TWI589587B - 中和性抗－ｃｃｌ２０抗體 - Google Patents

中和性抗－ｃｃｌ２０抗體 Download PDF

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西村美由希
村本賢三
堀添達央
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Description

中和性抗-CCL20抗體
本發明係關於特異性針對人類CC趨化因子配體20(CCL20)之新穎的人類化、嵌合及鼠類抗體。本發明之人類化抗體尤其較佳適用作用以治療發炎性疾病及自體免疫疾病之治療劑。
本申請案主張2010年11月19日申請之美國臨時專利申請案第61/415,614號之優先權。該申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
本申請案包含序列表，其以ASCII之格式呈送且其全部揭示內容以全文引用的方式併入本文中。該ASCII副本係於2011年12月14日製作，檔名為106806WO1.txt，檔案大小113,712 byte。
免疫系統為身體用以區別非自體(例如外來生物體或物質)與自體之極複雜生物電路。體內之非自體偵測可引起發炎，其中各種細胞及分子組分經安排對由非自體生物體或物質所引起之可能有害的事件有反應。儘管發炎過程有助於保護身體免受外來攻擊，但免疫系統之下調可導致不良後果，諸如自身攻擊，例如自體免疫疾病。藉由改變諸如趨化因子之發炎性分子之功能，有可能減緩與免疫/發炎性反應有關之病症的起始及進展。
趨化因子為在發炎中起關鍵作用之小型(8-10 kDa)蛋白質家族。在發炎過程中，趨化因子在有害刺激物部位局部產生且充當中心角色以募集表現其同源受體，即7種跨膜G蛋白偶合受體(GPCR)之免疫細胞。CCL20，或者稱為肝臟 活化調節趨化因子(LARC)、巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)或Exodus-1，為由上皮細胞表現之可溶性趨化因子。已知上皮角質細胞及滑膜襯裡細胞在體內平衡以及發炎性及病理性病狀(諸如癌症、牛皮癬及類風濕性關節炎)期間會產生大量CCL20。CCL20之同源受體為CC趨化因子受體6(CCR6)；CCL20為已知與CCR6相互作用之唯一趨化因子。回應於CCL20信號，諸如未成熟樹突狀細胞(DC)、效應子/記憶T細胞及B細胞之具有CCR6之免疫細胞遷移且浸潤至周圍組織中，因此活化發炎性級聯反應。
因為在由諸如介白素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)之發炎性細胞因子誘發之發炎中CCL20表現顯著提高，所以認為CCL20-CCR6相互作用在病理性發炎過程中起作用。
類風濕性關節炎(RA)為一種最常見之自體免疫疾病。RA之最初病徵通常為滑膜炎，其表現為關節腫脹疼痛。儘管起始滑膜炎之特定因素仍未知，但認為滑膜襯裡上皮細胞及滑液纖維母細胞為發炎反應之主要誘發物。來自RA患者之滑液有效地化學引誘人類單核細胞及促炎性T輔助17(Th17)細胞，接著誘發且加重RA發炎過程。因為反應性滑液細胞能夠產生大量CCL20(尤其在IL-1β及TNF-α影響下)，同時CCR6為Th17細胞之主要受體，所以認為CCL20-CCR6相互作用在發炎過程中起關鍵作用。
CCL20-CCR6相互作用亦可在某些類型皮炎中起重要作用。牛皮癬例如由皮膚中之有害牛皮癬事件(由環境及/或遺傳因素誘發)起始，之後浸潤Th17細胞。因為CCR6表現於Th17細胞、B細胞、樹突狀細胞及組織損傷效應T細胞 之表面上，所以CCL20可代表牛皮癬中此等細胞類型之主要化學引誘劑。CCL20-CCR6相互作用之重要性的進一步證明可見於使用介白素-23(IL-23)誘發之小鼠牛皮癬模型之研究中(Hedrick等人，J.Clin.Invest.119：2317-2329(2009))。在此模型中，注射IL-23會產生介白素22(IL-22)依賴性牛皮癬性炎症。然而，當注射IL-23時Ccr6 -/-小鼠不會呈現牛皮癬樣症狀，從而指示產生牛皮癬需要CCR6。
人類角質細胞尤其在源自Th17之細胞因子介白素17(IL-17)、IL-22及TNF-α影響下可產生大量CCL20。儘管CCL20及CCR6在正常皮膚中很少偵測到，但在異位性皮炎及膿皰性牛皮癬中皆展現表現含量增加。在人類皮炎病灶之微觀免疫組織化學分析中可觀測到CCL20之強烈誘導及CCR6+細胞之積聚。此等觀測為CCL20及CCR6在皮炎發炎過程中之作用提供額外證明。
可將治療免疫病症之現用MAb生物製劑大致分為三組：免疫刺激細胞因子之抑制劑(例如抗-TNF-α MAb)、免疫細胞消除劑(例如抗-CD20 MAb)及輔助分子之阻斷劑(例如阿巴西普(Abatacept))。此等生物製劑可能適用於治療發炎性疾病；然而，由於對此等治療最初無反應或反應速率逐漸降低，故急需具有新穎作用機制之替代生物製劑以滿足患有例如CCL20/CCR6介導之病症的患者之醫學需要。本發明之抗體表示該等替代生物製劑。
本發明係關於中和性抗-CCL20抗體或其抗原結合部 分。在某些實施例中，抗-CCL20抗體為人類化抗人類CCL20抗體，其可包含小鼠抗人類CCL20抗體之互補決定區(CDR)。在一些實施例中，抗-CCL20抗體為小鼠或嵌合抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分結合至人類CCL20。在一些實施例中，抗體或部分不結合至人類CCL16。
本發明抗體特異性結合CCL20。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分結合至食蟹獼猴及/或恆河猴CCL20以及人類CCL20。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分不會結合至小鼠及/或大鼠CCL20。在一個實施例中，抗-CCL20抗體或抗原結合部分結合至人類、食蟹獼猴及恆河猴CCL20，而不結合至小鼠及大鼠CCL20。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對人類CCL20之結合親和力(KD)小於：-1 nM、500 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM或50 pM，使用單價表面電漿子共振分析法，或-1 nM、500 pM、100 pM、75 pM、50 pM、25 pM、20 pM、15 pM、14 pM、13 pM、12 pM、11 pM、10 pM、9 pM、8 pM、7 pM、6 pM或5 pM，使用二價表面電漿子共振分析法。
在某些實施例中，抗體或部分對人類CCL20之結合親和力大於對人類CCR6之結合親和力。
在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對人類CCL20之ka小於100、90、80、70、60、50、40或30(×105 M-1 s-1)。在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對人類CCL20之kd小於10、9、8、7、6、5、4或3(×10-5 s-1)。
在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對恆河猴CCL20之ka小於100、90、80、70、60、50、40或30(×105 M-1 s-1)。在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對恆河猴CCL20之kd小於50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2(×10-5 s-1)。在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對恆河猴CCL20之KD小於100、90、80、70、60、50、40、30、20或10 pM。
在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對食蟹獼猴CCL20之ka小於500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40或30(×105 M-1 s-1)。在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對食蟹獼猴CCL20之kd小於50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6(×10-5 s-1)。在一些實施例中，使用二價表面電漿子共振分析法，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對食蟹獼猴CCL20之KD小於100、 90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16或15 pM。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分結合至人類CCL20，其中EC50小於100、90、80、70、60、50、40、39、38、37、36、35或34 pM。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分結合至恆河猴CCL20，其中EC50小於500、400、300、200、150、140、130、120、110、100、90、80、70、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50 pM。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分結合至食蟹獼猴CCL20，其中EC50小於500、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、109、108、107、106、105、104、103或102 pM。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分對人類CCL20之選擇性優於其他人類趨化因子，包括(但不限於)CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28及/或XCL1。在某些實施例中，抗-CCL20抗體或抗原結合部分對人類CCL20之選擇性優於所有該等趨化因子。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性， 其中IC50小於20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.1 nM。在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性，其中IC50小於1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.1 nM。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性，其中IC90小於45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、4.9、4.8、4.7或4.6 nM。在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性，其中IC90小於6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、4.9、4.8、4.7或4.6 nM。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性，其中IC95小於70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8或7 nM。在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性，其中IC95小於10、9.9、9.8、9.7、9.6、9.5、9.4、9.3、9.2、9.1或9 nM。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會活體外降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會活體內降低人類或小鼠CCR6+細胞之人類CCL20誘導之趨化性。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分會減緩個體、例如膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)及/或葡萄糖-6-磷酸異構酶(G6PI)誘發之關節炎小鼠模型之關節炎症狀(諸如肘或膝遠端四肢之關節病變及紅斑及腫脹之程度)之進展。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分會減輕個體、例如CIA模型之骨病變，包括骨質疏鬆症、骨侵蝕及/或新骨形成。在一些實施例中，抗體或抗原結合部分會降低個體、例如CIA模型中軟骨寡聚基質蛋白(COMP)血清含量。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分會降低個體、例如CIA模型中之小鼠爪子中核因子B配體之受體活化子(RANKL)、核因子B之受體活化子(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及/或組織蛋白酶K之mRNA含量。 在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分會減輕個體之異位性皮炎症狀(例如乾燥、鱗屑、紅斑、滲泌/結殼及/或表皮脫落)，例如NC/Nga品系小鼠之噁唑酮誘發之異位性皮炎症狀。在一些實施例中，抗體或抗原結合部分會減輕個體之過敏性接觸性皮炎症狀，例如小鼠模型之二硝基氟苯(DNFB)誘發之過敏性接觸性皮炎症狀。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含CDR3(H-CDR3)含SEQ ID NO：67或68之序列之重鏈。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包 含CDR3(L-CDR3)含SEQ ID NO 75之序列之輕鏈。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含序列含SEQ ID NO：67之H-CDR3及序列含SEQ ID NO：75之L-CDR3；或序列含SEQ ID NO：68之H-CDR3及序列含SEQ ID NO：75之L-CDR3。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含CDR1(H-CDR1)、CDR2(H-CDR2)及CDR3(H-CDR3)分別包含以下序列之重鏈：-SEQ ID NO：60、63及67；-SEQ ID NO：60、64及67；-SEQ ID NO：61、65及68；-SEQ ID NO：77、79及67；或-SEQ ID NO：78、80及68。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含CDR1(L-CDR1)、CDR2(L-CDR2)及CDR3(L-CDR3)分別包含以下序列之輕鏈：-SEQ ID NO：70、73及75；或-SEQ ID NO：71、73及75。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含：-H-CDR1，其包含選自由SEQ ID NO：60-62、77及78組成之群的序列；-H-CDR2，其包含選自由SEQ ID NO：63-66及79-81組成之群的序列； -H-CDR3，其包含SEQ ID NO：67或68之序列；-L-CDR1，其包含選自由SEQ ID NO：70-72組成之群的序列；-L-CDR2，其包含SEQ ID NO：73或74之序列；或-L-CDR3，其包含SEQ ID NO：75；或其任何組合。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含分別包含以下序列之H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3：-SEQ ID NO：60、63、67、70、73及75；-SEQ ID NO：60、64、67、70、73及75；-SEQ ID NO：61、65、68、70、73及75；-SEQ ID NO：77、79、67、70、73及75；-SEQ ID NO：78、80、68、70、73及75；-SEQ ID NO：60、63、67、71、73及75；-SEQ ID NO：60、64、67、71、73及75；-SEQ ID NO：61、65、68、71、73及75；-SEQ ID NO：77、79、67、71、73及75；或-SEQ ID NO：78、80、68、71、73及75。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含包括選自由SEQ ID NO：9-14組成之群的序列之重鏈可變域。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含包括選自由SEQ ID NO：39、41及43組成之群的序列之重鏈可變域。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：15或16之序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含包括選自由SEQ ID NO：40、42及44組成之群的序列之輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含分別包含以下序列之重鏈可變域及輕鏈可變域：-SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15；-SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：16；-SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：16；-SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：16；-SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：16；-SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16；或-SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：16。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含分別包含以下序列之重鏈可變域及輕鏈可變域：-SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40；-SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：42；-SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：44； -SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：40；-SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：42；-SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：44；-SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：40；-SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：42；或-SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含具有選自由無信號序列(若存在)且視情況無C端離胺酸之SEQ ID NO：1-6及108組成之群的序列之重鏈。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含具有選自由無信號序列(若存在)之SEQ ID NO：7、8、110及112組成之群的序列之輕鏈。在某些實施例中，抗-CCL20抗體包含分別具有以下序列之重鏈及輕鏈：-SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7；-SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：8；-SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：8；-SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：8；-SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：8；-SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：8； -SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8；-SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：110；或-SEQ ID NO：108及112；該等序列兩者皆無信號序列，SEQ ID NO：1-6及108視情況無C端離胺酸。
本發明亦提供一種抗-CCL20抗體或其抗原結合部分，其包含由選自由SEQ ID NO：25-30組成之群的序列編碼之重鏈可變域。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含由選自由SEQ ID NO：51、53及55組成之群的序列編碼之重鏈可變域。
此外，本發明提供一種抗-CCL20抗體或其抗原結合部分，其包含由SEQ ID NO：31或32之序列編碼之輕鏈可變域。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含由選自由SEQ ID NO：52、54及56組成之群的序列編碼之輕鏈可變域。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含分別由以下序列編碼之重鏈可變域及輕鏈可變域：-SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31；-SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：32； -SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：32；-SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：32；-SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：32；-SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：32；或-SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：32。
在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含分別由以下序列編碼之重鏈可變域及輕鏈可變域：-SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：52；-SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：54；-SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：56；-SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：52；-SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：54；-SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：56；-SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：52；-SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：54；或-SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含藉由選自由SEQ ID NO：17-22及109組成之群的序列編碼之重鏈，該序列缺乏編碼可能存在之信號序列之序列且視情況缺乏編碼C端離胺酸之序列。在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分包含由選自由SEQ ID NO：23、24、111及113組成之群的序列編碼之輕鏈，該序列缺乏編碼可能存在之信號序列之序列。在某些實施例中，抗-CCL20抗體包含分別由以下序列編碼之重鏈及輕鏈： -SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23；-SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24；-SEQ ID NO：1O9及SEQ ID NO：111；或-SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：113；該等序列兩者皆缺乏編碼可能存在之信號序列之序列，SEQ ID NO：17-22及109視情況缺乏編碼C端離胺酸之序列。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分為人類化或嵌合抗-CCL20抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，人類化抗-CCL20抗體或部分之重鏈之構架區利用IGHVI-46＊03人類生殖系基因(參見例如Altschul等人，「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。在某些實施例中，重鏈構架區與 IGHV1-46＊03人類生殖系基因之構架區具有至少50%同源性。舉例而言，重鏈構架區與IGHV1-46＊03人類生殖系基因之構架區可至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或甚至100%一致。在一些實施例中，人類化抗-CCL20抗體或部分之輕鏈之構架區利用IGKV1D-39＊01人類生殖系基因(參見Retter等人，同上)。在某些實施例中，輕鏈構架區與IGKV1D-39＊01人類生殖系基因之構架區具有至少50%同源性。舉例而言，輕鏈構架區與IGKV1D-39＊01人類生殖系基因之構架區可至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或甚至100%一致。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分(達到該部分包含重鏈恆定區之至少一部分之程度)為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在某些實施例中，抗-CCL20抗體或其抗原結合部分具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體為單株抗體。
本發明亦提供一種抗-CCL20抗體或其抗原結合部分，其結合至位於分子之N-迴路及/或β2-β3髮夾形區域之人類CCL20之抗原決定基。在一些實施例中，該抗-CCL20抗體或部分結合至與如本文所述之抗體或部分相同之人類CCL20上之抗原決定基。此外，本發明提供一種抗-CCL20抗體或其抗原結合部分，其與本文所述抗體或部分競爭或 交叉競爭以結合至人類CCL20。
在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分所結合之人類CCL20抗原決定基包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列：-SEQ ID NO：84之殘基7-9；-SEQ ID NO：84之殘基10-19；-SEQ ID NO：84之殘基20-21；及-SEQ ID NO：84之殘基20-22，或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。
在一些實施例中，該人類CCL20抗原決定基進一步包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列：-SEQ ID NO：84之殘基39-55；-SEQ ID NO：84之殘基39-57；-SEQ ID NO：84之殘基56-67；及-SEQ ID NO：84之殘基61-70，或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。
在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含由SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-22、39-55、56-57及61-70、或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基組成之胺基酸序列的任何組合。
在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19及20-22或與SEQ ID NO：84之該 等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-22、39-55、56-57及61-70、或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-22、39-57及61-70、或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。
在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19及20-21或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-21、39-55、56-67及61-70、或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。在某些實施例中，該人類CCL20抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-21、39-57及61-70、或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分所結合之人類CCL20抗原決定基包含一或多個選自殘基7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69及70或其任何組合之SEQ ID NO：84之胺基酸殘基(或與SEQ ID NO：84之該等殘基對應的野生型人類CCL20之殘基)。
本發明亦提供任一本文所述抗-CCL20抗體之抗原結合部分。該抗原結合部分可為例如單鏈抗體、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv二聚體、多價單鏈Fv多聚體、雙功能抗體、功能域缺失抗體(domain-deleted antibody)或單域抗體(dAb)。
本發明亦提供如本文所述之抗體或抗原結合部分之變異體，其中該變異體與抗體或部分之不同之處為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
在一個態樣中，本發明提供一種針對人類CCL20之抗體，其中該抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域分別包含以下序列：-SEQ ID NO：9及15；-SEQ ID NO：9及16；-SEQ ID NO：10及16；-SEQ ID NO：11及15；-SEQ ID NO：11及16；-SEQ ID NO：12及16；-SEQ ID NO：13及16；或-SEQ ID NO：14及16。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：1且輕鏈包含SEQ ID NO：7之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：1而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：7之抗體，其中該 等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：1且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：1而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：2且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：2而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：3且輕鏈包含SEQ ID NO：7之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：3而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：7之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：3且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：3而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該 等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：4且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：4而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：5且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：5而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：6且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：6而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：8之抗體，其中該等胺基酸序列缺乏信號序列。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：108且輕鏈包含SEQ ID NO：110之抗體。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：108而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：110之抗體。
在一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO： 108且輕鏈包含SEQ ID NO：112之抗體。
在另一個態樣中，本發明提供一種重鏈包含SEQ ID NO：108而無C端離胺酸且輕鏈包含SEQ ID NO：112之抗體。
在另一個態樣中，本發明提供一或多個編碼重鏈或其抗原結合部分或輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子，例如分離核酸分子，其中該等重鏈及輕鏈或其抗原結合部分可締合以形成抗-CCL20抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，編碼重鏈或其抗原結合部分之核酸分子包含選自由SEQ ID NO：17-22、25-30及109組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列。 SEQ ID NO：17-22及109之核苷酸序列亦可視情況缺乏編碼可能存在之C端離胺酸之序列。在一些實施例中，編碼輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子包含選自由SEQ ID NO：23、24、31、32、111及113組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列。在一些實施例中，一或多個核酸分子編碼如本文所述之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分及輕鏈或其抗原結合部分。在某些實施例中，一個核酸分子編碼該重鏈或其抗原結合部分與該輕鏈或其抗原結合部分。
在一個實施例中，將編碼重鏈或其抗原結合部分之核酸分子、編碼輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子、或編碼重鏈及輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子用於治療有需要之個體。
在另一個態樣中，本發明提供一種包含編碼如本文所述 之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合部分或兩者之核酸序列的載體。
在另一個態樣中，本發明提供一種表現如本文所述之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合部分或兩者的細胞。
在另一個態樣中，本發明提供一種製造如本文所述之抗體或部分之方法，其包含使如本文所述之細胞維持在適於表現該抗體或部分之條件下。在一些實施例中，該方法包含分離該抗體或部分之步驟。
本發明亦提供一種產生分泌抗-CCL20抗體之融合瘤之方法。在某些實施例中，融合瘤會產生結合至野生型人類CCL20之抗體。本發明亦提供一種由本發明方法所產生之融合瘤。視情況，收集由融合瘤所分泌之單株抗體且可進一步純化(例如實質上純化、分離)。在其他實施例中，該方法進一步包含測定由融合瘤所分泌之單株抗體之核苷酸序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種包含如本文所述之抗體或部分及醫藥學上可接受之媒劑或載劑之組合物。
在一個態樣中，將如本文所述之抗體或部分用作藥劑。在某些實施例中，如本文所述之抗體或部分係用於治療有需要之個體。在特定實施例中，抗體或部分係用於治療CCR6相關病狀、CCL20相關病狀或兩者。該等病狀包括(但不限於)發炎性疾病及自體免疫疾病，特別是關節炎，尤其是類風濕性關節炎、異位性皮炎或過敏性皮炎及牛皮 癬。在另一個特定實施例中，抗體或部分係用於治療癌症。抗體或部分可用於治療例如格雷氏病(Grave's disease)、白斑病、甲狀腺機能亢進、類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、接觸性皮炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、B細胞惡性病、乳腺癌、慢性肝炎、接觸性皮炎、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、子宮頸之人類乳頭狀瘤病毒感染、蕈樣真菌病、胰腺癌、牙周病、甲狀腺乳頭狀癌、掌蹠膿疱疹、與斑丘疹有關之病狀、大皰性表皮鬆解、斑禿、多發性硬化症、多發性肌炎、皮肌炎、貝西氏病(Behcet's disease)、急性全身發疹性膿皰病、血管炎、幼年特發性關節炎、類肉瘤病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、腎臟同種異體移植排斥、移植物抗宿主疾病、肝臟同種異體移植排斥、慢性阻塞性肺病、囊腫性纖維化、絲球體腎炎、呼吸道合胞病毒感染、多發性骨髓瘤及/或蘭格罕氏細胞組織細胞增多病(Langerhans cell histiocytosis)。
在一些實施例中，抗-CCL20抗體或部分係用於降低有需要個體中CCR6+細胞之由CCL20介導之趨化性。
在一些實施例中，本發明提供：
1.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含互補決定區3(CDR3)包含SEQ ID NO：67或68之重鏈。
2.如技術方案1之單株抗體或抗原結合部分，其中該重鏈之互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)及互補決 定區3(CDR3)分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：60、64及67；b)SEQ ID NO：60、63及67；c)SEQ ID NO：61、65及68；d)SEQ ID NO：77、79及67；及e)SEQ ID NO：78、80及68。
3.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含互補決定區3(CDR3)包含SEQ ID NO：75之輕鏈。
4.如技術方案3之單株抗體或抗原結合部分，其中該輕鏈之互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)及互補決定區3(CDR3)分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：70、73及75；及b)SEQ ID NO：71、73及75。
5.如技術方案1或3之抗體或抗原結合部分，其中該抗體之重鏈包含包括SEQ ID NO：67或68之CDR3，且該抗體之輕鏈包含包括SEQ ID NO：75之CDR3。
6.如技術方案2或4之抗體或抗原結合部分，其中該重鏈CDR1、CDR2及CDR3及該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：60、64、67、70、73及75；b)SEQ ID NO：60、64、67、71、73及75； c)SEQ ID NO：60、63、67、70、73及75；d)SEQ ID NO：60、63、67、71、73及75；e)SEQ ID NO：61、65、68、70、73及75；f)SEQ ID NO：61、65、68、71、73及75；g)SEQ ID NO：77、79、67、70、73及75；h)SEQ ID NO：77、79、67、71、73及75；i)SEQ ID NO：78、80、68、70、73及75；及j)SEQ ID NO：78、80、68、71、73及75。
7.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含可變域包含選自SEQ ID NO：9-14之胺基酸序列之重鏈。
8.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含可變域包含SEQ ID NO：15或16之輕鏈。
9.如技術方案7或8之抗體或抗原結合部分，其中該重鏈可變域及該輕鏈可變域分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：9及15；b)SEQ ID NO：9及16；c)SEQ ID NO：10及16；d)SEQ ID NO：11及15；e)SEQ ID NO：11及16；f)SEQ ID NO：12及16；g)SEQ ID NO：13及16；及h)SEQ ID NO：14及16。
10.一種單株抗人類CCL20抗體，其重鏈包含選自由無信號序列之SEQ ID NO：1-6以及SEQ ID NO：108組成之群的胺基酸序列。
11.一種單株抗人類CCL20抗體，其重鏈包含選自由無信號序列之SEQ ID NO：1-6以及SEQ ID NO：108組成之群的胺基酸序列，其中該胺基酸序列缺乏C端離胺酸。
12.一種單株抗人類CCL20抗體，其輕鏈包含選自由無信號序列之SEQ ID NO：7及8以及SEQ ID NO：110及112組成之群的胺基酸序列。
13.如技術方案10至12中任一技術方案之抗體，其中該重鏈及該輕鏈分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：1及7；b)SEQ ID NO：1及8；c)SEQ ID NO：2及8；d)SEQ ID NO：3及7；e)SEQ ID NO：3及8；f)SEQ ID NO：4及8；g)SEQ ID NO：5及8；h)SEQ ID NO：6及8；i)SEQ ID NO：108及110；及j)SEQ ID NO：108及112；其中該等胺基酸序列缺乏可能存在之信號序列，且其中 SEQ ID NO：1-6視情況缺乏C端離胺酸。
14.一種單株抗體，其重鏈包含SEQ ID NO：108且其輕鏈包含SEQ ID NO：110。
15.一種單株抗體，其重鏈包含無C端離胺酸之SEQ ID NO：108且其輕鏈包含SEQ ID NO：110。
16.一種單株抗體，其重鏈包含SEQ ID NO：108且其輕鏈包含SEQ ID NO：112。
17.一種單株抗體，其重鏈包含無C端離胺酸之SEQ ID NO：108且其輕鏈包含SEQ ID NO：112。
18.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其結合至與如技術方案1至17中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分相同的人類CCL20之抗原決定基。
19.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其與如技術方案1至17中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分競爭以結合至人類CCL20。
20.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其與如技術方案1至17中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分交叉競爭以結合至人類CCL20。
21.如技術方案1至12中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體為人類化抗體。
22.如技術方案1至6中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分，其中該重鏈之構架區利用IGHV1-46＊03人類生殖系序列，且其中該輕鏈之構架區利用IGKV1D-39＊01人類生殖系序列。
23.如技術方案1至9及18至22中任一技術方案之單株抗體，其中該抗體包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定域。
24.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其重鏈包含包括選自由SEQ ID NO：39、41及43組成之群的胺基酸序列之可變域。
25.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其輕鏈包含包括選自由SEQ ID NO：40、42及44組成之群的胺基酸序列之可變域。
26.如技術方案24或25之抗體或抗原結合部分，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO：39、41及43組成之群的胺基酸序列，且其中該輕鏈包含選自由SEQ ID NO：40、42及44組成之群的胺基酸序列。
27.如技術方案26之抗體，其中該重鏈及該輕鏈分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：39及40；b)SEQ ID NO：41及42；及c)SEQ ID NO：43及44。
28.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含包括SEQ ID NO：39之重鏈及包括SEQ ID NO：40之輕鏈。
29.如技術方案24至28中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體為嵌合抗體。
30.如技術方案1至9、18至22及24至28中任一技術方案之 抗原結合部分，其中該部分為單鏈抗體、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv二聚體、雙功能抗體、功能域缺失抗體或單域抗體(dAb)。
31.如技術方案1至30中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分具有一或多種選自由以下組成之群的特性：a)不會結合至人類CCL16；b)結合至食蟹獼猴或恆河猴CCL20，而不結合至小鼠或大鼠CCL20；c)對人類CCL20之結合親和力為70 pM或70 pM以下，使用單價表面電漿子共振分析法；d)對人類CCL20之結合親和力為12 pM或12 pM以下，使用二價表面電漿子共振分析法；e)對人類CCL20之結合親和力大於對人類CCR6之結合親和力；f)對人類CCL20之選擇性優於人類CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28或XCL1；g)降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性，其 中IC50為1.7 nM或1.7 nM以下；h)活體內降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性；i)活體外降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性；j)減緩個體之關節炎症狀之進展；k)減緩個體之骨質疏鬆症、骨侵蝕或新骨形成；l)降低個體之軟骨寡聚基質蛋白(COMP)血清含量；m)降低個體之RANKL、RANK、TRAP或組織蛋白酶K之mRNA含量；n)減緩個體之異位性皮炎之進展；及o)減緩個體之過敏性接觸性皮炎之進展。
32.一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其結合至包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列之人類CCL20之抗原決定基：a)SEQ ID NO：84之殘基7-9；b)SEQ ID NO：84之殘基10-19；及c)SEQ ID NO：84之殘基20-22。
33.如技術方案32之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19及20-22。
34.如技術方案32之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原決定基進一步包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列： a)SEQ ID NO：84之39-55；b)SEQ ID NO：84之56-67；及c)SEQ ID NO：84之61-70。
35.如技術方案34之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-22、39-55、56-67及61-70。
36.一種分離核酸分子，其編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分。
37.一種分離核酸分子，其編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之輕鏈或其抗原結合部分。
38.一種分離核酸分子，其編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分及輕鏈或其抗原結合部分。
39.一種分離核酸分子，其編碼單株抗人類CCL20抗體之重鏈或其抗原結合部分，其中該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：17-22、25-30及109組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列。
40.一種分離核酸分子，其編碼單株抗人類CCL20抗體之輕鏈或其抗原結合部分，其中該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：23、24、31、32、111及113組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列。
41.如技術方案39或40之分離核酸分子，其中該核酸分子 包含選自由SEQ ID NO：17-22、25-30及109組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列；且其中該核酸分子進一步包含選自由SEQ ID NO：23、24、31、32、111及113組成之群的核苷酸序列、或無編碼可能存在之信號序列之序列的該核苷酸序列。
42.一種(1)編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分的核酸序列、(2)編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之輕鏈或其抗原結合部分的核酸序列或(3)兩者之用途，其係用作藥劑。
43.一種重組載體，其包含(1)編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分的核酸序列、(2)編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之輕鏈或其抗原結合部分的核酸序列或(3)兩者。
44.一種宿主細胞，其包含編碼如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或部分之重鏈或其抗原結合部分的第一核酸序列，該第一核酸序列以操作方式連接至表現控制元件；及編碼該抗體或部分之輕鏈或其抗原結合部分之第二核酸序列，該第二核酸序列以操作方式連接至表現控制元件。
45.一種製造抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分之方法，其包含使如技術方案44之宿主細胞維持在適於表 現該抗體或部分之條件下。
46.如技術方案45之方法，其進一步包含分離該抗體或部分。
47.一種組合物，其包含如技術方案1至35中任一技術方案之單株抗體或抗原結合部分及醫藥學上可接受之媒劑或載劑。
48.一種治療有需要個體之方法，其包含向該個體投與有效量之如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物。
49.一種治療有需要個體之病狀之方法，其包含向該個體投與有效量之如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物。
50.如技術方案49之方法，其中該病狀為CCR6相關病狀。
51.如技術方案49之方法，其中該病狀為自體免疫病狀或發炎性病狀。
52.如請求項49之方法，其中該病狀為類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、接觸性皮炎、克羅恩氏病、發炎性腸病、格雷氏病、白斑病、甲狀腺機能亢進、慢性肝炎、子宮頸之人類乳頭狀瘤病毒感染、蕈樣真菌病、骨質疏鬆症或牙周病。
53.一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物。
54.如技術方案53之方法，其中該癌症為B細胞惡性病、 乳腺癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、胰腺癌或甲狀腺乳頭狀癌。
55.一種降低有需要個體之CCR6+細胞之由CCL20介導之趨化性的方法，其包含向該個體投與如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物。
56.一種活體外降低CCR6+細胞之由CCL20介導之趨化性的方法，其係使用如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物。
57.一種治療個體之病狀之方法，其包含向該個體投與如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物，其中該病狀係選自由以下組成之群：a)肘或膝遠端四肢之關節病變；b)紅斑；c)腫脹；d)軟骨寡聚基質蛋白(COMP)血清含量增加；e)核因子B配體之受體活化子(RANKL)、核因子B之受體活化子(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)或組織蛋白酶K之mRNA含量增加；f)異位性皮炎；及g)過敏性接觸性皮炎。
58.一種如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物之用途，其係用於製 造藥劑。
59.一種如技術方案1至35中任一技術方案之抗體或抗原結合部分或如技術方案47之組合物之用途，其係用作藥劑。
本發明係關於特異性結合至CCL20或其部分(例如其抗原部分)之抗體。本發明亦關於該等抗體之抗原結合部分。在一個實施例中，該等抗體會中和CCL20之一或多種活性。據稱當如BiacoreTM所測定KD 100 nM，較佳10 nM、1 nM、100 pM、50 pM、40 pM或35 pM時，抗體會特異性結合至抗原。在一個實施例中，特異性結合至CCL20之抗體不會特異性結合至非CCL20分子。在某些實施例中，在藉由BiacoreTM本發明之抗-CCL20抗體與非CCL20分子之間的相互作用與該抗體與人類CCL20之間的相互作用差40、50、60或70 RU以上之情況下，據稱該抗體不會特異性結合至非CCL20分子。在一個實施例中，抗體或部分特異性結合至人類CCL20或其部分，特異性結合至人類CCL20之一些序列變異體(諸如對偶基因變異體)，且亦可與來自其他物種之CCL20交叉反應。在一個實施例中，抗體或部分對野生型(亦稱為天然存在或內源性)人類CCL20具有結合特異性。除非另外指出，否則「人類CCL20」係指野生型人類CCL20。具有信號序列之野生型人類CCL20之胺基酸序列示於圖14中(SEQ ID NO：85)。無信號序列之野生型人類CCL20之胺基酸序列(SEQ ID NO： 85之殘基1-26)見於SEQ ID NO：99中(參見表18)。圖18描述無信號序列之人類CCL20之變異體(SEQ ID NO：84)，其中倒數第二個殘基為D，替代如野生型序列(SEQ ID NO：85)中之N。在一些實施例中，抗體或部分結合至野生型人類CCL20或人類CCL20，其中倒數第二個殘基為D，替代野生型序列中所示之N，任一序列可有或無信號序列(例如SEQ ID NO：84、85或99)。在一個特定實施例中，抗體或部分特異性結合至人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20，而不結合至小鼠或大鼠CCL20。
本文所述抗體及其抗原結合部分可使用已知技術純化及/或分離。「純化」或「分離」之抗體或部分已自其來源(例如細胞之上清液；混合物，諸如文庫中之抗體之混合物；等)之分子(例如肽)分離出，且包括由本文所述方法或其他適合方法獲得之抗體。分離之抗體包括實質上純(例如基本上純)之抗體，以及藉由化學合成、重組技術及其組合產生之抗體。
更特定言之，本發明係關於抗人類CCL20抗體、該等抗體之抗原結合部分(亦即部分)、該等抗體之輕鏈、該等抗體之重鏈及此等輕鏈或重鏈之部分。本發明亦關於缺乏重鏈及/或輕鏈信號序列之抗體及糖基化抗體。本發明亦關於前驅抗體、非糖基化抗體及重鏈及/或輕鏈包含信號序列之抗體。本發明亦關於編碼本文所述抗體重鏈及/或輕鏈或其部分中之任一者之核酸分子；包含該等核酸之載體及宿主細胞；產生本文所述抗體重鏈及/或輕鏈或其部分 中之任一者之方法；及使用該等抗體、抗體鏈或部分之方法。
本發明之抗體及其抗原結合部分可用於治療有需要之個體(例如人類患者)以按需要降低CCR6+細胞之CCL20結合至CCR6、CCL20介導之發炎及/或CCL20介導之趨化性。
本發明抗體包括包含兩個重鏈及兩個輕鏈之傳統抗體。在一些實施例中，一或多個重鏈及/或輕鏈包含可變域(本文亦稱為「可變區」)及恆定域(本文亦稱為「恆定區」)。完全可變域(若存在)包含4個構架區(FR)及三個互補決定區(CDR)，自胺基末端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4之次序排列。可進行目視檢查及序列分析以鑑別CDR邊界。對於本發明而言，CDR序列藉由使用Kabat系統(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部(U.S.Department of Health and Human Services)，美國政府印刷局(U.S.Government Printing Office)(1991))及/或Chothia系統(Chothia及Lesk,Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))來定義，如例如圖6中所示。
包含人類重鏈恆定區之本發明之實施例可包含任何同型之人類恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，其中重鏈分別具有γ、μ、α、δ或ε類型，且任何子類包括IgG1，IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2，其中重鏈分別具有γ1、γ2、γ3，γ4、α1及α2類型。包含人類輕鏈之實施例可 包含人類或人類λ輕鏈。
如本文所用，術語「抗體」係指完全抗體(包含兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈)。除非另外指出，否則術語「抗原結合片段」在本文可與術語「抗原結合部分」互換使用。抗體之抗原結合部分可呈例如單鏈抗體、Fv片段，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段，Fd片段、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09665)、雙功能抗體、功能域缺失抗體及單域抗體(dAb)之型式。參見例如Jespers等人，Nature Biotechnology 22(9)：1161-1165(2004)。包含VH及/或VL之抗原結合分子亦屬於本發明範圍內。在VH之情況下，分子亦可包含一或多個CH1、鉸鏈、CH2及CH3區。
抗體部分可藉由酶促裂解或藉由重組技術產生。舉例而言，番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分別用於產生Fab或F(ab')2片段。亦可使用抗體基因產生多種截短形式之抗體，其中在天然終止位點上游已引入一或多個終止密碼子。舉例而言，編碼F(ab')2片段之重鏈的重組構築體可經設計包括編碼重鏈之CH1結構域及鉸鏈區之DNA序列。
在另一個實施例中，可製造包含連接至另一多肽之本發明抗-CCL20抗體之全部或一部分的融合抗體或免疫黏附素。在一個實施例中，僅抗-CCL20抗體之可變域會連接至多肽。在另一個實施例中，抗-CCL20抗體之VH結構域連接至第一多肽，而抗-CCL20抗體之VL結構域連接至第二多肽，該第二多肽以使得VH及VL結構域可彼此相互作用以 形成抗原結合位點之方式與第一多肽締合。在又一個實施例中，VH結構域與VL結構域藉由連接子分離，以便VH及VL結構域可彼此相互作用(參見下文單鏈抗體)。接著VH-連接子-VL抗體連接至相關多肽。另外，可產生融合抗體，其中兩個(或兩個以上)單鏈抗體彼此連接，以在單個多肽鏈上產生二價或多價抗體或產生雙特異性抗體。
為產生本發明之單鏈抗體，將編碼VH-及VL-之DNA片段以操作方式連接至編碼可撓性連接子、例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO；116)之另一片段，以使得VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白質，其中VL及VH結構域藉由可撓性連接子接合。參見例如Bird等人，Science 242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；等。在一些實施例中，單鏈抗體為單價(僅使用單個VH及VL)、二價(使用兩個VH及VL)或多價(使用兩個以上VH及VL)單鏈抗體。本發明亦涵蓋特異性結合至人類CCL20及另一分子之雙特異性或多價抗體。
在其他實施例中，可使用編碼抗-CCL20抗體之核酸分子製備其他經修飾抗體。舉例而言，可根據本說明書之教示使用標準分子生物技術製備「抗體」(Ill等人，Protein Eng.10：949-57(1997))、「微型抗體」(Martin等人，EMBO J.13：5303-9(1994))、「雙功能抗體」(Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))或「兩面蛋白(Janusins)」(Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659 (1991)及Traunecker等人，Int.J.Cancer(增刊)7：51-52(1992))。
在另一個態樣中，本發明提供本文所例示抗體之變異體或該變異型抗體之抗原結合部分，其中該變異型抗體特異性結合至人類CCL20，但與所例示抗體在序列方面之不同之處為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上胺基酸取代(例如在CDR區、FR區及/或恆定域中)。根據本發明，變異型抗體可與參考抗體在重鏈、重鏈可變域、輕鏈、輕鏈可變域、六個CDR或8個FR方面至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。
如本文所用，亦稱為序列一致性之多肽之序列相似性通常使用序列分析軟體來量測，該軟體使用歸屬於不同取代、缺失及其他修飾(包括保守胺基酸取代)之相似性之量度匹配類似序列。舉例而言，遺傳學電腦組(Genetics Computer Group，GCG)序列分析封裝(Sequence Analysis Package)含有諸如「空位(Gap)」及「最佳適合(Bestfit)」之程式，該等程式可在預設參數下用以測定密切相關之多肽(諸如來自不同生物體物種之同源多肽)之間或野生型蛋白與其突變型蛋白之間的序列同源性或序列一致性。參見例如GCG 6.1版。多肽序列亦可與使用預設或推薦參數之FASTA(一種GCG 6.1版程式)相比較。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜尋序列之間最佳重疊區域之 比對及序列一致性百分比(Pearson,Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。本發明序列與含有大量來自不同生物體之序列之資料庫比較時所用之另一演算法為電腦程式BLAST，尤其blastp或tblastn，使用預設參數。參見例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)；該等文獻以引用的方式併入本文中。
根據本發明，可將抗體中之一或多個可具化學反應性之半胱胺酸變為另一殘基，諸如(但不限於)丙胺酸或絲胺酸。在一個實施例中，非典型半胱胺酸係經取代。取代可在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定域中進行。在一些實施例中，半胱胺酸為典型半胱胺酸。在一些實施例中，移除抗體中之潛在蛋白水解位點。該等位點可出現在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定域中。半胱胺酸殘基之取代及蛋白水解位點之移除可降低抗體產物異源性之風險且因此增加其同源性。在一些實施例中，藉由改變一或兩個殘基消除形成潛在去醯胺位點之天冬醯胺-甘胺酸對。在一些實施例中，將抗體去免疫化以降低其免疫原性。降低抗體免疫原性之技術在此項技術中熟知。參見例如PCT公開案第WO 98/52976號及第WO 00/34317號。
在一些實施例中，當與本發明之例示性抗體相比較時，抗體具有一或多個保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之 具有側鏈R基團的另一胺基酸殘基取代之胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能特性。在兩個或兩個以上胺基酸序列之保守性取代彼此不同之情況下，序列一致性百分比或相似度可上調以校正取代之保守性質。進行此調整之方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson,Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具有類似化學特性之側鏈之胺基酸組的實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，保守置換為在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中所揭示之PAM250對數概似矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守」置換為在PAM250對數概似矩陣中具有非負值之任何變化。
在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分之胺基酸取代為具有以下特徵之胺基酸取代：(1)降低對蛋白水解之敏感性，(2)降低對氧化之敏感性，(3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力，例如以提高抗體之ADCC及CDC活 性，(4)賦予或改良該等類似物之其他物理化學或功能特性，但仍保留與人類CCL20之特異性結合，(5)移除C端離胺酸，及(6)添加或移除糖基化位點。
在一個態樣中，本發明提供一種新開發且新穎之多肽，其為本發明抗體之重鏈或輕鏈或為重鏈或輕鏈之含有可變域之部分。該多肽由於可分別與輕抗體鏈或重抗體鏈搭配形成抗-CCL20抗體而適用。
本文描述新穎的人類化中和性抗-CCL20抗體，其包含新穎的小鼠抗人類CCL20抗體之CDR，及該等人類化抗體之抗原結合部分。如本文所用之術語「人類化抗-CCL20抗體」係指包含本文亦稱為供者抗體(例如小鼠抗-CCL20抗體)之非人類來源的抗-CCL20抗體之一或多個CDR(CDR1、CDR2及CDR3)及至少一個來自人類序列之部分的抗體。人類抗體部分可為一或多個構架區(例如所有構架區)及/或所有或部分恆定區。在一些實施例中，人類序列構架區包含生殖系序列，但可包括非生殖系突變。非人類抗-CCL20抗體之六個CDR移植至人類構架中之CDR移植抗-CCL20抗體為本發明之人類化抗-CCL20抗體之實例。參見例如Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利第0,125,023 B1號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利第0,120,694 B1號；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利第0,194,276 B1號；Winter，美國專利第5,225,539號；Winter，歐洲專利第0,239,400 B1號； Padlan,E.A.等人，歐洲專利申請案第0,519,596 A1號。亦參見Ladner等人，美國專利第4,946,778號；Huston，美國專利第5,476,786號；及Bird等人，Science 242：423-426(1988))。在一些實施例中，人類化抗體為去免疫化抗體。參見例如Carr等人，美國專利第7,264,806號，其係關於已經修飾以降低潛在T細胞抗原決定基數目之去免疫抗體，藉此降低抗體在投與至人類時引發免疫反應之傾向性。
在特定實施例中，人類化抗體包含一或多個以下鼠類單株抗人類CCL20抗體之一或多個輕鏈CDR及/或一或多個重鏈CDR：36F7C10、42G5B10及40-1C10B9，其中根據Kabat系統、Chothia系統或其任何組合來鑑別CDR。在一些實施例中，人類化抗體包含抗體36F7C10、42G5B10或40-1C10B9之所有三個重鏈CDR及所有三個輕鏈CDR。
在另一個實施例中，人類化抗體具有本發明之鼠類抗人類CCL20抗體之結合特異性(例如對人類CCL20之特異性，相同或類似抗原決定基特異性)及/或具有中和活性。人類化抗體可具有本文所述鼠類、嵌合或人類化抗人類CCL20抗體之結合特異性、抗原決定基特異性及/或中和活性。舉例而言，本發明之人類化抗體可與鼠類、嵌合或人類化抗人類CCL20抗體競爭以結合至人類CCL20，及/或其可具有鼠類、嵌合或人類化抗人類CCL20抗體之中和功能。在一個特定實施例中，人類化抗體具有小鼠抗體36F7C10、42G5B10及40-1C10B9中之任一者之結合特異性、抗原決定基特異性及/或中和活性。
人類化抗體之人類序列部分(例如構架區；恆定區)可來自任何適合人類抗體。舉例而言，人類化或嵌合抗體中之人類恆定區或其部分可藉由人類或λ輕鏈基因及/或藉由人類γ(例如γ1、γ2、γ3、γ4)、μ、α(例如α1、α2)、δ或ε重鏈基因(包括對偶基因變異體)編碼。可選擇特定人類恆定區同型(例如IgG1；IgG2)、變異體或其部分以修整效應功能。舉例而言，可將突變恆定區(亦即變異體)併入抗體中以降低與Fc受體結合及/或固定補體之能力。(參見例如Winter等人，GB 2,209,757 B；Morrison等人，WO 89/07142；Morgan等人，WO 94/29351)。
如本文所用，術語「生殖系」係指抗體基因及基因區段在經由生殖細胞由母體傳給後代時，該等抗體基因及基因區段之核苷酸序列及胺基酸序列。此生殖系序列不同於編碼B細胞中特定抗體之核苷酸序列，其已在親和力成熟過程中藉由重組及高頻突變事件得以改變。「利用」特定生殖系之抗體具有與指定與其他生殖系序列相比之生殖系核苷酸序列或胺基酸序列比對最密切的核苷酸或胺基酸序列。該等抗體可藉由與生殖系序列相比發生突變之序列編碼或包含該序列。
在一些實施例中，人類構架具有相較於生殖系序列之最少變化，例如已置換小於3、4、5、6、7、8、9或10個受者構架殘基以改良抗體之一或多種特性。在一些實施例中，受者構架殘基經供者構架殘基置換，例如以改良結合親和力(參見例如Queen等人，美國專利第5,530,101號)。 在一個特定實施例中，人類化抗體鏈之構架中的有限數目之胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)經選擇與供者序列(亦即「回復突變」)而非受者序列之此等位置之胺基酸相同，以增加包含人類化抗體鏈之抗體對人類CCL20之親和力。
人類構架區(例如重鏈及/或輕鏈可變區之人類構架區)較佳獲自或源自與供者抗體(例如鼠類抗-CCL20抗體)之抗原結合區之類似或等效區(例如重鏈或輕鏈可變區)具有序列相似性之人類生殖系序列。人類化抗體之人類序列部分之構架區的其他來源包括人類可變區共同序列(參見例如Kettleborough等人，Protein Engineering 4：773-783(1991)；Carter等人，WO 94/04679；Carter美國專利第6,407,213號)。舉例而言，用於獲得非人類部分之抗體之供者序列區(例如可變區之序列)可與如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部，美國政府印刷局(1991)所述之人類序列相比以選擇人類化抗體之人類部分之特定來源，例如構架區之來源。
在一個實施例中，人類化抗體鏈之構架區係獲自或源自與非人類供者之可變區具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%總序列一致性之人類Ig可變區。在一個特定實施例中，人類化抗體鏈之構架區係獲自或源自與非人類供者抗體之可變區之構架區 具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%總序列一致性之人類可變區構架區。
在一個實施例中，人類化抗體之至少一個構架區(FR)係獲自或源自人類序列之一或多個鏈。因此，FR可包括獲自或源自一或多種人類序列抗體(例如人類抗體鏈、人類共同序列)之FR1及/或FR2及/或FR3及/或FR4。
熟習此項技術者將瞭解，在一些情況下，側接鼠類抗-CCL20抗體之一或多個CDR之殘基可有助於起作用(例如結合)，且在一些情況下對於直接或間接起作用(例如結合)可能必要。因此，在一些實施例中，側接鼠類構架之一或多個CDR(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上側接胺基酸)之一或多個胺基酸亦包括於人類化抗體內。
在一些實施例中，本發明之人類化抗體之人類重鏈構架區利用人類IGHV1-46＊03生殖系序列。在一些實施例中，本發明之人類化抗體之人類輕鏈構架區利用人類IGKV1D-39＊01生殖系序列。在此等FR區，例如如以下實例所述在一或多個殘基處可視情況進行突變(例如回復突變)以改良人類化抗體之CCL20結合親和力。
「親和力」為描述結合相互作用強度之技術術語且通常係指抗體與抗原結合之總強度。抗體對抗原之親和力通常表示為特定抗體-抗原相互作用之結合親和力平衡常數(KD)。據稱當如BiacoreTM所測定KD 100 nM，較佳10 nM、1 nM、100 pM、50 pM、40 pM或35 pM時，抗體會 特異性結合抗原。
在一些實施例中，抗體結合至人類CCL20，具有70 pM或70 pM以下、60 pM或60 pM以下、或50 pM或50 pM以下之親和力(KD；KD=Koff(kd)/Kon(ka))，如單價表面電漿子共振所測定；或12 pM或12 pM以下、10 pM或10 pM以下、8 pM或8 pM以下、6 pM或6 pM以下、或5 pM或5 pM以下之親和力，如二價表面電漿子共振所測定。在一些實施例中，抗體結合至人類CCL20，具有500 pM或500 pM以下、400 pM或400 pM以下、300 pM或300 pM以下、200 pM或200 pM以下、100 pM或100 pM以下、90 pM或90 pM以下、80 pM或80 pM以下、70 pM或70 pM以下、60 pM或60 pM以下、50 pM或50 pM以下、或45 pM或45 pM以下之親和力，如表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。在一些實施例中，抗體結合至人類CCL20，具有1000×105 M-1 s-1或1000×105 M-1 s-1以下、900×105 M-1 s-1或900×105 M-1 s-1以下、800×105 M-1 s-1或800×105 M-1 s-1以下、700×105 M-1 s-1或700×105 M-1 s-1以下、600×105 M-1 s-1或600×105 M-1 s-1以下、500×105 M-1 s-1或500×105M-1 s-1以下、400×105M-1 s-1或400×105 M-1 s-1以下、300×105 M-1 s-1或300×105 M-1 s-1以下、240×105 M-1 s-1或240×105 M-1 s-1以下、200×105 M-1 s-1或200×105 M-1 s-1以下、190×105 M-1 s-1或190×105 M-1 s-1以下、180×105 M-1 s-1或180×105 M-1 s-1以下、170×105 M-1 s-1或170×105 M-1 s-1以下、160×105 M-1 s-1或160×105 M-1 s-1以下、或150×105 M-1 s-1或150×105 M-1 s-1以下之ka，如表 面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。在一些實施例中，抗體結合至人類CCL20，具有1000×10-5 s-1或1000×10-5 s-1以下、900×10-5 s-1或900×10-5 s-1以下、800×10-5 s-1或800×10-5 s-1以下、700×10-5 s-1或700×10-5 s-1以下、600×10-5 s-1或600×10-5 s-1以下、500×10-5 s-1或500×10-5 s-1以下、400×10-5 s-1或400×10-5 s-1以下、300×10-5 s-1或300×10-5 s-1以下、240×10-5 s-1或240×10-5 s-1以下、200×10-5 s-1或200×10-5 s-1以下、190×10-5 s-1或190×10-5 s-1以下、180×10-5 s-1或180×10-5 s-1以下、170×10-5 s-1或170×10-5 s-1以下、160×10-5 s-1或160×10-5 s-1以下、150×10-5 s-1或150×10-5 s-1以下、140×10-5 s-1或140×10-5 s-1以下、130×10-5 s-1或130×10-5 s-1以下、120×10-5 s-1或120×10-5 s-1以下、100×10-5 s-1或100×10-5 s-1以下、90×10-5 s-1或90×10-5 s-1以下、80×10-5 s-1或80×10-5 s-1以下、70×10-5 s-1或70×10-5 s-1以下、或65×10-5 s-1或65×10-5 s-1以下之kd，如表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。
如熟習此項技術者所顯而易見，可使用多種方法以確定根據本文所提供及此項技術中已知之方法所產生之抗體及其抗原結合部分具有必要特異性(例如結合特異性、抗原決定基特異性)。舉例而言，可使用任何適合方法偵測對人類CCL20具有結合特異性之本發明人類化抗-CCL20抗體或部分的結合功能，該方法為例如監測人類化抗體或部分與人類CCL20(或例如具有CCL20之胺基酸序列之肽或包含人類CCL20之固體支撐物)之間的複合物形成之分析法。
可使用熟習此項技術者所知之多種技術(包括例如競爭性結合分析法)容易地測定本發明之抗體或其抗原結合部分(例如本發明之人類化抗體或部分)結合至與本文所揭示之特定鼠類、嵌合或人類化單株抗體相同的人類CCL20上之抗原決定基、或結合至與結合本文所揭示之特定鼠類、嵌合或人類化單株抗體之人類CCL20上之抗原決定基重疊的人類CCL20上之抗原決定基之能力。此等技術可涉及使用標記形式之該特定抗體，及在存在及不存在本發明抗體下量測彼標記抗體與人類CCL20之結合。
如本文所用之「抗原決定基」包括能夠特異性結合至抗體之任何蛋白質決定子。表徵與抗體結合之抗原決定基之方法在此項技術中已知。實例9中描述一種表徵藉由本發明之抗-CCL20抗體所結合之抗原決定基之方法。一旦測出抗原上之所需抗原決定基，即有可能例如使用本發明中所述之技術產生彼抗原決定基之抗體。或者，在發現過程中，抗體之產生及表徵可闡明與所需抗原決定基有關之資訊。根據此資訊，接著可以競爭方式篩檢抗體以結合至相同抗原決定基。舉例而言，熟練技術者可進行競爭研究以找到彼此以競爭方式結合之抗體，亦即競爭以結合至抗原之抗體。
在一個實施例中，為測定測試抗體或其抗原結合部分是否結合至與本發明之人類化抗體相同或重疊之抗原決定基，允許本發明之抗-CCL20抗體在飽和條件下結合至CCL20，且接著量測測試抗體結合CCL20之能力。若測試 抗體能夠與參考抗-CCL20抗體同時結合至CCL20，則測試抗體可結合至與參考抗-CCL20抗體相比不同之抗原決定基。然而，若測試抗體不能同時結合至CCL20，則測試抗體可結合至相同抗原決定基、重疊抗原決定基或極接近於本發明抗-CCL20抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。此實驗可使用例如ELISA、RIA、BiacoreTM或流動式細胞測量術進行。為測試抗-CCL20抗體是否與另一抗-CCL20抗體交叉競爭，可在兩個方向使用上文所述之競爭方法，亦即測定參考抗體是否阻斷測試抗體，反之亦然。在一些實施例中，使用BiacoreTM進行實驗。
抗原決定基分級(binning)亦適用於分析本發明抗體之特徵。術語「分級」係指基於抗體之抗原結合特徵將抗體分組之方法。基於抗體之交叉競爭性為抗體「分級」之高通量過程描述於國際專利申請案第WO 03/48731號中。可藉由未標記形式之抗-CCL20抗體「A」結合至對應於CCL20或CCL20陽性細胞之序列之合成肽來研究「抗原決定基分級」。隨後添加經標記之第二抗-CCL20抗體「B」，且可相對於對照樣品，評估標記抗體之結合量，其中細胞或合成肽先前尚未曾暴露於抗-CCL20抗體「A」。或者，抗-CCL20抗體「A」與「B」皆可用不同螢光染料或能夠偵測之化學物質來標記，且可使用能夠偵測標記之裝置，量測可同時接合CCL20肽之兩種標記抗體之數量，或藉由流動式細胞計數儀量測同時接合CCL20陽性細胞之兩種抗體之量。BiacoreTM及Octet技術能夠研究未標記形式之抗體之 競爭結合性。當有些抗體之化學修飾可能損害結合活性時，需要使用未標記形式之抗體。亦參見Jia等人，J.Immunol.Methods 288：91-98(2004)中所述之技術，該技術亦適用於進行抗原決定基分級。
本文亦提供本發明之抗-CCL20抗體之一部分，諸如輕鏈、重鏈，及輕鏈與重鏈之一部分。此等抗體部分可獲自或源自抗體(例如藉由還原及/或裂解)，或由編碼具有所需特性(例如結合人類CCL20，序列相似性)之抗體或其鏈之一部分的核酸來產生或表現。其亦可藉由例如相關部分之重新合成來製備。包含人類及非人類來源之所需部分(例如抗原結合區、CDR、FR、C區)之人類化抗體可能使用合成及/或重組核酸產生，以製備編碼所需人類化鏈之構築體(例如cDNA)。舉例而言，為製備抗體之一部分(例如鏈之一部分)，可將一或多個終止密碼子引入核酸序列之所需位置。可使用PCR突變誘發方法構築編碼人類化可變區之核酸(例如DNA)序列，以改變現有DNA序列(參見例如Kamman等人，Nucl.Acids Res.17：5404(1989))。編碼新穎CDR之PCR引子可與先前人類化之可變區(其係基於相同或極類似之人類可變區)之DNA模板雜交(Sato等人，Cancer Research 53：851-856(1993))。若沒有類似DNA序列可用作模板，則可自合成寡核苷酸構築包含編碼可變區序列之序列的核酸(參見例如Kolbinger,Protein Engineering 8：971-980(1993))。亦可將編碼信號肽之序列(「信號序列」)併入核酸中(例如合成中，插入載體中 時)。若信號肽序列不可用(例如通常不存在)，則可使用來自另一抗體之信號肽序列(參見例如Kettleborough,Protein Engineering 4：773-783(1991))。使用此等方法、本文所述方法或其他適合方法，可容易地產生變異體。
如本文所用，首字母縮寫「mAb」(或「MAb」)係指單株抗體，其可為例如藉由細胞或人類化抗體之純系群體合成之抗體。產生單株抗體之純系群體可為永生化細胞之純系群體。在一些實施例中，純系群體中之永生化細胞為雜交細胞(融合瘤)，其通常藉由融合來自經免疫動物之個別B淋巴細胞與來自淋巴細胞腫瘤之個別細胞而產生。
本發明在部分程度上係關於對人類CCL20具有結合特異性且包含人類化輕鏈及人類化重鏈及/或其部分之人類化抗體或其抗原結合部分。在一個實施例中，人類化抗體包含包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：1之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：2之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：3之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：4之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：5之一或多個CDR(例如所 有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：7之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：6之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：1之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：2之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：3之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：4之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：5之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈；或包括SEQ ID NO：8之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：6之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈。
在一個實施例中，本發明之人類化抗體包含重鏈(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、輕鏈(L)-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，其胺基酸序列：a)分別為SEQ ID NO：60、64、67、70、73及75；b)分別為SEQ ID NO：60、64、67、71、73及75；c)分別為SEQ ID NO：60、63、67、70、73及75；d)分別為SEQ ID NO：60、63、67、71、73及75； e)分別為SEQ ID NO：61、65、68、70、73及75；f)分別為SEQ ID NO：61、65、68、71、73及75；g)分別為SEQ ID NO：77、79、67、70、73及75；h)分別為SEQ ID NO：77、79、67、71、73及75；i)分別為SEQ ID NO：78、80、68、70、73及75；及j)分別為SEQ ID NO：78、80、68、71、73及75。
在另一個實施例中，本發明之人類化抗體包含H-CDR3，其序列為SEQ ID NO：67或68。在某些實施例中，本發明之人類化抗體包含H-CDR3及L-CDR3，其序列分別為SEQ ID NO：67及75；或分別為SEQ ID NO：68及75。
在另一個實施例中，人類化抗體對人類CCL20具有結合特異性且包含包括一或多個選自由SEQ ID NO：70或71；73；及75或其組合組成之群的CDR之輕鏈；及包括一或多個選自由SEQ ID NO：60、61、77或78；63、64、65、79或80；及67或68；或其組合組成之群的CDR之重鏈。
在另一個實施例中，對人類CCL20具有結合特異性之人類化抗體包含包括SEQ ID NO：7、8、110或112之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之輕鏈及包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或108之一或多個CDR(例如所有三個CDR)之重鏈。
本發明亦關於一種本文所述人類化抗體之人類化抗體輕鏈。在一個實施例中，人類化抗體輕鏈包含一或多個選自由70或71；73；及75或其組合組成之群的CDR。舉例而言，人類化抗體具有L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，其胺基 酸序列分別為70、73及75；或分別為71、73及75。
本發明亦關於一種本文所述人類化抗體之人類化抗體重鏈。在一個實施例中，人類化抗體重鏈包含一或多個選自由60、61、77或78；63、64、65、79或80；及67或68；或其組合組成之群的CDR。舉例而言，人類化抗體具有H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3，其胺基酸序列為：a)SEQ ID NO：60、63及67；b)SEQ ID NO：60、64及67；c)SEQ ID NO：61、65及68；d)SEQ ID NO：77、79及67；或e)SEQ ID NO：78、80及68。
在一個實施例中，本發明之人類化抗體包含包括SEQ ID NO：15或16之可變域(VL)序列之輕鏈。在一個相關實施例中，人類化抗體包含胺基酸序列包含或由SEQ ID NO：7、8、110及112中之一者組成之輕鏈。在一個實施例中，人類化抗體包含胺基酸序列包含或由無信號序列之SEQ ID NO：7或8組成之輕鏈。
在一個實施例中，本發明之人類化抗體包含包括SEQ ID NO：9-14中之一者之可變域(VH)序列之重鏈。在一個相關實施例中，人類化抗體包含胺基酸序列包含或由SEQ ID NO：1-6及108中之一者組成之重鏈。在一個實施例中，人類化抗體包含胺基酸序列包含或由無信號序列且視情況無C端離胺酸之SEQ ID NO：1-6中之一者組成之重鏈。在一個實施例中，人類化抗體包含胺基酸序列包含或由無C端 離胺酸之SEQ ID NO：108組成之重鏈。
在一些實施例中，本發明之人類化抗體包含VH及VL，其胺基酸序列包含或由以下組成：a)SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：15；b)SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：15；c)SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：15；d)SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：15；e)SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：15；f)SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15；g)SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：16；h)SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：16；i)SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：16；j)SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：16；k)SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16；或l)SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：16。
在一個實施例中，本發明之人類化抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其胺基酸序列包含或由以下組成：a)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：7；c)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：7；d)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：7；e)SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7；f)SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7；g)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：8； h)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：8；i)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：8；j)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：8；k)SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：8；l)SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8,m)SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：110；及n)SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：112；其中胺基酸序列缺乏可能存在之信號序列，且其中SEQ ID NO：1-6及SEQ ID NO：108視情況缺乏C端離胺酸。
本發明提供包含本發明之例示人類化重鏈或其抗原結合部分及例示人類化輕鏈或其抗原結合部分之任何組合；換言之，重鏈及輕鏈可「混合並匹配」。應瞭解，任何該組合均可能維持與人類CCL20結合以及趨化性中和活性。此等功能特性可容易地使用本文所述方法來測試。實際上，圖7表明本發明之例示人類化重鏈及輕鏈之若干組合之中和活性。
本發明亦提供結合至與本文所例示抗體相同之抗原決定基及/或與本文所例示抗體競爭或交叉競爭之抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分。此等抗體可為例如人類化、嵌合或小鼠抗體。舉例而言，本發明提供抗人類CCL20抗體及部分，其結合至與小鼠抗-CCL20抗體36F7C10、40-1C10B9及42G5B10中之一者或該等小鼠抗體之人類化或嵌合型式相同之抗原決定基及/或與小鼠抗-CCL20抗體36F7C10、40-1C10B9及42G5B10中之一者或該等小鼠抗體之人類化 或嵌合型式競爭或交叉競爭。可如本文所述測定抗體結合至與參考抗體相同之抗原決定基或與參考抗體競爭或交叉競爭之能力。作為非限制性實例，預期包含來自小鼠抗體36F7C10之三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR之任何抗體或部分會結合至與小鼠抗體36F7C10相同之抗原決定基、與小鼠抗體36F7C10競爭且與小鼠抗體36F7C10交叉競爭。該等抗體可包括例如重鏈包含SEQ ID NO：9-11中之任一者且輕鏈包含SEQ ID NO：15或16之抗體。在一些實施例中，該等抗體可進一步包括例如重鏈包含SEQ ID NO：12-14中之任一者且輕鏈包含SEQ ID NO：15或16之抗體。
必要時，例如，出於診斷或分析目的(例如成像以允許例如監測治療)，人類化抗體(或其抗原結合部分)可包含可偵測標記。適合可偵測標記及標記人類化抗體或其抗原結合部分之方法在此項技術中熟知。合適的可偵測標記包括例如放射性同位素(例如銦-111、鎝-99m或碘-131)、正電子發射標記(例如氟-19)、順磁性離子(例如釓(III)、錳(II))、抗原決定基標記(標籤)、親和力標記(例如生物素、抗生物素蛋白)、自旋標記、酶、螢光基團或化學發光基團。當不利用標記時，可藉由表面電漿子共振、ELISA、FACS或其他適合方法測定複合物形成(例如在人類化抗體與人類CCL20之間)。
本發明中所用之抗-CCL20抗體或其抗原結合部分亦可例如經由化學反應或基因修飾結合至其他部分(例如聚乙二醇化部分)，其改良抗體之藥物動力學，諸如半衰期。 在一些實施例中，本發明中所用之抗-CCL20抗體可例如經由化學結合或基因修飾(例如將細胞因子之編碼序列添加至抗體編碼序列之框內，由此產生抗體：細胞因子融合蛋白)連接至適合細胞因子。
本發明亦關於免疫結合物，其中本發明之人類化抗體(或其抗原結合部分)偶合至另一治療劑，諸如生物活性化合物(例如細胞因子、超級抗原、細胞毒性劑或毒素)。舉例而言，對人類CCL20(或其抗原結合部分)具有結合特異性之人類化抗體可偶合至生物蛋白質、植物或細菌來源(或其衍生物)之分子、介白素-2抗體或白喉毒素抗體。
如本文所述，已產生對人類CCL20具有結合特異性之小鼠單株抗體。本發明之人類化及嵌合抗體可能源自本發明之小鼠單株抗體。在一些實施例中，本發明之人類化及嵌合抗-CCL20抗體包含取自本發明之小鼠單株抗體之序列，諸如一或多個CDR序列(例如所有六個CDR序列)或一或多個可變域(例如重鏈可變域及輕鏈可變域)。
如本文所用，「小鼠單株抗體」係指含有鼠類抗體之輕鏈CDR(L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3)及重鏈CDR(H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3)、及鼠類來源之構架及恆定區之抗體。
本發明係關於本文所述小鼠單株抗體以及該等小鼠單株抗體之抗原結合部分、該等小鼠單株抗體之輕鏈、該等小鼠單株抗體之重鏈及此等重鏈及輕鏈之部分。在一個特定實施例中，小鼠單株抗體為36F7C10、40-1C10B9或 42G5B10。本發明係關於缺乏重鏈及輕鏈信號序列之小鼠單株抗體及經糖基化之小鼠單株抗體。本發明亦關於前驅抗體、非糖基化抗體，及重鏈及/或輕鏈包含信號序列之抗體。本發明亦關於編碼以上小鼠抗體重鏈、輕鏈或其部分中之任一者的核酸分子；包含該等核酸之載體及宿主細胞；產生上述小鼠重鏈或輕鏈或其部分中之任一者的方法；及使用該等小鼠抗體或其抗原結合部分之方法。
對人類CCL20具有結合特異性之小鼠單株抗體或其抗原結合部分之結合功能可使用任何適合方法偵測，例如使用監測小鼠單株抗體或部分與人類CCL20(或例如具有CCL20之胺基酸序列之肽或包含人類CCL20之固體支撐物)之間的複合物形成之分析法。
本文亦提供鼠類抗體之部分，其包括輕鏈、重鏈以及輕鏈及重鏈之部分。此等抗體部分可例如藉由本文關於人類化抗體部分所述之方法而獲得或取得。
在一個實施例中，本發明之小鼠單株抗體包含包括SEQ ID NO：40、42或44之輕鏈，且進一步包含包括SEQ ID NO：39、41或43之重鏈。在一特定實施例中，小鼠單株抗體包含包括SEQ ID NO：40之輕鏈及包括SEQ ID NO：39之重鏈；包括SEQ ID NO：42之輕鏈及包括SEQ ID NO：41之重鏈；或包括SEQ ID NO：44之輕鏈及包括SEQ ID NO：43之重鏈。
在另一個實施例中，本發明亦關於一種對人類CCL20具有結合特異性之小鼠單株抗體，其包含序列選自由SEQ ID NO：40、42及44組成之群的輕鏈可變區；及序列選自由SEQ ID NO：39、41及43組成之群的重鏈可變區。
本發明亦關於一種輕鏈包含SEQ ID NO：40、42或44之可變區的小鼠單株抗體。
本發明亦關於一種重鏈包含SEQ ID NO：39、41或43之可變區的小鼠單株抗體。
必要時，例如，出於診斷或分析目的(例如成像)，小鼠單株抗體或其抗原結合部分可包含例如如本文針對人類化抗體所述之可偵測標記。本文針對本發明之人類化抗體所述之所有適合方法及技術亦可用於本發明之小鼠單株抗體。
如本文所述，已產生對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體。如本文所用，術語「嵌合抗體」係指重組蛋白質，其含有源自一種物種之抗體之可變域，而抗體之恆定域係源自不同物種。在一個實施例中，對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體包含來自小鼠抗人類CCL20單株抗體之可變域。在一個實施例中，對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體包含來自人類抗體之恆定域。在一個特定實施例中，嵌合抗體包含來自小鼠抗人類CCL20單株抗體之可變域及來自人類抗體之恆定域。
本發明係關於本文所述嵌合抗體以及該等嵌合抗體之抗原結合部分、該等嵌合抗體之輕鏈及重鏈以及此等重鏈及輕鏈之部分。本發明係關於缺乏重鏈及輕鏈信號序列之嵌合抗體及經糖基化之嵌合抗體。本發明亦關於前驅抗體、 非糖基化抗體及重鏈及/或輕鏈包含信號序列之抗體。本發明亦關於編碼上述嵌合抗體重鏈、輕鏈或其部分中之任一者的核酸分子；包含該等核酸之載體及宿主細胞；產生上述嵌合抗體重鏈或輕鏈或其部分中之任一者的方法；及使用該等嵌合抗體之方法。
對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體之結合功能可使用任何適合方法偵測，例如使用監測嵌合抗體與人類CCL20(或例如具有CCL20之胺基酸序列之肽或包含人類CCL20之固體支撐物)之間的複合物形成之分析法。
本文亦提供嵌合抗體之部分，其包括輕鏈、重鏈以及輕鏈及重鏈之部分。此等抗體部分可例如藉由本文關於人類化抗體部分所述之方法而獲得或取得。
在一個實施例中，本發明之嵌合抗體包含SEQ ID NO：40之輕鏈可變區及SEQ ID NO：39之重鏈可變區；SEQ ID NO：42之輕鏈可變區及SEQ ID NO：41之重鏈可變區；或SEQ ID NO：44之輕鏈可變區及SEQ ID NO：43之重鏈可變區。
本發明亦關於一種對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體，其包含選自由SEQ ID NO：40、42或44之輕鏈可變區組成之群的輕鏈可變區序列；且進一步包含選自由SEQ ID NO：39、41或43之重鏈可變區組成之群的重鏈可變區序列。
本發明亦關於一種包含SEQ ID NO：40、42或44之可變區的嵌合輕鏈。
本發明亦關於一種包含SEQ ID NO：39、41或43之可變區的嵌合重鏈。
必要時，例如，出於診斷或分析目的(例如成像)，嵌合抗體或其抗原結合部分可包含例如如本文針對人類化抗體所述之可偵測標記。本文針對本發明之人類化抗體所述之所有適合方法及技術亦可用於本發明之嵌合抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-CCL20抗體為全人類抗體。如本文所用，術語「人類抗體」意謂可變域及恆定域序列為人類序列之任何抗體。該術語涵蓋具有源自人類基因之序列的抗體，但其已經改變例如以降低可能存在之免疫原性、增加親和力、消除可引起不合乎需要之摺疊的半胱胺酸等。該術語亦涵蓋在非人類細胞中以重組方式產生之該等抗體，其可能賦予人類細胞非典型之糖基化作用。 製備全人類抗體之方法在此項技術中已知。舉例而言，人類抗-CCL20抗體可經由活體外方法，諸如噬菌體呈現、核糖體呈現(CAT)、酵母呈現及其類似方法來鑑別，或可由人類B細胞或人類融合瘤細胞產生。或者，人類抗體可藉由用CCL20抗原使大量非人類轉殖基因動物中之任一者免疫而產生，該等動物之基因組內包含一些或所有人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座。在一些實施例中，包含人類免疫球蛋白基因之非人類動物為具有人類免疫球蛋白「微小基因座」之動物(例如GenPharm International,Inc.)。在一些實施例中，人類抗-CCL20抗體係使用XENOMOUSE®(Abgenix,Inc.,Fremont,CA)、HuMAb-Mouse®(Medarex, Inc.)、VelocImmune®小鼠(Regeneron Pharmaaceuticals,Inc.)、AlivaMab小鼠(Ablexis,LLC)、KMTM小鼠(Kirin Pharma USA,Inc.)或其類似物產生。
本發明亦關於分離及/或重組核酸，其包含編碼本發明之人類化抗體或其輕鏈或重鏈、小鼠單株抗體或其輕鏈或重鏈、嵌合抗體或其輕鏈或重鏈、或上述任一者之抗原結合部分之序列。在一些實施例中，本發明提供一種選自由SEQ ID NO：17-32、51-56、109、111及113組成之群的核酸序列。
在一些實施例中，本發明之核酸分子包括在極嚴格條件下與一或多個本文所述核酸序列或編碼任一所提供之VH或VL序列之胺基酸序列的核酸序列雜交或與一或多個本文所述核酸序列或編碼任一所提供之VH或VL序列之胺基酸序列的核酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核酸序列。
本文稱為「分離」或「純化」之核酸為已自其來源之基因組DNA或細胞RNA之核酸(例如當其存在於細胞中或核酸混合物(諸如文庫)中時)分離出的核酸，且包括藉由本文所述方法或其他適合方法所獲得之核酸。在一些實施例中，分離核酸為基本上純的核酸、由化學合成產生之核酸、由生物及化學方法之組合產生之核酸或經分離之重組核酸(參見例如Daugherty等人，Nucleic Acids Res.19(9)：2471-2476(1991)；Lewis及Crowe,Gene 101：297-302(1991))。
除非另作說明，否則對核苷酸序列之提及涵蓋其互補序列。因此，對具有特定序列之核酸之提及應理解為涵蓋具有其互補序列之其互補鏈。如本文所提及，術語「聚核苷酸」意謂長度為至少10個鹼基之核苷酸之可能分離之聚合形式，核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一類型核苷酸之經修改形式。該術語包括單股及雙股形式。
本文稱為「重組體」之核酸為已藉由重組DNA方法產生之核酸，包括藉由依賴人工重組方法(諸如聚合酶鏈反應(PCR)及/或使用限制酶選殖至載體中)之程序產生之彼等核酸。在一些實施例中，重組核酸由重組事件產生，該等重組事件經由細胞之天然機制發生，但在將設計以允許且有可能發生所需重組事件之核酸引入細胞中之後進行選擇。
更特定言之，本發明亦關於包含編碼對人類CCL20具有結合特異性之人類化抗體、小鼠抗體或嵌合抗體或該抗體之抗原結合部分的核苷酸序列之分離及/或重組核酸。在一些實施例中，抗體為本發明之小鼠抗體；本發明之人類化抗體，其中非人類部分係源自鼠類抗-CCL20單株抗體；或本發明之嵌合抗體，其中非人類部分係源自鼠類抗-CCL20單株抗體。
在一些實施例中，使用本發明之核酸產生對人類CCL20具有結合特異性之人類化抗體、對人類CCL20具有結合特異性之小鼠抗體及對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體。舉例而言，可將核酸(例如DNA(諸如cDNA)或RNA)或一或多個編碼本發明之人類化抗體、小鼠抗體或嵌合抗體 之核酸併入適合構築體(例如重組載體)中以進一步操作序列或在適合宿主細胞中產生編碼抗體。
亦提供適用於表現對人類CCL20具有結合特異性之人類化抗體、對人類CCL20具有結合特異性之小鼠抗體或對人類CCL20具有結合特異性之嵌合抗體之構築體或載體。多種載體可用，包括維持於宿主細胞中之單個複本或多個複本中或整合於宿主細胞之染色體中之載體。可將構築體或載體引入適合宿主細胞中，且可在培養物中產生且維持表現本發明之人類化抗體、小鼠抗體或嵌合抗體之細胞。可使用單個載體或多個載體來表現對人類CCL20具有結合特異性之人類化抗體、小鼠抗體或嵌合抗體。
適合表現載體(例如哺乳動物細胞表現載體)亦可含有眾多組分，包括(但不限於)以下一或多種：複製起點；可選標記基因；一或多種表現控制元件，諸如轉錄控制元件(例如啟動子、增強子、終止子)；一或多種轉譯信號；及/或用於膜靶向或分泌之信號序列或前導序列(編碼「信號肽」)。在構築體或載體中，可藉由構築體或載體或其他來源提供信號序列。舉例而言，轉錄及/或轉譯信號可用於引導表現。
在一些實施例中，提供啟動子以在適合宿主細胞中表現本發明之抗體或抗體鏈。在一些實施例中，啟動子為組成性啟動子。在一些實施例中，啟動子為誘導性啟動子。啟動子以操作方式連接至編碼抗體或抗體鏈或該抗體或鏈之抗原結合部分之核酸，以便引導編碼多肽之表現。多種適 用於原核宿主(例如大腸桿菌(E.coli)之lac、tac、T3、T7啟動子)及真核宿主(例如酵母乙醇脫氫酶(ADH1)、SV40、CMV)之啟動子可用。熟習此項技術者將能夠選擇適當啟動子以表現本發明之抗-CCL20抗體或其抗原結合部分。
在一些實施例中，編碼本發明之抗體或抗體鏈之載體包含選擇帶有載體之宿主細胞之可選標記。在一些實施例中，可選標記為編碼賦予抗生素耐性或耐藥性之產物之基因，其可用於原核細胞(例如β-內醯胺酶基因(安比西林(ampicillin)抗性)、Tet基因(四環素抗性)等)及真核細胞(例如新黴素(G418或遺傳黴素)、gpt(黴酚酸)、安比西林或潮黴素抗性基因)中。在一些實施例中，可選標記為二氫葉酸還原酶，允許在多種宿主中選擇甲胺喋呤。在一些實施例中，可選標記為例如用於酵母之編碼宿主之營養缺陷標記之基因(例如LEU2、URA3，HIS3)。在一些實施例中，載體為病毒性(例如桿狀病毒)或噬菌體載體。在一個實施例中，載體能夠整合至宿主細胞之基因組中(例如反轉錄病毒載體)。在一些實施例中，載體為可複製載體且包含複製起點。
因此，本發明係關於編碼本發明之人類化抗體、人類化輕鏈、人類化重鏈、小鼠抗體、小鼠抗體輕鏈、小鼠抗體重鏈、嵌合抗體、嵌合輕鏈或嵌合重鏈之分離核酸分子。本發明亦關於編碼任何此等抗體或其鏈之抗原結合部分之分離核酸分子。藉由本發明之核酸編碼之多肽序列描述於上文及以下實例中。
在一些實施例中，本發明之核酸或載體編碼本發明之重鏈(或其抗原結合部分)或輕鏈(或其抗原結合部分)。含有編碼重鏈之核酸與編碼輕鏈之核酸、或編碼該重鏈及該輕鏈之抗原結合部分之核酸的宿主細胞可用於產生包含重鏈及輕鏈(或抗體之抗原結合部分)之抗體。編碼重鏈之核酸及編碼輕鏈之核酸可位於各別表現載體上。其亦可在相同或不同表現控制下位於單個表現載體上。參見例如美國專利第6,331,415號及第7,662,623號。
本發明之另一態樣係關於一種製造本發明之抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分之方法。抗體或部分可例如藉由在適合宿主細胞中表現一或多種編碼抗體或部分之重組核酸產生。宿主細胞可使用任何適合方法產生。舉例而言，可將一或多種本文所述表現構築體引入適合宿主細胞中，且可使所得細胞維持在適用於表現構築體或載體之條件下。在一些實施例中，使所得細胞維持於培養物、動物或植物中。適合宿主細胞可為原核細胞，包括細菌細胞，諸如大腸桿菌(例如菌株DH5αTM(Invitrogen,Carlsbad,CA))、枯草桿菌(B.subtilis)及/或其他合適細菌；真核細胞，諸如真菌細胞或酵母細胞(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)、麯黴屬(Aspergillus sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))或其他低等真核細胞，及高等真核生物之細胞，諸如來自昆蟲(例如果蠅S2細胞(Drosophila Schneider S2 cell)、Sf9昆蟲細胞(WO 94/26087(O'Connor)、TN5B1-4(HIGH 5)昆蟲細胞(Invitrogen))、哺乳動物(例如COS細胞，諸如COS-1(ATCC寄存編號CRL-1650)及COS-7(ATCC寄存編號CRL-1651)、CHO(例如ATCC寄存編號CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub及Chasin.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA 77(7)：4216-4220(1980))、293(ATCC寄存編號CRL-1573)、HeLa(ATCC寄存編號CCL-2)、CV1(ATCC寄存編號CCL-70)、WOP(Dailey等人，J.Virol.54：739-749(1985))、3T3、293T(Pear等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：8392-8396(1993))、NS0細胞、SP2/0細胞、HuT 78細胞及其類似物))或植物(例如菸草、浮萍屬(lemna)(浮萍(duckweed)及藻類)之細胞。(參見例如Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.(1993))。在一些實施例中，宿主細胞並非多細胞生物體(例如植物或動物)之一部分。在某些實施例中，宿主細胞為分離之宿主細胞或為細胞培養物之一部分。
本發明亦關於包含本發明之核酸或載體之細胞。在一些實施例中，載體為表現載體。在一些實施例中，可藉由適合於所選宿主細胞之方法將編碼人類化抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈、小鼠抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈或嵌合抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈之一或多種核酸或一或多種包含該(等)核酸之構築體引入適合宿主細胞中，其中該抗體或部分對人類CCL20具有結合特異 性。在一些實施例中，引入方法為例如轉型、轉染、電穿孔或感染。在一些實施例中，將核酸以操作方式連接至一或多種表現控制元件。在某些實施例中，核酸位於載體中、細胞中由處理產生之構築體中或整合至宿主細胞基因組中。宿主細胞可維持在適用於表現之條件下。在一些實施例中，此等條件包含存在誘發物或適合介質(補充有例如適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑等)，藉以產生編碼多肽。此等方法涵蓋在轉殖基因動物或植物(例如菸草)之宿主細胞(例如乳腺細胞)中表現(參見例如WO 92/03918)。在一些實施例中，將抗體或部分自宿主細胞、培養基或乳汁分離。
本發明亦關於融合蛋白，其中本發明之抗體或部分(例如人類化抗體或部分)在N端位置、C端位置或融合蛋白內部連接至另一部分(例如如自然界所見之抗體中不存在之部分)。在一些實施例中，融合蛋白可藉由將編碼抗體序列之核酸插入諸如pET載體(例如pET-15b,Novagen)、噬菌體載體(例如pCANTAB 5 E,Pharmacia)或其他載體(例如pRIT2T蛋白質A融合載體，Pharmacia)之適合表現載體中而產生。可將所得構築體引入適用於表現之宿主細胞中。在一些實施例中，藉助於適合親和力基質自細胞溶胞物分離或純化所表現之融合蛋白(參見例如Current Protocols in Molecu1ar Biology(Ausubel等人編，第2卷，增刊26，第16.4.1-16.7.8頁(1991)))。
本發明係關於一種包含編碼本文提供之抗體或部分或其 重鏈及/或輕鏈(例如本發明之人類化抗體、人類化輕鏈或人類化重鏈、小鼠抗體、小鼠輕鏈或小鼠重鏈、嵌合抗體或嵌合重鏈或嵌合輕鏈)之重組核酸的宿主細胞。本發明亦關於一種包含編碼抗體或其鏈之抗原結合部分之重組核酸的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含如本文所提及之本發明之重組載體。在一些實施例中，該重組載體為表現載體。在某些實施例中，該重組載體為哺乳動物細胞表現載體。
本發明亦關於一種製備本發明之抗體或部分或其重鏈或輕鏈之方法。在一個實施例中，該方法包含使如本文所述之本發明宿主細胞維持在適於表現抗體或部分或其重鏈及/或輕鏈之條件下。在一些實施例中，宿主細胞含有一或多種編碼本發明之抗體或部分或其重鏈及/或輕鏈之分離核酸。在一些實施例中，在受質上或懸浮液中培養宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含純化或分離抗體或抗體鏈之步驟。
本發明進一步關於一種經由噬菌體呈現製備抗體或其抗原結合部分之方法。在一些實施例中，關於CCL20抗原淘選未處理抗體噬菌體呈現文庫。在一些實施例中，使用經由引導選擇製備抗體之方法(參見例如美國專利公開案第US 2006-0251658 A1號)。在某些實施例中，產生圍繞例如已知抗-CCL20抗體之固定重鏈(及/或輕鏈)CDR3區建立之習用文庫。重鏈及輕鏈之CDR1及CDR2區可源自未處理譜系(Osburn等人，Methods 36：61-68(2005))。在一個實施例 中，抗-CCL20 scFv自用於獲得具有所需結合特性之小鼠-人類嵌合抗體之scFv未處理抗體文庫產生。此等文庫可針對具有所需結合特性之抗體進行篩檢。在一些實施例中，使用scFv噬菌體文庫。在某些實施例中，在關於重組人類CCL20之一系列重複選擇週期之後，自scFv引導選擇文庫分離出識別人類CCL20之scFv，基本上如Vaughan等人，Nature Biotech.14：309-314(1996)中所述。簡言之，在用文庫培育之後，與順磁性珠粒預先偶合之固定抗原及結合噬菌體可藉由磁性分離回收，而未經結合之噬菌體會沖走。接著可如Vaughan等人(1996；同上)所述拯救結合噬菌體，且重複選擇過程。
在一個特定實施例中，建構由以單鏈型式與未處理人類輕鏈可變區之譜系融合的小鼠抗-CCL20抗體之重鏈之整個可變域組成的文庫。在選擇之後，鑑別與小鼠重鏈可變區互補之人類輕鏈可變區。接著建構由以單鏈型式與由未處理人類CDR1及CDR2區及來自小鼠抗-CCL20抗體重鏈可變域之固定CDR3區組成之嵌合重鏈可變區融合的如上所述選擇之人類輕鏈可變區譜系組成之文庫。在選擇CCL20結合子之後，選擇最佳結合純系。六個CDR區中之五個可為人類來源，而重鏈可變區之CDR3可與小鼠重鏈可變域之原始CDR3一致。
在一些實施例中，根據製造商之建議，使用與DYNABEADS M-270胺(Dynal)偶合之CCL20進行選擇。在一些實施例中，可使用一級胺特異性試劑丁二醯亞胺基-6- (生物素醯胺基)己酸酯遵循製造商之說明書(EZ link NHS LC Biotin,Pierce)製備使用生物素標記之CCL20之選擇。
在一些實施例中，在高輸送量篩檢中基於量測周質製劑中存在之scFv競爭以結合至CCL20之能力的競爭分析法以周質製劑測試選擇之輸出。
在高輸送量篩檢中能夠競爭之樣品可進行DNA測序，如Vaughan等人(1996；同上)及Osburn等人(2005；同上)中所述。純系接著可經表現且以scFv或IgG形式純化，且例如使用諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)分析法及補體依賴性細胞毒性(CDC)分析法之分析法來評估其結合CCL20、中和CCL20或其組合之能力。接著可如WO 01/66754之實例3所述製備純化之scFv製劑。使用BCA方法(Pierce)測定純化之scFv製劑之蛋白質濃度。可使用類似方法以篩檢固定全長抗體重鏈或輕鏈或重鏈可變域或輕鏈可變域之最佳搭配物(相反鏈)。
在另一個實施例中，首先使用以引用的方式併入本文中之PCT公開案第WO 93/06213號中所述之抗原決定基印痕方法，使用如本文所述之抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分選擇對CCL20具有類似結合活性之重鏈及輕鏈序列。在某些實施例中，此方法中所用之抗體文庫為如PCT公開案第WO 92/01047號，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；及Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)中所述製備及篩檢之scFv文庫，該等文獻均以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，使用人類CCL20作為抗原 篩檢scFv抗體文庫。
一旦選擇初始VL及VH結構域，則可進行「混合並匹配」實驗，其中針對CCL20結合篩檢不同的最初選擇VL及VH區段對以選擇較佳VL/VH對組合。另外，為進一步改良抗體之品質，可以與在天然免疫反應期間造成抗體親和力成熟之活體內體細胞突變方法類似之方法使較佳VL/VH對之VL及VH區段隨機突變。在一些實施例中，隨機突變發生在VH及/或VL之CDR3區內。在某些實施例中，此活體外親和力成熟藉由例如使用分別與VH CDR3或VL CDR3互補之PCR引子擴增VH及VL結構域來實現，其中該等引子已在某些位置「外加」4個核苷酸鹼基之隨機混合物以便所得PCR產物編碼VH及VL區段，其中已將隨機突變引入VH及/或VL CDR3區中。可關於結合至CCL20再篩檢此等隨機突變之VH及VL區段。
在自重組抗體呈現文庫篩檢及分離本發明之抗-CCL20抗體之後，可自呈現封裝(例如自噬菌體基因組)回收編碼所選抗體之核酸且藉由標準重組DNA技術次選殖至其他表現載體中。在一些實施例中，如本文所述，進一步操作核酸以產生本發明之其他抗體形式。在某些實施例中，為表現藉由篩檢組合文庫分離之重組人類抗體，將編碼抗體之DNA選殖至重組表現載體中且引入哺乳動物宿主細胞中，如本文所述。
在一個特定實施例中，本發明提供一種產生分泌對人類CCL20具有結合特異性之單株抗體之融合瘤的方法，該方 法包含向具有與人類CCL20轉殖基因小鼠相同之菌株(例如CD1)的非轉殖基因小鼠投與CCL20轉殖基因小鼠之淋巴細胞，由此產生經免疫之非轉殖基因小鼠。使經免疫之非轉殖基因小鼠之脾細胞與永生化細胞接觸，由此產生融合細胞，且使融合細胞維持在產生分泌對人類CCL20具有結合特異性之單株抗體之融合瘤的條件下，由此產生分泌對人類CCL20具有結合特異性之單株抗體之融合瘤。
本發明亦提供製備突變形式之本發明之抗-CCL20抗體及其抗原結合部分的方法。在一些實施例中，抗體或部分在重鏈及/或輕鏈之可變域中突變。在某些實施例中，該突變改變抗體或部分之一或多種結合特性。在特定實施例中，可在一或多個CDR區進行突變以增加或降低抗-CCL20抗體或部分之KD、增加或降低koff，或改變抗體或部分之結合特異性。此項技術中熟知定點突變誘發中之技術。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，同上。在另一個實施例中，在已知與本發明之單株抗體中之生殖系相比發生變化之胺基酸殘基上進行一或多個突變。在某些實施例中，在可變域之CDR區或構架區中或在恆定域中進行突變。在一個特定實施例中，在可變域中進行突變。在一些實施例中，在已知與本發明抗體或部分之可變域之CDR區或構架區中的生殖系相比發生變化之胺基酸殘基上進行一或多個突變。
在另一個實施例中，構架區發生突變以使得所得構架區具有相應生殖系基因之胺基酸序列。在某些實施例中，在 構架區或恆定域中進行一或多個突變以增加抗-CCL20抗體或部分之半衰期。參見例如PCT公開案WO 00/09560。在某些實施例中，在構架區或恆定域中進行突變以改變抗體之免疫原性，或提供共價或非共價結合至另一分子之位點。根據本發明，單個抗體或部分可在可變域之任何一或多個CDR或構架區中或在恆定域中具有突變。
本發明之抗-CCL20抗體或其抗原結合部分亦可經由產生相關抗體重鏈及輕鏈序列轉殖基因哺乳動物或植物及產生可自其回收形式之抗體以轉殖基因方式產生。在一些實施例中，在山羊、母牛或其他哺乳動物之乳汁中產生且自其中回收抗-CCL20抗體或部分。參見例如美國專利第5,827,690號、第5,756,687號、第5,750,172號及第5,741,957號。在一些實施例中，如上所述，用人類CCL20或其免疫原性部分使包含人類抗體基因座之非人類轉殖基因動物免疫。例如在美國專利第6,046,037號及第5,959,177號中描述在植物中製造抗體之方法。
在一些實施例中，藉由標準轉殖基因技術將一或多個編碼本發明之抗-CCL20抗體或部分之核酸分子引入動物或植物中來產生非人類轉殖基因動物或植物。參見Hogan及美國專利第6,417,429號，同上。在某些實施例中，用於製備轉殖基因動物之轉殖基因細胞可為胚胎幹細胞或體細胞或受精卵。在一些實施例中，非人類轉殖基因動物或植物為嵌合、非嵌合雜合子或非嵌合純合子。參見例如Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach,Oxford University Press(2000)；及Pinkert,Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook,Academic Press(1999)。在一些實施例中，非人類轉殖基因動物或植物藉由編碼相關重鏈及/或輕鏈之靶向構築體具有靶向破環及置換。在某些實施例中，轉殖基因動物或植物包含且表現編碼特異性結合至人類CCL20之重鏈及輕鏈之核酸分子。抗-CCL20抗體或部分可在任何非人類轉殖基因動物或植物中製造。在特定實施例中，非人類動物為小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。非人類轉殖基因動物可表現血液、乳汁、尿液、唾液、眼淚、黏液及其他體液中之編碼多肽。
本發明之抗體及其抗原結合部分適用於中和例如CCR6+細胞(諸如未成熟樹突狀細胞(DC)、效應/記憶T細胞及B細胞)之由CCL20誘發之化學引誘。因此抗體及部分可適用於治療多種疾病及病狀，諸如炎症、自體免疫疾病及癌症。可用本發明之抗體或抗原結合部分治療之疾病及病狀的實例包括(但不限於)格雷氏病、白斑病、甲狀腺機能亢進、類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、接觸性皮炎、克羅恩氏病、發炎性腸病、B細胞惡性病、乳腺癌、慢性肝炎、接觸性皮炎、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、子宮頸之人類乳頭狀瘤病毒感染、蕈樣真菌病、胰腺癌、牙周病、甲狀腺乳頭狀癌、掌蹠膿疱疹、與斑丘疹有關之病狀、大 皰性表皮鬆解、斑禿、多發性硬化症、多發性肌炎、皮肌炎、貝西氏病、急性全身發疹性膿皰病、血管炎、幼年特發性關節炎、類肉瘤病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、腎臟同種異體移植排斥、移植物抗宿主疾病、肝臟同種異體移植排斥、慢性阻塞性肺病、囊腫性纖維化、絲球體腎炎、呼吸道合胞病毒感染、多發性骨髓瘤及蘭格罕氏細胞組織細胞增多病。在一些實施例中，本發明提供治療任何CCR6相關病狀之方法。
因此，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體或部分來治療炎症、自體免疫疾病或癌症的方法。在一些實施例中，個體為患有或有患上自體免疫疾病、癌症及/或炎症風險之人類患者。在一些實施例中，以預防方式投與抗體或部分以預防炎症、自體免疫疾病或癌症發作或復發。
本發明之抗體及其抗原結合部分可單獨或聯合另一藥劑以組合療法形式投與至個體(例如人類)。抗體或部分可在投與其他藥劑之前投與，以與其他藥劑之混合物、分別但同時投與，或在投與其他藥劑之後投與。在一些實施例中，其他藥劑係選自包括(但不限於)以下之群：免疫刺激細胞因子之抑制劑(例如抗-TNF-α MAb)、免疫細胞消除劑(例如抗-CD20 MAb)、輔助分子之阻斷劑(例如阿巴西普)、用於風濕性疾病之疾病改善劑(例如非類固醇消炎藥物(NSAID)、甲胺喋呤、視黃酸及維生素D3類似物)及免疫抑制劑(例如鈣調神經磷酸酶抑制劑)。在一些實施例中， 其他藥劑係選自包括(但不限於)以下之群：類固醇劑、免疫調節劑、生長抑素劑、習知免疫治療劑、細胞因子或細胞因子拮抗劑及/或生長因子或生長因子拮抗劑。在一些實施例中，抗-CCL20抗體療法可聯合諸如化學療法、手術或輻射之標準照護癌症治療或與諸如抗-VEGF抗體療法之另一靶向療法一起使用。在一些實施例中，抗-CCL20抗體療法可聯合預防性療法一起使用。在一個實施例中，合成肽模擬物可聯合本發明抗體一起投與。在另一個實施例中，激素療法可聯合本發明之抗體或部分一起投與。
在一個實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分單獨或與消炎劑組合投與。可與本發明抗體一起投與之消炎劑包括(但不限於)皮質類固醇(例如倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、皮質酮(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫皮質酮(hydrocortisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)及曲安西龍(triamcinolone))、非類固醇消炎藥物(例如巴柳氮(balsalazide)、塞內昔布(celecoxib)、雙氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、夫洛非寧(floctafenine)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奧沙拉嗪(olsalazine)、 噁丙嗪(oxaprozin)、苯基丁氮酮、吡羅昔康(piroxicam)、雙柳酸酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、替諾昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)及托美汀(tolmetin))以及乙醯胺苯酚、抗組織胺、胺基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、二氫吡唑酮、柳酸衍生物(例如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazone)及美沙拉嗪(mesalamine))、噻嗪羧醯胺、e-乙醯胺基己酸、S-腺苷甲硫胺酸、3-胺基-4-羥基丁酸、阿米西群(amixetrine)、苄達酸(bendazac)、苄達明(benzydamine)、布可隆(bucolome)、聯苯吡胺(difenpiramide)、雙苯唑醇(ditazol)、依莫法宗(emorfazone)、瓜甘菊薁(guaiazulene)、萘丁美酮(nabumetone)、尼美舒利(nimesulide)、奧古蛋白(orgotein)、奧沙西羅(oxaceprol)、瑞尼托林(paranyline)、哌立索唑(perisoxal)、哌福肟(pifoxime)、普羅喹宗(proquazone)、普羅沙唑(proxazole)及替尼達普(tenidap)。
可與本發明抗體組合投與之習知非特異性免疫抑制劑包括(但不限於)類固醇、環孢靈(cyclosporine)、環孢靈類似物、環磷醯胺(cyclophosphamide)、甲潑尼松(methylprednisone)、潑尼松、硫唑嘌呤(azathioprine)、FK-506、15-去氧斯匹胍素(15-deoxyspergualin)、那他珠單抗(natalizumab)及藉由抑制反應T細胞功能起作用之其他免疫抑制劑。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與免疫 抑制劑組合投與。可與本發明抗體一起投與之免疫抑制製劑包括(但不限於)ORTHOCLONETM(OKT3)、SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(環孢靈)、PROGRAFTM(他克莫司(tacrolimus))、CELLCEPTTM(黴酚酸酯(mycophenolate))、硫唑嘌呤、糖皮類固醇、AVONEXTM(干擾素-β 1A)及RAPAMUNETM(西羅莫司(sirolimus))。在一個實施例中，免疫抑制劑可用於預防器官或骨髓移植之排斥反應。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與化學治療劑組合投與。可與本發明抗體一起投與之化學治療劑包括(但不限於)抗生素衍生物(例如小紅莓(doxorubicin)、博萊黴素(bleomycin)、道諾黴素(daunorubicin)及更生黴素(dactinomycin))；抗雌激素藥(例如他莫昔芬(tamoxifen))；抗代謝物(例如氟尿嘧啶(fluorouracil)、5-FU、氮尿苷(floxuridine)、干擾素α-2b、麩胺酸、普卡黴素(plicamycin)、巰嘌呤(mercaptopurine)及6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine))；細胞毒性劑(例如卡莫司汀(carmustine)、BCNU、洛莫司汀(lomustine)、CCNU、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、環磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、羥基脲、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素(mitomycin)、白消安(busulfan)、順鉑(cis-platin)及硫酸長春新鹼(vincristine sulfate))；激素(例如甲羥助孕酮(medroxyprogesterone)、雌莫司汀磷酸鈉、乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、雌二醇(estradiol)、腎上腺素(epinephrine)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、甲睾酮 (methyltestosterone)、二磷酸己烯雌酚(diethylstilbestrol diphosphate)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)及睾內酯(testolactone))；氮芥衍生物(例如美法侖(mephalen)、瘤可寧(chorambucil)、氮芥(mechlorethamine/nitrogen mustard)及噻替派(thiotepa))；類固醇及組合(例如倍他米松磷酸鈉(bethamethasone sodium phosphate))；及其他(例如達卡巴嗪(dicarbazine)、天冬醯胺酶(asparaginase)、米托坦(mitotane)、硫酸長春新鹼、硫酸長春鹼(vinblastine sulfate)、利妥昔單抗(rituximab)及依託泊苷(etoposide))。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與TNF拮抗劑組合投與。可與本發明之抗體或抗原結合部分一起投與之TNF拮抗劑包括(但不限於)英利昔單抗(infliximab)(REMICADETM)、阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRATM)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(CIMZIATM)、戈利木單抗(golimumab)(SIMPONITM)、依那西普(etanercept)(ENBRELTM)、黃嘌呤衍生物(例如己酮可可鹼(pentoxifyline))及安非他酮(bupropion)(WELLBURTINTM、ZYBANTM)。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分單獨或與一或多種靜脈內免疫球蛋白製劑組合投與。可與本發明之抗體或部分一起投與之靜脈內免疫球蛋白製劑包括(但不限於)GAMMARTM、IVEEGAMTM、SANDOGLOBULINTM、GAMMAGARD S/DTM及GAMIMUNETM。在一些實施例中，在移植治療(例如骨髓移植)中本發明之抗體或抗原結合部 分與靜脈內免疫球蛋白製劑組合投與。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與細胞因子或細胞因子拮抗劑組合投與。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分可與任何細胞因子或細胞因子拮抗劑一起投與，該細胞因子或細胞因子拮抗劑包括(但不限於)IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗-CD40、CD40L、IFN-γ及TNF-α或其任何拮抗劑。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分可與任何介白素或介白素拮抗劑一起投與，該介白素或介白素拮抗劑包括(但不限於)：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20及IL-21或其任何拮抗劑。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與一或多種趨化因子或趨化因子拮抗劑組合投與。在特定實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與以下組合投與：選自由以下組成之群的α(CxC)趨化因子：γ-干擾素誘導蛋白-10(γIP-10)、介白素-8(IL-8)、血小板因子-4(PF4)、嗜中性白血球活化蛋白(NAP-2)、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、嗜中性白血球活化肽(ENA-78)、粒細胞化學引誘劑蛋白-2(GCP-2)及源自基質細胞之因子-1(SDF-1或前B細胞刺激因子(PBSF))；及/或選自由以下組成之群的β(CC)趨化因子：RANTES(受激活調節正常T細胞表現及分泌因子)、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬細胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、 單核細胞趨化性蛋白-1(MCP-1)、單核細胞趨化性蛋白-2(MCP-2)、單核細胞趨化性蛋白-3(MCP-3)、單核細胞趨化性蛋白-4(MCP-4)、巨噬細胞炎性蛋白-1γ(MIP-1γ)、巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)、巨噬細胞炎性蛋白-3β(MIP-3β)、巨噬細胞炎性蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC)、嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)、Exodus及I-309；及/或γ(C)趨化因子、淋巴細胞趨化因子(lymphotactin)；或其任何拮抗劑。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與趨化因子β-8、趨化因子β-1及/或巨噬細胞炎性蛋白-4或其任何拮抗劑一起投與。在一個較佳實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與趨化因子β-8或其拮抗劑一起投與。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與IL-4拮抗劑組合投與。可與本發明之抗體及抗體組合物一起投與之IL-4拮抗劑包括(但不限於)：可溶性IL-4受體多肽、可溶性IL-4受體多肽之多聚體形式、結合IL-4受體而不會轉導由IL-4引發之生物信號的抗-IL-4受體抗體、阻斷IL-4與一或多種IL-4受體結合之抗-IL4抗體，及結合IL-4受體但不會轉導由IL-4引發之生物信號的IL-4之突變型蛋白。根據此方法利用之抗-IL4抗體較佳為單株抗體；亦可利用其抗原結合部分。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與TNF家族之成員或其拮抗劑組合投與。在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分與包括(但不限於)以下之藥劑組 合投與：可溶形式之TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，亦稱為TNF-β)，LT-β(見於複合物異三聚體LT-α2-β中)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(國際公開案第WO 96/14328號)、AIM-I(國際公開案第WO 97/33899號)、內皮因子-α(endokine-α)(國際公開案第WO 98/07880號)、OPG、嗜中性白細胞因子-α(neutrokine-α)(國際公開案第WO 98/18921號)、OX40、神經生長因子(NGF)、可溶形式之Fas、CD30、CD27、CD40 4-IBB、TR2(國際公開案第WO 96/34095號)、DR3(國際公開案第WO 97/33904號)、DR4(國際公開案第WO 98/32856號)、TR5(國際公開案第WO 98/30693號)、TR6(國際公開案第WO 98/30694號)、TR7(國際公開案第WO 98/41629號)、TRANK、TR9(國際公開案第WO 98/56892號)、TR10(國際公開案第WO 98/54202號)、312C2(國際公開案第WO 98/06842號)、TR12及可溶形式CD154、CD70及CD153；或其任何拮抗劑。
如本文所用，術語「治療有效量」係指在一定程度上減輕或預防所治療之病症之一或多種症狀的所投與治療劑之量。用於治療疾病之抗-CCL20抗體或其抗原結合部分之有效量為有助於所治療個體達到一或多種所需臨床終點之量。
在一些實施例中，為使免疫原性減至最小，在本發明之治療方法及組合物中使用人類化抗體或部分治療人類患者。在不需要重複投與之情況下，在一些實施例中，向人 類患者投與本發明之小鼠或嵌合抗體或部分亦可為適當的。
在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分可用於治療先前已用例如免疫刺激細胞因子之抑制劑(例如抗-TNF-α MAb)、免疫細胞消除劑(例如抗-CD20 MAb)及/或輔助分子之阻斷劑(例如阿巴西普)治療之個體。在一些實施例中，使用抗體或部分來治療對此等其他治療最初無反應或反應速率逐漸降低之患者。
本發明之抗體或抗原結合部分可在健康照護提供者認為適當之任何時間點以單次單位劑量或多次劑量投與。劑量可藉由此項技術中已知之方法來確定且可例如視個體之年齡、敏感性、耐受性及總體健康狀態而定。此項技術中所接受之任何投藥方法可適當地用於本發明之抗體及部分，包括(但未必限於)非經腸(例如靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內、腹膜內、皮下注射)、經口(例如飲食)、局部、表面、吸入(例如支氣管內、鼻內或經口吸入、鼻內滴劑)或經直腸投藥，視待治療之疾病或病狀而定。在一個實施例中，抗體或部分係非經腸投與。
調配物將根據所選投藥途徑而不同(例如溶液、乳液)。可於生理學上可接受之媒劑或載劑中製備包含待投與之抗體或部分之適當組合物。組合物可包含多次劑量或為單次單位劑量組合物。對於溶液或乳液而言，適合載劑包括例如水性或醇性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑可包括氯化鈉溶液、林格氏右 旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏溶液或不揮發性油。靜脈內媒劑可包括不同添加劑、防腐劑、或流體、養分或電解質補充劑(一般參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Co.,PA,1985)。對於吸入而言，化合物可溶解及加載於適合分配器中以進行投與(例如霧化器、噴霧器或加壓氣霧劑分配器)。
可調節給藥方案以提供最佳所需反應。在某些實施例中，可投與單次大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情形之緊急性所示按比例減小或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所使用，單位劑型係指適宜以整體劑量用於待治療之患者/個體的物理個別單位；各單位含有經計算將產生所需治療效果之預定量的活性化合物與所需醫藥載劑結合。本發明之單位劑型的規格通常係由以下因素指定且直接取決於以下因素：(a)治療劑之獨特特徵及欲達成之特定治療或預防效果；及(b)混配該活性化合物以治療個體敏感性之技術內所固有之限制。
因此，熟練技術者將瞭解，基於本文所提供之揭示內容，可根據治療技術中所熟知之方法調節劑量及給藥方案。亦即，可容易地確立最大耐受劑量，且亦可確定為患者提供可偵測治療益處之有效量，以及可確定向患者投與各藥劑以提供可偵測治療益處之時間要求。因此，儘管本文例示某些劑量及投藥方案，但此等實例決不會限制在實 踐本發明中可提供給患者之劑量及投藥方案。
應注意到，劑量值可隨待減輕之病狀之類型及嚴重程度而變，且可包括單次或多次劑量。更應瞭解，對於任何特定個體而言，特定給藥方案應根據個體需要及投與或監督組合物投與之人士的專業判斷隨著時間加以調節，且本文中所述之劑量範圍僅為例示性的，而不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。此外，本發明組合物之給藥方案可基於多種因素，包括疾病類型、患者之年齡、體重、性別、醫學病狀、病狀之嚴重程度、投藥途徑及所用之特定抗體。因此，給藥方案可大大不同，但通常可使用標準方法確定。舉例而言，劑量可基於藥物動力學或藥效參數進行調節，該等參數可包括諸如毒性效應之臨床效應及/或實驗室值。因此，本發明涵蓋如熟練技術者所測定之患者體內劑量逐步增加。確定適當劑量及方案之方法在相關技術中熟知，且應瞭解一旦提供本文所揭示之教示內容即可由熟練技術者完成。
在一些實施例中，對於投與至人類個體而言，本發明之抗體或抗體部分之全月劑量在每個患者0.5至1200 mg之範圍內，當然視投藥模式而定。在某些實施例中，靜脈內月劑量需要每個患者約1至1000 mg。全月劑量可以單次劑量或分次劑量投與，且可根據醫師判斷超出本文所給出之典型範圍。
在某些實施例中，本發明抗體或抗體部分之治療或預防有效量之範圍為每月每個患者1至1000 mg/kg。在一個實 施例中，本發明之抗體或其部分可以每月每個患者約1至200或1至150 mg投與。在某些實施例中，抗體或部分以每個患者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg投與，每月注射1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。在一個特定實施例中，抗體或部分以每個患者1至5 mg/kg投與，每月注射1或2次。
本發明之抗體及其抗原結合部分亦適用於研究及診斷中所用之多種方法。在一些實施例中，抗體及部分係用於偵測、分離及/或純化人類CCL20或其變異體(例如藉由在懸浮液中對於例如細胞(諸如淋巴細胞)實施親和力純化或其他適合方法，諸如流動式細胞測量術)，且研究人類CCL20結構(例如構形)及功能。對於抗體之免疫原性不受關注之活體外應用而言，本發明之小鼠及嵌合抗體及其抗原結合部分適用於添加至人類化抗體中。
本發明之抗體或其抗原結合部分可用於診斷性應用(例如活體外、離體)。在一些實施例中，使用本發明之人類化抗體或部分偵測及/或量測樣品中人類CCL20之含量。在某些實施例中，樣品包含例如表現人類CCL20之細胞或組織，及/或帶有人類CCL20之體液，諸如發炎滲出液、血液、血清及/或腸液。樣品可獲自個體，且本文所述抗體或部分可用於適合免疫方法中以偵測及/或量測人類CCL20表現，包括諸如以下之方法：流動式細胞測量術(例如用於懸浮液中之細胞，諸如淋巴細胞)、酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)(包括化學發光分析法、放射免疫分析法及 免疫組織學分析法)。
在一個實施例中，偵測樣品中人類CCL20之方法包含在適用於使抗體或部分與人類CCL20特異性結合且偵測所形成之抗體-CCL20複合物之條件下使樣品與本發明之抗體或部分接觸。在一個實施例中，本文所述抗體或部分可用於分析正常組織相對於發炎組織(例如來自人類)之人類CCL20反應性及/或表現(例如免疫組織方式)，以偵測人類CCL20之表現增加(例如在受侵襲組織中)與一或多種選自(但不限於)以下之病症之間的關聯：格雷氏病、白斑病、甲狀腺機能亢進、類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、接觸性皮炎、克羅恩氏病、發炎性腸病、B細胞惡性病、乳腺癌、慢性肝炎、接觸性皮炎、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、子宮頸之人類乳頭狀瘤病毒感染、蕈樣真菌病、胰腺癌、牙周病、甲狀腺乳頭狀癌、掌蹠膿疱疹、與斑丘疹有關之病狀、大皰性表皮鬆解、斑禿、多發性硬化症、多發性肌炎、皮肌炎、貝西氏病、急性全身發疹性膿皰病、血管炎、幼年特發性關節炎、類肉瘤病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、腎臟同種異體移植排斥、移植物抗宿主疾病、肝臟同種異體移植排斥、慢性阻塞性肺病、囊腫性纖維化、絲球體腎炎、呼吸道合胞病毒感染、多發性骨髓瘤、蘭格罕氏細胞組織細胞增多病或其他病狀。因此，本發明之抗體允許評估正常及發炎組織中人類CCL20之存在的免疫方法，經由該等方法可評估疾病(例如發炎性疾病及/或免疫疾病)之存在、疾病進展及/或在疾病治療中抗人 類CCL20療法之功效。
除非另外指出，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知且如整個本說明書所引用及討論的各種一般參考文獻及更特定參考文獻中所述之習知方法進行。參見例如Sambrook J.及Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書，如此項技術中通常所實現或如本文所述來進行。關於本文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學所用之命名以及本文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用者。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。下文描述例示性方法及材料，但亦可將與本文所述類似或等效之方法及材料用於本發明之實踐或測試。本文所提及之所有公開案及其他參考文獻均以全文引 用的方式併入本文中。在出現衝突之情況下，以本說明書(包括定義)為準。儘管本文引用大量文獻，但此引用不構成承認任何此等文獻會形成此項技術中常用一般知識之一部分。在本說明書及申請專利範圍通篇中，詞語「包含(comrpise)」或其變化形式(諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」)將理解為意味包括所述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。材料、方法及實例僅具說明性且並不意欲具限制性。
為更充分理解本發明，闡明以下實例。此等實例僅為說明之目的，且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
實例1：CCL20與自體免疫病症/發炎性病症之關聯
為獲得CCL20與自體免疫病狀及發炎性病狀之關聯的證據，研究II型膠原蛋白誘發關節炎(CIA)小鼠類風濕性關節炎(RA)模型中剔除CCL20受體CCR6之作用。用在完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)(Chondrex，#7001)中乳化之牛II型膠原蛋白(每隻小鼠150 μg)在尾巴根部使CCR6野生型小鼠、CCR6+/-(異種接合)小鼠及CCR6-/-(同種接合)基因剔除小鼠(各n=10)免疫。三週後，在尾部根部投與相同量之含牛II型膠原蛋白乳液之不完全佐劑的加強注射液(booster injection)。將各小鼠爪中關節炎症狀之嚴重程度分級，如Griswold等人，Arthritis & Rheumatism 31(11)：1406-1412(1988)中所述。簡言之，基於所涉及之關節數及紅斑及腫脹程度將肘或膝遠端四肢之關節病變以0至4之等級分級。關節炎評分計算為各動物所有4個爪評 分之總和。CCR6野生型動物患上關節炎，而CCR6-/-動物展示對該疾病之強抗性(圖1)。有趣的是，CCR6+/-動物亦展現一定程度的抗性，指示完全廢除CCL20功能對於抵消關節炎表型沒有必要。
另外，以免疫組織化學方式分析小鼠後爪中CD3陽性T細胞或F4/80陽性巨噬細胞之存在。在第43天，收集小鼠且將其後爪固定於福馬林(formalin)中。接著將爪切片且置於載片上。在將爪樣品去鈣之後，用抗-CD3(#N1580，DAKO)及F4/80抗體(純系CI：A3-1，AbD Serotec)以免疫組織化學方式對載片染色。染色強度由兩個獨立觀測者藉由用Aperio儀(Aperio Technologies)掃描樣品來評分。評分等級如下：0，正常；1，整個爪輕微染色或一個趾強烈染色；2，多個趾中度染色；3，多個趾強烈染色或整個爪中度染色；4，整個所有趾及爪強烈染色。在CCR6+/-與CCR6-/-小鼠中浸潤CIA誘發之病變之T細胞數(圖2)及巨噬細胞數(圖3)強烈降低。
亦研究在二硝基氟苯(DNFB)誘發之過敏性接觸性皮炎小鼠模型中剔除CCR6之作用。藉由連續兩天(第0天及第1天)將25 μl 0.4% DNFB溶液(於4：1丙酮：橄欖油中)刷塗於已剃毛之腹部上使兩組各六隻小鼠(一組為CCR6野生型小鼠且一組為CCR6缺乏小鼠)敏感。在第5天，藉由向一隻耳一側塗覆20 μl 0.1% DNFB(於4：1丙酮：橄欖油中)再激發小鼠。作為水腫之指示，在DNFB激發之前及在第5天最後激發之後24小時藉由使用厚度規量測耳厚度。CCR6缺乏小 鼠顯示在用DNFB處理之後耳厚度幾乎不增加，指示抗DNFB誘發之接觸過敏之抗性(圖4)。
此等資料均支持CCR6及CCL20在自體免疫病症/發炎性病症中起作用。
實例2：藉由倉鼠抗小鼠CCL20 2F5-5 MAb抑制CCL20誘發之趨化性
為進一步探究CCL20作為潛在治療標靶之作用，使用倉鼠抗小鼠CCL20抗體(2F5-5)進行實驗。首先表徵2F5-5 MAb與小鼠、人類及恆河猴CCL20之結合能力。如下製備各物種之分泌可溶性CCL20之鹼性磷酸酶(SEAP)抗原。將編碼人類、食蟹獼猴、恆河猴、大鼠及小鼠之CCL20之cDNA擴增且次選殖至pcDNA3.1(+)dSalI SEAP載體中，該載體含有SEAP cDNA且其SalI位點已缺失(pcDNA 3.1(+)購自Invitrogen；SEAP cDNA源自pSEAP-強化子載體，Clontech)。將表現載體轉染至人胚腎細胞株HEK293EBNA(HEK293E，Invitrogen)中。在轉染之前一天用補充有10%胎牛血清之DMEM(Invitrogen)接種HEK293E細胞。轉染當天，用OPTI-MEM II無血清培養基(Invitrogen)替換培養基。使用TransIT LT1(TAKARA Bio Inc.，Shiga,Japan)根據製造商之方案轉染表現載體。在5% CO2及37℃下培育3天之後，收集培養物上清液。藉由使用Great EscAPe SEAP化學發光套組2.0(Clontech)量測各培養物中CCL20-SEAP之濃度。
接著進行表面電漿子共振(BiacoreTM)結合研究，以量測 2F5-5 MAb與小鼠、人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20-SEAP抗原之結合。使用標準NHS/EDC胺偶合程序將抗-SEAP(單株抗小鼠胎盤鹼性磷酸酶，Thermo Scientific，目錄號MAI-19354，批號KL12748M)固定於CM5感測器晶片(GE Healthcare)上。用含有0.005% Tween-20之TBS-P將SEAP標記小鼠CCL20(100 nM上清液溶液，ID735，批號091130)稀釋至5 nM且捕捉於CM5感測器晶片上。以30 μl/min之流速將倉鼠抗小鼠CCL20(2F5-5，批號060215，2 mg/ml)於TBS-P中之0.2 nM至80 nM稀釋液注射於感測器晶片上。分別監測倉鼠抗小鼠CCL20與小鼠CCL20之締合及解離4分鐘及16分鐘。在注射之間使用10 mM甘胺酸(pH 2.25)使晶片表面再生。感測器圖譜藉由扣除倉鼠抗小鼠CCL20注射至未捕捉小鼠CCL20之參考槽及捕捉小鼠CCL20上之TBS-P注射液進行雙重參考。由BIAevaluation 軟體(GE Healthcare，3.2版)使用1：1朗繆爾(Langmuir)結合模型分析感測器圖譜。在此分析中，2F5-5 MAb以32 pM之親和力結合至小鼠CCL20，但不會結合至人類、恆河猴或食蟹獼猴CCL20(表1)。
為測試2F5-5 MAb對CCL20功能之作用，使用活體外趨化性分析法評估其對小鼠CCL20之中和活性。將CCR6轉導B300.19細胞及重組小鼠CCL20(1 nM)添加至transwell培養盤中。4小時後，藉由螢光活化細胞分選(FACS)對遷移至下腔室中之細胞計數。1 μg/ml之2F5-5 MAb完全抑制趨化性，估計IC50值為0.04 μg/ml(0.27 nM)(圖5)。與之相比，對照倉鼠抗體(10 μg/ml)不會抑制趨化性(100%控制；資料未示)。
實例3：小鼠抗-CCL20 MAb之人類化
為獲得抗人類CCL20之單株抗體，產生一組小鼠抗人類CCL20抗體。將用弗氏完全佐劑(Mitsubishi-Kagaku Yatron，RM606-1)乳化之重組人類CCL20(R&D，#360-MP-025/CF，17.5 μg/頭)皮下注射至小鼠之足墊中。接著每三天施與兩次連續注射。最終免疫之後三天，處死動物且在50%聚乙二醇存在下使腹股溝淋巴結細胞與P3U1骨髓瘤細胞以2：1至10：1比率融合。接著用96孔塑膠培養盤培養細胞。
使用夾心ELISA進行初級篩檢。用多株抗人類1gG抗體(Jackson，#709-005-149，2 μg/ml PBS(-)溶液)塗佈96孔培養盤。在4℃下培育隔夜之後，在室溫下用1×Block-Ace(Dainippon Sumitomo Pharma，UK-B80)阻斷各孔1小時。接著用0.02% Tween 20/PBS(-)洗滌各孔，此後將1 nM人類CCL20-hIgG Fc嵌合體蛋白於0.02% Tween 20/PBS(-)中之溶液添加至各孔(每孔50 μl)。在室溫下培育1小時之 後，如上所述再進行三次洗滌。接著用20% FBS及200 μg/ml人類IgG(Mitsubishi Welpharma)於0.02% Tween 20/PBS(-)中之溶液2倍稀釋來自各融合瘤之培養物上清液，添加至各孔中，且在室溫下培育1小時。再洗滌三次之後，在室溫下用結合辣根過氧化酶之抗小鼠IgG抗體(Jackson，#715-035-150，用0.02% Tween 20/PBS(-)稀釋5000倍)培育各孔1小時。接著洗滌各孔三次且用TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液培育15至30分鐘。接著添加等體積2 M H2SO4以終止反應，且藉由ARVO(PerkinElmer)在450 nm下讀取光學密度。夾心ELISA鑑別24個陽性孔。
接著進行趨化性分析作為第二次篩檢。用transwell培養盤(MultiScreen孔5 μm，Millipore，#MAMIC 5S10)進行趨化性分析。首先，在室溫下在培養盤之下部孔中用每孔100 μl來自融合瘤之培養物上清液預先培育每孔50 μl 300 ng/ml重組人類CCL20(R&D，#360-MP-025/CF)於趨化性緩衝液(0.5% BSA、0.5% FBS、20 mM HEPES(pH 7.4)、50 μM 2-巰基乙醇之RPMI1640(Invitrogen)溶液)中之溶液30分鐘(最終CCL20濃度為100 ng/ml)。30分鐘之後，將用人類CCR6(SEQ ID NO：104)轉染之B300.19細胞(每75 μl 2×105個細胞)塗覆於上部孔中且於5% CO2培育箱中在37℃下培育4小時。培育之後，收集下部孔之150 μl且用50 μl 4% PFA/PBS(-)固定。將30 μl各樣品塗覆於FACSCantoII細胞分析器(BD Biosciences)中以計數遷移之細胞。在4個孔中發現中和活性。
接著使用標準限制稀釋法自4個陽性孔獲得融合瘤純系。使用活體外趨化性分析法確定來自各純系之上清液之中和活性。三種由此等純系(抗體36F7C10(表2)、42G5B10(表3)且40-1C10B9(表4))產生之小鼠抗人類CCL20單株抗體顯示對人類CCL20之中和活性。
接著使用36F7C10、42G5B10及40-1C10B9小鼠抗體產生人類化抗體重鏈及輕鏈。如Kabat及/或Chothia定義方法根據Kabat編號所鑑別，人類化方法涉及將小鼠互補決定區(CDR)移植至人類重鏈及輕鏈生殖系序列，表示與CDR來源之原始小鼠序列之最佳構架匹配(圖6A至圖6C；粗體表示小鼠抗體與人類生殖系序列之間不同的殘基；加下劃線 且粗體表示移植小鼠CDR；斜體且粗體表示經相應小鼠抗體殘基取代之構架殘基；及加下劃線、斜體且粗體表示經相應人類生殖系殘基取代之CDR殘基)。根據Altschul等人，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1997)所述之方法，使用IgBlast資料庫鑑別構架匹配。為衍生替代人類化鏈型式，使用兩種方法：1)預測與CDR殘基相互作用之構架內之關鍵鼠類殘基的3D建模技術，及2)鑑別緊鄰典型CDR序列之鼠類殘基之序列比對。
將人類化序列構築至表現載體中且轉染至哺乳動物細胞系(例如HEK293E細胞(Invitrogen))中以產生抗體。接著用功能及生理化學分析法表徵由此方法獲得之抗體。
實例4：證明人類化抗人類CCL20 Ab之中和活性的活體外趨化性分析法
鑑別藉由使用CCR6轉導之B300.19細胞進行活體外趨化性分析法積極中和人類CCL20配體之人類化抗體。當測定IC50、IC90及IC95值(圖7A至圖7C)時，顯示IC95表中數值降低之抗體視為具有顯著中和活性(圖7C)。關於所產生之14個人類化重鏈及26個人類化輕鏈，測試41種組合。此等組合中之8種組合顯示顯著中和趨化性。以下列舉此8種人類化抗體：
．36LK3/36HKK3
．36LK3/42HKK1
．36LK3/42HKK2
．36LK3/42HKK3
．36LK3/36HC2
．36LK3/36HC3
．36LC3/36HKK3
．36LC3/36HC2
人類化重鏈HC2、HC3、36HKK3、42HKK1、42HKK2及42HKK3及人類化輕鏈LC3及LK3之胺基酸及核苷酸序列示於表5至表12中。此等重鏈及輕鏈所用之藉由人類生殖系基因編碼之胺基酸序列示於表13中。
基於評估結果，選擇36LK3/36HC2(「HC2/LK3」)及36LC3/36HC2(「HC2/LC3」)進行進一步研究。對於此等兩種抗體而言，與親本小鼠純系36F7C10及其嵌合形式(包含人類Fc部分)平行進行活體外趨化性分析法。在此分析法中，利用在上層中具有接種之B300.19 CCR6+細胞且在下層中具有重組人類CCL20配體之transwell培養盤。在室溫下用人類化抗-CCL20抗體預先培育重組人類CCL20(最終10 nM，R&D Systems)。30分鐘之後，將人類CCR6轉導之鼠類前B細胞(B300.19，由東京大學(Tokyo University)之Dr.H.Kawasaki提供)塗覆於上層且在37℃下使趨化性顯影4小時。在培育結束時，使用FACS量測遷移之細胞。接著計算HC2/LK3及HC2/LC3之50%、90%及95%抑制濃度(分別為IC50、IC90及IC95)(表14)。與親本小鼠MAb相比，兩種人類化抗體皆不會失去中和活性，且在約1 nM下計算IC50值。
由HC2/LK3抗體進行之代表性試驗之劑量反應示於圖8A至圖8C中。描述三個獨立實驗。
進一步使用經內皮遷移(TEM)分析法確定HC2/LK3及HC2/LC3之中和活性，其中使用新近分離之人類周邊血液單核細胞替代CCR6轉導之人工細胞。因為熟知CD3+CD4+CD45RO+記憶T細胞及CD19+ B細胞富含CCR6陽性細胞，所以，在存在或不存在HC2/LK3及HC2/LC3抗體以及親本小鼠抗體36F7C10之情況下量測此等群體之遷移細胞數。兩種人類化抗體(圖9B及圖9C)皆顯示與 36F7C10(圖9A)類似之細胞遷移之劑量依賴性抑制作用，從而為其中和活性提供進一步證據。
實例5：人類化抗人類CCL20 MAb結合至人類CCL20
為藉由表面電漿子共振(BiacoreTM)量測人類化抗體HC2/LC3及HC2/LK3之結合親和力，表現且純化來自短暫性轉染之HEK293F細胞之條件培養基的抗體，且使用HBS-EP作為操作緩衝液在塗有抗人類Fc單株抗體之CM5晶片上捕捉抗體。接著注射人類CCL20蛋白(R&D Systems)之若干稀釋液(100、20、4、0.8、0.16及0 nM)於經塗佈晶片表面上，且觀測結合CCL20之解離長達20分鐘(圖10A及圖10B)。結合資料全面擬合1：1朗繆爾模型。結果示於表15中且表示兩個獨立實驗之平均值。已報導在初級人類細胞中CCL20與其受體CCR6之間的親和力為500 pM(Liao等人，J.Immunol.168(10)：4871-4880(2002))；此等資料表明HC2/LC3及HC2/LK3抗體對CCL20之親和力為CCR6對CCL20之親和力的約10倍。
實例6：人類化抗人類CCL20 MAb對趨化因子旁系同源物之交叉反應性
藉由使用酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)分析HC2/LK3及HC2/LC3對趨化因子組之交叉反應性(表16)來研究HC2/LK3及HC2/LC3對人類CCL20之特異性。
96孔培養盤之各孔用1 μg/ml重組人類趨化因子於PBS(-)中之溶液塗佈。在4℃下培育隔夜之後，在室溫下用1×Block-Ace(Dainippon Sumitomo Pharma，UK-B80)阻斷各孔1小時。在用0.02% Tween 20/PBS(-)洗滌兩次之後，向各孔添加50 μl 10 μg/ml純化36F7C10、嵌合36F710、HC2/LK3或HC2/LC3於0.02% Tween 20/PBS(-)中之溶液。在室溫下培育各孔1小時且洗滌三次，如實例3所述。接著添加結合辣根過氧化酶(HRP)之抗小鼠IgG抗體(Jackson，#715-035-150，對於36F7C10而言)或結合HRP之抗人類IgG Fcγ片段(Jackson，#109-035-098，對於嵌合及人類化mAb而言)(於用0.02% Tween 20/PBS(-)5000倍稀釋之稀釋液中)，且在室溫下培育各孔1小時。在洗滌五次之後，將TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液(1%，N,N-二甲基甲醯胺溶液)添加至各孔中且培育15至30分鐘。藉由添加等體積之2 M H2SO4終止溶液終止反應，且在450 nm下藉由ARVO(PerkinElmer)讀取光學密度。如圖11B中所顯示，HC2/LK3及HC2/LC3特異性地結合至人類CCL20，優於組中其他趨化因子。
在此等分析法中，儘管HC2/LK3對培養盤結合之人類CCL20具有反應性，但似乎與小鼠36F7C10或嵌合36F7C10-hFc抗體相比有效性較差(圖11A)。然而，在ELISA分析法中HC2/LK3展示與經由His標籤錨定之CCL20之結合清晰且強烈(圖11C)，此舉使所有CCL20部分暴露於溶劑。由此可指示，在第一分析型式中用於使CCL20結合至培養盤表面的程序中，HC2/LK3之CCL20抗原決定基經包埋或閉塞。為避免此種可能發生之假像，利用在感測器晶片上捕捉之MAb上塗覆游離CCL20之BiacoreTM分析。在BiacoreTM分析法中，HC2/LK3及HC2/LC3展示與36F7C10-hFc嵌合抗體類似之強CCL20結合(圖11D)。此外，發現圖11B中所觀測到之對CXCL4之小反應在BiacoreTM分析法中可忽略(圖11D)。
Dereeper等人(Nucleic Acids Res.1(36)：W465-469(2008))之系統發育分析指示CCL16為序列最接近於CCL20之趨化因子，但CCL20與CCL16之間的一致性百分比小於37.5%(包含成熟CCL20肽之70個胺基酸中僅56個同源(SIM-蛋白質序列比對工具，Swiss Institute of Bioinformatics))(圖12)。使用BiacoreTM分析以測試HC2/LK3及HC2/LC3是否與CCL16交叉反應。將單株小鼠抗人類Fc與含0.2 mg/mL BSA之HBS-EP緩衝液一起以25 μl/min之流速固定於CM5晶片之所有4個流量槽上。隨後，將50 μl 1 μg/ml嵌合、HC2/LC3或HC2/LK3抗體於具有0.2 mg/ml BSA之HBS-EP緩衝液中之溶液分別注射於流量槽2、3及4上。接 著將150 μl 100 nM CCL20或CCL16於具有0.2 mg/ml BSA之HBS-EP緩衝液(或僅緩衝液)中之溶液以40 μl/min之流速注射於所有4個流量槽上。之後解離20分鐘。將流量槽1(僅抗人類Fc抗體)用作所有流量槽之參考。
在此等條件下，人類CCL20以類似強度結合至晶片上所捕捉之嵌合抗體(圖13A)、HC2/LC3抗體(圖13B)及HC2/LK3抗體(圖13B)。與之相比，當人類CCL16穿過晶片時未偵測到顯著結合，指示儘管CCL16序列最接近於CCL20之趨化因子，但CCL20及CCL16不具有足夠同源性(<37%，如上文所討論)以使人類化抗-CCL20抗體與CCL16交叉反應。
此等資料指示HC2/LK3及HC2/LC3對人類CCL20之特異性優於其他趨化因子。
實例7：人類化抗人類CCL20 MAb對物種直系同源物之交叉反應性
接著測定HC2/LC3及HC2/LK3 MAb對來自其他物種之CCL20之交叉反應性。CCL20直系同源物(使用SIM(蛋白質序列比對工具(Swiss Institute of Bioinformatics))獲得)中之胺基酸序列比對指示食蟹獼猴/恆河猴與人類CCL20之間的一致性為86%，而小鼠與人類CCL20之間的同源性為64%(圖14；人類CCL20-SEQ ID NO：85；恆河猴CCL20-SEQ ID NO：86；食蟹獼猴CCL20-SEQ ID NO：87；部分小鼠CCL20-SEQ ID NO：88(整個小鼠CCL20胺基酸序列可見於SEQ ID NO：102中；殘基1-27構成信號序列；參見表 18))。
為測試嵌合及人類化抗體是否可結合至小鼠、食蟹獼猴或恆河猴CCL20直系同源物，使用如圖15中所說明之ELISA分析法。如實例2所述工程改造重組分泌鹼性磷酸酶(SEAP)趨化因子融合蛋白，表現及純化所有所測試CCL20直系同源物。在4℃下用1 μg/ml小鼠抗胎盤鹼性磷酸酶抗體(Pierce，目錄號MA1-19354)於50 mM碳酸氫鈉中之溶液(pH 9.4)塗佈Nunc MaxiSorb平底黑色培養盤隔夜。接著在室溫下使用具有5%牛血清白蛋白(BSA)之含Tween-20之1×磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBST)阻斷培養盤2小時。用Opti-MEM培養基(Invitrogen)5倍連續稀釋20 nM SEAP-CCL20融合蛋白。用具有5% BSA之1×PBST將嵌合及人類化(HC2/LC3及HC2/LK3)抗體稀釋至1 μg/ml，添加至培養盤中，且在室溫下培育1小時。接著用具有5% BSA之1×PBST洗滌培養盤三次。將山羊抗人類IgG+IgM(H+L)HRP結合物(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-035-127)稀釋至80 ng/ml，添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。添加QuantaBlu螢光HRP受質(Pierce，目錄號15169)以藉由用Molecular Devices M5(激發325 nm/發射420 nm)培養盤讀取器量測螢光來偵測結合抗體。
儘管倉鼠抗小鼠CCL20抗體2F5-5 MAb以64 pM之50%有效劑量(EC50)(資料未示)結合小鼠CCL20，但在上文所述條件下嵌合或人類化抗人類CCL20抗體皆不會可偵測地結合至小鼠CCL20或大鼠CCL20。與之相比，嵌合與人類化抗體皆有效結合至人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20(圖16A至圖16C、圖17A及圖17B)。儘管人類及恆河猴CCL20之 EC50似乎類似(例如對於HC2/LC3為62及101 pM)，但食蟹獼猴CCL20對HC2/LC3之EC50為340 pM，相對於人類CCL20為5.4倍差異。對於HC2/LK3觀察到類似結果。由此表明需要較大濃度之抗體以達成結合至食蟹獼猴CCL20之量與結合至人類或恆河猴CCL20之量相同。
實例8：人類化抗-CCL20 MAb對CCL20物種直系同源物之交叉反應性的表面電漿子共振分析法
亦使用表面電漿子共振(BiacoreTM)分析來測試HC2/LC3及HC2/LK3是否可結合至小鼠、食蟹獼猴或恆河猴CCL20直系同源物。將單株小鼠抗人類胎盤鹼性磷酸酶以25 μl/min之流速固定於CM5晶片之所有4個流量槽上。將25 μl 2 nM人類、恆河猴、食蟹獼猴或小鼠CCL20-SEAP於HBS-EP緩衝液中之溶液注射於流量槽2、3或4上。對於抗體結合而言，將240 μl之0至80 nM HC2/LC3、HC2/LK3或2F5-5 MAb於HBS-EP緩衝液(或僅緩衝液)中之稀釋液以50 μl/min之流速注射於所有4個流量槽上。之後解離45分鐘。將流量槽1(僅抗-SEAP)用作所有流量槽之參考。用10 mM甘胺酸(pH 2.25)使流量槽再生。由於晶片捕捉能力之再生作用，故自低濃度至高濃度依序進行抗體注射。使用1：1朗繆爾模型進行數據擬合。
在以上條件下，倉鼠抗小鼠CCL20抗體2F5-5以4.9 pM之(二價)KD結合小鼠CCL20，但不會顯著結合人類、恆河猴或食蟹獼猴CCL20。與之相比，嵌合、HC2/LC3及HC2/LK3抗體有效結合至人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20(表17)。
在此分析法中所量測之表觀親和力值高於先前實例5中所偵測(例如在本發明分析法中對於HC2/LC3為4.7 pM，相對於表3中之44 pM)，此係由於所用分析型式之二價(較高親和力)性質(相對於表3中所示資料所用之單價型式)。恆河猴及食蟹獼猴CCL20之KD值通常高於(3倍)人類CCL20，指示抗體更特異性地結合至人類CCL20。然而，與實例7之ELISA資料相比，未觀測到恆河猴與食蟹獼猴CCL20之結合親和力之間的顯著差異。
實例9：小鼠抗人類CCL20純系36F7C10之抗原決定基定位
為測定小鼠抗人類CCL20單株抗體36F7C10所結合之人類CCL20抗原決定基，使用氫/氘交換方法，其中抗體之結合性保護且因此保留抗原決定基之氘化。如圖18A中所示，在接近人類CCL20之N端的殘基7-9、10-19及20-22處觀測到極強之干擾，可能代表抗原決定基。在接近C端之殘基39-55、56-67及61-70處亦觀測到邊緣保護。此等區段可在抗原決定基周邊，或其呼吸運動可結合抗原決定基。在4個時間點展示各指定胺基酸之氘化程度：自上而下為150秒、500秒、1,500秒及5,000秒。
鑑別為36F7C10之抗原決定基的區域屬於CCL20之N端及迴路區域，已知其為CCR6結合及信號傳導之關鍵(Malik等人，Acta Cryst F62：631-634(2006))(圖18B)。預期源自36F7C10之嵌合及人類化抗體，尤其具有與36F7C10相同之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之抗體或與36F7C10類似之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列(例如與36F7C10之CDR相比對時，具有小於3、2或1個胺基酸取代)之抗體可結合至相同抗原決定基。鑑別出此抗原決定基因此可說明36F7C10 MAb及其所衍生之嵌合及人類化抗體在中和CCL20活性上之能力。
實例10：人類化抗人類CCL20抗體之活體內趨化性分析法
為測試HC2/LC3及HC2/LK3是否可於活體內抑制CCL20誘發之趨化性，利用人類CCL20可與小鼠CCR6(SEQ ID NO：106)相互作用，來誘發小鼠T細胞之趨化性(圖19)。使 用可以量測小鼠T細胞趨向皮內注射之人類CCL20之遷移的雜交活體內系統(圖20)。
將重組人類CCL20(每隻10 ng)及媒劑分別經皮內注射至測試小鼠之背部右側及左側已剃毛皮膚中(各組n=3)。接著將鈣黃綠素-AM標記之小鼠脾T細胞(每隻小鼠5×106個細胞)以經靜脈內方式轉移至尾靜脈中，同時將指定抗體依圖20中所述劑量注射至尾靜脈中。一小時後，使用立體顯微鏡在皮內注射部位計算螢光陽性細胞數。
HC2/LK3與HC2/LC3皆顯著抑制細胞向CCL20注射部位之遷移，該抑制程度與親本小鼠抗體36F7C10及其嵌合形式類似。因為T細胞之趨化性為發炎性級聯反應之關鍵步驟，所以防止此遷移對於治療自體免疫病狀及發炎性病狀具有臨床意義。
實例11：2F5-5 MAb對II型膠原蛋白誘發之關節炎之作用
為進一步評估抗-CCL20抗體用於治療性適應症之用途，進一步在小鼠中使用倉鼠抗小鼠2F5-5 MAb進行活體內研究。首先，評估CIA小鼠(類風濕性關節炎之動物模型)中2F5-5中和CCL20介導之趨化性之能力。CIA基本上如實例1所述誘發。在關節炎(關節炎評分1至3)發生之後，將小鼠隨機分組且用每隻小鼠500 μg 2F5-5 MAb或對照IgG抗體處理。在兩種情況下，每隔一天經靜脈內投與抗體。與對照IgG相比，2F5-5 MAb會抑制關節炎症狀之進一步發展(圖21、圖22)。
亦使用X射線評分來測定2F5-5 MAb對通常見於類風濕 性關節炎中之骨病變之作用。如Inoue等人，Agents Actions 39：187-194(1993)中所述進行評分。簡言之，根據X射線影像基於骨質疏鬆症(O)、骨侵蝕(E)及新骨形成(N)之嚴重程度將CIA小鼠之各爪分級為0至3之等級。所用等級為：0，無變化；1，輕微變化；2，中度變化；及3，嚴重變化。各因子之評分相加產生骨病變之累積X射線評分。相比於用對照IgG處理之小鼠，用2F5-5 MAb處理之小鼠顯示第39天X射線評分顯著不嚴重(圖23、圖24)。
藉由使用ELISA分析若干生物標記物確定2F5-5 MAb處理對骨病變之作用。使CIA小鼠免疫且如上所述用500 μg 2F5-5或對照IgG抗體處理。在第二次免疫之後第11或12天自小鼠製備血漿樣品。除以1：20稀釋動物血漿樣品之外，使用動物COMP ELISA酶免疫分析套組(AnaMar Medical)根據製造商之說明書(以引用的方式併入本文中)定量軟骨破壞之標記物，即血清軟骨寡聚基質蛋白(COMP)。因為將COMP預先塗佈於培養盤上，所以此為競爭ELISA，藉此添加COMP標準物或含有COMP之血漿引起OD450降低(圖25A)。來自樣品分析之原始資料示於圖25B及圖25C中。CIA小鼠中之COMP血清含量藉由用2F5-5 MAb處理幾乎降至正常含量(圖26)，表明2F5-5抑制軟骨破壞之能力。
因為破骨細胞之形成及分化會導致RA相關骨質疏鬆症及侵蝕，所以量測核因子B配體之破骨細胞誘導分子受體活化子(RANKL)及破骨細胞標記物(諸如核因子B之受體活化子(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及組織蛋白 酶K)之含量作為關節炎治療之指示。藉由定量PCR使用自均質化小鼠爪分離之總RNA評估此等標記物之mRNA表現量。首先在浸泡於含有Trizol試劑(Invitrogen,CA,USA)之組織溶解緩衝液中之後用均質器使爪均質化。在添加氯仿之後，在4℃下在14,000 rpm下將樣品離心15分鐘，將溶液分離為水相及有機相。移除水相且向其中添加異丙醇，之後在4℃下在14,000 rpm下離心15分鐘，獲得RNA離心塊。 將用無RNAse之水溶解的RNA離心塊用於RNAeasy小型套組(QIAGEN,Valencia,CA,USA)中以分離RNA且用DNAse處理以移除任何DNA。用RT反應套組(RNA PCR套組，TAKARA Bio,Inc.Shiga,Japan)根據製造商之方案由RNA產生互補DNA(cDNA)。對各cDNA種類進行定量即時PCR且與管家基因次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)之含量進行比較。PCR反應中使用以下正向及反向引子組：RANKL，5'-CATTTGCACACCTCACCATC-3'(SEQ ID NO：89)及5'-TCCGTTGCTTAACGTCATGT-3'(SEQ ID NO：90)；RANK，5'-CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3'(SEQ ID NO：91)及5'-TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-3'(SEQ ID NO：92)；TRAP，5'-GCTGGAAACCATGATCACCT-3'(SEQ ID NO：93)及5'-GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG-3'(SEQ ID NO：94)；組織蛋白酶K，5'-CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT-3'(SEQ ID NO：95)及5'-CCGAGCCAAGAGAGCATATC-3'(SEQ ID NO：96)；及HPRT，5'-CAGGCCAGACTTTGTTGGAT-3'(SEQ ID NO：97)及 5'-TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3'(SEQ ID NO：98)。
所有引子均使用基於網路之軟體Primer 3(Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA,USA)加以設計以避免RNA之非特異性擴增。與cDNA模板、引子、尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen,CA,USA)及QuantiTect SYBR Green PCR母體混合物(QIAGEN,Valencia,CA,USA)之反應混合物用於ABI PRISM 7700序列偵測系統(Applied Biosystems,Foster,CA,USA)中之擴增反應中。藉由ABI PRISM 7700序列偵測器軟體自動定量表現量。
2F5-5 MAb處理之後，關節組織中所有標記物之mRNA含量得以抑制(圖27A及圖27B；展示與管家基因HPRT相比表現量成倍變化)，進一步證明2F5-5活體內抑制骨病變。
實例12：2F5-5 MAb對葡萄糖-6-磷酸異構酶誘發之關節炎之作用
在患有葡萄糖-6-磷酸異構酶(G6PI)誘發之關節炎之小鼠(RA之另一小鼠模型)中測試2F5-5 MAb處理之抗關節炎作用。藉由用在完全弗氏佐劑中乳化之重組GST-G6PI(每隻小鼠300 μg)皮內敏化來誘發關節炎且在DBA/1小鼠之尾巴根部進行注射。G6PI免疫之後六天且剛好在關節腫脹發作之前，將小鼠隨機分組且用每隻小鼠500 μg同型匹配抗體或2F5-5 MAb處理。如先前實例1中所述分級各小鼠爪中關節炎症狀之嚴重程度。與用同型匹配抗體處理之小鼠相比，用2F5-5 MAb處理之小鼠展現顯著較低之關節炎評 分，展示2F5-5與對照相比會強烈抑制關節炎發展(圖28)。
此等資料證明活體內關節炎模型中抗-CCL20抗體處理之功效，且表明使用抗-CCL20抗體可有益於治療類風濕性關節炎。
實例13：2F5-5 MAb對噁唑酮誘發之異位性皮炎之作用
接著評估皮炎之小鼠模型中2F5-5 MAb處理之作用。在一個模型中，在易患疾病之小鼠(NC/Nga品系)中使用噁唑酮誘發異位性皮炎。在第0、5及8天將小鼠之腹部皮膚剃毛且暴露於噁唑酮。在第13天，選擇展示皮炎病徵(評分2)之小鼠且再用噁唑酮免疫。此後將小鼠隨機分為用2F5-5 MAb或同型匹配對照IgG抗體(每隻小鼠500 μg，每隔一天靜脈內投與)處理之六隻組。在不知情研究中如下分析皮炎評分：諸如乾燥、鱗屑、紅斑、滲泌/結殼及表皮脫落之各皮炎症狀按0比3之等級評分(0=無，1=輕微，2=中度，3=重度)；接著此等評分相加得到累積皮炎評分(如Leung等人，J.Allergy Clin.Immunol.85(5)：927-933(1990)中所述)。藉由定量第13天至第18天之曲線下面積(「AUC」)比較兩組之間的疾病抑制量值。在此皮炎模型中，與對照IgG相比，2F5-5 MAb誘發對疾病進展之統計上顯著(p<0.05)抑制(圖29)。
實例14：2F5-5 MAb對DNFB誘發之過敏性接觸性皮炎之作用
在二硝基氟苯(DNFB)誘發之過敏性接觸性皮炎(皮炎第二小鼠模型)中測試2F5-5 MAb處理之作用。將小鼠分成6 隻組且藉由於已剃毛腹部上刷塗25 μl DNFB溶液(含0.4% DNFB之丙酮：橄欖油之4：1溶液)連續兩天(第0天及第1天)使其敏感。用2F5-5 MAb處理一個組，同時用同型匹配對照抗體(每隻小鼠500 μg，經靜脈內，第0、2及5天)處理另一組。在第5天，藉由向一隻耳一側塗覆20 μl 0.2% DNFB溶液(於4：1丙酮：橄欖油中)再激發小鼠。在第6天使用厚度規量測耳厚度作為水腫之指示。用2F5-5 MAb處理會降低耳厚度，表明成功預防皮炎發展(圖30)本說明書所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中。雖然為清晰理解之目的已藉由說明及實例相當詳細地描述上述發明，但一般技術者應容易認識到，鑒於本發明之教示，可在不悖離隨附申請專利範圍之精神或範疇的情況下對本發明作出某些變化及修改。
圖1為展示CCR6缺乏小鼠相較於野生型小鼠對膠原蛋白誘發之關節炎敏感性較差之圖表。野生型，CCR6+/+小鼠；Het，CCR6+/-小鼠；基因剔除，CCR6-/-小鼠。參見實例1。
圖2為展示與野生型小鼠相比，CCR6缺乏小鼠展現在膠原蛋白誘發之關節炎病灶中T細胞浸潤削弱(如CD3含量所示)之圖表。所示數據為來自一個實驗(每組n=7隻小鼠)之平均值±SEM。＊p<0.05，＊＊p<0.01。參見實例1。
圖3為展示與野生型小鼠相比，CCR6缺乏小鼠展現在膠原蛋白誘發之關節炎病灶中巨噬細胞浸潤削弱(如F4/80含量所示)之圖表。所示數據為來自一個實驗(每組n=7隻小鼠)之平均值±SEM。＊＊p<0.01。參見實例1。
圖4為展示與野生型小鼠相比，CCR6缺乏小鼠抵抗二硝基氟苯(DNFB)誘發之過敏性接觸性皮炎模型的耳厚度增加之圖表。WT，野生型小鼠；KO，CCR6缺乏小鼠。參見實例1。
圖5為展示2F5-5 MAb抑制CCL20誘發之趨化性的圖表。參見實例2。
圖6A至圖6C描述本發明抗體(SEQ ID NO：9-16)之可變域與小鼠抗人類抗體36F7C10(VH：SEQ ID NO：39；VL：SEQ ID NO：40)及42G5B10(VH：SEQ ID NO：43)之可變域及與生殖系序列IGHV1-46＊03(SEQ ID NO：57)、JH4(SEQ ID NO：58)及IGKV1D-39＊01(SEQ ID NO：59)之序列比 對。指示各CDR之Kabat及Chothia定義。ABM67212(SEQ ID NO：82)及BAH04867.1(SEQ ID NO：83)為人類抗體，所示人類化抗體鏈之構架區係源自該人類抗體。參見實例3。
圖7A至圖7C為描述藉由人類化抗人類CCL20抗體鏈之不同組合抑制活體外趨化性的表。除非另外註明，否則數據表示三個試驗。參見實例4。
圖8A至圖8C描述評估人類化HC2/LK3抗人類CCL20抗體之抑制作用所進行之三個獨立試驗。展示HC2/LK3抗體以抑制CCL20誘發之趨化性。展示各實驗之IC50、IC90及IC95值。參見實例4。
圖9A至圖9C描述展示人類化抗體B)HC2/LK3及C)HC2/LC3表明經內皮遷移分析法中細胞遷移之劑量依賴性抑制作用類似於A)小鼠抗體36F7C10之一系列圖表。參見實例4。
圖10A及10B描述表明A)HC2/LC3及B)HC2/LK3人類化抗體以濃度依賴性方式結合至人類CCL20之BiacoreTM感測器圖譜。參見實例5。
圖11A至圖11D表明抗人類CCL20抗體特異性結合至人類CCL20。使用由培養盤結合CCL20及其他趨化因子(在1 μg/ml下)進行之ELISA分析法偵測A)36F7C10與嵌合抗體以及B)人類化HC2LK3與HC2LC3抗體之結合。C)使用由His標籤錨定之CCL20進行之ELISA分析法偵測結合。D)BiacoreTM實驗證實抗人類CCL20抗體結合至人類CCL20 且展現與CXCL4之結合可忽略。參見實例6。
圖12展示CCL20(SEQ ID NO：114)與CCL16(SEQ ID NO：115)之56殘基重疊部分之間的胺基酸序列比對。參見實例6。
圖13A及圖13B為展示A)嵌合抗人類CCL20抗體及B)人類化抗人類CCL20抗體與CCL20特異性反應且不與CCL16反應之一系列圖表。參見實例6。
圖14展示人類(第一次揭示時為SEQ ID NO：85，第二次揭示時為SEQ ID NO：85之殘基2-96)、恆河猴(SEQ ID NO：86)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：87)及小鼠(SEQ ID NO：88)CCL20直系同源物之間的胺基酸序列比對。參見實例7。
圖15為ELISA分析法中抗人類CCL20抗體偵測之圖示。參見實例7。
圖16A至圖16C描述表明A)嵌合抗人類CCL20抗體及B)、C)人類化抗人類CCL20抗體有效結合至人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20，而不結合至小鼠CCL20之一系列圖表。參見實例7。
圖17A及圖17B描述表明人類化及嵌合抗人類CCL20抗體有效結合至人類、恆河猴及食蟹獼猴CCL20，而不結合至大鼠或小鼠CCL20之圖表。B)人類化抗體及A)嵌合抗體保留A)小鼠抗體36F7C10之結合特異性，該等抗體係源自該小鼠抗體36F7C10。參見實例7。
圖18A及圖18B展示藉由氫/氘交換對人類CCL20進行抗原決定基定位之結果。此實驗利用來自R&D Systems之人 類CCL20(SEQ ID NO：84)之變異體，其中倒數第二個殘基為D，替代野生型序列中所示之N。A)指示4個時間點(自頂部：150 s、500 s、1500 s及5000 s)CCL20之各殘基之氘化程度。B)人類CCL20之結構，指示本發明抗體所結合之抗原決定基。參見實例9。
圖19為表明小鼠CCR6轉導B300細胞向小鼠與人類CCL20遷移之一對圖表。參見實例10。
圖20為展示小鼠、嵌合及人類化抗人類CCL20抗體活體內以劑量依賴性方式抑制小鼠T細胞向人類CCL20遷移之圖表。參見實例10。
圖21為展示倉鼠抗小鼠CCL 20 MAb 2F5-5減輕小鼠中膠原蛋白誘發之關節炎症狀之圖表。參見實例11。
圖22為表明2F5-5 MAb會減緩膠原蛋白誘發之關節炎症狀進展的個別動物臨床評分之表。參見實例11。
圖23為描述藉由X射線評分對小鼠爪子分級之圖表。展示2F5-5 MAb會減輕患有膠原蛋白誘發之關節炎之小鼠的骨病變。對照：對照IgG。參見實例11。
圖24描述指示患有膠原蛋白誘發之關節炎之小鼠爪子中骨病變的評分X射線之實例。O：骨質疏鬆症，E：骨侵蝕，N：新骨形成。參見實例11。
圖25A至圖25C展示膠原蛋白誘發之關節炎小鼠模型中軟骨破壞之標記物，即血清軟骨寡聚基質蛋白(COMP)之量測。A)由COMP標準物得到之校準器數據。X軸，單位/公升；Y軸，450 nm下之光學密度。B)用倉鼠對照IgG或 2F5-5 MAb處理之小鼠的培養盤模板及原始數據。C)個別動物之數據表明與用對照IgG抗體處理之動物相比，用2F5-5 MAb處理之動物中COMP含量降低。參見實例11。
圖26為展示2F5-5 MAb使小鼠中COMP之血清含量降低的圖表。對照IgG：同型匹配抗體；CCL20 mAb：2F5-5 MAb。參見實例11。
圖27A及圖27B為展示2F5-5 MAb會使破骨細胞標記物A)RANKL及RANK及B)TRAP及組織蛋白酶K之mRNA表現降低的圖表。對照IgG：同型匹配抗體；CCL20 mAb：2F5-5 MAb；Y軸：定量PCR單位。參見實例11。
圖28為展示2F5-5 MAb對小鼠之葡萄糖-6-磷酸異構酶誘發之關節炎具有預防性作用之圖表。參見實例12。
圖29為展示2F5-5 MAb抑制小鼠之噁唑酮誘發之異位性皮炎進展的圖表。參見實例13。
圖30為展示2F5-5 MAb抑制小鼠之二硝基氟苯誘發之過敏性接觸性皮炎(如耳厚度所量測)的圖表。參見實例14。
<110> 克林 布拉德
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<223> 人工序列之描述：合成引子
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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Claims (32)

  1. 一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含重鏈互補決定區1(CDR1)、重鏈互補決定區2(CDR2)及重鏈互補決定區3(CDR3)，及包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含輕鏈互補決定區1(CDR1)、輕鏈互補決定區2(CDR2)及輕鏈互補決定區3(CDR3)，其中該重鏈CDR1、CDR2及CDR3及該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)分別為SEQ ID NO：60、64、67、70、73及75；b)分別為SEQ ID NO：60、64、67、71、73及75；c)分別為SEQ ID NO：60、63、67、70、73及75；d)分別為SEQ ID NO：60、63、67、71、73及75；e)分別為SEQ ID NO：61、65、68、70、73及75；f)分別為SEQ ID NO：61、65、68、71、73及75；g)分別為SEQ ID NO：77、79、67、70、73及75；h)分別為SEQ ID NO：77、79、67、71、73及75；i)分別為SEQ ID NO：78、80、68、70、73及75；及j)分別為SEQ ID NO：78、80、68、71、73及75。
  2. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含以下之至少一者：a)一重鏈，其可變域包含選自SEQ ID NO：9-14之胺基酸序列；及b)一輕鏈，其可變域包含SEQ ID NO：15或16之胺基酸 序列。
  3. 如請求項2之單株抗體或抗原結合部分，其中該重鏈可變域及該輕鏈可變域分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：9及15；b)SEQ ID NO：9及16；c)SEQ ID NO：10及16；d)SEQ ID NO：11及15；e)SEQ ID NO：11及16；f)SEQ ID NO：12及16；g)SEQ ID NO：13及16；及h)SEQ ID NO：14及16。
  4. 如請求項1之單株抗人類CCL20抗體或抗原結合部分，其中：a)該重鏈包含：(1)選自由SEQ ID NO：1-6(無信號序列)及SEQ ID NO：108組成之群的胺基酸序列；或(2)選自由SEQ ID NO：1-6(無信號序列)及SEQ ID NO：108組成之群的胺基酸序列，其中該胺基酸序列缺乏C端離胺酸；或b)該輕鏈包含選自由SEQ ID NO：7及8(無信號序列)以及SEQ ID NO：110及112組成之群的胺基酸序列；或c)該抗體包含(a)之重鏈及(b)之輕鏈兩者。
  5. 如請求項4之單株抗體或抗原結合部分，其中該重鏈及 該輕鏈分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：1及7；b)SEQ ID NO：1及8；c)SEQ ID NO：2及8；d)SEQ ID NO：3及7；e)SEQ ID NO：3及8；f)SEQ ID NO：4及8；g)SEQ ID NO：5及8；h)SEQ ID NO：6及8；i)SEQ ID NO：108及110；j)SEQ ID NO：108及112；k)無C端離胺酸之SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：7；l)無C端離胺酸之SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：8；m)無C端離胺酸之SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：8；n)無C端離胺酸之SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：7；o)無C端離胺酸之SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：8；p)無C端離胺酸之SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：8；q)無C端離胺酸之SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：8；r)無C端離胺酸之SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8；s)無C端離胺酸之SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：110；及t)無C端離胺酸之SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：112；不含可能存在之信號序列。
  6. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體為人類化抗體。
  7. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中：a)該重鏈之構架區利用IGHV1-46*03人類生殖系序列；或b)該輕鏈之構架區利用IGKV1D-39*01人類生殖系序列；或c)a)及b)兩者。
  8. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定域。
  9. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原結合部分為單鏈抗體、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv二聚體、雙功能抗體、功能域缺失抗體或單域抗體(dAb)。
  10. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分具有一或多種選自由以下組成之群的特性：a)不會結合至人類CCL16；b)結合至食蟹獼猴或恆河猴CCL20，而不結合至小鼠或大鼠CCL20；c)使用單價表面電漿子共振分析法測得對人類CCL20之結合親和力為70pM或70pM以下；d)使用二價表面電漿子共振分析法測得對人類CCL20之結合親和力為12pM或12pM以下；e)對人類CCL20之結合親和力大於對人類CCR6之結合親和力； f)對人類CCL20之選擇性優於對人類CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28或XCL1；g)降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性，其中IC50為1.7nM或1.7nM以下；h)活體內降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性；i)活體外降低CCR6+細胞之由人類CCL20誘發之趨化性；j)減緩個體之關節炎症狀之進展；k)減緩個體之骨質疏鬆症、骨侵蝕或新骨形成；l)降低個體之軟骨寡聚基質蛋白(COMP)血清含量；m)降低個體之RANKL、RANK、TRAP或組織蛋白酶K之mRNA含量；n)減緩個體之異位性皮炎之進展；及o)減緩個體之過敏性接觸性皮炎之進展。
  11. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分結合至包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列之人類CCL20之抗原決定基：a)SEQ ID NO：84之殘基7-9；b)SEQ ID NO：84之殘基10-19；及 c)SEQ ID NO：84之殘基20-22。
  12. 如請求項11之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原決定基係選自由包含以下所組成之群：包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19及20-22之抗原決定基；及包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19及20-22且進一步包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸序列之抗原決定基：a)SEQ ID NO：84之殘基39-55；b)SEQ ID NO：84之殘基56-67；及c)SEQ ID NO：84之殘基61-70。
  13. 如請求項12之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO：84之殘基7-9、10-19、20-22、39-55、56-67及61-70。
  14. 一種單株抗體，其重鏈及輕鏈分別包含：a)SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：110；或b)無C端離胺酸之SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：110。
  15. 一種單株抗體，其重鏈及輕鏈分別包含：a)SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：112；或b)無C端離胺酸之SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：112。
  16. 一種單株抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含：a)一重鏈，其包含選自由SEQ ID NO：39、41及43組成之群的胺基酸序列；及 b)一輕鏈，包含選自由SEQ ID NO：40、42及44組成之群的胺基酸序列。
  17. 如請求項16之單株抗體或抗原結合部分，其中該重鏈及該輕鏈分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：39及40；b)SEQ ID NO：41及42；及c)SEQ ID NO：43及44。
  18. 如請求項17之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含包括SEQ ID NO：39之重鏈及包括SEQ ID NO：40之輕鏈。
  19. 如請求項16之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體為嵌合抗體。
  20. 一種經分離之核酸分子或核酸分子對，其包含編碼下列之核苷酸序列：如請求項1或11之單株抗體或抗原結合部分之重鏈CDR1、CDR2、CDR3或可變域；及如請求項1或11之單株抗體或抗原結合部分之輕鏈CDR1、CDR2、CDR3或可變域。
  21. 如請求項20之經分離之核酸分子或核酸分子對，其中該經分離之核酸分子或核酸分子對包含核苷酸序列，其編碼：a)單株抗人類CCL20抗體之重鏈，其中該核苷酸序列係選自由以下所組成之群：SEQ ID NO：17-22、25-30及109，以及不具有編碼信號序列之SEQ ID NO：17-22、25-30及109；及 b)單株抗人類CCL20抗體之輕鏈，其中該核苷酸序列係選自由以下所組成之群：SEQ ID NO：23、24、31、32、111及113，以及不具有編碼信號序列之SEQ ID NO：23、24、31、32、111及113。
  22. 一種如請求項20之經分離之核酸分子或核酸分子對之用途，其係用作藥劑。
  23. 一種重組載體，其包含如請求項20之經分離之核酸分子或核酸分子對。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項20之經分離之核酸分子或核酸分子對。
  25. 一種製造抗人類CCL20抗體或其抗原結合部分之方法，其包括使如請求項24之宿主細胞維持在適於表現該抗體或部分之條件下。
  26. 如請求項25之方法，其進一步包含分離該抗體或部分。
  27. 一種組合物，其包含如請求項1或11之單株抗體或抗原結合部分，及醫藥學上可接受之媒劑或載劑。
  28. 一種如請求項1或11之單株抗體或抗原結合部分之用途，其係用於製備治療有需要個體之病狀之藥物。
  29. 如請求項28之用途，其中該病狀為CCR6相關病狀、自體免疫病狀或發炎性病狀、癌症、B細胞惡性病、乳腺癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、類風濕性關節炎、牛皮癬、異位性皮炎、接觸性皮炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、格雷氏病(Grave's disease)、白斑病、甲狀腺機能亢進、慢性 肝炎、子宮頸之人類乳頭狀瘤病毒成染、蕈樣真菌病、骨質疏鬆症、牙周病、肘或膝遠端四肢之關節病變、紅斑、腫脹、軟骨寡聚基質蛋白(COMP)血清含量增加、核因子κB配體之受體活化子(RANKL)之mRNA含量增加、核因子κB之受體活化子(RANK)之mRNA含量增加、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)之mRNA含量增加、組織蛋白酶K之mRNA含量增加及過敏性接觸性皮炎。
  30. 一種如請求項1或11之單株之抗體或抗原結合部分之用途，其係用於製備在有需要個體中降低CCR6+細胞之由CCL20介導之趨化性的藥物。
  31. 一種如請求項1或11之單株之抗體或抗原結合部分之用途，其係用於製備於活體外降低CCR6+細胞之由CCL20介導之趨化性的藥物。
  32. 一種如請求項1或11之單株抗體或抗原結合部分之用途，其係用於製造藥劑。
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