши против ССЬ20). Другие источники каркасных областей для частей гуманизированного антитела, представляющих собой последовательности человека, включают консенсусные последовательности вариабельной области человека (см. например, КсЙсЬогоидЬ с! а1., Рго!ст Еидшеегтд 4:773-783 (1991); Сайег с! а1., \У0 94/04679; Сайег, патент США № 6407213)). Например, область донорной последовательности антитела (например, последовательности вариабельной области), используемую для получения не являющейся человеческой части, можно сравнивать с последовательностями человека, как описано в КаЬа!, Е. А. с! а1., 5>сс|иепсс5 о£ Рго1с1П8 о£ 1штипо1од1са1 1п1сгс51. ΗίΓΗι ЕйШои, И.8. ОераПтеШ о£ НеаНЪ апй Нитап §сгу1сс8, И.8. Ооусттеп! Рппйпд 0£йсс (1991) для выбора конкретного источника частей гуманизированного антитела, являющихся человеческими, например, источника каркасных областей.
В одном варианте осуществления каркасные области цепей гуманизированного антитела получают, или они происходят, из вариабельной области 1д человека, имеющей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% общую идентичность последовательности с вариабельной областью не являющегося человеческим донора. В конкретном варианте осуществления каркасные области цепей гуманизированного антитела получают или они происходят из каркасных областей из вариабельных областей человека, имеющих по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 8 0%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95% общую идентичность последовательности с каркасными областями из вариабельных областей не являющегося человеческим донорного антитела.
В одном варианте осуществления по меньшей мере одну из каркасных областей (РК) гуманизированного антитела получают, или она происходит из одной или нескольких цепей последовательности человека. Таким образом, РК может включать РК1 и/или РК2 и/или РК3 и/или РК4, полученные или происходящие из одной или нескольких последовательностей антител человека (например, из цепи антитела человека, из консенсусной последовательности человека).
Специалисту в данной области будет понятно, что в некоторых случаях остатки, фланкирующие одну или более СОК антитела(антител) мыши против ССЬ20, могут участвовать, и в некоторых случаях, могут быть необходимыми, либо прямо, либо непрямо, для функционирования (например, связывания). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более аминокислот, фланкирующих одну или более СОК (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более фланкирующих аминокислот) каркасной области мыши также включены в гуманизированное антитело.
В некоторых вариантах осуществления в каркасных областях тяжелой цепи человека гуманизированных антител по настоящему изобретению используется последовательность эмбрионального типа ЮНУ1-46х03 человека. В некоторых вариантах осуществления в каркасных областях легкой цепи человека гуманизированных антител по настоящему изобретению используется последовательность эмбрионального типа ЮКУГО-39х01 человека. В эти области РК можно вносить мутации (например, обратные мутации), например, в одном или нескольких остатках, как описано в примерах ниже, для повышения аффинности связывания гуманизированного антитела с ССЬ20.
"Аффинность" является термином в данной области, который описывает силу связывающего взаимодействия и, как правило, она относится к общей силе связывания антитела с антигеном. Аффинность антитела к антигену, как правило, выражают в качестве константы равновесия аффинности связывания (Кс) для конкретного взаимодействия антитело-антиген.
В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с ССЬ20 человека с аффинностью (КО; Кс=Ко££ (кй)/Коп (ка)) 500 пМ или менее, 400 пМ или менее, 300 пМ или менее, 200 пМ или менее,
- 20 029419
100 пМ или менее, 90 пМ или менее, 80 пМ или менее, 70 пМ или менее, 60 пМ или менее, 50 пМ или менее, или 45 пМ или менее при определении на основе моновалентного поверхностного плазмонного резонанса; или 12 пМ или менее, 10 пМ или менее, 8 пМ или менее, 6 пМ или менее, или 5 пМ или менее при определении на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с ССЬ20 человека с ка 1000х105 М-1 с-1 или менее, 900х105 М-1 с-
или менее, 800х105 М-1 с-1 или менее, 700х105 М-1
-1
с-1 или менее, 400х105 М-1 с-1 или менее, 300х105 М-1 с-1 или менее, 240х105 М-1
М-1 с-1 или менее, 190х105 М-1 с-1 160х105 М-1 с-1 или менее, или 150х105 М-1 с-1
связывается с ССЬ20 человека с ка 1000х10-5 с-1 или менее, 900х10-5 с
700х10-5 с-1 или менее, 600х10-5 с-1 или менее, 240х10-5 с-1 или менее, 200х10-5 с-1
или менее, 600х105 М-1 с-1 или менее, 500х105 М-1 с-1 1 или менее, 200х105 или менее, 180х105 М-1 с-1 или менее, 170х105 М-1 с-1 или менее, или менее, при определении на основе моновалентного поверхностного плазмонного резонанса (Ыасоге™). В некоторых вариантах осуществления антитело а 1000хю с или менее, 900хю с или менее, 800хю с- или менее, или менее, 500х10-5 с-1
или менее, 190х10
5
-1 или менее, 400х10-5 с-
1 или менее, 300х10-5 с-1
-5 с-1 или менее, 180х10-5 с-1 или менее,
-5 -1
170х10-5 с-1 или менее, 160х10-5 с-1 или менее, 150х10-5 с-1 или менее, 140х10-5 с-1 или менее, 130х10-5 с
или менее, 120х10-5 с-1 или менее,
100х10-5 с-1 или менее, 90х10-5 с-1 или менее, 80х10-5 с-1 или менее,
70х10-5 с-1 или менее, или 65х10-5 с-1 или менее при определении на основе одновалентного поверхностного плазмонного резонанса (Ыасоге™).
Как понятно специалисту в данной области, различные способы можно использовать для подтверждения того, что антитела и их антигенсвязывающие части, полученные способами, описанными в настоящем описании и известными в данной области, имеют требуемую специфичность (например, специфичность связывания, эпитопную специфичность). Например, связывающую функцию гуманизированного антитела против ССЬ20 или части по изобретению, имеющих специфичность к ССЬ20 человека, можно определять с использованием любого подходящего способа, например, анализов, которые осуществляют мониторинг образования комплекса между гуманизированным антителом или его частью и ССЬ20 человека (или, например, пептидом, имеющим аминокислотную последовательность ССЬ20, или твердой подложкой, содержащей ССЬ20 человека).
Способность антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению (например, гуманизированного антитела или его части по изобретению) связываться с тем же эпитопом на ССЬ20 человека, что и конкретное моноклональное антитело мыши, химерное или гуманизированное моноклональное антитело, описанное в настоящем описании, или связываться с эпитопом на ССЬ20 человека, который перекрывается с эпитопом на ССЬ20 человека, с которым связывается конкретное моноклональное антитело мыши, химерное или гуманизированное моноклональное антитело, описанное в настоящем описании, можно легко определять с использованием различных способов, известных специалистам в данной области, включая например, конкурентные анализы связывания. Они могут вовлекать использование меченой формы указанного конкретного антитела и измерение связывания этого меченого антитела с ССЬ20 человека в присутствии и в отсутствие антитела по изобретению.
"Эпитоп", как используют в рамках изобретения, включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Способы охарактеризации эпитопа, с которым связывается антитело, известны в данной области. Один из способов охарактеризации эпитопа, связываемого антителом против ССЬ20 по изобретению, описан в примере 9. После определения желаемого эпитопа на антигене, возможно получить антитела к этому эпитопу, например, с использованием способов, описанных в настоящем описании. Альтернативно в процессе разработки, получение и охарактеризация антител могут дать информацию о желаемых эпитопах. Исходя из этой информации можно провести конкурентный скрининг антител в отношении связывания с одним и тем же эпитопом. Например, квалифицированный специалист может провести конкурентные исследования, чтобы найти антитела, которые конкурентно связываются друг с другом, т. е. антитела, которые конкурируют за связывание с антигеном.
В одном варианте осуществления для определения того, связывается ли исследуемое антитело или его антигенсвязывающая часть с тем же или перекрывающимся эпитопом, что и у гуманизированного антитела по настоящему изобретению, антителу против ССЬ20 по изобретению позволяют связываться с ССЬ20 в насыщающих условиях, а затем определяют способность исследуемого антитела связываться с ССЬ20. Если исследуемое антитело способно связываться с ССЬ20 в то же самое время, когда и эталонное антитело против ССЬ20, тогда исследуемое антитело может связываться с отличающимся эпитопом от эпитопа эталонного антитела против ССЬ20. Однако, если исследуемое антитело не способно связываться с ССЬ20 в то же самое время, тогда исследуемое антитело может связываться с тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом, или эпитопом, который расположен близко к эпитопу, связываемому антителом против ССЬ20 по изобретению. Этот эксперимент можно проводить с использованием, например, ЕЬКА, К1А, Ыасоге™ или проточной цитометрии. Для исследования того, конкурирует ли антитело против ССЬ20 перекрестно с другим антителом против ССЬ20, можно использовать конкурентный способ, описанный выше, в двух направлениях, т.е. определение того, блокирует ли эталонное антитело исследуемое антитело и наоборот. В некоторых вариантах осуществления эксперимент проводят с использованием Ыасоге™.
- 21 029419
Также для охарактеризации антител по настоящему изобретению может быть пригодной сортировка эпитопов. Термин "сортировка" относится к способу группирования антител, на основе их характеристик связывания антигена.
Высокопроизводительный способ "сортировки" антител, на основе их перекрестного конкурирования описан в международной патентной заявке № XVО 03/48731. "Сортировку эпитопов" можно проводить, позволяя немеченой форме антитела против ССЬ20 "А" связываться с синтетическим пептидом, соответствующим последовательности ССЬ20, или с положительными по ССЬ20 клетками. Затем добавляют меченое второе антитело против ССЬ20 "В" и можно оценивать количество меченого антитела, которое может связываться, относительно контрольного образца, где клетки или синтетический пептид ранее подвергнуты воздействию антитела против ССЬ20 "А". Альтернативно оба антитела против ССЬ20 "А" и "В" можно метить различными флуорохромами или химическими реагентами, обеспечивающими выявление, и можно измерять количества обоих меченых антител, которые могут связывать пептид ССЬ20 в одно и то же время с использованием устройства, способного выявлять метку, или можно измерять количества обоих антител, которые одновременно связывают положительные по ССЬ20 клетки с помощью проточной цитометрии. Технологии Ыасоге™ и Ос1с1 позволяют исследовать конкурентное связывание немеченых форм антител. Это использование немеченых форм антител является желательным, поскольку химическая модификация некоторых антител может нарушить активность связывания. Также см. технологию, описанную в Ла еί а1., 1. 1ттипо1. МеШоДк 288:91-98 (2004), которая также пригодна для проведения сортировки эпитопов.
Также в настоящем описании предусмотрены части антител против ССЛ20 по изобретению, такие как легкие цепи, тяжелые цепи, и части легких и тяжелых цепей. Эти части антител могут быть получены или могут происходить из антител (например, путем восстановления и/или расщепления), или они могут продуцироваться или экспрессироваться с нуклеиновых кислот, кодирующих часть антитела или его цепь, имеющие желаемое свойство (например, связывает СС.Т-20 человека, сходство последовательности). Также их можно получать, например, путем синтеза 4е ηονο соответствующей части. Гуманизированные антитела, содержащие желаемые части (например, антигенсвязывающая часть, область СОК, РК, С), происходящие из человека или не из человека, можно получать с использованием синтетических и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения конструкций (например, кДНК), кодирующих желаемую гуманизированную цепь. Например, для получения части антитела (например, части цепи), один или более стоп-кодонов можно встраивать в желаемое положение в последовательности нуклеиновой кислоты. Последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК), кодирующие гуманизированные вариабельные области, можно конструировать с использованием способов ПЦР-мутагенеза для изменения существующих последовательностей ДНК (см., например, Каттап еί а1., №с1. АсМк Кек. 17:5404 (1989)). Праймеры ПЦР, кодирующие новые СОК, могут гибридизоваться с ДНК-матрицей для ранее гуманизированной вариабельной области, которая основана на такой же, или очень сходной, вариабельной области человека (8а1о еί а1., Сапсег Кекеагсй 53:851-856 (1993)). Если сходная последовательность ДНК недоступна для применения в качестве матрицы, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области, можно конструировать из синтетических олигонуклеотидов (см., например, Ко1Ьш§ег, Рго1ет Епдшеегшд 8:971-980 (1993)). Также в нуклеиновую кислоту может быть включена последовательность, кодирующая сигнальный пептид ("сигнальная последовательность") (например, при синтезе, при встраивании в вектор). Если последовательность сигнального пептида недоступна (например, обычно не присутствует), можно использовать последовательность сигнального пептида из другого антитела (см., например, КеШеЬогоидй, Рго1ет Епдшеегшд 4:773-783 (1991)). С использованием этих способов, описанных в настоящем описании способов или других подходящих способов, можно без труда получать варианты.
Как используют в рамках изобретения, сокращенное обозначение "тАЬ" (или "МАЬ") относится к моноклональному антителу, которое может представлять собой, например, антитело, синтезированное клональной популяцией клеток, или гуманизированное антитело. Клональная популяция, которая продуцирует моноклональное антитело, может представлять собой клональную популяцию иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления иммортализованные клетки в клональной популяции представляют собой гибридные клетки - гибридомы - обычно получаемые слиянием индивидуальных Влимфоцитов от иммунизированного животного с индивидуальными клетками из лимфоцитарной опухоли.
Изобретение относится частично к гуманизированному антителу или его антигенсвязывающей части, которые обладают специфичностью связывания с ССЬ20 человека и содержат гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь и/или их части. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит легкую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 1; легкую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 2; легкую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СИК (например, все три СИК) 8Еф ГО N0: 3; легкую цепь, содержащую одну или более
- 22 029419
СЭР (например, все три СЭР) 5ЕЦ ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СЭР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 4; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 5; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 7, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 6; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5ЕЦ ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 1; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 2; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 3; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 4; легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5ЕЦ ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5ЕЦ ГО N0: 5; или легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 8, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 6.
В одном варианте осуществления гуманизированное антитело по изобретению содержит тяжелую цепь (Н)-СГОР1. Н-СГОР2. Н-СГОР3. легкую цепь (Ь)-СОР1, Ь-СОР2, и Б-С0Р3. аминокислотные последовательности которых представляют собой:
a) 5>Е0 ГО N0: 60, 64, 67, 70, 73 и 75 соответственно;
b) 5>Е0 ГО N0: 60, 64, 67, 71, 73 и 75 соответственно;
c) 5>Е0 ГО N0: 60, 63, 67, 70, 73 и 75 соответственно; ά) 5>Е0 ГО N0: 60, 63, 67, 71, 73 и 75 соответственно; е) 5>Е0 ГО N0: 61, 65, 68, 70, 73 и 75 соответственно;
£) 5>Е0 ГО N0: 61, 65, 68, 71, 73 и 75 соответственно;
д) 5>Е0 ГО N0: 77, 79, 67, 70, 73 и 75 соответственно;
Ь) 5ЕЦ ГО N0: 77, 79, 67, 71, 73 и 75 соответственно; ί) 5>Е0 ГО N0: 78, 80, 68, 70, 73 и 75 соответственно; и _)) 5>Е0 ГО N0: 78, 80, 68, 71, 73 и 75 соответственно.
В другом варианте осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит Н-СЭР3, последовательность которой представляет собой 5>Е0 ГО N0: 67 или 68. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит Н-СГОР3 и Ь-СОР3, последовательности которых представляют собой 5ЕЦ ГО N0: 67 и 75 соответственно; или 5ЕЦ ГО N0: 68 и 75 соответственно.
В другом варианте осуществления гуманизированное антитело имеет специфичность связывания с ССЬ20 человека и содержит легкую цепь, содержащую одну или более СОР, выбранных из группы, состоящей из 5>Е0 ГО N0: 70 или 71; 73 и 75, или их комбинации; и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР, выбранных из группы, состоящей из 5>Е0 ГО N0: 60, 61, 77 или 78; 63, 64, 65, 79 или 80; и 67 или 68; или их комбинации.
В другом варианте осуществления гуманизированное антитело, которое обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека, содержит легкую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5>Е0 ГО N0: 7, 8, 110 или 112, и тяжелую цепь, содержащую одну или более СОР (например, все три СОР) 5ЕО ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 108.
Также изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела из гуманизированного антитела, описанного в настоящем описании. В одном варианте осуществления легкая цепь гуманизированного антитела содержит одну или более СОР, выбранных из группы, состоящей из 70 или 71; 73 и 75, или их комбинации. Например, гуманизированное антитело имеет Ь-СОР1, Ь-СОР2 и Ь-СОР3, аминокислотные последовательности которых представляют собой 70, 73 и 75 соответственно; или 71, 73 и 75 соответственно.
Изобретение также относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела из гуманизированного антитела, описанного в настоящем описании. В одном варианте осуществления тяжелая цепь гуманизированного антитела содержит одну или более СОР, выбранных из группы, состоящей из 60, 61, 77 или 78; 63, 64, 65, 79 или 80; и 67 или 68; или их комбинации. Например, гуманизированное антитело имеет Н-СГОРЕ Н-СГОР2 и Н-СОР3, аминокислотные последовательности которых представляют собой:
a) 5ЕО ГО N0: 60, 63 и 67;
b) 5ЕО ГО N0: 60, 64 и 67;
c) 5ЕО ГО N0: 61, 65 и 68;
ά) 5ЕО ΙΌ N0: 77, 79 и 67; или
е) 5ЕО ГО N0: 78, 80 и 68.
В одном варианте осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит легкую цепь, содержащую последовательность вариабельного домена (Уъ) 5>Е0 ГО N0: 15 или 16. В родственном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит легкую цепь, аминокислот- 23 029419
ная последовательность которой содержит или состоит из 8Е0 ГО N0: 7, 8, 110 и 112. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит легкую цепь, аминокислотная последовательность которой содержит или состоит из 8Е0 ГО N0: 7 или 8 без сигнальной последовательности.
В одном варианте осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность вариабельного домена (Ун) согласно одной из 8Е0 ГО N0: 9-14. В родственном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой содержит или состоит и 8Е0 ГО N0: 1-6 и 108. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой содержит или состоит из одной из 8Е0 ГО N0: 1-6 без сигнальной последовательности и необязательно без С-концевого остатка лизина. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой содержит или состоит из 8Е0 ГО N0: 108 без С-концевого остатка лизина.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит Ун и Уъ, аминокислотные последовательности которых содержат или состоят из:
a) 8ЕО ГО N0: 9 и 8ЕО ГО N0: 15;
b) 8ЕО ГО N0: 10 и 8ЕО ГО N0: 15;
c) 8ЕО ГО N0: 11 и 8ЕО ГО N0: 15, ά) 8ЕО ΙΌ N0: 12 и 8ЕО ΙΌ N0: 15 е) 8ЕО ΙΌ N0: 13 и 8ЕО ΙΌ N0: 15;
£) 8ЕО ΙΌ N0: 14 и 8ЕО ΙΌ N0: 15; д) 8ЕС) ΙΌ N0: 9 и 8ЕО ΙΌ N0: 16;
Ь) 8ЕС) ΙΌ N0: 10 и 8ЕО ΙΌ N0: 16; ί) 8ЕО ΙΌ N0: 11 и 8ЕО ΙΌ N0: 16;
Ц 8ЕО ΙΌ N0: 12 и 8ЕО ΙΌ N0: 16;
k) 8ЕО ΙΌ N0: 13 и 8ЕО ΙΌ N0: 16; или
l) 8ЕО ΙΌ N0: 14 и 8ЕО ΙΌ N0: 16.
В одном варианте осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит легкую цепь (ЬС) и тяжелую цепь (НС), аминокислотные последовательности которых содержат или состоят из
а) 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 8ЕО ΙΌ N0: 7
Ь) 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8 ЕС) ΙΌ N0: 7
с) 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 8ЕС) ΙΌ N0: 7
ά) 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 8 ЕС) ΙΌ N0: 7
е) 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 8ЕС) ΙΌ N0: 7
£) 8ЕО ГО N0: 6 и 8ЕО ГО N0: 7; д) 8ЕС) ГО N0: 1 и 8ЕО ГО N0: 8;
Ь) 8ЕО ГО N0: 2 и 8ЕО ГО N0: 8; ί) 8ЕО ГО N0: 3 и 8ЕО ГО N0: 8;
Ц 8ЕО ГО N0: 4 и 8ЕО ГО N0: 8;
k) 8ЕО ГО N0: 5 и 8ЕО ГО N0: 8;
l) 8ЕО ГО N0: 6 и 8ЕО ГО N0: 8,
т) 8ЕО ГО N0: 108 и 8ЕО ГО N0: 110; и п) 8ЕО ГО N0: 108 и 8ЕО ГО N0: 112;
где аминокислотные последовательности лишены сигнальной последовательности, если она присутствует, и где 8Е0 ГО N0: 1-6 и 8Е0 ГО N0: 108 необязательно лишены С-концевого остатка лизина.
Настоящее изобретение относится к любой комбинации, содержащей проиллюстрированную гуманизированную тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, и проиллюстрированную гуманизированную легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, по изобретению; иными словами, тяжелые и легкие цепи можно "смешивать и подбирать". Понятно, что любая такая комбинация, вероятно, сохранит связывание с ССЬ20 человека, а также активность нейтрализации хемотаксиса. Эти функциональные свойства можно без труда исследовать с использованием способов, описанных в настоящем описании. Действительно, на фиг. 7 представлена нейтрализующая активность нескольких комбинаций проиллюстрированных гуманизированных тяжелых и легких цепей по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к антителам против ССЬ20 человека или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с тем же эпитопом, что и у антитела, проиллюстрированного в настоящем описании, и/или конкурируют или перекрестно конкурируют с ним. Эти антитела могут представлять собой, например, гуманизированные, химерные антитела или антитела мыши. Например, изобретение относится к антителам против ССЬ20 и их частям, которые связываются с тем же эпитопом, что и одно из антител мыши против ССЬ20: 36Ε7Ο0, 40-1С10В9 и 42О5В10, или к гуманизированные или химерные версии этих антител, и/или конкурируют или перекрестно конкурируют с ними. Способность антитела связываться с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, или конкурировать или перекрестно конкурировать с ним, можно определять, как описано в настоящем описании. В качестве неогра- 24 029419
ничивающего примера, можно ожидать, что любое антитело или его часть, содержащие три СОВ тяжелой цепи и три СОВ легкой цепи из антитела мыши 36Р7С10, связывается с тем же эпитопом, что и антитело мыши 36Р7С10, конкурирует и перекрестно конкурирует с ним. Такие антитела могут включать, например, антитела, тяжелая цепь которых содержит любую из 8ЕС ГО N0: 9-11 и легкая цепь которых содержит 8Е0 ГО N0: 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления такие антитела, кроме того, могут включать, например, антитела, тяжелая цепь которых содержит любую из 8ЕС ГО N0: 12-14 и легкая цепь которых содержит 8ЕС ГО N0: 15 или 16.
Если желательно, например, для диагностических целей или для целей анализа (например, визуализация для обеспечения, например, мониторинга терапии), гуманизированное антитело (или его антигенсвязывающая часть) могут содержать поддающуюся детекции метку. Подходящие поддающиеся детекции метки и способы мечения гуманизированного антитела или его антигенсвязывающей части хорошо известны в данной области. Подходящие поддающиеся детекции метки включают, например, радиоизотоп (например, индий-111, технеций-99т или йод-131), позитронно-активные метки (например, фтор-19), парамагнитные ионы (например, гадолиний (ΙΙΙ), марганец (ΙΙ)), эпитопную метку (маркер), аффинную метку (например, биотин, авидин), спиновую метку, фермент, флуоресцентную группу или хемилюминесцентную группу. Когда метки не используют, образование комплекса (например, между гуманизированным антителом и ССЬ20 человека) можно определять с помощью поверхностного плазмонного резонанса, Еи8А, РЛС8 или других подходящих способов.
Антитела против ССЬ20 или их антигенсвязывающие части, используемые в рамках изобретения, также можно конъюгировать, например, посредством химических реакций или генетических модификаций, с другими частями (например, частями для пэгилирования), которые улучшают фармакокинетику антител, как например, время полужизни. В некоторых вариантах осуществления антитела против ССЬ20, используемых в рамках настоящего изобретения, могут быть связаны с подходящим цитокином, например, посредством химической конъюгации или генетических модификаций (например, связывание кодирующей цитокин последовательности в рамке считывания с кодирующей антитело последовательностью, тем самым, получая слитый белок антитело :цитокин).
Также изобретение относится к иммуноконъюгатам, в которых гуманизированное антитело (или его антигенсвязывающая часть) по изобретению связаны с другим лекарственным средством, таким как биологически активное соединение (например, цитокин, суперантиген, цитотоксическое средство или токсин). Например, гуманизированное антитело, которое обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека (или его антигенсвязывающей частью) может быть связано с биологическим белком, молекулой растительного или бактериального происхождения (или их производного), антителом против интерлейкина-2 или антителами против дифтерийного токсина.
Как описано в настоящем описании, были получены моноклональные антитела мыши, обладающие специфичностью связывания с ССЬ20 человека. Из моноклональных антител по настоящему изобретению можно получить гуманизированные и химерные антитела по настоящему изобретению. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления гуманизированные и химерные антитела против ССЬ20 по изобретению содержат последовательности, взятые из моноклонального антитела мыши по изобретению, такие как одна или более последовательностей СЭВ (например, все шесть последовательностей СЭВ) или один или более вариабельных доменов (например, вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи).
Как используют в рамках изобретения, термин "моноклональное антитело мыши" относится к антителу, содержащему СОВ легкой цепи (Ъ-СПВ1, Ь-СЭВ2 и Е-СГОВ3) и СОВ тяжелой цепи (Н-СОВ1, НСЭВ2 и Н-СЭВ3) антитела мыши, и каркасные и константные области мыши.
Изобретение относится к моноклональным антителам, описанным в настоящем описании, а также к антигенсвязывающим частям моноклональных антител мыши, легким цепям моноклональных антител мыши, тяжелым цепям моноклональных антител мыши и частям этих тяжелых и легких цепей. В конкретном варианте осуществления моноклональное антитело мыши представляет собой 36Р7С10, 401С10В9 или 42С5В10. Изобретение относится к моноклональным антителам мыши, лишенным сигнальных последовательностей тяжелой и легкой цепи, и моноклональным антителам мыши, которые являются гликозилированными. Также изобретение относится к антителам-предшественникам, негликозилированным антителам, и антителам, тяжелые и/или легкие цепи которых содержат сигнальные последовательности. Также изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из описанных выше тяжелых цепей, легких цепей антитела, или их частей; к векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат такие нуклеиновые кислоты; к способам получения любых из описанных выше тяжелых или легких цепей мыши или их частей; и к способам использования антител мыши или их антигенсвязывающих частей.
Функцию связывания моноклонального антитела мыши или его антигенсвязывающей части, обладающих специфичностью связывания с ССЬ20 человека, можно выявлять с использованием любого подходящего способа, например, с использованием анализов, которые осуществляют мониторинг образования комплекса между моноклональным антителом мыши или его частью и ССЬ20 человека (или, например, пептидом, обладающим аминокислотной последовательностью ССЬ20 или твердой подложкой, со- 25 029419
держащей ССЬ20 человека).
Также в настоящем описании предусмотрены части антител мыши, которые включают легкие цепи, тяжелые цепи и части легких и тяжелых цепей. Эти части антител можно получать или они могут быть сформированы, например, способами, описанными в настоящем описании для гуманизированных частей антител.
В одном варианте осуществления моноклональное антитело мыши по настоящему изобретению содержит легкую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 40, 42 или 44, и, кроме того, содержит тяжелую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 39, 41 или 43. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело мыши содержит легкую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 40, и тяжелую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 39; легкую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 42, и тяжелую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 41; или легкую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 44, и тяжелую цепь, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 43.
В другом варианте осуществления изобретение также относится к моноклональному антителу мыши, которое обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека, содержащему вариабельную область легкой цепи в последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 40, 42 и 44; и вариабельную область тяжелой цепи в последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 39, 41 и 43.
Также изобретение относится к моноклональному антителу мыши, легкая цепь которого содержит вариабельную область 8ЕЦ ГО N0: 40, 42 или 44.
Также изобретение относится к моноклональному антителу мыши, тяжелая цепь которого содержит вариабельную область 8ЕЦ ГО N0: 39, 41 или 43.
Если желательно, например, дли диагностических целей или для целей анализа (например, визуализации), моноклональное антитело мыши или его антигенсвязывающая часть могут содержать поддающуюся выявлению метку, например, как описано в настоящем описании для гуманизированных антител. Все подходящие способы и методики, описанные в настоящем описании для гуманизированных антител по настоящему изобретению, также можно использовать для моноклональных антител мыши по изобретению.
Как описано в настоящем описании, были получены химерные антитела, обладающие специфичностью связывания к ССЬ20 человека. Как используют в рамках изобретения, термин "химерное антитело" относится к рекомбинантному белку, который содержит вариабельные домены антитела, происходящего из одного вида, в то время как константные домены антитела происходят из другого вида. В одном варианте осуществления химерное антитело со специфичностью связывания с ССЬ20 человека содержит вариабельные домены из моноклонального антитела мыши против ССЬ20 человека. В одном варианте осуществления химерное антитело со специфичностью связывания с ССЬ20 человека содержит константные домены из антитела человека. В конкретном варианте осуществления химерное антитело содержит вариабельные домены из моноклонального антитела мыши против ССЬ20 человека и константные домены из антитела человека.
Изобретение относится к химерным антителам, описанным в настоящем описании, а также к антигенсвязывающим частям химерных антител, легким цепям и тяжелым цепям химерных антител, и частям этих легких и тяжелых цепей. Изобретение относится к химерным антителам, лишенным сигнальных последовательностей легких и тяжелых цепей и к химерным антителам, которые являются гликозилированными. Изобретение также относится к антителам-предшественникам, негликозилированным антителам, и антителам, тяжелые и/или легкие цепи которых содержат сигнальные последовательности. Также изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из описанных выше тяжелых цепей, легких цепей химерных антител или их частей; к векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат такие нуклеиновые кислоты; к способам получения этих любых из описанных выше тяжелых или легких цепей химерных антител или их частей; и к способам использования химерных антител.
Связывающую функцию химерного антитела, обладающего специфичностью связывания с ССЬ20 человека, можно выявлять с использованием любого подходящего способа, например, с использованием анализов, которые осуществляют мониторинг образования комплекса между химерным антителом и ССЬ20 человека (или, например, пептидом, имеющим аминокислотную последовательность ССЬ20, или твердой подложкой, содержащей ССЬ20 человека).
Также в настоящем изобретении предусмотрены части химерных антител, которые включают легкие цепи, тяжелые цепи и части легких и тяжелых цепей. Эти части антител можно получать или они могут быть сформированы, например, способами, описанными в настоящем описании для частей гуманизированных антител.
В одном варианте осуществления химерное антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 40 и вариабельную область тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 39; вариабельную область легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 42 и вариабельную область тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 41; или вариабельную область легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 44 и вариабельную область тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 43.
Также изобретение относится к химерному антителу, которое обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека, содержащему последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную
- 26 029419
из группы, состоящей из: вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0: 40, 42 или 44; и, кроме того, содержащему последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 39, 41 или 43.
Также изобретение относится к химерной легкой цепи, содержащей вариабельную область 8Е0 ГО N0: 40, 42 или 44.
Также изобретение относится к химерной тяжелой цепи, содержащей вариабельную область 8Е0 ГО N0: 39, 41 или 43.
Если желательно, например, для диагностических целей или для целей анализа (например, визуализации), химерное антитело или его антигенсвязывающая часть могут содержать поддающуюся выявлению метку, например, как описано в настоящем описании для гуманизированных антител. Все подходящие способы и технологии, описанные в настоящем описании для гуманизированных антител по настоящему изобретению, также можно использовать для химерных антител по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ССЬ20 по изобретению представляет собой полностью человеческое антитело. Как используют в рамках изобретения, термин "антитело человека" означает любое антитело, в котором последовательности вариабельного и константного доменов представляют собой последовательности человека. Термин охватывает антитела с последовательностями, происходящими из генов человека, но которые изменены, например, для снижения возможной иммуногенности, увеличения аффинности, удаления остатков цистеина, которые могут вызывать нежелательное сворачивание и т.д. Также термин охватывает такие антитела, продуцированные рекомбинантными способами в не являющихся человеческими клетках, которые могут обеспечивать гликозилирование, не являющееся типичным для клеток человека. Способы получения полностью человеческих антител известны в данной области. Например, антитела против ССЬ20 человека можно идентифицировать способами ίη νίΐΓΟ, такими как фаговый дисплей, рибосомный дисплей (САТ), дрожжевой дисплей и т.п. или можно получать из В-клеток человека или гибридомной клетки человека. Альтернативно антитела человека можно получать путем иммунизации антигеном ССЬ20 любого из ряда не являющихся человеком трансгенных животных, содержащих в их геномах некоторые или все из локусов тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком животное, содержащее гены иммуноглобулинов человека, представляет собой животное, которое имеет "минилокус" иммуноглобулина человека (например, СепРЬагт 1п1етайопа1, 1пс.). В некоторых вариантах осуществления антитела против ССЬ20 человека получают с использованием XЕN0Μ0υδЕ® (АЬдетх, 1пс., ЕгетоШ, СА), НиМАЬ-Моике® (Мейагех, 1пс.), мыши Уе1ос1ттипе® (Кедепегоп РЬагтасеиЕсак, 1пс.), мыши А1АаМаЬ (АЬ1ех18, ЕЬС), мыши КМ'™ (Ктп РЬагта И8А, 1пс.) или сходных с ними.
Также настоящее изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности, которые кодируют гуманизированное антитело или его легкую цепь или тяжелую цепь, моноклональное антитело мыши или его легкую цепь или тяжелую цепь, химерное антитело или его легкую цепь или тяжелую цепь, или антигенсвязывающие части любого из описанных выше, по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 17-32, 51-56, 109, 111 и 113.
В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот по изобретению включают последовательности нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости, или которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны, одной или нескольким последовательностям нуклеиновых кислот, указанным в настоящем описании, или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность любой из последовательностей УН или Уь.
Нуклеиновые кислоты, называемые в настоящем описании "выделенными" или "очищенными", представляют собой нуклеиновые кислоты, которые отделены от нуклеиновых кислот геномной ДНК или клеточной РНК их источника (например, как они существуют в клетках или смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека), и включают нуклеиновые кислоты, получаемые способами, описанными в настоящем описании, или другими подходящими способами. В некоторых вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты представляют собой по существу чистые нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты получаемые химическим синтезом, нуклеиновые кислоты, получаемые комбинациями биологических и химических способов, или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые являются выделенными (см., например, ОаидЬеПу е1 а1., №с1ею АсМк Ке8. 19 (9) :2471-2476 (1991); ЬеЮк апй Сго^е, Сепе 101: 297-302 (1991)).
Указание на нуклеотидную последовательность охватывает комплементарную ей последовательность, если нет иных указаний. Таким образом, следует понимать, что указание на нуклеиновую кислоту, имеющую конкретную последовательность, охватывает ее комплементарную нить с комплементарной ей последовательностью. Термин "полинуклеотид", упоминаемый в настоящем описании, означает полимерную, возможно выделенную, форму нуклеотидов, длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, или модифицированной формы любого типа нуклеотида. Тер- 27 029419
мин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы.
Нуклеиновые кислоты, называемые в настоящем описании "рекомбинантными", представляют собой нуклеиновые кислоты, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, включая нуклеиновые кислоты, которые получены с помощью методик, которые основаны на способе искусственной рекомбинации, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и/или клонирование в вектор с использованием ферментов рестрикции. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты являются результатом событий рекомбинации, которые происходят посредством естественных механизмов в клетках, однако подвергнуты селекции после введения в клетки нуклеиновых кислот, предназначенных для того, чтобы позволить и сделать возможным желаемое событие рекомбинации.
Также настоящее изобретение относится, более конкретно, к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим нуклеотидную последовательность, которая кодирует гуманизированное антитело, антитело мыши или химерное антитело, или антигенсвязывающую часть указанного антитела, которая обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело мыши по настоящему изобретению, гуманизированное антитело по настоящему изобретению, в котором не являющаяся человеческой часть(и) происходит из моноклонального антитела мыши против ССЬ20; или химерное антитело по настоящему изобретению, в котором не являющаяся человеческой часть(и) происходит из моноклонального антитела мыши против ССЬ20.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по изобретению используют для получения гуманизированных антител, обладающих специфичностью связывания с ССЬ20 человека, антител мыши, обладающих специфичностью связывания с ССЬ20 человека, и химерных антител, обладающих специфичностью связывания к ССЬ20 человека. Например, нуклеиновая кислота (например, ДНК (такая как кДНК) или РНК) или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих гуманизированное антитело, антитело мыши или химерное антитело по настоящему изобретению, могут быть включены в подходящую конструкцию (например, рекомбинантный вектор) для дальнейшего манипулирования последовательностями или для получения кодируемых антител в подходящих клетках-хозяевах.
Также предусматриваются конструкции или векторы, подходящие для экспрессии гуманизированного антитела, обладающего специфичностью связывания с ССЬ20 человека, антитела мыши, обладающего специфичностью связывания с ССЬ20 человека, или химерного антитела, обладающего специфичностью связывания с ССЬ20 человека. Доступны различные векторы, включая векторы, которые поддерживаются в клетке-хозяине в виде одной копии или в виде множества копий, или которые встраиваются в хромосому(ы) клетки-хозяина. Конструкции или векторы можно встраивать в подходящую клетку-хозяина, и клетки, которые экспрессируют гуманизированное антитело, антитело мыши или химерное антитело по настоящему изобретению, можно получать и поддерживать в культуре. Для экспрессии гуманизированного антитела, антитела мыши или химерного антитела, обладающего специфичностью связывания с ССЬ20 человека, можно использовать один вектор или более векторов.
Подходящие экспрессирующие векторы, например, экспрессирующие векторы клеток млекопитающих, также могут содержать ряд компонентов, включая, но не ограничиваясь ими, один или более из следующих: ориджин репликации; ген селективного маркера; один или более элементов контроля экспрессии, таких как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энханесер, терминатор), один или более сигналов трансляции; и/или сигнальную последовательность или лидерную последовательность (кодирующую "сигнальный пептид") для направления к мембране или секреции. В конструкции или векторе сигнальная последовательность может обеспечиваться конструкцией или вектором или другим источником. Например, для контроля экспрессии можно использовать сигналы транскрипции и/или трансляции.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрен промотор для экспрессии антитела или цепи антитела по изобретению в подходящей клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления промотор является конститутивным. В некоторых вариантах осуществления промотор является индуцибельным. Промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело или цепь антитела, или антигенсвязывающую часть указанного антитела или цепи, так чтобы он контролировал экспрессию кодируемого полипептида. Доступно множество подходящих промоторов для прокариотических (например, промоторы 1ас, 1ас. Т3, Т7 для Е. сой) и эукариотических (например, алкогольдегидрогеназа дрожжей (ΆΌΗ1), §У40, СМУ) хозяев.
Специалисты в данной области способны выбрать подходящий промотор для экспрессии антитела против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий антитело или цепь антитела по изобретению, содержит селективный маркер для селекции клеток-хозяев, несущих вектор. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой ген, кодирующий продукт, который обеспечивает устойчивость к антибиотику или лекарственному средству, который можно использовать в прокариотических клетках (например, ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Те! (устойчивость к тетрациклину), и т.д.) и эукариотических клетках (например, гены устойчивости к неомицину (С418 или генетицин), §ρΐ (микофеноловая кислота), ампициллину или гигромицину). В некоторых вариантах осу- 28 029419
ществления селективный маркер представляет собой дигидрофолатредуктазу, позволяющую селекцию с помощью метотрексата в различных хозяевах, в некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой ген, кодирующий ауксотрофный маркер хозяина (например, ЬЕШ, ИКА3, ΗΙ§3), например, для применения в дрожжах. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный (например, бакуловирусный) или фаговый вектор. В одном варианте осуществления вектор способен встраиваться в геном клетки-хозяина (например, ретровирусный вектор). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой реплицирующийся вектор и содержит ориджин репликации.
Таким образом, изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют гуманизированное антитело, гуманизированную легкую цепь, гуманизированную тяжелую цепь, антитело мыши, легкую цепь антитела мыши, тяжелую цепь антитела мыши, химерное антитело, химерную легкую цепь или химерную тяжелую цепь по настоящему изобретению. Также изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антигенсвязывающую часть любого из этих антител или их цепей. Полипептидные последовательности, кодируемые нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению, описаны выше и в следующих примерах.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или вектор по настоящему изобретению кодирует тяжелую цепь (или ее антигенсвязывающую часть) или легкую цепь (или ее антигенсвязывающую часть) по изобретению. Клетка-хозяин, содержащая как нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, так и нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, или нуклеиновые кислоты, кодирующие антигенсвязывающие части указанной тяжелой цепи и указанной легкой цепи, можно использовать для получения антитела, содержащего тяжелую и легкую цепь (или антигенсвязывающую часть антитела). Нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, и нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, можно помещать в отдельные экспрессирующие векторы. Их также можно помещать в один экспрессирующий вектор с тем же или другим контролем экспрессии. См., например, патенты США № 6331415 и 7662623.
Другой аспект изобретения относится к способу получения антитела против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части по изобретению. Антитело или часть можно получать, например, путем экспрессии одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или часть, в подходящей клетке-хозяине. Клетку-хозяина можно получать с использованием любого подходящего способа. Например, в подходящую клетку-хозяина можно встраивать одну или более экспрессирующих конструкций, описанных в настоящем описании, и полученную клетку можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии конструкции(ий) или вектора(ов). В некоторых вариантах осуществления полученную клетку поддерживают в культуре, в животном или в растении. Подходящие клетки-хозяева могут быть прокариотическими, включая бактериальные клетки, такие как Е. сой (например, штамм ΩΗ5σ.'™ Опуйгодсп. СагНЪай, СА)), В. 8иЪйЙ8 и/или другие подходящие бактерии; эукариотические клетки, такие как клетки грибов и дрожжевые клетки (например, РюЫа ра81оп8, А8регдй1и8 8р., §ассйагошусек се^еν^8^ае, §сй|/о8ассйаготусе8 ротЪе, Ыеиго8рога сга88а), или другие клетки низших эукариот, и клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых (например, клетки §2 Ого8орйПа §сйие1йег, клетки насекомых §£9 (АО 94/26087 (О'Сопиог), клетки насекомых ΤΝ5Β1-4 (ΗΙΟΗ 5) (1^йгодеи), клетки млекопитающих (например, клетки СО§, такие как СО§-1 (номер доступа АТСС № СКЬ-1650) и СО§7 (номер доступа АТСС № СКЬ-1651), СНО (например, номер доступа АТСС № СКЬ-9096), СНО ΩΟ44 (иг1аиЪ аий Сйа8ш., Ргос. №-И1. Асас. δα. и§А 77 (7): 4216-4220 (1980)), 293 (номер доступа АТСС № СКЬ-1573), НеЬа (номер доступа АТСС № ССЬ-2), СУ1 (номер доступа АТСС № сСй-70), АОР (Эайеу е! а1., 1. Уио1. 54:739-749 (1985)), 3Τ3, 293Т (Реаг е! а1., Ргос. №И. Асай §а. и.§.А. 90:8392-8396 (1993)), клетки ^О, клетки §Р2/0, клетки НиТ 78 и т.п.)), или клетки растений (например, табака, ряски (мокрица), и водорослей). (См., например, Аи8иЪе1 е! а1, ей8. Сиггеи! РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огееие РиЪЙ8Й1ид А88оаа1е8 и 1ойи Айеу & §ои8 1ис. (1993)). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин не является частью многоклеточного организма (например, растения или животного). В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой выделенную клетку-хозяина или является частью клеточной культуры.
Настоящее изобретение также относится к клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и легкие цепи гуманизированного антитела или его антигенсвязывающей части, тяжелые и легкие цепи антитела мыши или его антигенсвязывающей части, или тяжелые и легкие цепи химерного антитела или его антигенсвязывающей части, причем указанное антитело или его часть обладают специфичностью связывания с ССЬ20 человека, или одну или более конструкций, содержащих такую нуклеиновую кислоту(ы), можно встраивать в подходящую клетку-хозяина способом, подходящим для выбранной клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления способ введения представляет собой, например, трансформацию, трансфекцию, электропорацию или инфекцию. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота(ы) функционально связана с одним или несколькими элементами контроля экспрессии. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота(ы) находится в векторе, в кон- 29 029419
струкции, созданной посредством процессов в клетке, или встроена в геном клетки-хозяина. Клеткихозяева можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления эти условия включают наличие индуктора, или подходящей среды (дополненной, например, соответствующими солями, факторами роста, антибиотиком, питательными добавками и т. д.), посредством чего получают кодируемый полипептид(ы). Эти процессы охватывают экспрессию в клетке-хозяине (например, клетке молочной железы) трансгенного животного или растения (например, табака) (см., например, \У0 92/03918). В некоторых вариантах осуществления антитела или их части выделяют из клетокхозяев, культуральной среды или молока.
Изобретение также относится к слитым белкам, в которых антитело или его часть по изобретению (например, гуманизированное антитело или часть) связаны с другой частью (например, частью, которая не встречается в антителах, встречающихся в природе) на Оконце, С-конце или внутри слитого белка. В некоторых вариантах осуществления слитый белок можно получать встраиванием нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность(и) антитела, в подходящий экспрессирующий вектор, такой как вектор рЕТ (например, рЕТ-15Ь, Nονадеη), фаговый вектор (например, рСАЭТАВ 5 Е, РЬагшаша), или другой вектор (например, слитый вектор рК1Т2Т-белок А, РЬагшаша). Полученную конструкцию можно вводить в подходящую клетку-хозяина для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления экспрессированные слитые белки выделяют или очищают из клеточного лизата с помощью подходящей аффинной матрицы (см., например, СиггеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Аи8иЬе1 е1 а1., Еб§., Уо1. 2, Зирр1. 26, рр. 16,4,1-16,7,8 (1991))).
Изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую антитело или его часть, или его тяжелые и/или легкие цепи, описанные в настоящем описании (например, гуманизированное антитело, гуманизированная легкая цепь или гуманизированная тяжелая цепь, антитело мыши, легкая цепь мыши и тяжелая цепь мыши, химерное антитело или химерная тяжелая цепь или химерная легкая цепь по изобретению). Изобретение также относится к клеткехозяину, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую антигенсвязывающую часть антитела или его цепей. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит рекомбинантный вектор по изобретению, как указано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления указанный рекомбинантный вектор представляет собой экспрессирующий вектор. В определенных вариантах осуществления указанный рекомбинантный вектор представляет собой экспрессирующий вектор клеток млекопитающих.
Изобретение также относится к способу получения антитела или части, или их тяжелой или легкой цепи по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления способ включает поддержание клетки-хозяина по изобретению, как описано в настоящем описании, в условиях, подходящих для экспрессии антитела или части или их тяжелой и/или легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или более выделенных нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело или часть, или их тяжелую и/или легкую цепь, по изобретению. В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина культивируют на подложке или в суспензии. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию очистки или выделения антитела или цепи антитела.
Кроме того, изобретение относится к способу получения антител или их антигенсвязывающих частей с помощью фагового дисплея. В некоторых вариантах осуществления проводят сортировку библиотеки фагового дисплея наивных антител на антигене ССЬ20. В некоторых вариантах осуществления используют способ получения антител посредством направленной селекции (см., например, публикацию патента США № ИЗ 2006-0251658 А1). В определенных вариантах осуществления создают библиотеку на заказ, сконструированную на основе, например, фиксированной области СЭК3 тяжелой цепи (и/или легкой цепи) известного антитела против ССЬ20. Области СЭК1 и СЭК2 тяжелой и легкой цепей могут происходить из наивного репертуара (08Ьигп е1 а1., МебюШ 36, 61-68 (2005)). В одном варианте осуществления получают δсΡν против ССЬ20 из библиотек наивных антител δсΡν, которые используют для получения химерных антител мыши-человека с желаемыми связывающими свойствами. Эти библиотеки можно подвергать скринингу в отношении антител с желаемыми связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления используют фаговые библиотеки δсΡν. В определенных вариантах осуществления δсΡν, которые распознают ССЬ20 человека, выделяют из библиотек с направленной селекцией δсΡν с последующей серией повторяющих циклов селекции на рекомбинантном ССЬ20 человека, по существу как описано УаидЬап е1 а1., №1иге Вю1есЬ. 14:309-314 (1996). В кратком изложении, после инкубации с библиотекой иммобилизованный антиген, который предварительно связан с парамагнитными гранулами, и связанный фаг можно выделять с помощью магнитного разделения, в то время как не связанный фаг смывают. Затем связанный фаг можно освобождать, как описано УаидЬап е1 а1. (1996; выше), и повторять процесс селекции.
В конкретном варианте осуществления конструируют библиотеку, состоящую из целого вариабельного домена тяжелой цепи антитела мыши против ССЬ20, слитого в формате единой цепи с репертуаром наивных вариабельных областей легкой цепи человека. После селекции идентифицируют вариабельные области легкой цепи человека, которые комплементируют вариабельные области тяжелой цепи мыши. Затем конструируют библиотеку, состоящую из репертуара вариабельных областей легкой цепи челове- 30 029419
ка, отобранных, как описано выше, слитых в формате единой цепи с химерной вариабельной областью тяжелой цепи, состоящей из наивных областей СЭК1 и СЭК2 человека и фиксированной области СЭК3 из вариабельного домена тяжелой цепи антитела мыши против ССЬ20. После селекции связывающихся с ССЬ20 конструкций, отбирают клоны с наилучшим связыванием. От пяти до шести областей СОК могут происходить из человека, в то время как СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи может быть идентична исходной СЭК3 вариабельного домена тяжелой цепи мыши.
В некоторых вариантах осуществления селекцию проводят с использованием ССЬ20, связанного с амином ОУНЛВЕЛЭ8 М-270 (Эупа1) в соответствии с рекомендациями изготовителя. В некоторых вариантах осуществления можно проводить селекцию с использованием биотинилированного ССЬ20 с использованием специфичного к первичному амину реагента сукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноата в соответствии с инструкциями изготовителя (Е2 Ппк N48 ЬС Βίοίίη, Иегсе).
В некоторых вариантах осуществления полученные в результате селекции конструкции исследуют в качестве периплазматических препаратов в высокопроизводительном скрининге на основе конкурентных анализов, которые измеряют способность 8сРу, присутствующих в периплазматическом препарате, конкурировать за связывание с ССЬ20.
Образцы, которые способны конкурировать в высокопроизводительном скрининге, можно подвергать секвенированию ДНК, как описано УаидЬап е! а1. (1996; выше) и 0§Ьигп е! а1. (2005; выше). Затем клоны можно экспрессировать и очищать в качестве 8сРу или 1дО и оценивать в отношении их способности связывать ССЬ20, нейтрализовывать ССЬ20 или их комбинации, например, с использованием анализов, таких как анализ антителозависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ЛЭСС) и анализ комплементзависимой цитотоксичности (СЭС). Затем очищенные препараты 8сРу можно получать, как описано в примере 3 \У0 01/66754. Концентрацию белка в очищенных препаратах 8сРу определяли с использованием способа ВСА (Иегсе). Сходные подходы можно использовать для скрининга оптимального партнера (противоположная цепь) фиксированной тяжелой или легкой цепи или вариабельного домена тяжелой или легкой цепи полноразмерного антитела.
В другом варианте осуществления антитело против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающую часть, как описано в настоящем описании, сначала используют для селекции последовательностей тяжелых и легких цепей, имеющих сходную активность связывания в отношении ССЬ20, с использованием способов импринтинга эпитопов, описанных в публикации РСТ № XV0 93/06213, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В определенных вариантах осуществления библиотеки антител, используемые в этом способе, представляют собой библиотеки 8сРу, полученные и подвергнутые скринингу, как описано в публикации РСТ № ν0 92/01047, МсСайейу е! а1., №Циге 348:552-554 (1990); и Οηί1'цк е! а1., ЕМВ0 I. 12:725-734 (1993), все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок. В определенных вариантах осуществления библиотеки антител 8сРу подвергают скринингу с использованием ССЬ20 человека в качестве антигена.
После отбора исходных доменов Уъ и νΗ можно проводить эксперименты по "смешению и подбору", в которых различные пары первоначально отобранных сегментов V и νΗ подвергают скринингу в отношении связывания ССЬ20 для селекции предпочтительных комбинаций пар У[,/Ун. Кроме того, для дальнейшего повышения качества антитела сегменты Ун и νΗ предпочтительной пары(пар) У3/Ун можно случайным образом подвергать мутации в процессе, аналогичном процессу соматической мутации ίη νίνο, ответственного за созревание аффинности антител в ходе естественного иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления случайные мутации возникают в области СЭК3 νΗ и/или Уь. В определенных вариантах осуществления это созревание аффинности ίη νίίτο проводят, например, путем амплификации доменов νΗ и У[, с использованием праймеров для ПЦР, комплементарных СЭК3 νΗ или СЭК3 Уъ, соответственно, где в праймеры "встроена" случайная смесь четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так чтобы полученные продукты ПЦР кодировали сегменты Ун и Уъ, в которые внесены случайные мутации в области СЭК3 νΗ и/или Уь. Эти подвергнутые случайному мутагенезу сегменты Ун и Уъ можно подвергать повторному скринингу в отношении связывания с ССЬ20.
После скрининга и выделения антитела против ССЬ20 по изобретению из библиотеки дисплея рекомбинантных антител, нуклеиновые кислоты, кодирующие отобранное антитело, можно выделять из комплекса дисплея (например, из фагового генома) и субклонировать в другие экспрессирующие векторы стандартными способами рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления проводят дальнейшее манипулирование нуклеиновой кислотой для получения других форм антител по изобретению, как описано в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления для экспрессии рекомбинантного антитела человека, выделенного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в клетки-хозяева млекопитающих, как описано в настоящем описании.
В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу получения гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, которое обладает специфичностью связывания с ССЬ20 человека, включающему введение лимфоцитов трансгенной по ССЬ20 мыши нетрансгенной мыши той же линии (например, СЭ1), что и трансгенная по ССЬ20 человека мышь, тем самым, получая иммунизированную нетрансгенную мышь. Спленоциты иммунизированной нетрансгенной мыши контактируют с
- 31 029419
иммортализованными клетками, тем самым, получая слитые клетки, и слитые клетки поддерживают в условиях, в которых продуцируются гибридомы, которые секретируют моноклональное антитело, обладающее специфичностью связывания с ССБ20 человека, тем самым получая гибридому, которая секретирует моноклональное антитело, которое обладает специфичностью связывания с ССБ20 человека.
Настоящее изобретение также относится к способам получения мутантных форм антител против ССБ20 и их антигенсвязывающих частей по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитела или их части подвергают мутации в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей. В определенных вариантах осуществления указанная мутация изменяет одно или более свойств связывания антитела или части. В конкретных вариантах осуществления мутацию вносят в одну или более областей СОК для увеличения или снижения Кс антитела против ССБ20 или его части, для увеличения или снижения ко££, или для изменения специфичности связывания антитела или его части. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, 8атЬгоок с1 а1., и АикиЬе1 с1 а1., выше. В другом варианте осуществления одну или более мутаций вносят в аминокислотный остаток, о котором известно, что он изменен по сравнению с эмбриональным типом в моноклональном антителе по изобретению. В определенных вариантах осуществления мутации вносят в область СОК или каркасную область вариабельного домена, или в константный домен. В конкретном варианте осуществления мутации вносят в вариабельный домен. В некоторых вариантах осуществления одну или более мутаций вносят в аминокислотный остаток, о котором известно, что он изменен по сравнению с эмбриональным типом в области СОК или каркасной области вариабельного домена антитела или части по изобретению.
В другом варианте осуществления каркасную область подвергают мутации так, чтобы полученная каркасная область(и) имела аминокислотную последовательность соответствующего гена эмбрионального типа. В определенных вариантах осуществления одну или более мутаций вносят в каркасную область или константный домен для увеличения времени полужизни антитела против ССБ20 или его части. См. например публикацию РСТ νΟ 00/09560. В определенных вариантах осуществления мутацию в каркасной области или константном домене вносят для изменения иммуногенности антитела, или для обеспечения участка для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой. В соответствии с изобретением, отдельное антитело или его часть может иметь мутации в любой одной или нескольких СЭК или каркасных областях вариабельного домена или в константном домене.
Антитела против ССБ20 или их антигенсвязывающие части по изобретению также можно получать трансгенно путем получения млекопитающего или растения, которые являются трансгенными по последовательностям тяжелой и легкой цепи представляющего интерес антитела, и продукции антитела из них в поддающейся выделению форме. В некоторых вариантах осуществления антитела против ССБ20 или их части продуцируют в, или выделяют из, молока коз, коров или других млекопитающих. См., например, патенты США № 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957. В некоторых вариантах осуществления не являющихся человеком трансгенных животных, которые содержат локусы антител человека, иммунизируют ССБ20 человека или его иммуногенной частью, как описано выше. Способы получения антител в растениях описаны, например, в патентах США № 6046037 и 5959177.
В некоторых вариантах осуществления не являющихся человеком трансгенных животных или растения получают путем введения одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против ССБ20 или его часть по изобретению, в животное или растение стандартными трансгенными способами. См. Нодап и патент США № 6417429, выше. В определенных вариантах осуществления трансгенные клетки, используемые для получения трансгенного животного, могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки или соматические клетки или оплодотворенное яйцо. В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком трансгенные животные или растения являются химерными, нехимерными гетерозиготными или нехимерными гомозиготными. См., например, Нодап е1 а1., МашрШайпд 1йе Мойке ЕтЬгуо: А ЬаЬогаШгу Мапиа1 2пй ей., Со1й 8ргтд НагЬог Ргекк (1999); Шсккоп е1 а1, Мойке Сепейск апй Тгапкдетск: А Ргасйса1 Арргоасй, Οχ&Γά ипАегкйу Ргекк (2000); и Ршкей, Тгапкдетс Атта1 ТесЬпо1оду: А ЬаЬога&гу НапйЬоок, Асайетю Ргекк (1999). В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком трансгенные животные или растения имеют направленное прерывание и замену посредством нацеливающей конструкции, которая кодирует представляющую интерес тяжелую цепь и/или легкую цепь. В определенных вариантах осуществления трансгенные животные или растения содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелые и легкие цепи, которые специфично связываются с ССБ20 человека. Антитела против ССБ20 или их части можно получать в любом не являющемся человеком трансгенном животном или растении. В конкретных вариантах осуществления не являющиеся человеком животные представляют собой мышей, крыс, овец, свиней, коз, крупный рогатый скот и лошадей. Не являющееся человеком трансгенное животное может экспрессировать кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезной жидкости, слизи и других жидкостях организма.
Антитела и их антигенсвязывающие части по изобретению пригодны для нейтрализации индуцируемой ССБ20 хемоатракции, например, ССК6+ клеток, таких как незрелые дендритные клетки (ОС), эффекторные Т-клетки/Т-клетки памяти, и В-клетки. Антитела и их части, таким образом, могут быть пригодными для лечения различных заболеваний и состояний, таких как воспаление, аутоиммунные за- 32 029419
болевания и злокачественная опухоль. Примеры заболеваний и состояний, которые можно лечить с помощью антител и их антигенсвязывающих частей по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, болезнь Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизм, ревматоидный артрит, псориаз, атопический дерматит, контактный дерматит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, Вклеточные злокачественные опухоли, аденокарциному молочной железы, хронический гепатит, контактный дерматит, глиобластому, печеночно-клеточную карциному, инфекцию шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидный микоз, аденокарциному поджелудочной железы, пародонтоз, папиллярную карциному щитовидной железы, пустулез ладоней и стоп, состояния, ассоциированные с макулопапиллярной экзантемой, буллезный эпидермоз, очаговую алопецию, рассеянный склероз, полимиозит, дерматомиозит, болезнь Бехчета, острый генерализованный экзантематозный пустелез, васкулит, ювенильный идиопатический артрит, саркоидоз, бронхиальную астму, аллергический ринит, отторжение аллотрансплантата почки, реакцию "трансплантат против хозяина", отторжение аллотрансплантата печени, хроническое обструктивное заболевание легких, кистозный фиброз, гломерулонефрит, инфекцию респираторно-синцитиальным вирусом, множественную миелому и гистиоцитоз клеток Лангерганса. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения любого ассоциированного с ССР6 состояния.
Таким образом, изобретение относится к способам лечения воспаления, аутоиммунного заболевания или злокачественной опухоли путем введения эффективного количества антитела или его части по изобретению индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является пациент-человек, имеющий или имеющий риск аутоиммунного заболевания, злокачественной опухоли и/или воспаления. В некоторых вариантах осуществления антитело или его часть вводят профилактически для предотвращения возникновения или рецидива воспаления, аутоиммунного заболевания или злокачественной опухоли.
Антитела и их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно вводить индивидууму (например, человеку) отдельно или совместно с другим средством в комбинированной терапии. Антитела или их части можно вводить до, в качестве смеси, отдельно, но одновременно с, или после введения дополнительного средства. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбрано из группы, включающей, но не ограничивающейся ими: ингибиторы иммуностимулирующих цитокинов (например, МАЬ против ТОТ1-»), средства, устраняющие иммунные клетки (например, МАЬ против СЭ20). блокаторы вспомогательных молекул (например, АЬа1асер1), модифицирующие заболевание средства от ревматических заболеваний (например, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства Щ8АГО), метотрексат, ретиноевые кислоты и аналоги витамина Ό3) и иммунодепрессанты (например, ингибиторы кальциневрина). В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбрано из группы, включающей, но не ограничивающейся ими: стероидные средства, иммуномодулирующие средства, соматостатические средства, общепринятые иммунотерапевтические средства, цитокины или антагонисты цитокинов, и/или факторы роста или антагонисты факторов роста. В некоторых вариантах осуществления терапию антителом против ССБ20 можно использовать вместе со стандартными способами лечения злокачественной опухоли, такими как химиотерапия, хирургическая операция или лучевая терапия, или с другой направленной терапией, такой как терапия антителом против УЕСР. В некоторых вариантах осуществления терапию антителом против ССБ20 можно использовать совместно с профилактическим режимом. В одном варианте осуществления совместно с антителом по настоящему изобретению можно вводить миметик синтетического пептида. В другом варианте осуществления гормональную терапию можно проводить совместно с антителом или его частью по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят отдельно или в комбинации с противовоспалительным средством.
Противовоспалительные средства, которые можно вводить с антителами по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, кортикостероиды (например, бетаметазон, будезонид, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, балсалазид, целекоксиб, диклофенак, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флоктафенин, флубипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамат, мефенаминовая кислота, мелоксикам, набуметон, напроксен, олсалазин, оксапрозин, фенилбутазон, пироксикам, салсалат, сулиндак, теноксикам, тиапрофеновая кислота и толметин), а также ацетаминофен, антигистамины, производные аминоарилкарбоновой кислоты, производные арилуксусной кислоты, производные арилмасляной кислоты, арилкарбоновые кислоты, производные арилпропионовой кислоты, пиразолы, пиразолоны, производные салициловой кислоты (например, сульфасалазон и мезаламин), тиазинкарбоксамиды, е-ацетамидокапроевую кислоту, 8-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляную кислоту, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, гвайазулен, набуметон, нимезулид, орготеин, оксацепрол, паранилин, перизоксал, пифоксим, проквазон, проксазол и тенидап.
Общепринятые неспецифические иммуносупрессивные средства, которые можно вводить в комбинации с антителами по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, стероиды, циклоспорин,
- 33 029419
аналоги циклоспорина, циклофосфамид, метилпреднизон, преднизон, азатиоприн, РК-506, 15дезоксиспергуалин, натализумаб и другие иммуносупрессивные средства, которые действуют, подавляя функцию отвечающих Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с иммунодепрессантами. Иммунодепрессивные препараты, которые можно вводить с антителами по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, 0КТН0СЬ0МЕ™ (ОКТ3), 8АМВ1ММиМЕ™/МЕ0КАЬ™/8А^И¥А™ (циклоспорин), РК0ОКАР™ (такролимус), СЕЬЬСЕРТ™ (микофенолат), азатиоприн, глюкокортикостероиды, АУ0ИЕХ™ (интерферон-бета 1А) и
КАРАМиМЕ™ (сиролимус). В одном варианте осуществления иммунодепрессанты можно использовать для предупреждения отторжения трансплантата органа или костного мозга.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством. Химиотерапевтические средства, которые можно вводить с антителами по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, производные антибиотиков (например, доксорубицин, блеомицин, даунорубицин и дактиномицин); антиэстрогены (например, тамоксифен); антиметаболиты (например, фторурацил, 5-РИ, флоксуридин, интерферон альфа-2Ъ, глутаминовая кислота, пликамицин, меркаптопурин и 6-тиогуанин); цитотоксические средства (например, кармустин, ВСШ, ломустин, СС'Хи. цитозин арабинозид, циклофосфамид, эстрамустин, гидроксимочевина, прокарбазин, митомицин, бусульфан, цисплатин и винкристина сульфат); гормоны (например, медроксипрогестерон, эстрамустин фосфат натрий, этинилэстрадиол, эстрадиол, адреналин, магестрола ацетат, метилтестостерон, диэтилстилбестрола дифосфат, хлортрианизен и тестолактон); производные азотистого иприта (например, мефален, хлорамбуцил, мехлорэтамин (азотистый иприт) и тиотепа); стероиды и их комбинации (например, бетаметазон фосфат натрия) и другие (например, дикарбазин, аспарагиназа, митотан, винкристина сульфат, винбластина сульфат, ритуксимаб и этопозид).
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с антагонистом ТИР. Антагонисты ТИР, которые можно вводить с антителами или их антигенсвязывающими частями по изобретению включают, но не ограничиваются ими, инфликсимаб (КЕМ1САЭЕ™), адалимумаб (НИМ1КА™), цертолизумаб пегол (С1М21А™), голимумаб (81МР0№™), этанерцепт (ЕNВКЕ^™), производные ксантина (например, пентоксифилен) и бупропион (ШЕЬЬВик™™, /¥ВА\™).
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят отдельно или в комбинации с одним или несколькими внутривенными препаратами иммуноглобулинов. Внутривенные препараты иммуноглобулинов, которые можно вводить с антителами или их частями по изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, ОАММАК™, 1УЕЕОАМ™, 8АЮ П0СВ0ВЕМ\ОАММАОАКЭ 8/Ό™ и ОАМ1МиХЕ™. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с внутривенными препаратами иммуноглобулинов в трансплантационной терапии (например, трансплантат костного мозга).
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с цитокинами или антагонистами цитокинов. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению можно вводить с любым цитокином или антагонистом цитокина, включая, но не ограничиваясь ими, 1Ь2, 1Ь3, 1Ь4, 1Ь5, 1Ь6, 1Ь7, 1Ь10, 1Ь12, 1Ь13, 1Ь15, антитело против СИ40, СИ40Е, ГР№у и ТХР-α или любой их антагонист. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению можно вводить с любым интерлейкином или антагонистом интерлейкина, включая, но не ограничиваясь ими, 1Ь-1а, 1Ь-1а, ГО-2, 1Ь-3, ГО-4, ГО-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18, ГО19, ГО-20 и ГО-21 или любой их антагонист.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с одним или несколькими хемокинами или антагонистами хемокинов. В конкретных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с а(СхС)-хемокином, выбранным из группы, состоящей из индуцируемого гаммаинтерфероном белка 10 (γΙΡ-10), интерлейкина-8 (ГО-8), тромбоцитарного фактора-4 (РР4), активирующего нейтрофилы белка (ЯАР-2), ОК0-а, ОК0-Р, ОК0-у, активирующего нейтрофилы пептида (ЕКА78), гранулоцитарного хемоаттрактантного белка 2 (ОСР-2), и происходящего из стромальных клеток фактора 1 (8ИР-1 или фактора, стимулирующего пре-В-клетки (РВ8Р)); и/или Р(СС)-хемокина, выбранного из группы, состоящей из: КАNТЕδ (белок, регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками), воспалительный белок макрофагов 1 альфа (М1Р-1а), воспалительный белок макрофагов 1 бета (М1Р-1 β), белок хемотаксиса моноцитов 1 (МСР-1), белок хемотаксиса моноцитов 2 (МСР-2), белок хемотаксиса моноцитов 3 (МСР-3), белок хемотаксиса моноцитов 4 (МСР4), воспалительный белок макрофагов 1 гамма (М1Р-1у), воспалительный белок макрофагов 3 альфа (М1Р-3а), воспалительный белок макрофагов 3 (М1Р^), воспалительный белок макрофагов 4 (М1Р4/ИС-СК-1/РАКС), эотаксин, Ехобик и 1-309; и/или у(С)-хемокин, лимфотактин; или любого их антаго- 34 029419
ниста.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят с хемокином бета-8, хемокином бета-' и/или воспалительным белком макрофагов 4, или любым их антагонистом. В предпочтительном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят с хемокином бета-8 или их антагонистом.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с антагонистом 1Ь-4. Антагонисты 1Ь-4, которые можно вводить с антителом и композициями антитела по изобретению, включают, но не ограничиваются ими: растворимые полипептиды рецептора 1Ь-4, мультимерные формы растворимых полипептидов рецептора 1Ь-4, антитела против рецептора 1Ь-4, которые связывают рецептор 1Ь-4 без передачи биологического сигнала, индуцируемого 1Ь-4, антитела против 1Ь4, которые блокируют связывание 1Ь-4 с одним или несколькими рецепторами 1Ь-4, и мутеины 1Ь-4, которые связывают рецепторы 1Ь-4, но не передают биологический сигнал, индуцируемый 1Ь-4. Предпочтительно, антитела против 1Ь4, используемые в соответствии с этим способом, представляют собой моноклональные антитела; также можно использовать их антигенсвязывающие части.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации с представителями семейства ΤΝΡ или их антагонистами. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению вводят в комбинации со средствами, которые включают, но не ограничиваются ими, растворимые формы ΤΝΡ-α, лимфотоксин-альфа (ЬТ-альфа, также известный как ΤΝΡ-бета), ЬТ-бета (встречающийся в комплексном гетеротримере ЬТ-альфа2-бета), ОРОЬ, Ρа8^, СИ27Ь, СИ30Ь, СИ40Ь, 4-1ВВЬ, ИсК3, ОХ40Ь, ТОТДамма (международная публикация № XVО 96/14328), А1М-1 (международная публикация № XVО 97/33899), эндокин-альфа (международная публикация № XVО 98/07880), ОРО, нейтрокин-альфа (международная публикация № XVО 98/18921), ОХ40, фактор роста нервов (ΝΟΡ), растворимые формы Ρа8, СИ30, СИ27, СИ404-1ВВ, ТК2 (международная публикация № XVО 96/34095), ИК3 (международная публикация № ^О 97/33904), ИК4 (международная публикация № ^О 98/32856), ТК5 (международная публикация № XVО 98/30693), ТК6 (международная публикация № ^О 98/30694), ТК7 (международная публикация № ^О 98/41629), ΤКΑNΚ, ТК9 (международная публикация № ^О 98/56892), ТК10 (международная публикация № XVО 98/54202), 312С2 (международная публикация № XVО 98/06842), ТК12, и растворимые формы СИ154, СИ7 0 и СИ153; или любой их антагонист. Как используют в рамках изобретения, термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству вводимого лекарственного средства, которое смягчает или предупреждает до некоторой степени один или более симптомов нарушения, подвергаемого лечению. Эффективное количество антитела против ССЬ20 или его антигенсвязывающей части для лечения заболевания представляет собой количество, которое помогает подвергаемому лечению индивидууму достигать одного или нескольких желаемых клинических результатов.
В некоторых вариантах осуществления для минимизации иммуногенности используют гуманизированное антитело или его часть для лечения пациента-человека в терапевтических способах и композициях по настоящему изобретению. В случаях, когда повторяющееся введение не является необходимым, в некоторых вариантах осуществления также является пригодным вводить антитело мыши или химерное антитело или их часть по изобретению пациенту-человеку.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению можно использовать для лечения индивидуума, которого ранее лечили, например, ингибиторами иммуностимулирующих цитокинов (например, МАЬ против ΊΝΈ-α), средствами, устраняющими иммунные клетки (например, МАЬ против СИ20), и/или блокаторами вспомогательных молекул (например, АЬа!асер!). В некоторых вариантах осуществления антитела или части используют для лечения пациента, у которого развилась первичная неспособность отвечать или постепенное снижение уровня ответа на эти и другие способы лечения.
Антитело или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно вводить в однократной дозе или множестве доз в любой момент времени, который лицо, осуществляющее уход, сочтет подходящим. Дозировку можно определять способами, известными в данной области, и она может зависеть, например, от возраста индивидуума, чувствительности, переносимости и общего состояния здоровья. Можно использовать любой способ введения, признанный в данной области, для антител и их частей по изобретению, включая, но необязательно ограничиваясь ими, парентеральный (например, внутривенная, внутриартериальная, внутримышечная, интратекальная, внутрибрюшинная, подкожная инъекция), пероральный (например, с диетой), локальный, местный, путем ингаляции (например, внутрибронхиальная, интраназальная или пероральная ингаляция, интраназальные капли), или ректальный, в зависимости от заболевания или состояния, подлежащих лечению. В одном варианте осуществления антитело или часть вводят парентерально.
Состав варьирует, в зависимости от выбранного пути введения (например, раствор, эмульсия). Соответствующую композицию, содержащую антитело или часть, подлежащие введению, можно получать в физиологически приемлемом наполнителе или носителе. Композиция может содержать множество доз
- 35 029419
или она может представлять собой единичную дозированную композицию. Для растворов или эмульсий подходящие носители включают, например, водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии, или суспензии, включая солевой раствор и забуференную среду. Парентеральные носители могут включать раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, раствор декстрозы и хлорида натрия, лактатный раствор Рингера или жирные масла. Внутривенные носители могут включать различные добавки, консерванты или жидкости, питательные вещества или средства для восполнения электролитов (см., главным образом, Кеш1п§1оп'8 РЬагтасеийса1 Заепсек, 17'1' ЕЛИоп, Маск РиЬйкЫпд Со., РА, 1985). Для ингаляции соединение можно растворять и помещать в подходящее дозирующее устройство для введения (например, распылительное устройство, небулайзер или дозирующее устройство сжатого аэрозоля).
Режимы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа. В определенных вариантах осуществления можно вводить однократный болюс, можно вводить несколько отдельных доз с течением времени или дозу можно пропорционально снижать или увеличивать, как определяется потребностью терапевтической ситуации. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в единичной дозированной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Единичная дозированная форма, как используют в рамках изобретения, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных дозировок для пациентов/индивидуумов, подлежащих лечению; причем каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, вместе с требуемым терапевтическим носителем. Характеристики единичных дозированных форм по изобретению, как правило, определяются и прямо зависят от (а) уникальных характеристик лекарственного средства и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который намереваются достигнуть, и (Ь) ограничений, существующих в области составления такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуумов.
Таким образом, квалифицированному специалисту будет понятно, на основе представленного описания, что дозу и режим дозирования подбирают в соответствии со способами, хорошо известны в области терапии. Следовательно, можно легко устанавливать максимальную переносимую дозу, и также можно определять эффективное количество, обеспечивающее поддающуюся определению терапевтическую пользу для пациента, также как можно определять временные потребности по введению каждого средства для обеспечения поддающейся выявлению терапевтической пользы пациенту. Таким образом, хотя определенная доза и режимы введения проиллюстрированы в настоящем описании, эти примеры ни в коем случае не ограничивают дозу и режим введения, которые могут быть предоставлены пациенту при применении настоящего изобретения на практике.
Следует отметить, что величины дозировок могут варьировать, в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего смягчению, и они могут включать однократную или многократные дозы. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного индивидуума конкретные режимы дозирования следует корректировать с течением времени в соответствии с потребностью индивидуума и профессиональным мнением лица, осуществляющего введение или наблюдающего за введением композиций, и что диапазоны дозировок, указанные в настоящем описании, являются только иллюстративными и не ограничивают объем или применение на практике заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования композиций по настоящему изобретению может быть основан на различных факторах, включающих тип заболевания, возраст, массу тела, пол, медицинское состояние пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может широко варьировать, однако его можно определять обычным путем с использованием стандартных способов. Например, дозы можно корректировать на основе фармакокинетических или фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты, и/или лабораторные величины. Таким образом, настоящее изобретение охватывает повышение дозы у пациента, определяемое квалифицированным специалистом. Способы определения соответствующих дозировок и режимов хорошо известны в данной области, и они будут понятны квалифицированному специалисту после предоставления указаний, описанных в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления для введения человеку общая ежемесячная доза антител или частей антител по изобретению находится в диапазоне 0,5-1200 мг на пациента, в зависимости, безусловно, от способа введения. В определенных вариантах осуществления внутривенная ежемесячная доза требует приблизительно 1-1000 мг/пациент. Общую ежемесячную дозу можно вводить в однократной или разделенных дозах, или она может, в соответствии с мнением терапевта, выходить за пределы типичного диапазона, приведенного в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела по изобретению составляет 1-1000 мг/кг/пациент/месяц. В одном варианте осуществления антитело или его часть по изобретению можно вводить в количестве приблизительно 1-200 или 1-150 мг/пациент/месяц. В определенных вариантах осуществления антитело или его часть вводят в количестве 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг/пациент, вводимых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз в месяц. В конкретном варианте осуществления антитело или его часть вводят в количестве 1-5 мг/кг/пациент, вводимых 1 или 2 раза в месяц.
- 36 029419
Антитела и их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению также пригодны в различных процессах, применимых в исследовании и диагностике. В некоторых вариантах осуществления антитела и части используют для выявления, выделения и/или очистки ССБ20 человека или их вариантов (например, путем аффинной очистки или других подходящих способов, таких как проточная цитометрия, например, для клеток, таких как лимфоциты, в суспензии), и для исследования структуры ССБ20 человека (например, конформации) и функции. Для применений ίη уйго, где иммуногенность антитела не является важной, антитела мыши и химерные антитела и их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению являются пригодными в дополнение к гуманизированным антителам.
Антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно использовать в диагностических применениях (например, ίη уйго, ех У1уо). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела или части по настоящему изобретению используют для выявления и/или измерения уровня ССБ20 человека в образце. В определенных вариантах осуществления образец содержит, например, клетки или ткани, экспрессирующие ССБ20 человека, и/или жидкости организма, такие как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка и/или жидкость кишечника, содержащие ССБ20 человека. Образец можно получать от индивидуума и антитело или его часть, описанные в настоящем описании, можно использовать в подходящем иммунологическом способе для выявления и/или измерения экспрессии ССБ20 человека, включая способы, такие как проточная цитометрия (например, для клеток в суспензии, таких как лимфоциты), твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А), включая хемилюминесцентные анализы, радиоиммунный анализ и иммуногистологию.
В одном варианте осуществления способ выявления ССБ20 человека в образце включает контактирование образца с антителом или частью по настоящему изобретению в условиях, подходящих для специфического связывания антитела или части с ССБ20 человека, и выявление образовавшихся комплексов антитело-ССЬ20. В одном варианте осуществления антитела или части, описанные в настоящем описании, можно использовать для анализа нормальных тканей относительно воспаленных тканей (например, из человека) на реактивность в отношении человека ССБ20 и/или его экспрессию (например, иммуногистологическими способами) для выявления ассоциаций между увеличенной экспрессией ССБ20 человека (например, в пораженных тканях) и одним или несколькими нарушениями, выбранными из, но не ограничиваясь ими, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, Вклеточных злокачественных опухолей, аденокарциномы молочной железы, хронического гепатита, контактного дерматита, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, аденокарциномы поджелудочной железы, парадонтоза, папиллярной карциномы щитовидной железы, пустулеза ладоней и стоп, состояний, ассоциированных с макулопапиллярной экзантемой, буллезного эпидермоза, очаговой алопеции, рассеянного склероза, полимиозита, дерматомиозита, болезни Бехчета, острого генерализованного экзантематозного пустулеза, васкулита, ювенильного идиопатического артрита, саркоидоза, бронхиальной астмы, аллергического ринита, отторжения аллотрансплантата почки, реакции "трансплантат против хозяина", отторжения аллотрансплантата печени, хронического обструктивного заболевания легких, кистозного фиброза, гломерулонефрита, инфекции респираторно-синцитиальным вирусом, множественной миеломы, гистиоцитоза клеток Лангерганса или других состояний. Таким образом, антитела по настоящему изобретению обеспечивают иммунологические способы оценки присутствия ССБ20 человека в нормальных и воспаленных тканях, посредством чего можно оценивать наличие заболевания, прогрессирование заболевания и/или эффективность терапии против ССБ20 человека для лечения заболевания, например, воспалительного и/или иммунного заболевания.
Способы и технологии по настоящему изобретению, как правило, проводят в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитированы и обсуждаются в настоящем описании, если нет иных указаний. См., например, 8атЬгоок ί. & КиккеН Ό. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 3гб еб. Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. (2000); АикиЬе1 е! а1., 81юг1 Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду: А Сотрепбшт оГ МеШобк Ггот Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду. Айеу, 1о1т & 8опк, 1пс. (2002); Наг1оте апб Ьапе Икшд АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. (1998); и Сойдап е! а1. 81юг1 Рго!осо1к ш Рго!еш 8шепсе, Айеу, 1оНп & 8опк, 1пс. (2003). Ферментативные реакции и способы очистки проводят в соответствии с описанием изготовителей, как обычно проводят в данной области, или как описано в настоящем описании. Номенклатура, используемая применительно к аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, и их лабораторные методики и способы, описанные в настоящем описании, представляют собой номенклатуру и лабораторные методики и способы, известные и широко используемые в данной области.
Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой настоящее изобретение относится. Иллюстративные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, так- 37 029419
же можно использовать при применении на практике или исследовании настоящего изобретения. Все публикации и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречий, настоящее описание, включая определения, будет определяющим. Хотя в настоящем описании цитирован ряд документов, это цитирование не предполагает допущения, что любой из этих документов формирует часть общей информации в данной области. На протяжении описания и формулы изобретения, слово "содержат" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" следует понимать как предполагающие включение указанного числа или группы чисел, но не исключение любого другого числа или группы чисел. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумевают, что они являются ограничивающими.
Чтобы настоящее изобретение было более понятным, представлены следующие примеры. Эти примеры предназначены только для целей иллюстрации, и их никоим образом не следует истолковывать, как ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Вовлечение ССЬ20 в аутоиммунные/воспалительные нарушения
Для получения доказательств вовлечения ССЬ20 в аутоиммунные и воспалительные состояния, авторы настоящего изобретения исследовали эффекты нокаута рецептора ССЬ20 ССК6 в модели ревматоидного артрита (КА) на мышах - индуцируемом коллагеном типа II артрите (С1А). Мышей дикого типа по ССК6, мышей ССК6+/- (гетерозиготы), и мышей с нокаутом ССК6-/- (гомозиготы) (в каждом случае п=10) иммунизировали в основание хвоста бычьим коллагеном типа II (150 мкг/мышь), эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда (СНопДгех, #7001). Через три недели проводили вспомогательную инъекцию того же количества эмульсии бычьего коллагена типа II в неполном адъюванте в основание хвоста. Авторы настоящего изобретения ранжировали тяжесть симптомов артрита в конечностях каждой мыши, как описано в Спк\уо10 еί а1., ΛηΗΓίΙίκ & Кйеитайкт 31(11): 1406-1412 (1988). В кратком изложении, авторы настоящего изобретения ранжировали повреждения суставов конечностей дистальнее локтя или колена, по шкале от 0 до 4, исходя из количества вовлеченных суставов и степени эритемы и опухания. Показатели артрита вычисляли в качестве суммы показателей для всех четырех конечностей для каждого животного. У животных дикого типа по ССК6 развивался артрит, в то время как животные ССК6-/- продемонстрировали выраженную устойчивость к заболеванию (фиг. 1). Интересно, что животные ССК6+/- также проявляли некоторые уровни устойчивости, что указывало на то, что полное устранение функции ССЬ20 не требуется для противодействия артритическому фенотипу.
Кроме того, авторы настоящего изобретения провели иммуногистохимический анализ задних конечностей у мышей в отношении присутствия СИ3-положительных Т-клеток или Р4/80-положительных макрофагов. На 43 сутки мышей умерщвляли и их задние конечности фиксировали в формалине. Затем получали срезы задних конечностей и помещали их на предметные стекла. После декальцификации образцов конечностей предметные стекла иммуногистохимически окрашивали с помощью антител против СИ3 (#N 1580, ИАК0) и Р4/80 (клон СТА3-1, АЬИ 8его1ес). Интенсивность окрашивания оценивали два независимых наблюдателя путем сканирования образцов с помощью устройства Арепо (Арепо ТесНпо1од1ек). Оценочная шкала была следующей: 0, норма; 1, слабое окрашивание на протяжении конечности или интенсивное окрашивание в одном пальце; 2, умеренное окрашивание в нескольких пальцах; 3, интенсивное окрашивание в нескольких пальцах или умеренное окрашивание на протяжении конечности; 4, интенсивное окрашивание всех пальцев и конечности. Количество Т-клеток (фиг. 2) и макрофагов (фиг. 3), инфильтрирующих индуцированные ОА очаги повреждения, было значительно снижено как у мышей ССК6+/-, так и у мышей ССК6-/-.
Также авторы настоящего изобретения исследовали эффекты нокаута ССК6 в модели на мышах индуцируемого динитрофторбензолом (ИМЕВ) аллергического контактного дерматита. Две группы по шесть мышей в каждой (одна группа мышей, являющихся мышами дикого типа по ССК6, и одна группа мышей с дефицитом ССК6) сенсибилизировали нанесением щеткой 25 мкл 0,4% раствора ИОТВ (в смеси ацетон: оливковое масло 4:1) на побритый живот в течение двух последовательных суток (0 и 1 сутки). На 5 сутки мышей повторно иммунизировали нанесением 20 мкл 0,1% ИОТВ (в смеси ацетон: оливковое масло 4:1) на одну сторону одного уха. в качестве индикатора отека толщину уха измеряли до иммунизации ИОТВ и через 24 ч после последней иммунизации на 5 сутки с использованием толщиномера. У мышей с дефицитом ССК6 было выявлено практически отсутствие увеличения толщины уха после обработки ИОТВ, что указывает на устойчивость против индуцируемой ИОТВ контактной гиперчувствительности (фиг. 4).
Эти данные подтверждают роль ССК6 и ССЬ20 в аутоиммунных/воспалительных нарушениях.
Пример 2. Ингибирование индуцируемого ССЬ20 хемотаксиса посредством МАЬ хомячка против ССЬ20 мыши 2Р5-5
Для дальнейшего исследования роли ССЬ20 в качестве потенциальной терапевтической мишени, авторы настоящего изобретения провели эксперименты с использованием антитела хомячка против ССЬ20 мыши (2Р5-5). Сначала авторы настоящего изобретения охарактеризовали способность МАЬ 2Р55 связываться с ССЬ20 мыши, человека и макака-резус. Растворимые антигены ССЬ20-секритуремая щелочная фосфатаза (8ЕАР) каждого вида получали следующим образом. кДНК, кодирующие ССЬ20 человека, яванского макака, макака-резус, крысы и мыши, амплифицировали и субклонировали в вектор
- 38 029419
рс1)ХА3.1 (+) б8а11 8ЕАР, который содержит кДНК 8ЕАР и в котором удален участок 8а11 (рс^NА3.1 (+) приобретали от ЫПКгодеи; кДНК 8ЕАР происходила из вектора р8ЕАР-ЕиЪаисег, С1ои1есН). Экспрессирующие векторы трансфицировали в клеточную линию почки эмбриона человека НΕК293ΕВNА (НЕК293Е, 1иу11годеи). Клетки НЕК293Е инкубировали с ЭМЕМ (1иу11годеи), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой за сутки до трансфекции. В день трансфекции, культуральную среду заменяли бессывороточной средой 0РТ1-МЕМ II Циуйгодеи). Экспрессирующие векторы трансфицировали с использованием Тгаи§1Т 1.Т1 (ТАКАКА Вю 1ис., 8Ыда, Япония) в соответствии с протоколом изготовителя. После инкубации в течение 3 суток при 5% С02 и 37°С, культуральные супернатанты собирали. Концентрацию ССБ20-8ЕАР в каждой культуре измеряли с использованием набора Огеа1 ЕксАРс 8ЕАР СНетПиттезсеисе 2.0 (С1ои1есН).
Затем авторы настоящего изобретения провели исследования связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге™) для измерения связывания 2Ε5-5 МАЬ с антигенами ССБ20-8ЕАР мыши, человека, макака-резус и яванского макака. Антитело против 8ЕАР (моноклональное антитело против плацентарной щелочной фосфатазы, ТНегто ЗОеиййс, каталожный номер # МА1-19354, партия # КЙ12748М) иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ5 (ОЕ НеаЙНсаге) с использованием стандартной методики присоединения к амину N^^00. Меченный 8ЕАР СС1.20 мыши (100 нМ в супернатанте, ГО735, партия # 091130) разбавляли до 5 нМ с помощью ТВ8-Р, содержавшего 0,005% Т^ееи-20, и иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ5. Разведения от 0,2 до 80 нМ антитела хомячка против СС1.20 мыши (2Ε5-5, партия # 060215, 2 мг/мл) в ТВ8-Р инъецировали над сенсорном чипом со скоростью потока 30 мкл/мин. Мониторинг ассоциации и диссоциации антитела хомячка против СС1.20 мыши с СС1.20 мыши проводили в течение 4 и 16 мин соответственно. Между инъекциями поверхность чипа регенерировали с использованием 10 мМ глицина, рН 2,25. Сенсограммы подвергали двойному контролю путем вычитания инъекций антитела хомячка против СС1.20 мыши в эталонную клетку без иммобилизованного СС1.20 мыши и инъекции ТВ8-Р над иммобилизованным ССГ20 мыши. Сенсограммы анализировали с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1 с помощью программного обеспечения для оценки В1А (ОЕ НеаЙНсаге, версия 3.2). В этом анализе МАЬ 2Ε5-5 связывается с ССГ20 мыши с аффинностью 32 пМ, но не связывается с СС1.20 человека, макака-резус или яванского макака (табл. 1).
Таблица 1. Аффинность связывания МАЬ 2Ε5-5 с ортологами ССГ20
Ортолог ССИ20 ка (хЮ5 М^1 с1) кц (х10_5 с1) Кп (χ10~η М)
Мышь 9, 63 0,474 0,492
Человек Не поддается выявлению Не поддается выявлению Не поддается выявлению
Макакрезус Не поддается выявлению Не поддается выявлению Не поддается выявлению
Яванский макак Не поддается выявлению Не поддается выявлению Не поддается выявлению
Для исследования эффекта МАЬ 2Ε5-5 на функцию СС1.20 авторы настоящего изобретения оценивали его нейтрализующую активность против СС1.20 мыши с использованием анализа хемотаксиса ш νΐίΐΌ. Трансдуцированные ССК6 клетки В300.19 и рекомбинантный СС1.20 мыши (1 нМ) добавляли в культуральные планшеты Тгаиз^еП. Через четыре часа клетки, которые мигрировали в нижнюю камеру часов, подсчитывали с помощью активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8). МАЬ 2Ε55 полностью ингибировало хемотаксис в концентрации 1 мкг/мл с оцененной величиной 1С50 0,04 мкг/мл (0,27 нМ) (фиг. 5). Напротив, контрольное антитело хомячка (10 мкг/мл) не ингибировало хемотаксис (100% контроль; данные не представлены).
Пример 3. Гуманизация МАЬ мыши против СС1.20
Для получения моноклональных антител против СС1.20 человека авторы настоящего изобретения создали панель антител мыши против СС1.20 человека. Рекомбинантный СС1.20 человека (К&Э, #360МР-025/СР, 17,5 мкг/мышь), эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (МйзиЫзЫ-Кадаки Уайои, КМ606-1) инъецировали подкожно в подушечки лап мышей. Затем две последовательных инъекции проводили каждые трое суток. Через трое суток после последней иммунизации мышей умерщвляли, и клетки паховых лимфатических узлов подвергали слиянию с клетками миеломы Р3и1 в соотношении от 2:1 до 10:1 в присутствии 50% полиэтиленгликоля. Затем клетки культивировали в 96-луночных пластмассовых планшетах.
Для первичного скрининга использовали сэндвич-ЕЫ8А. 96-луночный планшет покрывали поликлональным антителом против 1дО человека (1аскзои, #709-005-149, 2 мкг/мл в РВ8 (-)). После инкубации в течение ночи при 4°С лунки блокировали с помощью 1х В1оск-Асе (Эахшррои 8итйото РНагта, иК-В80) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,02% Т^ееи 20/РВ8 (-), после чего в лунки добавляли 1 нМ химерного белка ССБ20 человека-ЫдО Рс в 0,02% Т\уееи 20/РВ8 (-) (50 мкл/лунка). После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре проводили три дополнительных промывания, как описано выше. Затем культуральные супернатанты каждой гибридомы разбавляли в два раза с помощью 20% РВ8 и в лунки добавляли 200 мкг/мл 1дО человека (МйзиЫзЫ ^е1- 39 029419
рПагта) в 0,02% Т^ееп 20/РВ8 (-) и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После трех дополнительных промываний клетки инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом против Ι§Ο мыши (1аскзоп, #715-035-150, разведение в 5000 раз с помощью 0,02% Т^ееп 20/РВ8 (-)) в течение одного часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали три раза и инкубировали в растворе ΤΜΒΖ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) в течение 15-30 мин. Затем добавляли равный раствор 2 М Н2804 для остановки реакции, и проводили считывание оптической плотности при 450 нм с помощью АВУ0 (РегктЕ1тег). В сэндвич-ЕЫ8Л были идентифицированы 24 положительных лунки.
Затем авторы настоящего изобретения провели анализ хемотаксиса в качестве вторичного скрининга. Анализ хемотаксиса проводили в культуральных планшетах Тгапз^еП (МиШзсгееп, размер пор 5 мкм, МПИроге, #ΜΛΜΙϋ 5810). Сначала 50 мкл/лунка рекомбинантного ССЬ20 человека (Κ&Ό, #360-МР025/СЕ) в концентрации 300 нг/мл в буфере для хемотаксиса (0,5% В8А, 0,5% ЕВ8, 20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4), 50 мкМ 2-меркаптоэтанол в ВРМИ640 (ШуШодеп)) предварительно инкубировали с 100 мкл/лунка культуральных супернатантов из гибридом при комнатной температуре в течение 30 мин (для конечной концентрации ССЬ20 100 нг/мл) в нижних лунках планшетов. Через 30 мин клетки В300.19, трансфицированные ССВ6 человека (8ЕР ΙΌ N0: 104) (2х105 клеток/75 мкл) наносили в верхние лунки и инкубировали в инкубаторе с 5% С02 при 37°С в течение 4 ч. После инкубации 150 мкл из нижних лунок собирали и фиксировали с помощью 50 мкл 4% РЕА/РВ8 (-). 30 мкл каждого образца помещали в анализатор клеток ЕАС8Сап1оП (ВЭ Вюзс1епсез) для подсчета мигрировавших клеток. Нейтрализующая активность была выявлена в четырех лукнах.
Затем авторы использовали стандартные лимитирующие разведения для получения клонов гибридом из четырех положительных лунок. Авторы настоящего изобретения подтвердили нейтрализующую активность супернатанта из каждого клона с использованием анализа хемотаксиса ΐπ уПго. Три из моноклональных антител мыши против ССЬ20 человека, продуцированных этими клонами (антитела 36Е7С10 (табл. 2), 42О5В10 (табл. 3) и 40-1С10В9 (табл. 4)) продемонстрировали нейтрализующую активность против ССЬ20 человека.
Таблица 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности 36Е7С10
ОПИСАНИЕ Сигнальная последовательность тяжелой цепи (аминокислотная) (5Е<2 Ю ΝΟ: 33) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МКИ5С11НЕЬУАТАТ(ДЖ5
Сигнальная последовательность легкой цепи (аминокислотная) (5Е<2 Ю ΝΟ: 34) МСУРТОННННИНТУУУУКС
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (ЗЕО ТЬ ΝΟ: 39) 0ν0Η00ΡΟΑΕΗνΚΡΟΑ5νΚΜ5ΟΚΑ5ΟΥΤΕ ΤΝΥΜΜΗ«νΚ0ΗΡΟ0ΟΗΕΐΛίΙθνΐΟΡ3Ο3ΥΤ ΤΥΝ0ΚΕΚΟΚΑΤΗΤνϋΤ533ΤΑΥΜ0Η33ΗΤ 3ΕΟ3ΑνΥΥΟΤΚΟΝΥθνΌΥΑΜϋΥΐΛΓΟ0ΟΤ3ν ΤΥ33
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи (5Е<2 Ю ΝΟ: 40) ЫОМТОЗРАЗЬЗАЗУСЕТУТ1ТССАЗЕШ ΥΟΑΗΝΜΥ0ΗΚ0ΟΚ3 РОЬЫ ΥΟΑΤΝΗΑϋΟΜ 33ΚΕ3Ο3Ο3ΟΚ0Υ3ΗΚΙ33ΗΗΡΟϋνΑΤΥΥ ΟΟΝνΉΙΤΡΥΤΕΟΟΟΤΚΗΕΙΚ
Сигнальная последовательность тяжелой цепи (нуклеотидная) (5Е<2 Ю ΝΟ: 45) АТСАСАТССАССТСТАТСАТССТСТТСТТ ССТАССААСАССТАСАССТСТСААСТСС
Сигнальная последовательность легкой цепи (нуклеотидная) (5Е<2 Ю ΝΟ: 46) АТСССТСТАСССАСТСАССТССТСТТССТ СТСССТТАСАСТССТАСТТСТСАСАТСТ
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 51) САССТССААСТССАССАСССТСССССТСА ССТССТСААСССТСССССТТСАСТСААСА ТСТССТССААСССТТСТСССТАСАССТТС АССААСТАСТССАТССАСТСССТСААССА САССССТССАСААССССТТСАСТССАТСС САС Τ САТ Τ САТ С С Τ Τ С Τ САТАС Τ ΤАТАС Τ АССТАСААТСААААОТΤСААССССААССС САСАТ Т ОАОТ СТАОАСАСАТСС Т ССАССА САСССТАСАТССАССТСАССАСССТСАСА ТСТСАССАСТСТССССТСТАТТАСТСТАС ААСАССТААСТАСССАСТАСАСТАТССТА ТССАСТАСТССССТСААССААССТСАСТС АСССТСТССТСС
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи (5Е<2 Ю N0: 52) САСАТ С САСАТ САС Т САС Т С Т С САС С Т Т С АСТСТСТССАТСТСТСССАСАААСТСТСА С САТ САСАТ СТО САС СААСТ САСААТАТ Т ТАСССТССТТТАААТТССТАТСАССССАА АСАСССААААТСТССТСАССТССТСАТСТ АТССТССААССААСТТСССАСАТСССАТС ТСАТССАССТТСАСТСССАСТССАТСТСС ТАСАСАС ТАТТСТСТ СААСАТСАСТАССС ТССАТССТСАССАТСТТССААССТАТТАС ТСТСААААТСТСТТААТТАСТСССТАСАС СТТСССАССССССАССААССТССАААТАА АА
- 40 029419
Таблица 3. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности 42О5В10
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Сигнальная МНИЗС1ΙΗΕΗνΑΤΑΤΟνΝΞ
последовательность тяжелой цепи (аминокислотная) (5Е<2 Ю N0: 37)
Сигнальная МСУРТОННННИНТАЛЛЛ/КС
последовательность легкой цепи (аминокислотная) (5Е<2 Ю N0: 38)
Аминокислотная ОУОНООРСАЕЬУКРСАЗЛКМЗСКАЗСУТЕТЗ
последовательность УИМНИУКОНРСОСЬЕИIОЬIЬРЗ ΏΚΥΤΝΥΝΟ
вариабельного домена тяжелой КЕКСКАТНТУОТЗЗЗТАУМОНЗЗЬТЗЕЬЗАУ
цепи УУСТКСЛУСУЬУСМЬУИСОСТЗУТУЗЗ
(5Е<2 Ю N0: 43)
Аминокислотная ЫОМТОЗРАЗЬЗАЗУСЕТУТ1ТССАЗЕШУС
последовательность АНШУОККОСКЗ РОНЫ Υ0ΑΤΝΗΑ00Μ3 ЗНЕ
вариабельного домена легкой 3Ο3Ο3ΟΚ0Υ3ΗΚΙ33ΗΗΡΟϋνΑΤΥΥΟ0ΝνΗ3
цепи ТРУТЕСССТКЬЕ1К
(5Е<2 Ю N0: 44)
Сигнальная АТСАСАТССАССТСТАТСАТССТСТТСТТСС
последовательность тяжелой ТА6СААСА6СТАСА66Т6ТСААСТСС
цепи (нуклеотидная) (5Е<2 Ю N0: 49)
Сигнальная АТСССТСТАСССАСТСАССТССТСТТССТСТ
последовательность легкой СССТТАСАСТССТАСТТСТСАСАТСТ
цепи (нуклеотидная) (5Е<2 Ю N0: 50)
Нуклеотидная СА66ТССААСТ6СА6СА6ССТ6666СТ6А0С
последовательность ТССТСААСССТСССССТТСАСТСААСАТСТС
вариабельного домена тяжелой СТ6САА66СТТСТ66СТАСАССТТСАССА6С
цепи ТАСТССАТССАСТСССТСААССАСАССССТС
(5Е<2 Ю N0: 55) 6АСАА66ССΤΤ 6А6Т 66АТ С66АСТ САТ Т СА Т С С Т Т С Т САТ ЛАС ТАТАС Т ЛАС ТАСЛАТ СЛА ЛАСТ ТСЛАССССЛАССССАСАТТСАСТ СТАС АСАСАТ СС Т ССАССАСАССС ТАСАТ ССАСС Т САССАСССТСАСАТСТСАССАСТСТССССТС ТАТ ТАС Т СТАСЛАСАССТЛАС ТАСССАСТАС АСТАТССТАТССАСТАСТССССТСЛАССЛАС С Т САС Т САС С С Т С Т С С Т СА
Нуклеотидная САСАТ С САСАТ САС Т САС Т С Т С САС СТТ САС
последовательность ТСТСТССАТСТСТСССАСАААСТСТСАССАТ
вариабельного домена легкой САСАТСТССАССААСТСАСААТАТТТАСССТ
цепи ССТТТАААТТССТАТСАССССАААСАСССАА
(5Е<2 Ю N0: 56) ЛАТСТССТСАССТССТСАТСТАТССТССЛАС СЛАСТТСССАСАТСССАТСТСАТССАССТТС АСТСССАСТССАТСТССТАСАСАСТАТТСТС ТСЛАСАТСАСТАСССТССАТССТСАССАТСТ ТССААССТАТТАСТСТСААААТСТСТТААСТ АСТСССТАСАССТТСССАССССССАССЛАСС ТССЛААТЛААА
Таблица 4. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности 40-1С10В9
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Сигнальная последовательность МЕИЗИУЕНЕНЬЗУ1АСУОЗ
тяжелой цепи (аминокислотная) (ЗЕ<2 Ю N0: 35)
Сигнальная последовательность МСУРТОННННИНТАЛЛЛ/КС
легкой цепи (аминокислотная) (ЗЕ<2 Ю N0: 36)
Аминокислотная ОУОНООЗСАЕНУКРСАЗЛТЬЗСКАЗСУТЕ
последовательность Т ЬУЕМНИЛКОТ РЛНСЬЕИIΟΑΙЬРЕ Τ Т 3 Т
вариабельного домена тяжелой ΑΥΝ0ΚΕΚΟΚΑΤΗΤΑϋΚ333ΤΑΥΜΕΗΗ3ΗΤ
цепи ЗЕЬЗАУУУСТКСУУСЗАЬУАМЬУИСОСТЗ
(ЗЕ<2 Ю N0: 41) ЛТЛЗЗ
Аминокислотная ЫОМТОЗРАЗЬЗАЗУСЕТЛТТТССАЗЕШ
последовательность УСАЫЛлГУОККОСКЗРОНЫ УСАТЖАОСМ
вариабельного домена легкой ЗЗКЕЗСЗСЗСКОУЗНКТЗЗЬНРЬЬУАТУУ
цепи СОЛУНЗТЫлГТЕСССТКЬЕТК
(ЗЕ<2 Ю N0: 42)
Сигнальная последовательность АТССААТССАССТСССТСТТТСТСТТССТ
тяжелой цепи (нуклеотидная) ССТСТСАСТААТТССАССТСТССААТСС
(ЗЕ<2 Ю N0: 47)
Сигнальная последовательность АТСССТСТАСССАСТСАССТССТСТТССТ
легкой цепи (нуклеотидная) СТСССТТАСАСТССТАСТТСТСАСАТСТ
(ЗЕ<2 Ю N0: 48)
Нуклеотидная САССТТСААСТССАССАСТСТСССССТСА
последовательность ССТССТСАССССТСССССТТСАСТСАССС
вариабельного домена тяжелой ТСТССТССААСССТТСССССТАСАСАТТТ
цепи АСТСАСТАТСАААТССАСТСССТСААССА
(ЗЕ<2 Ю N0: 53) САСАССТСТССАТССССТССААТССАТТС САС С ΤАТ Т САТ С С ТСАААС ТАС ТАСТАС Т СССТАСААТСАСААСТТСААССССААССС САСАС Т САС Т С САСАСАААТ С С Т С САС СА САСССТАСАТССАССТССССАСССТСАСА ТСТСАССАСТСТССССТСТАТТАСТСТАС САААТСТТАСТАСССТАССССССАСТАТС СТАТССАСТАСТССССТСААССААССТСА СТСАСССТСТССТСА
Нуклеотидная САСАТ С САСАТ САС Т САС Т С Т С САС С Τ Т С
последовательность АСТСТСТССАТСТСТСССАСАААСТСТСА
вариабельного домена легкой С САТ САСАТ СТО САС СААС Т САСААТАТ Т
цепи ТАСССТССТТТАААТТССТАТСАССССАА
(ЗЕ<2 Ю N0: 54) АСАСССААААТСТССТСАССТССТСАТСТ АТССТССААССААСТТСССАСАТСССАТС ТСАТССАССТТСАСТСССАСТССАТСТСС ТАСАСАС ТАТТСТСТ СААСАТ САС ТАС С С ТССАТССТСАССАТСТТССААССТАТТАС ТСТСААААТСТСТТААСТАСТСССТССАС СТТСССТССАСССАССААССТССАААТСА АА
Затем антитела мыши 36Р7С10, 42О5В10 и 40-1С10В9 использовали для получения тяжелых и лег- 41
029419
ких цепей гуманизированного антитела. Способ гуманизации вовлекал пересадку определяющих комплементарность областей (СОК) мыши, идентифицированных согласно способам определения КаЬа! и/или С1ю11на в соответствии с нумерацией КаЬа!, в последовательности тяжелой и легкой цепей человека эмбрионального типа, соответствующие наилучшим совпадениям каркасных областей с исходными последовательностями мыши, из которых происходили СОК (фиг. 6А-С; выделение полужирным шрифтом обозначает остатки, которые отличаются между антителом мыши и последовательностью человека эмбрионального типа; подчеркивание и выделение полужирным шрифтом обозначает пересаженные С.ОК мыши; выделение курсивом и полужирным шрифтом обозначает каркасные остатки, замененные соответствующими остатками антитела мыши; и подчеркивание, выделение курсивом и полужирным шрифтом обозначает остатки СОК, замененные соответствующими остатками человека эмбрионального типа). Совпадающие остатки каркасных областей идентифицировали с использованием базы данных 1дВ1ак1, в соответствии со способами, описанными в А11ксЬи1 е1 а1., №с1. Ас1Й8 Кек. 25:3389-3402 (1997). Для получения альтернативных версий гуманизированных цепей авторы настоящего изобретения использовали два способа: 1) способы 30-моделирования для предсказания критических остатков мыши в каркасной области, взаимодействующих с остатками СОК, и 2) выравнивание последовательностей для идентификации остатков мыши, непосредственно соседних с каноническими последовательностями СОК.
Гуманизированные последовательности встраивали в экспрессирующие векторы и трансфицировали в клеточные линии млекопитающих (например, клетки НЕК293Е (Ιηνίίτο^η)) для продуцирования антител. Затем антитела, полученные с помощью этого процесса, охарактеризовывали в функциональных и физико-химических анализах.
Пример 4. Анализы хемотаксиса ίη νίίΓο, демонстрирующие активность нейтрализации гуманизированных АЬ против ССЬ20 человека
Авторы настоящего изобретения идентифицировали гуманизированные антитела, которые активно нейтрализуют лиганд ССЬ20 человека, путем проведения анализов хемотаксиса ίη νίίτο с использованием трансдуцированных ССК6 клеток В300.19. При определении величин 1С50, 1С90 и 1С95 (фиг. 7А-С), антитела, продемонстрировавшие сниженную величину в таблице 1С95, считали обладающими значительной нейтрализующей активностью (фиг. 7С). Из 14 полученных гуманизированных тяжелых цепей и 26 полученных гуманизированных легких цепей, авторы настоящего изобретения исследовали 41 комбинацию. Было показано, что восемь из этих комбинаций значительно нейтрализуют хемотаксис. Эти восемь гуманизированных антител приведены ниже
36БК3/36НКК3
36БК3/42НКК1
36БК3/42НКК2
36БК3/42НКК3
36БК3/36НС2
36БК3/36НС3
36БС3/36НКК3
36БС3/36НС2
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности гуманизированных тяжелых цепей НС2, НС3, 36НКК3, 42НКК1, 42НКК2 и 42НКК3, и гуманизированных легких цепей ЬС3 и ЬК3, представлены в табл. 5-12. Аминокислотные последовательности, кодируемые генами человека эмбрионального типа, используемые в этих тяжелых и легких цепях, представлены в табл. 13.
- 42 029419
Таблица 5. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи 36НС2 ("НС2") гуманизированного антитела против ССЬ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи с сигнальной последовательностью (5Е<2 Ю N0: 1) МСИ5С1 ΙΗΕΗνΑΤΑΤΟνΗΞΟνςί,νςδΟΑΕ νΚΚΡΟΑ5νκν50ΚΑ5ΟΥΤΓΤΝΥΝΜΗΝνκς ΑΡΟςΟΣΕΝΜανίϋΡ5ϋ5ΥττΥΑςκρςοκν ΤΜΤνΌ ТЗ Τ3 ΤνΥΜΕ ЬЗЗЬКЗЕО ΤΑνΥΥΟΑ ΚΟΝΥΟνϋΥΑΜϋУ^СССТЬУТУЗ3Α5 ΤКСΡ 5νΕΡΗΑΡ85Κ5Τ566ΤΑΑΗ60ΗνΚΌΥΕΡΕ Ρντν5ΜΝ5ΟΑΗΤ5θνΗΤΕΡΑνΗ055ΟΗΥ5 Η55νντνΡ555ΗΟΤ0ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ5ΝΤΚ УОКНУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗ νΕΗΕΡΡΚΡΚϋΤΗΜΙ5ΚΤΡΕνΤθνννθν5Η ΕΟΡΕνΚΕΝΜΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ ΞΤΥΚννΞνΗΤνΗΗΟϋΜΗΝΟΚΕΥΚΟΚνΞΝΚ АЬРАР1ЕКТ13КАКС0РКЕР0УУТНРР8К ΕΕΜΤΚΝ0ν5ΗΤΟΗνΚΟΕΥΡ5ΡΙΑνΕΜΕ5Ν Ο0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΗΌ5ΌΟ5ΕΕΗΥ3ΚΗΤνΌ КЗНИООСИУЕЗСЗЛМНЕАННИНУТОКЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи без сигнальной последовательности (5Е0 Ю N0: 108) СУСЬУСЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГ ΤΝΥΝΜΗΝνκςΑΡΟςΟΣΕΝΜανίϋΡ3ϋ3Υτ τΥΑςκρςοκντΜτνο тз тз τνΥΜΕьззьк 3Ε Ό ΤΑνΥΥΟΑΚΟΝΥΟνϋΥΑΜϋΥΝΟςΟΤΣν ТУЗЗАЗТКСРЗЛЕРНАРЗЗКЗТЗССТААЬ ССНУКОУЕРЕРУТУЗИЫЗСАНТЗеУНТЕР АУН055С1А5Н55УУТУР555ЬСТ0ТУ1С ΝνΝΗΚΡΞΝΤΚνϋΚΚνΕΡΚΞΟΡΚΤΗΤΟΡΡΟ РАРЕННССРЗЛЕНЕРРКРКОТЬШЗКТРЕ ντ СνννϋνδНЕ ϋΡΕνκΕΝΜΥνΌΟνΕνΗΝΑ ΚΤΚΡΚΕΕ<2ΥΝ5ΤΥΚνν5νΗΤνΗΗ<2ΡΐΛίΗΝΟ ΚΕΥΚΟΚνΡΝΚΑΗΡΑΡΙΕΚΤI3ΚΑΚ60ΡΗΕ Ρ0νΥΤΗΡΡ5ΚΕΕΜΤΚΝ0ν5ΗΤΟΗνΚΟΕΥΡ 3ΌΙΑνΕΜΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΗΌ3ΌΟ3 ΕΕΗΥ5ΚΗΤν0Κ5ΗΜΟΟΟΝνΕ505νΜΗΕΑΗ ΗΝΗΥΤ0Κ3Η3Η3ΡΟΚ
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 9) СУСЬУСЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГ ΤΝΥΝΜΗΝνκςΑΡΟςΟΣΕΝΜανίϋΡ3ϋ3Υτ τΥΑςκρςοκντΜτνο тз тз τνΥΜΕьззьк 3Ε ϋ ΤΑνΥΥΟΑΚΟΝΥΟνϋΥΑΜΌУТССОСТЬУ τν33
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи с сигнальной АТССССТССТССТССАТСАТТСТСТТССТ 66Т66ССАСТ6СТАСС66А6Т6САСА6СС
АССТССАССТССТССАСТСТСССССТСАС
последовательностью (5Е<2 Ю N0: 17) СТСААСАААСССССТССААСТСТСААССТ СТСАТСТАААССАТССССС ТАТАСАТ ТСА С ТААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССАС СС ТССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС ССТСАТССАССС Τ ТСАСАТ ТСС ТАСАССА САТАТССССАСААСТ Τ ТСАССССАСССТС АССАТСАСАСТССАСАС ТАССАСС ТС ТАС АСТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАСАА СТСААСАТАСАССАСТСТАС ΤΑΤ ТССССС ССССССААТ ТАСССАСТССАС ТАТСССАТ ССАТ ТАС ТССССССАСССТАС ТС ТССТСА СССТСТСТАСТ6СТТСТАССАА666СССА ТС66ТСТТСССССТ66САСССТССТССАА САССАССТСТССССССАСАСССССССТСС 6СТ6ССТ66ТСАА66АСТАСТТСССС6АА СС66Т6АС66Т6ТС6Т66ААСТСА66С6С ССТ6АССА6С66С6Т6САСАССТТССС66 СТ6ТССТАСА6ТССТСА66АСТСТАСТСС СТСА6СА6С6Т66Т6АСС6Т6СССТССА6 СА6СТТ666САСССА6АССТАСАТСТ6СА АС С Τ СААТ САСААС С С САС СААСАС СААС СТО САСААСАСАС Τ Τ ОАО С С САААТ С Τ Τ С Τ САСААААС Τ САСАСАТ С С С САС С С Τ С С С СА6САССТ6ААСТССТ666666АСС6ТСА 6ТСТТССТСТТССССССААААСССАА66А САСССТСАТ6АТСТССС66АССССТ6А66 ТСАСАТ6С6Т66Т66Т66АС6Т6А6ССАС СААСАСССΤСАС6ΤСААСΤΤСААСΤ66ΤΑ С6Т66АС66С6Т66А66Т6САТААТ6ССА А6АСААА6СС6С666А66А6СА6ТАСААС А6САС6ТАСС6Т6Т66ТСА6С6ТССТСАС С6ТССТ6САССА66АСТ66СТ6ААТ66СА АССАСΤАСААСΤССААССΤСΤССААСΑΑΑ 6СССТСССА6СССССАТС6А6ААААССАТ СТССААА6ССААА666СА6СССС6А6ААС САСА66Т6ТАСАСССТ6СССССАТССС66 САС САСАТ САС СААСААС САС 6Τ САССС Τ 6АССТ6ССТ66ТСААА66СТТСТАТСССА 6С6АСАТС6СС6Т66А6Т666А6А6СААТ 666СА6СС66А6ААСААСТАСАА6АССАС 6ССТССС6Т6СТ66АСТСС6АС66СТССТ ТСТТССТСТАТА6САА6СТСАСС6Т66АС АА6А6СА66Т66СА6СА6666ААС6ТСТТ СТСАТ6СТСС6Т6АТ6САТ6А66СТСТ6С АСААС САС ΤАСАС 6САСААСАСС С Τ С Τ С С СТ6ТСТССС666АААТ6А
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи без сигнальной последовательности (5Е<2 Ю N0: 109) САССТССАССТССТССАСТСТСССССТСА ССТСААСАААСССССТССААСТСТСААСС ТСТСАТСТАААССАТССССС ТАТАСАТ ТС АС ТААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССА ССС ТССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС СССТСАТССАСССТТСАСАТТССТАСАСС АСАТАТССССАСААСТ Т ТСАССССАСССТ
- 43
029419
САССАТСАСАСТССАСАС ТАССАСС ТС ТА САСТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАСА АСТСААСАТАСАССАСТСТАС ТАТ ТСССС СССССССААТ ТАСССАСТССАС ТАТСССА ТССАТТАСТССССССАСССТАСТСТССТС АСССТСТСТАСТССТТСТАССААСССССС АТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССА АСАССАССТСТССССССАСАСССССССТС СССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССА АССССТСАСССТСТССТССААСТСАСССС СССТСАССАССССССТССАСАССТТСССС ССТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТС ССТСАССАСССТССТСАСССТССССТССА ССАССТТССССАСССАСАССТАСАТСТСС ААС С Т СААТ САС ААСС С САССААСАССАА 66ТССАСААСАСАСТТСАССССАААТСТТ 6Т САС ААААСТ САСАСАТ ССССАСССТ СС ССАССАССТСААСТССТССССССАСССТС АСТСТТССТСТТССССССААААСССААСС АСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАС СТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССА ССААСАСССТСАС6ТСААСТТСААСТ66Т АССТССАСССССТССАССТССАТААТССС ААСАСАААССССССССАССАССАСТАСАА САССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСА СССТССТССАССАССАСТСССТСААТССС ААС САС ТАСААС Т ССААСС Т С Т С СААСАА АССССТСССАССССССАТССАСААААССА ТСТССАААСССАААССССАССССССАСАА ССАСАССТСТАСАСССТССССССАТСССС ССАССАСАТСАССААСААССАССТСАССС ТСАССТСССТССТСАААСССТТСТАТССС АСССАСАТСССССТССАСТСССАСАССАА ТССССАСССССАСААСААСТАСААСАССА ССССТССССТССТССАСТСССАССССТСС ТТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССА СААСАССАССТСССАССАССССААССТСТ ТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТС САСААС САС ТАСАС 6САСААСАСС С Т С Т С ССТСТСТССССССАААТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 25) САССТССАССТССТССАСТСТСССССТСА ССТСААСАААСССССТССААСТСТСААСС ТСТСАТСТАААССАТССССС ТАТАСАТ ТС АС ТААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССА ССС ТССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС СССТСАТССАСССТТСАСАТТССТАСАСС АСАТАТССССАСААСТ Т ТСАССССАСССТ САССАТСАСАСТССАСАС ТАССАСС ТС ТА САСТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАСА АСТСААСАТАСАССАСТСТАС ТАТ ТСССС СССССССААТ ТАСССАСТССАС ТАТСССА ТССАТТАСТССССССАСССТАСТСТССТС АСССТСТСТАСТ
Таблица 6. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи
36НС3 ("НС3") гуманизированного антитела против СС620
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 2) МСИ5С11НЕНУАТАТСУН50УСЬУС5САЕ
уккрсазукузсказсутгтнутсмнтсукс АРСОСЬЕШ СУ1ϋΡ3Ό3ΥТТУЫОКГКСКА ΤΜΤΕϋΤ3Τ3ΤνΥΜΕΣ33ΣΚ3ΕϋΤΑνΥΥ0Τ ΚσΝΥανϋΥΑΜΟΥΝσθσΤ3ντν33Α5 ТКСР ЗУЕРНАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКЬУЕРЕ РУТУ5ИИ5САЬТ5СУНТЕРАУЬ055СЬ¥5 Η55νντνΡ555ΗΟΤ<2ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ5ΝΤΚ УЬКНУЕРКЗСЬКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗ νΕΗΕΡΡΚΡΚϋΤΗΜΙ5ΗΤΡΕνΤθνννθν5Η ΕΟΡΕνΚΕΝΜΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ ЗТУЫЛ/ЗУНТУЬНОЫлГЬИСКЕУКСКУЗИК ΑΗΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚ6<2ΡΚΕΡζ)νΥΤΗΡΡ5Κ ЕЕМТКИОУЗЬТСЬУКСЕУРЗЫАУЕИЕЗИ СОРЕИИУКТТРРУНЬЗЬСЗЕЫМЗКНТУЬ КЗНИООСИУЕЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 10) СУСЬУСЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГ ΤΝΥΝΜΗΝνκςΑΡσοσΣΕΝΙСУ1ϋΡ3ϋ3Υτ ΤΥΝςΚΓΚσΚΑΤΜΤΕϋ ТЗ Τ3 ΤνΥΜΕ ьззьк 3Ε ϋ ΤΑνΥΥΟ ТКСОТСУОΥΑΜϋУТССОСТЗУ τν33
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 18) АТССССТССТССТССАТСАТТСТСТТССТ ССТСССААСТСССАССССАСТССАСАССС АССТССАССТССТССАСТСТСССССТСАС СТСААСАААСССССТССААСТСТСАААСТ СТСАТССААСССАТССССС ТАТАСАТ ТСА С ТААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСААССАС ССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС ССТСАТССАССС Т ТСАСАТ ТСС ТАСАССА САТАТААТСАСААСТ Т ТАААСССААССС Т АССАТСАСААСССАСАС ТАССАСС ТС ТАС АСТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАССТ СССААСАТАСАССССТСТАС ТАТ ТССАС Т ССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСС ТАТ ССАТ ТАС ТССССССАСССТАС ТАСТСТСА СССТСТСТАСТССАТСТАССААССССССА ТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССАА САССАССТСТССССССАСАСССССССТСС ССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССАА ССССТСАСССТСТССТССААСТСАССССС
- 44 029419
ССТСАССАССССССТССАСАССТТССССС СТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСС СТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАС САССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССА АС С Т 6ААТСАСАА6СССАССААСАССААС С Т С САСААСАСАС Т Т САС С С САААТ С Т Т С Т САСААААСТ САСАСАТ ССССАСССТ ССС САССАССТСААСТССТССССССАСССТСА СТСТТССТСТТССССССААААСССААССА САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАСС ТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАС СААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССА АСАСАААССССССССАССАССАСТАСААС АССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАС ССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССА АССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА ССССТСССАССССССАТССАСААААССАТ СТССАААСССАААССССАССССССАСААС САСАССТСТАСАСССТССССССАТССССС САС САСАТ САС СААСААС САС С Т САС С С Т САССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССА СССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТ ССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАС СССТССССТССТССАСТСССАССССТССТ ТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССАС ААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТ СТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТСС АСААССАС ТАСАСССАСААСАССС Т С Т СС СТСТСТССССССАААТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (ЗЕО Ю N0: 26) САССТССАССТССТССАСТСТСССССТСА ССТСААСАААСССССТССААСТСТСАААС ТСТСАТССААСССАТССССС ТАТАСАТ ТС АС ТААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСААССА СССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС СССТСАТССАСССТТСАСАТТССТАСАСС АСАТАТААТСАСААСТ Т ТАААСССААССС ТАССАТСАСААСССАСАС ТАССАСС ТС ТА САСТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАСС ТСССААСАТАСАССССТСТАС ТАТ ТССАС ТССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСС ТА ТССАТ ТАС ТССССССАСССТАС ТАСТСТС АСССТСТСТАСТ
Таблица 7. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи 36НКК3 гуманизированного антитела против ССЬ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (ЗЕО ΙΌ N0: 3) МРИ ТИНIЬ ЕЬУАААТ САН3ОУОЬУОЗСАЕ УККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГТЫУИМНИУКО АРС0СЬЕИМСУ1ϋΡ3Ό3ΥТΤΥΝΟΚΓΚΟΚΑ ТЬТУЛТЗТЗ ΤΑΥΜΕ ЬЗЗЬКЗЕ Ό ТАУУУСТ КСИУСУОΥΑΜϋУИСОСТЬУГУЗЗАЗ ТКСР ЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗееТААЬССЬУКЬУЕРЕ РУТУЗИИЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬУЗ ЬЗЗАЛ/ТУРЗЗЗЬСТОТУЮИУИНКРЗИТК УРКНУЕРКЗСРКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗ УЕЕЕРРКРКРТЬМ13НТРЕУТСУУУРУЗН ΕϋΡΕνΚΕΝΗΥνΌΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ ЗТУНАЛ/ЗУЬТУЬНОРИНИСКЕУКСКУЗИК АЬРАР1ЕКТ13КАКС0РНЕР0УУТЬРРЗН ЕЕМТКИ0УЗЬТСЬУКСЕУРЗР1АУЕИЕЗИ СОРЕИИУКТТРРУНРЗБСЗЕЕНУЗКЬТУР КЗНИООСИУЕЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (ЗЕО Ю N0: 11) ОУОЬУОЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГ ТЫУИМНИУК0АРС0СЬЕИМСУ1ϋРЗР3ΥТ ΤΥΝΟΚΓΚΟΚΑΤΣΤνΟТЗТЗΤΑΥΜΕЬЗЗЬК ЗЕΌТАУУУСΤΚΟΝΥΟνϋΥΑΜϋУИСОСТЬУ ТУЗЗ
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (ЗЕО Ю N0: 19) АТССАСТССАСАТССАСААТССТСТТССТ ССТССССССТССААССССАССАСАСАССС АССТССАСС ТССТССАСТС ТССАССАСАС СТСААСАААСССССТСС ТАСТСТСАААСТ СТСАТССААССССТСССССТАТАСТТТСА ССААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССАС СС ТССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС ССТСАТТСАСССТТСАСАТТССТАСАССА САТАТААТСАСААСТ Т ТАААССАААСССА АСАС ТСАС ТСТССАСАССАССАСАТС ТАС ТСССТАСАТССАССТСТССАСССТСАССТ СССААСАТАС ТССССТСТАС ТАТ ТСТАСС ССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТССААТ ССАТТАСТССССССАСССТАСССТССТСА САСТСТСТАСТССТАССАССААССССССА ТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССАА еАссАсстстееееесАСАесеессстее ССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССАА ССССТСАСССТСТССТССААСТСАССССС ССТСАССАССССССТССАСАССТТССССС
- 45 029419
СТ6ТССТАСА6ТССТСА66АСТСТАСТСС СТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАС САССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССА АС 6 ТСААТ САСАА6СССАССААСАССААС С Т С САСААСАСАС Т Т САС С С САААТ С Т Т С Т САС ААААСТ САСАСАТ ССССАСССТ ССС САССАССТСААСТССТССССССАСССТСА СТСТТССТСТТССССССААААСССААССА САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАСС ТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАС 6АА6АСССТСАС6ТСААСТТСААСТ66ТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССА АСАСАААССССССССАССАССАСТАСААС АССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАС ССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССА АССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА ССССТСССАССССССАТССАСААААССАТ СТССАААСССАААССССАССССССАСААС САСАССТСТАСАСССТССССССАТССССС САС САСАТ САС САА6ААССАС6Т САССС Т САССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССА СССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТ ССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАС СССТССССТССТССАСТСССАССССТССТ ТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССАС ААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТ СТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТСС АСААССАС ТАСАС6САСААСАССС Т С Т СС СТ6ТСТСС666ТАААТ6А
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 27) САССТССАСС ТССТССАСТС ТССАССАСА ССТСААСАААСССССТСС ТАСТСТСАААС ТСТСАТССААССССТСССССТАТАСТТТС АССААС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССА ССС ТССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС СССТСАТТСАСССТТСАСАТТССТАСАСС АСАТАТААТСАСААСТ Т ТАААССАААССС ААСАС ТСАС ТСТССАСАССАССАСАТС ТА СТСССТАСАТССАССТСТССАСССТСАСС ТСССААСАТАС ТССССТСТАС ТАТ ТСТАС СССССССААС ТАСССАСТССАСТАТССАА ТССАТТАСТССССССАСССТАСССТССТС АСАСТСТСТАСТ
Таблица 8. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи 42НКК1 гуманизированного антитела против ССЬ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 4) Μϋ№ ТИЫ Ь ЕЬУАААТ САН 5 ОУОЬУСЗСАЕ
УККРСАЗУКУЗСКАЗСУТРТЗУТСМШТУКО АРС<2СЬЕ ТСМСЬIΏ Ρ3ΏΚΥ ΤΝΥΝςΚΓΚΟΚν ΤΜΤΕϋТЗТЗ ТУУМЕЬЗЗЬКЗЕОТАУУУСА КСЫУСУОУСМОУТССдСТЬУТУЗЗАЗ ТКСР ЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКРУЕРЕ РУТУЗИИЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬУЗ ЬЗЗАЛ/ТУРЗЗЗЬСТОТУЮИУИНКРЗИТК УРКРУЕРКЗСРКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗ УЕЬЕРРКРКРТЬШЗКТРЕУТСУУУРУЗН ЕОРЕУКЕИИУУОСУЕУНИАКТКРКЕЕОУИ ЗТУНАЛ/ЗУЬТУЬНООИЬИСКЕУКСКУЗИК АЬРАР1ЕКТ13КАКС0РНЕР0УУТЬРРЗН ЕЕМТКИ0УЗЬТСЬУКСЕУРЗО1АУЕИЕЗИ СОРЕИИУКТТРРУЬОЗОСЗЕЕЬУЗКЬТУО КЗНИ00СИУЕЗСЗУМНЕАЬНИН¥Т0КЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 ΙΌ N0: 12) ОУСЬУОЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГ ТЗУ^МН^УКСАРСОСЬЕ^МСЫϋΡ3ΌΚΥТ ΝΥΝςΚΓΚΟΚνΤΜΤΚϋТ3 ТЗ ТУУМЕьз зьк ЗЕ ϋ ТАУУУ САКСЫУ СУ0УСМОУЫС<2СТЬУ ТУЗЗ
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (5Е<2 ΙΌ N0: 20) АТССАСТССАССТССССААТССТСТТССТ сетеессестесААСАееАесАСАстсАс АССТССАССТССТССАСТСССССССАСАС СТСААСАААСССССТСССАСССТСААССТ СТС Т ТССАААСС ТАСТССС ТАТАСС Т ТСА СААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСССССАС ССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС СС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАС ТА АС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССААСССТС АС ТАТСАССССССАСАСАТСААС Т ТССАС ССТСТАСАТССАСС ТСТССАССС ТСАСАТ СССААСАТАССССССТСТАСТАТТСТССТ ССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССАТ ССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТСА СССТСТССАСТССТАССАССААССССССА ТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССАА САССАССТСТССССССАСАСССССССТСС ССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССАА ССОСТОАСССТСТССТССААСТСАССССС ССТСАССАССССССТССАСАССТТССССС
- 46 029419
СТ6ТССТАСА6ТССТСА66АСТСТАСТСС СТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАС САССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССА АС С Τ 6ААТСАСААССССАССААСАССААС СТС САСААСАСАСΤ Т САССССАААТ С Τ Т С Т САСААААСТ САСАСАТ ССССАСССТ ССС САССАССТСААСТССТССССССАСССТСА СТСТТССТСТТССССССААААСССААССА САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАСС ТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАС СААСАСССТСАССТСААСΤТСААСТССТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССА АСАСАААССССССССАССАССАСТАСААС АССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАС ССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССА АССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА ССССТСССАССССССАТССАСААААССАТ СТССАААСССАААССССАССССССАСААС САСАССТСТАСАСССТССССССАТССССС САС САСАТ САС СААСААС САС С Т САС ССТ САССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССА СССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТ 666СА6СС66А6ААСААСТАСААСАССАС СССТССССТССТССАСТСССАССССТССТ ТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССАС ААеАесАеетеесАесАееесААсетстт СТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТСС АСААССАС ТАСАСССАСААСАССС Т С Т СС СТСТСТСССССТАААТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (ЗЕф Ю N0: 28) САССТССАСС ТССТССАСТСССССССАСА ССТСААСАААСССССТСССАСССТСААСС ТСТСТТССАААССТАСТССС ТАТАССТТС АСААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСССССА СССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС ССС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАС Т ААС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССААСССТ САС ТАТСАССССССАСАСАТСААС Т ТССА СССТСТАСАТССАССТСТССАСССТСАСА ТСССААСАТАССССССТСТАСТАТТСТСС ТССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССА ТССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТС АСССТСТССАСТ
Таблица 9. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи 42НКК2 гуманизированного антитела против ССБ20 человека.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (3Εζ) Ю N0: 5) мьи тинιь еь νΑΑΑΤ сан з ονςι,νοδΟΑΕ УККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГТЗУИМНИУКО АРСОСЬЕИМСЬIϋΡ3ΌΚΥΤΝΥΝΟΚΡΚσκν ТЬТУОТЗТЗΤνΎΜΕЬЗЗЬКЗЕРТАУУУСТ КСЫУСУОУСМОУНС<2СТЬУТУЗЗАЗ ТКСР ЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКЬУЕРЕ РУТУЗИИЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬУЗ ЬЗЗАЛ/ТУРЗЗЗЬСТОТУЮИУИНКРЗИТК УОКНУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗ νΕΗΕΡΡΚΡΚϋΤΗΜΙ3ΗΤΡΕνΤθνννθν3Η ΕΌΡΕνΚΕΝΗΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ ЗТУНАЛ/ЗУЬТУЬНООИЬИСКЕУКСКУЗИК АЬРАР1ЕКТ13КАКС0РНЕР0УУТЬРРЗН ЕЕМТКИОУЗЬТСЬУКСЕУРЗЫАУЕИЕЗИ СОРЕИИУКТТРРУНОЗЬСЗЕЕНУЗКЬТУЬ КЗНИООСИУЕЗСЗУМНЕАЬНОТтаКЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 13) СУСЬусзсаеуккрсазукузсказсутг тзуимниуксарсосьенмсшорзокут ΝΥΝΟΚΓΚσκνΤΣΤνϋТЗТЗΤνΥΜΕьззьк ЗЕ ϋ ТАУУУСТНСЫУСУОУСМОУИСОСТЬУ ТУЗЗ
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (ЗЕ<2 Ю N0: 21) АТССАСТССАСТТССАССАТССТСТТССТ ССТССССССТССААССССАССТСАСТСАС АССТССАССТССТССАСТССССАССАСАС СТСААСАААСССССТСССТСССТСААССТ СТС Т ТССАААССААСТССС ТАТАСС Т ТСА СААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСАСАС ССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС СС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАС С А АС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССАССССТС АС ТС ТСАСССТССАСАСАТСААС Т ТССАС ССТСТАСАТССАССТСТССАСССТСАССТ СССААСАТАССССАСТСТАС ТАТ ТСТАСА ССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССАТ ССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТСА СССТСТССАСТССТАССАССААССССССА ТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССАА САССАССТСТССССССАСАСССССССТСС ССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССАА ССССТСАСССТСТССТССААСТСАССССС ССТСАССАССССССТССАСАССТТССССС
- 47 029419
СТ6ТССТАСА6ТССТСА66АСТСТАСТСС СТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАС САССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССА АС С Т СААТ САСАА6С С САССААСАССААС СТС САСААСАСАС Τ Т САС С С САААТ С Τ Т С Т САСААААСТ САСАСАТ ССССАСССТ ССС САССАССТСААСТССТССССССАСССТСА СТСТТССТСТТССССССААААСССААССА САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАСС ТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАС 6АА6АСССТСАС6ТСААСΤТСААСТ66ТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССА АСАСАААССССССССАССАССАСТАСААС АССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАС ССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССА АССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА ССССТСССАССССССАТССАСААААССАТ СТССАААСССАААССССАССССССАСААС САСАССТСТАСАСССТССССССАТССССС САС САСАТ САС САА6ААССАС6Т САССС Т САССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССА СССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТ ССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАС СССТССССТССТССАСТСССАССССТССТ ТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССАС ААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТ СТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТСС АСААССАС ТАСАС6САСААСАССС Т С Т СС СТСТСТСССССТАААТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (ЗЕО ΤΟΝΟ: 29) САССТССАСС ТССТССАСТССССАССАСА ССТСААСАААСССССТСССТСССТСААСС ТСТСТТССАААССААСТСССТАТАССТТС АСААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСАСА СССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС ССС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАСС ААС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССАССССТ САС ТС ТСАСССТССАСАСАТСААС Т ТССА СССТСТАСАТССАССТСТССАСССТСАСС ТСССААСАТАССССАСТСТАС ТАТ ТСТАС АССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССА ТССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТС АСССТСТССАСТ
Таблица 10. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности тяжелой цепи 42НКК3 гуманизированного антитела против ССЬ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (8Е0 Ю N0: 6) МОИТИНIЬ ЕЬУАААТ ΟΑΗΞΟνβΣνςδΟΑΕ УККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГТЗУИМНТСУКф АРС<2СЬЕ ИМСЪI ϋ Ρ3ϋΚΥ ΤΝΥΝφΚΓΚσΚΑ ΤΣΤνυТЗТЗΤΑΥΜΕЬЗ3ΣΚ3ΕΌТАУУУСТ КСЫУСУОУСМОУтеСССТЪУТУЗЗАЗ ТКСР ЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКОУЕРЕ РУТУЗИИЗСАЪТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬУЗ ЬЗЗУУТУРЗЗЗЬОТОТУЮИУИНКРЗИТК УОКНУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕООССРЗ УЕЬЕРРКРКОТЬМ15РТРЕУТСУУУЬУ5Н ΕΟΡΕνΚΕΝΗΥνΌΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ 3ΤΥΡ.νν3νΡΤνΕΗ0ΟΗΗΝΟΚΕΥΚΟΚν3ΝΚ АЬРАР1ЕКТ13КАКО0РКЕР0УУТЪРРЗН ΕΕΜΤΚΝ0ν5ΗΤ0ΕνΚ0ΕΥΡ5ΟΙΑνΕΗΕ5Ν СОРЕИИУКТТРРУЬОЗОСЗЕЫАЗКЬТУО КЗНИООСИУЕЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗ ЬЗРСК
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (3Εζ) Ю N0: 14) 0νςΣν03ΰΆΕνΚΚΡΰΑ3νκν30ΚΑ3ΰΥΤΓ тз уимннук<2арс<2Сье имсы ϋ рзрку т ΝΥΝΟΚΡΚσΚΑΤΣΤνΟ ТЗ ТЗ ΤΑΥΜΕЬЗЗЬР ЗЕ ϋ ТАУУУС ТКСЫУСУОУСМОУИСОСТЬУ ТУЗЗ
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (5Е0 ΙΌ N0: 22) АТССАСТОСАСТТССАСААТССТСТТССТ ОСТССССОСТССААССССАОСТСАСТСАС АССТССАСС ТССТССАСТССССАССАСАС СТСААСАААСССССТСССТСССТСАААСТ СТС Т ТССААССС ТАСТССС ТАТАСС Т ТСА СААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССАС ССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТССС СС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАССА АС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССАААСССА АС ТС ТСАСССТССАСАСАТСААС Т ТССАС ССССТАСАТССАССТСТССАСССТСАССТ СССААСАТАССССССТСТАСТАТТСТАСА ССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССАТ ССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТСА СССТСТССАСТССТАССАССААССССССА ТС66ТСТТСССССТ66САСССТССТССАА САССАССТСТССССССАСАСССССССТСС ОСТСССТОСТСААееАСТАСТТССССОАА ССССТСАСССТСТССТССААСТСАССССС ССТСАССАССССССТССАСАССТТССССС
- 48 029419
СТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСС СТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАС САССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССА АС С Т СААТ САСААСС С САССААСАССААС С Т С САСААСАСАСΤ Т САССССАААТ С Τ Т С Т САСААААС Т САСАСАТ ССС САС С С Т С С С САССАССТСААСТССТССССССАСССТСА СТСТТССТСТТССССССААААСССААССА САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАСС ТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАС СААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССА АСАСАААССССССССАССАССАСТАСААС АССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАС ССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССА АССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА ССССТСССАССССССАТССАСААААССАТ СТССАААСССАААССССАССССССАСААС САСАССТСТАСАСССТССССССАТССССС САС САСАТ САС СААСААС САС С Т САС ССТ САССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССА СССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТ ССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАС СССТССССТССТССАСТСССАССССТССТ ТСТТССТСТАТАССААССТСАСССТССАС ААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТ СТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТСС АСААС САС ТАСАС С САСААСАСС С Т С Т С С СТСТСТСССССТАААТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (5Е<2 Ю N0: 30) САССТССАСС ТССТССАСТССССАССАСА ССТСААСАААСССССТСССТСССТСАААС ТСТСТТССААСССТАСТСССТАТАССТТС АСААСС ТАС ТССАТССАТ ТСССТСАСССА СССАССАССАСАСССАС ТССААТССАТСС ССС ТСАТ ТСАССС Т ТС ТСАТААСТАСАСС ААС ТАСААССАСААСТ Т ТАААССАААССС ААС ТС ТСАСССТССАСАСАТСААС Т ТССА СССССТАСАТССАССТСТССАСССТСАСС ТСССААСАТАССССССТСТАСТАТТСТАС АССССССААС ТАСССАСТССАС ТАТСССА ТССАТ ТАС ТССССССАСССТАСАС ТССТС АСССТСТССАСТ
Таблица 11. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности легкой цепи ЬС3 гуманизированного антитела против ССБ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность легкой цепи с сигнальной последовательностью (5Е<2 ΙΌ N0: 7) МСИЗС11ЬЕЬУАТАТСУНЗИ1СМТС5Р55 Σ5Α5νθϋΚνΤΙΤΟΚΑδΕΝΙΥΟΑΣΝΝΥςςΚ РСКАРКЬЫУСАТЫЬАОСУРЗКГЗСЗСЗС ΚςΥ3ΣΤΙ33ΣςΡΕϋΓΑΤΥΥΟ0ΝνΣΙΤΡΥΤ ГСССТКЬЕ1ККТУААРЗУЕ1ЕРРЗЬЕ0ЬК 3 С ТАЗ ννο Ь ЬИИ ΕΥ РНЕАКУОИКЛЬИАЬ0 ЗСИЗОЕЗУТЕОЬЗКЬЗТУЗЬЗЗТЬТЬЗКА ЬУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗ 3 РЛТКЗ ΕΝΗΟΕ С
Аминокислотная последовательность легкой цепи без сигнальной последовательности (5Е<2 Ю N0: 110) ИI ςΜΤζ23 РЗ ЗЬЗАЗУСИКУТIΤ0ΚΑ3ΕΝI ΥΟΑΣΝνΤΥςςΚΡΟΚΑΡΚΕΣΙΥΟΑΤΝΙΑΟΟν Ρ3ΚΓ3Ο3Ο3ΟΚςΥ3ΕΤΙ33Ε0ΡΕϋΓΑΤΥΥ ΟΩΝνΣΙТРУТГСССТКЬЕΙΚΚΤνΑΑΡ3νΕ IЕРРЗОЕОЬКЗСТАЗУУСЬЬИИЕУРКЕАК УОИКУОИАЬОЗСИЗОЕЗУТЕОЬЗКЬЗТУЗ ЬЗЗТЬТЬЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗ РЛТКЗЕИНСЕС
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи (5Е<2 Ю ΝΟ: 15) ИI ςΜΤζ23 РЗ ЗЬЗАЗУСИКУТIΤ0ΚΑ3ΕΝI ΥΟΑΣΝνΤΥςςΚΡΟΚΑΡΚΕΣΙΥΟΑΤΝΙΑϋαν Ρ3ΚΓ3Ο3Ο3ΟΚςΥ3ΕΤΙ33Ε0ΡΕϋΓΑΤΥΥ ΟΟΝνίΠ ТРУТГСССТКЬЕΙΚ
Нуклеотидная последовательность легкой цепи с сигнальной последовательностью (5Е<2 Ю N0: 23) АТССССТССТССТССАТСАТТСТСТТССТ ССТСССААСССССАСАССАСТССАСАССС АСАТ С САСАТ САС С САС ТС ТССАТССАСС СТСАСТСССТСАСТСССССАТАСССТСАС ТАТСАСС ТСТССССССАСССАСААСАТС Т АСССССС ТС ТСААТ ТССТАТСАССАСААС ССАССААААСС ТСССААСС ТСС ТСАТС ТА ССССССТАСАААССТСССАСАСССТСТСС ССАСТССАТТСТССССТАСССССТСТССА ССАСАСТАТ ТСАС ТСАС ТАТС ТС ТАСТС Т ССАССС ТСААСАТ Т ТССССАС Т ТАС ТАТ Т СССАСААТСТСС ТСАТ ТАС ТССАТАТАСС Τ Т ТСССССАСССАСААААС ТССАСАТСАА САСААСТСТССССССТСССАСТСТСТТСА ТТТТТСССССТТСАСАССААСАССТСААА ТСАСССАССССТТСССТССТСТСТСТССТ СААСААТТТСТАСССТССССАСССААААС
- 49 029419
ТССАСТССААССТССАТААСССССТССАС АС Т С С СААТ Т САСАС САС Т С С С Т САС С СА АСАССАСАССАААСАТТ С ТАСАТАТАСТ С Т С Т САТ С САС ССТ САСАС Т САС СААС ССТ САТ ТАС САСААС САСАААС ТСТАТССАТС ССААСТСАСТСАТСАСССССТСАССТСТС СССТСАССААСТСТТТТААССССССТСАА ТСТТСА
Нуклеотидная последовательность легкой цепи без сигнальной последовательности (ЗЕО Ю N0: 111) САСАТССАСАТСАСССАСТС ТССАТССАС ССТСАСТСССТСАСТСССССАТАСССТСА С ТАТСАСС ТСТССССССАСССАСААСАТС ТАСССССС ТС ТСААТ ТССТАТСАССАСАА СССАССААААСС ТСССААСС ТСС ТСАТС Т АСССССС ТАСАААСС ТСССАСАСССТСТС СССАСТССАТТСТССССТАСССССТСТСС АССАСАСТАТ ТСАС ТСАС ТАТС ТС ТАСТС ТССАССС Т СААСАТ Т ТССССАС Т ТАС ТАТ ТСССАСААТСТСС ТСАТ ТАС ТССАТАТАС С Т Т ТСССССАСССАСААААС ТССАСАТСА АСАСААСТСТССССССТСССАСТСТСТТС АТТТТТСССССТТСАСАССААСАССТСАА АТСАСССАССССТТСССТССТСТСТСТСС ТСААСААТТТСТАСССТССССАСССАААА СТССАСТССААССТССАТААСССССТССА САС ТСС СААТ Т САСАС САС Т С С С Т САС С С ААСАССАСАССАААСАТТ С ТАСАТАТАСТ С Т С Т САТ С САС ССТ САСАС Т САС СААС С С Т САТ ТАС САСААС САСАААС ТСТАТССАТ СССААСТСАСТСАТСАСССССТСАССТСТ ССССТСАССААСТСТТТТААССССССТСА АТСТТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи (ЗЕО Ю N0: 31) САСАТССАСАТСАСССАСТС ТССАТССАС ССТСАСТСССТСАСТСССССАТАСССТСА СТАТСАССТСТССССССАСССАСААСАТС ТАСССССС ТС ТСААТ ТССТАТСАССАСАА СССАССААААСС ТСССААСС ТСС ТСАТС Т АСССССС ТАСАААСС ТСССАСАСССТСТС СССАСТССАТТСТССССТАСССССТСТСС АССАСАСТАТ ТСАС ТСАС ТАТС ТС ТАСТС ТССАССС ТСААСАТТТССССАСТ ТАС ТАТ ТСССАСААТСТСС ТСАТ ТАС ТССАТАТАС С Т Т ТСССССАСССАСААААС ТССАСАТСА АС
Таблица 12. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности легкой цепи ЬК3 гуманизированного антитела против ССБ20 человека
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (сигнальная последовательность подчеркнута, вариабельный домен выделен полужирным шрифтом)
Аминокислотная последовательность легкой цепи с сигнальной последовательностью (ЗЕО Ю N0: 8) ΜΟΜΕΥΡΑΟΗ Н СН Η Н НИННСАНСРIСМТСЗ Р55Ь5А8УСОКУТ1 ΤΟΟΑδΕΝΙΥΟΑΣΝΝΥ СЕКРСКАРКЬЫУСАТЫЬАОСУРЗКГЗСЗ Ο3ΟΕΟΥΤΣΤΙ33ΣςΡΕϋΓΑΤΥΥΟ0ΝνΣΙΤ ΡΥΤΓ0ς0ΤΚΣΕΙΚΗΤνΑΑΡ3νΕΙΕΡΡ30Ε ОЬКЗСТАЗАЛ/СНЬИИЕУРНЕАКУОИКУЬИ АНОЗСИЗОЕЗУТЕОЬЗКЬЗТУЗНЗЗТНТЬ ЗКАЬУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗРУТКЗЕИ НОЕС
Аминокислотная последовательность легкой цепи без сигнальной последовательности (ЗЕО Ю N0: 112) ϋΐςΜΤς3Ρ33Σ3Α3νθϋΡ.νΤΙΤΟΟΑ3ΕΝΙ УСАЪОТТУСЕКРСКАРКЬЫУСАТЫЬАРСУ РЗКГЗСЗСЗСЕОУТЬТТЗЗЬСРЕРГАТУУ ΟΩΝνΣΙТРУТГСОСТКЬЕ1КНТУААРЗУЕ IЕРРЗЬЕОЬКЗСТАЗАЛ/СНЬИИЕУРНЕАК УОИКУОИАЬОЗСИЗОЕЗУТЕОЬЗКЬЗТУЗ ЬЗЗТНТНЗКАЬУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗ РУТКЗЕИНСЕС
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи (ЗЕО Ю N0: 16) ϋΐςΜΤς3Ρ33Σ3Α3νσϋΚνΤΙΤΟΟΑ3ΕΝΙ УСАЪОТТУСЕКРСКАРКЬЫУСАТЫЬАРСУ РЗКГЗСЗСЗСЕОУТЬТТЗЗЬСРЕРГАТУУ ΟΟΝνί,Ι ТРУТГСОСТКЬЕΙΚ
Нуклеотидная последовательность легкой цепи с сигнальной последовательностью (ЗЕО Ю N0: 24) АТССАСАТСАСССТСССТССТСАССТССТ СССАСТССТССТССТСТСССТСАССССАС САССАТСССАСАТССАСАТСАСТСАСАСС ССАТССАСССТСТСАСССТСССТСССССА САСССТСАССАТСАСАТСТССАССАТССС АСААСАТСТАССССССССТСААТТССТАТ САСАССААСССССССАААСС ТСС ТААСС Т ССТСАТСТАСССТСССАСАААССТСССТС АТССССТССССТССАСАТТСАСССССТСТ ССААСТСССССССАС ТАТАС ТС ТСАССАТ Т ТС ТАСТС ТССАСССАСАССАТ Т ТССССА СС ТАС ТАТ ТСССАСААТСТСС ТСАТСАСА ССС ТАСАС Т Т Т ТССТСАССССАСААААС Т ССАААТТААСССТАСССТСССТССАССАТ СТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАС САСТТСАААТСТССААСТСССТСТСТТСТ СТСССТССТСААТААСТТСТАТСССАСАС
- 50 029419
А66ССААА6ТАСАСТ66АА6СТ66АТААС ССССТССААТССССТААСТСССАССАСАС ТСТСАСАСАССАССАСАССААССАСАССА ССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТС АССАААССАСАСТАССАСАААСАСАААСТ СТАССССТСССААСТСАСССАТСАССССС ТСАССТССССССТСАСАААСАССТТСААС АССССАСАСТСТТСА
Нуклеотидная последовательность легкой цепи без сигнальной последовательности (5Е0 Ю ΝΟ: 113) САСАТССАСАТСАС ТСАСАССССАТССАС ССТСТСАСССТСССТСССССАСАСССТСА ССАТСАСАТСТССАССАТСССАСААСАТС ТАССССССССТСААТТССТАТСАСАССАА СССССССАААССТССТААССТССТСАТСТ АСССТСССАСАААССТСССТСАТССССТС СССТССАСАТТСАСССССТСТССААСТСС СССССАС ТАТАС ТС ТСАССАТ Т ТС ТАСТС ТССАСССАСАССАТ Т ТССССАСС ТАС ТАТ ТСССАСААТСТСС ТСАТСАСАССС ТАСАС Т Т Т ТССТСАССССАСААААС ТССАААТ ТА АСССТАСССТСССТССАССАТСТСТСТТС АТСТТССССССАТСТСАТСАССАСТТСАА АТСТССААСТСССТСТСТТСТСТСССТСС Т СААТААС ТТСТАТСС САСАСАС С С СААА СТАСАСТССААССТССАТААСССССТССА АТ С С С С ТААС ТСС САС САСАС Т С Т САСАС АССАССАСАССААССАСАССАССТАСАСС СТСАССАССАСССТСАСССТСАССАААСС АСАС ТАС САСАААСАСАААС ТСТАССССТ СССААСТСАСССАТСАСССССТСАССТСС ССССТСАСАААСАССТТСААСАССССАСА СТСТТСА
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи (ЗЕО Ю ΝΟ: 32) САСАТССАСАТСАС ТСАСАССССАТССАС ССТСТСАСССТСССТСССССАСАСССТСА ССАТСАСАТСТССАССАТСССАСААСАТС ТАССССССССТСААТТССТАТСАСАССАА СССССССАААССТССТААССТССТСАТСТ АСССТСССАСАААССТСССТСАТССССТС СССТССАСАТТСАСССССТСТССААСТСС СССССАС ТАТАС ТС ТСАССАТ Т ТС ТАСТС ТССАСССАСАССАТ Т ТССССАСС ТАС ТАТ ТСССАСААТСТСС ТСАТСАСАССС ТАСАС Т Т Т ТССТСАССССАСААААС ТССАААТ ТА АС
Таблица 13. Аминокислотные последовательности, кодируемые генами эмбрионального типа
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1СНУ1-46*03 (ЗЕО Ю N0: 57) ОУОЬУОЗСАЕУККРСАЗУКЛЗСКАЗСУТЕ ТЗУУМН1лГУН0АРС0СНЕИМС1 ΙΝΡ3663Τ ЗУАОКЕОСКУТМТКЬТЗТЗТУУМЕЬЗЗЬК
ЗЕЬТАУУУСАН
ЛМ (ЗЕО ΙΌ N0:117) исостьлтлзз
Κ8Κνΐϋ-39*01 (ЗЕО Ю ΝΟ: 59) ЫОМТОЗРЗЗЬЗАЗУСЬНУТ1ТСРАЗО31 ЗЗУЬИИУООКРСКАРКЬЫУААЗЗЬОЗСУ РЗКЕЗСЗСЗСТЬЕТЬТЛЗЗЬОРЕЬЕАТУУ СООЗУЗТРР
Исходя из результатов оценки, авторы настоящего изобретения отобрали 36ЬК3/36НС2 ("НС2/ЬК3") и 36ЬС3/36НС2 ("НС2/ЬС3") для дальнейших исследований. Для этих двух антител проводили анализ хемотаксиса ΐη νίίΓο параллельно с родительским клоном 36Т7С10 мыши и его химерной формой (содержащей Тс-часть человека). В этом анализе авторы настоящего изобретения использовали культуральные планшеты Тгапз\уе11 с посевом В300.19 ССК6+ клеток в верхний слой и рекомбинантным лигандом ССЬ20 человека в нижнем слое. Рекомбинантный ССЬ20 человека (конечная концентрация 10
нМ, Κ&Ό 8уз!етз) предварительно инкубировали с гуманизированными антителами против ССЬ20 антитела при комнатной температуре. Через 30 мин на верхний слой наносили трансдуцированные ССК6 человека пре-В клетки мыши (В300.19, предоставленные Όγ. Η. Ка\уаза1<1, Тοкуο ИпгуегзНу) и позволяли протекать хемотаксису при 37°С в течение 4 ч. В конце инкубации использовали ТАС8 для измерения мигрировавших клеток. Затем вычисляли 50%, 90% и 95% ингибиторные концентрации (1С50/1С90 и 1С95, соответственно) для НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 (табл. 14). Ни одно из гуманизированных антител не утрачивало активность нейтрализации по сравнению с исходным МАЬ мыши, и величины 1С50 были вычислены на уровне приблизительно 1 нМ.
Таблица 14. Нейтрализующая активность НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 против ССЬ20 человека в анализе хемотаксиса (в нМ)
- 51 029419
Эффекты доз для репрезентативного испытания с антителом НС2/БК3 представлены на фиг. 8А-С. Представлены три независимых эксперимента.
Далее авторы настоящего изобретения подтвердили нейтрализующую активность НС2/БК3 и НС2/БС3 с использованием анализа трансэндотелиальной миграции (ТЕМ), в котором свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови человека использовали вместо искусственных трансдуцированных ССК6 клеток. Поскольку хорошо известно, что СП3+СЭ4+СП45К0+ Т-клетки памяти и СЭ19+ В-клетки обогащены положительными по ССК6 клетками, авторы настоящего изобретения измеряли количества мигрировавших клеток этих популяций в присутствии или в отсутствие антител НС2/БК3 и НС2/БС3, а также родительского антитела мыши 36Е7С10. Оба гуманизированных антитела (фиг. 9В и С) продемонстрировали зависимое от дозы ингибирование миграции клеток, сравнимое с 36Е7С10 (фиг. 9А), обеспечивая дальнейшее доказательство их нейтрализующей активности.
Пример 5. Связывание гуманизированных МАЬ против ССБ20 человека с ССБ20 человека
Для измерения аффинности связывания гуманизированных антител НС2/БС3 и НС2/БК3 с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Ыасоге™), авторы настоящего изобретения экспрессировали и очищали антитела от кондиционированной среды временно трансфицированных клеток НЕК293Е, и иммобилизовывали антитела на чипе СМ5, покрытом моноклональными антителами против Ес человека, с использованием НВ8-ЕР в качестве буфера для прогона. Затем авторы настоящего изобретения инжектировали несколько разведений (100, 20, 4, 0,8, 0,16 и 0 нМ) белка ССЕ20 человека (И&Э 8у81еш8) над покрытой поверхностью чипа и наблюдали диссоциацию связанного ССЕ20 в течение вплоть до 20 минут (фиг. 10А и В). Авторы настоящего изобретения аппроксимировали данные связывания в целом к модели Ленгмюра 1:1. Результаты представлены в табл. 15 и соответствуют среднему значению для двух независимых экспериментов. Было описано, что аффинность между ССБ20 и его рецептором ССК6 составляет 500 пМ в первичных клетках человека (Б1ао е! а1., I. 1шшипо1. 168 (10):4871-4880 (2002)); эти данные демонстрируют, что аффинность антител НС2/БС3 и НС2/БК3 в отношении ССБ20 приблизительно в 10 раз превышает аффинность ССК6 в отношении ССБ20.
Таблица 15. Результаты 8РК для гуманизированных антител против ССБ20 по изобретению
Тяжелая цепь/Легкая цепь ка (хЮ5 М-1 с’1) кс (х10_5 С’1) % (пМ) Стандартное отклонение
НС2/ЛСЗ 145 61 44 15
НС2/ЛКЗ 166 117 70 7
Пример 6. Перекрестная реактивность гуманизированных МАЬ против ССБ20 человека в отношении паралогов хемокинов
Авторы настоящего изобретения исследовали НС2/БК3 и НС2/БС3 в отношении их специфичности к ССБ20 человека путем анализа их перекрестной реактивности против панели хемокинов (табл. 16) с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А).
Таблица 16. Рекомбинантные хемокины человека, используемые в анализе ЕБ18А
Хемокин Изготовитель Каталожный номер
ССЫ0 ΜΙΡ-За/ЬАНС Κ&Ό #360-МР-025/СЕ
ХСЫ Ып Κ&Ό #695-ЬТ-025/СЕ
ССЬ28 Η&ϋ #717-ЛС-025/СЕ
ССЬ27 СТАСК Κ&Ό #376-СТ-025/СЕ
ССЬ25 ТЕСК ст #2234Х
ССЬ24 Эотаксин-2/ ΜΡΙΕ-2 ст #2343Х
ССЬ22 МОС Η&ϋ #336-Μϋ-025/ΟΕ
ССЬ21 бСЫпе/ЗЬС Η&ϋ #3 бб-6С-025/СЕ
ССЫ9 ΜΙΡ-ЗЪ Κ&Ό #361-М1-025/СЕ
ССЫ7 ТАКС ст #2364
ССЫб НСС-4 Κ&Ό #802-НС-025/СЕ
ССЫЗ МСР-4 ст #2327Х
ССЫ1 Эотаксин Κ&Ό #320-ЕО-020/СЕ
ССЬ7 МАКС Η&ϋ #282-РЗ-010/СЕ
ССЬ5 НапДез ΟΗΕΜΙΟΟΝ #СЕ020
ССЬ4 ΜΙΡ-1β Κ&Ό #271-ВМЕ-010/СЕ
ССЬЗ М1Р-1а ст #2270Х
ССЬ2 МСР-1/МСАЕ/ДЕ РЕРНО ТЕСН #300-04
ССЫ ТСАЗ/1-ЗО9 СТ #2272
СХСЫб СХСЫб СТ #2976Х
схсыз ВСА-1/ВЬС Κ&Ό #801-СХ-025/СЕ
СХСЫ2 ЗОЕ-1/РВЗЕ Η&ϋ #350-ИЗ-010/СЕ
схсыо ΙΡ-10 РЕРНО ТЕСН #300-12
СХСЬ9 ΜΙ6 СТ #2392Х
СХСЬ8 1Ы8 РЕРНО ТЕСН #200-08М
СХСЬ4 РЕ4 Κ&Ό #795-Р4-025/СЕ
СХСЫ скор Η&ϋ #276-СВ-010/СЕ
СХСЫ СНОа Κ&Ό #275-6Н-010/СЕ
схзсы (Домен хемокина) ΕΚΝ Η&ϋ #362-СХ-025/СЕ
СХЗСЫ (Внеклеточный домен) ΕΚΝ Η&ϋ #365-ЕН-025/СЕ
- 52 029419
Лунки 96-луночного планшета покрывали 1 мкг/мл рекомбинантных хемокинов человека в РВ8 (-). После инкубации в течение ночи при 4°С лунки блокировали 1х В1оск-Асе ГОаннрроп 8итЦото РЬагта, ИК-В80) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания два раза 0,02% Т\уееп 20/РВ8 (-), авторы настоящего изобретения добавляли 50 мкл очищенного 36Ε7Ο0, химерного 36Ε710, НС2/ЬК3 или НС2/ЬС3 в концентрации 10 мкг/мл в 0,02% Тетееп 20/РВ8 (-) в каждую лунку. Лунки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали три раза, как описано в примере 3. Затем добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена (НКР) антитело против Ι§Ο мыши (1асккоп, #715-035-150, для 36Е7С10) или конъюгированное с НКР антитело против Εсγ-фрагмента ΙβΟ человека (Засккоп. #109035-098, для химерных и гуманизированных тАЬ) (5000-кратном разведении 0,02% Т\уееп 20/РВ8 (-)) и лунки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания пять раз в лунки добавляли раствор ΤΜΕΖ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) (1%, в ^^диметилформамиде) и инкубировали в течение 15-30 мин. Реакцию останавливали добавлением равного объема стоп-раствора 2 М Н2804, и проводили считывание оптической плотности при 450 нм с помощью АКУ0 (РегкшЕ1тег). Как показано на фиг. 11В, НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 специфично связывались с ССЬ20 человека относительно других хемокинов в панели.
В этих анализах, хотя НС2/ЬК3 были реактивными против связанного с планшетом ССЬ20 человека, они оказались менее эффективными, чем 36Ε7Ο0 мыши или химерное антитело 36Ε7Ο0-№ά (фиг. 11 А). Однако НС2/ЬК3 показало отчетливое и сильное связывание с ССЬ20, заякоренным через Ηίκметку в анализах ЕЫ8А (фиг. 11С), что обеспечило воздействие растворителя на все участки ССЬ20. Это может указывать на то, что эпитоп(ы) ССЬ20 для НС2/ЬК3 погружаются или закрываются в процедуре, используемой для связывания ССЬ20 с поверхностью планшета в первом формате анализа. Для избежания этого возможного артефакта, авторы настоящего изобретения использовали анализ В1асоге™, в котором свободный ССЬ20 наносили над МАЬ, иммобилизованные на сенсорном чипе. В анализах В1асоге™, НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 продемонстрировали сильное связывание ССЬ20, сравнимое со связыванием химерного антитела 36Ε7Ο10-ΗΕο (фиг. 11Ό). Кроме того, было выявлено, что незначительная реакция против СХСЬ4, наблюдаемая на фиг. 11В, является несущественной в анализах В1асоге™ (фиг. 11Ό).
Филогенетический анализ Эегеерег е1 а1., Щис1ею Λαάδ Ке8. 1 (36):^465-469 (2008)) указывает на то, что ССЬ16 представляет собой хемокин, наиболее близкий по последовательности ССЬ20, хотя процентная идентичность между ССЬ20 и ССЬ16 составляет менее 37,5% (гомология только в 56 из 70 аминокислот, содержащих зрелый пептид ССЬ20 (8ΙΜ - АПдптеп! Тоо1 Гог рго1еш кедиепсек, 8\\а55 ЕъЦЦЦе оГ ВюшГогтайск)) (фиг. 12). Авторы настоящего изобретения использовали анализ В1асоге™ для исследования того, реагирует ли НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 перекрестно с ССЬ16. Моноклональное антитело мыши против Εс человека иммобилизовывали на всех четырех проточных ячейках чипа СМ5 со скоростью потока 25 мкл/мин с буфером НВ8-ЕР, содержащим 0,2 мг/мл В8А. Затем 50 мкл раствора 1 мкг/мл раствор химерного антитела, антитела НС2/ЬС3 или НС2/ЬК3 в буфере НВ8-ЕР с 0,2 мг/мл В8А инжектировали над проточными ячейками 2, 3 и 4 соответственно. Затем 150 мкл 100 нМ раствора ССЬ20 или ССЬ16 в буфере НВ8-ЕР (или буфере отдельно) с 0,2 мг/мл В8А инжектировали над всеми четырьмя проточными ячейками со скоростью потока 40 мкл/мин. Затем следовала диссоциация в течение 20 мин. Проточную ячейку 1 (антитело против Εс человека отдельно) использовали в качестве эталонного антитела для всех проточных ячеек.
В этих условиях ССЬ20 человека связывался с химерным антителом (фиг. 13А), НС2/ЬС3 (фиг. 13В) и НС2/ЬК3 (фиг. 13В), иммобилизованным на чипе, со сходной прочностью. Напротив, не было выявлено существенного связывания, когда ССЬ16 человека прогоняли через чип, что указывает на то, что, хотя ССЬ16 является хемокином, наиболее близким по последовательности ССЬ20, ССЬ20 и ССЬ16 не обладают достаточной гомологией (<37%, как рассмотрено выше) для обеспечения перекрестного реагирования гуманизированных антител против ССЬ20 с ССЬ16.
Эти данные указывают на то, что НС2/ЬК3 и НС2/ЬС3 являются специфичными к ССЬ20 человека относительно других хемокинов.
Пример 7. Перекрестная реактивность гуманизированных МАЬ против ССЬ20 человека к видовым ортологам
Затем авторы настоящего изобретения определяли перекрестную реактивность МАЬ НС2/ЬС3 и НС2/ЬК3 к ССЬ20 из других видов. Выравнивание аминокислотных последовательностей среди ортологов ССЬ20 (полученных с использованием инструмента для выравнивания 8ΙΜ для белковых последовательностей (8\νί55 ШкйШе оГ ВютГогтайск)) указывает на то, что идентичность между ССЬ20 яванского макака/макака-резус и ССЬ20 человека составляет 86%, в то время как гомология между ССЬ20 мыши и человека составляет 64% (фиг. 14; ССЬ20 человека - 8ЕО ГО N0: 85; ССЬ20 макака-резус - 8ЕО ГО N0: 86; ССЬ20 яванского макака - 8ЕО ГО N0: 87; неполный ССЬ20 мыши - 8ЕО ГО N0: 88 (полная аминокислотная последовательность ССЬ20 мыши может быть найдена в 8Е0 ГО N0: 102; остатки 1-27 составляют сигнальную последовательность; см. табл. 18)).
Для исследования того, могут ли химерные и гуманизированные антитела связываться с ортологами ССЬ20 мыши, яванского макака или макака-резус авторы настоящего изобретения использовали анализы
- 53 029419
ЕЫ§А, как проиллюстрировано на фиг. 15. Слитые белки рекомбинантная секретируемая щелочная фосфатаза (8ЕАР)-хемокин конструировали, как описано в примере 2, экспрессировали и очищали для всех исследованных ортологов ССБ20. Черные планшеты с плоским дном Νιιικ Мах18огЬ покрывали антителом против плацентарной щелочной фосфатазы в концентрации 1 мкг/мл (Р1егсе, каталожный номер # МА1-19354) в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,4, в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали с использованием 1Х фосфатно-солевого буфера с Т\уееп-20 (РВ8Т) с 5% бычьим сывороточным альбумином (В8А) в течение 2 ч при комнатной температуре. Слитые белки §ЕАР-ССЬ20 в концентрации 20 нМ подвергали серийным 5-кратным разведениям в среде Ορίί-МЕМ (1пуПгодеп). Химерные и гуманизированные (НС2/БС3 и НС2/БК3) антитела разбавляли до 1 мкг/мл в 1Х РВ8Т с 5% В8А, добавляли в планшеты, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты три раза промывали 1Х РВ8Т с 5% В8А. Конъюгат антител козы против 1дС+1дМ человека (Н+Ь) с НКР (.Тасккоп 1ттипоКекеагсЬ каталожный номер # 109-035-127) разбавляли до 80 нг/мл, добавляли в планшет и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли флуоресцентный субстрат НКР Оиап1аВ1и (Р1егсе, каталожный номер # 15169) для выявления связавшегося антитела путем измерения флуоресценции в устройстве для считывания планшетов Мо1еси1аг Эеуюек М§ (возбуждение 325 нм/испускание 420 нм).
Хотя антитело хомячка против СЬ20 мыши 2Р5-5 МАЬ связывало ССЬ20 мыши с 50% эффективной дозой (ЕС50) 64 пМ (данные не представлены), ни химерные, ни гуманизированные антитела против ССЬ20 человека не связывались на поддающемся выявлению уровне с ССЬ20 мыши или ССЬ20 крысы в условиях, описанных выше. Напротив, как химерные, так и гуманизированные антитела эффективно связывались с ССЬ20 человека, макака-резус и яванского макака (фиг. 16А-С, 17А и В). Хотя ЕС50 для ССЬ20 человека и макака-резус оказались сходными (например, 62 и 101 пМ для НС2/БС3), ЕС50 для ССБ20 яванского макака составляла 340 пМ для НС2/БС3, чтобы было 5,4-кратным отличием от ССБ20 человека. Сходные результаты наблюдали для НС2/БК3. Это указывает на то, что значительно более высокая концентрация антитела требовалась для достижения того же уровня связывания с ССЬ20 яванского макака, что и для ССБ20 человека и макака-резус.
Пример 8. Анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса перекрестной реактивности гуманизированных МАЬ против ССЬ20 в отношении видовых ортологов ССЬ20
Также авторы использовали анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге™) для исследования того, могут ли НС2/БС3 и НС2/БК3 связываться с ортологами ССЬ20 мыши, яванского макака или макака-резус. Моноклональное антитело мыши против плацентарной щелочной фосфатазы человека иммобилизовывали на всех четырех проточных ячейках чипа СМ5 со скоростью потока 25 мкл/мин. 25 мкл 2 нМ раствора ССБ20 человека-8ЕАР, ССБ20 макака-резус-8ЕАР, ССБ20 яванского макака-8ЕАР, или ССЬ20 мыши-§ЕАР мыши в буфере НВ8-ЕР инжектировали над проточной ячейкой 2, 3 или 4. Для связывания антитела 240 мкл разведений 0-80 нМ МАЬ НС2/БС3, НС2/БК3 или 2Р5-5 в буфере НВ8-ЕР (или буфере отдельно) инжектировали над всеми четырьмя проточными ячейками со скоростью потока 50 мкл/мин. Затем следовала диссоциация в течение 45 мин. Проточную ячейку 1 (антитело против §ЕАР отдельно) использовали в качестве эталона для всех проточных ячеек. Регенерацию проточных ячеек проводили с помощью 10 мМ глицина при рН 2,25. Вследствие эффектов регенерации на способность чипов к иммобилизации, проводили инжекции антител последовательно от низкой до высокой концентрации. Аппроксимацию данных проводили с использованием модели Ленгмюра 1:1. в описанных выше условиях антитело хомячка против ССЬ20 мыши 2Р5-5 связывало ССЬ20 мыши с (бивалентной) Кс 4,9 пМ, но по существу не связывало ССЬ20 человека, макака-резус или яванского макака. Напротив химерное антитело, антитело НС2/БС3 и антитело НС2/БК3 эффективно связывались с ССЬ20 человека, макака-резус и яванского макака (табл. 17).
Измеренные кажущиеся величины аффинности были более высокими в этом анализе, чем ранее было выявлено в примере 5 (например, 4,7 пМ для НС2/БС3 в настоящем анализе против 44 пМ в табл. 3) вследствие бивалентного (более высокая аффинность) характера используемого формата анализа (против одновалентного анализа, используемого для данных, представленных в табл. 15). Величины Кс для ССЬ20 макака-резус и яванского макака были, главным образом, более высокими (в 3 раза), чем для ССЬ20 человека, что указывает на то, что антитела более специфично связывались с ССЬ20 человека. Однако, в противоположность данным ЕЬРЗА из примера 7, авторы настоящего изобретения не выявили значимых отличий между аффинностью связывания в отношении ССЬ20 макака-резус и яванского макака.
- 54 029419
Таблица 17. Оценка связывания гуманизированного моноклонального антитела против ССЬ20 с . ортологами ССЬ20 посредством Вха^ге™
Антитело Лиганд А (х105 М-1с-1) кц (х1СГ5 с® Кп (пМ)
Химерный НССЛ20 29 2,08 7,16
клон ГССЛ20 29, 4 1,78 6, 05
36Г7С10а сССЪ20 38,3 5, 04 13,2
НС2/ЛСЗ НССЛ20 56, 9 2, 68 4,71
ГССЛ20 41,3 7,51 18,2
сССЪ20 86, 4 13,4 15, 5
НС2/ЛКЗ НССЛ20 28,8 3,39 11,8
ГССЛ20 26,3 8,21 31,2
сССЪ20 52,8 14,9 28,3
Антитело НССЛ20 Отсутствие Отсутствие Отсутствие
хомячка связывания связывания связывания
против ГССЛ20 Отсутствие Отсутствие Отсутствие
антитела связывания связывания связывания
мыши 2Г5- сССЪ20 Отсутствие Отсутствие Отсутствие
5Ь связывания связывания связывания
шССЪ20 9, 63 0,474 4,92
а: Ранее показано, что не связывает тССЬ20
Ь: Данные для антитела хомячка против антитела мыши, полученные ранее на другом чипе
Пример 9. Картирование эпитопов для антитела мыши против ССЬ20 человека, клон 36Е7С10
Для определения эпитопа(ов) ССЬ20 человека, с которым связывается моноклональное антитело мыши против ССЬ20 человека 36Е7С10, авторы настоящего изобретения использовали способ замены водород/дейтерий, в котором связывание антитело защищает, и, таким образом, предотвращает дейтерирование эпитопа. Как показано на фиг. 18 А, авторы настоящего изобретения выявили очень сильные отклонения вблизи Оконца ССЬ20 человека в остатках 7-9, 10-19 и 20-22, возможно соответствующих эпитопу(ам). Также частичную защиту наблюдали вблизи С-конца в остатках 39-55, 56-67 и 61-70. Эти сегменты могут быть периферическими для эпитопа, или их конформационные флуктуации могут быть конъюгированы с эпитопом. Уровень дейтерирования каждой указанной аминокислоты показан в четыре момента времени: сверху вниз 150, 500, 1500 и 5000 с.
Области, идентифицированные в качестве эпитопа для 36Е7С10, находятся в ^концевой области и области петли ССЬ20, о которых известно, что они являются критическими для связывания и передачи сигнала ССК6 (Майк е1 а1., Ас!а Сгуз! Е62:631-634 (2006)) (фиг. 18В). Ожидается, что химерные и гуманизированные антитела, происходящие из 36Е7С10, особенно антитела с теми же аминокислотными последовательностями СЭК1, С1)К2 и С1)К3 тяжелой и легкой цепи, что и у 36Е7С10, или сходными аминокислотными последовательностями СЭК1, СГЖ2 и СЭК3 тяжелой и легкой цепи с 36Е7С10 (например, с менее чем 3, 2 или 1 аминокислотными заменами по сравнению с СЭК 36Е7С10) будут связываться с одним и тем же эпитопом. Идентификация этого эпитопа, таким образом, может объяснить способность МАЬ 36Е7С10 и химерных и гуманизированных антител, происходящих из них, нейтрализовывать активность ССЬ20.
Пример 10. Анализ хемотаксиса ΐη νΐνο для гуманизированных антител против ССЬ20 человека
Для исследования того, могут ли НС2/ЙС3 и НС2/ЙК3 ингибировать индуцируемый ССЬ20 хемотаксис ΐη νΐνο, авторы настоящего изобретения воспользовались тем фактом, что ССЬ20 человека может взаимодействовать с ССК6 мыши (ЗЕр ГО N0: 106) для индукции хемотаксиса Т-клеток мыши (фиг. 19). Авторы настоящего изобретения использовали гибридную систему ΐη νΐνο, измеряющую миграцию Тклеток мыши в направлении внутрикожно инъецированного ССЕ20 человека (фиг. 20).
Рекомбинантный ССЕ20 человека (10 нг/мышь) и носитель внутрикожно инъецировали в побритую кожу на правом и левом боках соответственно, спины исследуемых мышей (группы η=3). Затем Т-клетки селезенки мыши (5х106 клеток/мышь), меченные Са1сет-АМ, переносили внутривенно в хвостовую вену с одновременной инъекцией указанных антител в хвостовую вену в дозировках, описанных на фиг. 20. Через один час флуоресцентно-положительные клетки подсчитывали с использованием стереоскопического микроскопа в области внутрикожных инъекций.
Как НС2ГОК3, так и НС2ГОС3, значительно ингибировали миграцию клеток в области инъекции ССЕ20 на уровне, сравнимом с уровнем родительского антитела мыши 36Е7С10 и его химерной формы. Поскольку хемотаксис Т-клеток является ключевой стадией в воспалительном каскаде, предупреждение этой миграции имеет клиническое значение для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Пример 11. Эффект МАЬ 2Е5-5 на индуцируемый коллагеном типа II артрит
Для дальнейшей оценки применения антител против ССЕ20 для терапевтических целей, авторы настоящего изобретения провели дальнейшие исследования ΐη νΐνο на мышах с использованием МАЬ хомяка против антител мыши 2Е5-5. Сначала авторы настоящего изобретения оценивали способность 2Е5-5 нейтрализовывать опосредуемый ССЕ20 хемотаксис у мышей С1А (модель ревматоидного артрита на животных). С1А индуцировали, по существу, как описано в примере 1. После развития артрита (показатель артрита 1-3), мышей случайным образом распределяли на группы и вводили 500 мкг/мышь либо МАЬ 2Е5-5, либо контрольного 1дС-антитела. В обоих случаях антитело вводили внутривенно раз в двое суток. По сравнению с контрольным 1дС, МАЬ 2Е5-5 ингибировало дальнейшее развитие симптомов
- 55 029419
артрита (фиг. 21, 22).
Также авторы настоящего изобретения использовали рентгеновскую оценку для определения эффектов МАЬ 2Р5-5 на очаги повреждения костей, которые часто наблюдают при ревматоидном артрите. Оценку проводили, как описано в Нюне еί а1., АдеШк АсЕопк 39: 187-194 (1993). В кратком изложении, каждую конечность мыши с СА ранжировали по шкале от 0 до 3, исходя из тяжести остеопороза (0), эрозии кости (Е) и разрастания кости (Л) в соответствии с рентгеновскими изображениями. Используемая шкала представляла собой: 0, нет изменений; 1, небольшое изменение: 2, умеренное изменение; и 3, тяжелое изменение. Показатели для каждого фактора добавляли для разработки совокупного рентгеновского показателя для очагов повреждения кости. Мыши, которым вводили МАЬ 2Р5-5, продемонстрировали значительно менее тяжелые рентгеновские показатели на 39 сутки по сравнению с мышами, которым вводили контрольный ^С (фиг. 23, 24).
Авторы настоящего изобретения подтвердили эффект МАЬ 2Р5-5 на патологию кости путем анализа нескольких биомаркеров с использованием ЕЫ8А. Мышей с СА иммунизировали и вводили 500 мкг 2Р5-5 или контрольного ^С-антитела, как описано выше. Образцы плазмы получали от мышей на 11 или 12 сутки после второй иммунизации. Маркер разрушения хряща, олигомерный матриксный белок хряща (СОМР) в сыворотке, количественно определяли использованием набора для ферментного иммуноанализа ЕЫ8А СОМР животных (АпаМаг МеШса1) в соответствии с инструкциями изготовителя (включенными в настоящее описание в качестве ссылки), за исключением того, что образцы плазмы животных разбавляли 1:20. Поскольку СОМР предварительно нанесен на планшет, то анализ представляет собой конкурентный ЕЫ8А, в котором добавление стандарта СОМР или содержащей СОМР плазмы приводит к снижению 0Ό450 (фиг. 25 А). Исходные данные анализа образцов представлены на фиг. 25В и 25С. Уровни СОМР в сыворотке мышей СА снижались практически до нормальных уровней путем обработки МАЬ 2Р5-5 (фиг. 26), демонстрируя способность 2Р5-5 ингибировать разрушение хряща.
Поскольку образование и дифференцировка остеокластов ответственна за связанные с КА остеопороз и эрозию, авторы настоящего изобретения измеряли уровни индукции в остеокластах молекулы активатора рецептора лиганда ядерного фактора кВ (КАИКЕ), и маркеров остеокластов, таких как активатор рецептора для ядерного фактора кВ (КАИК), устойчивая к тартрату кислая фосфатаза (ТКАР), и катепсин К, в качестве индикаторов терапии артрита. Авторы настоящего изобретения оценивали уровни экспрессии мРНК этих маркеров с помощью количественной ПЦР с использованием тотальной РНК, выделенной из гомогенизированных конечностей мышей. Конечности сначала гомогенизировали с помощью гомогенизатора после пропитывания буфером для лизиса тканей, содержащим реагент Тп/о1 (Епν^ί^οβеη, СА, США). После добавления хлороформа образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 мин при 4°С для разделения раствора на водную и органическую фазы. Водную фазу удаляли и к ней добавляли изопропанол с последующим центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин при 4°С для получения РНК в виде осадка. Осадок РНК, растворенный с помощью не содержащей РНКаз воды, использовали в наборе КNΛеаδу тт1 ^АСЕН Уа1епс1а, СА, США) для выделения РНК и обрабатывали ДНКазой для удаления любой ДНК. Комплементарную ДНК (кДНК) получали с РНК с помощью набора для реакции КТ (КНА РСК 1<ίί, ТАКАКА Вю, Щс. 8Ы§а, Япония) в соответствии с протоколом изготовителя. Количественную ПЦР в реальном времени для каждого вида кДНК проводили и сравнивали с уровнем гена домашнего хозяйства геном гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (НРКТ). В реакциях ПЦР использовали следующие наборы прямых и обратных праймеров:
КАЖЬ, 5’-САТТТССАСАССТСАССАТС-3’ (ЗЕО Ю N0: 89) и 5'-ТСС6ТТ6СТТААС6ТСАТ6Т-3' (ЗЕО Ю N0: 90);
ΚΑΝΚ, 5’-СССССТТТАСТАСАССААСС-3’ (ЗЕО Ю N0: 91) и 5'-ТТСТТССТСАСТССАССТТС-3' (ЗЕО Ю N0: 92);
ТКАР, 5’-ССТССАААССАТСАТСАССТ-3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 93) и 5’-ССТАСТААССССТССССААС-3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 94);
Катепсин К, 5 ’-САСТСТТССТССТССССТАТ-3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 95) и 5’-СССАСССААСАСАССАТАТС-3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 96); и НРКТ, 5’-САССССАСАСТТТСТТССАТ-3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 97) и 5’-ТТССССТСАТСТТАСССТТТ-3’ (ЗЕО Ю N0: 98).
Все праймеры конструировали с использованием доступного через интернет программного обеспечения Рптег 3 ^ЬИеЬеай Ы^Ше Юг ВютеШса1 КекеагсЬ, СатЬгЫде, МА, США) для избежания неспецифической амплификации РНК. Реакционные смеси с кДНК-матрицей, праймерами, урацил-ДНКгликозилазой ОпуЦгодеп, СА, США), и ^иаηί^Тесί 8УВК Сгееп РСК Маδίе^ М1х ^АСЕН Уа1епс1а, СА, США) использовали в реакции амплификации в системе ΛВI РШ8М 7700 Зециепсе ^еίесί^οη 8уδίет (АррНей В^οδуδίетδ, Рοδίе^, СА, США) . Уровни экспрессии автоматически количественно определяли с помощью программного обеспечения ΛВI РККМ 7700 Зециепсе ^еίесίο^ 8о1Еуаге.
После обработки МАЬ 2Р5-5 уровни мРНК подавлялись для всех маркеров в ткани сустава (фиг. 27А и В; представлено кратное изменение уровня экспрессии по сравнению с геном домашнего хозяйства НРКТ), обеспечивая дополнительное доказательство того, что 2Р5-5 ингибирует патологию кости т
- 56 029419
νίνο.
Пример 12. Эффекты МАЪ 2Р5-5 на индуцируемый глюкозо-6-фосфатизомеразой артрит
Авторы настоящего изобретения исследовали антиартритические эффекты введения МАЪ 2Р5-5 у мышей с индуцируемым глюкозо-фосфатизомеразой (О6Р1) артритом, другой модели на мышах для КА. Артрит индуцировали путем внутрикожной сенсибилизации рекомбинантным О8Т-О6Р1 (300 мкг/мышь), эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, и инъецировали в основание хвоста мышей ИВА/1. Через шесть суток после иммунизации О6Р1 и непосредственно перед началом опухания сустава, мышей случайным образом распределяли на группы и вводили 500 мкг/мышь либо совпадающего по изотипу антитела, либо МаЪ 2Р5-5. Тяжесть симптомов артрита в конечностях каждой мыши ранжировали, как описано выше в примере 1. Мыши, которым вводили МАЪ 2Р5-5, проявляли значимо более низкие показатели артрита, чем мыши, которым вводили совпадающие по изотипу антитела, демонстрируя, что 2Р5-5 сильно подавляет развитие артрита по сравнению с контролем (фиг. 28).
Эти данные демонстрируют эффективность введения антитела против ССЬ20 в моделях артрита ίη νίνο, и указывают на то, что применение антител против ССЬ20 может быть полезным для лечения ревматоидного артрита.
Пример 13. Эффект МАЪ 2Р5-5 на индуцируемый оксазолоном атопический дерматит
Затем авторы настоящего изобретения оценивали эффект введения 2Р5-5 МАЪ в моделях дерматита на мышах. В одной модели использовали оксазолон для индукции атопического дерматита у мышей, склонных к заболеванию (линия NС/Nда). Кожу живота мышей брили и подвергали воздействию оксазолона на 0, 5 и 8 сутки. На 13 сутки отбирали мышей, проявляющих признаки дерматита (показатель 2) и вновь иммунизировали оксазолоном. Затем мышей случайным образом распределяли на группы по шесть мышей для введения либо МАЪ 2Р5-5, либо совпадающего по изотипу контрольного 1дО-антитела (500 мкг/мышь, вводили внутривенно раз в двое суток). Авторы настоящего изобретения оценивали показатели дерматита в слепом исследовании следующим образом: каждый симптом дерматита, такой как сухость, наличие чешуек, эритема, наличие выделений/образование корки и экскориация, оценивали по шкале от 0 до 3 (0 = нет, 1 = мягкий, 2 = умеренный, 3 = тяжелый); затем эти показатели добавляли к совокупному показателю дерматита (как описано в Ьеиид е( а1., ί. А11егду СПп. 1ттиио1. 85 (5):927-933 (1990)). Авторы настоящего изобретения сравнили степень подавления заболевания между двумя группами путем количественного определения площади под кривой ("АИС") с 13 суток по 18 сутки. В этой модели дерматита МАЪ 2Р5-5 индуцировало статистически значимое (р<0,05) подавление прогрессирования заболевания по сравнению с контрольным 1дО (фиг. 29).
Пример 14. Эффект МАЪ 2Р5-5 на индуцируемый ИОТВ аллергический контактный дерматит
Авторы настоящего изобретения исследовали эффект введения МАЪ 2Р5-5 при индуцируемом динитрофторбензолом (ИОТВ) аллергическом контактном дерматите, второй модели дерматита на мышах. Мышей подразделяли на группы по 6 мышей и сенсибилизировали путем нанесения щеткой 25 мкл раствора ИОТВ (0,4% раствор ИОТВ в смеси ацетон:оливковое масло, 4:1) на побритый живот в течение двух последовательных суток (сутки 0 и 1). В одной группе вводили МАЪ 2Р5-5, в то время как в другой группе вводили совпадающее по изотипу контрольное антитело (500 мкг/мыль внутривенно на 0, 2 и 5 сутки). На 5 сутки мышей повторно иммунизировали путем нанесения 20 мкл 0,2% раствора ИОТВ (в смеси ацетон:оливковое масло 4:1) на одну сторону уха. Толщину уха измеряли в качестве индикатора отека на 6 сутки с использованием толщиномера. Обработка с помощью 2Р5-5 МАЪ уменьшала толщину уха, указывая на успешное предупреждение развития дерматита (фиг. 30).
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок. Хотя описанное выше изобретение описано более подробно в качестве иллюстрации и примеров для простоты понимания, специалисту в данной области ввиду идей настоящего изобретения будет понятно, что в него можно вносить определенные изменения и модификации без отклонения от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.
- 57 029419
Таблица 16. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для ССЬ20 и ССК6 человека и мыши
Описание Тип последовательности Последовательность (сигнальные последовательности подчеркнуты) 5Е<2 Ю N0:
ССИ20 человека с сигнальной последовательностью Аминокислотная тсс£кз111аа1тзч111к1сде зеаазп£бсс1ду£бгИНрк£1 чд££гд1апедсб1паИ£Н£кк к1зчсапркд£мчку1чг11зкк чкпт 85
Нуклеотидная а£д£дс£д£ассаадад£££дс£ сс£ддс£дс£££да£д£сад£дс £дс£ас£ссасс£с£дсддсдаа £садаадсадсаадсаас£££да с£дс£д£с££дда£асасадасс д£а££с££са£сс£ааа£££а££ д£дддс££сасасддсадс£ддс саа£дааддс£д£даса£саа£д с£а£са£с£££сасасааадааа аад££д£с£д£д£дсдсааа£сс аааасадас££ддд£дааа£а£а ££д£дсд£с£сс£сад£аааааа д£саадааса£д 101
ССИ20 человека без сигнальной Аминокислотная азп£бсс1ду£бгИНрк£1чд£ £гд1апедсб1паИ£Н£ккк1з чсапркд£мчку1чг11зккчкп т 99
последовательности Нуклеотидная дсаадсаас£££дас£дс£д£с£ £дда£асасадассд£а££с££с а£сс£ааа£££а££д£дддс££с асасддсадс£ддссаа£даадд с£д£даса£саа£дс£а£са£с£ ££сасасааадааааад££д£с£ д£д£дсдсааа£ссаааасадас ££ддд£дааа£а£а££д£дсд£с £сс£сад£аааааад£саадаас а£д 100
ССН2 0 мыши с сигнальной последовательностью Аминокислотная тасддкг11£1а1амч11аН1сз даеаазпубсс1зу1д£р1рзга 1чд££гдтабеасб1паИ£Н£к кгкзчсас(ркдпмчкгачп1151 гчккт 102
Нуклеотидная а£ддсс£дсдд£ддсаадсд£с£ дс£с££сс££дс£££ддса£ддд £ас£дс£ддс£сасс£с£дсадс саддсадаадсадсаадсаас£а сдас£д££дсс£с£сд£аса£ас адасдсс£с££сс££ссададс£ а££д£ддд£££сасаадасада£ ддссда£даадс££д£даса££а а£дс£а£са£с£££сасасдаад аааадаааа£с£д£д£дсдс£да £ссааадсадаас£ддд£даааа дддс£д£даасс£сс£садсс£а адад£саадаада£д 103
ССНб человека Аминокислотная тздезтп£збч£бззебу£чзчп £зуузчбзет11сз1дечгд£зг 1£чр1аузИсч£д11дп£1чч1 ££а£уккагзт£бчу11пта1ас1 И£ч1£1р£мачзНа£дамч£зп а£ск11кд£уа£п£псдт111£с 1зтбгу1а1чда£кз£г1гзг£1 ргзкИс1ччмд1зчИззз££ч £пдкуп£ддзс!чсеркуд£чзер 1гмк11т1д1е11£д£££р1т£т 1£су££1чк£1чдадпзкгНка1 гчИачч1ч£1асд1ркптч11ч £аап1дктпгзсдзек11ду£к£ ч£еч1а£1Нсс1прч1уа£1ддк £гпу£1кИкс11мсчггкукззд £зсадгузеп1згд£зе£абпбп азз££т 104
Нуклеотидная а£дадсддддаа£саа£даа£££ садсда£д££££сдас£ссад£д аада££а££££д£д£сад£саа£ ас££са£а££ас£сад££да££с £дада£д££ас£д£дс£сс££дс аддадд£саддсад££с£ссадд с£а£££д£ассда££дсс£ас£с с££да£с£д£д£с£££ддсс£сс £ддддаа£а££с£дд£дд£да£с асс£££дс£££££а£аадааддс садд£с£а£дасадасд£с£а£с £с££дааса£ддсса££дсадас а£сс£с£££д££с££ас£с£ссс а££с£дддсад£дад£са£дсса ссдд£дсд£ддд££££садсаа£ дссасд£дсаад££дс£аааадд са£с£а£дсса£саас£££аас£ дсддда£дс£дс£сс£дас££дс а££адса£ддассдд£аса£сдс са££д£асаддсдас£аад£са£ £ссддс£ссда£ссадаасас£а ссдсдсадсаааа£са£с£дсс£ £д££д£д£дддддс£д£сад£са £са£с£ссадс£саас££££д£с ££саассааааа£асаасассса аддсадсда£д£с£д£даассса ад£ассадас£д£с£сддадссс а£садд£ддаадс£дс£да£д££ 105
- 58 029419
ддддсккдадскаскскккддкк кскккакссскккдакдкксакд акаккккдккасасдкксаккдк саааассккддкдсаадсксада аккскааааддсасааадссакс сдкдкааксакадскдкддкдск кдкдкккскддсккдксадаккс сксакаасакддксскдсккдкд асддскдсааакккдддкаааак даассдаксскдссададсдааа адскааккддскакасдааааск дксасадаадксскддсккксск дсаскдскдсскдаассскдкдс кскасдсккккаккдддсадаад кксадаааскаскккскдаадак сккдааддасскдкддкдкдкда дааддаадкасаадкссксаддс кксксскдкдссдддаддкаскс адаааасаккксксддсадасса дкдадассдсадакаасдасаак дсдксдксскксаскакд
ССКб мыши Аминокислотная тпзкезу£дк00ус1пкеуу51рр 0Ндрсз1еелгп£ккл£лр1ауз Исл£д11дп1тллтк£а£укка гзткс1лу11пта1кс111£л1к1р £малккакпкмл£з0а1ск1ткд к у а νη £пс дт! 11 а с ί зтс1 г у ί а 1лдаккз£глгзгк1к]азкл1сл алм£151115зрк£1£пккуе1д 0гск/сергуг5лзер1кмк11дт д1е1££д££кр11ктл£су1£И кк1ν^а^ηзк^к^^а^^νν^аνν1 л£1асд1рЬптл11лкалпкдкл дгзсзкекл1аукгплаел1а£1 Нсс1прл1уа£1ддк£гпу£тк1 тксклл7стггкпктрд£1саглуз езу1згдкзеклеп0пазз£кт 106
Нуклеотидная акдааккссасададксскаскк кддаасддакдаккакдасааса сададкаккаккскаккссксса дассакдддссакдскссскада ададдксадаааскксассаадд какккдкдссааккдсскасксс ккаакакдкдкскккддссксск дддсаасаккакддкддкдакда сскккдссккскасаадааадсс адакссакдаскдасдкскасск дккдаасакддссаксасадаса каскскккдкссксассскассд ккскдддсадккасксакдссас саасасккдддкккксадсдакд саскдкдкаааскдакдаааддс асакакдсддксааскккааскд кдддакдскдсксскддсскдка ксадсакддассддкасаккдсс аксдкссаддсаассаааксккк ссдддкасдскссадаасаскда сдсасадкааддксакскдкдкд дсадкдкддкксакскссаксак саксксаадссскасакккакск ксаасаадааакасдадскдсад даксдкдакдкскдкдадссасд дкасаддкскдксксададссса ксасдкддаадскдскдддкакд ддаскддадскдккскккдддкк скксасссскккдскдкккакдд кдккскдскакскдкксаккакс аадассккддкдсаддсссадаа скссаададдсасададсааксс дадксдкдаксдскдкддккскс дкдкксскддсккдксадакссс ксасаасакддксскссксдкда скдсддксаасасдддсааадкд ддссддадскдсадсассдадаа адкссксдсскасассаддаасд кддссдаддксскддсккксскд саккдскдссксаассссдкдкк дкакдсдкккаккддасадааак ксадаааскаскксакдаадакс акдааддакдкдкддкдкакдад ааддаадаакаадакдсскддск ксскскдкдсссдддкккасксд дааадскасакскссаддсадас садкдадассдксдаааакдака акдсаксдксскккассакд 107
- 59 029419
Таблица 19. Идентификационный номер последовательности
1 НС2 Полноразмерная Аминокислотная
2 НСЗ тяжелая цепь (НС) последовательность
3 36ΗΚΚ3
4 42НКК1
5 42НКК2
6 42НККЗ
7 ЪСЗ Полноразмерная легкая
8 ЬКЗ цепь (ЬС)
9 НС2 Вариабельный домен
10 НСЗ тяжелой цепи (УН)
11 36ΗΚΚ3
12 42НКК1
13 42НКК2
14 42НККЗ
15 ЪСЗ Вариабельный домен
16 ЪКЗ легкой цепи УЬ)
17 НС2 Полноразмерная Нуклеотидная
18 НСЗ тяжелая цепь (НС) последовательность
19 36ΗΚΚ3
20 42НКК1
21 42НКК2
22 42НККЗ
23 ЪСЗ Полноразмерная легкая
24 ЪКЗ цепь (ЬС)
25 НС2 Вариабельный домен
26 НСЗ тяжелой цепи (УН)
27 36ΗΚΚ3
28 42НКК1
29 42НКК2
30 42НККЗ
31 ЪСЗ Полноразмерная легкая
32 ЪКЗ цепь (ЬС)
33 36В7С10 Сигнальная последовательность тяжелой цепи Аминокислотная последовательность
34 Сигнальная последовательность легкой цепи
35 40-1С10В9 Сигнальная последовательность тяжелой цепи
36 Сигнальная последовательность легкой цепи
37 4265В10 Сигнальная последовательность тяжелой цепи
38 Сигнальная последовательность легкой цепи
39 36В7С10 УН
40 УЬ
41 40-1С10В9 УН
42 УЬ
43 4265В10 УН
44 УЬ
45 36В7С10 Сигнальная последовательность тяжелой цепи Нуклеотидная последовательность
46 Сигнальная последовательность легкой цепи
47 40-1С10В9 Сигнальная последовательность
- 60 029419
48 тяжелой цепи Сигнальная последовательность легкой цепи
49 50 4265В10 Сигнальная последовательность тяжелой цепи Сигнальная последовательность легкой цепи
51 52 36Е7С10 УН УЬ
53 54 40-1С10В9 УН УЬ
55 56 4265В10 УН УЬ
57 Последовательность эмбрионального типа 16НУ1-46*03
58 Последовательность эмбрионального типа ИН4
59 Последовательность эмбрионального типа 16КУЮ-39*01
60 36В7С10 МЫШИ НС2 НСЗ 36ΗΚΚ3 Н-СОН1 (КаЬаб) ΝΥΜΜΗ
61 42С5В10 МЕТТТТИ 42НКК1 42НКК2 42НККЗ 3ΥΜΜΗ
62 1СНУ146*03/ АВМ67212 3ΥΥΜΗ
63 36В7С10 мыши НСЗ 36ΗΚΚ3 Н-СОН2 (КаЬаб) νΐΟΡ3Ο3ΥΤΤΥΝ<2ΚΕΚσ
64 НС2 УЮРЗОЗУТТУАОКЕОС
65 4265В10 МЕТШИ 42НКК1 42НКК2 42НККЗ ЬIϋΡ3 ϋΚΥΤΝΥΝΟΚΡΚσ
66 1СНУ146*03/ АВМ67212 11ЫРЗССЗТЗУА<2КР<2С
67 36В7С10 мыши НС2 НСЗ 36ΗΚΚ3 Н-СОНЗ (КаЬаб или СНобЫа) σΝΥσνϋΥΑΜϋΥ
68 4265В10 мыши 42НКК1 42НКК2 42НККЗ σΝΥσνϋΥσΜϋΥ
69 АВМ67212 есосуюароу
70 36В7С10 мыши ЬКЗ Ь-СОК1 (КаЬаб или СНобЫа) 6Α3ΕΝΙΥ6ΑΗΝ
71 ЬСЗ ΗΑ3ΕΝΙΥ6ΑΗΝ
72 ισκνίϋ39*01/ ВАН04867.1 ΚΑ3Ω3Ι33ΥΗΝ
73 36В7С10 МЕТШИ ЬСЗ ЬКЗ Ь-СОК2 (КаЬаб или СНобЫа) 6ΑΤΝΗΑ0
74 ισκνίϋ39*01/ ВАН04867.1 ААЗЗЬОЗ
75 36В7С10 мыши ЬСЗ ЬКЗ Ь-СОКЗ (КаЬаО или СНоОЫа) ОЫУЫТРУТ
76 ВАН04867.1 003Υ3ΤΡΥΤ
77 36В7С10 мыши НС2 НСЗ 36ΗΚΚ3 Н-СОК1 (СНоОЫа) 6ΥΤΕΤΝΥ
78 4265В10 мыши 42НКК1 42НКК2 42НККЗ 1СНУ146*03/ АВМ67212 6ΥΤΕΤ3Υ
79 36В7С10 мыши НС2 НСЗ 36ΗΚΚ3 Н-СОК2 (СНоОЫа) УЮРЗОЗУТТ
80 4265В10 мыши 42НКК1 42НКК2 42НККЗ ΗΙΌΡ3ϋΚΥΤΝ
81 1СНУ146*03/ АВМ67212 НЫРЗССЗТЗ
82 АВМ67212 УН
83 ВАН04867.1 УЬ
84 Аминокислотная последовательность варианта ССИ20
- 61
029419
человека (без сигнальной последовательности)
85 Аминокислотная последовательность ССЬ20 человека (с сигнальной последовательностью)
86 Аминокислотная последовательность ССЬ20 макака-резус
87 Аминокислотная последовательность ССЬ20 яванского макака
88 Аминокислотная последовательность ССЬ20 мыши (неполная)
89 5'-САТТТССАСАССТСАССАТС-3' КАМКЬ Праймеры
90 5'-ТСССТТССТТААССТСАТСТ-3'
91 5'-СССССТТТАСТАСАССААСС-3' ΚΑΝΚ
92 5'-ТТСТТССТСАСТССАССТТС-3'
93 5'-ССТССАААССАТСАТСАССТ-3' ТКАР
94 5'-ССТАСТААССССТССССААС-3'
95 5'-САСТСТТССТССТССССТАТ-3' Катепсин К
96 5'-СССАСССААСАСАССАТАТС-3'
97 5'-САССССАСАСТТТСТТССАТ-3' НРКТ
98 5' -ТТССССТСАТСТТАСССТТТ-3'
99 Аминокислотная последовательность ССЬ20 человека (без сигнальной последовательности)
100 Нуклеотидная последовательность ССЬ20 человека (без сигнальной последовательности)
101 Нуклеотидная последовательность ССЬ20 человека (с сигнальной последовательностью)
102 Аминокислотная последовательность ССЪ20 мыши (с сигнальной последовательностью)
103 Нуклеотидная последовательность ССЪ20 мыши (с сигнальной последовательностью)
104 Аминокислотная последовательность ССКб человека
105 Нуклеотидная последовательность ССКб человека
106 Аминокислотная последовательность ССК6 мыши
107 Нуклеотидная последовательность ССК6 мыши
108 Полноразмерная аминокислотная последовательность НС2 (без сигнальной последовательности)
109 Полноразмерная нуклеотидная последовательность НС2 (без сигнальной последовательности)
110 Полноразмерная аминокислотная последовательность ЬСЗ (без сигнальной последовательности)
111 Полноразмерная нуклеотидная последовательность ЬСЗ (без сигнальной последовательности)
112 Полноразмерная аминокислотная последовательность ЬКЗ (без сигнальной последовательности)
113 Полноразмерная нуклеотидная последовательность ЬКЗ (без сигнальной последовательности)
114 неполная аминокислотная последовательность ССЬ20
115 неполная аминокислотная последовательность ССЫб
Таблица 20. Последовательности гуманизированного антитела и антитела мыши
Аминокислотая последовательность Нуклеотидная последовательность
НС ЬС УН УЬ Η-ΟϋΚ Ь-СОК НС ЬС УН УЬ
1 2 3 1 2 3
Цепи гуманизмрованного АЬ против ССЬ20 человека НС2 1 9 К: 60 С: 77 К: 64 С: 79 К: 67 С: 67 17 25
НСЗ 2 10 К: 60 С:77 К: 63 С: 79 К: 67 С: 67 18 26
36ΗΚΚ3 3 11 К: 60 С: 77 К: 63 С: 79 К: 67 С: 67 19 27
42НКК1 4 12 К: 61 С: 78 К: 65 С: 80 К: 68 С: 68 20 28
42НКК2 5 13 К: 61 С: 78 К: 65 С: 80 К: 68 С: 68 21 29
42НККЗ 6 14 К: 61 С: 78 К: 65 С: 80 К: 68 С: 68 22 30
ЬСЗ 7 15 71 73 75 23 31
ЬКЗ 8 16 70 73 75 24 32
АЬ мыши против ССЬ20 человека 36В7С10
39 40 К: 60 С: 77 К: 63 С: 79 К: 67 С: 67 70 73 75 51 52
40-1С10В9 41 42 53 54
4265В10 43 44 К: 61 С: 78 К: 65 С: 80 К: 68 С: 68 55 56
- 62 029419
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ΙΜΑΙ, ΤΟ3ΗΙΟ КЫЫЕ, ΒΚΑΌ ΚΑΜΑΝΟ, ТЕТЕЙ ΟΚΑ33Ο, ьитс1 3ΑΚΑΜΟΤΟ, ΥΟ3ΗΙΜΑ3Α БР1БЕЬ, ЛАКЕБ ΝΙΕΗΙΜϋΚΑ, ΜΙΥυΚΙ ΜϋΚΜΟΤΟ, ΚΕΝΖΟ ΗΟΚΙΖΟΕ, ΤΑΞΤυΟ
<120> НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ССЬ20
<130> 106806-0008-ΜΟ1
<140> РСТ/иБ2011/061525
<141> 2011-11-18
<150> 61/415,614
<151> 2010-11-19
<160> 117
<170> РаЕепЕ1п νθΓΞίοη 3.5
<210> 1
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 1 Суз 5 11е 11е Ьеи РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а ΤΗγ А1а ΤΗγ 15 О1у
Μеύ 1 О1у ΤΓρ Бег
Уа1 Ηΐ3 Бег О1п 20 Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п 25 Бег О1у А1а О1и Уа1 30 Ьуз Ьуз
Рго О1у А1а 35 Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег 40 Суз Ьуз А1а Бег О1у Τуг 45 ΤΗγ РНе
ΤΗγ Азп 50 Τу^ ΤΓρ Μеύ Ηΐ3 ΤΓρ 55 Уа1 Агд О1п А1а Рго 60 О1у О1п О1у Ьеи
О1и 65 ΤΓρ Μеύ О1у Уа1 11е 70 Азр Рго Бег Азр Бег 75 Τуг ΤΗγ ΤΗγ Τуг А1а 80
О1п Ьуз РЬе О1п О1у 85 Агд Уа1 ΤΗγ Μеύ ΤΗγ 90 Уа1 Азр ΤΗγ Бег ΤΗγ 95 Бег
ΤΗγ Уа1 Τу^ Μеύ 100 О1и Ьеи Бег Бег Ьеи 105 Агд Бег О1и Азр ΤΗγ 110 А1а Уа1
- 63 029419
Туг Туг Суз 115 А1а Агд О1у Азп Туг 120 О1у Уа1 Азр Туг А1а 125 МеЬ Азр Туг
Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у О1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп Ηΐ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
Зег Ηΐ3 О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
290 295 300
О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з О1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго
- 64 029419
355 360 365
О1п Уа1 370 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 375 Зег Агд О1и О1и МеЬ 380 ТЬг Ьуз Азп С1п
Уа1 385 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи 390 Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг 395 Рго Зег Азр 11е А1а 400
Уа1 О1и Тгр О1и Зег 405 Азп С1у С1п Рго О1и 410 Азп Азп Туг Ьуз ТЬг 415 ТЬг
Рго Рго Уа1 Ьеи 420 Азр Зег Азр С1у Зег 425 РЬе РЬе Ьеи Туг Зег 430 Ьуз Ьеи
ТЬг Уа1 Азр 435 Ьуз Зег Агд Тгр С1п 440 С1п С1у Азп Уа1 РЬе 445 Зег Суз Зег
Уа1 МеЬ 450 Нтз О1и А1а Ьеи Нтз 455 Азп Нтз Туг ТЬг С1п 460 Ьуз Зег Ьеи Зег
Ьеи Зег Рго О1у Ьуз 465
<210> 2
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 2 11е Ьеи РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а ТЬг А1а ТЬг 15 О1у
МеЬ 1 О1у Тгр Зег Суз 5 11е
Уа1 Нтз Зег С1п Уа1 20 О1п Ьеи Уа1 О1п 25 Зег О1у А1а О1и Уа1 30 Ьуз Ьуз
Рго О1у А1а 35 Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег 40 Суз Ьуз А1а Зег О1у 45 Туг ТЬг РЬе
ТЬг Азп 50 Туг Тгр МеЬ Нтз Тгр 55 Уа1 Ьуз С1п А1а Рго 60 О1у С1п О1у Ьеи
О1и 65 Тгр 11е О1у Уа1 11е 70 Азр Рго Зег Азр Зег 75 Туг ТЬг ТЬг Туг Азп 80
С1п Ьуз РЬе Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг МеЬ ТЬг Агд Азр ТЬг Зег ТЬг Зег
85 90 95
- 65 029419
ТЬг Уа1 Туг МеЬ 100 О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд 105 Зег О1и Азр ТЬг 110 А1а Уа1
Туг Туг Суз ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЬ Азр Туг
115 120 125
Тгр О1у О1п О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у О1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп Ηΐ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
Зег Ηΐ3 О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
290 295 300
О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з О1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
- 66 029419
340 345 350
Рго 11е О1и 355 Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз 360 А1а Ьуз О1у О1п Рго 365 Агд О1и Рго
О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п
370 375 380
ναι Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а
385 390 395 400
ναι О1и Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п С1у Азп Уа1 РЬе Бег Суз Бег
435 440 445
ναι МеЬ Ηΐ3 О1и А1а Ьеи Η18 Азп Нтз Туг ТЬг О1п Ьуз Бег Ьеи Бег
450 455 460
Ьеи Бег Рго О1у Ьуз
465
<210> 3
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 3
МеЬ 1 Азр Тгр ТЬг Тгр 5 Агд 11е Ьеи РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а А1а А1а ТЬг 15 О1у
А1а Нтз Бег о1п να1 О1п Ьеи Уа1 О1п Бег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз
20 25 30
Рго О1у А1а Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе
35 40 45
ТЬг Азп Туг Тгр МеЬ Нтз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи
50 55 60
О1и Тгр МеЬ О1у Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг Туг Азп
65 70 75 80
- 67 029419
О1п Ьуз РЬе Ьуз О1у 85 Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг 90 Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг 95 Зег
ТЬг А1а Туг МеЬ О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЬ Азр Туг
115 120 125
Тгр О1у Ο1η О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у О1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Нтз ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи Ο1η Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп Ηΐ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
Зег Ηΐ3 О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
290 295 300
О1и Уа1 ΗΪ8 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нтз О1п Азр Тгр Ьеи
- 68 029419
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и 340 Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 345 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи 350 Рго А1а
Рго 11е О1и 355 Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз 360 А1а Ьуз О1у О1п Рго 365 Агд О1и Рго
О1п Уа1 370 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 375 Зег Агд О1и О1и МеЬ 380 ТЬг Ьуз Азп О1п
Уа1 385 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи 390 Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг 395 Рго Зег Азр 11е А1а 400
Уа1 О1и Тгр О1и Зег 405 Азп О1у О1п Рго О1и 410 Азп Азп Туг Ьуз ТЬг 415 ТЬг
Рго Рго Уа1 Ьеи 420 Азр Зег Азр О1у Зег 425 РЬе РЬе Ьеи Туг Зег 430 Ьуз Ьеи
ТЬг Уа1 Азр 435 Ьуз Зег Агд Тгр О1п 440 О1п О1у Азп Уа1 РЬе 445 Зег Суз Зег
Уа1 МеЬ 450 Нтз О1и А1а Ьеи Нтз 455 Азп Нтз Туг ТЬг О1п 460 Ьуз Зег Ьеи Зег
Ьеи Зег Рго О1у Ьуз 465
<210> 4
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 4 Тгр ТЬг Тгр 5 Агд 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 10 А1а А1а А1а ТЬг 15 О1у
МеЬ 1 Азр
А1а Нтз Зег О1п 20 Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п 25 Зег О1у А1а О1и Уа1 30 Ьуз Ьуз
Рго О1у А1а 35 Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег 40 Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг 45 ТЬг РЬе
ТЬг Зег Туг Тгр МеЬ Нтз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи
50 55 60
- 69 029419
О1и 65 ΤΓρ Μеύ О1у Ьеи 11е 70 Αзρ Рго Бег Αзρ Ьуз 75 Τ/γ ΤΗγ Азп ΤγΓ Азп 80
О1п Ьуз РНе Ьуз О1у Агд Уа1 ΤΗγ Μеύ ΤΗγ Агд Αзρ ΤΗγ Бег ΤΗγ Бег
85 90 95
ΤΗγ Уа1 Τ/γ Μеύ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Αзρ ΤΗγ А1а Уа1
100 105 110
Τ/γ Τ/γ Суз А1а Агд О1у Азп Τ/γ О1у Уа1 Αзρ Τ/γ О1у Μеύ Αзρ Τ/γ
115 120 125
ΤΓρ О1у О1п О1у ΤΗγ Ьеи Уа1 ΤΗγ Уа1 Бег Бег А1а Бег ΤΗγ Ьуз О1у
130 135 140
Рго Бег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Бег Бег Ьуз Бег ΤΗγ Бег О1у О1у
145 150 155 160
ΤΗγ А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Αзρ Τ/γ РНе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ΤΗγ Уа1 Бег ΤΓρ Азп Бег О1у А1а Ьеи ΤΗγ Бег О1у Уа1 И1з ΤΗγ РНе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Бег Бег О1у Ьеи Τ/γ Бег Ьеи Бег Бег Уа1 Уа1
195 200 205
ΤΗγ Уа1 Рго Бег Бег Бег Ьеи О1у ΤΗγ О1п ΤΗγ Τ/γ 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп И1з Ьуз Рго Бег Азп ΤΗγ Ьуз Уа1 Αзρ Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Бег Суз Αзρ Ьуз ΤΗγ И1з ΤΗγ Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Αзρ ΤΗγ
260 265 270
Ьеи Μеύ 11е Бег Агд ΤΗγ Рго О1и Уа1 ΤΗγ Суз Уа1 Уа1 Уа1 Αзρ Уа1
275 280 285
Бег И1з О1и Αзρ Рго О1и Уа1 Ьуз РНе Азп ΤΓρ Τ/γ Уа1 Αзρ О1у Уа1
290 295 300
О1и Уа1 Итз Азп А1а Ьуз ΤΗγ Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Τ/γ Азп Бег
- 70 029419
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нйз О1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго
355 360 365
О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п
370 375 380
ναι Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а
385 390 395 400
ναι О1и Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 РЬе Бег Суз Бег
435 440 445
ναι МеЬ Ηΐ3 О1и А1а Ьеи ΗΪ8 Азп Нтз Туг ТЬг О1п Ьуз Бег Ьеи Бег
450 455 460
Ьеи Бег Рго О1у Ьуз
465
<210> 5
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 5
МеЬ Азр 1 Тгр ТЬг Тгр Агд 5 11е Ьеи РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а А1а А1а ТЬг О1у 15
А1а Нйз Бег О1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п Бег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз
20 25 30
Рго О1у А1а Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе
35 40 45
- 71 029419
ТЬг Зег 50 Туг Тгр МеЬ ΗΪ8 Тгр Уа1 55 Агд О1п А1а Рго 60 О1у О1п О1у Ьеи
О1и Тгр МеЬ О1у Ьеи 11е Азр Рго Зег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп Туг Азп
65 70 75 80
О1п Ьуз РЬе Ьуз О1у Агд Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег
85 90 95
ТЬг Уа1 Туг МеЬ О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЬ Азр Туг
115 120 125
Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у О1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Ηί.8 ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп Ηΐ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг ΗΪ8 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
Зег Ηΐ3 О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
- 72 029419
290 295 300
О1и Уа1 Ηΐ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Бег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нчз О1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго
355 360 365
О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п
370 375 380
Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а
385 390 395 400
Уа1 О1и Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 РЬе Бег Суз Бег
435 440 445
Уа1 МеЬ Ηΐ3 О1и А1а Ьеи ΗΪ8 Азп Нтз Туг ТЬг О1п Ьуз Бег Ьеи Бег
450 455 460
Ьеи Бег Рго О1у Ьуз
465
<210> 6
<211> 469
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 6
МеЬ Азр Тгр ТЬг Тгр Агд 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а А1а А1а ТЬг О1у
1 5 10 15
А1а Нтз Бег О1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п Бег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз
20 25 30
- 73 029419
Рго О1у А1а 35 Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег 40 Суз Ьуз А1а Зег О1у 45 Туг ТЬг РЬе
ТЬг Зег Туг Тгр МеЬ Н1з Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи
50 55 60
О1и Тгр МеЬ О1у Ьеи 11е Азр Рго Зег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп Туг Азп
65 70 75 80
О1п Ьуз РЬе Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег
85 90 95
ТЬг А1а Туг МеЬ О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЬ Азр Туг
115 120 125
Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у О1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
Азп Ηΐ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
245 250 255
Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
- 74 029419
275 280 285
Зег Нтз О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
290 295 300
О1и Уа1 Нтз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нтз О1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго
355 360 365
О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п
370 375 380
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а
385 390 395 400
Уа1 О1и Тгр О1и Зег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
Уа1 МеЬ Нтз О1и А1а Ьеи Нтз Азп Нтз Туг ТЬг О1п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго О1у Ьуз 465
<210> 7
<211> 233
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 7
МеЬ О1у Тгр Зег Суз 11е 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а ТЬг А1а ТЬг О1у 1 5 10 15
- 75 029419
Уа1 Ηΐ3 Бег Азр 20 11е О1п МеЬ ТЬг О1п 25 Бег Рго Бег Бег Ьеи 30 Бег А1а
Бег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Бег О1и Азп 11е
35 40 45
Туг О1у А1а Ьеи Азп Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз
50 55 60
Ьеи Ьеи 11е Туг О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр О1у Уа1 Рго Бег Агд
65 70 75 80
РЬе Бег О1у Бег О1у Бег О1у Агд О1п Туг Бег Ьеи ТЬг 11е Бег Бег
85 90 95
Ьеи О1п Рго О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п Азп Уа1 Ьеи 11е
100 105 110
ТЬг Рго Туг ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз Агд ТЬг
115 120 125
Уа1 А1а А1а Рго Бег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Бег Азр О1и О1п Ьеи
130 135 140
Ьуз Бег О1у ТЬг А1а Бег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго
145 150 155 160
Агд О1и А1а Ьуз Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи О1п Бег О1у
165 170 175
Азп Бег О1п О1и Бег Уа1 ТЬг О1и О1п Азр Бег Ьуз Азр Бег ТЬг Туг
180 185 190
Бег Ьеи Бег Бег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Бег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Няз
195 200 205
Ьуз Уа1 Туг А1а Суз О1и Уа1 ТЬг ΗΪ8 О1п О1у Ьеи Бег Бег Рго Уа1
210 215 220
ТЬг Ьуз Бег РЬе Азп Агд О1у О1и Суз
225 230
<210> 8
<211> 236
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
- 76 029419
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 8 Уа1 5 Рго А1а О1п Ьеи Ьеи 10 О1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 15 Тгр
МеЕ 1 Азр МеЕ Агд
Ьеи Агд О1у А1а Агд Суз Азр 11е О1п МеЕ ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег
20 25 30
Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз О1у А1а Зег
35 40 45
О1и Азп 11е Туг О1у А1а Ьеи Азп Тгр Туг О1п Агд Ьуз Рго О1у Ьуз
50 55 60
А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр О1у Уа1
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у Агд Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг
85 90 95
11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п Азп
100 105 110
Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго Туг ТЬг РЬе О1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е
115 120 125
Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр
130 135 140
О1и О1п Ьеи Ьуз Зег О1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд О1и А1а Ьуз Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи
165 170 175
О1п Зег О1у Азп Зег О1п О1и Зег Уа1 ТЬг О1и О1п Азр Зег Ьуз Азр
180 185 190
Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг
195 200 205
О1и Ьуз Нчз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз О1и Уа1 ТЬг Нчз О1п О1у Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд О1у О1и Суз
225 230 235
- 77 029419
<210> 9
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 9 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Зег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
О1п 1 Уа1
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр МеЕ Нтз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЕ
35 40 45
О1у Уа1 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг ТЬг Туг А1а О1п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п О1у Агд Уа1 ТЬг МеЕ ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 80
МеЕ О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЕ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 10 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Зег О1у А1а О1и Уа1 10
Зег Уа1 Ьуз Уа1 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 30 Азп Туг
Тгр МеЕ Нтз Тгр Уа1 Ьуз О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр 11е
- 78 029419
35 40 45
οΐγ ναι 11е Азр Рго Бег Азр 55 Бег Туг ТЬг ТЬг Туг Азп 60 О1п Ьуз РЬе
50
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг МеЬ ТЬг Агд Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Бег Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120
<210> 11
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 11
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр МеЬ Н1з Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЬ
35 40 45
О1у Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг Туг Азп О1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120
- 79 029419
<210> 12
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
<400> 12
Синтетический
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз
Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг
20 25
Тгр МеЬ Нтз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у
35 40
О1у Ьеи 11е Азр Рго Бег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп Туг
50 55 60
Ьуз О1у Агд Уа1 ТЬг МеЬ ТЬг Агд Азр ТЬг Бег ТЬг
65 70 75
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а
85 90
А1а Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЬ Азр
100 105
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120
Ьуз Рго О1у 15 А1а
РЬе ТЬг 30 Бег Туг
Ьеи 45 О1и Тгр МеЬ
Азп О1п Ьуз РЬе
Бег ТЬг Уа1 Туг 80
Уа1 Туг Туг 95 Суз
Туг Тгр 110 О1у О1п
<210> 13
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
Синтетический
<400> 13
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз
Бег Уа1 Ьуз Уа1 20 Бег Суз Ьуз А1а Бег 25 О1у Туг ТЬг
Тгр МеЬ Нтз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у
Ьуз Рго О1у 15 А1а
РЬе ТЬг 30 Бег Туг
Ьеи О1и Тгр МеЬ
- 80 029419
35 40 45
О1у Ьеи 50 11е Азр Рго Бег Азр 55 Ьуз Туг ТЬг Азп Туг Азп 60 О1п Ьуз РЬе
Ьуз О1у Агд Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120
<210> 14
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 14
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Бег Туг
20 25 30
Тгр МеЬ Н1з Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЬ
35 40 45
О1у Ьеи 11е Азр Рго Бег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120
- 81 029419
<210> 15
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
<400> 15
Синтетический
Азр 1 11е О1п МеЬ ТЬг 5 О1п Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25 Бег О1и Азп
Ьеи Азп Тгр 35 Туг О1п О1п Ьуз Рго 40 О1у Ьуз А1а Рго
Туг О1у 50 А1а ТЬг Азп Ьеи А1а 55 Азр О1у Уа1 Рго Бег 60
Бег 65 О1у Бег О1у Агд О1п 70 Туг Бег Ьеи ТЬг 11е 75 Бег
О1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз О1п Азп 90 Уа1 Ьеи
ТЬг РЬе О1у О1у 100 О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 105 11е Ьуз
А1а Бег Уа1 15 О1у
11е Туг 30 О1у А1а
Ьуз 45 Ьеи Ьеи 11е
Агд РЬе Бег О1у
Бег Ьеи О1п Рго 80
11е ТЬг Рго 95 Туг
<210> 16
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
Синтетический
<400> 16 МеЬ ТЬг 5 О1п Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег
Азр 1 11е О1п
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз О1у А1а 25 Бег О1и Азп
Ьеи Азп Тгр 35 Туг О1п Агд Ьуз Рго 40 О1у Ьуз А1а Рго
Туг О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр О1у Уа1 Рго Бег
А1а Бег Уа1 15 О1у
11е Туг 30 О1у А1а
Ьуз 45 Ьеи Ьеи 11е
Агд РЬе Бег О1у
- 82 029419
50 55 60
Бег О1у Бег О1у Агд Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Бег Бег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п Азп Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе О1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 17
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 17
аЬдддсЬддЬ ссЬдсаЬсаЬ ЬсЬдЬЬссЬд дЬддссасЬд сЬассддадЬ дсасадссад
дЬдсадсЬдд ЬдсадЬсЬдд ддсЬдаддЬд аадааасссд дЬдсаадЬдЬ дааддЬдЬса
ЬдЬааадсаЬ ссддсЬаЬас аЬЬсасЬаас ЬасЬддаЬдс аЬЬдддЬдад дсаддсЬсса
ддасадддас ЬддааЬддаЬ дддсдЬдаЬс дасссЬЬсад аЬЬссЬасас сасаЬаЬдсс
садаадЬЬЬс адддсадддЬ дассаЬдаса дЬддасасЬа дсассЬсЬас адЬдЬасаЬд
дадсЬдЬсса дссЬдадаад ЬдаадаЬаса дсадЬдЬасЬ аЬЬдсдсссд сддсааЬЬас
ддадЬддасЬ аЬдссаЬдда ЬЬасЬддддд садддЬасЬс ЬддЬдассдЬ дЬсЬадЬдсЬ
ЬсЬассаадд дсссаЬсддЬ сЬЬсссссЬд дсасссЬссЬ ссаададсас сЬсЬдддддс
асадсддссс ЬдддсЬдссЬ ддЬсааддас ЬасЬЬссссд аассддЬдас ддЬдЬсдЬдд
аасЬсаддсд сссЬдассад сддсдЬдсас ассЬЬсссдд сЬдЬссЬаса дЬссЬсадда
сЬсЬасЬссс ЬсадсадсдЬ ддЬдассдЬд сссЬссадса дсЬЬдддсас ссадассЬас
аЬсЬдсаасд ЬдааЬсасаа дсссадсаас ассааддЬдд асаадададЬ Ьдадсссааа
ЬсЬЬдЬдаса ааасЬсасас аЬдсссассд Ьдсссадсас сЬдаасЬссЬ ддддддассд
- 83 029419
ЕсадЕсЕЕсс ЕсЕЕсссссс аааасссаад дасасссЕса
ЕдаЕсЕсссд
дассссЕдад
дЕсасаЕдсд ЕддЕддЕдда сдЕдадссас даадасссЕд
дЕддасддсд ЕддаддЕдса ЕааЕдссаад асааадссдс
асдЕассдЕд ЕддЕсадсдЕ ссЕсассдЕс сЕдсассадд
ЕасаадЕдса аддЕсЕссаа сааадсссЕс ссадссссса
дссааадддс адссссдада ассасаддЕд ЕасасссЕдс
ассаадаасс аддЕсадссЕ дассЕдссЕд дЕсаааддсЕ
дЕддадЕддд ададсааЕдд дсадссддад аасаасЕаса
дасЕссдасд дсЕссЕЕсЕЕ ссЕсЕаЕадс аадсЕсассд
саддддаасд ЕсЕЕсЕсаЕд сЕссдЕдаЕд саЕдаддсЕс
аададссЕсЕ
сссЕдЕсЕсс
<210> 18
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полинуклеотид
<400> 18
аЕдддсЕддЕ ссЕдсаЕсаЕ ЕсЕдЕЕссЕд дЕддсаасЕд
дЕдсадсЕдд ЕдсадЕсЕдд ддсЕдаддЕд аадааасссд
ЕдсааддсаЕ ссддсЕаЕас аЕЕсасЕаас ЕасЕддаЕдс
ддасадддас ЕддааЕддаЕ сддсдЕдаЕс дасссЕЕсад
садаадЕЕЕа ааддсааддс ЕассаЕдаса адддасасЕа
дадсЕдЕсса дссЕдаддЕс сдаадаЕаса дссдЕдЕасЕ
аддЕсаадЕЕ
саасЕддЕас
дддаддадса
асЕддсЕдаа
Есдадаааас
ссссаЕсссд
ЕсЕаЕсссад
адассасдсс
Еддасаадад
Едсасаасса
дЕасаасадс
Еддсааддад
саЕсЕссааа
ддаддадаЕд
сдасаЕсдсс
ЕсссдЕдсЕд
саддЕддсад
сЕасасдсад
сдддаааЕда
Синтетический
ссассддадЕ
дЕдсаадЕдЕ
аЕЕдддЕдаа
аЕЕссЕасас
дсассЕсЕас
аЕЕдсасЕсд
дсасадссад
дааадЕдЕса
дсаддсасса
сасаЕаЕааЕ
адЕдЕасаЕд
дддсаасЕас
- 84 029419
ддадЕддасЕ аЕдсЕаЕдда ЕЕасЕддддд садддЕасЕа дЕдЕдассдЕ дЕсЕадЕдса
ЕсЕассаадд дсссаЕсддЕ сЕЕсссссЕд дсасссЕссЕ ссаададсас сЕсЕдддддс
асадсддссс ЕдддсЕдссЕ ддЕсааддас ЕасЕЕссссд аассддЕдас ддЕдЕсдЕдд
аасЕсаддсд сссЕдассад сддсдЕдсас ассЕЕсссдд сЕдЕссЕаса дЕссЕсадда
сЕсЕасЕссс ЕсадсадсдЕ ддЕдассдЕд сссЕссадса дсЕЕдддсас ссадассЕас
аЕсЕдсаасд ЕдааЕсасаа дсссадсаас ассааддЕдд асаадададЕ Едадсссааа
ЕсЕЕдЕдаса ааасЕсасас аЕдсссассд Едсссадсас сЕдаасЕссЕ ддддддассд
ЕсадЕсЕЕсс ЕсЕЕсссссс аааасссаад дасасссЕса ЕдаЕсЕсссд дассссЕдад
дЕсасаЕдсд ЕддЕддЕдда сдЕдадссас даадасссЕд аддЕсаадЕЕ саасЕддЕас
дЕддасддсд ЕддаддЕдса ЕааЕдссаад асааадссдс дддаддадса дЕасаасадс
асдЕассдЕд ЕддЕсадсдЕ ссЕсассдЕс сЕдсассадд асЕддсЕдаа Еддсааддад
ЕасаадЕдса аддЕсЕссаа сааадсссЕс ссадссссса Есдадаааас саЕсЕссааа
дссааадддс адссссдада ассасаддЕд ЕасасссЕдс ссссаЕсссд ддаддадаЕд
ассаадаасс аддЕсадссЕ дассЕдссЕд дЕсаааддсЕ ЕсЕаЕсссад сдасаЕсдсс
дЕддадЕддд ададсааЕдд дсадссддад аасаасЕаса адассасдсс ЕсссдЕдсЕд
дасЕссдасд дсЕссЕЕсЕЕ ссЕсЕаЕадс аадсЕсассд Еддасаадад саддЕддсад
саддддаасд ЕсЕЕсЕсаЕд сЕссдЕдаЕд саЕдаддсЕс Едсасаасса сЕасасдсад
аададссЕсЕ сссЕдЕсЕсс сдддаааЕда
<210> 19
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 85 029419
<400> 19
аЕддасЕдда саЕддадааЕ ссЕдЕЕссЕд дЕддссдсЕд саассддадс асасадссад
дЕдсадсЕдд ЕдсадЕсЕдд адсададдЕд аадааасссд дЕдсЕадЕдЕ дааадЕдЕса
ЕдсааддссЕ ссдддЕаЕас ЕЕЕсассаас ЕасЕддаЕдс аЕЕдддЕдад дсаддсЕсса
ддасадддас ЕддааЕддаЕ дддсдЕдаЕЕ дасссЕЕсад аЕЕссЕасас сасаЕаЕааЕ
садаадЕЕЕа ааддаааддс аасасЕдасЕ дЕддасасса дсасаЕсЕас ЕдссЕасаЕд
дадсЕдЕсса дссЕдаддЕс сдаадаЕасЕ дссдЕдЕасЕ аЕЕдЕасссд дддсаасЕас
ддадЕддасЕ аЕдсааЕдда ЕЕасЕддддд садддЕассс ЕддЕдасадЕ дЕсЕадЕдсЕ
адсассаадд дсссаЕсддЕ сЕЕсссссЕд дсасссЕссЕ ссаададсас сЕсЕдддддс
асадсддссс ЕдддсЕдссЕ ддЕсааддас ЕасЕЕссссд аассддЕдас ддЕдЕсдЕдд
аасЕсаддсд сссЕдассад сддсдЕдсас ассЕЕсссдд сЕдЕссЕаса дЕссЕсадда
сЕсЕасЕссс ЕсадсадсдЕ ддЕдассдЕд сссЕссадса дсЕЕдддсас ссадассЕас
аЕсЕдсаасд ЕдааЕсасаа дсссадсаас ассааддЕдд асаадададЕ Едадсссааа
ЕсЕЕдЕдаса ааасЕсасас аЕдсссассд Едсссадсас сЕдаасЕссЕ ддддддассд
ЕсадЕсЕЕсс ЕсЕЕсссссс аааасссаад дасасссЕса ЕдаЕсЕсссд дассссЕдад
дЕсасаЕдсд ЕддЕддЕдда сдЕдадссас даадасссЕд аддЕсаадЕЕ саасЕддЕас
дЕддасддсд ЕддаддЕдса ЕааЕдссаад асааадссдс дддаддадса дЕасаасадс
асдЕассдЕд ЕддЕсадсдЕ ссЕсассдЕс сЕдсассадд асЕддсЕдаа Еддсааддад
ЕасаадЕдса аддЕсЕссаа сааадсссЕс ссадссссса Есдадаааас саЕсЕссааа
дссааадддс адссссдада ассасаддЕд ЕасасссЕдс ссссаЕсссд ддаддадаЕд
ассаадаасс аддЕсадссЕ дассЕдссЕд дЕсаааддсЕ ЕсЕаЕсссад сдасаЕсдсс
дЕддадЕддд ададсааЕдд дсадссддад аасаасЕаса адассасдсс ЕсссдЕдсЕд
- 86 029419
дасЬссдасд дсЬссЬЬсЬЬ ссЬсЬаЬадс аадсЬсассд Ьддасаадад саддЬддсад
саддддаасд ЬсЬЬсЬсаЬд сЬссдЬдаЬд саЬдаддсЬс Ьдсасаасса сЬасасдсад
аададссЬсЬ сссЬдЬсЬсс дддЬаааЬда
<210> 20
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 20 аЬддасЬдда ссЬддсдааЬ ссЬдЬЬссЬд дЬддссдсЬд саасаддадс асасЬсасад
дЬдсадсЬдд ЬдсадЬссдд ддсададдЬд аадааасссд дЬдссадсдЬ дааддЬдЬсЬ
ЬдсааадсЬа дЬддсЬаЬас сЬЬсасаадс ЬасЬддаЬдс аЬЬдддЬдсд дсаддсасса
ддасадддас ЬддааЬддаЬ дддссЬдаЬЬ дасссЬЬсЬд аЬаадЬасас ЬаасЬасаас
садаадЬЬЬа ааддаадддЬ дасЬаЬдасс сдддасасаЬ саасЬЬссас сдЬдЬасаЬд
дадсЬдЬсса дссЬдадаЬс сдаадаЬасс дссдЬдЬасЬ аЬЬдЬдсЬсд сддсаасЬас
ддадЬддасЬ аЬддсаЬдда ЬЬасЬддддд садддЬасас ЬддЬдассдЬ дЬссадЬдсЬ
адсассаадд дсссаЬсддЬ сЬЬсссссЬд дсасссЬссЬ ссаададсас сЬсЬдддддс
асадсддссс ЬдддсЬдссЬ ддЬсааддас ЬасЬЬссссд аассддЬдас ддЬдЬсдЬдд
аасЬсаддсд сссЬдассад сддсдЬдсас ассЬЬсссдд сЬдЬссЬаса дЬссЬсадда
сЬсЬасЬссс ЬсадсадсдЬ ддЬдассдЬд сссЬссадса дсЬЬдддсас ссадассЬас
аЬсЬдсаасд ЬдааЬсасаа дсссадсаас ассааддЬдд асаадададЬ Ьдадсссааа
ЬсЬЬдЬдаса ааасЬсасас аЬдсссассд Ьдсссадсас сЬдаасЬссЬ ддддддассд
ЬсадЬсЬЬсс ЬсЬЬсссссс аааасссаад дасасссЬса ЬдаЬсЬсссд дассссЬдад
- 87 029419
дЕсасаЕдсд
дЕддасддсд
асдЕассдЕд
ЕасаадЕдса
дссааадддс
ассаадаасс
дЕддадЕддд
дасЕссдасд
саддддаасд
аададссЕсЕ
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 21 аЕддасЕдда
дЕдсадсЕдд
Едсааадсаа
ддасадддас
садаадЕЕЕа
дадсЕдЕсса
ддадЕддасЕ
ЕддЕддЕдда
ЕддаддЕдса
ЕддЕсадсдЕ
аддЕсЕссаа
адссссдада
аддЕсадссЕ
ададсааЕдд
дсЕссЕЕсЕЕ
ЕсЕЕсЕсаЕд
сдЕдадссас даадасссЕд
ЕааЕдссаад асааадссдс
ссЕсассдЕс сЕдсассадд
сааадсссЕс ссадссссса
ассасаддЕд ЕасасссЕдс
дассЕдссЕд дЕсаааддсЕ
дсадссддад аасаасЕаса
ссЕсЕаЕадс аадсЕсассд
сЕссдЕдаЕд саЕдаддсЕс
сссЕдЕсЕсс
21
1410
ДНК
Искусственная последовательность
Описание искусственной полинуклеотид
сЕЕддаддаЕ
ЕдсадЕссдд
дЕддсЕаЕас
ЕддааЕддаЕ
ааддасдсдЕ
дссЕдаддЕс
аЕддсаЕдда
аддЕсаадЕЕ
саасЕддЕас
дддаддадса
асЕддсЕдаа
Есдадаааас
ссссаЕсссд
ЕсЕаЕсссад
адассасдсс
Еддасаадад
Едсасаасса
дЕасаасадс
Еддсааддад
саЕсЕссааа
ддаддадаЕд
сдасаЕсдсс
ЕсссдЕдсЕд
саддЕддсад
сЕасасдсад
дддЕаааЕда
последовательности
Синтетический
ссЕдЕЕссЕд
дЕддссдсЕд
саассддадс
ЕсасЕсасад
адсададдЕд
аадааасссд
дЕдссЕссдЕ
дааддЕдЕсЕ
сЕЕсасаадс
дддссЕдаЕЕ
дасЕсЕдасс
сдаадаЕасс
ЕЕасЕддддд
ЕасЕддаЕдс
дасссЕЕсЕд
дЕддасасаЕ
дсадЕдЕасЕ
садддЕасас
аЕЕдддЕдад
асаддсасса
аЕаадЕасас
саасЕЕссас
аЕЕдЕасасд
ЕддЕдассдЕ
саасЕасаас
сдЕдЕасаЕд
дддсаасЕас
дЕссадЕдсЕ
- 88 029419
адсассаадд дсссаЕсддЕ сЕЕсссссЕд дсасссЕссЕ ссаададсас сЕсЕдддддс
асадсддссс ЕдддсЕдссЕ ддЕсааддас ЕасЕЕссссд аассддЕдас ддЕдЕсдЕдд
аасЕсаддсд сссЕдассад сддсдЕдсас ассЕЕсссдд сЕдЕссЕаса дЕссЕсадда
сЕсЕасЕссс ЕсадсадсдЕ ддЕдассдЕд сссЕссадса дсЕЕдддсас ссадассЕас
аЕсЕдсаасд ЕдааЕсасаа дсссадсаас ассааддЕдд асаадададЕ Едадсссааа
ЕсЕЕдЕдаса ааасЕсасас аЕдсссассд Едсссадсас сЕдаасЕссЕ ддддддассд
ЕсадЕсЕЕсс ЕсЕЕсссссс аааасссаад дасасссЕса ЕдаЕсЕсссд дассссЕдад
дЕсасаЕдсд ЕддЕддЕдда сдЕдадссас даадасссЕд аддЕсаадЕЕ саасЕддЕас
дЕддасддсд ЕддаддЕдса ЕааЕдссаад асааадссдс дддаддадса дЕасаасадс
асдЕассдЕд ЕддЕсадсдЕ ссЕсассдЕс сЕдсассадд асЕддсЕдаа Еддсааддад
ЕасаадЕдса аддЕсЕссаа сааадсссЕс ссадссссса Есдадаааас саЕсЕссааа
дссааадддс адссссдада ассасаддЕд ЕасасссЕдс ссссаЕсссд ддаддадаЕд
ассаадаасс аддЕсадссЕ дассЕдссЕд дЕсаааддсЕ ЕсЕаЕсссад сдасаЕсдсс
дЕддадЕддд ададсааЕдд дсадссддад аасаасЕаса адассасдсс ЕсссдЕдсЕд
дасЕссдасд дсЕссЕЕсЕЕ ссЕсЕаЕадс аадсЕсассд Еддасаадад саддЕддсад
саддддаасд ЕсЕЕсЕсаЕд сЕссдЕдаЕд саЕдаддсЕс Едсасаасса сЕасасдсад
аададссЕсЕ сссЕдЕсЕсс дддЕаааЕда
<210> 22
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 22
аЕддасЕдда сЕЕддадааЕ ссЕдЕЕссЕд дЕддссдсЕд саассддадс ЕсасЕсасад
- 89 029419
дЬдсадсЬдд ЬдсадЬссдд адсададдЬд аадааасссд дЬдссЬссдЬ дааадЬдЬсЬ
ЬдсааддсЬа дЬддсЬаЬас сЬЬсасаадс ЬасЬддаЬдс аЬЬдддЬдад дсаддсасса
ддасадддас ЬддааЬддаЬ дддссЬдаЬЬ дасссЬЬсЬд аЬаадЬасас саасЬасаас
садаадЬЬЬа ааддаааддс аасЬсЬдасс дЬддасасаЬ саасЬЬссас сдссЬасаЬд
дадсЬдЬсса дссЬдаддЬс сдаадаЬасс дссдЬдЬасЬ аЬЬдЬасасд дддсаасЬас
ддадЬддасЬ аЬддсаЬдда ЬЬасЬддддд садддЬасас ЬддЬдассдЬ дЬссадЬдсЬ
адсассаадд дсссаЬсддЬ сЬЬсссссЬд дсасссЬссЬ ссаададсас сЬсЬдддддс
асадсддссс ЬдддсЬдссЬ ддЬсааддас ЬасЬЬссссд аассддЬдас ддЬдЬсдЬдд
аасЬсаддсд сссЬдассад сддсдЬдсас ассЬЬсссдд сЬдЬссЬаса дЬссЬсадда
сЬсЬасЬссс ЬсадсадсдЬ ддЬдассдЬд сссЬссадса дсЬЬдддсас ссадассЬас
аЬсЬдсаасд ЬдааЬсасаа дсссадсаас ассааддЬдд асаадададЬ Ьдадсссааа
ЬсЬЬдЬдаса ааасЬсасас аЬдсссассд Ьдсссадсас сЬдаасЬссЬ ддддддассд
ЬсадЬсЬЬсс ЬсЬЬсссссс аааасссаад дасасссЬса ЬдаЬсЬсссд дассссЬдад
дЬсасаЬдсд ЬддЬддЬдда сдЬдадссас даадасссЬд аддЬсаадЬЬ саасЬддЬас
дЬддасддсд ЬддаддЬдса ЬааЬдссаад асааадссдс дддаддадса дЬасаасадс
асдЬассдЬд ЬддЬсадсдЬ ссЬсассдЬс сЬдсассадд асЬддсЬдаа Ьддсааддад
ЬасаадЬдса аддЬсЬссаа сааадсссЬс ссадссссса Ьсдадаааас саЬсЬссааа
дссааадддс адссссдада ассасаддЬд ЬасасссЬдс ссссаЬсссд ддаддадаЬд
ассаадаасс аддЬсадссЬ дассЬдссЬд дЬсаааддсЬ ЬсЬаЬсссад сдасаЬсдсс
дЬддадЬддд ададсааЬдд дсадссддад аасаасЬаса адассасдсс ЬсссдЬдсЬд
дасЬссдасд дсЬссЬЬсЬЬ ссЬсЬаЬадс аадсЬсассд Ьддасаадад саддЬддсад
- 90 029419
саддддаасд ЕсЕЕсЕсаЕд сЕссдЕдаЕд саЕдаддсЕс Едсасаасса сЕасасдсад
аададссЕсЕ сссЕдЕсЕсс дддЕаааЕда
<210> 23
<211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 23
аЕдддсЕддЕ ссЕдсаЕсаЕ ЕсЕдЕЕссЕд дЕддсаассд ссасаддадЕ дсасадсдас
аЕссадаЕда сссадЕсЕсс аЕссадссЕд адЕдссЕсад ЕдддсдаЕад ддЕдасЕаЕс
ассЕдЕсддд ссадсдадаа саЕсЕасддс дсЕсЕдааЕЕ ддЕаЕсадса даадссадда
ааадсЕссса адсЕдсЕдаЕ сЕасддддсЕ асааассЕдд садасддЕдЕ дсссадЕсда
ЕЕсЕссддЕа дсддсЕсЕдд асдасадЕаЕ ЕсасЕдасЕа ЕсЕсЕадЕсЕ дсадссЕдаа
даЕЕЕсдсса сЕЕасЕаЕЕд ссадааЕдЕд сЕдаЕЕасЕс саЕаЕассЕЕ Еддсддаддд
асаааасЕдд адаЕсаадад аасЕдЕддсс дсЕсссадЕд ЕдЕЕсаЕЕЕЕ ЕсссссЕЕса
дасдаасадс ЕдаааЕсадд дассдсЕЕсс дЕддЕдЕдЕс ЕдсЕдаасаа ЕЕЕсЕасссЕ
сдсдаддсаа аадЕдсадЕд дааддЕддаЕ аасдсссЕдс ададЕддсаа ЕЕсасаддад
ЕссдЕдассд аасаддасад сааадаЕЕсЕ асаЕаЕадЕс ЕдЕсаЕссас ссЕдасасЕд
адсааддсЕд аЕЕасдадаа дсасааадЕд ЕаЕдсаЕдсд аадЕдасЕса ЕсаддддсЕд
адсЕсЕсссд ЕдассаадЕс ЕЕЕЕаассдд ддЕдааЕдЕЕ да
<210> 24
<211> 711
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 91 029419
полинуклеотид
<400> 24
аЕддасаЕда дддЕдссЕдс ЕсадсЕдсЕд ддасЕдсЕдс ЕдсЕдЕддсЕ даддддадса
сдаЕдсдаса ЕссадаЕдас Есададссса ЕссадссЕдЕ садссЕссдЕ дддсдасадд
дЕдассаЕса саЕдЕддадс аЕссдадаас аЕсЕасдддд сссЕдааЕЕд дЕаЕсададд
аадсссддса аадсЕссЕаа дсЕдсЕдаЕс ЕасддЕдсса сааассЕддс ЕдаЕддсдЕд
сссЕссадаЕ ЕсадсддсЕс ЕддаадЕддд сдсдасЕаЕа сЕсЕдассаЕ ЕЕсЕадЕсЕд
садссададд аЕЕЕсдссас сЕасЕаЕЕдс садааЕдЕдс ЕдаЕсасасс сЕасасЕЕЕЕ
ддЕсадддса саааасЕдда ааЕЕаадсдЕ асддЕддсЕд сассаЕсЕдЕ сЕЕсаЕсЕЕс
ссдссаЕсЕд аЕдадсадЕЕ даааЕсЕдда асЕдссЕсЕд ЕЕдЕдЕдссЕ дсЕдааЕаас
ЕЕсЕаЕссса дададдссаа адЕасадЕдд ааддЕддаЕа асдсссЕсса аЕсдддЕаас
Есссаддада дЕдЕсасада дсаддасадс ааддасадса ссЕасадссЕ садсадсасс
сЕдасдсЕда дсааадсада сЕасдадааа сасааадЕсЕ асдссЕдсда адЕсасссаЕ
садддссЕда дсЕсдсссдЕ сасааададс ЕЕсаасаддд дададЕдЕЕд а
<210> 25
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 25
саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадааас ссддЕдсаад ЕдЕдааддЕд
ЕсаЕдЕааад саЕссддсЕа ЕасаЕЕсасЕ аасЕасЕдда ЕдсаЕЕдддЕ даддсаддсЕ
ссаддасадд дасЕддааЕд даЕдддсдЕд аЕсдасссЕЕ садаЕЕссЕа сассасаЕаЕ
дсссадаадЕ ЕЕсадддсад ддЕдассаЕд асадЕддаса сЕадсассЕс ЕасадЕдЕас
аЕддадсЕдЕ ссадссЕдад аадЕдаадаЕ асадсадЕдЕ асЕаЕЕдсдс ссдсддсааЕ
- 92 029419
ЕасддадЕдд асЕаЕдссаЕ ддаЕЕасЕдд дддсадддЕа сЕсЕддЕдас сдЕдЕсЕадЕ
<210> 26
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 26
саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадааас ссддЕдсаад ЕдЕдааадЕд
ЕсаЕдсаадд саЕссддсЕа ЕасаЕЕсасЕ аасЕасЕдда ЕдсаЕЕдддЕ даадсаддса
ссаддасадд дасЕддааЕд даЕсддсдЕд аЕсдасссЕЕ садаЕЕссЕа сассасаЕаЕ
ааЕсадаадЕ ЕЕаааддсаа ддсЕассаЕд асаадддаса сЕадсассЕс ЕасадЕдЕас
аЕддадсЕдЕ ссадссЕдад дЕссдаадаЕ асадссдЕдЕ асЕаЕЕдсас Есддддсаас
ЕасддадЕдд асЕаЕдсЕаЕ ддаЕЕасЕдд дддсадддЕа сЕадЕдЕдас сдЕдЕсЕадЕ
<210> 27
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 27
саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс Еддадсадад дЕдаадааас ссддЕдсЕад ЕдЕдааадЕд
ЕсаЕдсаадд ссЕссдддЕа ЕасЕЕЕсасс аасЕасЕдда ЕдсаЕЕдддЕ даддсаддсЕ
ссаддасадд дасЕддааЕд даЕдддсдЕд аЕЕдасссЕЕ садаЕЕссЕа сассасаЕаЕ
ааЕсадаадЕ ЕЕаааддааа ддсаасасЕд асЕдЕддаса ссадсасаЕс ЕасЕдссЕас
аЕддадсЕдЕ ссадссЕдад дЕссдаадаЕ асЕдссдЕдЕ асЕаЕЕдЕас ссддддсаас
ЕасддадЕдд асЕаЕдсааЕ ддаЕЕасЕдд дддсадддЕа сссЕддЕдас адЕдЕсЕадЕ
- 93 029419
<210> 28
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 28
саддГдсадс ГддГдсадГс сддддсадад дГдаадааас ссддГдссад сдГдааддГд
ГсГГдсааад сГадГддсГа ГассГГсаса адсГасГдда ГдсаГГдддГ дсддсаддса
ссаддасадд дасГддааГд даГдддссГд аГГдасссГГ сГдаГаадГа сасГаасГас
аассадаадГ ГГаааддаад ддГдасГаГд асссдддаса саГсаасГГс сассдГдГас
аГддадсГдГ ссадссГдад аГссдаадаГ ассдссдГдГ асГаГГдГдс Гсдсддсаас
ГасддадГдд асГаГддсаГ ддаГГасГдд дддсадддГа сасГддГдас сдГдГссадГ
<210> 29
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 29
саддГдсадс ГддГдсадГс сддадсадад дГдаадааас ссддГдссГс сдГдааддГд
ГсГГдсааад саадГддсГа ГассГГсаса адсГасГдда ГдсаГГдддГ дадасаддса
ссаддасадд дасГддааГд даГдддссГд аГГдасссГГ сГдаГаадГа сассаасГас
аассадаадГ ГГаааддасд сдГдасГсГд ассдГддаса саГсаасГГс сассдГдГас
аГддадсГдГ ссадссГдад дГссдаадаГ ассдсадГдГ асГаГГдГас асддддсаас
ГасддадГдд асГаГддсаГ ддаГГасГдд дддсадддГа сасГддГдас сдГдГссадГ
<210> 30
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 94 029419
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 30
саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс сддадсадад дЕдаадааас ссддЕдссЕс сдЕдааадЕд
ЕсЕЕдсаадд сЕадЕддсЕа ЕассЕЕсаса адсЕасЕдда ЕдсаЕЕдддЕ даддсаддса
ссаддасадд дасЕддааЕд даЕдддссЕд аЕЕдасссЕЕ сЕдаЕаадЕа сассаасЕас
аассадаадЕ ЕЕаааддааа ддсаасЕсЕд ассдЕддаса саЕсаасЕЕс сассдссЕас
аЕддадсЕдЕ ссадссЕдад дЕссдаадаЕ ассдссдЕдЕ асЕаЕЕдЕас асддддсаас
ЕасддадЕдд асЕаЕддсаЕ ддаЕЕасЕдд дддсадддЕа сасЕддЕдас сдЕдЕссадЕ
<210> 31
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 31
дасаЕссада ЕдасссадЕс ЕссаЕссадс сЕдадЕдссЕ садЕдддсда ЕадддЕдасЕ
аЕсассЕдЕс дддссадсда даасаЕсЕас ддсдсЕсЕда аЕЕддЕаЕса дсадаадсса
ддаааадсЕс ссаадсЕдсЕ даЕсЕасддд дсЕасааасс Еддсадасдд ЕдЕдсссадЕ
сдаЕЕсЕссд дЕадсддсЕс Еддасдасад ЕаЕЕсасЕда сЕаЕсЕсЕад ЕсЕдсадссЕ
даадаЕЕЕсд ссасЕЕасЕа ЕЕдссадааЕ дЕдсЕдаЕЕа сЕссаЕаЕас сЕЕЕддсдда
дддасаааас ЕддадаЕсаа д
<210> 32
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 95 029419
<400> 32
60 дасаЕссада ЕдасЕсадад сссаЕссадс сЕдЕсадссЕ ссдЕдддсда садддЕдасс
120 аЕсасаЕдЕд дадсаЕссда даасаЕсЕас ддддсссЕда аЕЕддЕаЕса даддаадссс
180 ддсааадсЕс сЕаадсЕдсЕ даЕсЕасддЕ дссасааасс ЕддсЕдаЕдд сдЕдсссЕсс
240 адаЕЕсадсд дсЕсЕддаад Едддсдсдас ЕаЕасЕсЕда ссаЕЕЕсЕад ЕсЕдсадсса
даддаЕЕЕсд ссассЕасЕа ЕЕдссадааЕ дЕдсЕдаЕса сасссЕасас ЕЕЕЕддЕсад
300
ддсасаааас ЕддаааЕЕаа д
321
<210> 33
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 33
МеЕ Агд Тгр Зег Суз 11е 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а ТЬг А1а ТЬг О1у 1 5 10 15
Уа1 Азп Зег
<210> 34
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 34
МеЕ О1у Уа1 Рго ТЬг О1п Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи ТЬг Уа1 Уа1 Уа1 1 5 10 15
Уа1 Агд Суз
<210> 35
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 96 029419
пептид
<400> 35
МеЕ О1и Тгр Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег
1 5 10
Уа1 11е А1а О1у 15
Уа1 О1п Зег
<210> 36
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 36
МеЕ О1у Уа1 Рго ТЬг О1п Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи
1 5 10
Синтетический
ТЬг Уа1 Уа1 Уа1 15
Уа1 Агд Суз
<210> 37
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 37
МеЕ Агд Тгр Зег Суз 11е 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а
1 5 10
Синтетический
ТЬг А1а ТЬг О1у 15
Уа1 Азп Зег
<210> 38
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 38
МеЕ О1у Уа1 Рго ТЬг О1п Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи
1 5 10
Синтетический
ТЬг Уа1 Уа1 Уа1 15
Уа1 Агд Суз
- 97 029419
<210> 39
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
<400> 39
Синтетический
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Рго О1у А1а О1и Ьеи Уа1
5 10
Зег Уа1 Ьуз МеЕ Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг
20 25
Тгр МеЕ Няз Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у О1п О1у
35 40
О1у Уа1 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг ТЬг Туг
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег
65 70 75
МеЕ О1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а
85 90
ТЬг Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЕ Азр
100 105
О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
Ьуз Рго О1у 15 А1а
РЬе ТЬг 30 Азп Туг
Ьеи 45 О1и Тгр 11е
Азп О1п Ьуз РЬе
Зег ТЬг А1а Туг 80
Уа1 Туг Туг 95 Суз
Туг Тгр 110 О1у О1п
<210> 40
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
Синтетический
<400> 40
Азр 1 11е О1п МеЕ ТЬг 5 О1п Зег Рго А1а Зег 10 Ьеи Зег
О1и ТЬг Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз О1у А1а 25 Зег О1и Азп
Ьеи Азп Тгр Туг О1п Агд Ьуз О1п О1у Ьуз Зег Рго
А1а Зег Уа1 15 О1у
11е Туг 30 О1у А1а
О1п Ьеи Ьеи 11е
- 98 029419
35 40 45
Туг О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр О1у МеЕ Зег Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег О1у Зег О1у Агд О1п Туг Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Зег Ьеи Н1з Рго
65 70 75 80
Азр Азр Уа1 А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п Азп Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 41
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 41
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Зег О1у А1а О1и Ьеи Уа1 Агд Рго О1у 15 А1а
5 10
Зег Уа1 ТЬг Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
О1и МеЕ Н1з Тгр Уа1 Ьуз О1п ТЬг Рго Уа1 Н1з О1у Ьеи О1и Тгр 11е
35 40 45
О1у А1а 11е Азр Рго О1и ТЬг ТЬг Зег ТЬг А1а Туг Азп О1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЕ О1и Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
ТЬг Ьуз Суз Туг Туг О1у Зег А1а Азр Туг А1а МеЕ Азр Туг Тгр О1у
100 105 110
О1п О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 42 <211> 107
- 99 029419
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 42
Азр 1 11е О1п МеЬ ТЬг 5 О1п Зег Рго А1а Зег Ьеи 10 Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
О1и ТЬг Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз О1у А1а Зег О1и Азп 11е Туг О1у А1а
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг О1п Агд Ьуз О1п О1у Ьуз Зег Рго О1п Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр О1у МеЬ Зег Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег О1у Зег О1у Агд О1п Туг Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Зег Ьеи Н1з Рго
65 70 75 80
Азр Азр Уа1 А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п Азп Уа1 Ьеи Зег ТЬг Рго Тгр
85 90 95
ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 43
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 43 О1п Уа1 1 О1п Ьеи О1п 5 О1п Рго О1у А1а О1и 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у 15 А1а
Зег Уа1 Ьуз МеЬ 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 30 Зег Туг
Тгр МеЬ Н1з 35 Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд 40 Рго О1у О1п О1у Ьеи 45 О1и Тгр 11е
О1у Ьеи 50 11е Азр Рго Зег Азр 55 Ьуз Туг ТЬг Азп Туг 60 Азп О1п Ьуз РЬе
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
- 100 029419
65 70 75 80
ΜеЕ О1п Ьеи Бег Бег 85 Ьеи ΤΗγ Бег О1и Αзρ 90 Бег А1а Уа1 Τ/γ Τ/γ 95 Суз
ΤΗγ Агд О1у Азп 100 Τ/γ О1у Уа1 Αзρ Τ/γ 105 О1у ΜеЕ Αзρ Τ/γ ΤΓρ 110 О1у О1п
О1у ΤΗγ Бег 115 Уа1 ΤΗγ Уа1 Бег Бег 120
<210> 44
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 44
Αзρ 1 11е О1п ΜеЕ ΤΗγ 5 О1п Бег Рго А1а Бег Ьеи 10 Бег А1а Бег Уа1 15 О1у
О1и ΤΗγ Уа1 ΤΗγ 11е ΤΗγ Суз О1у А1а Бег О1и Азп 11е Τ/γ О1у А1а
20 25 30
Ьеи Азп ΤΓρ Τ/γ О1п Агд Ьуз О1п О1у Ьуз Бег Рго О1п Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Τ/γ О1у А1а ΤΗγ Азп Ьеи А1а Αзρ О1у ΜеЕ Бег Бег Агд РНе Бег О1у
50 55 60
Бег О1у Бег О1у Агд О1п Τ/γ Бег Ьеи Ьуз 11е Бег Бег Ьеи И1з Рго
65 70 75 80
Αзρ Αзρ Уа1 А1а ΤΗγ Τ/γ Τ/γ Суз О1п Азп Уа1 Ьеи Бег ΤΗγ Рго Τ/γ
85 90 95
ΤΗγ РНе О1у О1у О1у ΤΗγ Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 45
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 45
- 101 029419
57 аЕдадаЕдда дсЕдЕаЕсаЕ ссЕсЕЕсЕЕд дЕадсаасад сЕасаддЕдЕ саасЕсс
<210> 46 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 46 аЕдддЕдЕас ссасЕсадсЕ ссЕдЕЕдсЕд ЕддсЕЕасад ЕсдЕадЕЕдЕ садаЕдЕ
57 <210> 47 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 47 аЕддааЕдда дсЕдддЕсЕЕ ЕсЕсЕЕссЕс сЕдЕсадЕаа ЕЕдсаддЕдЕ ссааЕсс
57 <210> 48 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 48 аЕдддЕдЕас ссасЕсадсЕ ссЕдЕЕдсЕд ЕддсЕЕасад ЕсдЕадЕЕдЕ садаЕдЕ
57 <210> 49 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 49 аЕдадаЕдда дсЕдЕаЕсаЕ ссЕсЕЕсЕЕд дЕадсаасад сЕасаддЕдЕ саасЕсс
57 <210> 50 <211> 57 <212> ДНК
- 102 029419
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 50
аЕдддЕдЕас ссасЕсадсЕ ссЕдЕЕдсЕд ЕддсЕЕасад ЕсдЕадЕЕдЕ садаЕдЕ
<210> 51
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 51
саддЕссаас Едсадсадсс ЕддддсЕдад сЕддЕдаадс сЕддддсЕЕс адЕдаадаЕд
ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддсЕа сассЕЕсасс аасЕасЕдда ЕдсасЕдддЕ даадсададд
ссЕддасаад дссЕЕдадЕд даЕсддадЕд аЕЕдаЕссЕЕ сЕдаЕадЕЕа ЕасЕассЕас
ааЕсаааадЕ Есаадддсаа ддссасаЕЕд асЕдЕадаса саЕссЕссад сасадссЕас
аЕдсадсЕса дсадссЕдас аЕсЕдаддас ЕсЕдсддЕсЕ аЕЕасЕдЕас аададдЕаас
ЕасддадЕад асЕаЕдсЕаЕ ддасЕасЕдд ддЕсааддаа ссЕсадЕсас сдЕсЕссЕсд
<210> 52
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 52
дасаЕссада ЕдасЕсадЕс ЕссадсЕЕса сЕдЕсЕдсаЕ сЕдЕдддада аасЕдЕсасс
аЕсасаЕдЕд дадсаадЕда дааЕаЕЕЕас ддЕдсЕЕЕаа аЕЕддЕаЕса дсддааасад
ддааааЕсЕс сЕсадсЕссЕ даЕсЕаЕддЕ дсаассаасЕ ЕддсадаЕдд саЕдЕсаЕсд
аддЕЕсадЕд дсадЕддаЕс ЕддЕадасад ЕаЕЕсЕсЕса адаЕсадЕад ссЕдсаЕссЕ
дасдаЕдЕЕд саасдЕаЕЕа сЕдЕсааааЕ дЕдЕЕааЕЕа сЕссдЕасас дЕЕсддаддд
- 103 029419
дддассаадс ЬддаааЬааа а
<210> 53
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 53
саддЬЬсаас ЬдсадсадЬс ЬддддсЬдад сЬддЬдаддс сЬддддсЬЬс адЬдасдсЬд
ЬссЬдсаадд сЬЬсдддсЬа сасаЬЬЬасЬ дасЬаЬдааа ЬдсасЬдддЬ даадсадаса
ссЬдЬдсаЬд дссЬддааЬд даЬЬддадсЬ аЬЬдаЬссЬд ааасЬасЬад ЬасЬдссЬас
ааЬсадаадЬ Ьсаадддсаа ддссасасЬд асЬдсадаса ааЬссЬссад сасадссЬас
аЬддадсЬсс дсадссЬдас аЬсЬдаддас ЬсЬдссдЬсЬ аЬЬасЬдЬас саааЬдЬЬас
ЬасддЬадсд сддасЬаЬдс ЬаЬддасЬас ЬддддЬсаад даассЬсадЬ сассдЬсЬсс
Ьса
<210> 54
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 54
дасаЬссада ЬдасЬсадЬс ЬссадсЬЬса сЬдЬсЬдсаЬ сЬдЬдддада аасЬдЬсасс
аЬсасаЬдЬд дадсаадЬда дааЬаЬЬЬас ддЬдсЬЬЬаа аЬЬддЬаЬса дсддааасад
ддааааЬсЬс сЬсадсЬссЬ даЬсЬаЬддЬ дсаассаасЬ ЬддсадаЬдд саЬдЬсаЬсд
аддЬЬсадЬд дсадЬддаЬс ЬддЬадасад ЬаЬЬсЬсЬса адаЬсадЬад ссЬдсаЬссЬ
дасдаЬдЬЬд саасдЬаЬЬа сЬдЬсааааЬ дЬдЬЬаадЬа сЬссдЬддас дЬЬсддЬдда
- 104 029419
ддсассаадс ЕддаааЕсаа а
<210> 55
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 55
саддЕссаас Едсадсадсс ЕддддсЕдад сЕддЕдаадс сЕддддсЕЕс адЕдаадаЕд
ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддсЕа сассЕЕсасс адсЕасЕдда ЕдсасЕдддЕ даадсададд
ссЕддасаад дссЕЕдадЕд даЕсддасЕд аЕЕдаЕссЕЕ сЕдаЕаадЕа ЕасЕаасЕас
ааЕсаааадЕ Есаадддсаа ддссасаЕЕд асЕдЕадаса саЕссЕссад сасадссЕас
аЕдсадсЕса дсадссЕдас аЕсЕдаддас ЕсЕдсддЕсЕ аЕЕасЕдЕас аададдЕаас
ЕасддадЕад асЕаЕддЕаЕ ддасЕасЕдд ддЕсааддаа ссЕсадЕсас сдЕсЕссЕса
<210> 56
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 56
дасаЕссада ЕдасЕсадЕс ЕссадсЕЕса сЕдЕсЕдсаЕ сЕдЕдддада аасЕдЕсасс
аЕсасаЕдЕд дадсаадЕда дааЕаЕЕЕас ддЕдсЕЕЕаа аЕЕддЕаЕса дсддааасад
ддааааЕсЕс сЕсадсЕссЕ даЕсЕаЕддЕ дсаассаасЕ ЕддсадаЕдд саЕдЕсаЕсд
аддЕЕсадЕд дсадЕддаЕс ЕддЕадасад ЕаЕЕсЕсЕса адаЕсадЕад ссЕдсаЕссЕ
дасдаЕдЕЕд саасдЕаЕЕа сЕдЕсааааЕ дЕдЕЕаадЕа сЕссдЕасас дЕЕсддаддд
дддассаадс ЕддаааЕааа а
<210> 57
- 105 029419
<211> 98
<212> Белок <213> Ното зарчепз
<400> 57
О1п Уа1 1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Бег Туг
20 25 30
Туг Мей Н1з Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Мей
35 40 45
О1у 11е 11е Азп Рго Бег О1у О1у Бег ТЬг Бег Туг А1а О1п Ьуз РЬе
50 55 60
О1п О1у Агд Уа1 ТЬг Мей ТЬг Агд Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 80
Мей О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд
<210> 58 <211> 15 <212> Белок <213> Ното зарчепз <400> 58 Бег 15
Туг РЬе Азр 1 Туг Тгр 5 О1у О1п О1у ТЬг Ьеи 10 Уа1 ТЬг Уа1 Бег
<210> 59 <211> 96 <212> Белок <213> Ното зар+епз
<400> 59
Азр 11е О1п 1 Мей ТЬг 5 О1п Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег А1а Бег Уа1 О1у 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25 Бег О1п Бег 11е Бег 30 Бег Туг
Ьеи Азп Тгр 35 Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у 40 Ьуз А1а Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи 11е
Туг А1а А1а 50 Бег Бег Ьеи О1п 55 Бег О1у Уа1 Рго Бег 60 Агд РЬе Бег О1у
- 106 029419
Бег О1у 65
Бег О1у ТЬг Азр 70
РЬе
ТЬг Ьеи ТЬг 11е Бег Бег Ьеи О1п Рго
75
80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Бег Туг Бег ТЬг Рго Рго
85 90 95
<210> <211> <212> <213> 60 5 Белок Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 60
Азп Туг Тгр МеЕ Н1з 1 5
<210> 61
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 61
Бег Туг Тгр МеЕ Н1з
1 5
<210> 62
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 62
Бег Туг Туг МеЕ Н1з
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 63
Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг Туг Азп О1п Ьуз РЬе Ьуз
- 107 029419
10
15
О1у
<210> 64
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 64
Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг Туг А1а
1 5 10
Синтетический
О1п Ьуз РЬе О1п 15
О1у
<210> 65
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 65
Ьеи 11е Азр Рго Бег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп Туг Азп
1 5 10
Синтетический
О1п Ьуз РЬе Ьуз 15
О1у
<210> 66
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности пептид
<400> 66
11е 11е Азп Рго Бег О1у О1у Бег ТЬг Бег Туг А1а
1 5 10
Синтетический
О1п Ьуз РЬе О1п 15
О1у
<210> 67
<211> 11
- 108 029419
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 67
О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЕ Азр Туг
1 5 10
Синтетический
<210> 68
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 68
О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг О1у МеЕ Азр Туг
1 5 10
Синтетический
<210> 69
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 69
О1и О1у Азр О1у Туг 11е О1п А1а РЬе Азр Туг
1 5 10
Синтетический
<210> 70
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 70
О1у А1а Зег О1и Азп 11е Туг О1у А1а Ьеи Азп
1 5 10
Синтетический
<210> 71
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
- 109 029419
<400> 71
Агд А1а Зег О1и Азп 11е Туг О1у А1а Ьеи Азп
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 72
Агд А1а Зег О1п Зег 11е Зег Зег Туг Ьеи Азп
1 5 10
Синтетический
<210> 73
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
<400> 73
О1у А1а ТЬг Азп Ьеи А1а Азр 1 5
<210> 74
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 74
А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег
1 5
Синтетический
<210> 75
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 75
О1п Азп Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго Туг ТЬг
1 5
Синтетический
<210> 76
<211> 9
- 110 029419
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 76
О1п О1п Бег Туг Бег ТЬг Рго Туг ТЬг
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 77
О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 78
О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Бег Туг
1 5
<210> 79
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 79
Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический
- 111 029419
<400> 80
Ьеи 11е Азр Рго Зег Азр Ьуз Туг ТЬг Азп 1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 81
11е 11е Азп Рго Зег О1у О1у Зег ТЬг Зег
1 5 10
<210> 82
<211> 120
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 82
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Зег О1у
Зег Уа1 Ьуз Уа1 20 Зег Суз Ьуз А1а
Туг МеЕ Низ 35 Тгр Уа1 Агд О1п А1а 40
О1у 11е 50 11е Азп Рго Зег О1у 55 О1у
О1п 65 О1у Агд Уа1 ТЬг МеЕ 70 ТЬг Агд
МеЕ О1и Ьеи Зег Зег 85 Ьеи Агд Зег
А1а Агд О1и О1у 100 Азр О1у Туг 11е
О1у ТЬг Ьеи 115 Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 120
А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Зег 25 О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 30 Зег Туг
Рго О1у О1п О1у Ьеи 45 О1и Тгр МеЕ
Зег ТЬг Зег Туг 60 А1а О1п Ьуз РЬе
Азр ТЬг Зег 75 ТЬг Зег ТЬг Уа1 Туг 80
О1и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
О1п 105 А1а РЬе Азр Туг Тгр 110 О1у О1п
<210> 83
<211> 107
- 112 029419
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 83
Азр 1 11е О1п МеЬ ТЬг 5 О1п Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег А1а Бег Уа1 15 О1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Бег О1п Бег 11е Бег Бег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Бег Ьеи О1п Бег О1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег О1у
50 55 60
Бег О1у Бег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Бег Бег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Бег Туг Бег ТЬг Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе О1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 84
<211> 70
<212> Белок <213> Ното зарчепз
<400> 84
А1а 1 Бег Азп РЬе Азр 5 Суз Суз Ьеи О1у Туг 10 ТЬг Азр Агд 11е Ьеи 15 Н1з
Рго Ьуз РЬе 11е 20 Уа1 О1у РЬе ТЬг Агд 25 О1п Ьеи А1а Азп О1и 30 О1у Суз
Азр 11е Азп 35 А1а 11е 11е РЬе Н1з 40 ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Ьеи 45 Бег Уа1 Суз
А1а Азп 50 Рго Ьуз О1п ТЬг Тгр 55 Уа1 Ьуз Туг 11е Уа1 60 Агд Ьеи Ьеи Бег
Ьуз Ьуз Уа1 Ьуз Азр МеЬ 65 70
<210> 85
- 113 029419
<211> 96
<212> Белок <213> Ното зарчепз
<400> 85
МеЕ 1 Суз Суз ТЬг Ьуз 5 Бег Ьеи Ьеи Ьеи А1а 10 А1а Ьеи МеЕ Бег Уа1 15 Ьеи
Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Суз О1у О1и Бег О1и А1а А1а Бег Азп РЬе Азр Суз
20 25 30
Суз Ьеи О1у Туг ТЬг Азр Агд 11е Ьеи Н1з Рго Ьуз РЬе 11е Уа1 О1у
35 40 45
РЬе ТЬг Агд О1п Ьеи А1а Азп О1и О1у Суз Азр 11е Азп А1а 11е 11е
50 55 60
РЬе Н1з ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Ьеи Бег Уа1 Суз А1а Азп Рго Ьуз О1п ТЬг
65 70 75 80
Тгр Уа1 Ьуз Туг 11е Уа1 Агд Ьеи Ьеи Бег Ьуз Ьуз Уа1 Ьуз Азп МеЕ
85 90 95
<210> 86
<211> 96
<212> Белок
<213> Масаса ти1аЕЕа
<400> 86
МеЕ 1 Суз Суз ТЬг Ьуз 5 Бег Ьеи Ьеи Ьеи А1а 10 А1а Ьеи МеЕ Бег Уа1 15 Ьеи
Ьеи Ьеи Туг Ьеи Суз Бег О1и Бег О1и А1а А1а Бег Азп РЬе Азр Суз
20 25 30
Суз Ьеи Агд Туг ТЬг Азр Агд 11е Ьеи Н1з Рго Ьуз РЬе 11е Уа1 О1у
35 40 45
РЬе ТЬг О1п О1п Ьеи А1а Азп О1и ТЬг Суз Азр 11е Азп А1а Уа1 Уа1
50 55 60
РЬе Н1з ТЬг Ьуз Ьуз О1у Ьеи Бег Уа1 Суз А1а Азп Рго Ьуз О1п ТЬг
65 70 75 80
Тгр Уа1 Ьуз Ьеи 11е Уа1 Агд Агд Ьеи Бег Ьуз Ьуз 11е Азп Ьуз МеЕ
85 90 95
<210> 87
<211> 96
<212> Белок
<213> Масаса £азс1си1аг1з
- 114 029419
<400> 87 Ьеи А1а 10 А1а Ьеи МеЕ Зег Уа1 15 Ьеи
МеЕ 1 Суз Суз Зег Ьуз 5 Зег Ьеи Ьеи
Ьеи Ьеи Туг Ьеи Суз Зег О1и Зег О1и А1а А1а Зег Азп РЬе Азр Суз
20 25 30
Суз Ьеи Агд Туг ТЬг Азр Агд 11е Ьеи Ηίδ Рго Ьуз РЬе 11е Уа1 О1у
35 40 45
РЬе ТЬг О1п О1п Ьеи А1а Азп О1и ТЬг Суз Азр 11е Азп А1а Уа1 11е
50 55 60
РЬе Ηί.8 ТЬг Ьуз Ьуз О1у Ьеи Зег Уа1 Суз А1а Азп Рго Ьуз О1п ТЬг
65 70 75 80
Тгр Уа1 Ьуз Ьеи 11е Уа1 Агд Агд Ьеи Зег Ьуз Ьуз 11е Азп Ьуз МеЕ
85 90 95
<210> 88
<211> 95
<212> Белок <213> Миз тизси1из
<400> 88
Суз 1 О1у О1у Ьуз Агд 5 Ьеи Ьеи РЬе Ьеи А1а 10 Ьеи А1а Тгр Уа1 Ьеи 15 Ьеи
А1а Ηίδ Ьеи Суз Зег О1п А1а О1и А1а А1а Зег Азп Туг Азр Суз Суз
20 25 30
Ьеи Зег Туг 11е О1п ТЬг Рго Ьеи Рго Зег Агд А1а 11е Уа1 О1у РЬе
35 40 45
ТЬг Агд О1п МеЕ А1а Азр О1и А1а Суз Азр 11е Азп А1а 11е 11е РЬе
50 55 60
Ηίδ ТЬг Ьуз Ьуз Агд Ьуз Зег Уа1 Суз А1а Азр Рго Ьуз О1п Азп Тгр
65 70 75 80
Уа1 Ьуз Агд А1а Уа1 Азп Ьеи Ьеи Зег Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз МеЕ
85 90 95
<210> 89
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 115 029419
праймер
<400> 89 саЬЬЬдсаса
ссЬсассаЬс
<210> 90
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 90
ЁссдЁЬдсЬЁ
<210> 91
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 91
сддсдЬЬЬас
<210> 92
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 92
ЁЁсЬЁдсЬда
<210> 93
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 93
дсЬддааасс
Синтетический
аасдЬсаЬдЬ
Синтетический
Ьасаддаадд
Синтетический
сЬддаддЬЬд
Синтетический
аЬдаЬсассЬ
- 116 029419
<210> 94 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 94 ддЕадЕаадд
20
<210> 95 <211> 20 <212> БЫА
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 95 садЕдЕЕддЕ
20
<210> 96 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 96 ссдадссаад
20
<210> 97 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 97 саддссадас
20
Синтетический
дсЕддддаад
Синтетический
ддЕдддсЕаЕ
Синтетический
ададсаЕаЕс
Синтетический
ЕЕЕдЕЕддаЕ
<210> 98
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности:
Синтетический
- 117 029419
праймер
<400> 98
ЕЕдсдсЕсаЕ сЕЕаддсЕЕЕ
<210> 99
<211> 70
<212> Белок <213> Ното зартепз
<400> 99 Суз Суз Ьеи
А1а 1 Бег Азп РЬе Азр 5
Рго Ьуз РЬе 11е 20 Уа1 О1у РЬе ТЬг
Азр 11е Азп 35 А1а 11е 11е РЬе Н1з 40
А1а Азп 50 Рго Ьуз О1п ТЬг Тгр 55 Уа1
О1у Туг 10 ТЬг Азр Агд 11е Ьеи 15 Н1з
Агд 25 О1п Ьеи А1а Азп О1и 30 О1у Суз
ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Ьеи 45 Бег Уа1 Суз
Ьуз Туг 11е Уа1 60 Агд Ьеи Ьеи Бег
Ьуз Ьуз Уа1 65 Ьуз Азп МеЕ 70
<210> 100
<211> 210
<212> ДНК
<213> Ното заръепз
<400> 100
дсаадсаасЕ ЕЕдасЕдсЕд ЕсЕЕддаЕас
асадассдЕа
ЕЕсЕЕсаЕсс
ЕаааЕЕЕаЕЕ
дЕдддсЕЕса
сасддсадсЕ
ддссааЕдаа
ддсЕдЕдаса
ЕсааЕдсЕаЕ
саЕсЕЕЕсас
асааадаааа
адЕЕдЕсЕдЕ
дЕдсдсаааЕ
ссаааасада
сЕЕдддЕдаа
аЕаЕаЕЕдЕд
сдЕсЕссЕса
дЕаааааадЕ
саадаасаЕд
<210> 101 <211> 288 <212> ДНК <213> Ното <400> 101 аЕдЕдсЕдЕа заръепз
ссаададЕЕЕ дсЕссЕддсЕ дсЕЕЕдаЕдЕ садЕдсЕдсЕ асЕссассЕс
ЕдсддсдааЕ садаадсадс аадсаасЕЕЕ дасЕдсЕдЕс ЕЕддаЕасас адассдЕаЕЕ
- 118 029419
180
сЕЕсаЕссЕа ааЕЕЕаЕЕдЕ дддсЕЕсаса сддсадсЕдд ссааЕдаадд сЕдЕдасаЕс
ааЕдсЕаЕса ЕсЕЕЕсасас ааадааааад ЕЕдЕсЕдЕдЕ дсдсаааЕсс аааасадасЕ
240
ЕдддЕдаааЕ
аЕаЕЕдЕдсд
ЕсЕссЕсадЕ
аааааадЕса
адаасаЕд
288
<210> 102
<211> 97
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 102
МеЕ А1а Суз О1у О1у Ьуз Агд Ьеи Ьеи РЬе Ьеи А1а Ьеи А1а Тгр Уа1 1 5 10 15
Ьеи Ьеи А1а Ηΐ3 Ьеи Суз Бег О1п А1а О1и А1а А1а Бег Азп Туг Азр 20 25 30
Суз Суз Ьеи Бег Туг 11е О1п ТЬг Рго Ьеи Рго Бег Агд А1а 11е Уа1 35 40 45
О1у РЬе ТЬг Агд О1п МеЕ А1а Азр О1и А1а Суз Азр 11е Азп А1а 11е 50 55 60
11е РЬе Н1з ТЬг Ьуз Ьуз Агд Ьуз Бег Уа1 Суз А1а Азр Рго Ьуз О1п 65 70 75 80
Азп Тгр Уа1 Ьуз Агд А1а Уа1 Азп Ьеи Ьеи Бег Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз 85 90 95
МеЕ
<210>
<211>
<212>
<213>
<400> 103 аЕддссЕдсд
103
291
ДНК
Миз тизси1из
дЕддсаадсд
ЕсЕдсЕсЕЕс
сЕЕдсЕЕЕдд
саЕдддЕасЕ
дсЕддсЕсас
60
120
180
240
сЕсЕдсадсс
ссЕсЕЕссЕЕ
аЕЕааЕдсЕа
аддсадаадс
адсаадсаас
ЕасдасЕдЕЕ
дссЕсЕсдЕа
саЕасадасд
ссададсЕаЕ
ЕдЕдддЕЕЕс
асаадасада
ЕддссдаЕда
адсЕЕдЕдас
ЕсаЕсЕЕЕса
сасдаадааа
адааааЕсЕд
ЕдЕдсдсЕда
Ессааадсад
- 119 029419
аасЬдддЬда ааадддсЬдЬ даассЬссЬс адссЬаадад ЬсаадаадаЬ д
291
<210> 104
<211> 374
<212> Белок <213> Ното зартепз
<400> 104 Азп РЬе Бег Азр Уа1 10 РЬе Азр Бег Бег 15 О1и
МеЬ 1 Бег О1у О1и Бег МеЬ 5
Азр Туг РЬе Уа1 20 Бег Уа1 Азп ТЬг Бег Туг Туг 25 Бег Уа1 Азр 30 Бег О1и
МеЬ Ьеи Ьеи Суз 35 Бег Ьеи О1п О1и 40 Уа1 Агд О1п РЬе Бег 45 Агд Ьеи РЬе
Уа1 Рго 50 11е А1а Туг Бег Ьеи 55 11е Суз Уа1 РЬе О1у 60 Ьеи Ьеи О1у Азп
11е 65 Ьеи Уа1 Уа1 11е ТЬг 70 РЬе А1а РЬе Туг Ьуз 75 Ьуз А1а Агд Бег МеЬ 80
ТЬг Азр Уа1 Туг Ьеи Ьеи 85 Азп МеЬ А1а 11е А1а 90 Азр 11е Ьеи РЬе 95 Уа1
Ьеи ТЬг Ьеи Рго 100 РЬе Тгр А1а Уа1 Бег Н1з А1а 105 ТЬг О1у А1а 110 Тгр Уа1
РЬе Бег Азп А1а 115 ТЬг Суз Ьуз Ьеи 120 Ьеи Ьуз О1у 11е Туг 125 А1а 11е Азп
РЬе Азп 130 Суз О1у МеЬ Ьеи Ьеи 135 Ьеи ТЬг Суз 11е Бег 140 МеЬ Азр Агд Туг
11е 145 А1а 11е Уа1 О1п А1а 150 ТЬг Ьуз Бег РЬе Агд 155 Ьеи Агд Бег Агд ТЬг 160
Ьеи Рго Агд Бег Ьуз 11е 165 11е Суз Ьеи Уа1 Уа1 170 Тгр О1у Ьеи Бег 175 Уа1
11е 11е Бег Бег 180 Бег ТЬг РЬе Уа1 РЬе Азп О1п 185 Ьуз Туг Азп 190 ТЬг О1п
О1у Бег Азр Уа1 195 Суз О1и Рго Ьуз 200 Туг О1п ТЬг Уа1 Бег 205 О1и Рго 11е
Агд Тгр Ьуз Ьеи Ьеи МеЬ Ьеи О1у Ьеи О1и Ьеи Ьеи РЬе О1у РЬе РЬе
- 120 029419
210 215 220
11е Рго Ьеи МеЕ РЬе МеЕ 11е РЬе Суз Туг ТЬг РЬе 11е Уа1 Ьуз ТЬг
225 230 235 240
Ьеи Уа1 О1п А1а О1п Азп Зег Ьуз Агд Н1з Ьуз А1а 11е Агд Уа1 11е
245 250 255
11е А1а Уа1 Уа1 Ьеи Уа1 РЬе Ьеи А1а Суз О1п 11е Рго Н1з Азп МеЕ
260 265 270
Уа1 Ьеи Ьеи Уа1 ТЬг А1а А1а Азп Ьеи О1у Ьуз МеЕ Азп Агд Зег Суз
275 280 285
О1п Зег О1и Ьуз Ьеи 11е О1у Туг ТЬг Ьуз ТЬг Уа1 ТЬг О1и Уа1 Ьеи
290 295 300
А1а РЬе Ьеи Н1з Суз Суз Ьеи Азп Рго Уа1 Ьеи Туг А1а РЬе 11е О1у
305 310 315 320
О1п Ьуз РЬе Агд Азп Туг РЬе Ьеи Ьуз 11е Ьеи Ьуз Азр Ьеи Тгр Суз
325 330 335
Уа1 Агд Агд Ьуз Туг Ьуз Зег Зег О1у РЬе Зег Суз А1а О1у Агд Туг
340 345 350
Зег О1и Азп 11е Зег Агд О1п ТЬг Зег О1и ТЬг А1а Азр Азп Азр Азп
355 360 365
А1а Зег Зег РЬе ТЬг МеЕ
370
<210> 105
<211> 1122
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 105
аЕдадсдддд ааЕсааЕдаа ЕЕЕсадсдаЕ дЕЕЕЕсдасЕ ссадЕдаада ЕЕаЕЕЕЕдЕд
ЕсадЕсааЕа сЕЕсаЕаЕЕа сЕсадЕЕдаЕ ЕсЕдадаЕдЕ ЕасЕдЕдсЕс сЕЕдсаддад
дЕсаддсадЕ ЕсЕссаддсЕ аЕЕЕдЕассд аЕЕдссЕасЕ ссЕЕдаЕсЕд ЕдЕсЕЕЕддс
сЕссЕдддда аЕаЕЕсЕддЕ ддЕдаЕсасс ЕЕЕдсЕЕЕЕЕ аЕаадааддс саддЕсЕаЕд
асадасдЕсЕ аЕсЕсЕЕдаа саЕддссаЕЕ дсадасаЕсс ЕсЕЕЕдЕЕсЕ ЕасЕсЕссса
- 121 029419
ЕЕсЕдддсад ЕдадЕсаЕдс сассддЕдсд ЕдддЕЕЕЕса дсааЕдссас дЕдсаадЕЕд
сЕааааддса ЕсЕаЕдссаЕ саасЕЕЕаас ЕдсдддаЕдс ЕдсЕссЕдас ЕЕдсаЕЕадс
аЕддассддЕ асаЕсдссаЕ ЕдЕасаддсд асЕаадЕсаЕ ЕссддсЕссд аЕссадааса
сЕассдсдса дсааааЕсаЕ сЕдссЕЕдЕЕ дЕдЕдддддс ЕдЕсадЕсаЕ саЕсЕссадс
ЕсаасЕЕЕЕд ЕсЕЕсаасса ааааЕасаас асссааддса дсдаЕдЕсЕд Едаасссаад
ЕассадасЕд ЕсЕсддадсс саЕсаддЕдд аадсЕдсЕда ЕдЕЕддддсЕ ЕдадсЕасЕс
ЕЕЕддЕЕЕсЕ ЕЕаЕсссЕЕЕ даЕдЕЕсаЕд аЕаЕЕЕЕдЕЕ асасдЕЕсаЕ ЕдЕсаааасс
ЕЕддЕдсаад сЕсадааЕЕс Еааааддсас ааадссаЕсс дЕдЕааЕсаЕ адсЕдЕддЕд
сЕЕдЕдЕЕЕс ЕддсЕЕдЕса даЕЕссЕсаЕ аасаЕддЕсс ЕдсЕЕдЕдас ддсЕдсаааЕ
ЕЕдддЕаааа ЕдаассдаЕс сЕдссададс даааадсЕаа ЕЕддсЕаЕас даааасЕдЕс
асадаадЕсс ЕддсЕЕЕссЕ дсасЕдсЕдс сЕдаасссЕд ЕдсЕсЕасдс ЕЕЕЕаЕЕддд
садаадЕЕса дааасЕасЕЕ ЕсЕдаадаЕс ЕЕдааддасс ЕдЕддЕдЕдЕ дадааддаад
ЕасаадЕссЕ саддсЕЕсЕс сЕдЕдссддд аддЕасЕсад аааасаЕЕЕс Есддсадасс
адЕдадассд садаЕаасда сааЕдсдЕсд ЕссЕЕсасЕа Ед
<210> 106
<211> 367
<212> Белок <213> Миз тизси1из
<400> 106 Туг РЬе О1у ТЬг Азр 10 Азр Туг Азр Азп 15 ТЬг
МеЕ 1 Азп Зег ТЬг О1и 5 Зег
О1и Туг Туг Зег 20 11е Рго Рго Азр Н1з О1у Рго 25 Суз Зег Ьеи 30 О1и О1и
Уа1 Агд Азп 35 РЬе ТЬг Ьуз Уа1 РЬе 40 Уа1 Рго 11е А1а Туг 45 Зег Ьеи 11е
Суз Уа1 РЬе О1у Ьеи Ьеи О1у Азп 11е МеЕ Уа1 Уа1 МеЕ ТЬг РЬе А1а
- 122 029419
50 55 60
РЬе 65 Туг Ьуз Ьуз А1а Агд 70 Зег МеЕ ТЬг Азр Уа1 75 Туг Ьеи Ьеи Азп МеЕ 80
А1а 11е ТЬг Азр 11е Ьеи РЬе Уа1 Ьеи ТЬг Ьеи Рго РЬе Тгр А1а Уа1
85 90 95
ТЬг Ηΐ3 А1а ТЬг Азп ТЬг Тгр Уа1 РЬе Зег Азр А1а Ьеи Суз Ьуз Ьеи
100 105 110
МеЕ Ьуз О1у ТЬг Туг А1а Уа1 Азп РЬе Азп Суз О1у МеЕ Ьеи Ьеи Ьеи
115 120 125
А1а Суз 11е Зег МеЕ Азр Агд Туг 11е А1а 11е Уа1 О1п А1а ТЬг Ьуз
130 135 140
Зег РЬе Агд Уа1 Агд Зег Агд ТЬг Ьеи ТЬг ΗΪ8 Зег Ьуз Уа1 11е Суз
145 150 155 160
Уа1 А1а Уа1 Тгр РЬе 11е Зег 11е 11е 11е Зег Зег Рго ТЬг РЬе 11е
165 170 175
РЬе Азп Ьуз Ьуз Туг О1и Ьеи О1п Азр Агд Азр Уа1 Суз О1и Рго Агд
180 185 190
Туг Агд Зег Уа1 Зег О1и Рго 11е ТЬг Тгр Ьуз Ьеи Ьеи О1у МеЕ О1у
195 200 205
Ьеи О1и Ьеи РЬе РЬе О1у РЬе РЬе ТЬг Рго Ьеи Ьеи РЬе МеЕ Уа1 РЬе
210 215 220
Суз Туг Ьеи РЬе 11е 11е Ьуз ТЬг Ьеи Уа1 О1п А1а О1п Азп Зег Ьуз
225 230 235 240
Агд ΗΪ8 Агд А1а 11е Агд Уа1 Уа1 11е А1а Уа1 Уа1 Ьеи Уа1 РЬе Ьеи
245 250 255
А1а Суз О1п 11е Рго ΗΪ8 Азп МеЕ Уа1 Ьеи Ьеи Уа1 ТЬг А1а Уа1 Азп
260 265 270
ТЬг О1у Ьуз Уа1 О1у Агд Зег Суз Зег ТЬг О1и Ьуз Уа1 Ьеи А1а Туг
275 280 285
ТЬг Агд Азп Уа1 А1а О1и Уа1 Ьеи А1а РЬе Ьеи Ηί.8 Суз Суз Ьеи Азп
290 295 300
- 123 029419
Рго 305 Уа1 Ьеи Туг А1а РЬе 310 11е С1у О1п Ьуз РЬе 315 Агд Азп Туг РЬе МеГ 320
Ьуз 11е МеГ Ьуз Азр 325 Уа1 Тгр Суз МеГ Агд 330 Агд Ьуз Азп Ьуз МеГ 335 Рго
О1у РЬе Ьеи Суз 340 А1а Агд Уа1 Туг Зег 345 О1и Зег Туг 11е Зег 350 Агд О1п
ТЬг Зег О1и ТЬг Уа1 О1и Азп Азр Азп А1а Зег Зег РЬе ТЬг МеГ
355 360 365
<210> 107
<211> 1101
<212> ДНК
<213> Миз тизси1из
<400> 107
аГдааГГсса сададГссГа сГГГддаасд даГдаГГаГд асаасасада дГаГГаГГсГ
аГГссГссад ассаГдддсс аГдсГсссГа даададдГса дааасГГсас сааддГаГГГ
дГдссааГГд ссГасГссГГ ааГаГдГдГс ГГГддссГсс ГдддсаасаГ ГаГддГддГд
аГдассГГГд ссГГсГасаа дааадссада ГссаГдасГд асдГсГассГ дГГдаасаГд
дссаГсасад асаГасГсГГ ГдГссГсасс сГассдГГсГ дддсадГГас ГсаГдссасс
аасасГГддд ГГГГсадсда ГдсасГдГдГ ааасГдаГда ааддсасаГа ГдсддГсаас
ГГГаасГдГд ддаГдсГдсГ ссГддссГдГ аГсадсаГдд ассддГасаГ ГдссаГсдГс
саддсаасса ааГсГГГссд ддГасдсГсс адаасасГда сдсасадГаа ддГсаГсГдГ
дГддсадГдГ ддГГсаГсГс саГсаГсаГс ГсаадсссГа саГГГаГсГГ саасаадааа
ГасдадсГдс аддаГсдГда ГдГсГдГдад ссасддГаса ддГсГдГсГс ададсссаГс
асдГддаадс ГдсГдддГаГ дддасГддад сГдГГсГГГд ддГГсГГсас сссГГГдсГд
ГГГаГддГдГ ГсГдсГаГсГ дГГсаГГаГс аадассГГдд Гдсаддссса даасГссаад
аддсасадад сааГссдадГ сдГдаГсдсГ дГддГГсГсд ГдГГссГддс ГГдГсадаГс
ссГсасааса ГддГссГссГ сдГдасГдсд дГсаасасдд дсааадГддд ссддадсГдс
- 124 029419
900 адсассдада аадЬссЬсдс сЬасассадд аасдЬддссд аддЬссЬддс ЬЬЬссЬдсаЬ
960 ЬдсЬдссЬса ассссдЬдЬЬ дЬаЬдсдЬЬЬ аЬЬддасада ааЬЬсадааа сЬасЬЬсаЬд
1020 аадаЬсаЬда аддаЬдЬдЬд дЬдЬаЬдада аддаадааЬа адаЬдссЬдд сЬЬссЬсЬдЬ
дсссдддЬЬЬ асЬсддааад сЬасаЬсЬсс аддсадасса дЬдадассдЬ сдааааЬдаЬ
1080
ааЬдсаЬсдЬ ссЬЬЬассаЬ д
1101
<210> 108 <211> 450 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 108
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Бег О1у А1а О1и Уа1 10 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Бег Уа1 Ьуз Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр МеЬ Низ Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЬ
35 40 45
О1у Уа1 11е Азр Рго Бег Азр Бег Туг ТЬг ТЬг Туг А1а О1п Ьуз РЬе
50 55 60
О1п О1у Агд Уа1 ТЬг МеЬ ТЬг Уа1 Азр ТЬг Бег ТЬг Бег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд О1у Азп Туг О1у Уа1 Азр Туг А1а МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег А1а Бег ТЬг Ьуз О1у Рго Бег Уа1
115 120 125
РЬе Рго Ьеи А1а Рго Бег Бег Ьуз Бег ТЬг Бег О1у О1у ТЬг А1а А1а
130 135 140
- 125 029419
Ьеи 145 О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз 150 Азр Туг РЬе Рго О1и 155 Рго Уа1 ТЬг Уа1 Бег 160
Тгр Азп Бег О1у А1а Ьеи ТЬг Бег О1у Уа1 Нчз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи О1п Бег Бег О1у Ьеи Туг Бег Ьеи Бег Бег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго
180 185 190
Бег Бег Бег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Нчз Ьуз
195 200 205
Рго Бег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз Бег Суз Азр
210 215 220
Ьуз ТЬг Нчз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у
225 230 235 240
Рго Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е
245 250 255
Бег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Бег Нчз О1и
260 265 270
Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1 О1и Уа1 Нчз
275 280 285
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Бег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нчз О1п Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз
305 310 315 320
О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и
325 330 335
Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п Уа1 Бег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1 О1и Тгр
370 375 380
О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
- 126 029419
Ьеи Азр Зег Азр О1у 405 Зег РЬе РЬе Ьеи Туг 410 Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 415 Азр
Ьуз Зег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЕ Няз
420 425 430
О1и А1а Ьеи Няз Азп Няз Туг ТЬг О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
О1у Ьуз 450
<210> 109
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 109
саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадааас ссддЕдсаад ЕдЕдааддЕд
ЕсаЕдЕааад саЕссддсЕа ЕасаЕЕсасЕ аасЕасЕдда ЕдсаЕЕдддЕ даддсаддсЕ
ссаддасадд дасЕддааЕд даЕдддсдЕд аЕсдасссЕЕ садаЕЕссЕа сассасаЕаЕ
дсссадаадЕ ЕЕсадддсад ддЕдассаЕд асадЕддаса сЕадсассЕс ЕасадЕдЕас
аЕддадсЕдЕ ссадссЕдад аадЕдаадаЕ асадсадЕдЕ асЕаЕЕдсдс ссдсддсааЕ
ЕасддадЕдд асЕаЕдссаЕ ддаЕЕасЕдд дддсадддЕа сЕсЕддЕдас сдЕдЕсЕадЕ
дсЕЕсЕасса адддсссаЕс ддЕсЕЕсссс сЕддсасссЕ ссЕссаадад сассЕсЕддд
ддсасадсдд сссЕдддсЕд ссЕддЕсаад дасЕасЕЕсс ссдаассддЕ дасддЕдЕсд
ЕддаасЕсад дсдсссЕдас садсддсдЕд сасассЕЕсс сддсЕдЕссЕ асадЕссЕса
ддасЕсЕасЕ сссЕсадсад сдЕддЕдасс дЕдсссЕсса дсадсЕЕддд сасссадасс
ЕасаЕсЕдса асдЕдааЕса саадсссадс аасассаадд Еддасаадад адЕЕдадссс
аааЕсЕЕдЕд асаааасЕса сасаЕдссса ссдЕдсссад сассЕдаасЕ ссЕдддддда
- 127 029419
ссдЕсадЕсЕ ЕссЕсЕЕссс сссаааассс ааддасассс ЕсаЕдаЕсЕс ссддассссЕ
даддЕсасаЕ дсдЕддЕддЕ ддасдЕдадс сасдаадасс сЕдаддЕсаа дЕЕсаасЕдд
ЕасдЕддасд дсдЕддаддЕ дсаЕааЕдсс аадасааадс сдсдддадда дсадЕасаас
адсасдЕасс дЕдЕддЕсад сдЕссЕсасс дЕссЕдсасс аддасЕддсЕ дааЕддсаад
дадЕасаадЕ дсааддЕсЕс саасааадсс сЕсссадссс ссаЕсдадаа аассаЕсЕсс
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЕдЕасассс ЕдсссссаЕс ссдддаддад
аЕдассаада ассаддЕсад ссЕдассЕдс сЕддЕсааад дсЕЕсЕаЕсс садсдасаЕс
дссдЕддадЕ дддададсаа Едддсадссд дадаасаасЕ асаадассас дссЕсссдЕд
сЕддасЕссд асддсЕссЕЕ сЕЕссЕсЕаЕ адсаадсЕса ссдЕддасаа дадсаддЕдд
садсадддда асдЕсЕЕсЕс аЕдсЕссдЕд аЕдсаЕдадд сЕсЕдсасаа ссасЕасасд
садаададсс ЕсЕсссЕдЕс Есссдддааа Еда
<210> 110
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 110 ΜеЕ ΤΗγ 5 О1п Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег А1а Бег Уа1 15 О1у
Αзρ 1 11е О1п
Αзρ Агд Уа1 ΤΗγ 20 11е ΤΗγ Суз Агд А1а 25 Бег О1и Азп 11е Τ/γ 30 О1у А1а
Ьеи Азп ΤΓρ 35 Τ/γ О1п О1п Ьуз Рго 40 О1у Ьуз А1а Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи 11е
Τ/г О1у 50 А1а ΤΗγ Азп Ьеи А1а 55 Αзρ О1у Уа1 Рго Бег 60 Агд РНе Бег О1у
Бег 65 О1у Бег О1у Агд О1п 70 Τ/γ Бег Ьеи ΤΗγ 11е 75 Бег Бег Ьеи О1п Рго 80
- 128 029419
О1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз О1п Азп 90 Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго 95 Туг
ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а
100 105 110
Рго Бег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Бег Азр О1и О1п Ьеи Ьуз Бег О1у
115 120 125
ТЬг А1а Бег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд О1и А1а
130 135 140
Ьуз Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи О1п Бег О1у Азп Бег О1п
145 150 155 160
О1и Бег Уа1 ТЬг О1и О1п Азр Бег Ьуз Азр Бег ТЬг Туг Бег Ьеи Бег
165 170 175
Бег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Бег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз О1и Уа1 ТЬг Н1з О1п О1у Ьеи Бег Бег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Бег
195 200 205
РЬе Азп Агд О1у О1и Суз
210
<210> 111
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 111
дасаЕссада ЕдасссадЕс ЕссаЕссадс сЕдадЕдссЕ садЕдддсда ЕадддЕдасЕ
аЕсассЕдЕс дддссадсда даасаЕсЕас ддсдсЕсЕда аЕЕддЕаЕса дсадаадсса
ддаааадсЕс ссаадсЕдсЕ даЕсЕасддд дсЕасааасс Еддсадасдд ЕдЕдсссадЕ
сдаЕЕсЕссд дЕадсддсЕс Еддасдасад ЕаЕЕсасЕда сЕаЕсЕсЕад ЕсЕдсадссЕ
даадаЕЕЕсд ссасЕЕасЕа ЕЕдссадааЕ дЕдсЕдаЕЕа сЕссаЕаЕас сЕЕЕддсдда
дддасаааас ЕддадаЕсаа дадаасЕдЕд дссдсЕссса дЕдЕдЕЕсаЕ ЕЕЕЕсссссЕ
- 129 029419
Ьсадасдаас адсЬдаааЬс адддассдсЬ ЬссдЬддЬдЬ дЬсЬдсЬдаа сааЬЬЬсЬас
ссЬсдсдадд саааадЬдса дЬддааддЬд даЬаасдссс ЬдсададЬдд сааЬЬсасад
дадЬссдЬда ссдаасадда садсааадаЬ ЬсЬасаЬаЬа дЬсЬдЬсаЬс сасссЬдаса
сЬдадсаадд сЬдаЬЬасда даадсасааа дЬдЬаЬдсаЬ дсдаадЬдас ЬсаЬсадддд
сЬдадсЬсЬс ссдЬдассаа дЬсЬЬЬЬаас сддддЬдааЬ дЬЬда
<210> 112
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 112 ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр 1 11е О1п МеЬ
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз О1у А1а 25 Зег О1и Азп 11е Туг 30 О1у А1а
Ьеи Азп Тгр 35 Туг О1п Агд Ьуз Рго 40 О1у Ьуз А1а Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи 11е
Туг О1у 50 А1а ТЬг Азп Ьеи А1а 55 Азр О1у Уа1 Рго Зег 60 Агд РЬе Зег О1у
Зег 65 О1у Зег О1у Агд Азр 70 Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е 75 Зег Зег Ьеи О1п Рго 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз О1п Азп 90 Уа1 Ьеи 11е ТЬг Рго 95 Туг
ТЬг РЬе О1у О1п 100 О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 105 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 110 А1а А1а
Рго Зег Уа1 115 РЬе 11е РЬе Рго Рго 120 Зег Азр О1и О1п Ьеи 125 Ьуз Зег О1у
ТЬг А1а 130 Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи 135 Ьеи Азп Азп РЬе Туг 140 Рго Агд О1и А1а
- 130 029419
Ьуз 145 Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 150 Азр Азп А1а Ьеи О1п 155 Бег О1у Азп Бег О1п 160
О1и Бег Уа1 ТЬг О1и О1п Азр Бег Ьуз Азр Бег ТЬг Туг Бег Ьеи Бег
165 170 175
Бег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Бег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз О1и Уа1 ТЬг Н1з О1п О1у Ьеи Бег Бег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Бег
195 200 205
РЬе Азп Агд О1у О1и Суз
210
<210> 113
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 113
дасайссада йдасйсадад сссайссадс сйдйсадссй ссдйдддсда садддйдасс
айсасайдйд дадсайссда даасайсйас ддддсссйда аййддйайса даддаадссс
ддсааадсйс сйаадсйдсй дайсйасддй дссасааасс йддсйдайдд сдйдсссйсс
адаййсадсд дсйсйддаад йдддсдсдас йайасйсйда ссайййсйад йсйдсадсса
даддайййсд ссассйасйа ййдссадаай дйдсйдайса сасссйасас ййййддйсад
ддсасаааас йддаааййаа дсдйасддйд дсйдсассай сйдйсййсай сййсссдсса
йсйдайдадс адййдааайс йддаасйдсс йсйдййдйдй дссйдсйдаа йаасййсйай
сссадададд ссааадйаса дйддааддйд дайаасдссс йссаайсддд йаасйсссад
дададйдйса сададсадда садсааддас адсассйаса дссйсадсад сасссйдасд
сйдадсааад садасйасда дааасасааа дйсйасдссй дсдаадйсас ссайсадддс
сйдадсйсдс ссдйсасааа дадсййсаас аддддададй дййда
- 131 029419
<210> 114
<211> 56
<212> Белок <213> Ното зар1епз
<400> 114
Суз Суз Ьеи О1у Туг ТЬг Азр Агд 11е Ьеи Н1з Рго Ьуз РЬе 11е Уа1
1 5 10 15
О1у РЬе ТЬг Агд О1п Ьеи А1а Азп О1и О1у Суз Азр 11е Азп А1а 11е
20 25 30
11е РЬе Н1з ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз Ьеи Зег Уа1 Суз А1а Азп Рго Ьуз О1п
35 40 45
ТЬг Тгр Уа1 Ьуз Туг 11е Уа1 Агд
50 55
<210> 115
<211> 53
<212> Белок
<213> Ното зартепз
<400> 115
Суз Суз Ьеи Ьуз Туг Туг О1и Ьуз Уа1 Ьеи Рго Агд Агд Ьеи Уа1 Уа1
1 5 10 15
О1у Туг Агд Ьуз А1а Ьеи Азп Суз Н1з Ьеи Рго А1а 11е 11е РЬе Уа1
20 25 30
ТЬг Ьуз Агд Азп Агд О1и Уа1 Суз ТЬг Азп Рго Азп Азр Азр Тгр Уа1
35 40 45
О1п О1и Туг 11е Ьуз
50
<210> 116
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 116
О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег
1 5 10 15
<210> 117 <211> 11 <212> Белок
- 132 029419
<213> Ното зарбепз
<400> 117
Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 1 5 10

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело против лиганда 20 СС-хемокина человека (ССЬ20) или его антигенсвязывающая часть, содержащие СИК1, СИК2 и СИК3 тяжелой цепи, и СИК1, СИК2 и СИК3 легкой цепи, где указанные СИК1, СИК2 и СИК3 тяжелой цепи и СИК1, СИК2 и СИК3 легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
    a) 8ЕО ГО N0: 60, 64, 67, 70, 73 и 75 соответственно;
    b) 8Е0 ГО N0: 60, 64, 67, 71, 73 и 75 соответственно;
    c) 8Е0 ГО N0: 60, 63, 67, 70, 73 и 75 соответственно; б) 8Е0 ГО N0: 60, 63, 67, 71, 73 и 75 соответственно; е) 8Е0 ГО N0: 61, 65, 68, 70, 73 и 75 соответственно;
    £) 8Е0 ГО N0: 61, 65, 68, 71, 73 и 75 соответственно;
    д) 8Е0 ГО N0: 77, 79, 67, 70, 73 и 75 соответственно;
    Ь) 8Е0 ГО N0: 77, 79, 67, 71, 73 и 75 соответственно; ί) 8Е0 ГО N0: 78, 80, 68, 70, 73 и 75 соответственно; и _)) 8Е0 ГО N0: 78, 80, 68, 71, 73 и 75 соответственно.
  2. 2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где:
    a) указанная тяжелая цепь содержит вариабельный домен, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 9-14; и
    b) указанная легкая цепь содержит вариабельный домен, который содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 15 или 16.
  3. 3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.2, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи и указанный вариабельный домен легкой цепи соответственно содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
    a) 8ЕО ГО N0: 9 и 15;
    b) 8ЕО ГО N0: 9 и 16;
    c) 8ЕО ГО N0: 10 и 16; б) 8ЕО ГО N0: 11 и 15;
    е) 8ЕО ГО N0: 11 и 16;
    £) 8ЕО ГО N0: 12 и 16;
    д) 8ЕО ГО N0: 13 и 16; и
    Ь) 8ЕО ГО N0: 14 и 16.
  4. 4. Моноклональное антитело по п.1, где:
    a) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-6 без сигнальной последовательности и 8Е0 ГО N0: 108; или
    b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-6 без сигнальной последовательности и 8Е0 ГО N0: 108, где указанная аминокислотная последовательность лишена С-концевого остатка лизина; и
    c) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 7 и 8 без сигнальной последовательности и 8Е0 ГО N0: 110 и 112.
  5. 5. Моноклональное антитело по п.4, где указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь соответственно содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
    a) 8ЕО ГО N0: 1 и 7;
    b) 8ЕО ГО N0: 1 и 8;
    c) 8ЕО ГО N0: 2 и 8; б) 8ЕО ГО N0: 3 и 7;
    е) 8ЕО ГО N0: 3 и 8;
    £) 8ЕО ГО N0: 4 и 8; д) 8ЕО ГО N0: 5 и 8;
    Ь) 8ЕО ГО N0: 6 и 8;
    ί) 8ЕО ГО N0: 108 и 110; и
    Ц 8ЕО ГО N0: 108 и 112;
    где 8Е0 ГО N0: 1-8 лишены сигнальных последовательностей.
  6. 6. Моноклональное антитело по п.5, где 8Е0 ГО N0: 1-8 лишены С-концевого остатка лизина.
  7. 7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-6, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
    - 133 029419
  8. 8. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, где указанное антитело содержит константный домен 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4 человека.
  9. 9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где:
    a) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 5>ЕС ГО N0: 39; и
    b) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 5>ЕС ГО N0: 40.
  10. 10. Антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-3, 7 или 9, где указанная антигенсвязывающая часть представляет собой одноцепочечное антитело, Εν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Εά, одноцепочечную молекулу Εν ^Εν), биспецифический одноцепочечный димер Εν, диантитело, антитело с делецией домена или однодоменное антитело (бАЬ).
  11. 11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-10, где указанные антитело или антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из:
    a) не связывается с ССЬ16 человека;
    b) связывается с ССЬ20 яванского макака или макака-резус, но не с ССЬ20 мыши или крысы;
    c) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека 70 пМ или менее при использовании анализа на основе моновалентного поверхностного плазмонного резонанса;
    ά) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека 12 пМ или менее при использовании анализа на основе бивалентного поверхностного плазмонного резонанса;
    е) имеет аффинность связывания с ССЬ20 человека, превышающую аффинность связывания с ССК6 человека;
    Г) имеет селективность в отношении ССЬ20 человека относительно СХ3СЬ1, СХСЬ1, СХСЬ2, СХСЬ4, СХСЬ8, СХСЬ9, СХСЬ10, СХСЬ12, СХСЬ13, СХСЬ16, ССЬ1, ССЬ2, ССЬ3, ССЬ4, ССЬ5, ССЬ7, ССЬ11, ССЬ13, ССЬ16, ССЬ17, ССЬ19, ССЬ21, ССЬ22, ССЬ24, ССЬ25, ССЬ27, ССЬ28 или ХСЬ1 человека;
    д) снижает индуцируемый ССЬ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток с 1С50 1,7 нМ или менее;
    H) снижает индуцируемый ССЬ20 хемотаксис ССК6+ клеток ш νί\Ό;
    ί) снижает индуцируемый ССЬ20 человека хемотаксис ССК6+ клеток ш уйго;
    _() уменьшает прогрессирование симптомов артрита у индивидуума; к) уменьшает остеопороз, эрозию костей или разрастание костей у индивидуума;
    I) снижает уровни олигомерного матриксного белка хрящей (СОМР) в сыворотке у индивидуума; т) снижает уровни мРНК КАМУЕ КАМЕ ТКАР или катепсина К у индивидуума;
    и) уменьшает прогрессирование атопического дерматита у индивидуума; и о) уменьшает прогрессирование аллергического контактного дерматита у индивидуума.
  12. 12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая:
    a) тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-11;
    b) легкую цепь антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-11; или
    c) тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающей части и легкую цепь антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-11.
  13. 13. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.12 в качестве лекарственного средства для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из ассоциированного с ССК6 состояния, аутоиммунного или воспалительного состояния, злокачественной опухоли, В-клеточной злокачественной опухоли, аденокарциномы молочной железы, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, аденокарциномы поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, хронического гепатита, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, остеопороза, пародонтоза, повреждений суставов конечностей дистальнее локтя или колена, эритемы, опухания, увеличенных уровней в сыворотке олигомерного матриксного белка хряща (СОМР), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (КАNК^), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (КАNК), увеличенных уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТКАР), увеличенных уровней мРНК катепсина К, атопического дерматита и аллергического контактного дерматита.
  14. 14. Рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.
  15. 15. Клетка-хозяин для экспрессии антитела против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, содержащая первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-11, причем указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с элементом контроля экспрессии, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-11, причем указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с элементом контроля экспрессии.
  16. 16. Способ экспрессии антитела против ССЬ20 человека или его антигенсвязывающей части, включающий поддержание клетки-хозяина по п.15 в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его части.
    - 134 029419
  17. 17. Композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель, для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из ассоциированного с ССР6 состояния, аутоиммунного или воспалительного состояния, злокачественной опухоли, В-клеточной злокачественной опухоли, аденокарциномы молочной железы, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, аденокарциномы поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, хронического гепатита, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, остеопороза, пародонтоза, повреждений суставов конечностей дистальнее локтя или колена, эритемы, опухания, увеличенных уровней в сыворотке олигомерного матриксного белка хряща (СОМР), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (РАПКЬ), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (РЛМК), увеличенных уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТРАР), увеличенных уровней мРНК катепсина К, атопического дерматита и аллергического контактного дерматита.
  18. 18. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из ассоциированного с ССР6 состояния, аутоиммунного или воспалительного состояния, злокачественной опухоли, В-клеточной злокачественной опухоли, аденокарциномы молочной железы, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, аденокарциномы поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, хронического гепатита, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, остеопороза, пародонтоза, повреждений суставов конечностей дистальнее локтя или колена, эритемы, опухания, увеличенных уровней в сыворотке олигомерного матриксного белка хряща (СОМР), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (РАМКВ), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (РАМК), увеличенных уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТРАР), увеличенных уровней мРНК катепсина К, атопического дерматита и аллергического контактного дерматита.
  19. 19. Применение композиции по п.17 для лечения состояния, выбранного из группы, состоящей из ассоциированного с ССР6 состояния, аутоиммунного или воспалительного состояния, злокачественной опухоли, В-клеточной злокачественной опухоли, аденокарциномы молочной железы, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, аденокарциномы поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, ревматоидного артрита, псориаза, атопического дерматита, контактного дерматита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, болезни Грэйвса, витилиго, гипертиреоидизма, хронического гепатита, инфекции шейки матки вирусом папилломы человека, фунгоидного микоза, остеопороза, пародонтоза, повреждений суставов конечностей дистальнее локтя или колена, эритемы, опухания, увеличенных уровней в сыворотке олигомерного матриксного белка хряща (СОМР), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (РАНКВ), увеличенных уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (РАНК), увеличенных уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТРАР), увеличенных уровней мРНК катепсина К, атопического дерматита и аллергического контактного дерматита.
  20. 20. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения опосредуемого ССЬ20 хемотаксиса ССР6+ клеток ίη νίνο или ίη νίΐτο.
  21. 21. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения уровней олигомерного матриксного белка хряща (СОМР) в сыворотке у пациента с артритом.
  22. 22. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (РАККЬ) в тканях сустава пациента с артритом.
  23. 23. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (РАИК) в тканях сустава пациента с артритом.
  24. 24. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТРАР) в тканях сустава пациента с артритом.
  25. 25. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.111 для снижения уровней мРНК катепсина К в тканях сустава пациента с артритом.
  26. 26. Применение композиции по п.17 для снижения опосредуемого ССЬ20 хемотаксиса ССР6+ клеток у индивидуума.
  27. 27. Применение композиции по п.17 для снижения опосредуемого ССЬ20 хемотаксиса ССР6+ клеток ίη νίΐτο.
  28. 28. Применение композиции по п.17 для снижения уровней олигомерного матриксного белка хряща
    - 135 029419
    (СОМР) в сыворотке у пациента с артритом.
  29. 29. Применение композиции по п.17 для снижения уровней мРНК активатора рецептора для лиганда ядерного фактора кВ (КАNК^) в тканях сустава пациента с артритом.
  30. 30. Применение композиции по п.17 для снижения уровней мРНК активатора рецептора для ядерного фактора кВ (КАNК) в тканях сустава пациента с артритом.
  31. 31. Применение композиции по п.17 для снижения уровней мРНК устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТКАР) в тканях сустава пациента с артритом.
  32. 32. Применение композиции по п.17 для снижения уровней мРНК катепсина К в тканях сустава пациента с артритом.
    Р4/80
    Норма ννί Гетерозигота КО
EA201390738A 2010-11-19 2011-11-18 Нейтрализующие антитела против ccl20 EA029419B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41561410P 2010-11-19 2010-11-19
PCT/US2011/061525 WO2012068540A2 (en) 2010-11-19 2011-11-18 Neutralizing anti-ccl20 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390738A1 EA201390738A1 (ru) 2013-12-30
EA029419B1 true EA029419B1 (ru) 2018-03-30

Family

ID=46084688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390738A EA029419B1 (ru) 2010-11-19 2011-11-18 Нейтрализующие антитела против ccl20

Country Status (24)

Country Link
US (3) US8491901B2 (ru)
EP (1) EP2640744A4 (ru)
JP (3) JP5996549B2 (ru)
KR (1) KR101919170B1 (ru)
CN (1) CN103874707B (ru)
AR (1) AR084141A1 (ru)
AU (2) AU2011329647B2 (ru)
BR (1) BR112013012396A2 (ru)
CA (1) CA2818548A1 (ru)
CL (1) CL2013001403A1 (ru)
CO (1) CO6761352A2 (ru)
CR (1) CR20130228A (ru)
DO (1) DOP2013000111A (ru)
EA (1) EA029419B1 (ru)
IL (1) IL226383B (ru)
MA (1) MA34738B1 (ru)
MX (1) MX361929B (ru)
NZ (1) NZ611269A (ru)
PE (2) PE20180249A1 (ru)
SG (2) SG10201509499RA (ru)
TW (1) TWI589587B (ru)
UA (1) UA114077C2 (ru)
WO (1) WO2012068540A2 (ru)
ZA (3) ZA201303571B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201509499RA (en) * 2010-11-19 2015-12-30 Eisai R&D Man Co Ltd Neutralizing anti-ccl20 antibodies
CN105017420B (zh) 2012-02-17 2019-05-28 西雅图基因公司 针对整联蛋白αvβ6的抗体和使用该抗体治疗癌症
US20150368329A1 (en) * 2012-10-15 2015-12-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of Treating Ocular Diseases
CA2948275C (en) 2014-04-08 2023-10-17 Boston Pharmaceuticals Inc. Binding molecules specific for il-21 and uses thereof
JP2017517506A (ja) 2014-05-21 2017-06-29 ファイザー・インコーポレイテッド 癌を処置するための抗ｃｃｒ４抗体および４−１ｂｂアゴニストの併用
MA41480A (fr) * 2014-10-17 2017-12-19 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticorps qui se lient au ccr6 et leurs utilisations
CA2970857A1 (en) * 2014-12-17 2016-06-23 Cancer Research Technology Ltd Anti-cxcl12 antibody molecules and their uses
US11571462B2 (en) 2015-06-03 2023-02-07 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
WO2016196429A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Medical College Of Wisconsin, Inc. An engineered ccl20 locked dimer polypeptide
JP6895946B2 (ja) * 2015-07-14 2021-06-30 メディミューン，エルエルシー 癌の治療用組成物及び方法
WO2017064564A2 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Therapeutic regimens for treating psoriatic arthritis with an anti-ccl20 antibody
JP2019506390A (ja) * 2016-01-21 2019-03-07 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 合成オピオイドワクチン
KR20180104036A (ko) 2016-01-22 2018-09-19 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-응고 인자 xi 항체
TWI802193B (zh) 2016-06-14 2023-05-11 美商默沙東有限責任公司 抗凝血因子ｘｉ抗體
SG11201903800XA (en) * 2016-11-14 2019-05-30 Dinona ANTIBODY BINDING SPECIFICALLY TO CD66c AND USE THEREOF
FR3072779A1 (fr) * 2017-10-19 2019-04-26 Sinnovial Procede d'estimation de l'efficacite d'un modulateur de la costimulation des lymphocytes t contre la polyarthrite rhumatoide apres reponse inadequate a une biotherapie
WO2019094608A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Denali Therapeutics Inc. Anti-bace1 antibodies and methods of use thereof
WO2019094595A2 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 Pinteon Therapeutics Inc. Methods and compositions for the generation and use of humanized conformation-specific phosphorylated tau antibodies
WO2020185952A1 (en) * 2019-03-11 2020-09-17 xCella Biosciences, Inc. Cd27-binding antibodies and uses thereof
BR112022009570A2 (pt) * 2019-12-05 2022-08-02 Seagen Inc Anticorpo anti-¿v¿6 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, conjugado anticorpo-fármaco, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para produção de um anticorpo anti-¿v¿6 ou fragmento de ligação ao antígeno, para produção de um conjugado anticorpo anti-¿v¿6-fármaco e para tratamento de câncer em um indivíduo, e, composição farmacêutica
CN113087795A (zh) * 2019-12-23 2021-07-09 上海普铭生物科技有限公司 针对趋化因子cx3cl1的抗体及其应用
EP4392455A2 (en) * 2021-08-25 2024-07-03 iBio, Inc. Anti-cd-25 antibody
CN117209603B (zh) * 2021-12-02 2024-02-27 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049683A1 (en) * 2000-12-05 2003-03-13 Bowdish Katherine S. Rationally designed antibodies
US20030103976A1 (en) * 1997-04-01 2003-06-05 Sankyo Company, Limited Anti-fas antibodies
US20050069541A1 (en) * 2003-01-24 2005-03-31 Karlik Stephen J. Composition for and treatment of demyelinating diseases and paralysis by administration of remyelinating agents
US20060228349A1 (en) * 2004-10-25 2006-10-12 Paul Acton Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US20060263364A1 (en) * 1996-11-27 2006-11-23 Vicari Alain P Mammalian chemokines; related reagents
US20090162931A1 (en) * 2007-11-08 2009-06-25 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
WO2009156994A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Ccl20-specific antibodies for cancer therapy
US20100056764A1 (en) * 2007-12-14 2010-03-04 Novo Nordisk A/S Antibodies against human NKG2D and uses thereof
WO2010037837A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4897348A (en) 1983-08-25 1990-01-30 Sri International Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-III and analogs thereof
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
AU634508B2 (en) 1988-12-08 1993-02-25 Sandoz Ag Neutrophil-activating peptide-2
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5179078A (en) 1989-05-12 1993-01-12 Dana Farber Cancer Institute Method of suppressing tumor formation in vivo
US5212073A (en) 1989-05-12 1993-05-18 Genetics Institute, Inc. Process for producing human JE cytokine
ATE124421T1 (de) 1989-09-25 1995-07-15 Genetics Inst Verfahren zur wachstumshemmung von stammzellen.
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6750325B1 (en) 1989-12-21 2004-06-15 Celltech R&D Limited CD3 specific recombinant antibody
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
NZ237202A (en) 1990-02-23 1994-01-26 Bristol Myers Squibb Co Composition containing beta-lactam antibiotic and cationic oligopeptide
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
ATE177472T1 (de) 1990-09-14 1999-03-15 Chiron Corp Expression von makrophagen-induzierbaren proteinen (mips) in hefezellen
US6001649A (en) 1990-11-29 1999-12-14 Societe Anonyme: Elf Sanofi Chemokine NC28 (monocyte chemotactic protein-3, MCP-3) polypeptides and their recombinant production
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5401651A (en) 1991-10-16 1995-03-28 Walz; Alfred DNA encoding ENA-78, a neutrophil activating factor
US5306709A (en) 1991-11-15 1994-04-26 The University Of Pennsylvania Suppression of megakaryocytopoiesis by macrophage inflammatory proteins
US5413778A (en) 1992-10-05 1995-05-09 The Regents Of The University Of Michigan Labelled monocyte chemoattractant protein material and medical uses thereof
US5346686A (en) 1992-10-05 1994-09-13 Mallinckrodt Medical, Inc. Labelled interleukin-8 and medical uses thereof
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
US5474983A (en) 1993-03-15 1995-12-12 The Research Foundation Of State University Of New York Method of inhibiting pro-inflammatory mediator release from basophils and mast cells
WO1994026087A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 Connor Kim C O Recombinant protein production and insect cell culture and process
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
JPH0789866A (ja) 1993-09-21 1995-04-04 Nippon Kayaku Co Ltd 感染防御剤
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
EP0735818B1 (en) 1993-12-22 2004-03-31 Human Genome Sciences, Inc. MACROPHAGE INFLAMMATORY PROTEINS MIP-3, MIP-4 AND MIP-1gamma
KR970703353A (ko) 1994-05-16 1997-07-03 로버트 에이치. 벤슨 단핵구 주화성 단백질-4(monocyte chemotactic protein-4)
JPH10500301A (ja) 1994-05-16 1998-01-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド マクロファージ遊走阻止因子−３
AU708903B2 (en) 1994-08-23 1999-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine polypeptides
JPH10505493A (ja) 1994-08-23 1998-06-02 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒトケモカインベータ−９
US5981230A (en) 1994-08-23 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotide encoding chemokine β-4
EP1006188B1 (en) 1994-08-23 2006-12-27 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine polypeptides
EP0777494B1 (en) 1994-08-23 2004-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine polypeptides
US6174995B1 (en) 1994-08-23 2001-01-16 Haodong Li Human chemokines, CKβ4 and CKβ10/MCP-4
US6458349B1 (en) 1995-06-02 2002-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine β-4 polypeptides
AU3681795A (en) 1994-09-23 1996-04-09 University Of Nebraska Board Of Regents Polypeptide agonists and antagonists of human interleukin-8
KR100507431B1 (ko) 1994-11-07 2005-12-21 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 종양괴사인자-γ
US5602008A (en) 1994-11-29 1997-02-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. DNA encoding a liver expressed chemokine
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
JPH11507205A (ja) 1995-04-27 1999-06-29 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子受容体
EP0833914A4 (en) 1995-06-05 2003-05-28 Human Genome Sciences Inc HUMAN CHEMOKINE BETA-11 AND ALPHA-1
WO1996039520A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine beta-12
EP0832233B1 (en) 1995-06-06 2004-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine beta-13
ZA968896B (en) 1995-10-24 1997-04-24 Smithkline Beecham Corp Method of mobilizing hematopoietic stem cells
EP0871664B1 (en) 1995-10-24 2004-01-02 Smithkline Beecham Corporation Mobilization of hematopoietic stem cells using a chemokine
WO1997031098A1 (en) 1996-02-23 1997-08-28 Human Genome Sciences, Inc. Human chemokine polypeptides
WO1997033904A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU733925C (en) 1996-03-27 2002-06-13 Icos Corporation Monocyte chemotactic protein-5 materials and methods
US6290948B1 (en) 1996-05-14 2001-09-18 Smithkline Beecham Corporation Method of treating sepsis and ARDS using chamohine beta-10
AU3574997A (en) 1996-07-05 1998-02-02 Schering Corporation Mammalian chemokine reagents
ES2316153T3 (es) 1996-08-16 2009-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Endoquina alfa humana.
AU4055697A (en) 1996-08-16 1998-03-06 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
GB9617923D0 (en) 1996-08-28 1996-10-09 Smithkline Beecham Plc Novel receptor
WO1998011226A2 (en) 1996-09-10 1998-03-19 Schering Corporation Mammalian chemokines, related reagents
WO1998014573A1 (en) 1996-09-30 1998-04-09 The General Hospital Corporation Mcp-4 and mcp-5: novel chemokines
WO1998017800A1 (fr) 1996-10-17 1998-04-30 Shionogi & Co., Ltd. Larc, nouvelle chimiokine cc humaine
KR20050004269A (ko) 1996-10-25 2005-01-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 뉴트로킨 알파
HUP0000316A2 (en) 1996-11-15 2000-07-28 Exodus chemokine materials and methods
DE69837996T2 (de) 1997-01-14 2008-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrosefaktor-rezeptoren 6 alpha& 6 beta
JP2001505060A (ja) 1997-01-14 2001-04-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子受容体 ５
PT1012274E (pt) 1997-01-28 2007-08-14 Craig A Rosen Receptor 4 contendo um domínio de morte (dm4; receptor de morte 4), membro da super-família do ftn e ligação a liart (ap02)
CN1184315C (zh) 1997-03-17 2005-01-12 人类基因组科学公司 包含死亡结构域的受体－5
CA2287876A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Rat st38.2 chemokine
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
CA2292790A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor tr10
JP2002503963A (ja) 1997-06-11 2002-02-05 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子受容体ｔｒ９
IL138330A0 (en) 1998-03-18 2001-10-31 Corixa Corp Polynucleotides, polypeptides and pharmaceutical compositions for treating lung cancer
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
WO2000046248A1 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Schering Corporation Use of agonists or antagonists of mip-3a in therapy
US6645491B1 (en) 1999-02-03 2003-11-11 Schering Corporation Method for treating inflammatory conditions using an antibody to MIP-3α
GB2361704C (en) 2000-03-03 2006-08-02 Cambridge Antibody Tech Human antibodies against eotaxin and their use
WO2002032456A1 (fr) 2000-10-13 2002-04-25 Teijin Limited Remedes ou agents preventifs destines a l'arthrite rhumatoide
US7468253B2 (en) 2001-06-07 2008-12-23 Chemocentryx, Inc. Method for multiple chemokine receptor screening for antagonists using RAM assay
CA2449628C (en) 2001-06-07 2008-05-06 Zheng Wei Cell migration assay
US7442512B2 (en) 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
AU2003225237A1 (en) 2002-05-01 2003-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to chemokine beta-4
US7709224B2 (en) 2003-06-03 2010-05-04 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site
CN1898267B (zh) 2003-11-01 2012-05-23 默克专利股份有限公司 修饰的抗cd52抗体
HUE042689T2 (hu) 2005-02-08 2019-07-29 Genzyme Corp TGFbéta elleni antitestek
JP2009096716A (ja) * 2006-01-19 2009-05-07 Eisai R & D Management Co Ltd 抗ｃｃｌ２０抗体による自己免疫疾患の治療
SG10201509499RA (en) * 2010-11-19 2015-12-30 Eisai R&D Man Co Ltd Neutralizing anti-ccl20 antibodies
WO2013005649A1 (ja) * 2011-07-01 2013-01-10 協和発酵キリン株式会社 抗ヒトｃｃｒ６抗体
JP7089866B2 (ja) 2017-12-22 2022-06-23 セーレン株式会社 開口部を有するシート状物およびその製造方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060263364A1 (en) * 1996-11-27 2006-11-23 Vicari Alain P Mammalian chemokines; related reagents
US20030103976A1 (en) * 1997-04-01 2003-06-05 Sankyo Company, Limited Anti-fas antibodies
US20030049683A1 (en) * 2000-12-05 2003-03-13 Bowdish Katherine S. Rationally designed antibodies
US20050069541A1 (en) * 2003-01-24 2005-03-31 Karlik Stephen J. Composition for and treatment of demyelinating diseases and paralysis by administration of remyelinating agents
US20060228349A1 (en) * 2004-10-25 2006-10-12 Paul Acton Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US20090162931A1 (en) * 2007-11-08 2009-06-25 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
US20100056764A1 (en) * 2007-12-14 2010-03-04 Novo Nordisk A/S Antibodies against human NKG2D and uses thereof
WO2009156994A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Ccl20-specific antibodies for cancer therapy
WO2010037837A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELLIOTT et al., Fine-Structure Epitope Mapping of Antierythropoietin Monoclonal Antibodies Reveals a Model of Recombinant Human Erythropoietin Structure. Blood. 1996, Vol. 87(7), p. 2702-13. Abstract; and pg 2707, Fig 3. *
KATCHAR et al., MIP-3alpha neutralizing monoclonal antibody protects against TNBS-induced colonic injury and inflammation in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007, Vol. 292(5), p. G1263-71. Entire documentation especially. Abstract *
LIAO et al., Human B Cells Become Highly Responsive to Macrophage-lnftammatory Protein-3/CC Chemokine Ligand-20 After Cellular Activation Without Changes in CCR6 Expression or Ligand Binding. J Immunol. 2002, Vol. 168(10), 4871-80. Entire documentation especially. Abstract *
RD_system_MAB360, Human CCL20/MIP-3a Antibody, 07 October 2010, [online]. [Retrieved on 2012.02.29]. Retrieved from the Internet: <URL:http://www.rndsystems.com/pdf/mab360.pdf> Specificity; Source; and Background *
SOGA et al., Use of amino acid composition to predict epitope residues of individual antibodies. Protein Eng Des Sel. 2010 Jun, Vol. 23(6), p. 441-8. Epub 2010 Mar 19. Entire documentation especially. Abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2640744A4 (en) 2014-05-28
JP5996549B2 (ja) 2016-09-21
MX361929B (es) 2018-12-19
AR084141A1 (es) 2013-04-24
CA2818548A1 (en) 2012-05-24
SG10201509499RA (en) 2015-12-30
DOP2013000111A (es) 2014-06-15
US9133273B2 (en) 2015-09-15
JP2018042578A (ja) 2018-03-22
US20120148592A1 (en) 2012-06-14
TW201305204A (zh) 2013-02-01
US8491901B2 (en) 2013-07-23
AU2011329647A1 (en) 2013-05-02
US20160046707A1 (en) 2016-02-18
MX2013005532A (es) 2013-09-26
EP2640744A2 (en) 2013-09-25
CR20130228A (es) 2013-09-18
JP2016093195A (ja) 2016-05-26
US9809647B2 (en) 2017-11-07
MA34738B1 (fr) 2013-12-03
KR20130135872A (ko) 2013-12-11
IL226383B (en) 2018-07-31
ZA201406017B (en) 2017-06-28
JP2014502154A (ja) 2014-01-30
IL226383A0 (en) 2013-07-31
WO2012068540A2 (en) 2012-05-24
CL2013001403A1 (es) 2014-08-08
UA114077C2 (xx) 2017-04-25
ZA201303571B (en) 2014-12-23
ZA201701051B (en) 2018-05-30
NZ611269A (en) 2015-03-27
CO6761352A2 (es) 2013-09-30
CN103874707B (zh) 2017-04-19
AU2011329647B2 (en) 2015-10-22
AU2016200359A1 (en) 2016-02-11
AU2016200359B2 (en) 2018-05-24
EA201390738A1 (ru) 2013-12-30
PE20180249A1 (es) 2018-02-02
SG191716A1 (en) 2013-08-30
TWI589587B (zh) 2017-07-01
US20140045215A1 (en) 2014-02-13
JP6289520B2 (ja) 2018-03-07
PE20140633A1 (es) 2014-05-30
BR112013012396A2 (pt) 2020-11-10
CN103874707A (zh) 2014-06-18
KR101919170B1 (ko) 2018-11-15
WO2012068540A3 (en) 2012-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029419B1 (ru) Нейтрализующие антитела против ccl20
US11634490B2 (en) Blocking antibodies against CD47 and methods of use thereof
JP7328658B2 (ja) 抗ｐｄ－ｌ１／抗４－１ｂｂ二重特異性抗体およびその使用
KR102662387B1 (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
US20200017599A1 (en) ANTI-C5a RECEPTOR ANTIBODIES
CN110366560B (zh) 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP7022067B2 (ja) Ｆｏｘｐ３由来のペプチドに特異的なｔ細胞受容体様抗体
JP2019534859A (ja) Ｐｄ−１結合タンパク質を使用して白斑を治療する方法
AU2018242156B2 (en) Compositions and methods for detecting and treating prostate cancer using progastrin binding molecule
US11883495B2 (en) Anti-CD47 antibodies and uses thereof
JP2023508277A (ja) 新規のｄｄｒ１抗体およびその使用
JP2020532279A (ja) 抗ｇｉｔｒ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途
KR20240091226A (ko) 신규 항 l1cam 항체
CN115947855B (zh) 抗cd24抗体的制备及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU