JP5996549B2 - 中和抗ccl20抗体 - Google Patents

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Description

本願は、2010年11月19日に出願された米国仮特許出願第61/415,614号からの優先権を主張する。この米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
(発明の分野)
本発明は、ヒトCCケモカインリガンド20(CCL20)に対して特異的に指向される、新規なヒト化抗体、キメラ抗体およびマウス抗体に関する。本発明のヒト化抗体は、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置のための治療剤として特に十分に適している。
(発明の背景)
免疫系は、非自己(例えば、外来生物もしくは外来物質)を自己から区別するために身体によって使用される、非常に精巧な生体回路である。身体における非自己の検出は、炎症を生じ得、ここで種々の細胞成分および分子成分が調整されて、上記非自己の生物もしくは物質によって引き起こされる潜在的に有害な事象に応答する。その炎症プロセスは、外来の攻撃から身体を守る一助にはなるものの、免疫系の統制解除は、自己攻撃(例えば、自己免疫疾患)のような負の結果をもたらし得る。炎症性分子(例えば、ケモカイン)の機能を変化させることによって、免疫/炎症応答に関連する障害の開始および進行を減じることは、可能であり得る。
ケモカインは、炎症において中心的役割を果たす低分子(8〜10kDa)タンパク質のファミリーである。上記炎症プロセスの間に、ケモカインは、有害刺激の部位において局所的に生成され、それらの同族レセプターである7回膜貫通Gプロテイン共役レセプター(GPCR)を発現する免疫細胞を動員する中心的なプレーヤーとして働く。CCL20(肝臓および活性化調節ケモカイン(liver and activation−regulated chemokine)(LARC)、マクロファージ炎症性タンパク質−3α(MIP−3α)、もしくはExodus−1とも称される)は、上皮細胞によって発現される可溶性ケモカインである。上皮ケラチノサイトおよび滑膜裏打ち細胞(synovium−lining cell)は、恒常的な状態、ならびに炎症状態および病的な状態(例えば、がん、乾癬、および関節リウマチ)の間に、多量のCCL20を生成することが公知である。CCL20の同族レセプターは、CCケモカインレセプター6(CCR6)であり;CCL20は、CCR6と相互作用することが公知の唯一のケモカインである。上記CCL20シグナルへの応答において、CCR6を有する免疫細胞(例えば、未熟樹状細胞(DC)、エフェクター/記憶T細胞、およびB細胞)は、周りの組織に移動しかつ浸潤し、従って、炎症カスケードを活性化させる。
CCL20発現は、炎症性サイトカイン(例えば、インターロイキン1β(IL−1β)および腫瘍壊死因子α(TNF−α))によって誘発される炎症において有意に増強されるので、上記CCL20−CCR6相互作用は、病的な炎症プロセスにおいて役割を果たすと考えられている。
関節リウマチ(RA)は、最も一般的な自己免疫疾患のうちの1つである。RAの最初の徴候は、しばしば、腫脹した、疼痛のある関節として現れる滑膜炎である。滑膜炎を開始する特定の因子は未知のままであるが、滑膜裏打ち上皮細胞および滑膜線維芽細胞は、上記炎症反応の主な誘導因子であると考えられている。RA患者に由来する滑液は、ヒト単球および炎症促進性Tヘルパー17(Th17)細胞を効率的に化学誘引し、次いで、上記Th17細胞は、RA炎症プロセスを誘導および増悪させる。反応性滑膜細胞は、多量のCCL20を(特に、IL−1βおよびTNF−αの影響下で)生成し得る一方で、CCR6は、Th17細胞の主要なレセプターであるので、上記CCL20−CCR6相互作用は、上記炎症プロセスにおいて重要な役割を果たすと考えられている。
上記CCL20−CCR6相互作用はまた、特定のタイプの皮膚炎において重要な役割を果たし得る。例えば、乾癬は、皮膚において(環境因子および/もしくは遺伝的因子によって誘導される)有害乾癬事象とともに開始し、続いて、Th17細胞の浸潤が続く。CCR6は、Th17細胞、B細胞、樹状細胞、および組織損傷エフェクターT細胞の表面で発現されるので、CCL20は、乾癬においてこれら細胞タイプの主要な化学誘引物質を代表し得る。上記CCL20−CCR6相互作用の重要性のさらなる証拠は、乾癬の、インターロイキン23(IL−23)誘発マウスモデルを使用した研究において見いだされ得る(Hedrick et al, J. Clin. Invest. 119:2317−2329 (2009))。このモデルにおいて、IL−23の注射は、インターロイキン22(IL−22)依存性乾癬性炎症を引き起こす。しかし、Ccr6−/−マウスは、IL−23を注射した場合に乾癬様症状を示さない。このことは、CCR6が、乾癬の発症に必要とされることを示す。
ヒトケラチノサイトは、多量のCCL20を、特に、Th17由来サイトカインであるインターロイキン17(IL−17)、IL−22、およびTNF−αの影響下で生成し得る。CCL20およびCCR6は、希に正常皮膚において検出される一方で、これらはともに、アトピー性皮膚炎および膿胞性乾癬において増大した発現レベルを示す。CCL20の強い誘導およびCCR6+細胞の蓄積は、ヒト皮膚炎病変の顕微鏡による免疫組織化学的分析において観察され得る。これら観察は、皮膚炎炎症プロセスにおいてCCL20およびCCR6の役割のさらなる証拠を提供する。
免疫障害を処置するための現在利用可能なMAb生物製剤は、大きく3つの群に分類され得る:免疫刺激性サイトカインのインヒビター(例えば、抗TNF−α MAb)、免疫細胞除去剤(例えば、抗CD20 MAb)、およびアクセサリー分子のブロッカー(例えば、アバタセプト)。これらの生物製剤は、炎症性疾患の処置において有用であり得る;しかし、これらの処置への主な非応答性もしくは徐々に応答率が低下することに起因して、例えば、CCL20/CCR6媒介性障害を有する患者の医療的ニーズを満たすための、新規な作用機構を有する代替の生物製剤が早急に必要である。本発明の主題の抗体は、このような代替の生物製剤を示す。
(発明の要旨)
本発明は、中和抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分に関する。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体は、ヒト化抗ヒトCCL20抗体であり、これは、マウス抗ヒトCCL20抗体の相補性決定領域(CDR)を含み得る。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体は、マウスもしくはキメラの抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分である。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、ヒトCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、ヒトCCL16に結合しない。
本発明の抗体は、CCL20に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、カニクイザルおよび/もしくはアカゲザルのCCL20、ならびにヒトCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、マウスおよび/もしくはラットのCCL20に結合しない。一実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくは抗原結合部分は、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルのCCL20に結合するが、マウスおよびラットのCCL20に結合しない。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下より小さい、ヒトCCL20に対する結合親和性(K)を有する:
− 一価(monovalent)表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、1nM、500pM、100pM、90pM、80M、70pM、60pM、もしくは50pM、または
− 二価(bivalent)表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、1nM、500pM、100pM、75pM、50pM、25pM、20pM、15pM、14pM、13pM、12pM、11pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、もしくは5pM。
特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、ヒトCCR6より高い、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、100、90、80、70、60、50、40、もしくは30(×10−1 sec−1)未満の、ヒトCCL20に対するkを有する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、10、9、8、7、6、5、4、もしくは3(×10−5 sec−1)未満の、ヒトCCL20に対するkを有する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、100、90、80、70、60、50、40、もしくは30(×10−1 sec−1)未満の、アカゲザルCCL20に対するkを有する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、もしくは2(×10−5 sec−1)未満の、アカゲザルCCL20に対するkを有する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、100、90、80、70、60、50、40、30、20、もしくは10pM未満の、アカゲザルCCL20に対するKを有する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、もしくは30(×10−1 sec−1)未満の、カニクイザルCCL20に対するkを有する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、もしくは6(×10−5 sec−1)未満の、カニクイザルCCL20に対するkを有する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、100、90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、もしくは15pM未満の、カニクイザルCCL20に対するKを有する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、100、90、80、70、60、50、40、39、38、37、36、35、もしくは34pM未満のEC50で、ヒトCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、500、400、300、200、150、140、130、120、110、100、90、80、70、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、もしくは50pM未満のEC50で、アカゲザルCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、500、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、109、108、107、106、105、104、103、もしくは102pM未満のEC50で、カニクイザルCCL20に結合する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、他のヒトケモカイン(CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28、および/もしくはXCL1が挙げられるが、これらに限定されない)を上回る、ヒトCCL20に対する選択性を有する。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくは抗原結合部分は、上記ケモカインの全てを上回る、ヒトCCL20に対する選択性を有する。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、もしくは1.1nM未満のIC50で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、もしくは1.1nM未満のIC50で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、4.9、4.8、4.7、もしくは4.6nM未満のIC90で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1 、4.9、4.8、4.7、もしくは4.6nM未満のIC90で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、もしくは7nM未満のIC95で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性走化性を低下させる。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、10、9.9、9.8、9.7、9.6、9.5、9.4、9.3、9.2、9.1、もしくは9nM未満のIC95で、ヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性走化性を低下させる。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、インビトロでヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性走化性を低下させる。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、インビボでヒトもしくはマウスのCCR6+細胞のヒトCCL20誘導性走化性を低下させる。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、被験体における関節症状(例えば、肘もしくは膝に対して遠位の四肢の関節病変、ならびに紅斑および腫脹の程度)の進行を、例えば、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)および/もしくはグルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ(G6P1)誘発性関節炎のマウスモデルにおいて減じる。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくはその抗原結合部分は、例えば、CIAモデルにおいて、被験体における骨病変(骨粗鬆症、骨侵食、および/もしくは新たな骨形成が挙げられる)を減じる。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは抗原結合部分は、被験体における(例えば、CIAモデルにおける)軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)の血清レベルを低下させる。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくはその抗原結合部分は、被験体における(例えば、CIAモデルにおけるマウスの足における)核因子κΒリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)、核因子κΒのレセプターアクチベーター(RANK)、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)、および/もしくはカテプシンKのmRNAレベルを低下させる。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくはその抗原結合部分は、被験体におけるアトピー性皮膚炎症状(例えば、乾燥、鱗屑、紅斑、滲出/痂皮形成、および/もしくは擦過傷)(例えば、NC/Nga系統マウスにおけるオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎の症状)を減じる。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは抗原結合部分は、被験体におけるアレルギー性接触性皮膚炎症状(例えば、マウスモデルにおけるジニトロフルオロベンゼン(DNFB)誘発性アレルギー性接触性皮膚炎の症状)を減じる。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、CDR3(H−CDR3)が、配列番号67もしくは68の配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、CDR3(L−CDR3)が、配列番号75の配列を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列が配列番号67を含むH−CDR3、および配列が配列番号75を含むL−CDR3を含むか;または配列が配列番号68を含むH−CDR3、および配列が配列番号75を含むL−CDR3を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、CDR1(H−CDR1)、CDR2(H−CDR2)、およびCDR3(H−CDR3)がそれぞれ、以下の配列:
−配列番号60、63、および67;
−配列番号60、64、および67;
−配列番号61、65、および68;
−配列番号77、79、および67;または
−配列番号78、80、および68
を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、CDR1(L−CDR1)、CDR2(L−CDR2)、およびCDR3(L−CDR3)がそれぞれ、以下の配列:
−配列番号70、73、および75;または
−配列番号71、73、および75
を含む軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下:
−配列番号60〜62、77、および78からなる群より選択される配列を含むH−CDR1;
−配列番号63〜66および79〜81からなる群より選択される配列を含むH−CDR2;
−配列番号67もしくは68の配列を含むH−CDR3;
−配列番号70〜72からなる群より選択される配列を含むL−CDR1;
−配列番号73もしくは74の配列を含むL−CDR2;または
−配列番号75を含むL−CDR3;
または任意のこれらの組み合わせ
を含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下の配列:
−配列番号60、63、67、70、73、および75;
−配列番号60、64、67、70、73、および75;
−配列番号61、65、68、70、73、および75;
−配列番号77、79、67、70、73、および75;
−配列番号78、80、68、70、73、および75;
−配列番号60、63、67、71、73、および75;
−配列番号60、64、67、71、73、および75;
−配列番号61、65、68、71、73、および75;
−配列番号77、79、67、71、73、および75;または
−配列番号78、80、68、71、73、および75
をそれぞれ含む、H−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、L−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号9〜14からなる群より選択される配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号39、41、および43からなる群より選択される配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号15もしくは16の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号40、42、および44からなる群より選択される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下の配列:
−配列番号9および配列番号15;
−配列番号10および配列番号15;
−配列番号11および配列番号15;
−配列番号12および配列番号15;
−配列番号13および配列番号15;
−配列番号14および配列番号15;
−配列番号9および配列番号16;
−配列番号10および配列番号16;
−配列番号11および配列番号16;
−配列番号12および配列番号16;
−配列番号13および配列番号16;または
−配列番号14および配列番号16
をそれぞれ含む、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下の配列:
−配列番号39および配列番号40;
−配列番号39および配列番号42;
−配列番号39および配列番号44;
−配列番号41および配列番号40;
−配列番号41および配列番号42;
−配列番号41および配列番号44;
−配列番号43および配列番号40;
−配列番号43および配列番号42;または
−配列番号43および配列番号44
をそれぞれ含む、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号1〜6および108からなる群より選択される配列であって、シグナル配列(存在する場合)を含まず、必要に応じて、C末端リジンを含まない配列、を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、シグナル配列(存在する場合)を含まない配列番号7、8、110、および112からなる群より選択される配列を有する、軽鎖を含む。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体は、以下の配列:
−配列番号1および配列番号7;
−配列番号2および配列番号7;
−配列番号3および配列番号7;
−配列番号4および配列番号7;
−配列番号5および配列番号7;
−配列番号6および配列番号7;
−配列番号1および配列番号8;
−配列番号2および配列番号8;
−配列番号3および配列番号8;
−配列番号4および配列番号8;
−配列番号5および配列番号8;
−配列番号6および配列番号8;
−配列番号108および配列番号110;または
−配列番号108および112;
であって、
該両方の配列がシグナル配列を有さず、配列番号1〜6および108が必要に応じてC末端リジンを含まない配列、をそれぞれ有する、重鎖および軽鎖を含む。
本発明はまた、配列番号25〜30からなる群より選択される配列によってコードされる重鎖可変ドメインを含む抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号51、53、および55からなる群より選択される配列によってコードされる重鎖可変ドメインを含む。
さらに、本発明は、配列番号31もしくは32の配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号52、54、および56からなる群より選択される配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下の配列:
−配列番号25および配列番号31:
−配列番号26および配列番号31;
−配列番号27および配列番号31;
−配列番号28および配列番号31;
−配列番号29および配列番号31;
−配列番号30および配列番号31;
−配列番号25および配列番号32;
−配列番号26および配列番号32;
−配列番号27および配列番号32;
−配列番号28および配列番号32;
−配列番号29および配列番号32;または
−配列番号30および配列番号32
によってそれぞれコードされる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、以下の配列:
−配列番号51および配列番号52;
−配列番号51および配列番号54;
−配列番号51および配列番号56;
−配列番号53および配列番号52;
−配列番号53および配列番号54;
−配列番号53および配列番号56;
−配列番号55および配列番号52;
−配列番号55および配列番号54;または
−配列番号55および配列番号56
によってそれぞれコードされる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号17〜22および109からなる群より選択される配列であって、シグナル配列(存在する場合)をコードする配列を欠いており、必要に応じてC末端リジンをコードする配列を欠いている配列、によってコードされる重鎖を含む。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号23、24、111、および113からなる群より選択される配列であって、シグナル配列(存在する場合)をコードする配列を欠いている配列、によってコードされる軽鎖を含む。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体は、以下の配列:
−配列番号17および配列番号23;
−配列番号18および配列番号23;
−配列番号19および配列番号23;
−配列番号20および配列番号23;
−配列番号21および配列番号23;
−配列番号22および配列番号23;
−配列番号17および配列番号24;
−配列番号18および配列番号24;
−配列番号19および配列番号24;
−配列番号20および配列番号24;
−配列番号21および配列番号24;
−配列番号22および配列番号24;
−配列番号109および配列番号111;または
−配列番号109および配列番号113;
であって、
該両方の配列がシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を欠いており、配列番号17〜22および109が必要に応じてC末端リジンをコードする配列を欠いている配列、によってそれぞれコードされる、重鎖および軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、ヒト化されているか、もしくはキメラである。いくつかの実施形態において、上記ヒト化抗CCL20抗体もしくは部分の重鎖のフレームワーク領域は、IGHV1−46*03ヒト生殖細胞系列遺伝子を利用する(例えば、Altschul et al., 「Gapped BLAST and PSI−BLAST: a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25:3389−3402 (1997)を参照のこと)。特定の実施形態において、上記重鎖フレームワーク領域は、上記IGHV1−46*03ヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域に対して少なくとも50%相同性を有する。例えば、上記重鎖フレームワーク領域は、上記IGHV1−46*03ヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域に対して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはさらに100%同一であり得る。いくつかの実施形態において、上記ヒト化抗CCL20抗体もしくは部分の軽鎖のフレームワーク領域は、IGKV1D−39*01ヒト生殖細胞系列遺伝子を利用し(Altschul et al.,前出を参照のこと)、特定の実施形態において、上記軽鎖フレームワーク領域は、上記IGKV1D−39*01ヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域に対して少なくとも50%相同性を有する。例えば、上記軽鎖フレームワーク領域は、上記IGKV1D−39*01ヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域に対して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはさらに100%同一であり得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分(上記部分が、重鎖定常領域の少なくとも一部を含む程度まで)は、IgG分子、IgM分子、IgE分子、IgA分子、もしくはIgD分子である。特定の実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプ、もしくはIgG4サブタイプのものである。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体は、モノクローナル抗体である。
本発明はまた、上記分子のN−ループ領域および/もしくはβ2−β3ヘアピン領域に位置するヒトCCL20のエピトープに結合する抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施形態において、上記抗抗CCL20抗体もしくは部分は、本明細書に記載される抗体もしくは部分と同じ、ヒトCCL20上のエピトープに結合する。さらに、本発明は、本明細書に記載される抗体もしくは部分と、ヒトCCL20への結合について競合もしくは交叉競合する抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分によって結合される上記ヒトCCL20エピトープは、以下:
−配列番号84の残基7〜9;
−配列番号84の残基10〜19;
−配列番号84の残基20〜21;および
−配列番号84の残基20〜22、
または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、以下:
−配列番号84の残基39〜55;
−配列番号84の残基39〜57;
−配列番号84の残基56〜67;および
−配列番号84の残基61〜70、
または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列をさらに含む。
特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜55、56〜57、および61〜70、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基からなるアミノ酸配列の任意の組み合わせを含む。
特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、および20〜22、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜55、56〜57、および61〜70、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜57、および61〜70、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。
特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、および20〜21、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜21、39〜55、56〜67、および61〜70、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。特定の実施形態において、上記ヒトCCL20エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜21、39〜57、および61〜70、または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗体もしくはその抗原結合部分によって結合される上記ヒトCCL20エピトープは、残基7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、および70から選択される配列番号84の1個以上のアミノ酸残基(または配列番号84の上記残基に対応する野生型ヒトCCL20の残基)、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
本発明はまた、本明細書で記載される抗CCL20抗体のうちのいずれかの抗原結合部分を提供する。上記抗原結合部分は、例えば、単鎖抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd、単鎖Fv分子(scFv)、二重特異性単鎖Fvダイマー、多価単鎖Fvマルチマー、ダイアボディー、ドメイン欠失抗体、または単一ドメイン抗体(dAb)であり得る。
本発明はまた、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合部分の改変体であって、ここで上記改変体は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個もしくは10個のアミノ酸置換が、上記抗体もしくは部分とは異なる、改変体を提供する。
一局面において、本発明は、ヒトCCL20に対して指向される抗体であって、ここで上記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、それぞれ、以下の配列:
−配列番号9および15;
−配列番号9および16;
−配列番号10および16;
−配列番号11および15;
−配列番号11および16;
−配列番号12および16;
−配列番号13および16;または
−配列番号14および16
を含む、抗体を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号1を含み、軽鎖が配列番号7を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号1を含み、そして軽鎖が配列番号7を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号1を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号1を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号2を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号2を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号3を含み、軽鎖が配列番号7を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号3を含み、そして軽鎖が配列番号7を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号3を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号3を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号4を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号4を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号5を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号5を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号6を含み、軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号6を含み、そして軽鎖が配列番号8を含む抗体であって、ここで、該両方のアミノ酸配列がシグナル配列を欠いている抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号110を含む抗体を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、そして軽鎖が配列番号110を含む抗体、を提供する。
一局面において、本発明は、重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号112を含む抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、そして軽鎖が配列番号112を含む抗体、を提供する。
別の局面において、本発明は、1種以上の核酸分子(例えば、重鎖もしくはその抗原結合部分、または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子)であって、ここで上記重鎖および軽鎖もしくはこれらの抗原結合部分は、抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を形成するように会合し得る、核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、上記重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子は、配列番号17〜22、25〜30、および109からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または、シグナル配列をコードする配列(存在する場合)を含まない該ヌクレオチド配列を含む。配列番号17〜22および109のヌクレオチド配列はまた、必要に応じて、C末端リジンをコードする配列(存在する場合)を欠き得る。いくつかの実施形態において、上記軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子は、配列番号23、24、31、32、111、および113からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または、シグナル配列をコードする配列(存在する場合)を含まない該ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記1種以上の核酸分子は、本明細書に記載の抗体もしくは部分の、上記重鎖もしくはその抗原結合部分および上記軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする。特定の実施形態において、1種の核酸分子は、上記重鎖もしくはその抗原結合部分および上記軽鎖もしくはその抗原結合部分の両方をコードする。
一実施形態において、上記重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、上記軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、または上記重鎖および上記軽鎖もしくはこれらの抗原結合部分をコードする核酸分子(複数可)が、それを必要とする被験体を処置するために使用される。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される抗体もしくは部分の重鎖もしくはその抗原結合部分、軽鎖もしくはその抗原結合部分、またはその両方をコードする核酸配列(複数可)を含むベクターを提供する。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される抗体もしくは部分の重鎖もしくはその抗原結合部分、軽鎖もしくはその抗原結合部分、またはその両方を発現する細胞を提供する。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される抗体もしくは部分を作製するための方法であって、本明細書に記載される細胞を、上記抗体もしくは部分の発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記抗体もしくは部分を単離する工程を包含する。
本発明はまた、抗CCL20抗体を分泌するハイブリドーマを生成する方法を提供する。特定の実施形態において、上記ハイブリドーマは、野生型ヒトCCL20に結合する抗体を生成する。本発明はまた、本発明の方法によって生成されるハイブリドーマを提供する。必要に応じて、上記ハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体は、集められ、そしてさらに精製され得る(例えば、実質的に精製されるか、単離される)。他の実施形態において、上記方法は、上記ハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに包含する。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される抗体もしくは部分、および薬学的に受容可能なビヒクルもしくはキャリアを含む組成物を提供する。
一局面において、本明細書に記載される抗体もしくは部分は、医薬として使用される。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体もしくは部分は、それを必要とする被験体を処置するために使用される。特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、CCR6関連状態、CCL20関連状態もしくはその両方を処置するために使用される。このような状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:炎症疾患および自己免疫疾患(特に、関節炎(特に、関節リウマチ)、アトピー性皮膚炎もしくはアレルギー性皮膚炎、および乾癬)。別の特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、がんを処置するために使用される。上記抗体もしくは部分は、例えば、グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、慢性肝炎、接触性皮膚炎、神経膠芽腫、肝細胞癌、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、膵腺癌、歯周病、甲状腺乳頭状癌、掌蹠膿疱症状、点状丘疹性発疹(maculopapular exanthema)と関連する状態、表皮水疱症、円形脱毛症、多発性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、ベーチェット病、急性汎発性発疹性膿疱症、脈管炎(vasculitides)、若年性特発性関節炎、サルコイドーシス、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、腎臓同種移植片拒絶、移植片対宿主病、肝臓同種移植片拒絶、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、糸球体腎炎、呼吸器系合胞体ウイルス感染、多発性骨髄腫、および/またはランゲルハンス細胞組織球症を処置するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくは部分は、それを必要とする被験体におけるCCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるために使用される。
いくつかの実施形態において、本発明は、以下を提供する:
1.相補性決定領域3(CDR3)が配列番号67もしくは配列番号68を含む、重鎖を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
2.上記重鎖の相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、および相補性決定領域3(CDR3)が、それぞれ、以下:
a)配列番号60、64、および67;
b)配列番号60、63、および67;
c)配列番号61、65、および68;
d)配列番号77、79、および67;ならびに
e)配列番号78、80、および68
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態1に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
3.相補性決定領域3(CDR3)が配列番号75を含む軽鎖を含むモノクローナル抗ヒトCCL20抗体、もしくはその抗原結合部分。
4.上記軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、および相補性決定領域3(CDR3)が、それぞれ、以下:
a)配列番号70、73、および75;ならびに
b)配列番号71、73、および75
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態3に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
5.上記抗体の上記重鎖が、配列番号67もしくは68を含むCDR3を含み、上記抗体の上記軽鎖が、配列番号75を含むCDR3を含む、実施形態1または3に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
6.上記重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびに上記軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3は、それぞれ、以下:
a)配列番号60、64、67、70、73、および75;
b)配列番号60、64、67、71、73、および75;
c)配列番号60、63、67、70、73、および75;
d)配列番号60、63、67、71、73、および75;
e)配列番号61、65、68、70、73、および75;
f)配列番号61、65、68、71、73、および75;
g)配列番号77、79、67、70、73、および75;
h)配列番号77、79、67、71、73、および75;
i)配列番号78、80、68、70、73、および75;ならびに
j)配列番号78、80、68、71、73、および75
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態2または4に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
7.可変ドメインが配列番号9〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含むモノクローナル抗ヒトCCL20抗体、もしくはその抗原結合部分。
8.可変ドメインが配列番号15もしくは16を含む軽鎖を含むモノクローナル抗ヒトCCL20抗体、もしくはその抗原結合部分。
9.上記重鎖可変ドメインおよび上記軽鎖可変ドメインは、それぞれ、以下:
a)配列番号9および15;
b)配列番号9および16;
c)配列番号10および16;
d)配列番号11および15;
e)配列番号11および16;
f)配列番号12および16;
g)配列番号13および16;ならびに
h)配列番号14および16
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態7または8に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
10.重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1〜6および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体。
11.重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1〜6および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体であって、ここで該アミノ酸配列がC末端リジンを欠いている、抗体。
12.軽鎖が、シグナル配列を含まない配列番号7および8、ならびに配列番号110および112からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体。
13.上記重鎖および上記軽鎖は、それぞれ、以下:
a)配列番号1および7;
b)配列番号1および8;
c)配列番号2および8;
d)配列番号3および7;
e)配列番号3および8;
f)配列番号4および8;
g)配列番号5および8;
h)配列番号6および8;
i)配列番号108および110;ならびに
j)配列番号108および112
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで、該アミノ酸配列は、シグナル配列(存在する場合)を欠いており、ここで、配列番号1〜6は、必要に応じて、C末端リジンを欠いている、実施形態10〜12のいずれか1つに記載の抗体。
14.重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号110を含む、モノクローナル抗体。
15.重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、軽鎖が配列番号110を含む、モノクローナル抗体。
16.重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号112を含む、モノクローナル抗体。
17.重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、軽鎖が配列番号112を含む、モノクローナル抗体。
18.実施形態1〜17のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と、ヒトCCL20の同じエピトープに結合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
19.ヒトCCL20への結合について、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と競合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
20.ヒトCCL20への結合について、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と交叉競合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
21.ヒト化抗体である、実施形態1〜12のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
22.上記重鎖のフレームワーク領域は、IGHV1−46*03ヒト生殖細胞系列配列を利用し、上記軽鎖のフレームワーク領域は、IGKV1D−39*01ヒト生殖細胞系列配列を利用する、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
23.上記抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4の定常ドメインを含む、実施形態1〜9および18〜22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
24.重鎖は、配列番号39、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
25.軽鎖は、配列番号40、42、および44からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
26.上記重鎖は、配列番号39、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、上記軽鎖は、配列番号40、42、および44からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態24または25に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
27.上記重鎖および上記軽鎖は、それぞれ、以下:
a)配列番号39および40;
b)配列番号41および42;ならびに
c)配列番号43および44
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態26に記載の抗体。
28.配列番号39を含む重鎖および配列番号40を含む軽鎖を含むモノクローナル抗ヒトCCL20抗体、もしくはその抗原結合部分。
29.キメラ抗体である、実施形態24〜28のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
30.単鎖抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd、単鎖Fv分子(scFv)、二重特異性単鎖Fvダイマー、ダイアボディー、ドメイン欠失抗体もしくは単一ドメイン抗体(dAb)である、実施形態1〜9、18〜22、および24〜28のいずれか1つに記載の抗原結合部分。
31.以下:
a)ヒトCCL16に結合しない;
b)カニクイザルもしくはアカゲザルのCCL20には結合するが、マウスやラットのCCL20には結合しない;
c)一価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、70pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
d)二価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、12pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
e)ヒトCCR6に対する結合親和性より高い、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
f)ヒトCX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4,CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3,CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28、もしくはXCL1を上回る、ヒトCCL20に対する選択性を有する;
g)1.7nM以下のIC50で、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
h)インビボで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
i)インビトロで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
j)被験体において、関節炎症状の進行を減じる;
k)被験体において、骨粗鬆症、骨侵食、もしくは新たな骨形成を減じる;
l)被験体において、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルを低下させる;
m)被験体において、RANKL、RANK、TRAP、もしくはカテプシンKのmRNAレベルを低下させる;
n)被験体において、アトピー性皮膚炎の進行を減じる;および
o)被験体において、アレルギー性接触性皮膚炎の進行を減じる、
からなる群より選択される、1種以上の特性を有する、実施形態1〜30のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
32.以下:
a)配列番号84の残基7〜9;
b)配列番号84の残基10〜19;および
c)配列番号84の残基20〜22、
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列を含むヒトCCL20のエピトープに結合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
33.上記エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、および20〜22を含む、実施形態32に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
34.上記エピトープは、以下:
a)配列番号84の残基39〜55;
b)配列番号84の残基56〜67;および
c)配列番号84の残基61〜70
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列をさらに含む、実施形態32に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
35.上記エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜55、56〜67、および61〜70を含む、実施形態34に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
36.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
37.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
38.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。39.モノクローナル抗ヒトCCL20抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子は、配列番号17〜22、25〜30、および109からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
40.モノクローナル抗ヒトCCL20抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子は、配列番号23、24、31、32、111、および113からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
41.実施形態39または40に記載の単離された核酸分子であって、配列番号17〜22、25〜30、および109からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列を含み;そしてここで、配列番号23、24、31、32、111、および113からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列をさらに含む、単離された核酸分子。
42.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方の、医薬としての使用。
43.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方を含む、組換えベクター。
44.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第1の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第1の核酸配列と、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは部分の軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第2の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第2の核酸配列とを含む、宿主細胞。
45.抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法であって、実施形態44に記載の宿主細胞を、上記抗体もしくは部分の発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法。
46.上記抗体もしくは部分を単離する工程をさらに包含する、実施形態45に記載の方法。
47.実施形態1〜35のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分、および薬学的に受容可能なビヒクルもしくはキャリアを含む、組成物。
48.処置を必要とする被験体を処置するための方法であって、有効量の、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
49.状態の処置を必要とする被験体における状態を処置するための方法であって、有効量の、実施形態1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を、状態の処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
50.上記状態は、CCR6関連状態である、実施形態49に記載の方法。
51.上記状態は、自己免疫状態もしくは炎症状態である、実施形態49に記載の方法。52.上記状態は、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、慢性肝炎、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、骨粗鬆症、もしくは歯周病である、実施形態49に記載の方法。
53.がんを処置するための方法であって、有効量の、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
54.上記がんは、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、膵腺癌、もしくは甲状腺乳頭状癌である、実施形態53に記載の方法。
55.CCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性の低下を必要とする被験体におけるCCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるための方法であって、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を、CCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性の低下を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
56.実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を使用して、インビトロでCCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるための方法。
57.被験体における状態を処置するための方法であって、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで該状態は、以下:
a)肘もしくは膝に対して遠位の四肢の関節病変;
b)紅斑;
c)腫脹;
d)軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルの増大;
e)核因子κΒリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)、核因子κΒのレセプターアクチベーター(RANK)、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)、もしくはカテプシンKのmRNAレベルの増大;
f)アトピー性皮膚炎;ならびに
g)アレルギー性接触性皮膚炎、
からなる群より選択される、方法。
58.医薬の製造のための、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物の使用。
59.医薬としての、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または実施形態47に記載の組成物の使用。
本発明は、さらに以下の項目も提供する。
(項目1)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分であって、ここで該抗体は重鎖を含み、該重鎖の相補性決定領域3(CDR3)が配列番号67もしくは配列番号68を含む、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目2)
前記重鎖の相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、および相補性決定領域3(CDR3)は、それぞれ、以下:
a)配列番号60、64、および67;
b)配列番号60、63、および67;
c)配列番号61、65、および68;
d)配列番号77、79、および67;ならびに
e)配列番号78、80、および68
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目3)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分であって、ここで該抗体は軽鎖を含み、該軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)が配列番号75を含む、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目4)
前記軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、および相補性決定領域3(CDR3)は、それぞれ、以下:
a)配列番号70、73、および75;ならびに
b)配列番号71、73、および75
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目3に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目5)
前記抗体の前記重鎖は、配列番号67もしくは68を含むCDR3を含み、前記抗体の前記軽鎖は、配列番号75を含むCDR3を含む、項目1または3に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
(項目6)
前記重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびに前記軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3は、それぞれ、以下:
a)配列番号60、64、67、70、73、および75;
b)配列番号60、64、67、71、73、および75;
c)配列番号60、63、67、70、73、および75;
d)配列番号60、63、67、71、73、および75;
e)配列番号61、65、68、70、73、および75;
f)配列番号61、65、68、71、73、および75;
g)配列番号77、79、67、70、73、および75;
h)配列番号77、79、67、71、73、および75;
i)配列番号78、80、68、70、73、および75;ならびに
j)配列番号78、80、68、71、73、および75
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目2または4に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
(項目7)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分であって、ここで該抗体は重鎖を含み、該重鎖の可変ドメインが配列番号9〜14から選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目8)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分であって、ここで該抗体は軽鎖を含み、該軽鎖の可変ドメインが配列番号15もしくは16を含む、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目9)
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインは、それぞれ、以下:
a)配列番号9および15;
b)配列番号9および16;
c)配列番号10および16;
d)配列番号11および15;
e)配列番号11および16;
f)配列番号12および16;
g)配列番号13および16;ならびに
h)配列番号14および16
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目7または8に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
(項目10)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体であって、該抗体の重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1〜6、および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。
(項目11)
重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1〜6および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体であって、ここで該アミノ酸配列がC末端リジンを欠いている、抗体。
(項目12)
軽鎖が、シグナル配列を含まない配列番号7および8、ならびに配列番号110および112からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体。
(項目13)
前記重鎖および前記軽鎖は、それぞれ、以下:
a)配列番号1および7;
b)配列番号1および8;
c)配列番号2および8;
d)配列番号3および7;
e)配列番号3および8;
f)配列番号4および8;
g)配列番号5および8;
h)配列番号6および8;
i)配列番号108および110;ならびに
j)配列番号108および112
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで該アミノ酸配列は、シグナル配列(存在する場合)を欠いており、ここで、配列番号1〜6は、必要に応じて、C末端リジンを欠いている、項目10〜12のいずれか1項に記載の抗体。
(項目14)
重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号110を含む、モノクローナル抗体。
(項目15)
モノクローナル抗体であって、該抗体の重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、該抗体の軽鎖が配列番号110を含む、モノクローナル抗体。
(項目16)
重鎖が配列番号108を含み、軽鎖が配列番号112を含む、モノクローナル抗体。
(項目17)
モノクローナル抗体であって、該抗体の重鎖がC末端リジンを含まない配列番号108を含み、該抗体の軽鎖が配列番号112を含む、モノクローナル抗体。
(項目18)
項目1〜17のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と、ヒトCCL20の同じエピトープに結合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目19)
ヒトCCL20への結合について、項目1〜17のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と競合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目20)
ヒトCCL20への結合について、項目1〜17のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分と交叉競合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目21)
ヒト化抗体である、項目1〜12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目22)
前記重鎖のフレームワーク領域は、IGHV1−46*03ヒト生殖細胞系列配列を利用し、前記軽鎖のフレームワーク領域は、IGKV1D−39*01ヒト生殖細胞系列配列を利用する、項目1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目23)
前記抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4の定常ドメインを含む、項目1〜9および18〜22のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
(項目24)
重鎖は、配列番号39、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目25)
軽鎖は、配列番号40、42、および44からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目26)
前記重鎖は、配列番号39、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号40、42、および44からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目24または25に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
(項目27)
前記重鎖および前記軽鎖は、それぞれ、以下:
a)配列番号39および40;
b)配列番号41および42;ならびに
c)配列番号43および44
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目26に記載の抗体。
(項目28)
配列番号39を含む重鎖および配列番号40を含む軽鎖を含むモノクローナル抗ヒトCCL20抗体、もしくはその抗原結合部分。
(項目29)
キメラ抗体である、項目24〜28のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目30)
単鎖抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’) 、Fd、単鎖Fv分子(scFv)、二重特異性単鎖Fvダイマー、ダイアボディー、ドメイン欠失抗体もしくは単一ドメイン抗体(dAb)である、項目1〜9、18〜22、および24〜28のいずれか1項に記載の抗原結合部分。
(項目31)
以下:
a)ヒトCCL16に結合しない;
b)カニクイザルもしくはアカゲザルのCCL20には結合するが、マウスのCCL20にもラットのCCL20にも結合しない;
c)一価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、70pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
d)二価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、12pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
e)ヒトCCR6に対する結合親和性より高い、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
f)ヒトCX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4,CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3,CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28、もしくはXCL1を上回る、ヒトCCL20に対する選択性を有する;
g)1.7nM以下のIC 50 で、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
h)インビボで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
i)インビトロで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
j)被験体において、関節炎症状の進行を減じる;
k)被験体において、骨粗鬆症、骨侵食、もしくは新たな骨形成を減じる;
l)被験体において、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルを低下させる;
m)被験体において、RANKL、RANK、TRAP、もしくはカテプシンKのmRNAレベルを低下させる;
n)被験体において、アトピー性皮膚炎の進行を減じる;および
o)被験体において、アレルギー性接触性皮膚炎の進行を減じる、
からなる群より選択される、1種以上の特性を有する、項目1〜30のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目32)
以下:
a)配列番号84の残基7〜9;
b)配列番号84の残基10〜19;および
c)配列番号84の残基20〜22、
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列を含むヒトCCL20のエピトープに結合する、モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
(項目33)
前記エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、および20〜22を含む、項目32に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目34)
前記エピトープは、以下:
a)配列番号84の残基39〜55;
b)配列番号84の残基56〜67;および
c)配列番号84の残基61〜70
からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列をさらに含む、項目32に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目35)
前記エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜55、56〜67、および61〜70を含む、項目34に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
(項目36)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
(項目37)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
(項目38)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
(項目39)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子は、配列番号17〜22、25〜30、および109からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
(項目40)
モノクローナル抗ヒトCCL20抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子は、配列番号23、24、31、32、111、および113からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
(項目41)
項目39または40に記載の単離された核酸分子であって、配列番号17〜22、25〜30、および109からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含ない該ヌクレオチド配列を含み;そしてここで、配列番号23、24、31、32、111、および113からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはシグナル配列(存在する場合)をコードする配列を含まない該ヌクレオチド配列をさらに含む、単離された核酸分子。
(項目42)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方の、医薬としての使用。
(項目43)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方を含む、組換えベクター。
(項目44)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは部分の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第1の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第1の核酸配列と、該抗体もしくは部分の軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第2の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第2の核酸配列とを含む、宿主細胞。
(項目45)
抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法であって、項目44に記載の宿主細胞を、該抗体もしくは部分の発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法。
(項目46)
前記抗体もしくは部分を単離する工程をさらに包含する、項目45に記載の方法。
(項目47)
項目1〜35のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分、および薬学的に受容可能なビヒクルもしくはキャリアを含む、組成物。
(項目48)
処置を必要とする被験体を処置するための方法であって、有効量の、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目49)
状態の処置を必要とする被験体における状態を処置するための方法であって、有効量の、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目50)
前記状態は、CCR6関連状態である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記状態は、自己免疫状態もしくは炎症状態である、項目49に記載の方法。
(項目52)
前記状態は、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、慢性肝炎、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、骨粗鬆症、もしくは歯周病である、項目49に記載の方法。
(項目53)
がんを処置するための方法であって、有効量の、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目54)
前記がんは、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、膵腺癌、もしくは甲状腺乳頭状癌である、項目53に記載の方法。
(項目55)
CCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性の低下を必要とする被験体におけるCCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるための方法であって、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目56)
項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を使用して、インビトロでCCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるための方法。
(項目57)
被験体における状態を処置するための方法であって、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで該状態は、以下:
a)肘もしくは膝に対して遠位の四肢の関節病変;
b)紅斑;
c)腫脹;
d)軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルの増大;
e)核因子κΒリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)、核因子κΒのレセプターアクチベーター(RANK)、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)、もしくはカテプシンKのmRNAレベルの増大;
f)アトピー性皮膚炎;ならびに
g)アレルギー性接触性皮膚炎、
からなる群より選択される、方法。
(項目58)
医薬の製造のための、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物の使用。
(項目59)
医薬としての、項目1〜35のいずれか1項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または項目47に記載の組成物の使用。

図1は、CCR6欠損マウスが、野生型マウスよりコラーゲン誘発性関節炎に対して感受性が低いことを示すグラフである。野生型、CCR6+/+マウス;Het、CCR6+/−マウス;ノックアウト、CCR6−/−マウス。実施例1を参照のこと。 図2は、CCR6欠損マウスが、野生型マウスとの比較において、コラーゲン誘発性関節炎病変におけるT細胞の損なわれた浸潤を示す(CD3レベルによって示される場合)ことを示すグラフである。データは、1実験からの平均値±SEMとして示される(n=7マウス/群)。*p<0.05、**p<0.01。実施例1を参照のこと。 図3は、CCR6欠損マウスが、野生型マウスとの比較において、コラーゲン誘発性関節炎病変におけるマクロファージの損なわれた浸潤を示す(F4/80レベルによって示される場合)ことを示すグラフである。データは、1実験からの平均値±SEMとして示される(n=7マウス/群)。**p<0.01。実施例1を参照のこと。 図4は、野生型マウスとの比較において、CCR6欠損マウスが、ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)誘発性アレルギー性接触性皮膚炎モデルにおいて耳の厚みの増大に抵抗性であることを示すグラフである。WT、野生型マウス;KO、CCR6欠損マウス。実施例1を参照のこと。 図5は、2F5−5 MAbが、CCL20誘導性走化性を阻害することを示すグラフである。実施例2を参照のこと。 図6A〜Cは、本発明の抗体の可変ドメイン(配列番号9〜16)と、マウス抗ヒト抗体36F7C10の可変ドメイン(VH:配列番号39; VL:配列番号40)および42G5B10の可変ドメイン(VH:配列番号43)、ならびに生殖細胞系列配列IGHV1−46*03(配列番号57)、JH4(配列番号58)、およびIGKV1D−39*01(配列番号59)との配列アラインメントを示す。各CDRのKabatおよびChothiaの定義が示される。ABM67212(配列番号82)およびBAH04867.1(配列番号83)は、示されるヒト化抗体鎖のフレームワーク領域が由来したヒト抗体である。実施例3を参照のこと。 図6A〜Cは、本発明の抗体の可変ドメイン(配列番号9〜16)と、マウス抗ヒト抗体36F7C10の可変ドメイン(VH:配列番号39; VL:配列番号40)および42G5B10の可変ドメイン(VH:配列番号43)、ならびに生殖細胞系列配列IGHV1−46*03(配列番号57)、JH4(配列番号58)、およびIGKV1D−39*01(配列番号59)との配列アラインメントを示す。各CDRのKabatおよびChothiaの定義が示される。ABM67212(配列番号82)およびBAH04867.1(配列番号83)は、示されるヒト化抗体鎖のフレームワーク領域が由来したヒト抗体である。実施例3を参照のこと。 図6A〜Cは、本発明の抗体の可変ドメイン(配列番号9〜16)と、マウス抗ヒト抗体36F7C10の可変ドメイン(VH:配列番号39; VL:配列番号40)および42G5B10の可変ドメイン(VH:配列番号43)、ならびに生殖細胞系列配列IGHV1−46*03(配列番号57)、JH4(配列番号58)、およびIGKV1D−39*01(配列番号59)との配列アラインメントを示す。各CDRのKabatおよびChothiaの定義が示される。ABM67212(配列番号82)およびBAH04867.1(配列番号83)は、示されるヒト化抗体鎖のフレームワーク領域が由来したヒト抗体である。実施例3を参照のこと。 図7A〜Cは、ヒト化抗ヒトCCL20抗体鎖の異なる組み合わせによるインビトロ化学走性の阻害を示す表である。データは、示された場合を除いて3回の試行を示す。実施例4を参照のこと。 図7A〜Cは、ヒト化抗ヒトCCL20抗体鎖の異なる組み合わせによるインビトロ化学走性の阻害を示す表である。データは、示された場合を除いて3回の試行を示す。実施例4を参照のこと。 図7A〜Cは、ヒト化抗ヒトCCL20抗体鎖の異なる組み合わせによるインビトロ化学走性の阻害を示す表である。データは、示された場合を除いて3回の試行を示す。実施例4を参照のこと。 図8A〜Cは、上記ヒト化HC2/LK3抗ヒトCCL20抗体の阻害効果を評価するために行った3回の独立した試行を示す。上記HC2/LK3抗体は、CCL20誘導性走化性を阻害することが示される。IC50、IC90、およびIC95の値は、各実験について示される。実施例4を参照のこと。 図8A〜Cは、上記ヒト化HC2/LK3抗ヒトCCL20抗体の阻害効果を評価するために行った3回の独立した試行を示す。上記HC2/LK3抗体は、CCL20誘導性走化性を阻害することが示される。IC50、IC90、およびIC95の値は、各実験について示される。実施例4を参照のこと。 図8A〜Cは、上記ヒト化HC2/LK3抗ヒトCCL20抗体の阻害効果を評価するために行った3回の独立した試行を示す。上記HC2/LK3抗体は、CCL20誘導性走化性を阻害することが示される。IC50、IC90、およびIC95の値は、各実験について示される。実施例4を参照のこと。 図9A〜Cは、ヒト化抗体 B)HC2/LK3およびC)HC2/LC3が、経内皮移動アッセイにおいて、A)マウス抗体36F7C10のものに匹敵する細胞移動の用量依存性阻害を示すことを示す一連のグラフを示す。実施例4を参照のこと。 図9A〜Cは、ヒト化抗体 B)HC2/LK3およびC)HC2/LC3が、経内皮移動アッセイにおいて、A)マウス抗体36F7C10のものに匹敵する細胞移動の用量依存性阻害を示すことを示す一連のグラフを示す。実施例4を参照のこと。 図9A〜Cは、ヒト化抗体 B)HC2/LK3およびC)HC2/LC3が、経内皮移動アッセイにおいて、A)マウス抗体36F7C10のものに匹敵する細胞移動の用量依存性阻害を示すことを示す一連のグラフを示す。実施例4を参照のこと。
図10Aおよび図10Bは、上記A)HC2/LC3およびB)HC2/LK3ヒト化抗体が、濃度依存性様式でヒトCCL20に結合することを実証するBiacoreTMセンサーグラム(sensogram)を示す。実施例5を参照のこと。 図10Aおよび図10Bは、上記A)HC2/LC3およびB)HC2/LK3ヒト化抗体が、濃度依存性様式でヒトCCL20に結合することを実証するBiacoreTMセンサーグラム(sensogram)を示す。実施例5を参照のこと。 図11A〜Dは、抗ヒトCCL20抗体が、ヒトCCL20に特異的に結合することを示す。プレートに結合したCCL20および他のケモカイン(1μg/mlにおいて)を用いたELISAアッセイを使用して、A)36F7C10およびキメラ抗体、ならびにB)ヒト化HC2LK3およびHC2LC3抗体の結合を検出した。C)Hisタグ固定したCCL20を用いたELISAアッセイを使用して、結合を検出した。D)BiacoreTM実験から、抗ヒトCCL20抗体がヒトCCL20に結合し、CXCL4への無視できる程度の結合を示すことが確認される。実施例6を参照のこと。 図11A〜Dは、抗ヒトCCL20抗体が、ヒトCCL20に特異的に結合することを示す。プレートに結合したCCL20および他のケモカイン(1μg/mlにおいて)を用いたELISAアッセイを使用して、A)36F7C10およびキメラ抗体、ならびにB)ヒト化HC2LK3およびHC2LC3抗体の結合を検出した。C)Hisタグ固定したCCL20を用いたELISAアッセイを使用して、結合を検出した。D)BiacoreTM実験から、抗ヒトCCL20抗体がヒトCCL20に結合し、CXCL4への無視できる程度の結合を示すことが確認される。実施例6を参照のこと。 図11A〜Dは、抗ヒトCCL20抗体が、ヒトCCL20に特異的に結合することを示す。プレートに結合したCCL20および他のケモカイン(1μg/mlにおいて)を用いたELISAアッセイを使用して、A)36F7C10およびキメラ抗体、ならびにB)ヒト化HC2LK3およびHC2LC3抗体の結合を検出した。C)Hisタグ固定したCCL20を用いたELISAアッセイを使用して、結合を検出した。D)BiacoreTM実験から、抗ヒトCCL20抗体がヒトCCL20に結合し、CXCL4への無視できる程度の結合を示すことが確認される。実施例6を参照のこと。 図11A〜Dは、抗ヒトCCL20抗体が、ヒトCCL20に特異的に結合することを示す。プレートに結合したCCL20および他のケモカイン(1μg/mlにおいて)を用いたELISAアッセイを使用して、A)36F7C10およびキメラ抗体、ならびにB)ヒト化HC2LK3およびHC2LC3抗体の結合を検出した。C)Hisタグ固定したCCL20を用いたELISAアッセイを使用して、結合を検出した。D)BiacoreTM実験から、抗ヒトCCL20抗体がヒトCCL20に結合し、CXCL4への無視できる程度の結合を示すことが確認される。実施例6を参照のこと。 図12は、CCL20(配列番号114)とCCL16(配列番号115)との56残基の重複部分の間のアミノ酸配列アラインメントを示す。実施例6を参照のこと。 図13Aおよび図13Bは、A)キメラ抗ヒトCCL20抗体およびB)ヒト化抗ヒトCCL20抗体が、CCL20と特異的に反応し、CCL16とは反応しないことを示す一連のグラフである。実施例6を参照のこと。 図13Aおよび図13Bは、A)キメラ抗ヒトCCL20抗体およびB)ヒト化抗ヒトCCL20抗体が、CCL20と特異的に反応し、CCL16とは反応しないことを示す一連のグラフである。実施例6を参照のこと。 図14は、ヒト(第一の開示は配列番号85であり、第二の開示は配列番 号85の残基2〜96である)、アカゲザル(配列番号86)、カニクイザル(配列番号87)、およびマウス(配列番号88)のCCL20オルソログの間のアミノ酸配列アラインメントを示す。実施例7を参照のこと。 図15は、ELISAアッセイにおける抗ヒトCCL20抗体検出の模式図である。実施例7を参照のこと。 図16A〜Cは、A)キメラ抗ヒトCCL20抗体、およびB)、C)ヒト化抗ヒトCCL20抗体が、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合するが、マウスCCL20には結合しないことを示す一連のグラフを示す。実施例7を参照のこと。 図16A〜Cは、A)キメラ抗ヒトCCL20抗体、およびB)、C)ヒト化抗ヒトCCL20抗体が、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合するが、マウスCCL20には結合しないことを示す一連のグラフを示す。実施例7を参照のこと。 図16A〜Cは、A)キメラ抗ヒトCCL20抗体、およびB)、C)ヒト化抗ヒトCCL20抗体が、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合するが、マウスCCL20には結合しないことを示す一連のグラフを示す。実施例7を参照のこと。 図17Aおよび図17Bは、ヒト化抗ヒトCCL20抗体およびキメラ抗ヒトCCL20抗体が、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合するが、ラットもしくはマウスのCCL20には結合しないことを示すグラフを示す。B)ヒト化抗体およびA)キメラ抗体は、これらが由来するA)マウス抗体36F7C10の結合特異性を保持する。実施例7を参照のこと。 図17Aおよび図17Bは、ヒト化抗ヒトCCL20抗体およびキメラ抗ヒトCCL20抗体が、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合するが、ラットもしくはマウスのCCL20には結合しないことを示すグラフを示す。B)ヒト化抗体およびA)キメラ抗体は、これらが由来するA)マウス抗体36F7C10の結合特異性を保持する。実施例7を参照のこと。 図18Aおよび図18Bは、水素/重水素交換によるヒトCCL20のエピトープマッピングの結果を示す。この実験は、R&D SystemsのヒトCCL20の改変体(配列番号84)を利用した。ここで最後から2番目の残基は、上記野生型配列において示されるNの代わりに、Dである。A)CCL20の各残基の重水素化レベルは、4つの時間点において示される(上から:150s、500s、1500s、および5000s)。B)ヒトCCL20の構造であって、本発明の抗体が結合するエピトープを示している。実施例9を参照のこと。 図18Aおよび図18Bは、水素/重水素交換によるヒトCCL20のエピトープマッピングの結果を示す。この実験は、R&D SystemsのヒトCCL20の改変体(配列番号84)を利用した。ここで最後から2番目の残基は、上記野生型配列において示されるNの代わりに、Dである。A)CCL20の各残基の重水素化レベルは、4つの時間点において示される(上から:150s、500s、1500s、および5000s)。B)ヒトCCL20の構造であって、本発明の抗体が結合するエピトープを示している。実施例9を参照のこと。 図19は、マウスCCR6を形質導入したB300細胞が、マウスおよびヒト両方のCCL20に向かって移動することを実証する1対のグラフである。実施例10を参照のこと。 図20は、マウス抗ヒトCCL20抗体、キメラ抗ヒトCCL20抗体、およびヒト化抗ヒトCCL20抗体が、ヒトCCL20に向かうマウスT細胞の移動をインビボで用量依存性様式で阻害することを示すグラフである。実施例10を参照のこと。 図21は、ハムスター抗マウスCCL20 MAb 2F5−5がマウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎症状を減じることを示すグラフである。実施例11を参照のこと。 図22は、2F5−5 MAbが、コラーゲン誘発性関節炎症状の進行を減じることを実証する個々の動物の臨床スコアの表である。実施例11を参照のこと。 図23は、X線スコア付けによるマウスの足の格付けを示すグラフである。2F5−5 MAbは、コラーゲン誘発性関節炎を有するマウスにおける骨の病変を減じることが示される。Cont:コントロールIgG。実施例11を参照のこと。 図24は、コラーゲン誘発性関節炎を有するマウスの足における骨の病変を示すスコア付けされたX線の例を示す。O:骨粗鬆症、E:骨侵食、N:新たな骨形成。実施例11を参照のこと。 図25A〜Cは、コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルにおいて、軟骨破壊のマーカーである、血清軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)の測定値を示す。A)COMP標準での較正データ。X軸、単位/リットル;Y軸、450nmでの光学密度。B)ハムスターコントロールIgGもしくは2F5−5 MAbで処置したマウスについてのプレートテンプレートおよび生データ。C)個々の動物のデータは、コントロールIgG抗体で処置した動物と比較して、2F5−5 MAbで処置した動物における低下したCOMPレベルを実証する。実施例11を参照のこと。 図25A〜Cは、コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルにおいて、軟骨破壊のマーカーである、血清軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)の測定値を示す。A)COMP標準での較正データ。X軸、単位/リットル;Y軸、450nmでの光学密度。B)ハムスターコントロールIgGもしくは2F5−5 MAbで処置したマウスについてのプレートテンプレートおよび生データ。C)個々の動物のデータは、コントロールIgG抗体で処置した動物と比較して、2F5−5 MAbで処置した動物における低下したCOMPレベルを実証する。実施例11を参照のこと。 図25A〜Cは、コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルにおいて、軟骨破壊のマーカーである、血清軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)の測定値を示す。A)COMP標準での較正データ。X軸、単位/リットル;Y軸、450nmでの光学密度。B)ハムスターコントロールIgGもしくは2F5−5 MAbで処置したマウスについてのプレートテンプレートおよび生データ。C)個々の動物のデータは、コントロールIgG抗体で処置した動物と比較して、2F5−5 MAbで処置した動物における低下したCOMPレベルを実証する。実施例11を参照のこと。 図26は、2F5−5 MAbが、マウスにおけるCOMPの血清レベルを低下させることを示すグラフである。Ctrl IgG:アイソタイプマッチさせた抗体;CCL20 mAb:2F5−5 MAb。実施例11を参照のこと。 図27Aおよび図27Bは、2F5−5 MAbが、破骨細胞マーカーであるA)RANKLおよびRANK、ならびにB)TRAPおよびカテプシンKのmRNA発現を低下させることを示すグラフである。Ctrl IgG:アイソタイプマッチさせた抗体;CCL20 mAb:2F5−5MAb;Y軸:定量的PCR単位。実施例11を参照のこと。 図27Aおよび図27Bは、2F5−5 MAbが、破骨細胞マーカーであるA)RANKLおよびRANK、ならびにB)TRAPおよびカテプシンKのmRNA発現を低下させることを示すグラフである。Ctrl IgG:アイソタイプマッチさせた抗体;CCL20 mAb:2F5−5MAb;Y軸:定量的PCR単位。実施例11を参照のこと。 図28は、2F5−5 MAbが、マウスにおけるグルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ誘発性関節炎に対する予防効果を有することを示すグラフである。実施例12を参照のこと。 図29は、2F5−5 MAbが、マウスにおけるオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎の進行を抑制することを示すグラフである。実施例13を参照のこと。 図30は、2F5−5 MAbが、マウスにおけるジニトロフルオロベンゼン誘発性アレルギー性接触性皮膚炎を阻害する(耳の厚みによって測定した場合)ことを示すグラフである。実施例14を参照のこと。
(発明の詳細な説明)
本発明は、CCL20もしくはその部分(例えば、その抗原性部分)に特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、上記抗体の抗原結合部分に関する。一実施形態において、上記抗体は、CCL20の1種以上の活性を中和する。抗体は、非CCL20分子に実質的に結合しなければ、CCL20に特異的に結合するといわれる。実質的な結合は、BiacoreTM(二価フォーマットにおいて)によって決定される場合、例えば、≦100nM、好ましくは、≦10nM、≦1nM、≦100pM、≦50pM、≦40pM、もしくは≦35pMのKでの結合である。一実施形態において、上記抗体もしくは部分は、ヒトCCL20もしくはその部分に、ヒトCCL20のいくつかの配列改変体(例えば、対立遺伝子改変体)に特異的に結合し、他の種に由来するCCL20と交叉反応し得る。一実施形態において、上記抗体もしくは部分は、野生型(天然に存在するもしくは内因性ともいわれる)ヒトCCL20に対して結合特異性を有する。別段示されなければ、「ヒトCCL20」とは、野生型ヒトCCL20を指す。シグナル配列を有する野生型ヒトCCL20のアミノ酸配列は、図14に示される(配列番号85)。シグナル配列(配列番号85の残基1〜26)を含まない野生型ヒトCCL20のアミノ酸配列は、配列番号99に見いだされる(表18を参照のこと)。図18は、シグナル配列を含まないヒトCCL20の改変体(配列番号84)を示し、ここで最後の残基の隣の残基は、上記野生型配列(配列番号85)におけるようなNの代わりに、Dである。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、野生型ヒトCCL20に結合するか、または、最後の残基の隣の残基が上記野生型配列(シグナル配列を有するかもしくは有さないかのいずれかの配列(例えば、配列番号84、85、もしくは99))に示されるNの代わりに、DであるヒトCCL20に結合する。特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に特異的に結合するが、マウスもしくはラットのCCL20には結合しない。
本明細書に記載される抗体およびその抗原結合部分は、公知の技術を使用して、精製および/もしくは単離され得る。「精製」もしくは「単離」されている抗体もしくは部分は、それらの元の供給源(例えば、細胞の上清;ライブラリーにおける抗体の混合物中などの混合物中、など)の分子(例えば、ペプチド)から分離されており、本明細書に記載される方法もしくは他の適切な方法によって得られる抗体を含む。単離された抗体は、実質的に純粋な(例えば、本質的に純粋な)抗体、ならびに化学合成、組み換え技術およびこれらの組み合わせによって生成される抗体を含む。
より具体的には、本発明は、抗ヒトCCL20抗体、上記抗体の抗原結合部分(すなわち、部分)、上記抗体の軽鎖、上記抗体の重鎖、およびこれら軽鎖もしくは重鎖の部分に関する。本発明はまた、上記重鎖および/もしくは軽鎖のシグナル配列を欠いている抗体、ならびにグリコシル化抗体に関する。本発明はまた、前駆抗体(precursor antibody)、非グリコシル化抗体、ならびに重鎖および/もしくは軽鎖がシグナル配列を含む抗体に関する。本発明はまた、上記抗体の重鎖および/もしくは軽鎖のうちのいずれかをコードする核酸分子、または本明細書に記載されるその部分;このような核酸を含むベクターおよび宿主細胞;本明細書に記載される抗体の重鎖および/または軽鎖もしくはその部分のうちのいずれかを生成する方法;ならびに上記抗体、抗体鎖、もしくは部分を使用する方法に関する。
本発明の抗体およびその抗原結合部分は、処置を必要とする被験体(例えば、ヒト患者)を処置して、CCR6へのCCL20の結合を低下させる、CCL20媒介性炎症を減じる、および/もしくは必要とされる場合、CCR6+細胞のCCL20媒介性化学走性を低下させるために使用され得る。
本発明の抗体は、2本の重鎖および2本の軽鎖を含む従来の抗体を包含する。いくつかの実施形態において、上記重鎖および/もしくは軽鎖のうちの1つ以上は、可変ドメイン(本明細書において「可変領域」ともいわれる)および定常ドメイン(本明細書において「定常領域」ともいわれる)を含む。完全可変ドメインは、存在する場合、4個のフレームワーク領域(FR)および3個の相補性決定領域(CDR)を含み、アミノ末端から始めて、順番に、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4と配置される。視覚的検査および配列分析は、上記CDR境界を同定するために行われ得る。本発明に関して、上記CDR配列は、例えば、図6に示されるように、Kabatシステム(Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.Government Printing Office (1991))および/もしくはChothiaシステム(Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987))を使用することによって定義される。
ヒト重鎖定常領域を含む本発明の実施形態は、該重鎖が、それぞれ、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、およびアルファ(α)、デルタ(δ)もしくはエプシロン(ε)タイプのものである、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを含む任意のアイソタイプのヒト定常領域、および該重鎖が、それぞれ、γ1、γ2、γ3、γ4、α1およびα2タイプのものである、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2を含む任意のサブクラスのヒト定常領域を含み得る。ヒト軽鎖を含む実施形態は、ヒトカッパ(κ)もしくはヒトラムダ(λ)軽鎖を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、完全抗体(2本の全長重鎖および2本の全長軽鎖を含む)を指す。用語「抗原結合フラグメント」とは、別段示されなければ、本明細書において、用語「抗原結合部分」と交換可能に使用される。抗体の抗原結合部分は、例えば、単鎖抗体、Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)フラグメント、Fdフラグメント、単鎖Fv分子(scFv)、二重特異性単鎖Fvダイマー(PCT/US92/09665)、ダイアボディー、ドメイン欠失抗体および単一ドメイン抗体(dAb)の様式で存在し得る。例えば、Jespers et al., Nature Biotechnology 22(9): 1161−1165 (2004))を参照のこと。VHおよび/もしくはVLを含む抗原結合分子もまた、本発明の範囲内である。VHの場合には、上記分子はまた、CH1、ヒンジ、CH2およびCH3領域のうちの1種以上を含み得る。
抗体部分は、酵素切断によって、もしくは組換え技術によって、生成され得る。例えば、パパインもしくはペプシンでの切断は、それぞれ、FabもしくはF(ab’)フラグメントを生成するために使用され得る。抗体はまた、1個以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、種々の短縮型形態で生成され得る。例えば、F(ab’)フラグメントの重鎖をコードする組換え構築物は、上記重鎖のCHドメインおよびヒンジ領域をコードするDNA配列を含むように設計され得る。
別の実施形態において、別のポリペプチドに連結された、本発明の抗CCL20抗体のうちの全てもしくは部分を含む、融合抗体もしくはイムノアドヘシンが作製され得る。一実施形態において、上記抗CCL20抗体の可変ドメインのみが、上記ポリペプチドに連結される。別の実施形態において、抗CCL20抗体のVドメインは、第1のポリペプチドに連結される一方で、抗CCL20抗体のVドメインは、該Vドメインおよび該Vドメインが互いに相互作用して、抗原結合部位を形成し得るような様式で、該第1のポリペプチドと会合する第2のポリペプチドに連結される。なお別の実施形態において、上記Vドメインは、該VドメインおよびVドメインが、互いに相互作用し得るように、リンカーによって該Vドメインから分離される(以下の単鎖抗体を参照のこと)。次いで、上記V−リンカー−V抗体は、目的の上記ポリペプチドに連結される。さらに、融合抗体が、作られ得、ここで2種(もしくはそれより多い)単鎖抗体が互いに連結されて、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価の抗体を作製し得るか、または二重特異性抗体を作製し得る。
本発明の単鎖抗体を作製するために、上記VコードDNAフラグメントおよびVコードDNAフラグメントは、可撓性リンカーをコードする(例えば、アミノ酸配列(Gly−Ser) (配列番号116)をコードする)別のフラグメントに作用的に連結され、その結果、上記V配列およびV配列は、該可撓性リンカーによって繋げられた上記VドメインおよびVドメインを有する連続した単鎖タンパク質(contiguous single−chain protein)として、発現され得る。例えば、Bird et al., Science 242:423−426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883 (1988); McCafferty et al. , Nature 348: 552−554 (1990);などを参照のこと。いくつかの実施形態において、上記単鎖抗体は、一価(単一のVおよびVのみが使用される)、二価(2つのVおよびVが使用される)、もしくは多価(2つより多くのVおよびVが使用される)である。本発明はまた、ヒトCCL20および別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体もしくは多価抗体を企図する。

他の実施形態において、他の改変された抗体は、抗CCL20抗体コード核酸分子を使用して、調製され得る。例えば、「カッパボディー(Kappa body)」(Ill et al., Protein Eng. 10:949−57 (1997))、「ミニボディー」(Martin et al.. EMBO J. 13:5303−9 (1994))、「ダイアボディー」(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444−6448 (1993))、もしくは「ヤヌシン(Janusin)」(Traunecker et al. , EMBO J. 10:3655−3659 (1991 )およびTraunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51−52 (1992))は、本明細書の技術に従い、標準的な分子生物学的技術を使用して調製され得る。
別の局面において、本発明は、本明細書で例示される抗体の改変体、もしくは該改変抗体の抗原結合部分を提供し、ここで該改変抗体は、ヒトCCL20に特異的に結合するが、上記例示される抗体とは、配列において、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、もしくはそれより多くのアミノ酸置換(例えば、CDR領域、FR領域、および/もしくは定常ドメインにおいて)だけ異なる。本発明によれば、上記改変抗体は、上記重鎖、上記重鎖可変ドメイン、上記軽鎖、上記軽鎖可変ドメイン、上記6個のCDR、もしくは上記8個のFRにおいて、参照抗体に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%同一であり得る。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドについての配列類似性(これは、配列同一性としても言及される)は、代表的には、配列分析ソフトウェア(これは、種々の置換、欠失および他の改変(保存的アミノ酸置換が挙げられる)に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似の配列をマッチさせる)を使用して測定される。例えば、Genetics Computer Group (GCG) Sequence Analysis Packageは、「ギャップ」および「ベストフィット」のようなプログラムを含み、これらは、密接に関連したポリペプチド(例えば、生物の異なる種に由来する相同なポリペプチド)の間で、または野生型タンパク質とそのムテインとの間で、配列相同性もしくは配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターで使用することができる。例えば、GCG Version 6.1を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトパラメーターもしくは推奨されるパラメーターを使用して、FASTA(GCG Version 6.1中のプログラム)で比較することができる。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、質問配列と検索配列との間の最もよい重複の領域のアラインメントおよび%配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183 :63−98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185−219 (2000))。本発明の配列と、異なる生物に由来する多数の配列を含むデータベースとを比較する場合に使用される別のアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する、コンピュータープログラムBLAST(特に、blastpもしくはtblastn)である。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403−410 (1990); Altschul et al.. Nucleic Acids Res. 25:3389−402 (1997)(本明細書に参考として援用される)を参照のこと。
本発明によれば、上記抗体中の1個以上のシステイン(これらは、化学的に反応性であり得る)は、別の残基(例えば、アラニンもしくはセリンが挙げられるが、これらに限定されない)に変化させられ得る。一実施形態において、非標準的(non−canonical)システインは、置換され得る。上記置換は、抗体の可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいて、行われ得る。いくつかの実施形態において、上記システインは、標準的である。いくつかの実施形態において、上記抗体における潜在的タンパク質分解部位は、除去される。このような部位は、抗体の可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域に、または定常ドメインに、存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物における不均一性というリスクを減じ得るので、その均一性を増大させ得る。いくつかの実施形態において、アスパラギン−グリシン対(これは、潜在的な脱アミド化部位を形成する)は、上記残基のうちの一方もしくは両方を変化させることによって、除去される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、その免疫原性を低下させるために、脱免疫(deimmunized)される。抗体の免疫原性を低下させるための技術は、当該分野で周知である。例えば、PCT公開番号WO 98/52976およびWO 00/34317を参照のこと。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、本発明の例示される抗体と比較される場合、1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似の化学的特性(例えば、電荷もしくは疎水性)を有する側鎖R基を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。2種以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、%配列同一性もしくは類似性の程度は、該置換の保存的性質について補正する(correct)ために、上方に調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307−31 (1994)を参照のこと。
類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、以下が挙げられる:1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン;2)脂肪族−ヒドロキシル側鎖:セリンおよびスレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギンおよびグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、およびヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびに7)含硫側鎖:システインおよびメチオニン。好ましい保存的アミノ酸置換群は、以下である:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびアスパラギン−グルタミン。あるいは、保存的置換は、Gonnet et al., Science 256:1443−45(1992)において開示されるPAM250対数尤度行列(log−likelihood matrix)において正の値を有する任意の変化である。「中程度の保存的」置換は、PAM250対数尤度行列において負ではない値を有する任意の変化である。
特定の実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分に対するアミノ酸置換は、以下である置換である:(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させる、(2)酸化に対する感受性を低下させる、(3)タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる(例えば、上記抗体のADCC活性およびCDC活性を増強するための)、(4)このようなアナログの他の物理化学的特性もしくは機能的特性を付与するかもしくは改変するが、ヒトCCL20への特異的結合性を保持する、(5)C末端リジンを除去する、および(6)グリコシル化部位を付加もしくは除去する。
一局面において、本発明は、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖であるか、または該重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン含有部分である、新しくかつ新規なポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは有用である。なぜなら、それは、それぞれ、抗体軽鎖もしくは抗体重鎖と組み合わせて、抗CCL20抗体を形成し得るからである。
新規なマウス抗ヒトCCL20抗体のCDRを含む、新規なヒト化中和抗CCL20抗体、および該ヒト化抗体の抗原結合部分が、本明細書に記載される。用語「ヒト化抗CCL20抗体」とは、本明細書で使用される場合、非ヒト起源の抗CCL20抗体(本明細書においてドナー抗体ともいう(例えば、マウス抗CCL20抗体))の1種以上のCDR(CDR1、CDR2およびCDR3)、およびヒト配列に由来する少なくとも部分を含む抗体を指す。上記ヒト抗体部分は、1種以上のフレームワーク領域(例えば、上記フレームワーク領域のうちの全て)、および/または定常領域のうちの全てもしくは一部であり得る。いくつかの実施形態において、上記ヒト配列フレームワーク領域は、生殖細胞系列配列を含むが、非生殖細胞系列変異を含み得る。非ヒト抗CCL20抗体の6個のCDRがヒトフレームワークに移植される、CDRを移植した抗CCL20抗体は、本発明のヒト化抗CCL20抗体の例である。例えば、Cabilly et al.,米国特許第4,816,567号; Cabilly et al.,欧州特許第0,125,023 B1号; Boss et al.,米国特許第4,816,397号; Boss et al.,欧州特許第0,120,694 B1号; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., 欧州特許第0,194,276 B1号; Winter, 米国特許第5,225,539号; Winter,欧州特許第0,239,400 B1号; Padlan, E.A. et al.,欧州特許出願第0,519,596 A1号を参照のこと。Ladner et al.,米国特許第4,946,778号; Huston,米国特許第5,476,786号;およびBird et al. Science 242:423−426 (1988))もまた参照のこと。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、脱免疫抗体である。潜在的T細胞エピトープの数を低下させ、それにより、ヒトへ投与された際の、免疫応答を惹起する抗体の性質を弱めるように改変された脱免疫抗体に関しては、例えば、Carr et al.,米国特許第7,264,806号を参照のこと。
特定の実施形態において、上記ヒト化抗体は、以下のマウスモノクローナル抗ヒトCCL20抗体:36F7C10、42G5B10、および40−1C10B9のうちの1種以上の、1種以上の軽鎖CDRおよび/もしくは1種以上の重鎖CDRを含み、ここで、該CDRは、Kabatシステム、Chothiaシステム、もしくはこれらの任意の組み合わせに従って同定される。いくつかの実施形態において、上記ヒト化抗体は、抗体36F7C10、42G5B10、もしくは40−1C10B9の3種全ての重鎖CDRおよび3種全ての軽鎖CDRを含む。
別の実施形態において、上記ヒト化抗体は、本発明のマウス抗ヒトCCL20抗体の結合特異性(例えば、ヒトCCL20に対する特異性、同じもしくは類似のエピトープ特異性)を有し、そして/または中和活性を有する。上記ヒト化抗体は、本明細書に記載されるマウス抗ヒトCCL20抗体、キメラ抗ヒトCCL20抗体、もしくはヒト化抗ヒトCCL20抗体の結合特異性、エピトープ特異性、および/もしくは中和活性を有し得る。例えば、本発明のヒト化抗体は、ヒトCCL20への結合について、上記マウス抗ヒトCCL20抗体、キメラ抗ヒトCCL20抗体、もしくはヒト化抗ヒトCCL20抗体と競合し得、そして/または該マウス抗ヒトCCL20抗体、キメラ抗ヒトCCL20抗体、もしくはヒト化抗ヒトCCL20抗体の中和機能を有し得る。特定の実施形態において、上記ヒト化抗体は、マウス抗体36F7C10、42G5B10、および40−1C10B9のうちのいずれか1つの結合特異性、エピトープ特異性および/もしくは中和活性を有する。
上記ヒト化抗体のヒト配列部分(例えば、フレームワーク領域;定常領域)は、任意の適切なヒト抗体に由来し得る。例えば、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体におけるヒト定常領域もしくはその部分は、対立遺伝子改変体を含め、ヒトκもしくはλ軽鎖遺伝子によって、および/またはヒトγ(例えば、γ1、γ2、γ3、γ4)、μ、α(例えば、α1、α2)、δもしくはε重鎖遺伝子によってコードされ得る。特定のヒト定常領域アイソタイプ(例えば、IgG1;IgG2)、その改変体もしくは部分は、エフェクター機能を調整するように選択され得る。例えば、変異した定常領域(すなわち、改変体)は、上記抗体へと組み込まれ得、Fcレセプターへの結合および/もしくは補体を固定する能力を低下させ得る(例えば、Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351を参照のこと)。
本明細書で使用される場合、用語「生殖細胞系列」とは、上記抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。なぜなら、それらが、生殖細胞を介して親から子孫へと受け継がれるからである。この生殖細胞系列配列は、親和性成熟過程の間の組換え事象および超変異事象により改変されている、B細胞における特定の抗体をコードするヌクレオチド配列から区別される。特定の生殖細胞系列を「利用する」抗体は、他の生殖細胞系列配列と比較して、それが指定する、生殖細胞系列ヌクレオチド配列と、もしくはアミノ酸配列と、最も厳密に整列するヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を有する。このような抗体は、上記生殖細胞系列配列と比較して変異している配列によってコードされ得るか、またはそのような配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記ヒトフレームワークは、生殖細胞系列配列から最小限のバリエーションを有する。例えば、3個未満の、4個未満の、5個未満の、6個未満の、7個未満の、8個未満の、、9個未満の、もしくは10個未満のアクセプターフレームワーク残基が、上記抗体の1種以上の特性を改善するために置き換えられてきた。いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク残基は、ドナーフレームワーク残基で置き換えられて、例えば、結合親和性が改善される(例えば、Queen el al.,米国特許第5,530,101号を参照のこと)。特定の実施形態において、ヒト化抗体鎖のフレームワークにおける制限された数のアミノ酸(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個のアミノ酸)が、アクセプター配列におけるよりむしろ、ドナー配列におけるそれらの位置において、上記アミノ酸と同じであるように選択されて(すなわち、「復帰変異を受ける(back−mutated)」)、ヒトCCL20に関する上記ヒト化抗体鎖を含む抗体の親和性を増大させる。
ヒトフレームワーク領域(例えば、重鎖および/もしくは軽鎖の可変領域の)は、好ましくは、上記ドナー抗体(例えば、マウス抗CCL20抗体)の抗原結合領域の類似のもしくは等価な領域(例えば、重鎖もしくは軽鎖の可変領域)に対して配列類似性を有するヒト生殖細胞系列配列から得られるかもしくはこれらに由来する。ヒト化抗体のヒト配列部分のフレームワーク領域の他の供給源は、ヒト可変領域コンセンサス配列を含む(例えば、Kettleborough et al. Protein Engineering 4:773−783 (1991); Carter et al., WO 94/04679; Carter 米国特許第6.407,213号)を参照のこと)。例えば、非ヒト部分を得るために使用される上記抗体のドナー配列(例えば、上記可変領域の配列)の領域は、Kabat, E. A. et al. Sequences of Proteins of immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.Government Printing Office (1991)に記載されるヒト配列と比較されて、上記ヒト化抗体のヒト部分の特定の供給源(例えば、上記フレームワーク領域の供給源)を選択し得る。
一実施形態において、上記ヒト化抗体鎖のフレームワーク領域は、非ヒトドナーの可変領域と、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%もしくは少なくとも約95%の全体的な配列同一性を有するヒトIg可変領域から得られるか、もしくは該ヒトIg可変領域に由来する。特定の実施形態において、上記ヒト化抗体鎖のフレームワーク領域は、非ヒトドナー抗体の可変領域のフレームワーク領域と、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%の全体配列同一性を有するヒト可変領域フレームワーク領域から得られるか、または該領域に由来する。
一実施形態において、上記ヒト化抗体のフレームワーク領域(FR)のうちの少なくとも1種は、ヒト配列のうちの1個以上の鎖から得られるか、もしくはこれらに由来する。従って、上記FRは、1種以上のヒト配列抗体から(例えば、ヒト抗体鎖から、ヒトコンセンサス配列から)得られるか、またはこれらに由来する、FR1および/もしくはFR2および/もしくはFR3および/もしくはFR4を含み得る。
いくつかの場合において、上記マウス抗CCL20抗体(複数可)の1種以上のCDRに隣接する残基が、直接的もしくは間接的のいずれかで、機能(例えば、結合性)に寄与し得、そしていくつかの場合においては、必須であり得ることは、当業者によって認識される。よって、いくつかの実施形態において、マウスフレームワークの1種以上のCDRに隣接する1個以上のアミノ酸(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、もしくはこれより多くの隣接するアミノ酸)はまた、上記ヒト化抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体のヒト重鎖フレームワーク領域は、ヒトIGHV1−46*03生殖細胞系列配列を利用する。いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体のヒト軽鎖フレームワーク領域は、ヒトIGKV1D−39*01生殖細胞系列配列を利用する。変異(例えば、復帰変異)は、必要に応じて、上記ヒト化抗体のCCL20結合親和性を改善するために、これらFR領域において(例えば、以下の実施例において記載される残基のうちの1個以上において)行われ得る。
「親和性」とは、結合相互作用の強度を記載する技術用語であり、代表的には、上記抗原への上記抗体の結合の全体的な強度を指す。上記抗原に対する上記抗体の親和性は、代表的には、特定の抗体−抗原相互作用の結合親和性平衡定数(K)として表される。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、一価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、500pM以下、400pM以下、300pM以下、200pM以下、100pM以下、90pM以下、80pM以下、70pM以下、60pM以下、50pM以下、もしくは45pM以下;または二価表面プラズモン共鳴によって決定される場合、12pM以下、10pM以下、8pM以下、6pM以下、もしくは5pM以下の親和性(K; K=Koff(k)/Kon(k))でヒトCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、1価表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)によって決定される場合、1000×10−1sec−1以下、900×10−1sec−1以下、800×10−1sec−1以下、700×10−1sec−1以下、600×10−1sec−1以下、500×10−1sec−1以下、400×10−1sec−1以下、300×10−1sec−1以下、240×10−1sec−1以下、200×10−1sec−1以下、190×10−1sec−1以下、180×10−1sec−1以下、170×10−1sec−1以下、160×10−1sec−1以下、もしくは150×10−1sec−1以下のkでヒトCCL20に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、1価表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)によって決定される場合、1000×10−5sec−1以下、900×10−5sec−1以下、800×10−5sec−1以下、700×10−5sec−1以下、600×10−5sec−1以下、500×10−5sec−1以下、400×10−5sec−1以下、300×10−5sec−1以下、240×10−5sec−1以下、200×10−5sec−1以下、190×10−5sec−1以下、180×10−5sec−1以下、170×10−5sec−1以下、160×10−5sec−1以下、150×10−5sec−1以下、140×10−5sec−1以下、130×10−5sec−1以下、120×10−5sec−1以下、100×10−5sec−1以下、90×10−5sec−1以下、80×10−5sec−1以下、70×10−5sec−1以下、もしくは65×10−5sec−1以下のkでヒトCCL20に結合する。
当業者に明らかであるように、種々の方法を使用して、本明細書に提供されかつ当該分野で公知の方法に従って生成される抗体およびその抗原結合部分が、必要な特異性(例えば、結合特異性、エピトープ特異性)を有することを確認し得る。例えば、ヒトCCL20に対して結合特異性を有する本発明のヒト化抗CCL20抗体もしくは部分の結合機能は、任意の適切な方法(例えば、上記ヒト化抗体もしくは部分と、ヒトCCL20(または例えば、CCL20のアミノ酸配列を有するペプチドもしくはヒトCCL20を含む固体支持体)との間の複合体の形成をモニターするアッセイ)を使用して、検出され得る。
本明細書で開示される特定のマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、もしくはヒト化モノクローナル抗体と、ヒトCCL20上の同じエピトープに結合する、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分(例えば、本発明のヒト化抗体もしくは部分)の能力、または本明細書で開示される特定のマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、もしくはヒト化モノクローナル抗体が結合する、ヒトCCL20上のエピトープと重複するヒトCCL20上のエピトープに結合する能力は、当業者に公知の種々の技術(例えば、競合的結合アッセイを含む)を使用して容易に決定され得る。これらは、上記特定の抗体の標識された形態の使用、および本発明の抗体の存在下および非存在下での、ヒトCCL20へのその標識された抗体の結合性の測定を包含し得る。
「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、抗体に特異的結合し得る任意のタンパク質決定基を包含する。抗体が結合するエピトープを特徴付けるための方法は、当該分野で公知である。本発明の抗CCL20抗体によって結合されるエピトープを特徴付ける1つの方法は、実施例9に記載される。抗原上の所望のエピトープがいったん決定されると、例えば、本発明において記載される技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することは可能である。あるいは、その発見プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けを行って、所望のエピトープについての情報を明らかにし得る。次いで、この情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。例えば、当業者は、互いに競合的に結合する抗体(すなわち、その抗原のへ結合について競合する抗体)を見いだすために、競合研究を行い得る。
一実施形態において、試験抗体もしくはその抗原結合部分が、本発明のヒト化抗体と同じもしくは重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために、本発明の抗CCL20抗体を、飽和条件下でCCL20に結合させ、次いで、上記試験抗体がCCL20に結合する能力を測定する。上記試験抗体が、参照抗CCL20抗体と同時にCCL20に結合し得る場合、上記試験抗体は、上記参照抗CCL20抗体とは異なるエピトープに結合し得る。しかし、上記試験抗体が同時にCCL20に結合し得ない場合、上記試験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、もしくは本発明の抗CCL20抗体が結合するエピトープに極めて近接して存在するエピトープに結合し得る。この実験は、例えば、ELISA、RIA、BiacoreTM、もしくはフローサイトメトリーを使用して行われ得る。抗CCL20抗体が別の抗CCL20抗体と交叉競合するかどうかを試験するために、二方向において、上記の競合方法を使用し得る(すなわち、上記参照抗体が、上記試験抗体をブロックするかどうか、そしてその逆も同様に決定する)。いくつかの実施形態において、上記実験は、BiacoreTMを使用して行われる。
エピトープビニング(binning)はまた、本発明の抗体を特徴付けるために有用であり得る。用語「ビニング」とは、それらの抗原結合特徴に基づいて抗体をグループ分けする方法を指す。それらの交叉競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、国際特許出願番号WO 03/48731に記載されている。上記「エピトープビニング」は、抗CCL20抗体の非標識形態「A」を、CCL20の配列に対応する合成ペプチドもしくはCCL20陽性細胞に結合させることによって、調査され得る。その後、標識された第2の抗CCL20抗体「B」が添加され、上記細胞もしくは合成ペプチドが、抗CCL20抗体「A」に以前に曝されなかったコントロールサンプルと比べて結合し得る、標識された抗体の量が評価され得る。あるいは、抗CCL20抗体「A」および「B」がともに、検出を可能にする、異なる蛍光色素もしくは化学物質で標識され得、上記標識を検出し得るデバイスを使用して、同時にCCL20ペプチドに結合し得る両方の標識された抗体の量が測定され得るか、またはフローサイトメトリーによってCCL20陽性細胞に同時にに結合する両方の抗体の量が測定され得る。BiacoreTMおよびOctet技術は、抗体の非標識形態の競合的結合を調査することを可能にする。抗体の非標識形態のこの使用は望ましい。なぜなら、いくつかの抗体の化学的改変は、上記結合活性を損ない得るからである。Jia et al., J. Immunol. Methods 288:91−98 (2004)(これは、エピトープビニングを行うことにおいても有用である)に記載される技術もまた参照のこと。
本発明の抗CCL20抗体の部分(例えば、軽鎖、重鎖、ならびに軽鎖および重鎖の部分)もまた、本明細書において提供される。これら抗体部分は、抗体から(例えば、還元および/もしくは切断によって)得られるかもしくは該抗体に由来し得るか、または所望の特性(例えば、ヒトCCL20を結合する、配列類似性)を有する抗体の部分もしくは鎖をコードする核酸によって生成もしくは発現され得る。それらはまた、例えば、関連部分のデノボ合成によって調製され得る。ヒトおよび非ヒト起源の所望の部分(例えば、抗原結合領域、CDR、FR、C領域)を含むヒト化抗体は、所望のヒト化された鎖をコードする構築物(例えば、cDNA)を調製するために、合成および/もしくは組換え核酸を使用して生成され得る。例えば、抗体の部分(例えば、鎖の部分)を調製するために、1個以上の終止コドンが、上記核酸配列の所望の部位に導入され得る。ヒト化可変領域をコードする核酸(例えば、DNA)配列は、既存のDNA配列を改変するPCR変異誘発法を使用して構築され得る(例えば、Kamman et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)を参照のこと)。新たなCDRをコードするPCRプライマーは、同じか、もしくは非常に類似のヒト可変領域に基づいている、以前にヒト化された可変領域のDNAテンプレートにハイブリダイズされ得る(Sato et al.、 Cancer Research 53:851−856 (1993))。類似のDNA配列が、テンプレートとして利用可能でない場合、可変領域配列をコードする配列を含む核酸が、合成オリゴヌクレオチドから構築され得る(例えば、Kolbinger, Protein Engineering 8:971−980 (1993)を参照のこと)。シグナルペプチドをコードする配列(「シグナル配列」)はまた、上記核酸に(例えば、合成で、ベクターへの挿入によって)組み込まれ得る。シグナルペプチド配列が利用可能でない(例えば、代表的には、存在しない)場合、別の抗体に由来するシグナルペプチド配列が使用され得る(例えば、Kettleborough, Protein Engineering 4:773−783 (1991)を参照のこと)。これら方法、本明細書に記載される方法もしくは他の適切な方法を使用して、改変体を容易に生成し得る。
本明細書で使用される場合、頭字語「mAb」(もしくは「MAb」)とは、モノクローナル抗体を指し、これは、例えば、細胞のクローン集団によって合成される抗体もしくはヒト化抗体であり得る。モノクローナル抗体を生成するクローン集団は、不死化細胞のクローン集団であり得る。いくつかの実施形態において、上記クローン集団中の不死化細胞は、ハイブリッド細胞(ハイブリドーマ)であり、代表的には、免疫した動物に由来する個々のBリンパ球と、リンパ球性腫瘍に由来する個々の細胞との融合によって生成される。
本発明は、一部、ヒトCCL20に対する結合特異性を有するヒト化抗体もしくはその抗原結合部分に関するもので、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖ならびに/またはこれらの部分を含む。一実施形態において、上記ヒト化抗体は、配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号1の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号2の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号3の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号4の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号5の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号7の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号6の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号1の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号2の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号3の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号4の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号5の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖;または配列番号8の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖および配列番号6の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖を含む。
一実施形態において、本発明のヒト化抗体は、アミノ酸配列が以下:
a)それぞれ、配列番号60、64、67、70、73、および75;
b)それぞれ、配列番号60、64、67、71、73、および75;
c)それぞれ、配列番号60、63、67、70、73、および75;
d)それぞれ、配列番号60、63、67、71、73、および75;
e)それぞれ、配列番号61、65、68、70、73、および75;
f)それぞれ、配列番号61、65、68、71、73、および75;
g)それぞれ、配列番号77、79、67、70、73、および75;
h)それぞれ、配列番号77、79、67、71、73、および75;
i)それぞれ、配列番号78、80、68、70、73、および75;ならびに
j)それぞれ、配列番号78、80、68、71、73、および75
である重鎖(H)−CDR1、H−CDR2、H−CDR3、軽鎖(L)−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3を含む。
別の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、配列が配列番号67もしくは68であるH−CDR3を含む。特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、配列がそれぞれ、配列番号67および75であるか;またはそれぞれ、配列番号68および75であるH−CDR3およびL−CDR3を含む。
別の実施形態において、上記ヒト化抗体は、ヒトCCL20に対して結合特異性を有し、配列番号70もしくは71;73;および75、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される1種以上のCDRを含む軽鎖;ならびに配列番号60、61、77、もしくは78;63、64、65、79、もしくは80;および67もしくは68;またはこれらの組み合わせからなる群より選択される1種以上のCDRを含む重鎖を含む。
別の実施形態において、ヒトCCL20に対して結合特異性を有する上記ヒト化抗体は、配列番号7、8、110、もしくは112の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む軽鎖、ならびに配列番号1、2、3、4、5、6、もしくは108の1種以上のCDR(例えば、3種全てのCDR)を含む重鎖を含む。
本発明はまた、本明細書に記載されるヒト化抗体のヒト化抗体軽鎖に関する。一実施形態において、上記ヒト化抗体軽鎖は、70もしくは71;73;および75、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される1種以上のCDRを含む。例えば、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が、それぞれ、70、73、および75;またはそれぞれ、71、73、および75であるL−CDR1、L−CDR2、およびL−CDR3を有する。
本発明はまた、本明細書に記載されるヒト化抗体のヒト化抗体重鎖に関する。一実施形態において、上記ヒト化抗体重鎖は、60、61、77、もしくは78;63、64、65、79、もしくは80;および67もしくは68;またはこれらの組み合わせからなる群より選択される1種以上のCDRを含む。例えば、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が以下:
a)配列番号60、63、および67;
b)配列番号60、64、および67;
c)配列番号61、65、および68;
d)配列番号77、79、および67;または
e)配列番号78、80、および68
であるH−CDR1、H−CDR2、およびH−CDR3を有する。
一実施形態において、本発明のヒト化抗体は、配列番号15もしくは16の可変ドメイン(V)配列を含む軽鎖を含む。関連実施形態において、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が配列番号7、8、110、および112のうちの1つを含むか、またはアミノ酸配列が配列番号7、8、110、および112のうちの1つからなる軽鎖を含む。一実施形態において、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が、シグナル配列を含まない配列番号7もしくは8を含むか、またはシグナル配列を含まない配列番号7もしくは8からなる軽鎖を含む。
一実施形態において、本発明のヒト化抗体は、配列番号9〜14のうちの1つの可変ドメイン(V)配列を含む重鎖を含む。関連実施形態において、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が、配列番号1〜6および108のうちの1つを含むか、または配列番号1〜6および108のうちの1つからなる重鎖を含む。一実施形態において、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が、シグナル配列を含まない、および必要に応じて、C末端リジンを含まない配列番号1〜6のうちの1つを含むかまたはシグナル配列を含まない、および必要に応じて、C末端リジンを含まない配列番号1〜6のうちの1つからなる重鎖を含む。一実施形態において、上記ヒト化抗体は、アミノ酸配列が、C末端リジンを含まない配列番号108を含むかまたはC末端リジンを含まない配列番号108からなる重鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、アミノ酸配列が、以下:
a)配列番号9および配列番号15;
b)配列番号10および配列番号15;
c)配列番号11および配列番号15;
d)配列番号12および配列番号15;
e)配列番号13および配列番号15;
f)配列番号14および配列番号15;
g)配列番号9および配列番号16;
h)配列番号10および配列番号16;
i)配列番号11および配列番号16;
j)配列番号12および配列番号16;
k)配列番号13および配列番号16;または
l)配列番号14および配列番号16
を含むかまたはそれからなるVおよびVを含む。
一実施形態において、本発明のヒト化抗体は、アミノ酸配列が、以下:
a)配列番号1および配列番号7;
b)配列番号2および配列番号7;
c)配列番号3および配列番号7;
d)配列番号4および配列番号7;
e)配列番号5および配列番号7;
f)配列番号6および配列番号7;
g)配列番号1および配列番号8;
h)配列番号2および配列番号8;
i)配列番号3および配列番号8;
j)配列番号4および配列番号8;
k)配列番号5および配列番号8;
l)配列番号6および配列番号8;
m)配列番号108および配列番号110;ならびに
n)配列番号108および配列番号112;
を含むかまたはそれからなる軽鎖(LC)および重鎖(HC)であって、
ここで、上記アミノ酸配列が、シグナル配列(存在する場合)を欠いており、配列番号1〜6および配列番号108は、必要に応じて、C末端リジンを欠いている、軽鎖(LC)および重鎖(HC)を含む。
本発明は、本発明の例示されるヒト化重鎖もしくはその抗原結合部分、および例示されるヒト化軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む任意の組み合わせを提供し;言い換えると、上記重鎖および軽鎖は、「混合および適合させられ(mixed and matched)」得る。任意のこのような組み合わせが、ヒトCCL20への結合性、ならびに化学走性中和活性を保持するようであることは、理解される。これら機能的特性は、本明細書に記載される方法を使用して、容易に試験され得る。実際に、図7は、本発明の例示されるヒト化重鎖および軽鎖のいくつかの組み合わせの中和活性を実証する。
本発明はまた、本明細書で例示される抗体が結合するのと同じエピトープに結合し、そして/または該抗体と競合するかもしくは交叉競合する、抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分を提供する。これら抗体は、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはマウス抗体であり得る。例えば、本発明は、マウス抗CCL20抗体である、36F7C10、40−1C10B9、および42G5B10、またはこれらマウス抗体のヒト化バージョンもしくはキメラバージョンのうちの1つが結合するのと同じエピトープに結合し、そして/または該抗体と競合するかもしくは交叉競合する抗ヒトCCL20抗体および部分を提供する。参照抗体が結合するのと同じエピトープに結合するか、または該参照抗体と競合するかもしくは交叉競合する、抗体の能力は、本明細書で記載されるように決定され得る。非限定的例によって、マウス抗体36F7C10に由来する3種の重鎖CDRおよび3種の軽鎖CDRを含む任意の抗体もしくは部分は、マウス抗体36F7C10が結合するのと同じエピトープに結合し、該マウス抗体と競合し、そして交叉競合すると予測される。このような抗体は、例えば、重鎖が配列番号9〜11のうちのいずれか1つを含み、軽鎖が配列番号15もしくは16を含む抗体を包含し得る。いくつかの実施形態において、このような抗体は、例えば、重鎖が配列番号12〜14のうちのいずれか1つを含み、軽鎖が配列番号15もしくは16を含む抗体をさらに含み得る。
所望であれば、例えば、診断目的もしくはアッセイ目的で(例えば、例えば、治療のモニタリングを可能にするように画像化する)、上記ヒト化抗体(もしくはその抗原結合部分)は、検出可能な標識を含み得る。適切な検出可能な標識およびヒト化抗体もしくはその抗原結合部分の標識のための方法は、当該分野で周知である。適切な検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体(例えば、インジウム−111、テクネチウム−99mもしくはヨウ素−131)、陽電子放射標識(例えば、フッ素−19)、常磁性イオン(例えば、ガドリニウム(III)、マンガン(II))、エピトープ標識(タグ)、親和性標識(例えば、ビオチン、アビジン)、スピン標識、酵素、蛍光基もしくは化学発光基が挙げられる。標識が使用されない場合、複合体形成(例えば、ヒト化抗体とヒトCCL20との間)は、表面プラズモン共鳴、ELISA、FACS、もしくは他の適切な方法によって決定され得る。
本発明において使用される抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分はまた、例えば、化学反応もしくは遺伝子改変を介して、上記抗体の薬物動態(例えば、半減期)を改善する他の部分(例えば、ペグ化(pegylation)部分)に結合体化され得る。いくつかの実施形態において、本発明において使用される抗CCL20抗体は、適切なサイトカインに、例えば、化学結合体化もしくは遺伝子改変を介して連結され得る(例えば、抗体コード配列にインフレームで上記サイトカインのコード配列を付加し、それによって、抗体:サイトカイン融合タンパク質を作り出す)。
本発明はまた、本発明のヒト化抗体(もしくはその抗原結合部分)が、別の治療剤(例えば、生物活性化合物(例えば、サイトカイン、超抗原、細胞傷害剤もしくは毒素))に結合させる免疫結合体に関する。例えば、ヒトCCL20(もしくはその抗原結合部分)に対して結合特異性を有する上記ヒト化抗体は、生物学的タンパク質、植物もしくは細菌起源の分子(もしくはその誘導体)、インターロイキン−2抗体もしくはジフテリア毒素抗体に結合させることができる。
本明細書に記載されるように、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するマウスモノクローナル抗体が、生成された。本発明のヒト化抗体およびキメラ抗体は、本発明のマウスモノクローナル抗体に由来し得る。すなわち、いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗CCL20抗体およびキメラ抗CCL20抗体は、本発明のマウスモノクローナル抗体から得た配列(例えば、1種以上のCDR配列(例えば、6種全てのCDR配列)または1種以上の可変ドメイン(例えば、上記重鎖可変ドメインおよび上記軽鎖可変ドメイン))を含む。
本明細書で使用される場合、用語「マウスモノクローナル抗体」は、マウス抗体の軽鎖CDR(L−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3)および重鎖CDR(H−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3)、ならびにマウス起源のフレームワーク領域および定常領域を含む抗体を指す。
本発明は、本明細書に記載されるマウスモノクローナル抗体、ならびに上記マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分、上記マウスモノクローナル抗体の軽鎖、上記マウスモノクローナル抗体の重鎖、ならびにこれら重鎖および軽鎖の部分に関する。特定の実施形態において、上記マウスモノクローナル抗体は、36F7C10、40−1C10B9、もしくは42G5B10である。本発明は、重鎖シグナル配列および軽鎖シグナル配列を欠いているマウスモノクローナル抗体、ならびにグリコシル化されているマウスモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、前駆抗体、非グリコシル化抗体、および重鎖および/もしくは軽鎖がシグナル配列を含む抗体に関する。本発明はまた、上記マウス抗体の重鎖、軽鎖、もしくはこれらの部分のうちのいずれかをコードする核酸分子;このような核酸を含むベクターおよび宿主細胞;上記マウスの重鎖もしくは軽鎖またはこれらの部分のうちのいずれかを生成する方法;ならびに上記マウス抗体もしくはその抗原結合部分を使用する方法に関する。
ヒトCCL20に対して結合特異性を有するマウスモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の結合機能は、任意の適切な方法を使用して、例えば、マウスモノクローナル抗体もしくは部分と、ヒトCCL20(または例えば、CCL20のアミノ酸配列を有するペプチドもしくはヒトCCL20を含む固体支持体)との間の複合体の形成をモニターするアッセイを使用して、検出され得る。
軽鎖、重鎖、ならびに軽鎖および重鎖の部分を含む上記マウス抗体の部分もまた、本明細書において提供される。これら抗体部分は、例えば、ヒト化抗体部分について本明細書に記載される手段によって、得られ得るかもしくは誘導し得る。
一実施形態において、本発明のマウスモノクローナル抗体は、配列番号40、42、もしくは44を含む軽鎖を含み、配列番号39、41、もしくは43を含む重鎖をさらに含む。特定の実施形態において、上記マウスモノクローナル抗体は、配列番号40を含む軽鎖および配列番号39を含む重鎖;配列番号42を含む軽鎖および配列番号41を含む重鎖;または配列番号44を含む軽鎖および配列番号43を含む重鎖を含む。
別の実施形態において、本発明はまた、配列番号40、42、および44からなる群より選択される配列に軽鎖可変領域;ならびに配列番号39、41、および43からなる群より選択される配列に重鎖可変領域を含む、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するマウスモノクローナル抗体に関する。
本発明はまた、軽鎖が配列番号40、42、もしくは44に可変領域を含む、マウスモノクローナル抗体に関する。
本発明はまた、重鎖が配列番号39、41、もしくは43に可変領域を含む、マウスモノクローナル抗体に関する。
所望であれば、例えば、診断目的もしくはアッセイ目的で(例えば、画像化)、上記マウスモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分は、例えば、ヒト化抗体について本明細書で記載されるように、検出可能な標識を含み得る。本発明のヒト化抗体について本明細書に記載される全ての適切な方法および技術はまた、本発明のマウスモノクローナル抗体について使用され得る。
本明細書で記載されるように、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体が、生成された。本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、1つの種に由来する抗体の可変ドメインを含む一方で、上記抗体の定常ドメインは、異なる種に由来する組換えタンパク質を指す。一実施形態において、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体は、マウス抗ヒトCCL20モノクローナル抗体に由来する可変ドメインを含む。一実施形態において、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体は、ヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。特定の実施形態において、上記キメラ抗体は、マウス抗ヒトCCL20モノクローナル抗体に由来する可変ドメインおよびヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。
本発明は、本明細書に記載されるキメラ抗体、ならびに上記キメラ抗体の抗原結合部分、上記キメラ抗体の軽鎖および重鎖、ならびにこれら軽鎖および重鎖の部分に関する。本発明は、上記重鎖および軽鎖のシグナル配列を欠いているキメラ抗体、ならびにグリコシル化されているキメラ抗体に関する。本発明はまた、前駆抗体、非グリコシル化抗体、および重鎖および/もしくは軽鎖がシグナル配列を含む抗体に関する。本発明はまた、上記キメラ抗体の重鎖、軽鎖、もしくはその部分のうちのいずれかをコードする核酸分子;またはこのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞;上記キメラ抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその部分のうちのこれらいずれかを生成する方法;ならびに上記キメラ抗体を使用する方法に関する。
ヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体の結合機能は、任意の適切な方法を使用して、例えば、キメラ抗体と、ヒトCCL20(または、例えば、CCL20のアミノ酸配列を有するペプチドもしくはヒトCCL20を含む固体支持体)との間の複合体の形成をモニターするアッセイを使用して、検出され得る。
軽鎖、重鎖、ならびに軽鎖および重鎖の部分を含むキメラ抗体の部分もまた、本明細書において提供される。これら抗体部分は、例えば、ヒト化抗体部分について本明細書に記載される手段によって、得られ得るかもしくは誘導し得る。
一実施形態において、本発明のキメラ抗体は、配列番号40の軽鎖可変領域および配列番号39の重鎖可変領域;配列番号42の軽鎖可変領域および配列番号41の重鎖可変領域;または配列番号44の軽鎖可変領域および配列番号43の重鎖可変領域を含む。
本発明はまた、配列番号40、42、もしくは44における軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域配列を含み;および配列番号39、41、もしくは43における重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域配列をさらに含む、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体に関する。
本発明はまた、配列番号40、42、もしくは44における可変領域を含むキメラ軽鎖に関する。
本発明はまた、配列番号39、41、もしくは43における可変領域を含むキメラ重鎖に関する。
所望であれば、例えば、診断目的もしくはアッセイ目的で(例えば、画像化)、上記キメラ抗体もしくはその抗原結合部分は、例えば、ヒト化抗体について本明細書に記載されるように、検出可能な標識を含み得る。本発明のヒト化抗体について本明細書に記載される全ての適切な方法および技術はまた、本発明のキメラ抗体のために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗CCL20抗体は、完全にヒト抗体である。本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」とは、上記可変ドメイン配列および定常ドメイン配列が、ヒト配列である任意の抗体を意味する。上記用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、可能な免疫原性を低下させる、親和性を増大させる、望ましくない折りたたみを引き起こし得るシステインを除去するなどのように変化させられた配列を有する抗体を包含する。上記用語はまた、非ヒト細胞において組換え生成され、ヒト細胞に代表的でないグリコシル化を付与し得るそのような抗体を包含する。完全にヒト抗体を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ヒト抗CCL20抗体は、インビトロ方法(例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ(CAT)、酵母ディスプレイなど)を介して同定されてもよいし、ヒトB細胞もしくはヒトハイブリドーマ細胞から生成されてもよい。あるいは、ヒト抗体は、多くの非ヒトトランスジェニック動物(彼らのゲノムの中にヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座のうちのいくらかもしくは全てを含む)のうちのいずれかを、CCL20抗原で免疫することによって生成され得る。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン「ミニ遺伝子座」を有する動物(例えば、GenPharm International, Inc.)である。いくつかの実施形態において、ヒト抗CCL20抗体は、XENOMOUSE(登録商標)マウス(Abgenix, Inc., Fremont, CA)、HuMAb−Mouse(登録商標)マウス(Mcdarex, Inc.)、VelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaaceuticals, Inc.)、AlivaMabマウス(Ablexis, LLC)、KMTMマウス(Kirin Pharma USA, Inc.)などを使用して、生成される。
本発明はまた、本発明のヒト化抗体またはその軽鎖もしくは重鎖、マウスモノクローナル抗体またはその軽鎖もしくは重鎖、キメラ抗体またはその軽鎖もしくは重鎖、あるいは上記のうちのいずれかの抗原結合部分をコードする配列を含む、単離されたおよび/もしくは組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号17〜32、51〜56、109、111、および113からなる群より選択される核酸配列を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子は、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは本明細書に記載される核酸配列または上記提供されるV配列もしくはV配列のうちのいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列のうちの1種以上に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%もしくは99%同一である核酸配列を包含する。
本明細書において「単離された」もしくは「精製された」といわれる核酸は、それらの起源となる供給源のゲノムDNAもしくは細胞RNAの核酸(例えば、それらが細胞中に、もしくは核酸の混合物(例えば、ライブラリー)中に存在する場合)から分離された核酸であり、本明細書に記載の方法もしくは他の適切な方法によって得られる核酸を包含する。いくつかの実施形態において、上記単離された核酸は、本質的に純粋な核酸、化学合成によって生成される核酸、生物学的方法および化学的方法の組み合わせによって生成される核酸、もしくは単離される組換え核酸である(例えば、Daugherty et al. Nucleic Acids Res. 19(9):2471−2476 (1991); Lewis and Crowe. Gene 101: 297−302 (1991)を参照のこと)。
ヌクレオチド配列への言及は、別段特定されなければ、その相補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含することが理解されるべきである。用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で言及される場合、ポリマー状の(おそらく単離された)、少なくとも10塩基長のヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか)の形態、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変形態を意味する。上記用語は、一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
本明細書において「組換え体」といわれる核酸は、組換えDNA方法論によって生成された核酸(人工的組換えの方法に依拠する手順(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/もしくは制限酵素を使用するベクターへのクローニング)によって生成される核酸が挙げられる)である。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸は、細胞の天然の機構を介して起こる組換え事象から生じるが、所望の組換え事象を可能にしかつ確実にするように設計された細胞へ核酸の導入した後に選択される。
本発明はまた、より具体的には、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するヒト化抗体、マウス抗体もしくはキメラ抗体、または上記抗体の抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたおよび/もしくは組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、本発明のマウス抗体、本発明のヒト化抗体(ここでその非ヒト部分(複数可)は、マウス抗CCL20モノクローナル抗体に由来する);または本発明のキメラ抗体(ここでその非ヒト部分(複数可)は、マウス抗CCL20モノクローナル抗体に由来する)である。
いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、ヒトCCL20に対する結合特異性を有するヒト化抗体、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するマウス抗体、およびヒトCCL20に対して結合特異性を有するキメラ抗体を生成するために使用される。例えば、本発明のヒト化抗体、マウス抗体もしくはキメラ抗体をコードする1種の核酸(例えば、DNA(例えば、cDNA)もしくはRNA)、または1種以上の核酸は、配列のさらなる操作のために、または適切な宿主細胞において上記コードされる抗体の生成のために、適切な構築物(例えば、組換えベクター)の中に組み込まれ得る。
ヒトCCL20に対する結合特異性を有するヒト化抗体、ヒトCCL20に対する結合特異性を有するマウス抗体またはヒトCCL20に対する結合特異性を有するキメラ抗体の発現に適した構築物もしくはベクターもまた、提供される。種々のベクターが利用可能であり、これらとしては、宿主細胞において単一コピーもしくは複数コピーにおいて維持されるか、または宿主細胞の染色体(複数可)への組み込まれるベクターが挙げられる。上記構築物もしくはベクターは、適切な宿主細胞へ導入され得、本発明のヒト化抗体、マウス抗体もしくはキメラ抗体を発現する細胞が、生成され得、培養物中で維持され得る。単一のベクターもしくは複数のベクターが、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するヒト化抗体、マウス抗体もしくはキメラ抗体の発現のために使用され得る。
適切な発現ベクター(例えば、哺乳動物細胞発現ベクター)はまた、多くの成分(以下のうちの1種以上を含むが、これらに限定されない:複製起点;選択マーカー遺伝子;1種以上の発現制御エレメント(例えば、転写制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター)、1種以上の翻訳シグナル);および/または膜標的化もしくは分泌のためのシグナル配列もしくはリーダー配列(「シグナルペプチド」をコードする))を含み得る。構築物もしくはベクターにおいて、シグナル配列は、上記構築物もしくはベクター、または他の供給源によって提供され得る。例えば、転写シグナルおよび/もしくは翻訳シグナルは、発現を指向するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、適切な宿主細胞において本発明の抗体もしくは抗体鎖の発現のために提供される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、構成性である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは誘導性である。上記プロモーターは、抗体もしくは抗体鎖、または上記抗体もしくは抗体鎖の抗原結合部分をコードする核酸に作動可能に連結され得、その結果、上記プロモーターは、上記コードされるポリペプチドの発現を誘導する。原核生物宿主のための種々の適切なプロモーター(例えば、E.coliのためのlac、tac、T3、T7プロモーター)および真核生物宿主のための種々の適切なプロモーター(例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH1)、SV40、CMV)が、利用可能である。当業者は、本発明の抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分を発現するための適切なプロモーターを選択し得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗体鎖をコードするベクターは、該ベクターを有する宿主の選択のための選択マーカーを含む。いくつかの実施形態において、上記選択マーカーは、原核生物細胞(例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性)、Tet遺伝子(テトラサイクリン耐性)など)および真核生物細胞(例えば、ネオマイシン(G418もしくはジェネティシン)耐性遺伝子、gpt(ミコフェノール酸)耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、もしくはハイグロマイシン耐性遺伝子)において使用され得る抗生物質耐性もしくは薬物耐性を付与する生成物をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記選択マーカーは、種々の宿主においてメトトレキサートでの選択を可能にするジヒドロ葉酸レダクタ−ゼであり、いくつかの実施形態において、上記選択マーカーは、上記宿主の、例えば、酵母において使用するための栄養要求性マーカーをコードする遺伝子(例えば、LEU2、URA3、HIS3)である。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)もしくがファージベクターである。一実施形態において、上記ベクターは、上記宿主細胞のゲノムへ組み込まれ得る(例えば、レトロウイルスベクター)。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、複製可能なベクターであり、複製起点を含む。
本発明は、従って、本発明のヒト化抗体、ヒト化軽鎖、ヒト化重鎖、マウス抗体、マウス抗体軽鎖、マウス抗体重鎖、キメラ抗体、キメラ軽鎖、もしくはキメラ重鎖をコードする単離された核酸分子に関する。本発明はまた、これら抗体もしくはこれら抗体の鎖のうちのいずれかの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子に関する。本発明の核酸によってコードされるポリペプチド配列は、上記に記載され、以下の実施例において記載される。
いくつかの実施形態において、本発明の核酸もしくはベクターは、本発明の重鎖(もしくはその抗原結合部分)または軽鎖(もしくはその抗原結合部分)をコードする。上記重鎖コード核酸および上記軽鎖コード核酸の両方、または上記重鎖および上記軽鎖の抗原結合部分をコードする核酸を含む宿主細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体(または該抗体の抗原結合部分)を作製するために使用され得る。上記重鎖コード核酸および上記軽鎖コード核酸は、別個の発現ベクターに配置され得る。それらはまた、同じかまたは異なる発現制御下にある単一の発現ベクターに配置され得る。例えば、米国特許第6,331,415号および同第7,662,623号を参照のこと。
本発明の別の局面は、本発明の抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法に関する。上記抗体もしくは部分は、例えば、適切な宿主細胞における上記抗体もしくは部分をコードする1種以上の組換え核酸の発現によって生成され得る。上記宿主細胞は、任意の適切な方法を使用して生成され得る。例えば、本明細書に記載される1種以上の発現構築物は、適切な宿主細胞に導入され得、得られた細胞は、上記構築物(複数可)もしくはベクター(複数可)の発現に適した条件下で維持され得る。いくつかの実施形態において、上記得られた細胞は、培養物、動物、もしくは植物中で維持される。適切な宿主細胞は、原核生物細胞(細菌細胞(例えば、E.coli(例えば、DH5αTM株(Invitrogen, Carlsbad, CA))、B.subtilisおよび/もしくは他の適切な細菌)が挙げられる);真核生物細胞(例えば、真菌細胞もしくは酵母細胞(例えば、Pichia pastoris、Aspergillus sp.、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Neurospora crassa))、または他のより下等な真核生物細胞、およびより高等な真核生物の細胞(例えば、以下に由来するもの:昆虫(例えば、Drosophila Schneider S2細胞、Sf9昆虫細胞(WO 94/26087 (O’Connor)、TN5B1−4 (HIGH 5)昆虫細胞(Invitrogen))、哺乳動物(例えば、COS細胞(例えば、COS−1(ATCCアクセッション番号CRL−1650)およびCOS−7(ATCCアクセッション番号CRL−1651))、CHO(例えば、ATCCアクセッション番号CRL−9096)、CHO DG44(Urlaub and Chasin., Proc. Natl. Acac. Sci. USA 77(7):4216−4220 (1980))、293(ATCCアクセッション番号CRL−1573)、HeLa(ATCCアクセッション番号CCL−2)、CV1(ATCCアクセッション番号CCL−70)、WOP(Dailey et al., J. Virol. 54:739−749 (1985))、3T3、293T(Pear et al., Proc. Natl.Acad Sci. U.S.A. 90:8392−8396 (1993))、NS0細胞、SP2/0細胞、HuT 78細胞など))、または植物(例えば、タバコ、ウキクサ科(lemna)(ウキクサ科)、および藻類))(例えば、Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)を参照のこと)。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、多細胞生物(例えば、植物もしくは動物)の一部ではない。特定の実施形態において、上記宿主細胞は、単離された宿主細胞であるか、または細胞培養物の一部である。
本発明はまた、本発明の核酸もしくはベクターを含む細胞に関する。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体の重鎖および軽鎖もしくはその抗原結合部分、マウス抗体の重鎖および軽鎖もしくはその抗原結合部分、またはキメラ抗体の重鎖および軽鎖もしくはその抗原結合部分、ヒトCCL20に対して結合特異性を有する上記抗体もしくは部分をコードする1種以上の核酸、あるいはこのような核酸(複数可)を含む1種以上の構築物は、選択した適切な宿主細胞に適した方法によって、該宿主細胞へと導入され得る。いくつかの実施形態において、導入方法は、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、もしくは感染である。いくつかの実施形態において、上記核酸(複数可)は、1種以上の発現制御エレメントに作動可能に連結される。特定の実施形態において、上記核酸(複数可)は、ベクター中に、上記細胞におけるプロセスによって作り出された構築物中に、または上記宿主細胞ゲノムに組み込まれて存在する。宿主細胞は、発現に適した条件下で維持され得る。いくつかの実施形態において、これら条件は、誘導因子、もしくは適切な媒体(例えば、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助物質などが補充されている)の存在を含み、それによって上記コードされるポリペプチド(複数可)が生成される。これらプロセスは、トランスジェニック動物もしくは植物(例えば、タバコ)の宿主細胞(例えば、乳腺細胞)における発現を包含する(例えば、WO 92/03918を参照のこと)。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、上記宿主細胞、培養培地、もしくは乳汁から単離される。
本発明はまた、本発明の抗体もしくは部分(例えば、ヒト化抗体もしくは部分)が、融合タンパク質にとって、N末端位置、C末端位置もしくは内部で別の部分(例えば、天然において見いだされる場合の抗体には存在しない部分)へと連結される、融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、適切な発現ベクター(例えば、pETベクター(例えば、pET−15b,Novagen)、ファージベクター(例えば、pCANTAB 5 E, Pharmacia)、もしくは他のベクター(例えば、pR1T2T Protein A融合ベクター, Pharmacia)への、抗体配列(複数可)をコードする核酸の挿入によって生成され得る。得られた構築物は、発現に適した宿主細胞へと導入され得る。いくつかの実施形態において、上記発現される融合タンパク質は、適切なアフィニティーマトリクスによって、細胞溶解物から単離もしくは精製される(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel el al., Eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1−16.7.8 (1991))。
本発明は、本明細書で提供される抗体もしくは部分、あるいはその重鎖および/または軽鎖(例えば、本発明のヒト化抗体、ヒト化軽鎖もしくはヒト化重鎖、マウス抗体、マウス軽鎖もしくはマウス重鎖、キメラ抗体、またはキメラ重鎖もしくはキメラ軽鎖)をコードする組換え核酸(複数可)を含む宿主細胞に関する。本発明はまた、上記抗体もしくはその鎖の抗原結合部分をコードする組換え核酸(複数可)を含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、本明細書で言及されるように、本発明の組換えベクターを含む。いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、発現ベクターである。特定の実施形態において、上記組換えベクターは、哺乳動物細胞発現ベクターである。
本発明はまた、本発明の抗体もしくは部分、またはその重鎖もしくは軽鎖を調製する方法に関する。一実施形態において、上記方法は、上記抗体もしくは部分またはその重鎖および/もしくは軽鎖の発現に適した条件下で、本明細書に記載されるように、本発明の宿主細胞を維持する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の抗体もしくは部分、またはその重鎖および/もしくは軽鎖をコードする1種以上の単離された核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、基材上でもしくは懸濁物中で培養される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記抗体もしくは抗体鎖を精製もしくは単離する工程をさらに包含する。
本発明はさらに、ファージディスプレイを介して抗体もしくはその抗原結合部分を調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、CCL20抗原に対してナイーブな抗体ファージディスプレイライブラリーが、パニングされる。いくつかの実施形態において、誘導選択(guided selection)を介して抗体を調製する方法が使用される(例えば、米国特許公開US 2006−0251658 A1を参照のこと)。特定の実施形態において、例えば、既知の抗CCL20抗体の固定された重鎖(および/もしくは軽鎖)CDR3領域の周りに構築されるカスタムライブラリーが、作製される。上記重鎖および軽鎖のCDR1領域およびCDR2領域は、ナイーブなレパートリーに由来し得る(Osburn et al., Methods 36.61−68 (2005))。一実施形態において、抗CCL20 scFvは、所望の結合特性を有するマウス−ヒトキメラ抗体を得るために使用されるscFvナイーブ抗体ライブラリーから生成される。これらライブラリーは、所望の結合特性を有する抗体についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態において、scFvファージライブラリーが使用される。特定の実施形態において、ヒトCCL20を認識するscFvは、Vaughan et al. Nature Biotech. 14:309−314 (1996)に本質的に記載されるように、組換えヒトCCL20に対して反復される一連の選択サイクルの後に、scFv誘導選択ライブラリーから単離される。簡潔には、上記ライブラリーとのインキュベーション後、固定された抗原(これは、常磁性ビーズと予め結合されている)、および結合したファージが、磁気分離によって回収され得るその一方で、非結合ファージが洗い流される。次いで、結合したファージは、Vaughan et al. (1996; 前出)に記載されるように、および上記反復される選択プロセスによって回収され得る。
特定の実施形態において、単鎖様式で、ナイーブなヒト軽鎖可変領域のレパートリーへと融合される、マウス抗CCL20抗体の重鎖の可変ドメイン全体からなるライブラリーが構築される。選択後、上記マウス重鎖可変領域を補う上記ヒト軽鎖可変領域が、同定される。次いで、上記のように選択されたヒト軽鎖可変領域のレパートリーからなるラブラリーが構築され、これは、単鎖様式で、ナイーブなヒトCDR1およびCDR2領域、ならびに上記マウス抗CCL20抗体重鎖可変ドメインに由来する固定されたCDR3領域からなるキメラ重鎖可変領域へと融合される。CCL20結合物質(binder)の選択後、最良の結合クローンを選択する。上記6個のCDR領域のうちの5個は、ヒト起源であり得る一方で、上記重鎖可変領域のCDR3は、上記マウス重鎖可変ドメインの元のCDR3と同一であり得る。
いくつかの実施形態において、選択は、製造業者の推奨に従って、DYNABEADS M−270アミン(Dynal)に結合されたCCL20を使用して行われる。いくつかの実施形態において、ビオチン化CCL20を使用する選択は、製造業者の指示(EZ link NHS LC Biotin, Pierce)に従って、一級アミン特異的試薬であるスクシンイミジル−6−(ビオチンアミド)ヘキサノエートを使用して調製し得る。
いくつかの実施形態において、選択からの生成物(output)は、CCL20への結合について競合する、細胞周辺(periplasmic)調製物に存在するscFvの能力を測定する競合アッセイに基づく、ハイスループットスクリーニングにおいて細胞周辺調製物として試験される。
ハイスループットスクリーニングにおいて競合し得るサンプルは、Vaughan et al. (1996;前出)およびOsburn et al. (2005;前出)に記載されるように、DNA配列決定に供され得る。次いで、クローンは、scFvもしくはIgGとして発現および精製され得、CCL20に結合するか、CCL20を中和するか、またはこれらの組み合わせのそれらの能力について、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)アッセイおよび補体依存性細胞傷害性(CDC)アッセイなどのアッセイを使用して、評価され得る。精製されたscFv調製物は、次いで、WO 01/66754の実施例3に記載されるように調製され得る。精製されるscFv調製物のタンパク質濃度を、BCA法(Pierce)を使用して決定した。類似のアプローチを使用して、固定された全長抗体重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインの至適パートナー(反対鎖)についてスクリーニングし得る。
別の実施形態において、抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分は、PCT公開番号WO 93/06213(本明細書に参考として援用される)に記載されるエピトープインプリンティング法を使用して、本明細書に記載されるように、CCL20に対して類似の結合活性を有する重鎖配列および軽鎖配列を選択するために最初に使用される。特定の実施形態において、この方法において使用される抗体ライブラリーは、PCT公開番号WO 92/01047、McCafferty et al., Nature 348:552−554 (1990);およびGriffiths et al, EMBO J. 12:725−734 (1993)(全て本明細書に参考として援用される)に記載されるように、調製されかつスクリーニングされるscFvライブラリーである。特定の実施形態において、上記scFv抗体ライブラリーは、抗原としてヒトCCL20を使用してスクリーニングされる。
最初のVドメインおよびVドメインがいったん選択されると、「混合および適合(mix and match)」実験が行われ得、ここで上記最初に選択されたVセグメントおよびVセグメントの異なる対が、CCL20結合についてスクリーニングされて、好ましいV/V対の組み合わせが選択される。さらに、上記抗体の質をさらに改善するために、好ましいV/V対(複数可)の上記VセグメントおよびVセグメントが、天然の免疫応答の間に抗体の親和性成熟を担うインビボ体細胞変異プロセスに類似のプロセスにおいて、無作為に変異を受け得る。いくつかの実施形態において、上記ランダム変異は、Vおよび/もしくはVのCDR3領域内で起こる。特定の実施形態において、このインビトロ親和性成熟は、例えば、VドメインおよびVドメインを、それぞれ、上記V CDR3もしくはVのCDR3に相補的なPCRプライマーを使用して増幅することによって達成され、ここで上記プライマーは、得られるPCR生成物が、VセグメントおよびVセグメント(ランダム変異が、Vおよび/もしくはV CDR3領域の中に導入される)をコードするように、特定の位置において4種のヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」された。これら無作為に変異したVセグメントおよびVセグメントは、CCL20への結合に対して再スクリーニングされ得る。
組換え抗体ディスプレイライブラリーから本発明の抗CCL20抗体をスクリーニングおよび単離した後に、上記選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージから(例えば、ファージゲノムから)回収され得、標準的な組換えDNA技術によって他の発現ベクターへサブクローニングされ得る。いくつかの実施形態において、上記核酸は、本明細書に記載されるように、本発明の他の抗体形態を作り出すようにさらに操作される。特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現するために、上記抗体をコードするDNAは、本明細書に記載されるように、組換え発現ベクターにクローニングされ、哺乳動物宿主細胞へと導入される。
特定の実施形態において、本発明は、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する方法であって、CCL20トランスジェニックマウスのリンパ球を、上記ヒトCCL20トランスジェニックマウスと同じ系統(例えば、CD1)を有する非トランスジェニックマウスに投与し、それによって、免疫された非トランスジェニックマウスを生成する工程を包含する方法を提供する。上記免疫した非トランスジェニックマウスの脾細胞を、不死化細胞と接触させ、それによって、融合細胞を生成し、該融合細胞を、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが生成される条件下で維持し、それによって、ヒトCCL20に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する。
本発明はまた、本発明の抗CCL20抗体およびその抗原結合部分が変異を受けた形態を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、上記重鎖および/もしくは軽鎖の可変ドメインに変異を受ける。特定の実施形態において、上記変異は、上記抗体もしくは部分の1種以上の結合特性を変化させる。特定の実施形態において、変異は、上記抗CCL20抗体もしくは部分のKを増大もしくは低下させるか、koffを増大もしくは低下させるか、または上記抗体もしくは部分の結合特異性を変化させるように、上記CDR領域のうちの1種以上においてなされる。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知である。例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.(前出)を参照のこと。別の実施形態において、1つ以上の変異が、本発明のモノクローナル抗体における生殖細胞系列と比較して変化していることが公知であるアミノ酸残基においてなされる。特定の実施形態において、上記変異は、可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいてなされる。特定の実施形態において、上記変異は、可変ドメインにおいてなされる。いくつかの実施形態において、1つ以上の変異は、本発明の抗体もしくは部分の可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域における生殖細胞系列と比較して変化していることが公知のアミノ酸残基においてなされる。
別の実施形態において、上記フレームワーク領域は、得られたフレームワーク領域(複数可)が、対応する生殖細胞系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異を受ける。特定の実施形態において、1つ以上の変異は、上記抗CCL20抗体もしくは部分の半減期を増大させるために、フレームワーク領域もしくは定常ドメインにおいてなされる。例えば、PCT公開 WO 00/09560を参照のこと。特定の実施形態において、フレームワーク領域もしくは定常ドメインにおける変異は、上記抗体の免疫原性を変化させるために、または別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するために、なされる。本発明によれば、単一の抗体もしくは部分は、上記可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域のうちのいずれか1種以上において、または上記定常ドメインにおいて変異を有し得る。
本発明の抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分はまた、目的の上記抗体重鎖配列および軽鎖配列に関してトランスジェニックである哺乳動物もしくは植物の生成、ならびにそこからの回収可能な形態での上記抗体の生成を介してトランスジェニックに(transgenically)生成され得る。いくつかの実施形態において、上記抗CCL20抗体もしくは部分は、ヤギ、ウシ、もしくは他の哺乳動物の乳汁中に生成され、そこから回収される。例えば、米国特許第5,827,690号、同第5,756.687号、同第5,750,172号、および同第5,741,957号を参照のこと。いくつかの実施形態において、ヒト抗体遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物は、上記で記載されるように、ヒトCCL20もしくはその免疫原性部分で免疫される。植物において抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許第6,046,037号および同第5,959,177号に記載される。
いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物もしくは植物は、本発明の抗CCL20抗体もしくは部分をコードする1種以上の核酸分子を、標準的なトランスジェニック技術によって、上記動物もしくは植物に導入することによって生成される。Hoganおよび米国特許第6,417,429号(前出)を参照のこと。特定の実施形態において、上記トランスジェニック動物を作製するために使用されるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞もしくは体細胞もしくは受精卵であり得る。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物もしくは植物は、キメラヘテロ接合体、非キメラヘテロ接合体、もしくは非キメラホモ接合体である。例えば、Hogan et al, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000);およびPinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)を参照のこと。いくつかの実施形態において、上記非ヒトトランスジェニック動物もしくは植物は、目的の重鎖および/もしくは軽鎖をコードする標的化構築物による標的化された破壊および置き換えを有する。特定の実施形態において、上記トランスジェニック動物もしくは植物は、ヒトCCL20に対して特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、これを発現する。上記抗CCL20抗体もしくは部分は、任意の非ヒトトランスジェニック動物もしくは植物に作製され得る。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシもしくはウマである。上記非ヒトトランスジェニック動物は、血液、乳汁、尿、唾液、涙液、粘液および他の体液に上記コードされるポリペプチドを発現し得る。
本発明の抗体およびその抗原結合部分は、例えば、CCR6+細胞(例えば、未熟樹状細胞(DC)、エフェクター/記憶T細胞、およびB細胞)のCCL20誘導性化学誘引を中和することにおいて有用である。従って、上記抗体および部分は、種々の疾患および状態(例えば、炎症、自己免疫疾患、およびがん)を処置することにおいて有用であり得る。本発明の抗体もしくは抗原結合部分で処置され得る疾患および状態の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、慢性肝炎、接触性皮膚炎、神経膠芽腫、肝細胞癌、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、膵腺癌、歯周病、甲状腺乳頭状癌、掌蹠膿疱症状、点状丘疹性発疹と関連する状態、表皮水疱症、円形脱毛症、多発性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、ベーチェット病、急性汎発性発疹性膿疱症、脈管炎、若年性特発性関節炎、サルコイドーシス、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、腎臓同種移植片拒絶、移植片対宿主病、肝臓同種移植片拒絶、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、糸球体腎炎、呼吸器系合胞体ウイルス感染、多発性骨髄腫、およびランゲルハンス細胞組織球症。いくつかの実施形態において、本発明は、任意のCCR6関連状態を処置するための方法を提供する。
よって、本発明は、有効量の、本発明の抗体もしくは部分を、それを必要とする被験体に投与することによって、炎症、自己免疫疾患、もしくはがんを処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、自己免疫疾患、がん、および/もしくは炎症を有するか、または自己免疫疾患、がん、および/もしくは炎症を有するリスクがあるヒト患者である。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、炎症、自己免疫疾患、もしくはがんの発症もしくは再発を防止するために、予防的に投与される。
本発明の抗体およびその抗原結合部分は、個体(例えば、ヒト)に、単独で、もしくは組み合わせ治療において別の作用物質(agent)とともに投与され得る。上記抗体もしくは部分は、事前に、さらなる作用物質との混合物として、該さらなる作用物質と別個であるが同時に、または該さらなる作用物質の投与の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、上記さらなる作用物質は、以下を含む群より選択されるが、これらに限定されない:免疫刺激性サイトカインのインヒビター(例えば、抗TNF−α MAb)、免疫細胞除去因子(例えば、抗CD20 MAb)、アクセサリー分子のブロッカー(例えば、アバタセプト)、リウマチ性疾患の疾患改変因子(例えば、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、メトトレキサート、レチノイン酸、およびビタミンD3アナログ)、ならびに免疫抑制剤(例えば、カルシニューリンインヒビター)。いくつかの実施形態において、上記さらなる作用物質は、以下を含む群より選択されるが、これらに限定されない:ステロイド剤、免疫調節剤、ソマトスタチン作用物質(somatostatic agent)、従来の免疫治療剤、サイトカインもしくはサイトカインアンタゴニスト、および/または増殖因子もしくは増殖因子アンタゴニスト。いくつかの実施形態において、抗CCL20抗体治療は、標準医療でのがん処置(例えば、化学療法、外科手術、もしくは放射線療法)とともに、または別の標的化された治療(例えば、抗VEGF抗体治療)とともに、使用され得る。いくつかの実施形態において、抗CCL20抗体治療は、予防的レジメンとともに使用され得る。一実施形態において、合成ペプチド摸倣物は、本発明の抗体とともに投与され得る。別の実施形態において、ホルモン療法は、本発明の抗体もしくは部分とともに施され得る。
一実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、単独で、もしくは抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る抗炎症剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:コルチコステロイド(例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロン)、非ステロイド系抗炎症薬(例えば、バルサラジド、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン)、ならびにアセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体(例えば、スルファサラジン(sulfasalazone)およびメサラミン)、チアジンカルボキサミド、ε−アセトアミドカプロン酸、S−アデノシルメチオニン、3−アミノ−4−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン(amixetrine)、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサール、ピホキシム、プロクアゾン、プロキサゾール、およびテニダップ。
本発明の抗体と組み合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、FK−506、15−デオキシスペルグアリン、ナタリズマブ、およびT細胞応答機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る免疫抑制調製物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ORTHOCLONETM(OKT3)、SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(シクロスポリン)、PROGRAFTM(タクロリムス)、CELLCEPTTM(ミコフェノレート)、アザチオプリン、グルココルチコステロイド類(glucorticosteroids)、AVONEXTM(インターフェロン−β 1A)、およびRAPAMUNETM(シロリムス)。一実施形態において、免疫抑制剤は、器官もしくは骨髄の移植の拒絶を防止するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る化学療法剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:抗生物質誘導体(例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン);抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン);代謝拮抗物質(例えば、フルオロウラシル、5−FU、フロクスウリジン、インターフェロンα−2b、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および6−チオグアニン);細胞傷害剤(例えば、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン);ホルモン(例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、エピネフリン、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、およびテストラクトン);ナイトロジェンマスタード誘導体(例えば、メルファラン(mephalen)、クロラムブシル(chorambucil)、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)およびチオテパ);ステロイドおよび組み合わせ(例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム);および他(例えば、ダカルバジン(dicarbazine)、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、リツキシマブ、およびエトポシド)。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、TNFアンタゴニストと組み合わせて投与される。本発明の抗体もしくは抗原結合部分とともに投与され得るTNFアンタゴニストは、インフリキシマブ(REMICADETM)、アダリムマブ(HUMIRATM)、セルトリズマブペゴール(CIMZIATM)、ゴリムマブ(SIMPONITM)、エタネルセプト(ENBRELTM)、キサンチン誘導体(例えば、ペントキシフィリン)およびブプロピオン(WELLBURTINTM、ZYBANTM)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、単独で、もしくは1種以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の抗体もしくは部分とともに投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:GAMMARTM、IVEEGAMTM、SANDOGLOBULINTM、GAMMAGARD S/DTM、およびGAMIMUNETM。いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、移植治療(例えば、骨髄移植)において静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、サイトカインもしくはサイトカインアンタゴニストと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、任意のサイトカインもしくはサイトカインアンタゴニストとともに投与され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:IL2、IL3、1I4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN−γおよびTNF−αまたはこれらの任意のアンタゴニスト。いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、任意のインターロイキンもしくはインターロイキンアンタゴニストとともに投与され得、これらとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない:IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、およびIL−21またはこれらの任意のアンタゴニスト。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、1種以上のケモカインもしくはケモカインアンタゴニストと組み合わせて投与される。具体的実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、以下からなる群より選択されるα(CxC)ケモカイン:γ−インターフェロン誘導性タンパク質−10(γIP−10)、インターロイキン−8(IL−8)、血小板因子−4(PF4)、好中球活性化タンパク質(NAP−2)、GRO−α、GRO−β、GRO−γ、好中球活性化ペプチド(ENA−78)、顆粒球化学誘引タンパク質−2(GCP−2)、および間質細胞由来因子−1(SDF−1、もしくはプレ−B細胞刺激因子(PBSF));ならびに/または以下からなる群より選択されるβ(CC)ケモカイン:RANTES(regulated on activation, normal T expressed and secreted)、マクロファージ炎症タンパク質−1α(MIP−1α)、マクロファージ炎症タンパク質−1β(MIP−1β)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、単球走化性タンパク質−2(MCP−2)、単球走化性タンパク質−3(MCP−3)、単球走化性タンパク質−4(MCP−4)、マクロファージ炎症タンパク質−1γ(MIP−1γ)、マクロファージ炎症タンパク質−3α(MIP−3α)、マクロファージ炎症タンパク質−3β(MIP−3β)、マクロファージ炎症タンパク質−4(MIP−4/DC−CK−1/PARC)、エオタキシン、Exodus、および1−309;ならびに/またはγ(C)ケモカインであるリンホタクチン;あるいはこれらの任意のアンタゴニストと組み合わせて投与される。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、ケモカインβ−8、ケモカインβ−1、および/もしくはマクロファージ炎症タンパク質−4、またはこれらの任意のアンタゴニストとともに投与される。好ましい実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、ケモカインβ−8もしくはそのアンタゴニストとともに投与される。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、IL−4アンタゴニストと組み合わせて投与される。本発明の抗体および抗体組成物とともに投与され得るIL−4アンタゴニストとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:可溶性IL−4レセプターポリペプチド、可溶性IL−4レセプターポリペプチドのマルチマー形態、IL−4によって誘発される生物学的シグナルを伝達することなくIL−4レセプターと結合する抗IL−4レセプター抗体、1種以上のIL−4レセプターへのIL−4の結合をブロックする抗IL4抗体、およびIL−4レセプターを結合するが、IL−4によって誘発される生物学的シグナルを伝達しないIL−4のムテイン。好ましくは、この方法に従って使用される上記抗IL4抗体は、モノクローナル抗体であり;その抗原結合部分もまた、使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、TNFファミリーのメンバー、もしくはそのアンタゴニストと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、以下が挙げられるが、これらに限定されない作用物質と組み合わせて投与される:TNF−αの可溶性形態、リンホトキシン−α(LT−α,TNF−βとしても公知)、LT−β(複合ヘテロトリマーLT−α2−β中で見いだされる)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4−1BBL、DcR3、OX40L、TNF−γ(国際公開番号WO 96/14328)、AIM−I(国際公開番号WO 97/33899)、エンドカイン(endokine)−α(国際公開番号WO 98/07880)、OPG、ニュートロカイン(neutrokine)−α(国際公開番号WO 98/18921)、OX40、神経増殖因子(NGF)、Fasの可溶性形態、CD30、CD27、CD40 4−1BB、TR2(国際公開番号WO 96/34095)、DR3(国際公開番号WO 97/33904)、DR4(国際公開番号WO 98/32856)、TR5(国際公開番号WO 98/30693)、TR6(国際公開番号WO 98/30694)、TR7(国際公開番号WO 98/41629)、TRANK、TR9(国際公開番号WO 98/56892)、TR10(国際公開番号WO 98/54202)、312C2(国際公開番号WO 98/06842)、TR12、ならびにCD154、CD70、およびCD153の可溶性形態;またはこれらの任意のアンタゴニスト。
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、処置されている障害の症状のうちの1つ以上をある程度軽減もしくは防止する、投与される治療剤の量を指す。疾患を処置するための抗CCL20抗体もしくはその抗原結合部分の有効量は、1種以上の所望の臨床エンドポイントに達するように、処置される被験体の助けとなる量である。
いくつかの実施形態において、免疫原性を最小にするために、ヒト化抗体もしくは部分は、本発明の治療法および組成物で、ヒト患者を処置するために使用される。反復投与が必要でない場合では、いくつかの実施形態において、本発明のマウス抗体もしくはキメラ抗体または部分をヒト患者に投与することもまた、適切であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分は、例えば、免疫刺激性サイトカインのインヒビター(例えば、抗TNF−α MAb)、免疫細胞除去因子(例えば、抗CD20 MAb)、および/もしくはアクセサリー分子のブロッカー(例えば、アバタセプト)で以前に処置されてきた個体を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記抗体もしくは部分は、これらの他の処置に対して一次非応答性または応答速度において徐々に低下を示した患者を処置するために使用される。
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分は、ヘルスケア提供者によって適切であるとみなされる任意の時点において、単一の単位用量もしくは複数用量で投与され得る。上記投与量は、当該分野で公知の方法によって決定され得、例えば、上記個体の年齢、感受性、耐性および全体的な健康状態に依存し得る。当該分野で受容されている任意の投与法が、本発明の抗体および部分に適切に使用され得、これらとしては、処置されるべき疾患もしくは状態に依存して、非経口(例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内(intrathecal)、腹腔内、皮下の注射)、経口(例えば、食餌)、局所に(locally)、局所(topical)、吸入(例えば、気管支内、鼻内もしくは経口吸入、点鼻)、または直腸が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。一実施形態において、上記抗体もしくは部分は、非経口投与される。
製剤は、選択される投与経路に従って変わる(例えば、液剤、エマルジョン)。投与されるべき抗体もしくは部分を含む適切な組成物は、生理学的に受容可能なビヒクルもしくはキャリア中に調製され得る。上記組成物は、複数用量を含み得るか、または単一の単位用量組成物であり得る。液剤もしくは乳剤に関しては、適切なキャリアとしては、例えば、水性もしくはアルコール性/水性溶剤、乳化剤、もしくは懸濁化剤(食塩水および緩衝媒体が挙げられる)が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルもしくは不揮発性油が挙げられ得る。静脈内ビヒクルとしては、種々の添加剤、保存剤、もしくは流動性の、栄養素もしくは電解質補充物が挙げられ得る(一般には、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Co., PA, 1985を参照のこと)。吸入に関しては、上記化合物は、投与に適切なディスペンサー(例えば、噴霧器、ネブライザもしくは加圧エアロゾルディスペンサー)へと可溶化および充填され得る。
投与量レジメンは、最適な所望の応答を提供するよう調整され得る。 特定の実施形態において、単一ボーラスが投与され得、いくつかの分割用量が、経時的に投与され得るか、または上記用量は、治療状況の緊急性によって示されるものと調和して低減もしくは増大してよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することは、特に有利ある。単位剤形は、本明細書で使用される場合、処置されるべき上記患者/被験体のための単位投与量として適した、物理的に別個の単位を指し;各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を生み出すように計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の単位剤形の仕様は、一般に、(a)上記治療剤の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果もしくは予防効果、ならびに(b)個体における感受性に対する上記処置のためのこのような活性化合物を調合することの当該分野に固有の制限、によって規定され、かつこれらに直接依存する。
従って、当業者は、本明細書で提供される開示に基づいて、上記用量および投与レジメンが、治療分野で周知の方法に従って調節されることを認識する。すなわち、最大耐量は、容易に確立され得、検出可能な治療上の利益を患者に提供する有効量もまた、各作用物質を投与するための時間的な要件が上記患者への検出可能な治療上の利益を提供し得るように、決定され得る。よって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明を実施することにおいて、患者に提供され得る用量および投与レジメンを決して限定しない。
投与量の値は、緩和されるべき状態のタイプおよび重症度とともに変化し得、単一用量もしくは複数用量を含み得ることは、特に言及されるべきである。任意の特定の被験体について、特定の投与レジメンが、個々の必要性ならびに上記組成物を投与するかもしくは上記組成物の投与を監督するヒトの専門的な判断に従って、経時的に調節されるべきであり、本明細書に示される投与量範囲は例示に過ぎず、本請求される組成物の範囲もしくは実施を限定するとは解釈されないことはさらに理解されるべきである。さらに、本発明の組成物での投与レジメンは、種々の要因に基づき得る。上記要因としては、疾患のタイプ、上記患者の年齢、体重、性別および医学的状態、該状態の重症度、投与経路、ならびに使用される特定の抗体が挙げられる。従って、上記投与レジメンは、広く変動し得るが、標準的な方法を使用して慣用的に決定され得る。例えば、用量は、薬物動態パラメーターもしくは薬力学的パラメーターに基づいて調節され得、これらパラメーターは、臨床効果(例えば、毒性作用および/もしくは実験室値)を含み得る。従って、本発明は、当業者によって決定されるように、患者内用量増加(intra−paticnt dose−escalation)を包含する。適切な投与量およびレジメンを決定する方法は、関連分野において周知であり、本明細書で開示される教示がいったん提供されれば、当業者によって達成されることが理解される。
いくつかの実施形態において、ヒト被験体への投与について、本発明の抗体もしくは抗体部分の全1ヶ月用量は、当然のことながら、投与様式に依存して、0.5mg/患者〜1200mg/患者の範囲にある。特定の実施形態において、静脈内の1ヶ月用量は、約1mg/患者〜1000mg/患者を必要とする。上記全1ヶ月用量は、単一用量もしくは分割用量において投与され得、医師の判断において、本明細書で提供される代表的範囲の外であってもよい。
特定の実施形態において、本発明の抗体もしくは抗体部分の治療上もしくは予防上有効な量についての範囲は、1mg/kg/患者/月〜1000mg/kg/患者/月である。一実施形態において、本発明の抗体もしくはその部分は、約1mg/患者/月〜200mg/患者/月もしくは1mg/患者/月〜150mg/患者/月で投与され得る。特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、1mg/kg/患者、2mg/kg/患者、3mg/kg/患者、4mg/kg/患者、5mg/kg/患者、6mg/kg/患者、7mg/kg/患者、8mg/kg/患者、9mg/kg/患者、もしくは10mg/kg/患者の注射が、1ヶ月に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回投与される。特定の実施形態において、上記抗体もしくは部分は、1〜5mg/kg/患者の注射が、1ヶ月に1回もしくは2回投与される。
本発明の抗体およびその抗原結合部分はまた、研究および診断における適用に関する、種々のプロセスにおいて有用である。いくつかの実施形態において、上記抗体および部分は、ヒトCCL20もしくはその改変体を(例えば、アフィニティー精製もしくは他の適切な方法(例えば、細胞(例えば、懸濁物中の、リンパ球)に関しては、例えば、フローサイトメトリー)によって)、検出、単離および/もしくは精製するために、そしてヒトCCL20構造(例えば、コンホメーション)および機能を研究するために、使用される。上記抗体の免疫原性が懸念事項でないインビトロ適用に関しては、本発明のマウス抗体およびキメラ抗体、ならびにそれらの抗原結合部分は、ヒト化抗体に加えて、有用である。
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分は、診断適用において(例えば、インビトロ、エキソビボで)使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体もしくは部分は、サンプル中のヒトCCL20のレベルを検出および/もしくは測定するために使用される。特定の実施形態において、上記サンプルは、例えば、ヒトCCL20を発現する細胞もしくは組織、および/または体液(例えば、ヒトCCL20を有する、炎症滲出物、血液、血清、および/もしくは腸液)を含む。サンプルは、個体から得られ得、本明細書に記載される抗体もしくは部分は、ヒトCCL20発現を検出および/もしくは測定するための適切な免疫学的方法(フローサイトメトリー(例えば、リンパ球のような懸濁物中の細胞に関して)、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)(化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が挙げられる)などの方法が挙げられる)において使用され得る。
一実施形態において、サンプル中のヒトCCL20を検出する方法は、該サンプルと、本発明の抗体もしくは部分とを、ヒトCCL20への該抗体もしくは部分の特異的結合に適した条件下で接触させる工程、および形成される抗体−CCL20複合体を検出する工程を包含する。一実施形態において、本明細書に記載される抗体もしくは部分は、ヒトCCL20反応性および/もしくは発現に関して、正常組織対炎症組織(例えば、ヒト由来)を分析して(例えば、免疫組織学的に)、ヒトCCL20(例えば、罹患組織における)の増大した発現と、以下から選択されるが、これらに限定されない1種以上の障害との間の関係性を検出するために使用され得る:グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、慢性肝炎、接触性皮膚炎、神経膠芽腫、肝細胞癌、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、膵腺癌、歯周病、甲状腺乳頭状癌、掌蹠膿疱症状、点状丘疹性発疹と関連する状態、表皮水疱症、円形脱毛症、多発性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、ベーチェット病、急性汎発性発疹性膿疱症、脈管炎、若年性特発性関節炎、サルコイドーシス、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、腎臓同種移植片拒絶、移植片対宿主病、肝臓同種移植片拒絶、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、糸球体腎炎、呼吸器系合胞体ウイルス感染、多発性骨髄腫、ランゲルハンス細胞組織球症、もしくは他の状態。従って、本発明の抗体は、正常組織もしくは炎症組織におけるヒトCCL20の存在を評価する免疫学的方法を可能にする。上記方法を介して、疾患の存在、疾患の進行および/もしくは疾患(例えば、炎症疾患および/もしくは免疫疾患)の処置における抗ヒトCCL20治療の効力が、評価され得る。
本発明の方法および技術は、一般には、当該分野で周知の従来方法に従って、および、別段示されなければ、本明細書全体にわたって引用および考察される種々の一般的なかつより具体的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、Sambrook J . & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)を参照のこと。酵素反応および精製技術は、当該分野で一般に達成されるように、もしくは本明細書で記載されるように、製造業者の仕様に従って行われる。本明細書で記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学の実験手順および技術に関連して使用される命名法、ならびに該実験手順および技術は、周知のものであり、当該分野で一般に使用される。
別段定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例示的方法および材料が以下に記載されるものの、本明細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料がまた、本発明の実施もしくは試験において使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書(定義を含む)が優先する。多くの文書が本明細書で引用されているが、この引用は、これら文書のうちのいずれかが、当該分野での通常の一般知識の一部を形成するという許容を構成しない。本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、語句「含む、包含する(comprise)」、または「含む、包含する(comprises)」もしくは「含む、包含する(comprising)」などの変形は、示される整数もしくは整数の群を包含するが、任意の他の整数もしくは整数の群を排除しないことを意味することと理解される。上記材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することが意図されない。
本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例が示される。これら実施例は、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定するとは如何様にも解釈されるべきでない。
(実施例1:自己免疫/炎症性障害におけるCCL20の関与)
自己免疫状態および炎症状態におけるCCL20の関与についての証拠を得るために、本発明者らは、II型コラーゲン誘発性関節炎(CIA)マウス関節リウマチ(RA)モデルにおいてCCL20レセプターCCR6をノックアウトすることの効果を研究した。CCR6野生型マウス、CCR6+/−(ヘテロ接合性)マウス、およびCCR6−/−(ホモ接合性)ノックアウトマウス(各n=10)を、完全フロイントアジュバント(Chondrex, #7001)中で乳化したウシII型コラーゲン(150μg/マウス)を尾の基部に免疫した。3週間後、不完全アジュバント中の同じ量のウシII型コラーゲンエマルジョンのブースター注射を、上記尾の基部に投与した。本発明者らは、Griswold et al., Arthritis & Rheumatism 31(11): 1406−1412 (1988)に記載されるように、各マウスの足の関節炎症状の重症度を等級付けした。簡潔には、本発明者らは、関与した関節の数、ならびに紅斑および腫脹の程度に基づいて、0〜4のスケールで肘もしくは膝に対して遠位の四肢の関節病変を等級づけした。関節炎スコアを、各動物について四肢全てのスコアの合計として計算した。CCR6野生型動物は関節炎を発症した一方で、CCR6−/−動物は、該疾患に対して強い抵抗性を示した(図1)。興味深いことに、CCR6+/−動物はまた、あるレベルの抵抗性を示した。このことは、CCL20機能の完全な排除が、関節炎表現型を打ち消すのに必要とされないことを示す。
さらに、本発明者らは、CD3陽性T細胞もしくはF4/80陽性マクロファージの存在について、マウスの後足を免疫組織化学的に分析した。43日目に、マウスを捕獲し、彼らの後足をホルマリン中で固定した。次いで、上記足を切片にし、スライド上に置いた。上記足のサンプルの脱石灰化の後に、そのスライドを、抗CD3抗体(#N 1580, DAKO)および抗F4/80抗体(Clone CI:A3−1, AbD Serotec)で免疫組織化学的に染色した。染色の強度は、Aperio機器(Aperio Technologies)で上記サンプルをスキャンすることによって、2人の独立した観察者によってスコア付けされた。上記スコア付けスケールは、以下のとおりであった:0,正常; 1,足全体にわたって軽度の染色もしくは1本の指において強い染色; 2,複数の指に中程度の染色; 3,複数の指において強い染色もしくは全体にわたって中程度; 4,全ての指および足全体にわたって強い染色。上記CIA誘発性病変に浸潤しているT細胞数(図2)およびマクロファージ数(図3)は、CCR6+/−マウスおよびCCR6−/−マウスの両方において強く低下した。
本発明者らはまた、ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)誘発性アレルギー性接触性皮膚炎マウスモデルにおいてCCR6をノックアウトすることの効果を研究した。各6匹のマウスの2つの群(一方の群のマウスは、CCR6について野生型であり、一方の群は、CCR6欠損性である)を、2連続日(0日目および1日目)にわたって剃毛した腹部に25μlの0.4% DNFB溶液(4:1 アセトン:オリーブ油中)を塗布することによって感作させた。5日目に、マウスに、20μlの0.1% DNFB(4:1 アセトン:オリーブ油中)を一方の耳の片側に塗布することによって、再チャレンジした。浮腫のインジケーターとして、耳の厚みを、DNFBチャレンジ前および5日目に最後のチャレンジをして24時間後に、厚みゲージ(thickness gauge)を使用することによって測定した。CCR6欠損マウスは、DNFBでの処置後に、ほとんど耳の厚みの増大を示さなかった。このことにより、DNFB誘発性接触性過敏に対する抵抗性が示された(図4)。
これらデータは、自己免疫/炎症性障害におけるCCR6およびCCL20の役割を裏付ける。
(実施例2:ハムスター抗マウスCCL20 2F5−5 MAbによるCCL20誘導性走化性の阻害)
潜在的治療標的としてのCCL20の役割をさらに調べるために、本発明者らは、ハムスター抗マウスCCL20抗体(2F5−5)を使用して実験を行った。本発明者らは、最初に、上記2F5−5 MAbが、マウス、ヒト、およびアカゲザルのCCL20に結合する能力を特徴付けた。各々の種の可溶性CCL20分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)抗原を、以下のとおりに調製した。ヒト、カニクイザル、アカゲザル、ラットおよびマウスのCCL20をコードするcDNAを増幅し、pcDNA3.1 (+) dSalI SEAPベクターにサブクローニングした。上記ベクターは、SEAP cDNAを含み、そのSalI部位が欠失している(pcDNA 3.1 (+)はInvitrogenから購入; SEAP cDNAは、pSEAP−Enhancerベクター(Clontech)に由来)。上記発現ベクターを、ヒト胚性腎細胞系HEK293EBNA(HEK293E, Invitrogen)へとトランスフェクトした。上記HEK293E細胞を、トランスフェクション前日に、10% ウシ胎仔血清を補充したDMEM(Invitrogen)を用いて播種した。トランスフェクションの当日に、培養培地を、OPTI−MEM II無血清培地(Invitrogen)で置き換えた。上記発現ベクターを、製造業者のプロトコルに従って、TransIT LT1(TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan)を使用してトランスフェクトした。5% COおよび37℃で3日間インキュベートした後、培養上清を採取した。各培養物中のCCL20−SEAPの濃度を、Great EscAPc SEAP Chemiluminescence Kit 2.0(Clontech)を使用することによって測定した。
次いで、本発明者らは、表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)結合研究を行って、マウス、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20−SEAP抗原への2F5−5 MAbの結合性を測定した。抗SEAP(モノクローナル抗マウス胎盤アルカリホスファターゼ,Thermo Scientific, Cat # MAI−19354, Lot # KL12748M)を、標準的なNHS/EDCアミンカップリング手順を使用して、CM5センサーチップ(GE Healthcare)上に固定した。SEAPタグ化マウスCCL20(上清中100nM, ID735, Lot # 091130)を、0.005 % Tween−20を含むTBS−Pで5nMへと希釈し、上記CM5センサーチップ上に捕捉した。TBS−P中のハムスター抗マウスCCL20(2F5−5, Lot # 060215, 2mg/ml)の0.2nM〜80nM 希釈物を、流速30μl/分で上記センサーチップの上に注入した。ハムスター抗マウスCCL20とマウスCCL20との会合および解離を、それぞれ、4分間および16分間にわたってモニターした。上記チップ表面を、10mM グリシン(pH2.25)を使用して注入の間に再生した。捕捉されたマウスCCL20なしの参照セルへのハムスター抗マウスCCL20注入、および捕捉されたマウスCCL20上へのTBS−Pの注入を差し引きすることによって、センサーグラムを二重参照した(double referenced)。上記センサーグラムを、BIA評価ソフトウェア(GE Healthcare, バージョン3.2)において1:1 ラングミュア結合モデルを使用して分析した。このアッセイにおいて、2F5−5 MAbは、マウスCCL20に32pMの親和性で結合するが、ヒト、アカゲザル、もしくはカニクイザルのCCL20には結合しない(表1)。
CCL20機能に対する2F5−5 MAbの効果を試験するために、本発明者らは、インビトロ化学走性アッセイを使用して、マウスCCL20に対するその中和活性を評価した。CCR6形質導入したB300.19細胞および組換えマウスCCL20(1nM)を、トランスウェル培養プレートに添加した。4時間後、下側のチャンバに移動した細胞を、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって計数した。2F5−5 MAbは、0.04μg/ml(0.27nM)の推定IC50値を有して、1μg/mlで化学走性を完全に阻害した(図5)。対照的に、コントロールハムスター抗体(10μg/ml)は、化学走性を阻害しなかった(100%コントロール;データは示さず)。
(実施例3:マウス抗CCL20 MAbのヒト化)
ヒトCCL20に対するモノクローナル抗体を得るために、本発明者らは、マウス抗ヒトCCL20抗体の一団を生成した。フロイント完全アジュバント(Mitsubishi−Kagaku Yatron, RM606−1)で乳化した組換えヒトCCL20(R&D, #360−MP−025/CF, 17.5μg/匹)を、マウスの足蹠へと皮下注射した。次いで、2回の連続注射(two consequtive injections)を、3日ごとに施した。最後の免疫の3日後に、上記動物を屠殺し、鼠径リンパ節細胞を、P3U1骨髄腫細胞と、2:1〜10:1比で、50% ポリエチレングリコールの存在下、融合した。次いで、上記細胞を、96ウェルプラスチックプレート中で培養した。
サンドイッチELISAを、一次スクリーニングに使用した。96ウェルプレートを、ポリクローナル抗ヒトIgG抗体(Jackson, #709−005−149, PBS(−)中2μg/ml)で被覆した。4℃で一晩インキュベートした後、上記ウェルを、1×Block−Ace(Dainippon Sumitomo Pharma, UK−B80)で、1時間にわたって室温でブロッキングした。次いで、上記ウェルを、0.02% Tween 20/PBS(−)で洗浄し、その後、0.02% Tween 20/PBS(−)中の1nM ヒトCCL20−hIgG Fcキメラタンパク質を、上記ウェルに添加した(50μl/ウェル)。室温で1時間インキュベートした後、上記のように、さらに3回洗浄した。次いで、各ハイブリドーマ由来の培養上清を、0.02% Tween 20/PBS(−)中の20% FBSおよび200μg/ml ヒトIgG(Mitsubishi Welpharma)で2倍希釈し、上記ウェルに添加し、1時間にわたって室温でインキュベートした。さらに3回洗浄した後、上記ウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗マウスIgG抗体(Jackson, #715−035−150, 0.02% Tween 20/PBS(−)で5000倍希釈)とともに1時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、上記ウェルを3回洗浄し、TMBZ(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)溶液中で15〜30分間にわたってインキュベートした。次いで、等容積の2M HSOを添加して、反応を停止させ、その光学密度を、450nmにおいてARVO(PerkinElmer)で読み取った。上記サンドイッチELISAから、24の陽性ウェルが同定された。
本発明者らは、次いで、二次スクリーニングとして化学走性アッセイを行った。上記化学走性アッセイを、トランスウェル培養プレート(Multiscreen 孔 5μm, Millipore, #MAMIC 5S10)において行った。第1に、化学走性緩衝液(RPMI1640(lnvitrogen)中の0.5% BSA、0.5% FBS、20mM HEPES(pH7.4)、50μΜ 2−メルカプトエタノール)中の50μl/ウェルの300ng/ml 組換えヒトCCL20(R&D, #360−MP−025/CF)を、上記ハイブリドーマ由来の100μl/ウェルの培養上清と、上記プレートの下側ウェル中で、室温で30分間にわたって(100ng/mlの最終CCL20濃度について)プレインキュベートした。30分後、ヒトCCR6(配列番号104)(2×10細胞/75μl)でトランスフェクトしたB300.19細胞を、上側のウェルに加え、5% COインキュベーター中、37℃で4時間にわたってインキュベートした。上記インキュベーション後、上記下側のウェルから150μlを採取し、50μlの4% PFA/PBS(−)で固定した。30μlの各サンプルを、FACSCantoII細胞分析器(BD Biosciences)に入れて、移動した細胞を計数した。中和活性を、4個のウェルに見いだした。
次いで、本発明者らは、標準的な限界希釈法を使用して、上記4個の陽性ウェルからハイブリドーマクローンを得た。本発明者らは、上記インビトロ化学走性アッセイを使用して、各クローン由来の上清の中和活性を確認した。これらクローン(抗体36F7C10(表2)、42G5B10(表3)、および40−1C10B9(表4))によって生成されるマウス抗ヒトCCL20モノクローナル抗体のうちの3種は、ヒトCCL20に対する中和活性を示した。
上記36F7C10、42G5B10、および40−1C10B9マウス抗体を、次いで、ヒト化抗体重鎖および軽鎖を生成するために使用した。そのヒト化方法は、Kabat番号付けに従ってKabatおよび/もしくはChothia定義法によって同定される場合、マウス相補性決定領域(CDR)を、上記CDRが由来する元のマウス配列と最良のフレームワークマッチを表すヒト重鎖および軽鎖の生殖細胞系列配列へとグラフト化する工程を包含した(図6A〜C;太字は、上記マウス抗体と上記ヒト生殖細胞系列配列の間で異なる残基を示し;下線および太字は、グラフト化されたマウスCDRを示し;斜体および太字は、対応するマウス抗体残基で置換されたフレームワーク残基を示す;そして下線、斜体および太字は、対応するヒト生殖細胞系列残基で置換されたCDR残基を示す)。フレームワークマッチを、lgBlastデータベースを使用して、Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389−3402 (1997)に記載される方法に従って同定した。代わりのヒト化鎖バージョンを得るために、本発明者らは、2つの方法を使用した: 1)上記CDR残基と相互作用する、フレームワーク内の重要なマウス残基を推定する3Dモデリング技術、および2)標準的CDR配列に直ぐ隣り合うマウス残基を同定するための配列アラインメント。
上記ヒト化配列を発現ベクター中に構築して、抗体生成のために哺乳動物細胞系(例えば、HEK293E細胞(Invitrogen))へとトランスフェクトした。次いで、このプロセスによって得られる抗体を、機能的アッセイおよび物理化学的アッセイにおいて特徴付けした。
(実施例4:ヒト化抗ヒトCCL20Abの中和活性を示すインビトロ化学走性アッセイ)
本発明者らは、CCR6形質導入したB300.19細胞を使用するインビトロ化学走性アッセイを行うことによって、上記ヒトCCL20リガンドを活発に中和するヒト化抗体を同定した。IC50値、IC90値、およびIC95値(図7A〜C)の決定した後、IC95表において低下した値を示す抗体を、有意な中和活性を有するとみなした(図7C)。生成された14種のヒト化重鎖および26種のヒト化軽鎖のうち、本発明者らは、41の組み合わせを試験した。これら組み合わせのうちの8つは、化学走性を有意に中和することを示した。これら8つのヒト化抗体を以下に列挙する:
・36LK3/36HKK3
・36LK3/42HKK1
・36LK3/42HKK2
・36LK3/42HKK3
・36LK3/36HC2
・36LK3/36HC3
・36LC3/36HKK3
・36LC3/36HC2。
ヒト化重鎖であるHC2、HC3、36HKK3、42HKK1、42HKK2、および42HKK3、ならびにヒト化軽鎖であるLC3およびLK3のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、表5〜12に示される。これら重鎖および軽鎖によって利用されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、表13に示される。
上記評価結果に基づいて、本発明者らは、さらなる研究のために、36LK3/36HC2(「HC2/LK3」)および36LC3/36HC2(「HC2/LC3」)を選択した。これら2種の抗体に関して、インビトロ化学走性アッセイを、親マウスクローン36F7C10およびそのキメラ形態(ヒトFc部分を含む)と並行して行った。このアッセイにおいて、本発明者らは、上側の層に播種したB300.19 CCR6+細胞および下側の層に組換えヒトCCL20リガンドを有するトランスウェル培養プレートを使用した。組換えヒトCCL20(10nM 最終, R&D Systems)を、上記ヒト化抗CCL20抗体とともに室温でプレインキュベートした。30分後に、ヒトCCR6形質導入したマウスプレB細胞(B300.19(東京大学のH. Kawasaki博士により提供))を、上記上側の層を加え、化学走性を、37℃で4時間にわたって起こさせた。インキュベーションの最後に、FACSを使用して、移動した細胞を測定した。次いで、HC2/LK3およびHC2/LC3についての50%阻害濃度、90%阻害濃度および95%阻害濃度(それぞれ、IC50、IC90、およびIC95)を計算した(表14)。親マウスMAbと比較して、ヒト化抗体のいずれも、中和活性を失わなかった。IC50値は、約1nMと計算された。
上記HC2/LK3抗体での代表的試験に関する用量応答を、図8A〜Cに示す。3回の独立した実験を示す。
本発明者らはさらに、CCR6形質導入した人工細胞の代わりに新しく単離されたヒト末梢血単核細胞を用いる、経内皮移動(transendothelial migration)(TEM)アッセイを使用して、HC2/LK3およびHC2/LC3の中和活性を確認した。CD3+CD4+CD45RO+記憶T細胞およびCD19+ B細胞は、CCR6陽性細胞で富化されることが周知であるので、本発明者らは、上記HC2/LK3抗体およびHC2/LC3抗体、ならびに上記親マウス抗体36F7C10の存在下もしくは非存在下で、これら集団の移動した細胞数を測定した。両方のヒト化抗体(図9BおよびC)は、36F7C10のもの(図9A)に匹敵する用量依存性細胞移動阻害を実証し、これにより、それらの中和活性のさらなる証拠が提供された。
(実施例5:ヒトCCL20へのヒト化抗ヒトCCL20 MAbの結合性)
表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)によってヒト化抗体HC2/LC3およびHC2/LK3の結合親和性を測定するために、本発明者らは、一過性にトランスフェクトしたHEK293F細胞の馴化培地から上記抗体を発現および精製し、泳動緩衝液としてHBS−EPを使用して、抗ヒトFcモノクローナル抗体で被覆したCM5チップ上で該抗体を捕捉した。本発明者らは、次いで、ヒトCCL20タンパク質(R&D Systems)のいくつかの希釈物(100、20、4、0.8、0.16、および0nM)を、上記被覆したチップ表面上に注入し、最大20分間にわたって、結合したCCL20の解離を観察した(図10AおよびB)。本発明者らは、1:1 ラングミュアモデルへと結合性のデータを全体的にフィットさせた。その結果を表15に示す。その結果は2回の独立した実験の平均を表す。CCL20とそのレセプターであるCCR6との間の親和性は、初代ヒト細胞において500pMとして報告された(Liao et al., J. Immunol. 168(10):4871− 4880 (2002));これらデータは、CCL20に対する上記HC2/LC3抗体およびHC2/LK3抗体の親和性が、CCL20に対するCCR6の親和性より約10倍高いことを実証する。
(実施例6:ケモカインパラログに対するヒト化抗ヒトCCL20 MAbの交叉反応性)
本発明者らは、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を使用して、ケモカインパネルに対するHC2/LK3およびHC2/LC3の交叉反応性を分析することによって、ヒトCCL20に対するそれらの特異性についてHC2/LK3およびHC2/LC3を試験した(表16)。
96ウェルプレートのウェルを、PBS(−)中の1μg/mlの上記組換えヒトケモカインで被覆した。4℃で一晩インキュベートした後、上記ウェルを、1×Block−Ace(Dainippon Sumitomo Pharma, UK−B80)で、1時間にわたって室温でブロッキングした。0.02% Tween 20/PBS(−)で2回洗浄した後、本発明者らは、50μlの、0.02% Tween 20/PBS(−)中10μg/mlの精製36F7C10、キメラ36F710、HC2/LK3、もしくはHC2/LC3を各ウェルに添加した。上記ウェルを1時間にわたって室温でインキュベートし、実施例3に記載されるように、3回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化抗マウスIgG抗体(36F7C10については、Jackson, #715−035−150)もしくはHRP結合体化抗ヒトIgG Fcγフラグメント(キメラmAbおよびヒト化mAbについては、Jackson, #109−035−098)を、(0.02% Tween 20/PBS(−)で5000倍希釈して)添加し、上記ウェルを、1時間にわたって室温でインキュベートした。5回洗浄した後、TMBZ(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)溶液(Ν,Ν−ジメチルホルムアミド中1%)を上記ウェルに添加し、15〜30分間にわたってインキュベートした。等容積の2M HSO停止溶液を添加することによって反応を停止させ、その光学密度を、450nmにおいてARVO(PerkinElmer)で読み取った。図11Bにおいて実証されるように、HC2/LK3およびHC2/LC3は、上記パネル中の他のケモカインよりヒトCCL20に対して特異的に結合する。
これらアッセイにおいて、HC2/LK3は、プレート結合ヒトCCL20に対して反応性であったが、上記マウス36F7C10抗体もしくはキメラ36F7C10−hFc抗体より効力が低いようであった(図11A)。しかし、上記HC2/LK3は、ELISAアッセイにおいて、Hisタグ(これは、上記溶媒への全てのCCL20部分の曝露を可能にする)を介して固定されたCCL20に対して明確かつ強力な結合性を示した(図11C)。このことは、HC2/LK3に対するCCL20エピトープ(複数可)が、上記第1のアッセイ様式においてプレート表面にCCL20を結合するために使用される手順では、隠されているかもしくはふさがれていることを示し得る。この考えられる人工産物を回避するために、本発明者らは、BiacoreTM分析(ここで遊離CCL20は、センサーチップ上に捕捉されたMAb上に加えられた)を使用した。上記BiacoreTMアッセイにおいて、HC2/LK3およびHC2/LC3は、上記36F7C10−hFcキメラ抗体のものに匹敵する、強力なCCL20結合性を示した(図11D)。さらに、図11Bにおいて観察されたCXCL4に対する小さな反応は、上記BiacoreTMアッセイにおいて無視できるものであることが分かった(図11D)。
Derceper et al., (Nucleic Acids Res. 1 (36):W465−469 (2008))による系統発生分析は、CCL16が、配列においてCCL20に最も近いケモカインであるが、CCL20とCCL16との間の%同一性は、37.5%未満(成熟CCL20ペプチド(SIM− タンパク質配列のためのアラインメントツール(Alignment Tool for protein sequences), Swiss Institute of Bioinformatics))を構成する70アミノ酸のうちわずか56アミノ酸において相同性)であることを示す(図12)。本発明者らは、BiacoreTM分析を使用して、HC2/LK3およびHC2/LC3が、CCL16と交叉反応するかどうかを試験した。モノクローナルマウス抗ヒトFcを、0.2mg/mL BSAを含むHBS−EP緩衝液で流速 25μl/分において、CM5チップの全4つのフローセル上に固定した。その後、0.2mg/ml BSAを含むHBS−EP緩衝液中のキメラ抗体、HC2/LC3抗体、もしくはHC2/LK3抗体の1μg/ml 溶液50μlを、それぞれ、フローセル2、3および4上に注入した。次いで、0.2mg/ml BSAを含むHBS−EP緩衝液中のCCL20もしくはCCL16の100nM 溶液(または緩衝液のみ)150μlを、流速40μl/分で全4つのフローセル上に注入した。20分間にわたって解離を追跡した。フローセル1(抗ヒトFc抗体のみ)を、全フローセルの参照として使用した。
これら条件下で、ヒトCCL20は、類似の強度で、上記チップに捕捉した上記キメラ抗体(図13A)、HC2/LC3抗体(図13B)、およびHC2/LK3抗体(図13B)に結合した。対照的に、ヒトCCL16が上記チップを通って流動した場合、有意な結合は検出されなかった。このことは、CCL16が、配列においてCCL20に最も近いケモカインであるが、CCL20およびCCL16は、上記ヒト化抗CCL20抗体をCCL16と交叉反応させるために充分な相同性を有さない(上記で考察されるように、<37%)ことを示していた。
これらデータは、HC2/LK3およびHC2/LC3が、他のケモカインよりヒトCCL20に対して特異的であることを示す。
(実施例7:ヒト化抗ヒトCCL20 MAbの種オルソログに対する交叉反応性)
本発明者らは、次いで、他の種に由来するCCL20への上記HC2/LC3 MAbおよびHC2/LK3 MAbの交叉反応性を決定した。CCL20オルソログ(SIM −タンパク質配列のためのアラインメントツール(Swiss Institute of Bioinformatics)を使用して得た)の中でのアミノ酸配列アラインメントは、カニクイザル/アカゲザルとヒトCCL20との間の同一性が86%である一方で、マウスとヒトCCL20との間の相同性が64%である(図14;ヒトCCL20−配列番号85;アカゲザルCCL20−配列番号86;カニクイザルCCL20−配列番号87;部分マウスCCL20−配列番号88(マウスCCL20アミノ酸配列全体は、配列番号102において見いだされ得る;残基1〜27は、シグナル配列を構成する;表18を参照のこと))を示す。
上記キメラ抗体およびヒト化抗体が、マウス、カニクイザル、もしくはアカゲザルのCCL20オルソログに結合し得るかどうかを試験するために、本発明者らは、図15に図示されるような、ELISAアッセイを使用した。組換え分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)−ケモカイン融合タンパク質を、実施例2に記載されるように工学的に作製し、試験される上記CCL20オルソログの全てについて、発現させ、精製した。Nunc MaxiSorb平底ブラックプレートを、50mM 炭酸水素ナトリウム(pH9.4)中の1μg/ml マウス抗胎盤アルカリホスファターゼ抗体(Pierce, cat# MA1−19354)で、一晩4℃で被覆した。次いで、プレートを、Tween−20を含む1×リン酸緩衝食塩水(PBST)(5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む)を使用して、2時間にわたって室温でブロッキングした。20nM SEAP−CCL20融合タンパク質から、Opti−MEM培地(Invitrogen)で5倍希釈系列を作製した。キメラ抗体およびヒト化抗体(HC2/LC3およびHC2/LK3)を、1×PBST(5% BSAを含む)中1μg/mlへと希釈し、上記プレートに添加し、1時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、上記プレートを、1×PBST(5% BSAをふくむ)で3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG+IgM(H+L) HRP結合体(Jackson ImmunoResearch cat# 109−035−127)を、80ng/mlへと希釈し、上記プレートに添加し、1時間にわたって室温でインキュベートした。QuantaBlu蛍光HRP基質(Pierce cat# 15169)を添加し、Molecular Devices MS(励起325nm/発光420nm)プレートリーダーにおいて蛍光を測定することによって、結合した抗体を検出した。
上記ハムスター抗マウスCCL20抗体 2F5−5 MAbが、64pMという50% 有効用量(EC50)でマウスCCL20を結合した(データは示さず)一方で、上記キメラ抗ヒトCCL20抗体もヒト化抗ヒトCCL20抗体も、上記の条件下では、マウスCCL20にもラットCCL20にも検出可能に結合しなかった。対照的に、上記キメラ抗体およびヒト化抗体はともに、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合した(図16A〜C、17AおよびB)。ヒトおよびアカゲザルのCCL20に対するEC50は、類似しているようである(例えば、HC2/LC3については、62pMおよび101pM)一方で、カニクイザルCCL20に対するEC50は、HC2/LC3については340pMであり、ヒトCCL20に対して5.4倍の差異であった。類似の結果が、HC2/LK3について認められた。このことは、ヒトもしくはアカゲザルのCCL20に対する結合量と同じ結合量をカニクイザルCCL20に対して達成するために、遙かに高い濃度の抗体が必要とされたことを示唆する。
(実施例8:ヒト化抗CCL20 MAbのCCL20種オルソログに対する交叉反応性のための表面プラズモン共鳴アッセイ)
本発明者らはまた、表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)分析を使用して、HC2/LC3およびHC2/LK3が、マウス、カニクイザル、もしくはアカゲザルのCCL20オルソログに結合し得るかどうかを試験した。モノクローナルマウス抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼを、流速25μl/分において、CM5チップの全4つのフローセル上に固定した。HBS−EP緩衝液中のヒト、アカゲザル、カニクイザル、もしくはマウスのCCL20−SEAPの2nM 溶液25μlを、フローセル2、3、もしくは4上に注入した。抗体結合のために、HBS−EP緩衝液中のHC2/LC3 MAb、HC2/LK3 MAb、もしくは2F5−5 MAbの0〜80nM 希釈物(もしくは緩衝液のみ)240μlを、流速50μl/分において、全4つのフローセル上に注入した。解離を45分間にわたって追跡した。フローセル1(抗SEAPのみ)を、全4つのフローセルの参照として使用した。上記フローセルの再生を、10mM グリシン(pH2.25)で行った。上記チップの捕捉能に対する再生効果に起因して、抗体注入を、低濃度から高濃度まで逐次的に行った。データ適合を、1:1 ラングミュアモデルを使用して行った。
上記の条件下では、ハムスター抗マウスCCL20抗体 2F5−5は、4.9pMという(二価)KでマウスCCL20を結合したが、ヒト、アカゲザル、もしくはカニクイザルのCCL20には有意に結合しなかった。対照的には、キメラ抗体、HC2/LC3抗体、およびHC2/LK3抗体は、ヒト、アカゲザル、およびカニクイザルのCCL20に効率的に結合した(表17)。
(表15において示されるデータについて使用される1価様式に対して)使用される上記アッセイ様式の二価の(より高い親和性)性質に起因して、測定した見かけの親和性値は、以前に実施例5において検出したものよりこのアッセイにおいて高かった(例えば、本アッセイにおいては、HC2/LC3について4.7pM 対 表3において44pM)。アカゲザルおよびカニクイザルのCCL20に対するK値は、ヒトCCL20に対するものより一般に高かった(3倍)。このことは、上記抗体が、ヒトCCL20に対してより特異的に結合することを示していた。しかし、実施例7からのELISAデータとは対照的に、本発明者らは、アカゲザルおよびカニクイザルのCCL20に対する結合親和性の間に有意差を認めなかった。
(実施例9:マウス抗ヒトCCL20クローン 36F7C10に対するエピトープマッピング)
マウス抗ヒトCCL20モノクローナル抗体 36F7C10が結合するヒトCCL20エピトープ(複数可)を決定するために、本発明者らは、水素/重水素交換法(ここで抗体結合は、上記エピトープの重水素化を防御し、そのため、上記エピトープの重水素化から保護する)を使用した。図18Aに示されるように、本発明者らは、ヒトCCL20のN末端付近の、残基7〜9、10〜19、および20〜22(おそらく、エピトープ(複数可)を表す)に非常に強い摂動(perturbation)を認めた。辺縁の防御はまた、C末端付近の残基39〜55、56〜67、および61〜70で認められた。これらセグメントは、上記エピトープにとって周辺に存在し得るか、またはそれらの呼吸運動(breathing motion)は、上記エピトープに結合体化され得る。各示されるアミノ酸の重水素化レベルは、4つの時点で示される:上から下に、150s、500s、1s、500s、および5,000s。
36F7C10のエピトープとして同定された領域は、CCL20のN末端領域およびループ領域内に含まれる。これらは、CCR6結合およびシグナル伝達に重要であることが公知である(Malik et al., Acta Cryst F62:631−634 (2006))(図18B)。36F7C10に由来するキメラ抗体およびヒト化抗体、特に、36F7C10と同じ重鎖および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列を有する抗体、または36F7C10と類似の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列を有する抗体(例えば、36F7C10のCDRと比較して、3個未満、2個未満、もしくは1個未満のアミノ酸置換を有する抗体)は、同じエピトープに結合すると予測される。従って、このエピトープの同定は、上記36F7C10 MAb、ならびにこれに由来するキメラ抗体およびヒト化抗体の、CCL20活性を中和する能力を説明し得る。
(実施例10:ヒト化抗ヒトCCL20抗体についてのインビボ走化性アッセイ)
HC2/LC3およびHC2/LK3が、CCL20誘導性走化性をインビボで阻害し得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ヒトCCL20が、マウスCCR6(配列番号106)と相互作用して、マウスT細胞の化学走性を誘導し得るという事実を利用した(図19)。本発明者らは、マウスT細胞が皮内注射したヒトCCL20に向かって移動することを測定するハイブリッドインビボシステムを使用した(図20)。
組換えヒトCCL20(10ng/匹)およびビヒクルを、それぞれ、試験マウスの背部の右側および左側の剃毛した皮膚へと皮内注射した(n=3の群)。次いで、カルセイン−AM標識マウス脾性T細胞(5×10細胞/マウス)を、尾静脈内へと静脈内に移入し、図20に示される投与量で、示された抗体を尾静脈へと同時に注射した。1時間後、蛍光陽性細胞を、皮内注射の部位において立体顕微鏡を使用して計数した。
HC2/LK3およびHC2/LC3はともに、親マウス抗体36F7C10およびそのキメラ形態のレベルに匹敵するレベルで、上記CCL20注射部位への細胞移動を有意に阻害した。T細胞の化学走性は、炎症カスケードにおいて重要なステップであるので、この移動の防止は、自己免疫状態および炎症状態を処置する上で臨床的意味を有する。
(実施例11:II型コラーゲン誘発性関節炎に対する2F5−5 MAbの効果)
治療適応のための抗CCL20抗体の使用をさらに評価するために、本発明者らは、ハムスター抗マウス 2F5−5 MAbを使用して、マウスにおけるインビボ研究をさらに行った。第1に、本発明者らは、CIAマウス(関節リウマチの動物モデル)において、CCL20媒介性化学走性を中和する2F5−5の能力を評価した。CIAを、実施例1に本質的に記載されるように誘発した。関節炎の発症後(関節炎スコア1〜3)、マウスを無作為化し、2F5−5 MAbもしくはコントロールIgG抗体のいずれか500μg/マウスを用いて処置した。両方の場合において、上記抗体を、1日おきに静脈内投与した。上記コントロールIgGと比較して、2F5−5 MAbは、関節炎症状のさらなる発達を阻害した(図21、22)。
本発明者らはまた、X線スコア付けを使用して、骨病変(これは、関節リウマチにおいて頻繁に認められる)に対する2F5−5 MAbの効果を決定した。スコア付けを、Inoue et al., Agents Actions 39: 187−194 (1993)に記載されるように行った。簡潔には、CIAマウスの各足を、X線画像に従って、骨粗鬆症(O)の重症度、骨侵食(E)、および新たな骨形成(N)に基づいて0〜3のスケールで等級付けした。使用したスケールは、以下であった: 0,変化なし; 1,僅かな変化; 2,中程度の変化;および3,重度の変化。各因子のスコアを加えて、骨病変についての累積X線スコアを明らかにした。2F5−5 MAbで処置したマウスは、コントロールIgGで処置したマウスと比較して、39日目に、明らかに低い重症度のX線スコアを示した(図23、24)。
本発明者らは、ELISAを使用していくつかのバイオマーカーを分析することによって、骨病変に対する2F5−5 MAb処置の効果を確認した。500μgの2F5−5抗体もしくはコントロールIgG抗体で上記のように、CIAマウスを免疫し、処置した。血漿サンプルを、2回目の免疫後の11日目および12日目にマウスから調製した。軟骨破壊のマーカーである、血清軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)を、Animal COMP ELISA Enzymeimmunoassayキット(AnaMar Medical)を使用して、動物の血漿サンプルを、1:20希釈したことを除いて、製造業者の指示(本明細書に参考として援用される)に従って定量化した。COMPは、プレートに予め被覆されているので、これは、競合ELISAである。それによって、上記COMP標準もしくはCOMP含有血漿の添加は、OD450の低下を生じる(図25A)。サンプルアッセイからの生データは、図25Bおよび25Cに示される。CIAマウスにおけるCOMP血清レベルは、2F5−5 MAbでの処置によって、ほぼ正常レベルまで低下した(図26)。このことから、2F5−5の、軟骨破壊を阻害する能力が実証される。
破骨細胞の形成および分化は、RA関連骨粗鬆症および侵食の原因であるので、本発明者らは、関節炎治療のインジケーターとして、破骨細胞誘導分子である、核因子κBリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)、および破骨細胞マーカー(例えば、核因子κBのレセプターアクチベーター(RANK)、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)、およびカテプシンK)のレベルを測定した。本発明者らは、ホモジナイズしたマウス足から単離した総RNAを使用して、定量的PCRによって、これらマーカーのmRNA発現レベルを評価した。上記足を、最初に、Trizol試薬を含む組織溶解緩衝液(Invitrogen, CA, USA)に浸漬した後に、ホモジナイザーでホモジナイズした。クロロホルムを添加した後、サンプルを、14,000rpmにおいて15分間にわたって、4℃で遠心分離して、上記溶液を、水相と有機相とに分離した。上記水相を取り出し、これにイソプロパノールを添加し、続いて、14,000rpmにおいて15分間にわたって、4℃で遠心分離して、RNAペレットを得た。RNAseを含まない水で溶解したRNAペレットを、RNAeasyミニキット(QIAGEN,Valencia, CA, USA)に使用して、上記RNAを単離し、DNAseで処理して、いかなるDNAをも除去した。相補DNA(cDNA)を、上記RNAから、RT反応キット(RNA PCR Kit, TAKARA Bio, Inc. Shiga, Japan)で、製造業者のプロトコルに従って生成した。各cDNA種に対する定量的リアルタイムPCRを行い、ハウスキーピング遺伝子であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)のレベルに対して比較した。以下の順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットを、PCR反応において使用した:
全てのプライマーを、ウェブベースのソフトウェアPrimer 3(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA)を使用して設計して、RNAの非特異的増幅を回避した。cDNAテンプレート、プライマー、ウラシルDNAグリコシラーゼ(Invitrogen, CA, USA)、およびQuantiTcct SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN, Valencia, CA, USA)を含む反応混合物を、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)の増幅反応に使用した。発現レベルを、ABI PRISM 7700 Sequence Detector Softwareによって自動的に定量化した。
2F5−5 MAb処置の後、mRNAレベルは、関節組織における全てのマーカーについて抑制された(図27AおよびB;ハウスキーピング遺伝子HPRTと比較しての、発現レベルの倍数変化を示す)。このことから、2F5−5がインビボで骨病変を阻害するというさらなる証拠が提供された。
(実施例12:グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ誘発性関節炎に対する2F5−5 MAbの効果)
本発明者らは、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ(G6P1)誘発性関節炎を有するマウス(RAの別のマウスモデル)における2F5−5 MAb処置の抗関節炎効果を試験した。フロイント完全アジュバント中で乳化してDBA/1マウスの尾の基部に注射した、組換えGST−G6PI(300μg/マウス)による皮内感作によって、関節炎を誘発した。上記G6P1免疫の6日後かつ関節腫張の発生の直前に、マウスを無作為化し、アイソタイプマッチ抗体もしくは2F5−5 MAbのいずれか500μg/マウスを用いて処置した。各マウスの足における関節炎症状の重症度を、先の実施例1において記載されるように等級付けした。2F5−5 MAbで処置したマウスは、アイソタイプマッチ抗体で処置したマウスより有意に低い関節炎スコアを示した。このことは、2F5−5が、上記コントロールと比較して、関節炎の発達を強力に抑制することを示していた(図28)。
これらデータは、インビボ関節炎モデルにおける抗CCL20抗体処置の効力を実証し、抗CCL20抗体の使用が、関節リウマチの処置において有益であり得ることを示唆する。
(実施例13:オキサゾロン誘発性 アトピー性皮膚炎に対する2F5−5 MAbの効果)
本発明者らは、次いで、皮膚炎のマウスモデルにおいて2F5−5 MAb処置の効果を評価した。1つのモデルにおいて、オキサゾロンを使用して、上記疾患に罹りやすいマウス(NC/Nga系統)においてアトピー性皮膚炎を誘発した。上記マウスの腹部皮膚を剃毛し、0日目、5日目、および8日目に、オキサゾロンに曝した。13日目に、皮膚炎の徴候(スコア2)を示すマウスを選択し、オキサゾロンで再び免疫した。その後、マウスを、2F5−5 MAbもしくはアイソタイプマッチコントロールIgG抗体(500μg/マウス,1日おきに静脈内投与した)いずれかでの処置のために6匹の群に無作為化した。本発明者らは、以下のように盲検試験において皮膚スコアをアッセイした:各皮膚炎症状(例えば、乾燥、鱗屑、紅斑、滲出/痂皮形成、および擦過傷)を、0〜3(0=なし、1=軽度、2=中程度、3=重度)のスケールでスコア付けした;これらスコアを、次いで、累積皮膚炎スコアのために加えた(Leung et al., J. Allergy Clin. Immunol. 85(5):927−933 (1990)に記載されるとおり)。本発明者らは、13日目から18日目までの曲線下面積(「AUC」)を定量化することによって、上記2群の間の疾患抑制の程度を比較した。この皮膚炎モデルにおいて、2F5−5 MAbは、コントロールIgGと比較して、疾患進行の統計的に有意な(p<0.05)抑制を誘導した(図29)。
(実施例14:DNFB誘発性アレルギー性接触性皮膚炎に対する2F5−5 MAbの効果)
本発明者らは、ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)誘発性アレルギー性接触性皮膚炎(皮膚炎の第2のマウスモデル)において、2F5−5 MAb処置の効果を試験した。マウスを6匹の群に分け、25μlのDNFB溶液(アセトン:オリーブオイルの4:1溶液中の0.4% DNFB)を、2連続日(0日目および1日目)にわたって剃毛した腹部に塗布することによって、感作した。1つの群を、2F5−5 MAbで処置した一方で、他方の群を、アイソタイプマッチコントロール抗体で処置した(500μg/マウスに、0日目、2日目および5日目に静脈内で)。5日目に、上記マウスを、20μlの0.2% DNFB溶液(4:1 アセトン:オリーブオイル中)を、一方の耳の片側に塗布することによって、再チャレンジした。耳の厚みを、厚みゲージを使用して、6日目に浮腫のインジケーターとして測定した。2F5−5 MAbでの処置は、耳の厚みを低下させた。このことから、皮膚炎発達の成功裏な防止が示された(図30)。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書に参考として援用される。前述の発明は、幾分詳細に、理解を明瞭にする目的で図示および例示によって記載されてきたものの、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨もしくは範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることは、本発明の教示に鑑みれば、当業者には容易に明らかである。

Claims (22)

  1. モノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分であって、該抗体もしくはその抗原結合部分は、重鎖相補性決定領域1(CDR1)、重鎖相補性決定領域2(CDR2)、および重鎖相補性決定領域3(CDR3)を含む重鎖可変ドメイン、ならびに、軽鎖相補性決定領域1(CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR2)、および軽鎖相補性決定領域3(CDR3)を含む軽鎖可変ドメインを含み、重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに、軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3は、以下:
    a)それぞれ、配列番号60、64、67、70、73、および75;
    b)それぞれ、配列番号60、64、67、71、73、および75
    それぞれ、配列番号77、79、67、70、73、および75;ならびに
    それぞれ、配列番号77、79、67、71、73、および75
    らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
  2. 前記抗体が、以下:
    )配列番号9アミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン;および
    )配列番号15もしくは16のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン
    のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分。
  3. 前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインは、それぞれ、以下:
    a)配列番号9および15;ならびに
    b)配列番号9および16
    らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の抗体もしくは抗原結合部分。
  4. a)前記重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか;または
    b)前記重鎖が、シグナル配列を含まない配列番号1および配列番号108からなる群より選択されるアミノ酸配列において、C末端リジンを欠いているアミノ酸配列を含むか;または
    c)前記軽鎖が、シグナル配列を含まない配列番号7および8、ならびに配列番号110および112からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
    請求項1に記載のモノクローナル抗ヒトCCL20抗体。
  5. 前記重鎖および前記軽鎖は、それぞれ、以下:
    a)配列番号1および7;
    b)配列番号1および8
    )配列番号108および110;ならびに
    )配列番号108および112
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    ここで該アミノ酸配列は、シグナル配列(存在する場合)を欠いており、ここで、配列番号1、必要に応じて、C末端リジンを欠いている、請求項4に記載の抗体。
  6. ヒト化抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
  7. 前記抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4の定常ドメインを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
  8. 単鎖抗体、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd、単鎖Fv分子(scFv)、二重特異性単鎖Fvダイマー、ダイアボディー、ドメイン欠失抗体もしくは単一ドメイン抗体(dAb)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗原結合部分。
  9. 以下:
    a)ヒトCCL16に結合しない;
    b)カニクイザルもしくはアカゲザルのCCL20には結合するが、マウスのCCL20にもラットのCCL20にも結合しない;
    c)一価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、70pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
    d)二価表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、12pM以下の、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
    e)ヒトCCR6に対する結合親和性より高い、ヒトCCL20に対する結合親和性を有する;
    f)ヒトCX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL4,CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3,CCL4、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL27、CCL28、もしくはXCL1を上回る、ヒトCCL20に対する選択性を有する;
    g)1.7nM以下のIC50で、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
    h)インビボで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
    i)インビトロで、CCR6+細胞のヒトCCL20誘導性化学走性を低下させる;
    j)被験体において、関節炎症状の進行を減じる;
    k)被験体において、骨粗鬆症、骨侵食、もしくは新たな骨形成を減じる;
    l)被験体において、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルを低下させる;
    m)被験体において、RANKL、RANK、TRAP、もしくはカテプシンKのmRNAレベルを低下させる;
    n)被験体において、アトピー性皮膚炎の進行を減じる;および
    o)被験体において、アレルギー性接触性皮膚炎の進行を減じる、
    からなる群より選択される、1種以上の特性を有する、請求項1〜のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
  10. 以下:
    a)配列番号84の残基7〜9;
    b)配列番号84の残基10〜19;および
    c)配列番号84の残基20〜22、
    からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列を含むヒトCCL20のエピトープに結合する、請求項1〜9のいずれか1項に記載のモノクローナル抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分。
  11. 前記エピトープは、以下:
    a)配列番号84の残基39〜55;
    b)配列番号84の残基56〜67;および
    c)配列番号84の残基61〜70
    からなる群より選択される1種以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
  12. 前記エピトープは、配列番号84の残基7〜9、10〜19、20〜22、39〜55、56〜67、および61〜70を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分。
  13. a)請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分;
    b)請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の、軽鎖もしくはその抗原結合部分;または
    c)請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分および軽鎖もしくはその抗原結合部分
    をコードする、単離された核酸分子。
  14. 請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方を含む、医薬として使用するための組成物。
  15. 請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の、(1)重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、(2)軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸配列、または(3)その両方を含む、組換えベクター。
  16. 請求項1もしくは1に記載の抗体もしくは部分の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第1の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第1の核酸配列と、該抗体もしくは部分の軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする第2の核酸配列であって、発現制御エレメントに作動可能に連結された第2の核酸配列とを含む、宿主細胞。
  17. 抗ヒトCCL20抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法であって、請求項1に記載の宿主細胞を、該抗体もしくは部分の発現に適した条件下で維持する工程を包含する、方法。
  18. 請求項1もしくは1に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分、および薬学的に受容可能なビヒクルもしくはキャリアを含む、組成物。
  19. 医薬として使用するための、請求項1〜8、1もしくは1のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分を含む組成物または請求項18に記載の組成物。
  20. 状態を処置するための、請求項1〜8、1もしくは1のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分を含む組成物または請求項18に記載の組成物であって、該状態は、以下:
    CCR6関連状態、自己免疫状態もしくは炎症状態、がん、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、グレーブス病、白斑、甲状線機能亢進症、慢性肝炎、子宮頸部のヒトパピローマウイルス感染、菌状息肉腫、骨粗鬆症、歯周病、肘もしくは膝に対して遠位の四肢の関節病変、紅斑、腫脹、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルの増大、核因子κΒリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)のmRNAレベルの増大、核因子κΒのレセプターアクチベーター(RANK)のmRNAレベルの増大、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)のmRNAレベルの増大、カテプシンKのmRNAレベルの増大、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性接触性皮膚炎
    からなる群より選択される、組成物。
  21. 前記がんは、B細胞悪性腫瘍、乳腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、膵腺癌、もしくは甲状腺乳頭状癌である、請求項2に記載の組成物。
  22. 請求項1〜8、1もしくは1のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分を含む組成物または請求項18に記載の組成物であって、該組成物は、以下:
    a)被験体においてCCR6+細胞のCCL20誘導性化学走性を低下させること;
    b)インビトロでCCR6+細胞のCCL20誘導性化学走性を低下させること;
    c)関節炎患者において軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(COMP)血清レベルを低下させること;
    d)関節炎患者の関節組織における核因子κΒリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)のmRNAレベルを低下させること;
    e)関節炎患者の関節組織における核因子κΒのレセプターアクチベーター(RANK)のmRNAレベルを低下させること;
    f)関節炎患者の関節組織における酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)のmRNAレベルを低下させること;および
    g)関節炎患者の関節組織におけるカテプシンKのmRNAレベルを低下させること;からなる群より選択される目的のためのものである、組成物。
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