KR20100020946A - 신규한 화합물 - Google Patents

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조너선 에이치. 엘리스
폴커 게르마쉐브스키
알렉시스 폴 고딜롯
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앨런 피. 루이스
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Abstract

본 발명은 다중 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합한다 (그와 교차 반응한다).
다중 특이성, 항체, 오중 특이성, 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, ENA-78

Description

신규한 화합물{NOVEL COMPOUNDS}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2007년 4월 17일 출원된 미국 가출원 60/912229와 2008년 4월 11일 출원된 61/044132을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 다중 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합한다 (그와 교차 반응한다). 본 발명은 또한 상기 항체를 사용하여, 상승되거나 불균형한 수준의 하나 이상의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
공개된 데이타 및 보고서에서는 CXCL 케모킨의 ELRCXC 서브패밀리의 멤버가 많은 질병에서 상승되는 것을 나타낸다. 총 16개의 CXCL 패밀리 멤버가 존재한다. CXCL1-3, 5 및 8 (또한 Gro-α, -β, -γ로서도 알려짐) (Haskill, S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990: 87, 7732-7736), ENA-78 ([Wang, D. and Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1023-1027], [Powerm C.A. et al. Gene., 1994: 151, 333-334]) 및 IL-8 ([Iizasa, H. and Matsushima, K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1061-1067], [Matsushima, K. et al, J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893])과 같은 케모킨이 COPD를 포함한 많은 염증성 질병에서 상승-조절되는 것으로 보고되었다 ([Am. J. Respir. Crit Care Med., 163: 349-355, 2001], [Am. J. Respir. Crit Care Med., 168: 968-975, 2003], [Thorax, 57: 590-595, 2002]). 이들 케모킨의 연장되고 상승된 발현이 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상, 또는 자궁내막증과 같은 질병의 발병에 관여될 수 있는 것으로 가정되었다. 상기 CXC 케모킨은 CXCR1 및/또는 CXCR2 수용체를 관여시키고 활성화시킴으로써 호중구 화학주성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이들 케모킨의 억제는 염증 세포가 폐 조직으로 침윤하는 것을 방지하여, 조직 손상을 예방할 수 있다. 본 발명은 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 능력을 갖는 항체, 즉 5중-특이적 항체를 사용함으로써 CXCR1 및 CXCR2 수용체의 활성화를 억제하는 것에 관한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은 하나의 면역글로불린 내에 함유된 다중 특이성을 갖는 항체 (면역글로불린)에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합한다 (그와 교차 반응한다). 본 발명은 또한 상기 항체를 사용하여, 상승되거나 불균형한 수준의 하나 이상의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 대한 다중 특이성을 갖는 (또는 그와 교차 반응하는) 단리된 항체에 관한 것이고; 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 항체를 5중-특이적 (또는 범 (pan)-ELR) 항체로서 정의한다. 항체의 정의는 항원 결합 부분 (또는 단편)이 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 경우에 항체의 항원 결합 부분 (또는 단편)을 포함한다. 본 발명의 5중-특이적 항체는 바람직하게는 뮤린 모노클로날, 키메라, 인간 또는 인간화 항체이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 5중-특이적 항체는 전적으로 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78 항원에만 결합할 필요가 없고, 대신 다른 관련 단백질, 예를 들어 인간 GCP-2에도 결합할 수 있거나, 심지어 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, ENA-78 및 GCP-2의 비-인간 동족체 (orthologue)에도 결합할 수 있고; 즉, 본 발명의 5중-특이적 항체는 최소한으로 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 5중-특이적 항체는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78 각각에 표면 플라즈몬 공명으로 결정할 때 10-7 M 미만, 보다 바람직하게는 10-8 M 미만, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M 미만의 평형 상수 KD 값으로 결합한다. 전형적으로, 표면 플라즈몬 공명 측정은 아래에 설명된 바와 같이 수행한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 5중-특이적 항체를 사용하여 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 및 ENA-78을 중화함으로써 CXCR1 및 CXCR2 수용체 활성화의 억제를 통해 호중구 화학주성을 감소시키는 방법을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 5중-특이적 항체를 투여함으로써 그를 필요로 하는 환자에서 호중구 화학주성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 인간 IL-8 내의 KELRCQCIKTYSKP (서열 54)의 에피토프 내에 결합한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 5중-특이적 항체는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물 (칵테일 (cocktail))을 5개의 다중 항원 펩티 드 (MAP)의 세트 (각각의 MAP 단위는 서열 49-53의 폴리펩티드로부터의 하나의 별개의 서열을 갖는다)와 함께 사용하는 RIMM (Kilpatrick, K.E., et al. Hybridoma. 1997: 16, 381) 타입 프로토콜을 사용하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
LATELRSQSLQTLQG 서열 49
SAKELRSQSIKTYSK 서열 50
LRELRSVSLQTTQG 서열 51
SPGPHSAQTEVIAT 서열 52
ESGPHSANTEIIVK 서열 53
이론에 매이지는 않지만, MAP는 면역처리 프로토콜 내에서 2가지 기능을 수행한다. 먼저, MAP는 숙주 면역계에 대해 공지의 표적 아미노산 서열의 선택적인 다중 제시를 허용한다. 두 번째로, 비제한적으로 라이신과 같은 코어 (core)를 통해 연결된 다중 카피의 서열로 인한 질량 증가가 개별 펩티드의 것에 비해 서열의 면역원성을 증가시킨다 ([Francis, J.P., et al, Immunology, 1991: 73; 249], [Schott, M.E., et al, Cell. Immuno. 1996: 174: 199-209], [Tarn, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988: 85; 5409-5413]).
본 발명을 실시하기 위해 사용된 MAP는 표적 케모킨의 ELRCXC 및 GPHCA 구역과 함께 및 그 주위에서 발견되는 다중 카피의 보존된 표적 서열 (예를 들어 서열 49-53)로 이루어진다. 예시적인 MAP 세트를 도 1에 도시한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 5중-특이적 항체는
a. 마우스에게 완전 프로인트 (Freund) 어쥬번트 (cFA) 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물을 주사하는 단계;
b. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 (iFA) 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물을 주사하는 단계;
c. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 5개의 다중 항원 펩티드 (MAP)의 세트 (각각의 MAP 단위는 서열 49-53의 폴리펩티드로부터 하나의 별개의 서열을 갖는다)를 주사하고;
d. 마우스로부터 B 세포를 단리하는 단계;
e. B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 목적하는 5중-특이적 항체를 분비하는 무한증식 (immortal) 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
f. 하이브리도마의 배양 상층액으로부터 5중-특이적 항체를 단리하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
경우에 따라, 임의로 단계 c와 d 사이에 마우스에게 PBS 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 서열 49-53의 아미노산 서열을 포함하는 MAP의 세트를 주사할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 5중-특이적 항체는
a. 마우스에게 완전 프로인트 어쥬번트 내의 5개의 다중 항원 펩티드 (MAP)의 세트 (각각의 MAP 단위는 서열 49-53의 폴리펩티드로부터 하나의 별개의 서열을 갖는다; 이하에서 MAP 세트로도 칭함)를 주사하는 단계;
b. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 MAP 세트를 주사하는 단계;
c. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 모든 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 MAP 세트를 주사하는 단계;
d. 마우스로부터 B 세포를 단리하는 단계;
e. B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 목적하는 5중-특이적 항체를 분비하는 무한증식 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
f. 하이브리도마의 배양 상층액으로부터 5중-특이적 항체를 단리하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
경우에 따라, 임의로 단계 c와 d 사이에 마우스에게 PBS 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 서열 49-53을 갖는 MAP의 세트를 주사할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 5중-특이적 항체에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 1 및 서열 3의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 5 및 서열 7의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 9의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 구역을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 2 및 서열 4의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 2 및 서열 4의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 6 및 서열 8의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 6 및 서열 8의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 10 및 12의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 10 및 12의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 (i) 아미노산 서열 2, 4, 6, 8, 10 또는 12; 또는 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 가변 구역을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 서열의 보존적 서열 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마 (transfectoma)에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 (i) 서열 13, 14, 15, 16, 17 또는 18; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 15의 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 13, 14 및 15, 및 서열 16, 17 및 18의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 (i) 서열 19, 20, 21, 22, 23 또는 24; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 21의 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 19, 20 및 21, 및 서열 22, 23 및 24의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마에 관한 것 이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 (i) 서열 25, 26, 27, 28, 29 또는 30; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 27의 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 CDR 서열을 포함하거나; 하나 이상의 CDR 서열은 서열 25, 26, 27, 28, 29 및 30에 나열된 서열의 보존적 변형일 수 있다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 25, 26 및 27, 및 서열 28, 29 및 30의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 1, 5 또는 9, 또는 서열 3 또는 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 2, 6 또는 10, 또는 서열 4, 8 또는 12의 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 2, 6 또는 10, 또는 서열 4, 8 또는 12의 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 13, 14 및 15; 또는 서열 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 5중-특이적 항체의 적어도 4개의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 31, 32 또는 33의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 34, 35 및 36의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 31, 32, 33, 34, 35 및 36으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 19, 20 및 21; 또는 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19, 20, 21, 22, 23 또는 24로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 5중-특이적 항체의 적어도 4개의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 37, 38 및 39의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 40, 41 및 42의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 37, 38, 39, 40, 41 및 42로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 25, 26 및 27의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 25, 26 또는 27로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 43, 44 및 45의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46 및 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46 및 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 5중-특이적 항체는 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또 는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 또는 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 또는 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오 티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 11, 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 11, 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 5중-특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 5중-특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 46, 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 46, 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은
(i) 단일 숙주 세포를 서열 46의 폴리펩티드를 포함하는 중쇄를 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 폴리펩티드를 포함하는 경쇄를 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
(ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발현시키는 단계
를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 5중-특이적 항체 (면역글로불린)를 생산하는 방법에 관한 것이고;
추가로, 상기 방법은 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하도록 수행될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은
(i) 단일 숙주 세포를 적어도 서열 13, 14 및 15의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 적어도 서열 16, 17 및 18의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
(ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발현시키는 단계
를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 5중-특이적 항체 (면역글로불린)를 생 산하는 방법에 관한 것이고;
추가로 상기 방법은 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하도록 수행될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은
(i) 단일 숙주 세포를 적어도 서열 19, 20 및 21의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 적어도 서열 22, 23 및 24의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
(ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발현시키는 단계
를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 5중-특이적 항체 (면역글로불린)를 생산하는 방법에 관한 것이고;
상기 방법은 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하도록 수행될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 면역분석, 예를 들어 ELISA 분석에서 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, ENA-78 및 GCP-2에 대한 임의의 하나의 상기 언급된 5중-특이적 항체의 결합을 완전히 또는 부분적으로 차단하는 항체에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 부분적 차단은 항체가 5중-특이적 항체의 결합을 10％, 20％, 40％ 또는 50％ 초과로 차단하는 경우에 일어난다.
한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, ENA-78 및 GCP-2에 대한 임의의 상기 언급된 5중-특이적 항체의 결합과 경쟁하는 항체에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 면역분석, 예를 들어 ELISA 분석에서 인간 IL-8 내의 KELRCQCIKTYSKP (서열 54)의 에피토프에 대한 임의의 하나의 상기 언급된 5중-특이적 항체의 결합을 완전히 또는 부분적으로 차단하는 항체에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 부분적 차단은 항체가 5중-특이적 항체의 결합을 10％, 20％, 40％ 또는 50％ 초과로 차단하는 경우에 일어난다.
한 실시태양에서, 본 발명은 인간 IL-8 내의 KELRCQCIKTYSKP (서열 54)의 에피토프에 대한 임의의 하나의 상기 언급된 5중-특이적 항체의 결합과 경쟁하는 항체에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 상기 언급된 5중-특이적 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 상기 언급된 5중-특이적 항체를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 상승되거나 불균형한 수준의 하나 이상의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 및 ENA-78을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상, 또는 자궁내막증의 치료에 사용하기 위한 상기 언급된 5중-특이적 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 상기 언급된 5중-특이적 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 상기 언급된 5중-특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미 란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 있어서 상기 5중-특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 상기 포유동물은 인간이다.
도 1은 5중-특이적 항체를 생성하기 위한 MAP의 예시적인 세트를 도시한 것이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 5개의 MAP 펩티드 단위를 도시한다. 각각의 단위는 서열 49-53의 선형 펩티드로부터 선택된 하나의 동일한 아미노산 서열을 함유한다.
도 2는 BAL 샘플 내에 존재하는 호중구를 비교하는 유동 세포측정 데이타를 보여준다. 세션 (session) 1, 2 및 3을 제시한다. 흑색의 속이 찬 막대는 LPS 유발 (challenge) 5일 전의 기준선을 보여준다. 회색의 속이 찬 막대는 LPS 유발 6시간 후의 BAL 데이타를 도시한 것이다. 키메라 항체 (HcLc) 처리는 호중구 침윤을 유의하고 용량 의존적으로 억제하였다. 회색의 평행선 막대는 24시간 데이타를 나타낸다 (n=6, *p≤0.05, †p≤0.01, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다).
도 3은 총 순환 호중구 (세포 계수)의 혈액학적 분석을 도시한 것이다. 1 (열린 사각형, □) 및 10 mg/kg (닫힌 원, ●)의 키메라 항체 (HcLc)의 IV 주사는 순환 호중구의 흡입된 LPS 자극을 방지하였다. 1 및 10 mg/kg 처리는 모두 비히클 NHP에 비해 유의하게 감소되고 (†), 10 mg/kg 처리는 또한 1 mg/kg 용량에 비해 유의하게 감소되었다 (*). 데이타는 혈액의 ㎕당 총 계수로서 나타낸다 (n=6, *p≤0.05 대 1 mg/kg, †p≤0.01 대 비히클, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다).
도 4는 인간 IL-8 자극된 호중구 활성화 (증가된 CD11b 표면 발현)의 억제를 도시한 것이다. 다양한 농도의 인간화 5중-특이적 항체를 10 nM hIL-8과 함께 예비-인큐베이팅한 후, 정제된 인간 호중구에 첨가하였다. 데이타는 4개의 상이한 공여체 (n=4)의 평균값으로서 표현한다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. 모든 샘플을 hIL-8만으로 자극된 정제된 호중구 (정제된 호중구에 첨가하기 전에 mAb 없음)와 비교한다. 인간화 구성체 H0L10 및 H0M0이 hIL-8 자극된 CD11b 표면 발현을 억제하는데 보다 더 효과적이다.
도 5A는 표적 인간 케모킨에 대한 마우스 656.35 mAb의 결합을 보여준다.
도 5B는 인간 표적 케모킨에 대한 키메라 항체 (HcLc) mAb의 결합을 보여준다.
도 5C는 인간 표적 케모킨에 대한 인간화 mAb의 결합을 보여준다.
본원에서 사용될 때, "단리된 5중-특이적 항체" 또는 간단히 "5중-특이적 항체"는 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하고 따라서 그와 교차 반응하는 항체를 나타내고자 의도되고, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않고, 또한 물질의 단일 조성물이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 5중-특이적 항체는 전적으로 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78 항원에만 결합할 필요가 없고, 대신 다른 관련 단백질, 예를 들어 인간 GCP-2에도 결합하는 일이 일어날 수 있거나, 심지어 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, ENA-78 및 GCP-2의 비-인간 동족체에도 결합할 수 있고; 즉, 본 발명의 5중-특이적 항체는 최소한으로 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 것이다. 또한, 단리된 5중-특이적 항체에는 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 존재하지 않는다. 또한, 이 맥락에서 사용될 때 5중-특이적 항체는 그의 "모" 5중-특이적 항체의 결합 특징을 갖는 항원 결합 단편 및/또는 유도체도 포함한다. 본 발명의 5중-특이적 항체는 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄를 포함할 수 있고, 이들은 각각 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2개의 이종이량체로 이루어진 전형적인 좌우 대칭의 면역글로불린 분자를 형성한다. 따라서, 본 발명의 5중-특이적 항체는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄의 회합에 의해 형성된 동일한 항원 결합 도메인의 2개의 카피를 포함할 수 있다. 본 발명의 5중-특이적 항체는 한가지 종류의 결합 도메인만을 갖지만 여전히 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하고 따라서 그와 교차 반응할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "항체"는 또한 "면역글로불린"으로서 불린다.
본원에서 사용될 때, "~과 교차 반응하는 항체"는 하나의 항원에만 결합하는 것이 아니라 다른 항원에도 또한 결합하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "중화하는"은 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 또는 ENA-78의 적어도 하나의 생물학적 활성의 부분 또는 완전 억제를 나타내도록 의도하는 것이다. 예를 들어, 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 또는 ENA-78의 생물학적 활성 중 하나는 호중구 화학주성을 유도하는 그의 능력이다.
항체의 결합 운동학을 측정하는 하나의 방식은 표면 플라즈몬 공명에 의한 것이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 예를 들어 BIAcore 시스템 (파마시아 바이오센서 아베 (Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경의 검출에 의해 생체특이적 상호작용의 실시간 분석을 허용하는 광학 현상을 나타낸다. 추가의 설명에 대해서는 문헌 ([Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26]; [Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627]; [Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131]; 및 [Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277])을 참조한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어지고, 대체로 특이적인 3차원 구조 특징 및 특이적인 전하 특징을 갖는다.
본원에서 사용될 때, "모노클로날 항체" 또는 mAb (폴리클로날 항체와 반대로서)는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 나타내도록 의도된다. 예를 들어, 뮤린 유래된 모노클로날 항체 (마우스 모노클로날 항체)는 하이브리도마 기술, 예를 들어 표준 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein) 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다.
항체-생산 세포를 대상으로부터 얻고, 문헌 [Kohler and Milstein (1975), Nature 256:495-497]에서 처음 설명된 하이브리도마 기술과 같은 표준 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다 (또한, 문헌 ([Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46]; [Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83]; [Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31]; 및 [Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75]) 참조). 모노클로날 항체 하이브리도마를 생산하는 기술은 잘 공지되어 있다 (일반적으로 문헌 ([R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980)]; [E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402]; [M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36]) 참조).
본원에서 사용될 때, 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "특이적" 결합은 소정의 항원에 대한 항체 결합을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 약 1x10-7 M 이하에 대응하는 평형 상수, 즉 KD로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 다른 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카제인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2차수 규모 더 낮은 KD에 대응하는 친화도로 소정의 항원에 결합한다. 구문 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "kd" (sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타내도록 의도된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "ka" (M x sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 나타내도록 의도된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 상수를 나타내도록 의도되고, kd를 ka로 나누어서 얻는다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형에 대한 "보존적 서열 변형"은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 결합 특성을 유의하게 변경시키지 않는 변화를 의미한다. 그러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 서열 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 그의 서열이 구체적으로 개시된 항체의 예측된 비필수적인 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 5중-특이적 항체는 구체적으로 개시된 아미노산 서열의 모든 보존적 서열 변형을 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 잔기가 예를 들어 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 주거나 결합 특성을 유의하게 변경시키지 않으면서 아실화 또는 글리코실화에 의해 유도체화된, 구체적으로 개시된 아미노산 서열의 "유도체"를 포함한다.
핵산에서, 용어 "실질적인 동일성"은 뉴클레오티드를 적절히 삽입 또는 결실시키면서 최적으로 정렬되어 비교될 때, 2개의 핵산, 또는 그의 지정된 서열이 적어도 약 80％의 뉴클레오티드, 대체로 적어도 약 90％ 내지 95％, 보다 바람직하게는 적어도 약 98％ 내지 99.5％의 뉴클레오티드와 동일함을 나타낸다. 별법으로, 실질적인 동일성은 세그먼트가 선택적 혼성화 조건 하에서 DNA 가닥의 보체에 혼성화할 때 존재한다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열에서, 용어 "동일성"은 적절히 삽입 또는 결실시키면서 최적으로 정렬되어 비교될 때, 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 정도를 나타낸다. 별법으로, 실질적인 동일성은 DNA 세그먼트가 선택적 혼성화 조건 하에서 가닥의 보체에 혼성화할 때 존재한다.
2개의 서열 사이의 동일성 비율은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, ％ 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100). 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 비율의 결정은 하기 비제한적인 예에서 설명되는 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 비율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com으로부터 입수가능)의 GAP 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 비율은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 (penalty) 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 비율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함)의 GAP 프로그램 내로 포함된 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 조절 서열의 전사에 있어서, 작동가능하게 연결된은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 2개의 단백질 코딩 구역을 연결하기 위해 필요한 경우에는 판독 프레임으로 연속됨을 의미한다. 스위치 (switch) 서열의 경우, 작동가능하게 연결된은 서열이 스위치 재조합을 수행할 수 있음을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하고자 의도된다. 벡터의 한 종류는 "플라스미드"이고, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 그 내부에 라이게이션될 수 있는 환상의 이중가닥 DNA 루프를 의미한다. 다른 형태의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 벡터가 그 내부로 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 (episomal) 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 보이는 발현 벡터의 다른 형태, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 그 내부에 도입된 세포를 의미하고자 의도하는 것이다. 상기 용어는 특정 해당 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손체를 의미하고자 의도하는 것임을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경에 의한 영향 때문에 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 상기 자손체는 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 트랜스펙토마, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포, 및 림프구를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
1. 항체 구조
무손상 항체
무손상 항체는 대체로 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이종다량체 당단백질이다. IgM 이외에, 무손상 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진, 약 150 Kda의 이종사량체 당단백질이다. 일반적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이의 디술피드 연결의 수는 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을, 이어서 많은 불변 구역을 갖는다. 각각의 경쇄는 그의 다른 말단에 가변 도메인 (VL) 및 불변 구역을 갖고; 경쇄의 불변 구역은 중쇄의 제1 불변 구역과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 대부분의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 구역의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 불리는 2 종류 중의 하나로 분류할 수 있다. 그 중쇄의 불변 구역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 5개의 상이한 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류될 수 있다. IgG 및 IgA는 서브클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 다시 분류될 수 있다. 적어도 IgG2a, IgG2b를 갖는 마우스 및 래트에서 종 변이체가 존재한다. 항체의 가변 도메인은 항체에 대한 결합 특이성을 부여하고, 특정 구역은 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 특정 가변성을 제시한다. 가변 구역의 보다 보존된 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 언급된다. 무손상 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 구역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 작용을 한다. 불변 구역은 항체의 항원에 대한 결합에 직접 관련되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존 세포-매개 세포독성 (ADCC), Fcγ 수용체에 대한 결합을 통한 포식작용, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 통한 반감기/소실율 및 보체 캐스케이드의 C1q 성분을 통한 보체 의존성 세포독성의 참여를 보인다. 인간 IgG2 불변 구역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 또는 항체 의존성 세포성 세포독성을 매개하는 능력이 결여되어 있다. IgG4 불변 구역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력이 결여되어 있고, 항체 의존성 세포성 세포독성을 단지 약한 정도로만 매개한다. 본질적으로 상기 효과기 기능이 결여된 항체는 '비-용해성 (lytic)' 항체로 칭할 수 있다.
인간 항체
인간 항체는 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하여 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다 ([Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984)] 및 [Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)] 참조). 다른 방법은 둘 모두 인간 V 구역 레퍼토리를 이용하는 파지 라이브러리 또는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스의 사용을 포함한다 (문헌 [Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12,433-455], [Green LL (1999), J. Immunol. methods 231, 11-23] 참조).
그의 마우스 면역글로불린 로커스가 인간 면역글로불린 유전자 세그먼트로 대체된 트랜스제닉 마우스의 여러 균주가 현재 이용가능하다 (문헌 [Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727]; [Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851], [Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156] 참조). 항원 시험 접종시에, 상기 마우스는 목적하는 항체가 그로부터 선택될 수 있는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있다.
인간 림프구가 방사선 조사된 마우스에 이식된 Trimera™ 시스템 (Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161), 인간 (또는 다른 종) 림프구가 대규모의 집단 (massive pooled) 시험관 내 항체 생성 절차, 이어서 데콘벌레이티드 (deconvulated), 제한 희석 및 선택 절차를 통해 효과적으로 제시되는 선택 림프구 항체 시스템 (SLAM, [Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848] 참조) 및 Xenomouse II™ (아브게닉스 인크 (Abgenix Inc))이 특히 주목된다. 다른 방법은 Morphodoma™ 기술을 사용하는 모포텍 인크 (Morphotek Inc)로부터 이용가능하다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여 인간 항체 (및 그의 단편)를 생산할 수 있다 ([McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990)] 및 [Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260] 참조). 상기 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 단백질 유전자의 메이저 또는 마이너 코트 내로 인 프레임 (in frame)으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다 (대체로 헬퍼 파지를 사용하여). 항체의 기능적 특성을 기초로 한 선택은 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하도록 한다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 상기 설명한 질병 또는 질환으로 고통받는 개체로부터 또는 비면역처리된 인간 공여체로부터 채취한 인간 B 세포로부터 제조된 라이브러리로부터 항원 특이적 항체를 선택할 수 있다 (Marks; J. Mol. Bio. 222,581-597, 1991). Fc 도메인을 포함하는 무손상 인간 항체가 요구되는 경우에, 파지 디스플레이 유래 단편을, 목적하는 불변 구역을 포함하고 안정한 발현 세포주를 확립하는 포유동물 발현 벡터 내로 재클로닝하는 것이 필요하다.
친화도 성숙 기술 (Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992))은 결합 친화도를 개선하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 1차 인간 항체의 친화도는 H쇄 및 L쇄 V 구역을 순차적으로 자연 발생 변이체로 교체하고 개선된 결합 친화도를 기준으로 선택함으로써 개선된다. 상기 기술의 변형 방법, 예를 들어 "에피토프 각인 (imprinting)"도 현재 이용할 수 있다 (WO 93/06213). 또한, 문헌 [Waterhouse; Nucl. Acids Res 21, 2265-2266 (1993)]을 참조한다.
키메라 및 인간화 항체
인간 질병 또는 질환의 치료에서 무손상 비-인간 항체의 사용은 특히 항체의 반복 투여시에 잠재적인 면역원성이라는 현재 잘 확립된 문제를 야기한다. 즉, 환자의 면역계는 비-인간 무손상 항체를 비-자기 물질로 인식하고, 중화 반응을 개시시킨다. 완전 인간 항체의 개발 이외에 (상기 참조), 상기 문제를 극복하기 위해 수 년에 걸쳐 다양한 기술이 개발되었고, 이것은 일반적으로 면역처리된 동물, 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼로부터 비-인간 항체를 비교적 쉽게 계속 얻으면서 무손상 치료 항체의 비-인간 아미노산 서열의 조성을 감소시키는 것을 수반한다. 이를 달성하기 위해 두 가지의 방법이 사용되어 왔다. 첫 번째 방법은 일반적으로 인간 불변 구역에 융합된 비-인간 (예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스) 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체이다. 항체의 항원-결합 부위는 가변 구역 내에 위치하기 때문에, 키메라 항체는 항원에 대한 그의 결합 친화도를 보유하지만, 인간 불변 구역의 효과기 기능을 획득하고, 따라서 상기 설명한 바와 같은 효과기 기능을 수행할 수 있다. 키메라 항체는 일반적으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산된다. 항체를 코딩하는 DNA (예를 들어 cDNA)는 종래의 절차를 사용하여, 예를 들어 본 발명의 항체의 H쇄 및 L쇄 가변 구역을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 단리되고 서열 결정된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 전형적인 공급원이다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내로 도입된 후, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. Coli), COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 항체를 합성한다. DNA는 인간 L 및 H쇄의 코딩 서열로 대응하는 비-인간 (예를 들어 뮤린) H 및 L 불변 구역을 치환함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)] 참조). 따라서, 본 발명의 다른 실시태양에서, 인간 불변 구역 (IgG 이소형, 예를 들어 IgG1의 불변 구역일 수 있음)에 융합된, 서열 2, 6 또는 10의 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 4, 8, 또는 12의 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 키메라 항체가 제공된다.
두 번째 방법은 항체의 비-인간 성분이 가변 구역의 인간화에 의해 감소된 인간화 항체의 생성을 수반한다. 2개의 인간화 기술이 널리 실시되고 있다. 첫 번째 기술은 CDR 그라프팅 (grafting)에 의한 인간화이다. CDR은 항체의 N-말단에 근접한 루프를 형성하고, 여기서 프레임워크 구역에 의해 제시되는 스캐폴드에 고정된 표면을 형성한다. 항체의 항원-결합 특이성은 주로 그의 CDR 표면의 국소 형태 (topography) 및 화학적 특성에 의해 주로 규정된다. 이러한 특징은 다시 개별적인 CDR의 입체형태, CDR의 상대적인 특성, 및 CDR을 포함하는 잔기의 측쇄의 성질 및 특성에 의해 결정된다. 면역원성의 큰 감소는 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체 ("공여" 항체)의 CDR만을 적합한 인간 프레임워크 ("수용 프레임워크") 및 불변 구역 상에 그라프팅함으로써 달성될 수 있다 ([Jones et al (1986) Nature 321,522-525] 및 [Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536] 참조). 그러나, CDR 그라프팅 자체는 항원-결합 특성을 완전히 유지할 수는 없고, 유의한 항원-결합 친화도가 회복되어야 할 경우에 공여 항체의 일부의 프레임워크 잔기가 인간화 분자에 보존될 필요가 있음이 종종 밝혀졌다 (때로 "복귀돌연변이 (backmutation)"로 칭함) (문헌 [Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033], [Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502] 참조). 이 경우에, 비-인간 공여 항체에 대해 가장 큰 서열 상동성 (일반적으로 60％ 이상)을 보이는 인간 V 구역은 인간 프레임워크 (FR)를 제공하기 위해서 데이타베이스로부터 선택될 수 있다. 인간 FR은 인간 컨센서스 (consensus) 또는 개별적인 인간 항체로부터 선택될 수 있다. 필요한 경우, 공여 항체로부터의 핵심 잔기는 CDR 입체형태를 보존하기 위해서 인간 수용 프레임워크 내로 치환된다. 상기 구조적으로 중요한 잔기의 확인을 돕기 위해서 항체의 컴퓨터 모델링을 사용할 수 있다 (WO99/48523 참조).
별법으로, 인간화는 "베니어링 (veneering)" 방법에 의해 달성될 수 있다. 특유한 인간 및 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 구역에 대한 통계학적 분석에 의해 노출된 잔기의 정밀한 패턴이 인간 및 뮤린 항체에서 상이하고, 대부분의 개별적인 표면 위치는 소수의 상이한 잔기를 크게 선호함이 밝혀졌다 ([Padlan E.A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498] 및 [Pedersen J.T. et al (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973] 참조). 따라서, 대체로 인간 항체에서 발견되는 것과 상이한 그의 프레임워크 구역 내의 노출된 잔기를 대체함으로써 비-인간 Fv의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 단백질 항원성은 표면 접근성과 밀접하게 관련될 수 있기 때문에, 표면 잔기의 대체는 마우스 가변 구역을 인간 면역계가 "식별할 수 없도록" 만들기에 충분할 수 있다 (또한 [Mark G.E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134] 참조). 상기 인간화 절차는 항체의 표면만이 변경되고 지지하는 잔기는 그대로 유지되기 때문에 "베니어링"으로 언급된다. 또다른 방법은 WO04/006955에 제시되어 있다. 다른 방법은 WO04/006955에 제시된 방법 및 세균 발현 시스템을 사용하고 서열이 인간 생식세포와 근접한 항체를 생산하는 Humaneering™ (칼로바이오스 (Kalobios))의 절차를 포함한다 (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California). 다른 인간화 방법은 항체의 다른 구역, 예를 들어 프레임워크 구역 사이의 상동성을 기초로 하기보다는 공여 마우스 항체 CDR 구역에 대한 인간 CDR 구역의 구조적 유사성을 기초로 하여 인간 수용 프레임워크를 선택하는 것을 포함한다. 상기 과정은 Superhumanisation™ (에보게닉스 인크. (Evogenix Inc.); Hwang et al (2005) Methods 36:35-42)로도 알려져 있다.
용어 "유도(유래)된"은 물질의 물리적 기원이라는 의미의 공급원을 규정하기 위한 것뿐만 아니라 물질과 구조적으로 동일하지만 참조 공급원으로부터 유래되지 않는 물질을 규정하고자 의도됨이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, "공여 항체에서 발견된 잔기"는 반드시 공여 항체로부터 정제될 필요는 없다.
항체 단편
본 발명의 특정 실시태양에서 항원 결합 단편인 치료 항체가 제공된다. 상기 단편은 무손상 및/또는 인간화 및/또는 키메라 항체의 기능적 항원 결합 단편, 예를 들어 상기 설명한 항체의 Fab, Fd, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv 단편일 수 있다. 불변 구역이 결여된 단편은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 또는 항체 의존성 세포성 세포독성을 매개하는 능력이 결여된다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화, 예를 들어 파파인 소화 (예를 들어, WO 94/29348 참조)에 의해 생산되지만, 재조합 방식으로 형질전환된 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다. ScFv의 생산에 대해서는 문헌 [Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426]을 참조한다. 또한, 항체 단편은 아래에서 설명되는 바와 같은 다양한 공학처리 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
Fv 단편은 Fab 단편보다 그의 2개의 사슬의 보다 낮은 상호작용 에너지를 갖는 것으로 보인다. VH 및 VL 도메인의 회합을 안정화시키기 위해서, 이들은 펩티드 ([Bird et al, (1988) Science 242, 423-426], [Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883]), 디술피드 다리 (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) 및 "놉 인 홀 (knob in hole)" 돌연변이 (Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)로 연결되었다. ScFv 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 ([Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105] 및 [Huston et al (1993) Int. Rev. Immunol 10, 195-217] 참조). ScFv는 세균 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 생산될 수 있지만, 보다 일반적으로는 진핵 세포에서 생산된다. ScFv의 한 가지 단점은 다가 결합에 의한 결합력의 증가를 방해하는 산물의 1가성 및 그의 짧은 반감기이다. 이 문제를 극복하기 위한 시도는 화학적 커플링 ([Adams et al (1993) Can. Res 53, 4026-4034] 및 [McCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314]) 또는 비페어링된 (unpaired) C 말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의 자연적인 부위-특이적 이량체화 (Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204)에 의해 추가의 C 말단 시스테인을 함유하는 ScFV로부터 생산된 2가 (ScFv')2를 포함한다. 별법으로, ScFv는 펩티드 링커를 3 내지 12개의 잔기로 단축시켜 "디아바디 (diabody)"를 형성함으로써 다량체를 형성시킬 수 있다 (Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448). 링커의 감소는 ScFV 삼량체 ("트리아바디 (triabody)" [Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433]) 및 사량체 ("테트라바디 (tetrabody)", [Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168])를 생성시킬 수 있다. 또한, 2가 ScFV 분자의 제조는 단백질 이량체화 모티프와의 유전자 융합에 의해 "미니항체" (Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) 및 "미니바디 (minibody)" (Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061)를 형성함으로써 달성될 수 있다. ScFv-Sc-Fv 직렬체 (tandem) ((ScFV)2)도 제3 펩티드 링커에 의해 2개의 ScFv 단위를 연결함으로써 생성될 수 있다 (Kurucz et al (1995) J. Immol. 154, 4576-4582). 이중 특이적 디아바디는 짧은 링커에 의해 다른 항체의 VL 도메인에 연결된 한 항체의 VH 도메인으로 구성된 2개의 단일쇄 융합 산물의 비공유 회합을 통해 생산될 수 있다 (Kipriyanov et al (1998), Int. J. Can 77,763-772). 상기 이중 특이적 디아바디의 안정성은 상기 설명한 바와 같은 디술피드 다리 또는 "놉 인 홀" 돌연변이의 도입 또는 단일쇄 디아바디 (ScDb)의 형성 (여기서, 2개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커에 의해 연결됨)에 의해 향상될 수 있다 (Kontermann et al (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188). 4가의 이중 특이적 분자는 예를 들어 ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인에 또는 Fab 단편에 힌지 구역을 통해 융합시켜 얻을 수 있다 (Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163). 별법으로, 4가의 이중 특이적 분자는 이중 특이적 단일쇄 디아바디의 융합에 의해 생성되었다 (Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94). 또한, 보다 작은 4가의 이중 특이적 분자는 나선-루프-나선 모티프를 함유하는 링커를 사용한 ScFv-ScFv 직렬체 (DiBi 미니항체, [Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49] 참조) 또는 분자내 페어링을 억제하는 배향으로 4개의 항체 가변 도메인 (VH 및 VL)을 포함하는 단일쇄 분자 (직렬 디아바디 (tandem diabody) (Kipriyanov et al, (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56))의 이량체화에 의해 형성될 수 있다. 이중 특이적 F(ab')2 단편은 Fab' 단편의 화학적 커플링에 의해 또는 류신 지퍼를 통한 이종이량체화에 의해 생성시킬 수 있다 ([Shalaby et al, (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225] 및 [Kostelny et al (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553]). 또한, 단리된 VH 또는 VL 도메인을 기초로 한 소위 도메인 항체도 이용가능하다 (도만티스 엘티디 (Domantis Ltd.)) (US 6,248,516; US 6,291,158; US 6,172,197 참조).
이종컨쥬게이트 항체
이종컨쥬게이트 항체도 본 발명의 실시태양을 형성하는 유도체이다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 형성된 2개의 공유 연결된 항체로 이루어진다 (US 4,676,980 참조).
다른 변형
또한, 본 발명의 항체는 불변 구역 내에 임의의 다른 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그의 불변 구역 내의 보존된 위치에서 항체의 글리코실화는 항체 기능, 특히 상기한 바와 같은 효과기 기능에 대해 큰 효과를 갖는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318] 참조). 하나 이상의 탄수화물 모이어티 (moiety)가 부가, 치환, 결실 또는 변형된 본 발명의 치료 항체의 글리코실화 변이체가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프의 도입은 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 잠재적인 부위를 생성시키고, 따라서 항체의 글리코실화를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876]에서, TNFR-IgG 면역어드헤신의 말단 시알릴화는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 및/또는 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 사용한 재갈락토실화 및/또는 재시알릴화 과정을 통해 증가하였다. 말단 시알릴화의 증가는 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다. 대부분의 당단백질과 마찬가지로, 항체는 일반적으로 당형태 (glycoform)의 혼합물로서 자연에서 생산된다. 상기 혼합물은 항체가 진핵, 특히 포유동물 세포에서 생산될 때 특히 분명하다. 규정된 당형태를 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다 ([Zhang et al Science (2004), 303, 371], [Sears et al, Science, (2001) 291, 2344], [Wacker et al (2002) Science, 298 1790], [Davis et al (2002) Chem. Rev. 102, 579], [Hang et al (2001) Acc. Chem. Res 34, 727]). 따라서, 본 발명은 상기 항체의 한정된 수 (예를 들어 7개 이하, 예를 들어 5개 이하, 예를 들어 2개 또는 하나)의 당형태(들)를 포함하는, 본원에서 설명되는 다수의 치료 항체 (IgG 이소형, 예를 들어 IgG1일 수 있음)에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 유도체는 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 커플링된 본 발명의 치료 항체를 포함한다. 단백질의 PEG에 대한 컨쥬게이션은 단백질의 반감기를 증가시키기 위해, 및 단백질의 항원성 및 면역원성을 감소시키기 위해 확립된 기술이다. 상이한 분자량 및 형태 (선형 또는 분지형)를 갖는 PEG화의 사용이 무손상 항체 및 Fab' 단편에 대해 조사되었다 (Koumenis I.L. et al (2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95). 특정 실시태양은 a) 전통적인 경로에 의한 보체의 활성화; 및 b) 항체 의존성 세포성 세포독성의 매개의 효과기 기능이 없는, PEG에 커플링된 본 발명의 항원-결합 단편 (예를 들어 Fab 단편 또는 scFv)을 포함한다.
항체의 Fc 구역과 다양한 Fc 수용체 (FcγR) 사이의 상호작용은 항체 의존 세포성 세포독성 (ADCC), 보체 고정, 포식작용 및 항체의 반감기/소실을 포함하는, 항체의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 본 발명의 항체의 Fc 구역에 대한 상이한 변형은 목적하는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. 특히, a) 전통적인 경로에 의한 보체의 활성화; 및 b) 항체 의존성 세포성 세포독성의 매개의 기능이 본질적으로 결여된 인간 불변 구역은 예를 들어 EP0307434 (WO8807089), EP 0629 240 (WO9317105) 및 WO 2004/014953에 개시된 위치 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및/또는 322의 돌연변이와 같은 특정 돌연변이를 함유하는 IgG4 불변 구역, IgG2 불변 구역 및 IgG1 불변 구역을 포함한다. 중쇄 불변 구역 (카바트 (Kabat) 넘버링; EU 지수 (Index) 시스템)의 CH2 도메인 내의 잔기 235 또는 237의 돌연변이는 각각 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII에 대한 결합을 감소시키고 따라서 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 감소시킨다고 설명된 바 있다 ([Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564]; [Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662]; [Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040]; [Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;l-84]; [Morgan et al, Immunology 1995, 86; 319-324]; [Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)]). 또한, 몇몇 보고서는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 동원하거나 매개할 때 이들 잔기 중의 일부가 연관된다고 설명한 바 있다 ([Morgan et al., 1995]; [Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26]; [Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168]). 따라서, 잔기 235 및 237은 모두 보체 매개 및 FcγR-매개 효과를 모두 감소시키기 위해 알라닌 잔기로 돌연변이되었다 ([Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353]; [Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48]; 및 WO9958679). 상기 불변 구역을 포함하는 항체는 '비-용해성' 항체로 언급될 수 있다.
혈청 반감기를 증가시키기 위해서 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체에 포함시킬 수 있다 (US 5,739,277 참조).
현재 5개의 인간 Fcγ 수용체, 즉 FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn이 존재한다. 문헌 [Shields et al, (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604]은 공통적인 세트의 IgG1 잔기가 모든 FcγR에 대한 결합에 관여하지만, FcγRII 및 FcγRIII는 상기 공통적인 세트 외부의 별개의 부위를 이용함을 입증하였다. IgG1 잔기의 한 군, 즉 Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239이 알라닌으로 변경될 때 모든 FcγR에 대한 결합이 감소하였다. 이들은 모두 IgG CH2 도메인에 존재하고, CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 근처에서 밀집한다. FcγRI은 결합을 위해 공통적인 세트의 IgG1 잔기만을 이용하지만, FcγRII 및 FcγRIII은 공통적인 세트 이외의 별개의 잔기와 상호작용한다. 일부 잔기의 변형은 FcγRII (예를 들어 Arg-292) 또는 FcγRIII (예를 들어 Glu-293)에 대한 결합만을 감소시켰다. 일부 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대한 개선된 결합을 보였지만, 다른 수용체에 대한 결합에는 영향을 주지 않았다 (예를 들어, Ser-267Ala은 FcγRII에 대한 결합은 개선시켰지만, FcγRIII에 대한 결합에는 영향을 주지 않았다). 다른 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대해 개선된 결합을 보였고, 다른 수용체에 대한 결합은 감소하였다 (예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII에 대해 개선된 결합을 보였고, FcγRII에 대한 결합은 감소하였다). FcγRIIIa의 경우, 가장 우수하게 결합하는 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 조합된 알라닌 치환을 보유하였다. 신생아 FcRn 수용체는 IgG 분자를 분해로부터 보호하고 따라서 혈청 반감기 및 조직을 가로지른 세포 전달 작용 (transcytosis)을 향상시키는 과정에 관련되는 것으로 생각된다 ([Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57] 및 [Ghetie et al (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766] 참조). 인간 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 결정된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다.
본 발명의 치료 항체는 임의의 상기 불변 구역 변형을 포함할 수 있다.
2. 생산 방법
본 발명의 항체는 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 염소 ([Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231: 147-157] 참조), 닭 ([Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55] 참조), 마우스 ([Pollock et al 상기 문헌] 참조) 또는 식물 ([Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204], [Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606], [Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54], [Stoger E et al; (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590] 참조)에서 생산될 수 있다. 또한, 항체는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 일반적으로 당업자에게 공지된 재조합 세포 배양 기술을 사용하여 생산된다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가의 클로닝 (증폭) 또는 숙주 세포 내에서의 발현을 위해 복제 가능 벡터, 예를 들어 플라스미드에 삽입한다. 한 유용한 발현 시스템은 특히 숙주 세포가 CHO 또는 NSO (아래 참조)인 경우에 글루타메이트 합성효소 시스템 (론자 바이올로지스 (Lonza Biologies)에 의해 시판되는 것)이다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 종래의 절차 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 프로브)를 사용하여 쉽게 단리되고 서열 결정된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존 (transposon), 미니염색체 (minichromosome)를 포함하고, 이 중에서 플라스미드가 전형적인 실시태양이다. 일반적으로, 상기 벡터는 발현을 용이하게 하기 위해 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터에 삽입되어 동일한 숙주 세포 내로 동시에 또는 순차적으로 (예를 들어 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입에 의해) 도입될 수 있거나, 필요한 경우 중쇄 및 경쇄 모두가 상기 도입 전에 동일한 벡터 내에 삽입될 수 있다.
유전자 코드의 다의성 (redundancy) 때문에, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 대한 대체 폴리뉴클레오티드도 이용가능함을 당업자는 분명하게 알 것이다.
신호 서열
본 발명의 항체는 성숙 단백질의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 이종 신호 서열이 존재하는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되어야 한다. 원핵 숙주 세포에서, 신호 서열은 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 또는 열 안정성 장독소 II 리더일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타제 리더일 수 있다 (예를 들어 WO90/13646 참조). 포유동물 세포 시스템에서는, 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호 및 천연 면역글로불린 신호 서열 (예를 들어 인간 Ig 중쇄)을 이용할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 판독 프레임으로 라이게이션된다.
복제 기점
복제 기점은 당업계에 잘 공지되어 있고, pBR322는 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드는 대부분의 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점, 예를 들어 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV는 대부분의 포유동물 세포에 적합하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 벡터 증식이 이. 콜라이에서 필요하지 않으면 통합된 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다. 그러나, 조기 프로모터를 함유하기 때문에 SV40 ori는 사용될 수 있다.
선택 마커
일반적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나 또는 (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나 복합 배지에서 이용할 수 없는 영양분을 공급하거나 또는 (c) 이 둘의 조합을 제시하는 단백질을 코딩한다. 선택 방식은 벡터 또는 벡터들을 함유하지 않는 숙주 세포의 성장 정지를 수반할 수 있다. 본 발명의 치료 항체를 코딩하는 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 예를 들어 동시 전달된 선택 마커에 의해 부여된 약물 내성 때문에 생존한다. 하나의 예는 형질전환체가 DHFR 음성 숙주 균주에서 생성되는 DHFR-선택 시스템이다 (예를 들어, 문헌 [Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68] 참조). 상기 시스템에서, DHFR 유전자는 본 발명의 항체 코딩 폴리뉴클레오티드 서열과 동시 전달된 후, DHFR 양성 세포를 뉴클레오시드 투여 중지에 의해 선택한다. 필요한 경우, DHFR 억제제 메토트렉세이트도 DHFR 유전자 증폭을 갖는 형질전환체를 선택하기 위해 사용된다. DHFR 유전자를 본 발명의 항체 코딩 서열 또는 그의 기능적 유도체에 작동가능하게 연결함으로써, DHFR 유전자 증폭은 목적하는 항체 서열의 동시 증폭을 야기한다. CHO 세포는 상기 DHFR/메토트렉세이트 선택에 특히 유용한 세포주이고, DHFR 시스템을 사용한 숙주 세포의 증폭 및 선택 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다 ([Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621], [Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8): 870-80, 1998 Aug] 참조). 추가의 예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템 (론자 바이올로지스)이다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 trp1 유전자이고; 문헌 [Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979]을 참조한다.
프로모터
본 발명의 항체 발현에 적합한 프로모터는 항체 코딩 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주용 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 Tac를 포함한다. 효모 세포 발현에 적합한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 및 글루코키나제를 포함한다. 유도가능 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토스/갈락토스 이용을 책임지는 효소를 포함한다. 포유동물 세포 시스템에서의 발현을 위한 프로모터는 RNA 중합효소 II 프로모터, 예를 들어 바이러스 프로모터, 예를 들어 폴리오마, 조류폭스 및 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (특히 최조기 (immediate early) 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 및 조기 또는 후기 원숭이 바이러스 40 및 비-바이러스 프로모터, 예를 들어 EF-1알파 (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322)를 포함한다. 프로모터는 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적합한 상용성을 기초로 하여 선택할 수 있다.
인핸서 요소
적절한 경우, 예를 들어 보다 고등한 진핵세포에서의 발현을 위해, 추가의 인핸서 요소가 상기한 프로모터 대신에, 또는 프로모터와 함께 포함될 수 있다. 적합한 포유동물 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아단백질, 메탈로티오닌 및 인슐린으로부터의 인핸서 요소를 포함한다. 별법으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서 요소, 예를 들어 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 로커스 (WO04/009823 참조)를 사용할 수 있다. 상기 인핸서는 일반적으로 벡터에서 프로모터의 상류 부위에 위치하지만, 다른 부위, 예를 들어 비번역 구역 내 또는 폴리아데닐화 신호의 하류에 위치할 수도 있다. 인핸서의 선택 및 위치는 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적절한 상용성을 기초로 하여 결정할 수 있다.
폴리아데닐화 /종결
진핵 시스템에서, 폴리아데닐화 신호는 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 상기 신호는 일반적으로 개방 판독 프레임의 3'에 위치한다. 포유동물 시스템에서, 신호의 비-제한적인 예는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스 (예를 들어 SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 긴 말단 리피트로부터 유도된 것을 포함한다. 효모 시스템에서, 폴리아데닐화/종결 신호의 비-제한적인 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 및 알콜 데히드로게나제 1 (ADH) 유전자로부터 유도된 것을 포함한다. 원핵 시스템에서, 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 필요하지 않고, 대신에 보다 짧고 보다 한정된 터미네이터 서열을 사용하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적절한 상용성을 기초로 하여 선택될 수 있다.
수율 향상을 위한 다른 방법/요소
상기 요소 이외에, 수율을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 다른 특징은 크로마틴 리모델링 요소, 인트론 및 숙주 세포 특이적 코돈 변형을 포함한다. 본 발명의 항체의 코돈 사용 빈도는 전사 및/또는 산물 수율 증가를 위해 숙주 세포의 코돈 편향을 수용하도록 변형될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24] 참조). 코돈은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적절한 상용성을 기초로 하여 선택될 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 항체의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 예를 들어 원핵 세포, 효모 세포 또는 보다 고등한 진핵 세포이다. 적합한 원핵 세포는 진정세균, 예를 들어 엔테로박테리아세애 (enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이 (예를 들어 ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 및 바실러스 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (DD 266 710 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 효모 숙주 세포 중에서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) (예를 들어 ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226), 피키아 파스토리스 (Pichia Pastoris) (EP183,070, 문헌 [Peng et al J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192] 참조), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP244,234), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)도 고려된다.
원핵 및 효모 숙주 세포가 구체적으로 본 발명에 의해 고려되지만, 일반적으로 본 발명의 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 적합한 척추동물 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 주 293, PerC6 (크루셀 (Crucell)), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) (ATCC No. CRL 1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO. CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어 CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, DHFR-CHO 세포주, 예를 들어 DG44 (Urlaub et al, (1986), 상기 문헌 참조), 특히 현탁 배양에 적응시킨 CHO 세포주, 마우스 세르톨리 (Sertoli) 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개 신장 세포 (ATCC CCL 34), 인간 폐 세포 (ATCC CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포, 예를 들어 NSO (US 5,807,715 참조), Sp2/0, YO를 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 본원에 기재된 치료 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 벡터를 포함하는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 일반적으로, 상기 숙주 세포는 경쇄를 코딩하는 제1 벡터 및 상기 중쇄를 코딩하는 제2 벡터를 포함한다.
또한, 상기 숙주 세포는 본 발명의 항체의 품질, 기능 및/또는 수율을 변경시키기 위해 추가로 공학적으로 처리되거나 변형될 수 있다. 비-제한적인 예는 특이적 변형 (예를 들어 글리코실화) 효소 및 단백질 폴딩 쉐퍼론 (chaperone)의 발현을 포함한다.
세포 배양 방법
본 발명의 치료 항체를 코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너 플라스크, 진탕 플라스크, 롤러 병 (roller bottle) 또는 중공사 시스템에서 배양될 수 있지만, 대규모 생산을 위해 교반 탱크 반응기 또는 백 (bag) 반응기 (예를 들어 웨이브 바이오테크 (Wave Biotech, 미국 뉴저지주 소머세트))가 바람직하고, 이는 특히 현탁 배양을 위해 사용된다. 일반적으로, 교반 탱커 (tanker)는 예를 들어 통기관 (sparger), 배플 또는 저전단 임펠러를 사용한 공기주입을 위해 변형된다. 버블 컬럼 및 공기펌프 (airlift) 반응기의 경우, 공기 또는 산소 버블을 사용한 직접 공기주입을 사용할 수 있다. 숙주 세포를 무혈청 배양 배지에서 배양하는 경우, 공기주입 공정에 의해 발생하는 세포 손상의 방지를 돕기 위해 배지를 세포 보호제, 예를 들어 플루로닉 (pluronic) F-68로 보충하는 것이 바람직하다. 숙주 세포 특성에 따라, 마이크로캐리어 (microcarrier)를 부착 의존성 세포주의 성장 기재로서 사용할 수 있거나 또는 세포를 현탁 배양 (이 배양이 전형적임)에 적응시킬 수 있다. 숙주 세포, 특히 척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 작동 방식, 예를 들어 회분식, 유가식 (fed-batch), 반복 회분식 공정 (문헌 [Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109] 참조), 연장된 회분식 공정 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합 방식으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 소 태아 혈청 (FCS)을 포함하는 혈청-함유 배지에서 배양할 수 있지만, 상기 숙주 세포는 문헌 [Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 개시된 바와 같은 합성 무혈청 배지, 또는 시판되는 배지, 예를 들어 필요한 경우 에너지원, 예를 들어 글루코스 및 합성 성장 인자, 예를 들어 재조합 인슐린으로 보충된 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO™ (칼브렉스 (Cambrex, 미국 뉴저지주))에서 배양하는 것이 바람직하다. 숙주 세포의 무혈청 배양은 숙주 세포를 무혈청 조건에서 성장하도록 적응시키는 것이 필요할 수 있다. 한 적응 방법은 혈청 함유 배지에서 상기 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포가 무혈청 조건에 적응하도록 배양 배지의 80％를 무혈청 배지로 반복적으로 교환하는 것이다 (예를 들어 [Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers] 참조).
배지 내로 분비된 본 발명의 항체는 회수하여, 의도하는 용도에 적합한 정제 수준을 제공하기 위해 다양한 기술을 사용하여 배지로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위한 본 발명의 치료 항체의 사용은 일반적으로 치료 항체를 포함하는 배양 배지에 비해 환원 SDS-PAGE에 의해 측정시에 적어도 95％의 순도, 보다 일반적으로 98％ 또는 99％의 순도를 요구한다. 처음 예에서, 배양 배지로부터의 세포 파쇄물은 일반적으로 원심분리, 이어서 예를 들어 미세여과, 한외여과 및/또는 다층 (depth) 여과를 사용하는 상층액 정제 단계를 사용하여 제거된다. 별법으로, 항체는 사전 원심분리를 실시하지 않으면서 미세여과, 한외여과 또는 다층 여과에 의해 수거할 수 있다. 다양한 다른 기술, 예를 들어 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그래피 기술, 예를 들어 히드록시아파타이트 (HA), 친화도 크로마토그래피 (임의로 친화도 태깅 (tagging) 시스템, 예를 들어 폴리히스티딘을 포함함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, US 5,429,746)를 이용할 수 있다. 한 실시태양에서, 다양한 정제 단계 후에 본 발명의 항체는 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피, 이어서 추가의 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전을 사용하여 포획된다. 일반적으로, 각종 바이러스 제거 단계도 사용된다 (예를 들어 DV-20 필터를 사용하는 나노여과). 이들 다양한 단계 후에, 적어도 10 mg/ml 이상, 예를 들어 100 mg/ml 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 정제된 (일반적으로 모노클로날) 제제가 제공되고, 따라서 본 발명의 실시태양을 형성한다. 100 mg/ml 이상의 농도는 초원심분리에 의해 생성될 수 있다. 적합하게는, 상기 제제에는 응집된 형태의 본 발명의 항체가 실질적으로 존재하지 않는다.
세균 시스템은 항체 단편의 발현에 특히 적합하다. 상기 단편은 세포 내에 또는 또는 주변 세포질 내에 위치한다. 불용성의 주변 세포질 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 따라 추출되고 재폴딩되어 활성 단백질을 형성한다 ([Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20] 및 [Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277] 참조).
3. 제약 조성물 및 투여 방식
상기 설명한 바와 같은 본 발명의 항체의 정제된 제제는 상기 개략된 것과 같은 인간 질병 및 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물 내로 포함될 수 있다. 전형적으로, 상기 조성물을 허용되는 제약 실무 (예를 들어 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co] 참조)에서 공지되고 요구되는 제약상 허용되는 (즉, 불활성) 담체를 추가로 포함한다. 그러한 담체의 예는 멸균 담체, 예를 들어 적합한 버퍼로 pH 5 내지 8 범위로 완충시킨 염수, 링거 (Ringer) 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 주사 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피부내, 피하, 근육내 또는 문맥내) 또는 연속 주입을 위한 제약 조성물에는 적합하게는 눈에 보이는 입자형 물질이 존재하지 않고, 0.1 mg 내지 10 g의 치료 항체, 일반적으로 5 mg 내지 25 mg의 항체를 포함할 수 있다. 상기 제약 조성물의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 한 실시태양에서, 제약 조성물은 0.1 mg 내지 10 g의 본 발명의 치료 항체를 단위 투여형 내에 임의로 사용을 위한 지시서와 함께 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 당업자에게 잘 알려지거나 명백한 방법에 따라 투여하기 전에 재구성을 위해 동결건조 (냉동 건조)될 수 있다. 본 발명의 실시태양이 본 발명의 항체를 IgG1 이소형과 함께 포함하는 경우에, 상기 이소형의 항체의 구리-매개된 분해 정도를 감소시키기 위해 구리의 킬레이트제, 예를 들어 시트르산염 (예를 들어 시트르산나트륨) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 제약 조성물에 첨가될 수 있다 (EP0612251 참조).
본 발명의 항체를 투여하기 위한 유효 투여량 및 치료 요법은 일반적으로 경험적으로 결정되고, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태와 치료되는 질병 또는 질환과 같은 인자에 따라 결정된다. 상기 인자는 담당의의 판단에 따라 결정된다. 적절한 용량을 선택하는데 있어서 지침은 예를 들어 문헌 [Smith et al (1977) Antibodies in diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 찾을 수 있지만, 일반적으로 0.1 mg 내지 1 g일 것이다. 한 실시태양에서, 인간 환자를 치료하기 위한 투여 요법은 매주 1회 또는 2주마다 피하 투여되거나, 1 또는 2개월마다 정맥내 주입되는 0.1 mg 내지 10 g의 본 발명의 치료 항체이다. 본 발명의 조성물은 또한 예방 목적으로 사용될 수 있다.
4. 임상 용도
본 발명은 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 사용하여, 상승되거나 불균형한 수준의 하나 이상의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히, COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상승되거나 불균형한 수준의 하나 이상의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 및 ENA-78을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히 COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상, 또는 자궁내막증의 치료용 의약의 제조에 있어서 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명을 주로 인간 질병 또는 질환의 치료와 관련하여 설명하였지만, 본 발명은 비-인간 포유동물의 유사한 질병 또는 질환의 치료에도 적용될 수 있다.
실시예 1. 마우스 모노클로날 항체 656.35, 197.2, 및 81.1의 생성
표적 케모킨 (인간 IL -8, Gro -알파, Gro -베타, Gro -감마 및 ENA -78)에 대한 5중-특이적 mAb 의 생성.
다수의 방법 및 방식을 사용하여 범-특이적 mAb를 생성하기 위해 마우스를 면역처리하였다. 범-특이적 mAb의 생성은 완전 또는 불완전 프로인트 어쥬번트 (cFA 또는 iFA) 내에 혼합된 다중 항원 펩티드 (MAP) 및/또는 무손상 표적 케모킨 (IL-8, Gro-α, -β, -γ, 및 ENA-78)의 각종 혼합물을 사용하여 변형된 Repetitive Immunization Multiple Sites (RIMMS) 프로토콜에 따라 SJL/JOrlCrl 마우스 주 내에서 생성하였다.
MAP 또는 다중 항원 펩티드는 면역처리 프로토콜 내에서 2가지 기능을 수행한다. 먼저, MAP는 공지의 표적 아미노산 서열의 선택적인 다중 제시를 허용한다. 두 번째로, 예를 들어, 라이신 코어를 통해 연결된 다중 카피의 서열로 인해 질량이 증가하고, 이는 또한 개별 펩티드의 것에 비해 서열의 면역원성을 증가시킨다 ([Francis, J.P., et al, Immunology, 1991: 73; 249], [Schott, M.E., et al, Cell. Immuno. 1996: 174: 199-209], [Tarn, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988: 85; 5409-5413]). 도 1은 아미노산 서열 49-53을 갖는 MAP의 세트의 개략도이다. MAP 내의 링커는 라이신 이외의 임의의 링커일 수 있다.
일반적인 면역처리 스케쥴:
상기 스케쥴에 따른 2가지 상이한 면역처리 프로토콜로 범-특이적 mAb를 생산하였다:
1. 초기 면역처리 (제0일)는 cFA 내에 혼합된 모든 표적 케모킨 (각각 10 ㎍)의 다수 피하 주사 (뒷다리, 등 및 목)로 이루어졌다. 다음 4개의 추가 접종 (boost)은 iFA 내에 혼합된 모든 표적 케모킨 (각각 10 ㎍)의 혼합물로 이루어졌다. 제5 및 모든 후속 추가 접종은 iFA 내의 모든 표적 케모킨과 5개의 모든 선형 MAP (각각 10 ㎍)의 칵테일로 이루어졌다. 희생 및 융합 3일 전의 최종 추가 접종은 PBS 중의 모든 표적 케모킨과 선형 MAP로 이루어졌고, 복강내 (IP) 주사를 통해 전달되었다.
2. 초기 면역처리 (제0일)는 cFA 내에 혼합된 5개의 모든 선형 MAP (각각 10 ㎍)의 다수 피하 주사 (뒷다리, 등 및 목)로 이루어진다. 다음 4개의 추가 접종은 iFA 내의 5개의 모든 선형 MAP (각각 10 ㎍)의 혼합물로 이루어졌다. 제5 및 모든 후속 추가 접종은 iFA 내의 5개의 모든 선형 MAP와 모든 표적 케모킨 (각각 10 ㎍)의 칵테일로 이루어졌다. 희생 및 융합 3일 전의 최종 추가 접종은 PBS 중의 5개의 모든 선형 MAP와 모든 표적 케모킨 (각각 10 ㎍)으로 이루어졌고, 복강내 (IP) 주사를 통해 전달되었다.
실시예 2. 표적 케모킨 (인간 IL -8, Gro -알파, Gro -베타, Gro -감마, GCP -2 및 ENA-78)에 대한 mAb 의 범-결합은 시분해 형광 면역형광 분석 ( TRFIA )을 통해 확인하였다.
간단히 설명하면, 각각의 항원 (인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마, GCP-2 및 ENA-78과 음성 대조군으로서 사용되는 hIL-18)을 96-웰 면역형광 플레이트 상에 개별적으로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 시판되는 차단 용액으로 차단하였다. 차단 용액을 비우고, mAb를 함유하는 샘플을 각각의 웰에 첨가하고, 40 내지 60분 동안 인큐베이팅하였다 (이는 mAb가 표적 케모킨에 결합하도록 한다). 이어서, 플레이트를 다시 세척하고, 검출 Ab를 각각의 웰에 첨가하였다. 검출 시약은 2X656.35, 키메라 (HcLc) 및 인간화 MAb에 대해 각각 다음과 같다: 비오티닐화된 항-마우스 IgG, 비오티닐화된 항-인간 IgG Fab2 시약, 및 유로퓸 항-인간 IgG. 검출 항체는 유로퓸 또는 비오틴에 컨쥬게이팅된다. 결합되지 않은 검출 Ab를 제거하기 위해 추가 라운드의 세척 후에, 스트렙타비딘-유로퓸의 용액을 비오틴 검출된 분석에 첨가하였다. 스트렙타비딘-유로퓸은 비오틴에 결합하여 검출을 허용한다. 결합되지 않은 스트렙타비딘-유로퓸을 제거하기 위해 최종 세척 후에, 또는 인간화 MAb 분석의 경우에 유로퓸 컨쥬게이트 2차를 세척한 후, 각각의 웰을 킬레이팅 세제 용액으로 채워 유로퓸 생산 형광을 활성화시킨다. 보다 큰 기록된 형광은 웰 내에 존재하는 검출 Ab의 양에 정비례하고, 이는 케모킨 결합 mAb의 양에 직접 연관되고 비례한다.
도 5A는 표적 인간 케모킨에 대한 마우스 656.35 mAb의 결합을 보여준다. 도 5B는 인간 표적 케모킨에 대한 키메라 항체 (HcLc) mAb의 결합을 보여준다. 도 5C는 인간 표적 케모킨에 대한 인간화 mAb의 결합을 보여준다.
실시예 3. 뮤린 mAb 에 의한 기능적 범-억제는 다양한 방법을 이용하여 확인하였다: CXCR2 매개된 Ca 2 + 이동, 인간 호중구 화학주성 , 및 인간 호중구 활성화 ( CD11b 표면 발현).
hCXCR2 및 Gα16으로 형질감염되어 이를 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포에서 ELR+ 케모킨 유도된 [Ca2 +]i-이동에 대한 항체의 중화 효과의 기능적 특성 결정을 위해, 미세적정 플레이트 기반 칼슘 이동 분석, FLIPR (형광측정 영상화 플레이트 판독기; Fluorometric Imaging Plate Reader, 몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일)), [Schroeder, 1996])을 사용하였다.
분석 전일에, 세포를 96 웰의 흑색 벽 및 투명한 바닥의 플레이트 (패카드 뷰 (Packard View)) 내에 40000 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 18 내지 24시간 후, 배지를 세포로부터 흡인 제거하고, 얼스 염 (Earl's salt) 및 L-글루타민, 0.1％ BSA (세롤로지칼스 코퍼레이션 (Serologicals Corporation)), 4 μM Fluo-4-아세톡시메틸 에스테르 형광 인디케이터 염료 (Fluo-4 AM) 및 2.5 mM 프로베네시드와 함께 이글스 최소 필수 배지 (EMEM)을 함유하는 100 ㎕ 로드 (load) 배지로 교체하였다. 세포를 상기 염료 함유 배지 내에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 염료 함유 배지를 세포로부터 흡인 제거하고, Fluo-4 AM을 함유하지 않고 0.1％ 젤라틴 (BSA 제거) 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 동일한 배지 로 교체하였다. 세포를 10분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, KRH 분석 버퍼 [0.1％ 젤라틴 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 크렙스 링거 헨젤라이트 (Krebs Ringer Henseleit) (120 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 1.03 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1.0 mM CaCl2, 1.1 mM MgCl2, 11 mM 글루코스, 20 mM HEPES (pH 7.4))]로 3회 세척하였다. 최종 버퍼 세척 후에, 0.1％ 젤라틴 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 100 ㎕ KRH 분석 버퍼를 세포에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 가온한 후, FLIPR 내에 넣고, 여기서 염료 로딩된 세포를 6 와트 아르곤 레이저로부터 여기광 (488 nm)에 노출시켰다. [Ca2 +]i-이동을 Ca2 +에 결합될 때 Fluo-4의 516 nm 방출 강도의 증가의 결과로서 모니터링하였다. 방출 강도에서 변화는 세포기질 (cytosolic) 칼슘 수준, [Ca2 +]i에 직접 관련된다. 기준선을 10초 동안 모니터링한 후, 50 ㎕의 3X ELR+ 케모킨 (일정 농도 범위의 항체와 함께 예비-인큐베이팅시킴)을 세포 플레이트에 첨가하고, 데이타를 1분 동안 매초 수집한 후, 추가의 30초 동안 3초 간격으로 기록하였다. 기초 판독치를 넘는 최대 세포성 반응을 GraphPad Prism (v4.03)에서 플로팅하기 위해 이송하였다.
IC50은 3X EC80 케모킨의 예비-처리 동안, EC80 농도의 ELR+ 케모킨의 CXCR2 매개된 자극 효과를 50％ 중화시키기 위해 요구되는 항체의 농도로서 정의하였다. 세포 생활력을 시험하기 위해 25 μM ATP에 대한 2차 세포성 반응을 모니터링하였다 [Sarau, 1999].
Figure 112009070070096-PCT00001
표: 3가지의 뮤린 mAb에 의한 인간 ELR+ 케모킨 유도된 칼슘 유동의 억제 (기하 평균된 IC50, ㎍/ml) (n=3 내지 6) (n.d. = 결정되지 않음, N/A = 이용불가)
문헌 ([Schroeder KS, Neagle, BD. FLIPR: a new instrument for accurate, high throughput optical screening. J. Biomol. Screen. 1996:1-75],
[Sarau HM, Ames RS, Chambers J, Ellis C, Elshourbagy N, Foley JJ et al. Identification, molecular cloning, expression, and characterization of a cysteinyl leukotrien receptor. Mol Pharmacol. 1999;56:657-663]) 참조.
IL-8 자극된 인간 호중구 화학주성의 억제는 또한 마이크로-보이덴 챔버 (Boyden chamber)를 사용하여 입증하였다. 마이크로-보이덴 장치는 3 미크론-다공성 막 위 아래에 하나씩 존재하는 2개의 작은 챔버로 이루어진다. 하부 챔버는 화학주성제 (즉, IL-8) 또는 케모킨과 5중-특이적 mAb의 혼합물로 로딩된다. 상부 챔버는 정제된 비-활성화된 인간 호중구를 함유한다. 챔버가 조립되면, 저변 웰로부터 상부로 농도 구배가 형성되어, 호중구가 막을 가로질러 주화하도록 자극한다. 분석은 비-자극된 화학주성 세포수에 비하여 자극제에 반응하여 주화하는 세포의 수의 비인 CI (화학주성 지수)로서 표현한다. 하부 챔버에서 케모킨 (즉, IL-8)을 5중-특이적 mAb와 함께 예비-인큐베이팅하면 IL-8 자극된 호중구 화학주성을 용량 의존적으로 억제하였다. IL-8은 10 nM에서 3.6±0.8의 CI를 달성하였다. IL-8을 증가하는 농도의 5중-특이적 mAb (656.35)와 함께 예비-인큐베이팅하면 인간 호중 구 화학주성을 용량 의존적으로 억제하였고, 유의성은 1 ㎍/ml에서 2.2±0.6의 CI에서 도달하였다. 분석의 양 및 감도 때문에, 다른 케모킨은 검사할 수 없었다 (Gro-α, -β, -γ, 및 ENA-78).
CD11b의 표면 발현의 모니터링을 통한 정제된 인간 호중구 활성화의 억제. CD11b 또는 Mac-1은 기질에 대한 부착, 응집 및 화학주성을 매개하고, 표면 활성화된 호중구 상에서 상승-조절되는 것으로 알려져 있다 (Molad, Y.J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1994: 71; 281-286). 간단히 설명하면, 비-활성화된 인간 호중구를 정제하고, 표적 케모킨 (즉, IL-8)으로 또는 케모킨 5중-특이적 mAb와 함께 예비-인큐베이팅된 케모킨으로 생체외 자극한다. 데이타는 IL-8 자극으로 인한 최대 CD11b 표면 발현에 대한 ％ 활성화 세트로서 제시한다. IL-8을 656.35 mAb와 함께 예비-인큐베이팅하면 CD11b의 표면 발현의 증가된 수준을 용량 의존적으로 억제하였고, 이는 따라서 호중구 활성화의 억제를 나타낸다 (각각 0.01, 0.1, 1, 10 및 50 ㎍/ml에서 79.9％±3.7, 48.5％±7.2, 28.7％±3.2 및 31.6％±3.4).
실시예 4 . 각각의 표적 케모킨 (인간 IL-8, Gro-베타, 및 ENA-78)에 대한 5중-특이적 mAb 회합/해리 값.
Biacore 분석을 위한 방법.
KL로 지정된 실험을 위해, 토끼 항-마우스 IgG-Fc (Biacore BR-1005-14)를 제조자의 지시에 따라 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정시킨다.
BE로 지정된 실험을 위해, 아민 커플링에 의해 칩에 직접 고정된 정제된 항체를 사용하였다.
모 마우스 mAb로부터의 상층액 또는 정제된 항체를 항-마우스 IgG-Fc 표면 상에 포획시킨다. 규정된 농도의 각각의 분석물 (IL8, Gro-β 및 ENA-78)을 고정되거나 포획된 항체 표면 위로 통과시키고, 별개의 포획 사건을 각각의 분석물 주사를 위해 사용한다. 분석물의 각각의 주사 후에, 포획된 항체를 제거하지만 다른 포획 사건을 수행하는 항-마우스 IgG-Fc 표면의 능력을 유의하게 해치지 않고 직접 고정된 항체를 해치지 않는 약산성 용액의 주사에 의해 표면을 재생시킨다. 버퍼의 주사를 또한 항체 포획된 표면 위로 주입시키고, 이를 이중 참조를 위해 사용한다. 데이타를 결합의 1:1 모델을 이용하여 기기의 고유한 분석 소프트웨어를 이용하여 분석한다.
Figure 112009070070096-PCT00002
실시예 5
에피토프 매핑 ( mapping )
656.35 mAb를 에피토프 매핑하였고, 인간 IL-8 내의 KELRCQCIKTYSKP (서열 54) 내에서 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 IL-8의 서열 54의 에피토프 내에서 결합하는 5중-특이적 항체에 관한 것이다.
실시예 6 . 서열 56의 중쇄 서열 및 서열 58의 경쇄 서열을 갖는 656.35로부터 제조된 키메라 항체의 효능 연구. (상기 항체를 키메라 항체로서 칭할 것이다.)
- 생체내 연구:
흡입된 LPS 급성 폐 염증 모델을 사용하여 비-인간 영장류 (NHP - 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이)의 폐 내로 호중구의 침윤을 억제하는 5중-특이적 항체의 능력을 검사하였다. 간단히 설명하면, NHP (비-인간 영장류)를 건강 및 외인적으로 첨가된 사이노몰거스 IL-8 (cynoIL-8)에 대한 반응성에 대해 예비-스크리닝하였다. 이어서, 선택된 NHP를 제1 LPS 유발 5일 전에 기준선 샘플을 수집하였다 (혈액 및 기관지폐포 세척액 - BAL). LPS 유발은 NHP를 케타민 HCl (약 10 mg/kg)의 단일 IM 주사로 진정시키는 것으로 이루어졌다. 일단 NHP가 진정되면, 프로포폴 (약 0.2 mg/kg/min, 필요한 양)의 정맥내 주입을 통해 마취제를 투여하였다. 마취된 동물을 순환 온수 가열 블랭킷 (blanket) 상에 및/또는 순환 온기 블랭킷 내에 넣고, 각각의 눈에 안과용 윤활제를 투여하였다. 이어서, 유발 절차를 위해 동물에 삽관하고, 기계 호흡시켰다. 부피 조절식 양압 인공호흡기 (ventilator)를 절차 동안 사용하였다 (Stoelting Cat/Rabbit 인공호흡기, www.stoeltingco.com Cat #5019510). 리포다당체 (lipopolysaccharide; LPS) 유발은 DeVilbiss Ultraneb-99 초음파 네불라이저 (nebulizer)를 사용하는 에어로졸 흡입을 통해 수행하였다. 에어로졸화 LPS를 5분 동안 100 ug/ml로 투여하였다. 유발 절차 동안 심박수, 체온 및 호흡수를 모니터링하고 기록하였다. 초기 유발로 NHP가 LPS에 반응하는 것을 확인하였다 (폐 내로 호중구 침윤의 증가 및 IL-8 수준의 상승). 개별 NHP 반응은 유발 후 6 및 24시간에서 샘플 수집에 의해 확인하였다.
이어서, 초기 LPS 유발된 NHP를 무작위로 2개의 군으로 나누었다. 4주 회복 기 후에, 모든 참여 NHP에 대해 또다른 기준선 샘플 (혈액 및 BAL)을 수집하였다. 기준선 측정 4일 후에, 대상 군에 비히클 또는 1 mg/kg의 키메라 항체를 IV 주사하였다. 다음날, NHP에게 흡입 LPS로 다시 유발시키고, 분석을 위한 샘플을 유발 6 및 24시간 후에 수집하였다. 추가의 회복기 후에, 비히클 NHP로부터 기준선 샘플을 수집하고, 4일 후에 이들 NHP를 키메라 항체의 단일 IV 볼러스 주사로 10 mg/kg로 처리하였다. 다음날, 동물을 LPS 유발에 노출시키고, 분석을 위해 샘플을 6 및 24시간에서 수집하였다.
LPS 흡입은 폐 내로 호중구 침윤을 증가시키는 화학주성 케모킨, 예를 들어 IL-8의 상승을 자극하는 급성 염증 모델이다. 키메라 항체 처리에 대한 1차 효능 파라미터는 LPS로 유발시킨 NHP의 폐 내로 침윤하는 호중구의 억제이다. 상기 급성 염증 모델에서 호중구 침윤은 LPS 유발 후 처음 24시간 동안 일어나고, 이 시점에 다른 염증 과정은 보다 현저해진다.
키메라 항체로 예비처리하면 LPS 유발된 NHP의 폐 내로 호중구 침윤을 유의하고 용량 의존적으로 억제하였다. 키메라 항체를 사용하는 처리는 또한 실제 호중구 기능 (즉, 포식작용하는 세포 능력)을 해치지 않으면서 순환 호중구의 상승을 방지하였다. 처리는 또한 폐 또는 순환계 내의 다른 세포 종류, 예를 들어 대식세포/단핵구에 크게 영향을 미치지 않았다 (도 2 참조).
실시예 7
인간화 mAb 에 대한 추가의 연구
다수의 인간화 5중-특이적 항체 구성체를 생산하였고, 이들 중 4개는 모든 표적 케모킨에 단단히 결합하고 그를 억제하는 것으로 나타났다 (각각의 서열에 대해서는 아래의 서열 정보 참조). 상기 분석은 친화도 측정 (BiaCore), 칼슘 이동 분석 (시험관내 기능적 분석, FLIPR), 및 CD11b 인간 및 NHP 호중구 자극 분석 (생체외 기능적 분석, 유동 세포측정)으로 이루어졌다.
- BiaCore
단백질 A 포획 방법을 다음과 같이 인간화 및 키메라 구성체에 대한 운동학을 생성하기 위해 사용하였다:
단백질 A를 제조자의 지시에 따라 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정시켰다. 정제된 인간화 또는 키메라 항체가 단백질 A 표면 상에 포획되었다. 포획 후에, 규정된 농도의 각각의 분석물 (IL8, Gro-β 및 ENA-78)을 항체 포획된 표면 위로 통과시키고, 별개의 포획 사건을 각각의 분석물 주사를 위해 사용하였다. 분석물의 각각의 주사 후에, 포획된 항체를 제거하지만 다른 포획 사건을 수행하는 단백질 A의 능력을 유의하게 해치지 않는 약산성 용액의 주사에 의해 표면을 재생시켰다. 버퍼를 또한 항체 포획된 표면 위로 주입시키고, 이를 이중 참조를 위해 사용하였다. 데이타를 결합의 1:1 모델을 이용하여 기기의 고유한 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
Figure 112009070070096-PCT00003
Figure 112009070070096-PCT00004
Figure 112009070070096-PCT00005
Figure 112009070070096-PCT00006
친화도 (KD)는 단백질의 회합 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)를 검사하여 결정한다.
HcLc는 서열 56의 중쇄 서열 및 서열 58의 경쇄 서열을 갖는 656.35로부터 제조된 키메라 항체를 나타낸다.
- 기능적 분석: CHO - K1 CXCR2 (w/Gα16)을 사용한 칼슘 이동 ( FLIPR )
hCXCR2 및 Gα16으로 형질감염되어 이를 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포에서 ELR+ 케모킨 유도된 [Ca2 +]i-이동에 대한 항체의 중화 효과의 기능적 특성 결정을 위해, 미세적정 플레이트 기반 칼슘 이동 분석, FLIPR (형광측정 영상화 플레이트 판독기, 몰레큘라 디바이시즈, [Schroeder, 1996])을 사용하였다.
분석 전일에, 세포를 96 웰의 흑색 벽 및 투명한 바닥의 플레이트 (패카드 뷰) 내에 40000 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 18 내지 24시간 후, 배지를 세포로부터 흡인 제거하고, 얼스 염 및 L-글루타민, 0.1％ BSA (세롤로지칼스 코퍼레이션), 4 μM Fluo-4-아세톡시메틸 에스테르 형광 인디케이터 염료 (Fluo-4 AM) 및 2.5 mM 프로베네시드와 함께 이글스 최소 필수 배지 (EMEM)을 함유하는 100 ㎕ 로드 배지로 교체하였다. 세포를 상기 염료 함유 배지 내에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 염료 함유 배지를 세포로부터 흡인 제거하고, Fluo-4 AM을 함유하지 않고 0.1％ 젤라틴 (BSA 제거) 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 동일한 배지로 교체하였다. 세포를 10분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, KRH 분석 버퍼 [0.1％ 젤라틴 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 크렙스 링거 헨젤라이트 (120 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 1.03 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1.0 mM CaCl2, 1.1 mM MgCl2, 11 mM 글루코스, 20 mM HEPES (pH 7.4))]로 3회 세척하였다. 최종 버퍼 세 척 후에, 0.1％ 젤라틴 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 100 ㎕ KRH 분석 버퍼를 세포에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 가온한 후, FLIPR 내에 넣고, 여기서 염료 로딩된 세포를 6 와트 아르곤 레이저로부터 여기광 (488 nm)에 노출시켰다. [Ca2 +]i-이동을 Ca2 +에 결합될 때 Fluo-4의 516 nm 방출 강도의 증가의 결과로서 모니터링하였다. 방출 강도에서 변화는 세포기질 칼슘 수준, [Ca2 +]i에 직접 관련된다. 기준선을 10초 동안 모니터링한 후, 50 ㎕의 3X ELR+ 케모킨 (일정 농도 범위의 항체와 함께 예비-인큐베이팅시킴)을 세포 플레이트에 첨가하고, 데이타를 1분 동안 매초 수집한 후, 추가의 30초 동안 3초 간격으로 기록하였다. 기초 판독치를 넘는 최대 세포성 반응을 GraphPad Prism (v4.03)에서 플로팅하기 위해 이송하였다.
IC50은 3X EC80 케모킨의 예비-처리 동안, EC80 농도의 ELR+ 케모킨의 CXCR2 매개된 자극 효과를 50％ 중화시키기 위해 요구되는 항체의 농도로서 정의하였다. 세포 생활력을 시험하기 위해 25 μM ATP에 대한 2차 세포성 반응을 모니터링하였다 [Sarau, 1999].
Figure 112009070070096-PCT00007
표: 4개의 인간화 mAb 구성체에 의한 인간 ELR+ 케모킨 유도된 칼슘 유동의 억제 (기하 평균된 IC50, ㎍/ml) (n=3)
문헌 ([Schroeder KS, Neagle, BD. FLIPR: a new instrument for accurate, high throughput optical screening. J. Biomol. Screen. 1996:1-75],
[Sarau HM, Ames RS, Chambers J, Ellis C, Elshourbagy N, Foley JJ et al. Identification, molecular cloning, expression, and characterization of a cysteinyl leukotrien receptor. Mol Pharmacol. 1999;56:657-663]) 참조.
- 생체외 CD11b 인간 호중구 자극 분석
유동 세포측정을 이용하여, 물리적 세포성 변화 (크기 및 형태 - 과립화)를 추적하고 표면 활성화 마커 (CD11b 표면 발현의 증가)를 검사함으로써 케모킨 유도된 인간 정제된 호중구 활성화를 방지하는 인간화 5중-특이적 항체의 능력을 검사하였다. 호중구 제어 자극제 fMLP를 사용하여, 활성화시키는 정제된 인간 호중구 능력을 확인하였다 (도 4 참조).
서열 정보
656.35, 197.2 및 81.1 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출한 후, 역전사 및 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 생성하였다. RT-PCR을 위한 정방향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 리더-서열에 특이적인 퇴화 프라이머의 혼합물이고, 역방향 프라이머는 항체 불변 구역, 본 경우에 이소형 IgG2a/κ에 특이적이다. 프라이머는 문헌 [Jones and Bendig, Bio/Technology 9:88, 1991]에 설명된 전략에 따라 설계하였다. RT-PCR은 정확한 V-구역 서열의 후속적인 증명을 가능하게 하도록 두 개의 V-구역 서열 모두에 대해 이중으로 수행하였다. RT-PCR에 의해 생성된 V-구역 생성물을 클로닝하고 (Invitrogen TA 클로닝 키트), 서열 데이타를 얻었다. 상기 과정은 81.1 경쇄 가변 도메인에 대해서는 성공하지 않았다. 따라서, 아래 제시된 아미노산 서열 (서열 12)은 환원 조건 하에 실행된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 단리된 경쇄를 단백질 서열결정함으로써 생성하였다.
상보성 결정 구역 (CDR)은 밑줄로 표시한다.
656.35에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 구역 (각각 서열 1 및 3)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 1:
Figure 112009070070096-PCT00008
서열 3:
Figure 112009070070096-PCT00009
656.35에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 구역 (각각 서열 2 및 4)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 2:
Figure 112009070070096-PCT00010
서열 4:
Figure 112009070070096-PCT00011
656.35에 대한 중쇄 CDR (각각 서열 13, 14, 15)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 13:
NYWIV
서열 14:
DLYSGGGYTFYSENFKG
서열 15:
SGYDRTWFAH
656.35에 대한 경쇄 CDR (각각 서열 16, 17, 18)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 16:
QASQDIESYLS
서열 17:
YATRLAD
서열 18:
LQHGESPPT
656.35에 대한 중쇄 CDR (서열 31, 32, 33)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 31:
AACTACTGGATAGTT
서열 32:
GATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGG
서열 33:
TCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCAC
656.35에 대한 경쇄 CDR (서열 34, 35, 36)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 34:
CAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGC
서열 35:
TACGCTACAAGGTTGGCAGAT
서열 36:
CTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACG
197.2에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 구역 (각각 서열 5 및 7)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 5:
Figure 112009070070096-PCT00012
서열 7:
Figure 112009070070096-PCT00013
197.2에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 구역 (각각 서열 6 및 8)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 6:
Figure 112009070070096-PCT00014
서열 8:
Figure 112009070070096-PCT00015
197.2에 대한 중쇄 CDR (각각 서열 19, 20, 21)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 19:
DYNMN
서열 20:
VINPKYGTTSYNQKFKG
서열 21;
GMGLLFGMDY
197.2에 대한 경쇄 CDR (서열 22, 23, 24)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 22:
KSSQSLLNSGNQKNYLA
서열 23:
GASTRKS
서열 24:
QNDHSFPCT
197.2에 대한 중쇄 CDR (서열 37, 38, 39)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 37:
GACTACAACATGAAC
서열 38:
GTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGC
서열 39:
GGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTAC
197.2에 대한 경쇄 CDR (서열 40, 41, 42)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 40:
AAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC
서열 41
GGGGCATCCACTAGGAAATCT
서열 42
CAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACG
81.1에 대한 중쇄 가변 구역 (서열 9)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 9:
Figure 112009070070096-PCT00016
81.1에 대한 중쇄 가변 구역 (서열 10)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 10:
Figure 112009070070096-PCT00017
81.1에 대한 중쇄 CDR (각각 서열 25, 26, 27)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 25:
VYGMN
서열 26:
NFDPYFSVTSYNQKFQD
서열 27:
GSWETIFAY
81.1에 대한 중쇄 CDR (서열 43, 44, 45)에 대한 폴리뉴클레오티드 서열
서열 43:
GTCTACGGCATGAAC
서열 44:
AATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGAC
서열 45:
GGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTAC
81.1에 대한 경쇄 가변 구역 (서열 12)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 12:
Figure 112009070070096-PCT00018
81.1에 대한 경쇄 CDR (각각 서열 28, 29 및 30)에 대한 폴리펩티드 서열
서열 28:
RSSTGAVTTSNYAN
서열 29:
GTNNRAP
서열 30:
ALWYSNHV
키메라* 폴리뉴클레오티드 서열 (가변 중쇄 구역 + 코돈 최적화된 IgG1)
서열 55
Figure 112009070070096-PCT00019
키메라* 폴리펩티드 서열 (가변 중쇄 구역 + 코돈 최적화된 IgG1)
서열 56:
Figure 112009070070096-PCT00020
키메라* 폴리뉴클레오티드 서열 (가변 경쇄 구역 + 코돈 최적화된 인간 cK)
서열 57:
Figure 112009070070096-PCT00021
키메라* 폴리펩티드 서열 (가변 경쇄 구역 + 코돈 최적화된 인간 cK)
서열 58:
Figure 112009070070096-PCT00022
키메라*는 뮤린 656.35 항체로부터 제조된 키메라 항체를 나타낸다.
성숙 중쇄의 H0 DNA 서열
서열 11:
Figure 112009070070096-PCT00023
성숙 중쇄의 H0 단백질 서열
서열 46:
Figure 112009070070096-PCT00024
성숙 경쇄의 L7 DNA 서열
서열 47:
Figure 112009070070096-PCT00025
성숙 경쇄의 L7 단백질 서열
서열 48:
Figure 112009070070096-PCT00026
성숙 경쇄의 L8 DNA 서열
서열 59:
Figure 112009070070096-PCT00027
성숙 경쇄의 L8 단백질 서열
서열 60:
Figure 112009070070096-PCT00028
성숙 경쇄의 L10 DNA 서열
서열 61:
Figure 112009070070096-PCT00029
성숙 경쇄의 L10 단백질 서열
서열 62:
Figure 112009070070096-PCT00030
성숙 경쇄의 M0 DNA 서열
서열 63:
Figure 112009070070096-PCT00031
성숙 경쇄의 M0 단백질 서열
서열 64:
Figure 112009070070096-PCT00032
SEQUENCE LISTING <110> CLEGG, Stephanie J. DOBRZYNSKI, Eric ELLIS, Jonathan H. GERMASCHEWSKI, Volker GODILLOT, A. Paul JONAK, Zdenka L. LEWIS, Alan P. WHITE, John R. <120> NOVEL COMPOUNDS <130> PU62421 <150> 60/912,229 <151> 2007-04-17 <150> 61/044,132 <151> 2008-04-11 <160> 64 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Murine <400> 1 caggtccagt tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaggc ctgggacttc agtgacgata 60 tcctgtaagg cttctggcta caccttcact aactactgga tagtttgggt caaacagagg 120 cctggacatg gacttgagtg gattggagat ctttactctg gaggtggtta tactttctac 180 agtgaaaatt tcaaggggaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cactgcctac 240 atgcacctca ttagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagatcgggt 300 tacgacagaa cctggtttgc tcactggggc caagggtctc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Val Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Asp Arg Thr Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Murine <400> 3 gacatcaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtctgcat cgctgggaga gagagtcact 60 atcacttgtc aggcgagtca ggacattgaa agctatttaa gctggtatca gcagaaacca 120 tggaaatctc ctaagaccct gatctattac gctacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tggtcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240 gacgatacag caacttatta ctgtctacaa catggtgaga gccctcccac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa acgg 324 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 357 <212> DNA <213> Murine <400> 5 gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120 aatggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccta agtatggtac tactagttac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacgttg actgtagacc aatcctccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atcactgtgc aagaggaatg 300 ggactcctct ttggtatgga ctactggggc caaggaacct ctgtcaccgt ctcctca 357 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Met Gly Leu Leu Phe Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 342 <212> DNA <213> Murine <400> 7 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaraagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180 aaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagtttt 300 ccgtgcacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Murine <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Murine <400> 9 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctctttcact gtctacggca tgaactgggt gagacagagc 120 aatggaaaga gccttgaatg gattggaaat tttgatcctt actttagtgt cacttcctac 180 aaccagaagt tccaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca agaacctcac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagagggagc 300 tgggaaacca tttttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Murine <400> 10 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Val Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Phe Asp Pro Tyr Phe Ser Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Trp Glu Thr Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 11 <211> 1347 <212> DNA <213> Murine <400> 11 caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggggccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactgga tcgtgtgggt caggcaggcc 120 cccggccagg gactggagtg gatgggcgac ctgtatagcg gcggcggcta caccttctac 180 agcgagaact tcaagggcag ggtgaccatg accagggaca ccagcaccag caccgtgtac 240 atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagcggc 300 tacgacagga cttggtttgc tcactggggc cagggcacac tagtgaccgt gtccagcgcc 360 agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg aaccggtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgtaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660 agctgtgaca agacccacac ctgccccccc tgccctgccc ccgagctgct gggaggcccc 720 agcgtgttcc tgttcccccc caagcctaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 780 gtgacctgtg tggtggtgga tgtgagccac gaggaccctg aggtgaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgta aggtgtccaa caaggccctg cctgccccta tcgagaaaac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccagaga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcag agatgagctg 1080 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgatg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag cagatggcag 1260 cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag 1320 aagagcctga gcctgtcccc tggcaag 1347 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Murine <400> 12 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Pro Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 13 Asn Tyr Trp Ile Val 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 14 Asp Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Murine <400> 15 Ser Gly Tyr Asp Arg Thr Trp Phe Ala His 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Murine <400> 16 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 17 Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Protein <400> 18 Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 19 Asp Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 20 Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Murine <400> 21 Gly Met Gly Leu Leu Phe Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 22 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 23 Gly Ala Ser Thr Arg Lys Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 24 Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Cys Thr 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 25 Val Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 26 Asn Phe Asp Pro Tyr Phe Ser Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 27 Gly Ser Trp Glu Thr Ile Phe Ala Tyr 1 5 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 28 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 29 Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 30 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Val 1 5 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Murine <400> 31 aactactgga tagtt 15 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Murine <400> 32 gatctttact ctggaggtgg ttatactttc tacagtgaaa atttcaaggg g 51 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Murine <400> 33 tcgggttacg acagaacctg gtttgctcac 30 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Murine <400> 34 caggcgagtc aggacattga aagctattta agc 33 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Murine <400> 35 tacgctacaa ggttggcaga t 21 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Murine <400> 36 ctacaacatg gtgagagccc tcccacg 27 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Murine <400> 37 gactacaaca tgaac 15 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Murine <400> 38 gtaattaatc ctaagtatgg tactactagt tacaatcaga agttcaaggg c 51 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Murine <400> 39 ggaatgggac tcctctttgg tatggactac 30 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Murine <400> 40 aagtccagtc agagtctgtt aaacagtgga aatcaaaaga actacttggc c 51 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Murine <400> 41 ggggcatcca ctaggaaatc t 21 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Murine <400> 42 cagaatgatc atagttttcc gtgcacg 27 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Murine <400> 43 gtctacggca tgaac 15 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Murine <400> 44 aattttgatc cttactttag tgtcacttcc tacaaccaga agttccagga c 51 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Murine <400> 45 gggagctggg aaaccatttt tgcttac 27 <210> 46 <211> 449 <212> PRT <213> Murine <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Asp Arg Thr Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 47 <211> 642 <212> DNA <213> Murine <400> 47 gatatccaga tgacccagag ccctagctcc ctcagcgcat cagtcggcga cagagtgaca 60 atcacctgcc aggcatccca ggacatcgag tcttacctga gctggtacca gcagaagccc 120 ggaaaggccc caaagctcct gatctactac gccactcggc tggcagacgg cgtgcctagc 180 aggttctccg gctcagggtc tgggacagac ttcaccctga ccatcagctc actgcagccc 240 gaggatttcg ccacctacta ctgtctgcag cacggagaga gccccccaac ctttggccag 300 ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 48 <211> 214 <212> PRT <213> Murine <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 49 Leu Ala Thr Glu Leu Arg Ser Gln Ser Leu Gln Thr Leu Gln Gly 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 50 Ser Ala Lys Glu Leu Arg Ser Gln Ser Ile Lys Thr Tyr Ser Lys 1 5 10 15 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 51 Leu Arg Glu Leu Arg Ser Val Ser Leu Gln Thr Thr Gln Gly 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 52 Ser Pro Gly Pro His Ser Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 53 Glu Ser Gly Pro His Ser Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Murine <400> 54 Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 55 <211> 1347 <212> DNA <213> Murine <400> 55 caggtccagt tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaggc ctgggacttc agtgacgata 60 tcctgtaagg cttctggcta caccttcact aactactgga tagtttgggt caaacagagg 120 cctggacatg gacttgagtg gattggagat ctttactctg gaggtggtta tactttctac 180 agtgaaaatt tcaaggggaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cactgcctac 240 atgcacctca ttagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagatcgggt 300 tacgacagaa cctggtttgc tcactggggc caagggtcac tagtgaccgt gtccagcgcc 360 agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg aaccggtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgtaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660 agctgtgaca agacccacac ctgccccccc tgccctgccc ccgagctgct gggaggcccc 720 agcgtgttcc tgttcccccc caagcctaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 780 gtgacctgtg tggtggtgga tgtgagccac gaggaccctg aggtgaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgta aggtgtccaa caaggccctg cctgccccta tcgagaaaac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccagaga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcag agatgagctg 1080 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgatg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag cagatggcag 1260 cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag 1320 aagagcctga gcctgtcccc tggcaag 1347 <210> 56 <211> 449 <212> PRT <213> Murine <400> 56 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Val Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Asp Arg Thr Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 57 <211> 642 <212> DNA <213> Murine <400> 57 gacatcaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtctgcat cgctgggaga gagagtcact 60 atcacttgtc aggcgagtca ggacattgaa agctatttaa gctggtatca gcagaaacca 120 tggaaatctc ctaagaccct gatctattac gctacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tggtcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240 gacgatacag caacttatta ctgtctacaa catggtgaga gccctcccac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa acgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 58 <211> 214 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195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 59 <211> 642 <212> DNA <213> Murine <400> 59 gatatccaga tgacccagag ccctagctcc ctcagcgcat cagtcggcga cagagtgaca 60 atcacctgcc aggcatccca ggacatcgag tcttacctga gctggtacca gcagaagccc 120 ggaaaggccc caaagctcct gatctactac gccactcggc tggcagacgg cgtgcctagc 180 aggttctccg gctcagggtc tgggacagac ttcaccttca ccatcagctc actgcagccc 240 gaggatatcg ccacctacta ctgtctgcag cacggagaga gccccccaac ctttggccag 300 ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 60 <211> 214 <212> PRT <213> Murine <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 61 <211> 642 <212> DNA <213> Murine <400> 61 gatatccaga tgacccagag ccctagctcc ctcagcgcat cagtcggcga cagagtgaca 60 atcacctgcc aggcatccca ggacatcgag tcttacctga gctggtacca gcagaagccc 120 ggaaaggccc caaagctcct gatctactac gccactcggc tggcagacgg cgtgcctagc 180 aggttctccg gctcagggtc tgggcaggac tacaccctga ccatcagctc actgcagccc 240 gaggatttcg ccacctacta ctgtctgcag cacggagaga gccccccaac ctttggccag 300 ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 62 <211> 214 <212> PRT <213> Murine <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 63 <211> 642 <212> DNA <213> Murine <400> 63 gagatcgtgc tgacccagtc tcccgccacc ctgtcactgt ctcccggcga aagggcaacc 60 ctgagctgcc aggccagcca ggacatcgag agctacctga gctggtacca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccaggctgct gatctactac gccaccaggc tggccgacgg cattcccgcc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcactctga ccatcagcag cctggagccc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgcctgcag cacggcgaga gccctcccac cttcggccag 300 ggcaccaagc tcgagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 64 <211> 214 <212> PRT <213> Murine <400> 64 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (84)

  1. 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 대한 다중 특이성을 갖는 (또는 그와 교차 반응하는) 5중-특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 마우스 모노클로날, 키메라, 인간 또는 인간화 항체인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 결정할 때 10-7 M, 10-8 M, 또는 10-9 M 미만의 평형 상수 (KD) 값으로 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78에 결합하는 항체.
  4. a. 마우스에게 완전 프로인트 어쥬번트 (cFA) 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물을 주사하는 단계;
    b. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 (iFA) 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물을 주사하는 단계;
    c. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 5개의 다중 항원 펩티드 (MAP)의 세트를 주사하며, 여기서 각각의 MAP 단위는 서열 49-53의 폴리펩티드로부터 하나의 별개의 서열을 갖는 것인 단계;
    d. 마우스로부터 B 세포를 단리하는 단계;
    e. B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 목적하는 5중-특이적 항체를 분비하는 무한증식 (immortal) 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
    f. 하이브리도마의 배양 상층액으로부터 5중-특이적 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 5중-특이적 항체의 제조 방법.
  5. a. 마우스에게 완전 프로인트 어쥬번트 내의 5개의 다중 항원 펩티드 (MAP)의 세트 (MAP 세트)를 주사하며, 여기서 각각의 MAP 단위는 서열 49-53의 폴리펩티드로부터 하나의 별개의 서열을 갖는 것인 단계;
    b. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 MAP 세트를 주사하는 단계;
    c. 마우스에게 불완전 프로인트 어쥬번트 내의 모든 인간 IL-8, Gro-알파, Gro-베타, Gro-감마 및 ENA-78의 혼합물, 및 MAP 세트를 주사하는 단계;
    d. 마우스로부터 B 세포를 단리하는 단계;
    e. B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 목적하는 5중-특이적 항체를 분비하는 무한증식 하이브리도마 세포를 형성하는 단계; 및
    f. 하이브리도마의 배양 상층액으로부터 5중-특이적 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 5중-특이적 항체의 제조 방법.
  6. 제4항 또는 5항의 방법에 의해 제조된 항체.
  7. 제1항에 있어서, 각각 서열 1 및 서열 3의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 각각 서열 5 및 서열 7의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 서열 9의 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  10. 제1항에 있어서, 각각 서열 2 및 서열 4의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  11. 제1항에 있어서, 각각 서열 2 및 서열 4의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  12. 제1항에 있어서, 각각 서열 6 및 서열 8의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  13. 제1항에 있어서, 각각 서열 6 및 서열 8의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  14. 제1항에 있어서, 서열 10의 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  15. 제1항에 있어서, 서열 10의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  16. 제1항에 있어서, (i) 서열 2, 4, 6, 8, 또는 10의 아미노산 서열; 또는 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 가변 구역을 포함하는 항체.
  17. 제1항에 있어서, 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하거나; 또는 하나 이상의 CDR 서열이 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 서열의 보존적 서열 변형일 수 있는 것인 항체.
  18. 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마 (transfectoma).
  19. 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포.
  20. 제1항에 있어서, (i) 서열 13, 14, 15, 16, 17 또는 18; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  21. 제1항에 있어서, 서열 15의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
  22. 제1항에 있어서, 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 CDR 서열을 포함하거나; 또는 하나 이상의 CDR 서열이 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있는 것인 항체.
  23. 제1항에 있어서, 각각 서열 13, 14 및 15, 및 서열 16, 17 및 18의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  24. 제1항에 있어서, 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하거나; 또는 하나 이상의 CDR 서열이 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있는 것인 항체.
  25. 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마.
  26. 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포.
  27. 제1항에 있어서, (i) 서열 19, 20, 21, 22, 23 또는 24; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  28. 제1항에 있어서, 서열 21의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
  29. 제1항에 있어서, 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 CDR 서열을 포함하거나; 또는 하나 이상의 CDR 서열이 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있는 것인 항체.
  30. 제1항에 있어서, 각각 서열 19, 20 및 21, 및 서열 22, 23 및 24의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  31. 제1항에 있어서, 서열 25, 26 및 27의 CDR 서열을 포함하거나; 또는 하나 이상의 CDR 서열이 서열 25, 26 및 27에 나열된 서열의 보존적 서열 변형일 수 있는 것인 항체.
  32. 서열 25, 26 및 27의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마.
  33. 서열 25, 26 및 27의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 세포.
  34. 제1항에 있어서, (i) 서열 25, 26 또는 27; 또는 (ii) (i)에 나열된 서열의 보존적 서열 변형으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  35. 제1항에 있어서, 서열 27의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
  36. 제1항에 있어서, 서열 25, 26 및 27의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  37. 각각 서열 1, 5 또는 9, 또는 서열 3 또는 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  38. 각각 서열 2, 6 또는 10, 또는 서열 4 또는 8의 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  39. 각각 서열 2, 6 또는 10, 또는 서열 4 또는 8의 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 갖는 5중-특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  40. 제1항의 5중-특이적 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  41. 유효량의 제1항의 5중-특이적 항체를 투여하는 것을 포함하는, COPD, 골관절염, 류마티스 관절염, 미란성 관절염, 천식, 죽상경화증, 염증성 장 질병, 건선, 이식 거부반응, 통풍, 암, 급성 폐 손상, 급성 폐 질병, 패혈증, ARDS, 말초 동맥 질병, 전신 경화증, 신생아 호흡 곤란 증후군, 천식 및 COPD의 악화, 낭성 섬유증, 미만성 범세기관지염, 재관류 손상 및/또는 자궁내막증을 치료 또는 예방하는 방법.
  42. 각각 서열 13, 14 및 15; 또는 서열 16, 17 및 18의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  43. 서열 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  44. 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 5중-특이적 항체의 적어도 4개의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  45. 서열 31, 32 또는 33의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  46. 서열 34, 35 및 36의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  47. 서열 31, 32, 33, 34, 35 및 36으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  48. 각각 서열 19, 20 및 21; 또는 22, 23 및 24의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  49. 서열 19, 20, 21, 22, 23 또는 24로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  50. 서열 19, 20, 21, 22, 23 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 5중-특이적 항체의 적어도 4개의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  51. 서열 37, 38 및 39의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  52. 서열 40, 41 및 42의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  53. 서열 37, 38, 39, 40, 41 및 42로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 4개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  54. 서열 25, 26 및 27의 CDR 서열을 포함하는 5중-특이적 항체의 가변 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  55. 서열 25, 26 또는 27로부터 선택되는 5중-특이적 항체의 CDR 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  56. 서열 43, 44 및 45의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  57. (i) 단일 숙주 세포를 적어도 서열 13, 14 및 15의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 적어도 서열 16, 17 및 18의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
    (ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발현시키는 단계
    를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 5중-특이적 항체 (면역글로불린)를 생산하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하는 것인 방법.
  59. (i) 단일 숙주 세포를 적어도 서열 19, 20 및 21의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 적어도 서열 22, 23 및 24의 CDR 도메인을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
    (ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발현시키는 단계
    를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 5중-특이적 항체 (면역글로불린)를 생산하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하는 것인 방법.
  61. 제1항에 있어서, 인간 IL-8의 KELRCQCIKTYSKP (서열 54)의 에피토프 내에 결합하는 항체.
  62. 제1항의 항체를 투여함으로써 그를 필요로 하는 환자에서 호중구 화학주성을 감소시키는 방법.
  63. 제1항에 있어서, 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함 하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  64. 제1항에 있어서, 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  65. 제1항에 있어서, 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  66. 제1항에 있어서, 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  67. 각각 서열 46, 또는 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 갖는 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  68. 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  69. 각각 서열 46, 또는 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90 ％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 갖는 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  70. 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  71. 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  72. 각각 서열 11, 및 서열 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  73. 서열 11, 47, 59, 61 또는 63의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  74. 각각 서열 11, 47, 59, 61 또는 63의 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  75. 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  76. 각각 서열 46, 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  77. 서열 46, 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  78. 서열 46, 48, 60, 62 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  79. (i) 단일 숙주 세포를 서열 46의 폴리펩티드를 포함하는 중쇄를 코딩하는 제1 DNA 서열; 및 서열 48, 60, 62 또는 64의 폴리펩티드를 포함하는 경쇄를 코딩하는 제2 DNA 서열로 형질전환시키는 단계; 및
    (ii) 상기 제1 DNA 서열 및 상기 제2 DNA 서열을, 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 상기 형질전환된 단일 숙주 세포 내에서 별개의 분자로서 생산되도록 발 현시키는 단계
    를 포함하는, 단일 숙주 세포 내에서 항체 (면역글로불린)를 생산하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 상이한 벡터 내에 존재하거나, 또는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 단일 벡터 내에 존재하는 것인 방법.
  81. 제1항에 있어서, 각각 서열 46 및 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  82. 제1항에 있어서, 각각 서열 46 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  83. 제1항에 있어서, 각각 서열 46 및 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  84. 제1항에 있어서, 각각 서열 46 및 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
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